OBTkZfCIOñ DE UN ALIMENTO FEMENTADO, A PART19

DE SOW0 (Sorghum bicolor L. moench), UTILI-

ZAKKl MICBOOR(ZM1SIQS FüNGICOS.

Gebriol Vhquos !?&los (Re. do net. 79 23 35 15).

Sorgio Bojtu Sorranfa (No. de net. 79 22 03 83).

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OBTmCION DE UN ALIMEmO PEIIlI[ENTADO, A PART13

DE SORI30 (Sorghum bicolor L. moench), UTILI-

J

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ZANDO MICROOROANISMOS FUNGICOS.

J Gabriel Vdzquez NGíez.

Sergio R o j s s Serrania.

UWIVBRSIDAD AüTONOU YgTROPOLITáNA- I CCS $ DEPIBTllPNTO JN BIOTBCNOLOGIA

Y I N G . BIOQUIllICA IlOIXlSTRIAt

/A6omoremr

1. oa C. B-0 E. GoneCUez H.

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I RE-.......................... i............... 1

I1 I NTBO~ CC I OB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

I11 AiVTBOBDBFPPES..........................,........ 6

IV OBJ'ETIVOS.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . 9

v M E T O D O S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

V.1. Seleccidn de cepaa con actividad fenolftica. . . . 10

V.1.1. Medio de cultivo A...........,............... 10

V.1.2. Medio d. cultivo A'. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

V.1.3. Dedio da Cultivo BI.......................... 1 2

V.1.4. Dedio d. cultivo C. . . . ....................... 13

v.i.5. 10ai0 e. ouítivo D........................... 1 4

V.1.6. medio be cultivo E........................... 15

V.2, A i i l s d oa to de cepaa a partir de sorgo ......... 16

9.2.2. T6cniaa ..................................... 17 V.3. Aisleaimto de o e p u a par t i r de t i e r ra ........ 18

V.3.1. T6cnica ..................................... 18

V.4. Aielmuiento d6 cepas a partir de taninoe ....... 19 V.4.1. T6cnica IV. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 V.5. Fermentaeibn.................. ................. 20

V.5.1. Medio de cultivo F........................... 20

V.5.2. Medio de cultivo G. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

V.5.3. Conteo de espores............................ 22

V.6. medioiones............. ........................ 23

V.6.1. Bvo lmi6n de C0 2............................. 23

V.2.1. TBcn iCa I.................................... 16

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4

V.6.2. Determinacidn de huruedad........................ 24 25

V.6.4. Determinación de carbohidratos tota les . . . . . . . . . . 27

V.6.5. Determinación de fenoleo totales. . . . . . . . . . . . . . . . 29

V.6.6. Deteminación de taninos........................ 31

V.?. Equipo de fermentaci6n............................ 32

VI ñESILTBDOS... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

V.6.3. Determinaci6n de proteina.......,........... ....

VI.l. Diagrama de f l u j o de actividades para aislamien-

t o y selecci6n de cepas.......................... 33

VI.2. Cepru pertenecientes al cepario de laUAH ........ 35

VI.3. D i a g r m a de flujo de actividadea para e l proceeo

do f ~n iontao ibn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Vi.4. Ai8la111ientO de cepas a p a x t i r de sorgo.........,. Vi.5. A i f i d e n t o de cepas a part i r de t i e r r a negra....

Vi.6. Ai8lat~%Onto de cepas a pa r t i r de taninos ......... VI.7.1. Pruoba con l o s medios A, A' y B... ............. Vi.7.2. Pruoba con l o s medios D y A' . .................. VI.8. Seleccibn de cepss de l cepilrio de laurn. . . . . . . . .

VI.8.1. PNeba con l o s medios A, A* y E.......,........

VI.7. S e l e co ih de cepa8 del lote aislado..............

VI.8.2. P m e b con los sedios D y A* . .................. Vi.9. Pmb.. do crecimiento a cepas selecciondaa......

Vi.9.1. Detenuhacibn cuslit8tíva......................

VI.9.2. Dete rmiu~ ibn cueotitativa.. ................... Vi.10. ?ar1~esstaci6n.................................... VI.10.1. Primora --da...............................

Vi . lO.% Trataenionto tdnnico al g r a o de sorgo.,.......

56

37 40

41 42

42 44 46 46 49 52

52

53

55 55

56

c

c

Vi.10.3. Segunda corrida... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

VI.ll. Mediciones... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

VI.11.1. Cuantificaci6n de proteina..................

V I . l l . 2. Cuantificacidn de carbohidratos totales.. ... pstr6n construida con taninos). ........... patr6n construida con ácido t k i c o ) .......

VI.11.3.a..~Cuantificacidn de fenoles t o t d e s (curva - V1.11.3.b. Cuantificacibn de fenoles totales (curva - VI.11.4. Cu.atificacibn de taninos...................

VI1

VI11 co~cLusIoNEs...................................

IX RIco~D*aIoNI3s... . . . . . . . . . . ..................... x B.II-c1AsS.......................................

58

59

59 61

63

65

67

70

73

74

79

Las finalidades del presente trabajo son; ais lar y

eeieccionar s e p w fúngicae con actividad fenoi it ice, es

to es, cspqces de degradar conpuestos poiifenóiicoe (tg

ninon), y utilizando l a s cepas seleccionadas obtener un alimento fermentado a part i r de sorgo, a l cual se l e ig

tentar$ disminuir en l a mayor cant idd posible e l conte

nido de timinon y se enriquecer8 en su cal idad y canti-

dad protoica, mplementando para e l l o e l nitrdgeno ;r % tX'%6nte8 neCúSU"iO8.

Se a in l r r on c o p u a partir de aorgo, t i e r r a negra

y turinon condensdon, D lea qua gor+t;ariorn*nte aa l r n determind mu ospacidod ienol it lca, tambien se busc6 ea-

t o oaracteristica on oepcre proporoionsdss por e l cepa-

rio do 1aUnIrersidad Autánome letropolitlma. Laa cepas

seleccionsdí. da l oa dos lotee anteriores se emplearon

en e l proceso de fenientecidn.

E l medio empleado per% l a fewentascidn consiste de

grano da sorgo entom, con e l objeto de que l a e cepas - ut i l i sen como f w n t e de carbono l o s taninoe que se 91%-

cuentrsn l O C & i S d l O S en l a corteza del grano.

Lm humedd neceeu ia en 1- coium~as de fermenta--

cidn debe ser dol 50 $, para que l a fewentaci4n se 110

Ve a Cabo satisfactoriamente. Y considerando que el gt-2

ne de norgo no logra incorporar l a solucidn auiiciente

paca obtenor l a htuaedlia requerido, y por l o tcmto tarnAp

Co ne puodon mpiementar los nutrientes y e l i d c u l o

- 1 -

cluidoa en ese solucibn, se ap l icó un trstamiento térmico

prev io a i proceao de fermentacibn, con e l fin de aumentpr

l a capacidad de retention de l grano d e sorgo, pero Gin -- l l e g a r a l a &Iatinizacibn, ya que evto cxpondria l o s 53- midones de l grano; y siendo estos mejor sustrato para l o s

hongos, no u t i l i e a r i a n l o s fenoles como fuente de carbono.

Para l a s mediciones a determinar, se empiearon méto--

dos bastante aceptados para este f i n , y ofrecen una corifia

b l e idea de l o que ocurre durante e l proceso fermentativo.

- 2 -

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11. 1mRomcc10n.

B1 oultlvo de sorgo en M4xic0, se ha incrementado

ac-iaente'y ompa un iraportente lugar con respecto a

l a suparfiEie totai cu i t i vda , y tiene BU principal do

earrol lo en l a regi6n noroeste de l a Refiblica Eexiceb

(11.

B1 -0 do sorgo tiene entre BUS usos m l n iapor-

tautem, la olaboraei6n de forralea y concentrdoe 821-

wnt io ioe para gierado y awe de C O r T a i . Sin embargo, - se ha enooutrrdo qua auaudo so incorpora a l a dieta de

MaiaadLe8 j 6 ~ 0 , trriodideo con una elevada cantidad

triclonal de l a dm 06 beaasidto pobre* teniendo co-

intersmcidn do lorn taPinos con l e a protein- y las en- eiinaar de1 t r a t o digestivo y de l a saliva, provocriado

l a pérdida do peso por l a baja disponibilidad de l a s

proteinas de l a dieta.

de t.Pinoo (001J1UI.?ifm po i i f@d í iCQe ) , la Calidad n\G-

mo I.deUlQsb0 trlstOZ'!lOe d i g eü t i vo~ OC@8iOXladO6 por l a

Aunado a estos problearas, encontramos ciertas - desventajas en e l cultivo de determinadas variedades

do1 grsno, ;la qua e l eatas contienen una cantidad re-

ducida de taninoa, estan expuestas a enfermededee y a l a depredación por pbjaros e insectos (1).

