LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI KULTUR JARINGAN

Disusun Oleh:

Nama: Dean Rudolph P. L.NIM: 135040201111355Kelompok: M2 (Senin, 9.00 WIB)Asisten: Visna Dwi ArisandiProgram Studi Agroekoteknologi

Fakultas Pertanian

Malang

2014BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta menumbuhkannya dalam keadaan aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman utuh kembali. Konsep awal dari kultur jarngan adalah diketahuinya kemempuan totipotensi dari sel tumbuhan.

Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu adanya usaha sterilisasi peralatan yang akan digunakan dalam proses kultur.1.2 Tujuan

Adapun tujuan dari praktikum kultur jaringan ini yaitu agar mahasiswa dapat mengetahui teknik teknik perbanyakan tanaman secara in vitro, tata cara penyediaan bahan tanaman untuk kultur jaringan, tata caa sterilisasi media biakan dan alat untuk kultur jaringan, serta mengetahui proses perbanyakan in vitro.BAB II TINJAUAN PUSTAKA2.1 Tinjauan terkait Kultur Jaringan dan Macam Teknik Kultur

Kultur jaringan memiliki beberapa macam teknik, diantaranya yaitu sebagai berikut: 1. Meristem kultur, yaitu salah satu cara dalam teknik kultur jaringan tumbuhan yang menggunakan eksplan(bagian tanaman) berupa jaringan muda atau disebut juga meristem. Teknik ini dapat dilakukan pada kultur meristem melinjo, 2. Pollen atau anther kultur, yaitu salah satu cara dalam teknik kultur jaringan yang menggunakan eksplan berupa serbuk sari atau benang sari tumbuhan,3. Protoplast kultur, yaitu merupakan salah satu teknik kultur jaringan yang menggunakan eksplan berupa protoplast ( sel hidup yang telah dihilangkan dinding selnya),4. Chloroplast kultur, yaitu merupakan salah satu teknik kultur jaringan yang menggunakan eksplan berupa cloroplas dengan tujuan untuk memperbaiki sifat tanaman dengan membuat varietas baru, dan 5. Somatic cross atau persilangan protoplasma, yaitu merupakan salah satu teknik kultur jaringan yang berupa penyilangan dua macam protoplasma menjadi satu, kemudian dikulturkan secara in vitro dalam medium sehingga menjadi tanaman yang mempunyai sifat baru. (Leo Anjar Kusuma, 2000).2.2 Penjelasan mengenai eksplan dan syarat eksplan yang baik1. Pemilihan eksplanEksplan adalah bagian dari tanaman yang digunakan dalam kulturisasi. Eksplan ini menjadi bahan dasar bagi pembentukan kalus (bentuk awal calon tunas yang kemudian mengalami proses pelengkapan bagian tanaman, seperti daun, batang, dan akar). Sebagian eksplan sebaiknya dipilih dari pucuk muda tanaman dewasa yang diketahui asal-usul dan varietasnya, tidak terinfeksi penyakit, dan jenisnya unggul.2. Penggunaan media yang cocokMedia yang cocok memengaruhi pertumbuhan eksplan yang telah ditanam untuk menjadi plantlet (tanaman kecil). Media yang baik, harus memenuhi syarat nutrisi yang diperlukan eksplan untuk tumbuh dan berkembang. Oleh karena itu, di dalam media kultur jaringan ditambahkan berbagai macam mineral, vitamin, sumber karbohidrat, dan zat pengatur tumbuh (hormon).3. Keadaan yang aseptik dan pengaturan udara yang baik.Semua tahapan yang dilakukan dalam kultur jaringan harus dilakukan secara aseptik. Hal ini guna menghindari kontaminasi oleh jamur maupun bakteri. Oleh karena itu, sterilisasi eksplan ke dalam medium dilakukan di dalam laminar air flow cabinet untuk mencegah kontaminasi. Penyimpanan kultur juga harus di dalam ruangan dengan suhu, pencahayaan, dan pengaturan udara yang baik.