La presente inoemtlgacidn propone e l empleo de - UM fenwntaci6n sdl lda para l a obtencido de un ali--

IROR*O, u t l l l d para e l l o Sorghum bicolor (L.) IDO-

onoh# una do 168 varioddea del greno máa difundidu,

- 3 -

L s

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en nunstro P d s , y que present- una elevada concentre cidn de tsaiims. B1 uso en l a fewentacidn, de hongos - filmmontosos coa actividad fenoiftica, no esten deatina

dos rulicsini.nte a l a d e ~ a d a c i b n parc ia l o total de l oa

taninoi dei gnmo, sino teinbien a l a producci6n de pro-

teinrr.

Y

Bd s t en d~. tipos de oultivo f ewa i ta t ivo usados - industrialmente y en laboratorios sdlidos y sumergidos.

Las difemncisa cwtn e l l o s se d a primero, a nivel de

traneferenoia d6 mesa entre medio y microorgenismo, que

crea diferentes microaabientes y consecuentemente un -- distinto comportaaiento, 'y segundo, di fsrsnciai en c u q

to a diseño op r rc idn y oontroi.

Los cu l t ims sumergidos son los sistemaa n8ir popu- lares, en este caso, l o s nutrientes se encuentran di- sueltos o en siispsnsidn en e l -&io. Los problemam di-

fueionales om menores que en cultivos superficiales, - puesto quo se puede moUifieax por e j e q l o l a agitwida, i e1 control d6 vsriabies embientaies es ed. sencillo.

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Laa ierrp.ntaoionem ediiam no aon laa m h dilisadi-

das comerci.lnnte h a b l d o , debido a que presentma me-

yores problema tie control de variables arabientales en

e l truucurn> de ma erolwidn, por ejemplo pñ, T , c o p c centrmaibn tie austrato, etc. Pero si reiriltan 1 ~ 4 8 eco-

&OM en -to ai eonmam~ de energfa, y en emte traba-

je OH) coniitituya un patato import8nte debido a l a apli-

cemibn que se pretende, demás se requiere una tramsfor

- 4 -

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macibn bioqufmica euperficiai (corteza del grano) para de-

gradar l o s taninos, ea por e l l o que en este cae0 se ha es-

cogido una fewentacibn sblida.

- 5 -

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E1 uso de microorganismos fdngicos en la producci6n

de alimentom, se ha desarrollado en todo e l mundo desde

muchos rdog atras.

B1 -do occidentai se ha distinguido del oriental

no unicmmnte en ou eituaaibn geografice o 6u8 &rupoa - etnoibgicom sino tambien en l a forms de convertir e l pl-

midbn en a d e a r f e m n t a h l e con e l propósito de hvrer - bebidas aieooholioai. Eite contraste oriente-occidente - e s t i t a b i e n ilinmtrdo por e l tipo de alimentos que son

procesadom por hongos; e4 e l occidente l o s hongo. son - u t i l í s do s p r í a o n i h i m e n t r oomo m n t r i de prooreo pri-- aic*pio en l a tratmforuoibn de proteina de la leche, m i q tras que en e l oriente lo. hongos son ueados principal-

mente para procesar f r i j o l de soja, arro%, trigo, sorgo, etc,

Bmto piede explicaree s i ae toma en cuenta l a ya - larga histor ia de1 altivo de frijol de soya en e i oriez

te , l o s serios problemem de eobrepoblacibn prevalecien-

te., j que a lpam religionee excluyen la carne de las - dieta8 aimenticias. A s í , Shibaeaki y Hesse l t iw (3) re- portan tan alimento preparado desde hace miles de a 0 8 en

Japbn, elaboradio via un proceso fermentativo que emplea

como mastrato, aieZC18S de arrbe, f r i j o l soya y sal , e l - cual recibe e1 nombre de Miso.

- 6 -

i

Otra fennentacidn tradicional del Japón, es e l X o j i ,

que u t i l i z a un proceso de dos etapas; una en que a l arroz

e s inoculado cop Aspergillus oryzae o Aspergillus soyae,

y otra en la cual se cuece y se mezcla con f r i j o l de soya

triturado y es entonces inoculado con Sacharomyces rouxil .

El S h o p y el Tempeh, son alimentos m& ampliamente - conocido8 por e l mundo occidental. E l primero e8 un slimes t o líquido, que emplea en su transfonnacibn e l hongo A s p ~

g i l l u s o r y a m , a 18 levadura Hansenula sp y a l a bacteria

Lactobacillus 8p, Bn un laboratorio E escala este proceeo

requiere u11 mfniao do 37 horae y rinde 2.5 galones de Sho-

JP par aadr 5 libru do fri jQl aaja. este slimon% o. rioo an g r d o s cantid.ll.8 de msInoQcido8, entro a l l o s 01 h i d o

g iuthioo . E1 mguido, es un elimento originario da Indone-

sia que ai igual qw e l -pa y e l Miso es hecho enteraoea t o da f r i j o l da -ya. En l a prepsracidn del Tempeh se em- pioa 01 PhJcoeicrafo Bhiaopae, oligosporus, y en contraste - con los otros áliantos monoiondoe e l Tempah es produaido

on un rango de tiempo mb corto.

r

Como sst.cr f o rwntsn i aee existen mohaa otrw que e=

p i a m en su procee.iriento alguna var ied4 de hongos, COPIQ.

por ejemplo; e l Ontjom alimento de l este de 1s India que - u t i l i s a especies de A8pergillua o Rhiaopus, e1 Meitaues - del este do Aais, que usa en su preparacidn a l mucor Rei-.-

tabs, sinónimo de actinomcor eiegana.

En i o que d sorgo BO refiere, en Nigeria e l O g i de - sorgo ea un dimonto tradicioaiL destinado al consumo in-

fantil. Heeseltina y colabordores (4 ) ensilaron semilla - - 7 -

.-

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comercial de sorgo blanco inoculada con Rhizopus oligosporus

para mejorar BU contenido proteico.

Se ha buscado mejorar l a calidad de las dietas a base - de sorgo, mediante e l reforzamiento de aminoácidos, adici6n

de concentrados proteicos, germinacibn de l a semilla y por

fennentaci6n sdl ida y sumergida del grano, pero no existen - antecedentes de algún alimento que u t i l i c e un proceso via -- fermentativa y conjuntamente supere los problemas de tipo f&

eioldgico provocado por l a presencia de fenoles, en l a corn--

poaicidn química del grano, y se enriquezca en su cal idad y

cantidad proteica al alimento obtenido.

.-

Si him, debido a I n implantaoi6n de tdcnicar modornne

para e l desarrollo agrícola, se puede proporcionar parcial-

mente l a denisnga de alimentos que d o con año se increments

en nuestro P d e . La elaboracidn de alimentos fermentados -- con ~p i i aac ibn rural para consumo a n i m a l , ea otra posibili-

dad que encierra gran interda dedos l o s grandes volumenee - de productos sgricolaa que se destinan actualmente para di-

cho consumo.

IV. OBJBTI~OS. I_

1. Aislamiento de cepas fdnglcas, a partir de grano de

morgo, t i e r r s negra y taninos condensados naturales.

.-

2. Seleccidn do cepas filigicas con capacidad de degra-

dar taninos, de un lote proporcionado por e l cepac-

r i o de l a Unlvereldad Autdnoma Metropolitana y de - otro oonrntitui.de por lan quo h r i i i aldi> atalailam.

3, Llevar a cabo una fennentaclbn sdl lda en e l grano - de mrgo entero, para d iminuir en l a mayor canti--

dad posible e l contenido de tenino., que Be locali -

z m en l a corteza del grano, y conjuntamente enri--

quecer en proteins gL alimento obtenido, euplemen-

tando para e l l o l o s nutrientes necesarios.

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- 9 -

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v. DOS.

V.I. Selección de oepse con actividad fenolftica.

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V . l . l . Medio de oultivo A, (selectivo).

AgW...... ................. 3.4 g

Yea& Nitrogen Base........ 1.34 g

Tsninoo ( 7 l . 7 $ pureza).... 1.0 g

1. Dimlvmr *midoe aforaudo a 100 ml.

2. Solubl l1.u ager y YElB dorardo a 100 nl.

3. Ajumt.a 01 p€I a 4.5, en ambas soluoioneo, oon E1 0.1 1.

4. Biectuar tm trdSt.iiiento térnico con vepor de agua por ,

d~parldo de 1- .o lwicnes anteriores, duranto 10 minu- toa a 15 la/in2. I

5. meralar abaa iloiucioras a 43 OC, (mantener en ~o de

agpa a em temperature).

Distribuir 10 ml do1 medio en cajaa patri. 6.

- 10 -

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v.i .2. Bedio de cultivo A ' , (control) . I.

Re activos ;

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1.

2.

3.

4.

Glucosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 .0 g

Agar............................ 3.4 g

Yeast Nitrogen Base. . . . . . . . . . . . . 1.34 g

Procedimientos

Diaolver dorando a 200 d.

Ajustar pH a 4.5, con HC1 0.1 Ip.

Ester i l i za r l a solución, durante 15 minutos a - 15 lb/in2.

Distr ibui r 10 ml del medio en cajas petri.

- 11 -

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IC I'

V.1.3. Medio de cultivo B, (selectivo) .

Reac tivosr c

Sulfato de Amonio................... 0.2 g

Extracto de Levadura... . . . . . . . . . . . . . 0.1 g

Fosfato Dipotdsico... ............... 0.1 g

Cloruro de ca lc io . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.02 g

o i o n u ~ , da soaio..................,. 0.02 g

hgmr................................ 2.4 6

Taninoci ( 7 l , 7 $ pureed. . ........... 1.0 g

Procedimientos

1. Disolver los taninaa dorando a 100 ml.

! 2. So lubi l iear reactivoa restantes aforando a 100 &l.

3. Ajustar e1 pE a 4.5 en mubaa soluciones, con HC1 0.1 A.

4. Efectuar un trstmiento t6naico con vapor de agua por

separado de 1- soluaiones anteriores, durante 10 mi-

nutos a 15 l b/b . 2

5. Mezclar ambas soluciones a 43 OC, (mantener en b a o de

agua a esa temperatura).

6. Distr ibui r 10 ml del medio en cajas petr i .

- 12 -

. . . . .

’ . I

V.1.4. Mediorde Cult ivo C, para prueba de crecimiento.

Reactiooe:

sorgo ibtoro.......................... 8.0 g

Agria Dedllda........................ 15.0 ml

Procedimientos

1. Colocar e l sorgo entero en un8 ca ja petri.

2. Aiiadir e l egua destilada.

3. &juetar e1 #i a 4.5, con HC1 0.1 N.

4. Efectuar un tratioaiento térmico en futoclave durrrnte 2 5 minutos a 15 lb/in .

13 - I : -

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...

. . . .

",.. . V.1.5. Medio de cultivo D, (selectivo).

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I

React ivoa i

Agar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4 g

.- Yeaat Nitrogen Base.. .......... 1.14 g

Acido T W c o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.0 g

1. Disolver l o a reaotivos dorando a ZOO mi.

2. Ajuatax e l pFI a 4.5, con RC1 0.1 N. .-

3. Efectuar un tretamiento térmico en autoclave durante

10 minutos a 15 ib/in2.

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4. Diatribuir 10 ml de l a soiucl6n en cajaa petri. ,-

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V.1.6. Medio de Cultivo E, para prueba de crecimiento,

ñeactivosr

Sulfato de &nonio... . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.2 g

Extracto de Levadura ................. 0.1 g

Fosfato dipotAsico.... ............... 0.1 g

C l O ~ O de ca lc io . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.02 g

Cloruro de Sodio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.02 g

Tsninom (71.7 $ pureza). ............. 1.0 g

Prooediniiento:

2. Disolver tmlnes dorando a 100 mi.

2. Dimolver reactires restantee aforando a 100 ml.

3. A j u e t a r pü a 4.5 en -baa soluciones, con HC1 0.1 H.

4. Bfectwr t r n t d e n t o t6w ic0 , por separaüo, a las sol-

oionee anteriores, en autoclave durante 10 minutos a - 1 5 l d i n 2 .

l e e c l a r amb- solucionee a 43 OC, (manteniendo en ba&

de agua a esa temperatura).

Diatr ibuir 10 mi tie l a aolucibn en cajas petri .

5,

6.

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V.2. Aislamiento de cepas a p a r t i r de sorgo. c .

V.2.1. Técnica I. . . C .

React i v o s :

,-- Sorgo entero. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 g .-

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Agua destilada... . . . . . . . . . . . . . . . . 100 mi

Procedimiento:

1. Colocar e l grano de sorgo en un matra% y agregar el - agua destilada.

2. Ajwtar e l pH a 3.5, cota HC1 0.1 N.

3. Someter l a mezcla anterior a ebull icibn, durante x) - minutos, con e l f i n de aseptizar.

4. D i v i d i r l a mezcla en cuatro porciones p colocarla8 en

matracea Srlenmeyer de 250 mi.

5. Adicionar 10 g de sorgo entero, s in ningún tratamien- to previo.

6, Incubar l o s matraces a 35 Or:, durante 7 dfas.

- 1 6 -

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..... .I_.__. ..

V.2.2. Técnica 11. . , .. .

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2. Se a g ~ e g 6 una g o t a de Tween 83, con e l f i n de eniulsifi

C a r ,

3. Se a justd e l pH a 3 . 5 , con HC1 0.1 N.

4. Se a g i t 6 en un vdrtex d u r m t e 1 5 segundos.

.-

5. De e s t e tubo se tomaron azadas para i n x x i a r cajas pe-

tri con l o s medios A , A' y B.

O 6. Las cajas se incubaron a 35 C durante 7 dfs.s.

- 17 -

V.3. Aislamiento de cepas a p a r t i r de t ierra.

V.3.i. Técnica 111. c.. .

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Re ac t i v o s I

Tween 80

Agua dest i lada

Acido clorhfdr ico 0.1 N T i e r ra negra

Medios de cu l t i v o A, A * y B

Procedimiento 1

1. Se colocaron 2 g de t i e r r a en un tubo de ensaye con 25 ml de agua destilada.

2. Se agregb una gota de Tween 80.

3. Se txjustd e l pH (f 3.5, con HC1 0.1 N.

4. Se agit6 en un v6rtex durante 1 5 segundos.

5. Se tomaron azadas para inocular cajas petri con l o s

medios A, A' y E.

6. Las cajas ae incubaron a 35 OC, durante 7 d i u .

I

- 18 -

V.4. Aislamiento de cepas a par t i r de taninos condensados.

- 8

.. ..,

V.4.1. Técnica IV.

Reactivosr

Tween 80

Agua destilada

Acido clorhfdrico

Taninos condensados (71.7 % de I n i r e d

Medios de cultivo A, A' y B.

Procedimiento t

1. Colocar 2 g de taninos en un tubo de ensaye con 25 ml

de agua destilada.

3. Ajustar e l @ a 3.5, con HC1 0.1 R.

4. A g i t a r en un vArtex durante 15 segundos.

- 19 -

5. Tomar azadsa para inocular cajas petr i con l o s medios

A, A' Y B.

O 6. Las cajas se incubaron a 35 C , durante 7 dias.

... v.5. Permentaci6n.

V.5.1. Medio de cultivo F. C“ .

React ivo s I

Sorgo entero... . . . . . . . . . . . . . . . . 160.0 g

Sulfato de amonio .............. 4.7 g

Posfato monopotAsico........... 2.7 g

Acido clorhídrico... . . . . . . . . . . . 0.1 N

Procedimientos

I -

I ...

c

l - 1 ....

I ” ”

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Mezclar los reactivos aforaado a 320 ml.

Ajustar el PfI a 3.5, con ?E1 0.1 N.

Llenar las coluamw con 20 g de l a mezcla, cuidando que

e1 grado do comgactaci6n sea e l mismo.

incubar en un b a o ae agua a 35’~.

Ajustar l a aireacibn con un Redidor de flujo, y conec--

tar l a sa l ida de1 a i re al absorbedor de C02.

i

Medir periodicamente e l consumo de NaDH.

- 2 0 -

i - t b ._.

v.5.2. Medio de cultivo G , (para producción de inócuo ) .

I ieac tivos I

Suifato de a m o n i o . . . . . . . . . . . . . . . . 4.7 g

Fosfato monopotásico..... ........ 2.7 Q

Harina de s o r g o . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100.0 g

A g u a . . . . . . . . , . . . . . . . . . . .......... 230.0 g

Procedimientor

1. Mesclar todoe l o s reactivos.

2. Ajustar e l pH a 3.5, Con &cid0 fosfór ico 0.1 N. i

1 I

3. Repartir en mstraces de 250 “u, (aproximadamente 20

g de nodo que quede una capa delgada en el fondo).

4. E s te r i l i s a r en autoclave, durante 30 minutos a 15 - lb/in2.

- 2 1 -

c .

v.5.3. Conteo de esporas y cantidad de in6cuio.

Reactivos8

Agua destilada.. .............. 150.0 I%€

Tween 80...................... 0.5 EU

Procedimiento t

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7 .

8,

9.

Agregar los reactivos al matrai que contiene e l in6-o.

Agitar 1 5 minutos con agitador -6tico.

Filtras en gasa al vacio.

Hacer una diluci6n 1820 con egua destilada.

Llenar l a chars de Neubauer con l a dilucibn, usando - una pipeta Pasteur.

Contar l a s osporas de 10 cuadros al a%*, obsexwmdo - en e l microscopio con e l objetivo de 4CZ.

Obtener e l promedio de esporas por cuadro.

Multipl icar este proaedio por e l factor de conversidn - 25 X lo4, y por la dilucidn hecha.