(Ferdinand,2009)2.3 Macam-macam sterilisasi alat, bahan dan eksplan.Sterilisasi dapat dilakukan dengan cara:

a. Sterilisasi dengan pembakaran Alat-alat yang terbuat dari logam dapat disterilkan dengan cara memanaskan atau membakar di atas lampu spirtus. b. Sterilisasi dengan udara panas/keringAlat-alat dari gelas seperti cawan petri, erlenmeyer, tabung piala, botol eksplan, tabung reaksi dan sebagainya dapat disterilkan dengan udara panas (oven) pada suhu 130 160o C selama 1 2 jam. Alat alat ditata tidak terlalu rapat agar sirkulasi udara antar tumpukan alat dapat berjalan lancar, sehingga semua alat dapat disterilkan dan dapat dengan mudah dijaga kesterilannya saat dikeluarkan dari alat sterilisasi.c. Sterilisasi dengan uap panas (basah)Bahan atau alat dapat disterilkan dengan uap panas atau secara basah pada uap panas biasa atau uap panas dengan tekanan tinggi, secara terus menerus (kontinyu) atau secara terputus putus (diskontinyu), khususnya medium pada suhu atau tekanan yang rendah. Untuk sterilisasi dengan cara ini sering kali menggunakan otoklaf. Sterilisasi medium biasanya dilakukan pada suhu 121oC dengan tekanan 1 atm selama 15-30 menit, namun untuk medium yang tidak mudah rusak dapat dilakukan pada suhu atau tekanan yang sedikit lebih tinggi.d. Sterilisasi dengan bahan kimiaBahan kimia tertentu sering digunakan untuk sterilisasi alat maupun bahan. Etanol 70% sering digunakan untuk sterilisasi permukaan pada alat yang sering dikombinasi dengan pembakaran pada api. NOCl (natrium hipoklorit) dan formalin juga sering digunakan untuk sterilisasi permukaan atau disinfestasi permukaan atau disinfeksi permukaan.e. Sterilisasi lingkungan kerja

Lingkungan kerja untuk teknik kultur jaringan dapat dibagi atas lingkungan umum dan lingkungan spesifik. Lingkungan umum adalah ruangan transfer secara keseluruhan, sedangkan lingkungan spesifik adalah lingkungan didalam laminar air flow cabinet dimana proses penanaman eksplan dan prosedur lain seperti isolasi protoplasma dilakukan.

f. Sterilisasi alat-alat dan media

Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting, gagang scalpel, petridisk, botol-botol kosong, jarum suntik untuk isolasi meristem dan pipet untuk memindahkan suspensi sel.

Media dan aquades juga disterilkan dalam autoclave.Untuk aquades sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya elemeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoclave pada suhu 1210C. g. Sterilisasi bahan tanaman

Pada setiap jenis tanaman, ditemukan juga kontaminan yang berasal dari dalam jaringan tanaman, terutama bakteri.Bakteri-bakteri ini sampai sekarang belum diidentifikasi.Kontaminan internal ini sangat sulit diatasi, karena sterilisasi permukaan tidak menyelesaikan masalah.Pada bahan tanaman yang mengandung kontaminan internal, harus diberi perlakuan antibiotik atau fungisida yang sistemik. (Zulkarnain, 2009)2.4Penjelasan mengenai Kontaminasi pada Kultur Jaringan

a. Kontaminasi Cendawan

Kontaminasi cendawan hanya terjadi pada 1 MSP dan 2 MSP. Kontaminasi cendawan terjadi pada eksplan yang kurang steril dalam proses sterilisasi baik di lapang maupun dalam Laminar air flow cabinet. Kontaminasi cendawan juga terjadi karena kurang sterilnya peralatan yang digunakan untuk menanam.