Se desea tener una cantidad de 2 X 10 7 esporas por gramo I I de sorgo, asf, para 100 g se sorgo, se deben tomar ----

2 X 10 esperas. Entonces; se debe d i v i d i r e l niimero de

esporas que se desea, entre e l número de esporas que se

tiene, lo que nos d a e l número de ml a emdear.

9

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V. 6. Mediciones.

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f ". .__ c-

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c

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c.

r-

...

L.

V.6.1. Monitoreo del crecimiento, (evolucidn de COZ).

Procedimientos

2' para lo c u d se pasa por un pre-humidificador l leno de

solucidn de sosa 4 N.

1. E l a ire que entre al equipo deberá estar l i b r e de CO

2. La sa l ida de a i re de l equipo se conecta a un recipien-

t e her1a4ticanente cerrado conteniendo inicialmente -- agua destilada, qua fu4 llevndn a un pH de 11 oon una

solucidn de N d H 1 R. B1 pH es mantenido constante por

un controlador autom4tico marca New Brunawick Scienti-

fic,.

3. A1 disminuir e l pH en l a solucidn, por disolucidn del

CO:, en e l recipiente, e l controlador accione una bomba

p r i s t á l t i c a que bombea una solucidn de NaDR 0.5 N de2

do uaa probrtn cuidadosamente tap&ia.

4. Se mide periodicasante e l consumo de l a probeta.

5. Se coloca un temometro decimal en e l centro del equi-

po y en e l -o externo, para observar l a evolución de

temperatura debido a laa reaccione8 metabdlicas del -- hongo, se hacen lecturaa periodicamente.

I ,..

F

- .

r - .

I ...

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.... - 23 -

.

V.6 .L . Determinnci6n de humedad.

a). Método del peso seco.

1. En un c r i so l a peso constante, colocar de 1 a 2 g de

muestra y pesarlo on balanea analítica.

2. Colocar en l a estufa a 50-60°C por 24 horas.

3. Colocar en un desecador durante una hora, para que se

enirie,

4. Pesar e l c r i so l nuevamente.

5. Por diferancia de pee08 ca icu iar el $ de agua.

b). Y6todo con tolueno.

Se pesen 2.5 g de mueetra 0n un matraz redondo. Se - añaden 75 ml de tolueno, y se cai ieeta en una pa r r i l l a de

tal forma que la destilacidn sea de tres got= por s e e

do. E1 prooeso se COntinUS hasta que ya n? heya condensa-

ción.

c t constante equivalente a 0.98.

- 24 -

' 7 .

: ...

-- I

. .~

-,..

V.6.3. Determinacidn de proteina.

Método de Lowrg (5).

Xeactivosr

Solución AI D i l u i r 20 g de carbonato de sodio en un l i t r o de NaOH 0.1 N.

Solución R I D i l u i r 1 g de sul fa to de cobre en 100 - de agua destilada.

Soluci6n C I D i l u i r 2 e; de tartrato de sodio y pot+ s i0 en 100 ml de agua destilada.

Reactivo de Polin-Ciocaiteo, d i l u i r l o 112 con appa

dest i lada ai momento de usarlo.

Soiucidn cstandard con caseina. En un matra5 afora-

do de 100 mi, aolubi l i ear un g de caseina, aforar - con eolucidn de NaDH 0.1 N; hacer una di lución ---- 31100 (ooncentraaibn f ind. 300 Y&nl)

C u r v a patr6nr

Tubo O 1 2 3 4 5

Sol. Est. (nu) 0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8

Agua Dest. (ai) 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2

conc. (Wd O 30 60 120 í ao 240

6

1.0 I o. o

300

- 2 5 -

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Procedimiento:

1, Hornogenizar 0.5 g de muestra en 10 ml de agua destilad:%, tomar 1 ml y llevarlo a 100 mi de agua destilada, tomar 1 ml y hacerle el maisis (0.5 mg rnuestra/ml),

2. A 1 ml de muestra, adicionar 1 ml de NaOH 1 N y calen- tar en baiio m a r i a durante 5 minutos.

3. Enfriar loa tubos en bafío con hielo.

4. Preparar una aolución en la siguiente proporci6ns 50 a de soluci6n A, 1 ml de 6oluci6n B, 1 ml de solucidn C - (calcular la oantidud necesaria de solución), y adicio- nar 5 m i a cada muestra agitando enseguida.

5. Colocar en obscuridaü durente 30 minutos.

6. Adicionar 1 idl de l~ soluci6n de folin (Ir 21, agitar en un vórtex, y colocar en la obscuridad durante 30 minu--

tos.

I 7. Xedir absorv-cia a 750 run.

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- 2 6 -

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V.6.4. Determinacidn de carbohidratos (6).

m6todo de l a antrona.

3 e act ivos 1

Antronar D i s o l v e r 200 mg de antronn en 100 m l de --- ácido sulfúrico al 95 6, mantener e l reactivo frío.

Soluci6n estaudardr Disolver 5 g de giucosa en un -- l i t r o de agua destilada.

Hacer una dilución lSlOO a i momento de utilizarla.

Curva patr6ns

Tubo O 1 2 3 4 5

Sol. Est. (mi) O 1 2 3 4 5

Agua dest. (idl) 5 4 3 2 1 O

Cono. wgl/iai) O 10 20 30 40 50

Procedimientos

1. Hornogenizar 0.1 g de m e s t r s en 10 mL de agua destila-

da, tomar 1 mi y iievaXio 8 250 mi de agua destilada, tomar 1 ml y hacerle e l d i e i s (0.04 mg muestra/ml)

Bn tubos de ensege anohos, preaerv8doe en baño de hie-

l o a O O ü , conteniendo 5 ml de antrona (reactivo) frío, añadir con ouidado y resbalando por lae paredes 2.5 mi

de muestre (conteniendo da 10 a 50ffg/niL) de adca res

to tdee .

2.

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r-

3. A g i t a r con cuidado, calentar en bafío marfa durante 10

minutoe.

4. Enfriar en b a o de hielo.

5. Medir absorvancia a 625 nm, comparando con la curva - patr6n.

- 2 8 -

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L-.

V.6.5.

Método del complejo a& de prusia.

Determinación de Fenoles t o t d e s (7)

a). ütiiizando tw ino s como reactivo para l a curva patrbn.

React ivos I

Acid0 c lo rNdr ico U 1 $ en metanol.

c i ~ r u r o f4rric0 0.1 E, disuelto en HC1 0.1 H.

Taninos condensados, (n.7 $ de pureza).

Procedimiento a

1. Se prepara una 80luoibn stock, 139.47 mg de teninor, di- sueltos en H C l al 1 $ en metanol, sforando a 100 d..

2. Se f i l t r a l a soiucidn resultante, y a part ir de e l l a ae

preparan diluciones, variando la concentracidn de 10 a

15OAdmi.

3. Se a g r e g a 3 nii do l a solución de cloruro f6r r ico 0.1 ll

y 3 ml de ferrocianuro de potasio 0.000 U. Se de ja rep2

sar 10 minutos. I

I 4. Leer abaorvancia a 720 nm.

-.. I

I

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~ . , .

b). Util izando &ido tbnico como reactivo para l a curva ps-

tr6n.

React ivos s

Acido clorhidrico al 1 % en metanol.

Cloruro férrico O . l M , disuelto en HC1 0.1 N. Acido tbico .

I

Procedimiento a

1. Preparar una soluci6n stock de 100 mg de ácido tánico en

100 mi de dcido clorhídrico a l 1 $ en metanol.

2. Preparar diluciones de 1 a 3.5 mtdml .

3. Agregar 3 inl de l a sqluci6n de cloruro f é rr ico y 3 ml de

ferrocianuro de potasio 0.008 M. Dejar reposar 10 minu--

tos.

4. Leer abbsorvancia a 720 nm.

5. E l ajuste a cero me llev6 a cabo con una dilucidn prepet

rada de l a mism amera pero omitiendo e l &ido t h i c o .

- 30 -

I

L .

I . . .1 .

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V.6.6. Deteminsci4n de teninos (7, 8 y 9).

Wtodo Vainillina-X1.

ReaotiYo m;

HC1 dL 1 $ en m e t a l

HC1 al 8 $ en metano1

Vaini i i ina ELI 4 $ en metano1

Taninos condensados (71.7 $ de -sa)

Procedimiento:

1. Preparar ma soluci4n con 139.47 mg de taninom dorando a 50 mi, en una solucfdn de H C 1 al 1 $ en metenol.

2. Preparar diluciones con concentracionea desde 0.2 a 2.0

ne;/pi.

3. Preparar e1 reactivo W-lkcl, que es una ao luc lh Ir1 de

M l al 8 $ en metano1 Y vaini i i ina al 4 $ en iwtmoi - (se preparó en s i momento de usarse).

4. Tomar 5 mi del reactivo W-1 y 1 mi da crda ailuaibn,

y transfer lr loa a tubos de ensaye. D e j P reposar duran-

te 20 mizlu*oa.

5. Leer absorvaola a 525 nm.

- 31 -

c- .

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. ,-

V.7. Deacripci6n de l equipo para l a fcrmentscidn (2) .

- 32 -

VI. RESULTADOS.

I

I_-

c . r.,. . . .. .

V I . l . Diagrama de f l u j o de actividadee, para e l eielamien-

to y eeiecci6n de cepas con caracteristica fenoliti-

ca.

Aislamiento de - cepas a partir - de sorgo, t i e r r a y taninoa conde2 SadOS..

. .,. - . .. . .-

_.I

. .

.. .

Deter&nar acti- dad fenolftioa en cepas aisladas, - utilieando los e dios de c u l t i v o - A , A * Y B.

I Corroborar a c t i G dsd feno l f t i ca en cepas aialadae, - utilieando medios de cultivo D y A * .

Cepas pertenecientes a l cepario de l a Un& veraidad Autónoma me tropo1 it ana.

-

I De ternin& actividad fenolíticm en ooptie proporcionada6 por - l a U N , utilizarulo - l o a wdioe de culti- vo A, A* y E.

- 33 -

Corroborar 1 actividad

fenoi f t ica en cepas proporcionadae por - l a UAM, utilieando - lorn medios de culti - vo D Y A * .

I . Cepar uiecoioaadai oon actividad feno- if tica.

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I .

I PrU8baS de crecimiento para cepas selecciona- das, utilizando e l me- d io de cultivo C.

I Deteminaci6n gravime- t r i c a de micelio en ce pas seleccionadas, u t i lizando el' medio de -- cultivo E.

- 34 -

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Vi .2 . Cepas proporcionadas por e l cepario de l a Universi-

dad Autbnoma Metropolitana,

Número (en e l cepario)

6

8

10

11

1 2

13

15

20

21

25

27

31

32

38

Descripci6n

Ab,~ergi l lus niger

Rhizopus sp

Aspergillus niger (0ene- gal)

Aspergillus awamori

KO ji (Jafene France)

Aspergillus sp

Aspergillus ep

Xhizopus oligosporus

Neurospora sit ophiia

Monilia s itophi ls

Aislado de ensilado do col

Aspergillua ap

- 33 -

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VI.3. Diagrama de f l u j o j a r a . l l e v a r a cabo le, fementa--

cidn con cepae seleccionadas con actividad fenolf-

tica.

L l e v a r FI cabo la fermentaci6n con cepas selcccions dao con Retivi-- dad fenol it ica.

I Efectuar mediciq neo 8 evolucidn de COZ Pro te ina humedad carbohidratos taninos f enoie s t o t s l e s

cinética micro-- bisna consumo de tani- noe. armento de pro-- teina

- 3 6 -

V1.4. Aislamiento de cepas a part i r de sorgo.

. ..

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L"

VI.4.1. Utilizando l a técnica I

1. Se prepararon 4 matrnces Erlenmeyer de 250 ml con

l a técnica descrita.

2. Transcurrida l a fermentacidn se h i z o una revieidn

ai microwopio y una observacidn macróecopica.

3. Datos obtenidos.

Unicemente meron aisladea 2 cep- fúne;icae.

a). Observacidn ai microscopio.

Doscripaibn

T d o fil-ntoa

Pimento filmen%os

Smperficie filamentos

Cepa # 1

largos largoe

negativo ll8gatiVO

Uepa # 2

lieí l i s a

- 37 -

--. . r-

b) . Observaci6n macrosc6pica.

Descripcidn Cepa # 1 Cepa i< 2

Forma de colonia redonda redonda

Borde continuo continuo

Elevación cdncava cóncava

Textura opaca opaca

Superficie algodonosa aigodonosa

Figmen tací6n negro-verdoeo verde

Para dist inguir embas cepas aisladas, Be Les otorg6 un nombre I

~

en base a l a s in ic ia les de BU pígnientací6n.

Cepa# i

Cepa# 2

Pigmento Nombre

Negro-Verdoso wv

Verde V

- 38 -

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Vi.4.2. Uti l izando l a técnica 11. e-

... .

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.. .

P..

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.-. m-.

1. Se prepararon 8 cajas pe t r i , dos por cada medio ut i -

l izado.

2. Transcurrida l a fennentaci6n, se hizo una rev is idn - al microscopio y una observaci6n macrosc6pica.

3. Datos obtenidos.

Unicamente se ais16 una cepa f h g i c a .

a). Observaci6n a l microscopio.

Descripcidn Tammio f i l m e n t o e

Pigmento fi lamentos

super f ic ie f i lamentos

b) . Observacidn rnacrosc6pica.

Descripci6n

Forma de l a colonia

Borde

Elevnc i6n

Textura

Superf ic ie

P i gement ac i6n

Cepn n i a i n d n

cor to .: negativo

rugosos i

Cepa aislada

i r regular

discont inuo

convexa

opaca

rug0 sa

blanc o

Como en e l caso anter ior a esta cepa tambien se le d i 6

nombre en base a l a i n i c i a l de BU pigmentacibn.

Cepa &dada

Pigmento

blanco Nombre B

- 39 -

r-

VI.5. Aislamiento de cepas a par t i r de t ierra .

... . VI.5.1. Utilizando l a técnica 111.

1. Se prepararon 8 cajas petr i , 2 por caüa medio utili-

zado.

-_ c

....

2. Transcurrida l a fermentación, so hizo una revisldn - ai microscopio y una observación macroscopica.

3. Datos obtenidos.

No se 10-6 aislar cepaa que presentaran buen creci--

miento, el cual f'u4 practicamente nulo en micalio. Aunque

se observó abundancia en esporas.

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-40-

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I -

VI.6. Aislamiento de cepas a partir de taninos condensados.

VI.6 .1 . Utilizando la técnica I V .

1. Se prep8raron 8 cajas petri, 2 por cada medio u t i l i -

zado.

2. Transcurrida la fennentaci6n, se hizo una revisión - a l microscopio y una observación macroscópica.

3. Datos obtenidos.

No w pudieron aislar cepas con buen crecimiento, h u b

abundante prosencia de espor-, y muy poco micella. Tatabien

se observd oontrainaci6n oon bacterias.

- 41 -

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VI.7. Seleccibn de cepas con mt i v idad f eno l f t i ca .

V i . 7 . i . Prueba a cepas aisladas, con los medios A, A' y B.

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b .

I .

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.. ...

1. Determinar actividad f eno l f t i c a en l a s cepas aisla-

das de l sorgo; N, MI y B.

Se p r e p m n 18 ce j e s p e t r i con los medios A, A' 9

B. Probemdo alaSr cepa y cada medio por duplicado.

3. Se inocularon e incubaroe a 35 C , durante un perio-

2.

O

do de 7 dim.

4. Sa hicisron observacionee al microecopio de &leea-- alba.

Cepa Biedioe de cu l t i vo A A' B

V B + + + + + + I - + + + -

B x + + + + M - + + + -

Nv E + + + M + + + + + + + + +

+ + + Muy abundante

+ + Abundante

+ Poao - Negativo

-~

E EsponLLación

Y Mice l io

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- 42 -

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I,*

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Bi abundante crecimiento presente en e l medio de cui-

t ivo A* de las t res cepas probadas, se debe a que a8 trata de un medio de control con fuentes de elementos comunes y

digerible6 a todos l o s microorganismos f h g i co s .

La preerencis de taninos condensados, como fuente de - carbono en los sirdios de cultivo A y B, convierte a estoe

en medios selectivos.

E l amplio desarrollo de la cepa NV, indica que posee

actividad fanol it ice, como unn de 811s carrrcteristicea en - esta prueba preliminar.

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VI.7.2. Prueba a cepas aisladas con l o s medios D y A ' .

1. Determinar actividad fenoi i t ica en las cepas aisladas

del sorgo iV, Iw y B,

2. Se prepararon 12 cajas petri con los medios D y A ' ,

cada cepa y cada medio por duplicado.

3. Se inocularon e incubaron a 35 OC, diirante un periodo

de 7 dfaa.

4. Se hicieron observaciones a i microscopio de disección.

5. Datos obtenidos.

Ceps Medios de cuitivo

D A' v E + + +

P - + + + B O + + + +

M L + + + ir0 E + +

M + + + + + +

+ + + H v abundant.

+ + Abundant..

+ Poco

- No gat ivo

E Esponilaci6n

Til íüicelio

- 4 4 -

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P-

En este caso se utilizd un nuevo medio de cultivo selectivo conteniendo como fuente de carbono ácido t& nico. Y además el medio de control.

Se observa tembien, que l a cepa cap42 de emplear

como fuente de carbono a los fenolee (ácido tbico), - es la denominada W aislada del sorgo.