Persentase eksplan yang terkontaminasi cendawan adalah 8.69 % dari seluruh eksplan yang ditanam. Keadaan ini menunjukkan bahwa metode sterilisasi yang diterapkan sudah cukup baik dalam mengatasi kontaminasi cendawan. Pada penelitian Marulanda dan Isaza (2004) mengenai teknik sterilisasi pada heliconia, jumlah kontaminasi cendawan mencapai 13.3% hingga 73.3% pada berbagai metode yang diaplikasikan. Eksplan yang terkontaminasi cendawan berubah menjadi coklat kehitaman dan akhirnya mati. Cendawan cepat sekali berkembang biak, d alam 7 hari hifa sudah menutupi seluruh permukaan eksplan. Jenis cendawan yang menjadi kontaminan ada beberapa macam, namun sebagian besar memiliki ciri hifa berwarna putih yang menyerupai rambut halus.b. Kontaminasi Bakteri

Persentase eksplan terkontaminasi bakteri cenderung meningkat setiap minggunya. Jenis antibiotic menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap persentase eksplan yang terkontaminasi bakteri pada 6, 9 dan 12 MSP. Chlorampenicol nyata menekan kontaminasi bakteri bila dibandingkan dengan cefotaxime dan ceftriaxone.Chlorampenicol berdaya jangkau luas pada bakteri baik gram positif atau gram negative.

Chlorampenicol memiliki masa stabil yang panjang, aktifitasnya menurun 50% dalam 290 hari pada temperatur 20C (Seckinger, 2004), oleh karena itu hingga 12 MSP antibiotik ini tetap aktif dalam menghambat pertumbuhan bakteri. Persentase eksplan terkontaminasi bakteri pada perlakuan ceftriaxone pada 3 MSP cenderung rendah dan tidak memiliki perbedaan yang nyata dengan jenis antibiotik lain. Pada 6 MSP persentase kontaminasi bakteri semakin meningkat dan nyata memiliki persentase eksplan terkontaminasi bakteri terbesar, hal ini disebabkan oleh semakin menurunnya aktifitas antibiotik. Pada 3 MSP, antibiotik dengan konsentrasi 500 mg/l tidak memiliki perbedaan yang nyata dengan konsentrasi 1000 mg/l. Persentase eksplan yang terkontaminasi bakteri pada perlakuan 1000 mg/l lebih kecil bila dibandingkan dengan perlakuan 500 mg/l, perbedaan ini nyata pada 6 MSP dan 9 MSP .Kenaikan persentase kontaminasi bakteri dapat disebabkan oleh adanya resistensi bakteri, karena dalam konsentrasi hingga 1000 mg/l, bakteri tetap bertahan hidup. Bahan kimia dan nutrisi yang digunakan dalam media kultur jaringan bukan media yang tepat dalam pertumbuhan bakteri (Leifert dan Cassels, 2001). Jika bakteri tetap saja tumbuh, berarti telah terjadi resistensi bakteri, dimana bakteri dapat bertahan dalam kondisi kekurangan nutrisi untuk hidupnya (Gunawan,1992).BAB III METODOLOGI3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 AlatPinset

: Untuk mengambil sampelSkalpel

: Untuk memotong bahanPetridish

: Wadah / tempat membuang carrierLAFC

: Tempat melakukan kulturSprayers

: Untuk menyemprotkan larutanMata pisau: Untuk memotong ujung organGelas Ukur: Untuk meletakkan larutanBotol Kultur: Sebagai tempat mediaSaringan

: Untuk menyaring larutanSpatula

: Untuk mengambil media kulturBunsen

: Untuk mensterilkan media 3.1.2 BahanTunas

: Sebagai tanaman yang akan di kultur

Deterjen: Untuk membersihkan bahan dari kotoran

Bayclean: Untuk memutihkan bahan kultur

Aquades: Untuk pencampuran bahan

Fungisida: Untuk mencegah tumbuhnya jamur

Etanol (C2H5OH) 70%:Sebagai bahan dalam media kultur organ. Dan juga untuk mensterilkan bahan kultur agar tidak terjadi kontaminasi dari bakteri dan jamur.