Se puede concluir que de laa cepas aislades, as - que mrá ooasidorada ai l levar a cabo la fermentaoibn para cuantificar la capmidad degradativa de taninos. Debido quo pnment6 meJor demarrollo en mu creoirnien t o .

- 45 - I

VI.8 . Seleccidn de cepas con act iv idad feno l f t i ca . r.. . .._. .

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VI.8.1. Prueba a cepas proporcionadas por e l cepario de

l a UAM en medios de cu l t i vo A, A' y B.

1. Determinar actividad f eno l f t i c a en las cepas pro--

porcionadaa por l a DAM.

2. Se prepararon cajas p e t r i c m los medios A, A' y B.

3. Se inocularon e incubaron a 35 OC, durante un perio - do de 7 dha .

4. Se h ic ieron obeervacionee al microscopio de dieec--

cibn.

5. Datos obtealdos.

a). Corri.de # 1.

no. da cepe Medios de cu l t i vo A A' B

1 5 E + + + + + + M - + + + -

8 E + + + + Id - + + + -

20 E + + +

6 E + + + + + l0 + + + + + + + + +

M - + + + - 1 2 E + + +

I + + + + + + + + +

I -- I

j p

i- - 46 -

__

Corrida # 2.

Cepa No. M A

dios de milt

A'

.vo B

n E + + + + + I - + + + -

38 E + + + M + + + + +

31 E + + + + + 1 - + + + +

11 B + + + + m - + + + +

32 E + + + I + + + + + + + + +

13 E + + + + + H - + + + -

25 E + + + + lm + + + + -

10 E + + + + ll + + + + -

27 E + + + + + M + + + + +

+ + + Muy abundante E Esporulacldn

+ + Abundante M ülicelio + Poco

- Negativo

- 47 -

.-

I

Despues de transcurrido. l a fermentncibn, en l a primera

corrida se aprecia que e l mejor crecimiento en l o s medios - selectivos A y B l o obtuvieron l a s cepas 1 2 y 20.

En l a segunda corrida l a cepa preliniinmente seleccio - nada con actividad feno l i t i ca es l a número 32.

Todaa la0 cepas tuvieron buen crecimiento en a l medio

d e control A'.

- 4 8 -

-- .

I

j , -

VI.8.2. Prueba a cepas proporcionadas por e l ceperio de

l a U M en medios de cultivo D y 8 ' .

1. Determinar actividad fenol it ica en cepas proporciz

nadas por l a UAM.

2. Se prepararon c a j m petr i con l o s medios D y A'.

3. Se inocularon e incubaron a 35 OC, durante un pe-

riodo de 7 días.

4. Se hicieron observaciones al. microscopio de disec-

ci6n.

5. Datos obtenidos.

a). Corr ida # 1.

No. de cepa Medios de cultivo

A' D

E + + + Y + + + -

6

E + + + a Y + + + - E + + + + bf + + + + E + + + M + + + + E + +

I 10

11

12

+ + + + + + 11

... i ! .".. - 49 - i -

P

.- .

I

b). Corr ida # 2.

No. da cepa Medios de cultivo A' D

13 E + + ld + + + -

15 E + + + 111 + + + +

20 E + + Y + + + + + +

21 E + + H + + + -

25 E + + + + M + + + +

n E + + + + P + + + +

31 E + + Id + + + -

32 E + +

30 E + + Y + + + - Id + + + + + +

+ + + abundlmte

+ + Abundante

+ Po00 - Nogrtiro

E Eeponilacibn

11 Mioel io

L

c

' C

c

En esta segunda prueba de confirmacidn de actividad - fenoi í t ica en iae cepas proporcionadas por l a UAM, u t i l i z ag

do un medio selectivo con ácido t h i c o como fuente de cwbg no, l a s cepas seleccionadas son; l a s ndmeros 12, 20 y 32. - todas con buen crecimiento.

. .

- 51 -

Y"

c x

c

- .

.-

VI.9. Pruebas de crecimiento a cepas seleccionadas.

VI.9.1. Detenninaci6n cualitativa.

1. Pruebas de crecimiento a cepas seleccionadas "v, 12,

20 Y 32.

2. Se prepararon cajas petr i con el medio C.

3. Se inocularon e Incubaron a 35 O C , durante 10 dire.

4. Se hicieron obsrrvaclones al microscopio de disec-

ci6n, a los 7 y 10 dise de fementacibn.

5. Datos obtenido..

a). 7 dfR8 de fennntmibn.

Todas Ire cajsa presentaron gran esponilacl6n, y e1 cre-

cimiento Be los hongos se apreciaba en e l lfquido forma-

do, constituyendo polimalas Be micelio.

b). 10 dfaa de fermentacibn.

Transcurridos 10 dfas de fermentacibn, el crecimiento de

l o s hongo8 se encontró en l e superficie del grano. Las - cepas con mayor cantidad de micelio fueron; l a aíslade - del sorgo (IW), y l a ndmero 32,

- 52 -

.- 8 . I

~ "'I . V i . 9.2. De t eminacidxi cuantitativa.

, ....

c-

-.,.

c

r-

..,..

m-

i

L"

-""

. .

1. Determinar gravimetricemrnte el crecimiento en las ce-

pas seleccionadas Hv, 1 2 y 32.

2. Se prepararon 4 matraces de un l i t r o con 200 mi. del -- medio de cultivo E.

3. Se inoculó con solucidn de esporas (1 ml) y ae incuba-

ron bajo agit;acibn a 30 OC, durante > dha.

4. E1 mioelio se f i l t r ó en papel Wattman # 2 y se secd en

estufa a 70 OC e l papel m á s e l micelio.

5. Datoa obtenidos.

a). Hongo NV

Peso papol filtro............................ 1.2472 g

Peso papel f i l t r o + micelio.................. 1.3891 g

Peeo del micelio............................. 0.1419 g

b). Hongo # 20

Peso papel fi ltro.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2i76 g

Peso papel f i l t r o + micelio.................. 1 . 3 8 6 g

Peso del micelio............................. 0.1010 g

c). Hongo # 32

Peso pap1 fi ltro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2l53 g

Pew pup.1 filtro + micelio.................. 1.3275 g

Peso de1 miceiio............................. 0.1122 g

- . -.

c

L-

c

L

- 53 -

d). Hongo # 12.

Pea0 papel f i l tro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1484 g

Peso papel f i l t r o + micelio.............. 1.2472 g

Pea0 miceiio,............................ 0.0988 g

Este experimento cuantitativo, aunque no nos d ice nada

acerca de l a cinetics del hongo, s i nos permite reafirmar - en cierto modo i a idea de l a caracteriatics de actividad -- f eno l i t i ca mostrada en las cepaa seleccionadas que eupersron

les pruebaa que se aplicaron a l l o t e de cepss aieladas y a - las proporcionadaa por e l cepario de l a Urn. Se denota tam- bien un orecimiento similar en l a e ouatro cepaa, obeervando- ee mejor en l a s oepas IiN y l a n h r o 32.

. - 5 1 -

VI.10. Proceso de fermentación.

V I .10,1. Fermentaci6n (primera corrida).

1.

2.

3.

4.

5.

Preparar un lote de 8 columnas con l as cepas seleccio-

nades, dos por cada una, suplementar con 01 medio de - cultivo ?.

Ajustar e l pA do 3 a 3.5, aireaci6n en la8 columnas de

4 a 6 It/& y mantaner una humedd de l 50 $ en las co-

l-.

Inocular y de ja r correr 1s fermentacldn mientras no se presente esporul aci6n.

Tra8owi r lb r l a formentaoi6n l l evux a cabo lan medioip

nos.

Datos obtenidos.

Ho se pudo ofactuar l e fermentación, debido a quo 01 -- grano do sorgo no a ~ o r p l d l a solucl6n noceasrir para obto-

zmr 18 huwüaci de1 50 $, d e d a de quo an ens soluol6n ae on . . cuantrao dimeltom loir nutrfontes suplementados y el indculo. .

- Por lo tanto 80 huoo lmprascíndlble encontrar la forma -

da Intagrsr dicha soluctibn a3 grano de sorgo empecdo an lu coiuanarr.

Bn v l s t s da1 p r o b l a u mterlor me procedi6 8 intentrr un t r r t rdanto tdrriao ril grew de sorgo y provocw .si una ma-.- j o r incorperaoiópp, y r a a i i z a r más satisfactoriamente e l procz so fermentatlw.

- 55 -

r

.. , . ...

I.-

....

VI.10.2, Tratamiento de l grano de sorgor

1. Tratamiento t4rmico de l sorgo, para resblandecer l a - corteza del grano y lograr una mayor absorci6n, pero - sin l l e g a r a l a gslatinizacibn.

2. Tratamiento termico a diferentes tiempos y a la tempera

tura de ebull icidn de l agua, con e l fin de seleccionar

e l tiempo m&e adecuado.

3. Se colocaron 10 g de sorgo entero en 20 ml de agu8 des-

tildl5.

4. Loa experimsntos ea hicieron por duplicado en cada t i a s

po probado, determinendo e l porcentaje da humeded find..

5. Datos obtenldon.

1 1 Tiempo (min) Peso del sorgo trs- $ humedad

todo escurrido ( g ) final

5 5 10

10

15 15 20

20

25

25

60 60

14.06

14.0

14.2

14.15 15.0

15.0

15.25

15.20

15.6 15.5 17.45 17 40

~

23.4 I

23.3

23.6

23.5

25.0 25.0 , .

25.4 25.3 L

26.0 26.0 . ,

29.0

29.0

. .

c

0 % -

1 *._ i i - 1 , . ..

._ .

Para e l c á i m o de1 poroentaje de humedd f ina l se - utili56 l a siguiente f 6 r w l a .

w* = Peao del sorgo tratado eacurrido.

u** Peeo del sorgo s in tratamiento.

w* * * 5 Pea0 del agua destileda.

Densidad de l agua a 1.0 g/iPi.

Como 68 obmerva .a l a tabla anterior, nobra l a colum- n i de poroentaje de huiwdd final, l a rnbimm huwdmd 80 -- ob t i em ouando e l grano es t ratado teripicslaente durmte n

una hora, pen, en este 0-0 .e aelcciodl 01 t i e i p o de trac

t d e n t o de 1 5 minutos, con humedad f i na l del 25 $. -- Considerando que deopuh de esa temperrtura, se detect6 - geiatini5aci6n en e l grano, y esta iitusci6n podrir favoq oer e l ataqtae fikigico 8 l o 8 almidone6 do1 grano, niendo - e8t .h~ mejor emt8trato carbonedo que l o a compuestos polifend

l ioga, l o carsl nos deeviaria del objetivo principal do ea-

t s trabajo.

Por o t r a parte, despu4s de l trataniento t(lrmic0, el - grcrpo ee dejd en repoeo en l a soluoidn durante 24 ñoraa, - paro no se spreoi6 n+ aunmnto importeate en la huiwdrd fiad..

n .

- 57 -

I-

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V i .lo. 3. Fementacidn ( s e w d a corrida).

1. Intentar l a fermentacibn con e l grano de sorgo pretrsc

tado (15 minutoe).

2. Preparar 0 columnas con iaa cepas aeieccionadaa, dos - por c&a ma, suplementar con e l medio de cultivo F.

3. Ajustar e l pH de 3 a 3.5, aireaci6n en l a a columnas de

4 a 6 lt/lw, mantai1.r l e humedad de l 50

nas.

4. Inoouisr y dejar correr l a fermentación mientras no se

presente eaporulación.

en l a e c o l 9 I

5. Truiaourrida la fement<ici6n l l e v w R QRhO Inn mndioia

nes.

6. Datos obtenidos.

a). Se present6 escurrimiento t o t a l en l a s columnae.

b). Se observ6 ausencia tota l de micelio en l a s columnae.

c) . En l a aolución escurrida, retenida en un matraz, tampo-

co ae detect6 presencia de micelio.

d). Al observar al microscopio l a soluci6n escurrida unicec

mente se aprecluron esporas.

e). En observacidn al microscopio del peno de sorgo empa-

do en l a s columnae, ae aprecien muy pocas eaporas.

f). A l r e t i r a r l a femsntación, se encuentra una humedad - final da1 5 $ en las coiumnaa.

- 58 -

*.. .. .

.“-

VI. 11. Mediciones.

c

c

I

VI. 11.1. Pro t eina;.

Curva patrónr

Concentraci6n ,

,cid* Absonrancia

30 60 120

180 240

300

0.015 O. 051

0.111 0.180 O. 239

O. 295

1‘ = 0.999

A = 0.001C - 0.0128

C = 1000 A + 12.8

Muestra O 5004g

Volúmn = i ml

$ protainr 3 c ( i 0 0 ) / w , w s Peso muestra/ml

$ protalnm P (lo00 & + 12.8) 100/500

$ proto inn - 200 A + 2.56

r = coeficiente a. co~=ralenidn C = Concantraoibn A = Abwrriacla

....

*I

c

L_

r-

.- ' I C

... c

/ -

..-.

- ,

Se anai i~6 una muestra de harino de sorgo, antes de

l l e v a r a cabo l a fermentación, con e l f i n de establecer

un punto de comparaci6n in ic ia l .

Se prepard una muestra de harina de eorgo se& e l

método descrito; con e1 siguiente resultado.

Absomancia............................. 0.0322

Concentraci6n proteinadg/nil.. .......... 45.0

$ proteina .............................. 9.0

-60-

I VI .11.2. Carbohidratos totales.

. ...

c

c.

-.

r.

.... .

C u r v a patrdnr

Concentracidn Absorvancia

rldd

10 0.187 20 0.367 30 0.547 40 0.720 50 O. 870

r = 0.990

A = OaC172 C + 0.0225

c = 58.1395 A - 1.30ai3 Muestra = 40Ag

Voldmen = 1 mi

% carbohidratoa = C (~oo)/w , w a peso m u e s t r d d

$ carbohidretos = (58.1395 A - 1.30813) 100/40 k carbohidratos = 145.34 A - 3.27

61 -

j c

r-. . - . _ <

c

....

c

La determinacidn de carbohidratos totales a una -- muestra de harina de sorgo, previamente a l a fermenta-

ci6n erro j 6 los siguientes resultados.

Absorvancia............................. 0.5729

Conc. carbohidratosde;/mi.. .............. 32.0

5 carbnhidratos.. ....................... 80.0

0 62 - L

I-.

._ . I

VI.11.3.a. Fenoles totales (utilizando taninos condensados

para l a curva patrbn).

Curva patrbna .. ."

n

.... F

.... r..

.....

r""

."

.- I-

c-

Concentracidn Ab- o man c i a

Ada 20 0.088

40 0.173

60 O. 233 00 O. 305

1 O0 0.378

1 25 0.506

150 O. 533

r = 0.998

A = 0.0039 C + 0.00356

C 3 256.41 A - 0.9130

Muestra s 5OOOAg

V0ldm.n 3 1 ml

SS fenolee = C ( i O O ) / w , w = Peso nueatra/d

$ fenolee = (256.41 A - 0,9130) 100/50oo

$ fenolee = 5.1282 A - 0.01826

..

-".

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.....

c

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...

I -

....

e..

... I C"

1 .

-.-

Se determinaron fenoles totales en harina de sorgo, an-

t e s de efectuar l a fermentacibn. ntilizando parllmetros de -- una curva patrdn construida con taninos condensados.

La muestra analizada se prepar6 hornogenizando 0.6 g de

harina de sorgo en 1 2 ml de HC1 a l 1 $ an metanol. Tomando

i ml para and iear ( 5 mg mueetrdd ) .

Absorvancia............................. 0.513

Conc. fenolesAfdnU... ................. ,130.6 5 fenolas tota les . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.617

I

- 6 4 -

I

Vi.11.3.b. Fenoles totales (utilizando ácido t h i c o para

l a curva patrbn).

...- . Curva patrón3 ._

r -

L_.

c

"..

i_

c".

I - I - "

Concentracidn

4dmi

Abeorvanoia

10

15 20

25 30 35 40 45

0.195 O. 275 O . 365 0.450 0.526 0.625

0.710 0.800

r = 0.999

A = 0.0175 C + 0.0173

C 57.142 A - 0.98857

Muestra = SOOkfg

Volben = 1 mi

$ fanoles = c ( i 0 0 ) / w , w = Peso Pniestrdd

$ fenolee = (57.142 A - 0.98857) 100/500

$ fenolea P 11.428 A - 0.197 I

- 65 - 1

...

L"

,

i ...

"- I " ...

....

Se lleva5 a cabo una segunda determinaci6n de fenolea to- t a l e s , en harina de sorgo s in fermentar, pero empleando par&

metros de una curva patr6n construid:a con ácido tánico.

La muestra se preparó homogenizando 0.5 g de harina de

sorgo en 10 a i l de HC1 &l 1 $ en metanol, tomando 1 ml y l l e -

aándolo a 100 ml de HC1 ai 1 $ en metanol. Tomar 1 mi pare

analizar, (0.5 mg muestrdml).

Absorvancia...t.................... 0,244

Conc. fenoles totalesdg/ml.. ...... 13.0

$ fenoies totales.................. 2.59

I

....

".."

,

I , ' ' , 1 ' -- '

- 6 6 -

* t i _.I-". .... ~-

tTt.11.4. Taninoe.

Curva patrdnr

Concentracidn

o. 2

0.4 0.8 1.2

1.6

2.0

0.048

0.108 O. 207 0.342

0.475

0.598

r = 0.999

A = 0.3072 C - 0.0211 C = 3.2552 A + 0.06868 bbestra I 50 mg

Volúmen 1 mi

$ tanihos = C (IOO)/W , w = Peso uuestrdml

% taninos = (3.2552 A + 0.06868) 100/50

% teninos = 6.5104 A + 0.13736

Absorvancia

- 67 -

....