3.2 Cara kerja

3.2.1 Sterilisasi eksplan

3.2.2 Penanaman eksplan

BAB IV PEMBAHASAN4.1 Hasil Pengamatan

NoHari, Tanggal pengamatanDokumentasiKeterangan Pertumbuhan

117-11-2014Tidak ada pertumbuhan tunas dan tidak ada kontaminasi

219-11-2014Tidak mengalami pertumbuhan tunas baru. Tidak ada kontaminasi

321-11-2014Tidak mengalami pertumbuhan tunas. Tidak terjadi kontaminasi

424-11-2014Tidak mengalami pertumbuhan.Tidak mengalami kontaminasi. Warna mulai berubah kuning kecoklatan

28-11-2014Tidak mengalami pertumbuhan tunas. Tidak terjadi kontaminasi. Warna berubah Kuning kecoklatan.

4.2 Pembahasan mengenai kondisi pertumbuhan eksplan selama pengamatan (dibandingkan literatur)

Kondisi perkembangan dari minggu ke minggu tidak mengalami pertumbuhan. Perkembangan tetap saja sama seperti biasa atau bisa dikatakan gagal. Kondisi eksplan hanya berubah warna menjadi coklat kekuningan yang disebut browning.Menurut literatur (Susilowati, 2001) Mikroorganisme terdapat di berbagai tempat seperti tanah, debu, air, udara, kulit dan selaput lendir. Mikroorganisme dapat berupa bakteri, fungi, protozoa dan lain-lain. Mikroorganisme mudah terhembus udara dan menyebar ke mana-mana karena ukuran selnya kecil dan ringan.

4.3 Pembahasan factor penyebab keberhasilan dan kegagalan kultur (dibandingkan literatur)

Penyebab dari kegagalan pertumbuhan tanaman eksplan ini mungkin berasa dari bakteri atau virus yang menyebar melalui udara, alat/bahan yang tidak steril, serta alat pemotong eksplan yang masih panas. Menyebabkan tumbuhan gagal tumbuh dan menyebabkan browning. Mikroorganisme dapat menyebabkan banyak kerusakan. Sumber kontaminasi dapat berasal dari eksplan tumbuhan, organisme kecil yang masuk ke dalam media, alat yang tidak steril dan lingkungan kerja yang kotor. Sehingga harus dilakukan: sterilisasi lingkungan kerja, alat-alat, media dan bahan tanaman (Gunawan, 1988 dalam susilowati 2001).

BAB V PENUTUP

4.1 Kesimpulan

Dari kegiatan pratikum ini dapat disimpulkan bahwa dalam melakukan kultru jaringan harus banyak melihat berbagai aspek untuk membuat tanaman tersebut hidup, seperti udara, alat dan bahan harus steril serta cara pemotongan menentukan tingkat keberhasilan eksplan.4.2 Kritik dan Saran

Semoga pratikum kedepannya terus lebih baik.DAFTAR PUSTAKAKusuma, Anjar Leo.2000. Teori-teori Kultur Jaringan Materi

.jogjakarta : UGM. Ferdinand, Fictor dan Moekti Ariebowo. 2009. Praktis Belajar Biologi untuk Kelas XI Sekolah Menengah Atas /

Madrasah Aliyah Program Ilmu Pengetahuan Alam.

Jakarta: Pusat Perbukuan Departemen Pendidikan

NasionalZulkarnain, 2009. Kultur jaringan Tanaman Solusi Perbanyakan

Tanaman Budi Daya. Jakarta: Bumi Aksara.Potong pucuk tanaman krisan secara miring sesuai kebutuhan

Masukkan ke dalam botol yang telah berisi detergen 10% dan kocok selama 5 menit, bilas air mengalir

Masukkan ke dalam botol yang telah berisi chlorox (bahan aktif NaOCl) 30%, kocok selama 10 menit, bilas dengan aquades dan bilas air mengalir

Masukkan ke dalam botol yang telah berisi fungisida, rendam selama 5 menit bilas aquades

Masukkan ke dalam botol yang telah berisi aquades steril dan masukkan ke dalam LAFC

Potong bagian bagian eksplan

Tanam semua bagian tadi kedalam MS (tidak menancap hanya menempel)

Tutup botol kultur dengan plastic atau alumunium foil

Ikat dengan karet (nb: mulut tutup botol dipanaskan terlebih dahulu)

Lakukan pengamatan 3 hari sekali selama 2 minggu

Dokumentasi ke 2 botol kultur (lihat yang terkontaminasi)