, ._. Se determin6 el contenido de taninos en harina de s o r g o I i I_ - * s i n fermentar, con el método descrito.

- . Se prepar6 una muestra hornogenizando 0.5 g en 10 mi de

HC1 ai 1 $ en metanol. Tomando 1 ml para anal izar (50 ng de

muestra/d). -.

Absorvancia........... ............ 0.362

Conc. taninos mej/mi.. ............. 1.25

% taninos ......................... 2.49

I -- ' ~ . .

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- 68 -

-_.

c .

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.-

c

L.

Cuadro resúmen del contenido de feno les t o ta l e s en el grano

de sorgo s i n fermentar.

Método

Vi.10.3.a.

V i ~ 0 . 3 . b .

Porcentaje

2.612

2.59

Considerando los resultados anteriores, e l método del

complejo az& de pruoia con las dos variantes incluidas, - da una buena aproximaci6n de l contenido de fenolee t o ta i e s

y una forma. de corroborar datos obtenidos por ente mdtodo.

Cuadro reailmen de los analisis practicados al sorgo antes

de fermentar.

Descripci6n Porcentaje

Pro te ina 9 .o Carbohidrato8 t o t a l e a 80.0

Fenoles t o ta l e s (Vi.10.3.a.) 2.612

Fenoles t o ta l e s (VI .lo. 3 .b.) 2.59

T aninos 2.49

I

r- - 69 -

V I1 DISCUSION

..._

w..

-.,.

.... , .- ....

_. i ' - I

a).

1.

2.

3.

4.

5.

Seieccidn de cepas con actividad fenolit ica.

LOS medios de cultivo (A y ñ), para seleccionar ce-

pas, desempeñaron muy bien su papel, diferenciando-

se perfectmeate l o a microorganismos que presenta-

ron actividad feno l i t i ca de l o s que no poseian esta

caracteristica.

E l medio de cultivo (D ) , conaiderado en este caso - para reafirmar conooimienbo de actividad fenol i t ica

en las cepas, tambien periaitib oon c lara diferencia oorroborrr por s e w a ocasión la ospaoidad buroada.

DeepuBa de aplicar t o d a las pNebas a las cepse - aisladas y a las que proporcion6 e l cepario de l a - IJAM, 80 observa que las que tienen actividad fenolA ticit eon las nheroe; 12 , 20, 32, y l a que fu6 ai-

l ada del sorgo designada con las siglarr NV.

La cepa a is lada del sorgo y denominada MT, se into2

t6 c l a s i f i c a r l a se& sus caracteristicao, y parece

que se trata de un tipo de aapergillue.

Las prueba8 de creciiniento aplicadas a l a s cepas - seleccionadas, proporcionan una idea intuitiva de - l e actividad fenol it ica de 108 hongos, debido a que

crecieron en una cantided gravimetrica einiilar, aún

ouando se encuentran en una fuente cerboneda como - l o s fenoles.

I

- 70 -

II ̂ .

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, . . ' -

-I

.." ~. .. I.

- . -I

b) . Fermentacibn. 1. Cusndo se intent6 la primera fermentación se present6

el problema de la no incorporaci6n al grano de la ao-

lucibn, que contiene los nutrientes suplementados y - el in6cd0, por io que no se concluy6 con ella.

Es requisito en principio, que l a humedad en la Colug na sea del 50 96, y que se incorporen l o s nutrientes - suplementados y el inbculo.

2.

3. El trrttemiento del grano de sorgo, previo a la segun- d a fementacibn, se llev6 a cabo para aumentar l a c&

yncidsd de retonci6n de hiuaednd d e l grtmo.

4 . La sebwndn fermentnci6n ue cractu6, con l n o m e j o r e s - condiciones de humedad en las columnas, aplicando a l

(grano e l tratamiento indicado.

5. La falta de crecimiento de los honeos en las columnas posiblemente se debe di escurrimiento de los nutria- tes suplementados y de la0 esporas contenidas en el - in6cuío.

La ausencia de micelio detectada en la columna proba- blemente se debe al mecanismo de defenea del hongo, - por falta de un medio ambiente adecuado pare desarro- llarse, y a que permanecieron muy pocas esporae de- .. pu4a da1 escurrimiento.

6.

I

- n - e

, * !

._. C.<.

I-

7. La ausencia de micelio observaea en la soiuci6n es- currida, colectada en un m t r n z , quizá obedece a l a

falta de una fuente de carbon:,.

La humedad find del 5 $ en las columnas, después - de la fermentaci6n, se debe ai escurrimiento totdt ocurrido, y a el paso del aire através de la coium- n* W e graduamente fue disminuyendola.

8.

- .

- 72 -

VIII. CONCLUSIONES.

1. LOB medios uti l izados para seleccionar l a s cepas con

actividad fsnol i t ica proporcionaron una buene fonaa

de diferenciaai6n de esta caracteristica.

2. Las cepas con l a capacidad de degradar fenoies, son l a s números; 1 2 , 20, 32, proporcionadas por e l ce-

pari0 de l a UAM y l a ais lade del sorgo denominada - MI, que probablemente se treta de un t i p o de -per- gi l lus .

3. E l tratamiento t6nsIao a l grsno de aorgo, durMts - 15 minutos a l a temperatura de ebulllaidn del agua,

no fu6 mxfiaiente para lograr que e1 grano de sorgo incorporara l a solucibn, hasta obtener una humedad

del 50 $ durante l a fereisntación.

4. Ea necesario mantener constante l a humedad en l a ap

lumne y e1 contacto de los nutrientes suplementados

e in6cui.o con e l grano empacado en la coluaaa, para

que se l l eve a cabo l a fennentacibn.

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- 73 -

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c-

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1. Considemdo l a ausencia de crecimiento duraate l a

ferwnhel6n, debido a l a faite de ague, y ril es- curriiolento de nutrientes e indculo en l a s colta+-

nas. Se recomienda dimefiar un equipo que meatenga

l a humedad y raciroulecl6n da nu t r i a t e a e inbmlo.

2. Se sugiera up diseflo de equipo descrito enseguida,

papa l o cmal se recoiPieNa l l eva r a cabo l a s *ti- vidadea que se menoionan.

8). Compieinentmr e1 d i ~ f % ~ harit8 obtener un. d e -

cuadcr ~ c i r o u l a 0 1 6 n de l e soiuoibn.

b). Optimiscrr condiciones hidráulicas y de pm8io-

aes ea e l equipo.

c). E f e c h e diferentes fermentaoiones, pera opti-

isisar condiciones de fermentación uon reap.cto

al equipo.

d). Efectuar lae fermentaciones con la0 cepas se-

ieociona&w y l l ewrr a cebo l a s mdicione8 in-

dicad-, para finalmente deterniinar cinética - de creaimlento y consumo de sustrato.

- 74 -

n

col- de f er~entacibn

ESQUEMA NO. 2

r-7

entrada de aire hacia e l matraz

/ de

poleas @?3 .

- 76 -

aire

La idea de funcionamiento sobre e l diseño de e l

esquema no. 1, se concreta a l o siguiente8

1.

2.

3.

4.

E l e v a r l a soiuci6n escurrida, que se encuentra en e l

matraz colector, hasta e l depósito de almacenamiento

aplicmdo 1q presión necesaria, mediante l a introduz

cidn de a ire a l matraz.

Llenar e l depbeito de almacenamiento con l a solucidn

escurrida.

Detener e1 tiempo suficiente l a introducci6n del -- aire, para permitir que se vacie el depdsito de ai- macenamiento.

Repetir 1011 pnnoi uiterlor*ri, oontinircunento, duran-

te l a fewentacibn.

Considerando el procedimiento descrito anteriomez

te, ee necesario acoplar un mcenismo, regulado automa-

ticamente que real ice aada uno de los pasos en e l tiem-

po adecuado logrando con eeto, mejores condiciones para

l a fementacidn, en cuanto a disponibilidad de nutrien-

tee, oxigeno,agua e indculo en l a s columnae. Para ello se sugiere el mecanismo ilustrado en e l esquema no. 2,

que funciona de l a siguiente maneras

1. Cumdo el or i f i c i o de l a esfera coincide con e l de - l a entrada de aire hacia e l matraz, el aire ejerce - l a preeidn necesaria para elevar l a solucidn.

- 77 - . - . -~ .-

r- * ...

.... h

...

._ .

2. Cuando el dep6sito de almacenamiento (esquema no. 1) se encuentra l leno, el motor hace girar lentamente - l a esfera, interrumpiendo la entrada da aire, io --- cual permite que l a solucidn descienda escurriendo - através de laa columnas de fermsntacibn.

3. La esfera debe tardar en su giro el Liempo suficien- te, para que se vacie el depósito de almacenamiento, antes de permitir que penetre nuevamente el aire,

- 78 - -_ -I_

X.

1.

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