DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E ING QUÍMICA

INSTITUTO TECNOLGICO DE SONORADDEEPPAARRTTAAMMEENNTTOO DDEE QQUUÍÍMMIICCAA EE IINNGG.. QQUUÍÍMMIICCAA
DETERMINACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES ÓPTIMAS DE
FITORREGULADORES AUXINA Y CITOCININA: EN HOJA, TALLO, Y YEMA AXILAR PARA LA PROPAGACIÓN MASIVA DE PALO
FIERRO(Olneya tesota).
INGENIERO BIOTECNOLOGO
AGRADECIMIENTOS
de Sonora, por darme la oportunidad de formarme como profesionista, y por
las facilidades que me dio para realizar esta investigación.
Tineo, gracias por su apoyo y confianza en la realización de esta
investigación.
participaron en la investigación como asesores y revisores M.C. Mucio
Osorio, M.C Alejandro Javalera Rembao y M.C. Amada Tamayo, así como al
Dr. Marco Antonio Gutiérrez, a todos gracias por apoyo.
Gassós Ortega, le agradezco toda su gran ayuda que me dió desde el inicio
de mi carrera. Por igual a todos los maestras que me impartieron materias;
M.I. Iram Mondaca, Margarita Ramos, Q. Jorge E. Cabrera Pinto, por citar
algunos, gracias por haberme transmitido sus conocimientos durante mi
estancia en la universidad. A Mariano Esteban Coyito y Don Panchito.
Ba., Diana Shaid, Yulenin, Roberto, Román, Marcelo, Guadalupe Chávez.,
Sugey, Maritza, Paco, Aron, Max, Rochin, Angélica.
Bojorquez, así como a mis sobrinitos; My-Leyna Furi “Flor Itzel” y el Enano
“Raulito” los quiero mucho.
Ramón Camarillo y por su puesto que al nuevo integrante de la familia.
Quintero Mármol, gracias por todo su apoyo.
compañeros de escuelas, ITSON, Gaby y Ramón (compadres) Patricia
Angulo, Flor Alcantar (brujita menor), Humberto, Max, Aron, IIiana, Griss,
Cintia, Hilda, Nina, Nadia (bruja), Anacenit (Chapis) ITLM, Alejandra, Luis,
Edgar, Pedro, Sandra, Selenia, Erika, Gladis, Lulu, Joel, Nadia, Ely, Johana,
COBAES, Helio Q., J. Oros, Martha Ca. Nelsson, Fabián, Luz, así como ha
Alba Lucia, Erika, Eduardo G., Rogelio canto, David, liban Montes de Oca.,
Tomas A. ha todos ustedes gracias por haber compartido su tiempo, he
aprendo de todos, los quiero mucho.
DEDICATORIAS
A Dios por darme la oportunidad de vivir, y por ayudarme a realizar una de mis
metas en la vida. Porque contigo señor todo es posible.
A mi madre a este ser que siempre a luchado por darme lo mejor, porque a sabido
ser padre y madre a la vez, me has dado todo con el único interés de que siempre
sea feliz gracias por todo.
A mis hermanos Chayito, Flor, Betty, Hortencia, Nilo y Marlene, ustedes con los que
he aprendido a luchar y a enfrentar nuevos retos, los quiero mucho.
A José G. Márquez, porque llegaste a mi vida justo cuando más te necesitaba,
gracias por todos los momentos hermosos que me has regalado.
El presente trabajo de investigación “Determinación de las concentraciones optimas
de fitorreguladores auxinas y citocinina: en hoja , tallo y yema axilar para la
propagación masiva de palo fierro “Olneya tesota” forma parte del proyecto de
investigación de cultivo de tejidos vegetales y fue asesorado por la Ing. Lorena Tineo.
ÍNDICE
10
1.2 Causas y consecuencias de especies en peligro de extinción en
México........................................................................................................................................ 10
NOM-ECOL-059-2001”.......................................................................................... 11
1.4 Principales factores no biológicos que afectaran al desarrollo del
cultivo in vitro........................................................................................................................... 15
1.4.1.2 Requerimientos nutritivos para el crecimiento
in vitro............................................................................................................ 16
in vitro............................................................................................................. 17
1.7 La temperatura. ................................................................................................................... 23
in vitro............................................................................................................................. 25
FASE 0: Preparación de la planta madre..................................................... 27
FASE l: Establecimiento del cultivo en condiciones de
asepsia........................................................................................................ 28
los explantes........................................................................................... 29
1.9.3 Propagación por cultivo de tejidos vegetales............................................... 30
1.9.3.1 Cultivo de tejidos organizados............................................................. 30
ll. - MATERIALES Y METODOS........................................................................................................ 35
2.2 Diseño del experimento.............................................................................................................. 35
2.3 Desarrollo y metodología del la investigación................................................................. 37
2.3.1 Etapa l: germinación in vitro de las semillas de palo fierro y
obtención de plántulas asépticas donadoras de
explantes (tallo, hoja y yema axilar)........................................................ 37
2.3.2 Etapa ll: determinación de la mejor concentración de
fitorreguladores para la micropropagación masiva de
palo fierro (Olneya tesota)............................................................................. 39
2.3.1.3 Incubación de los medios sembrados in vitro........................................ 40
lll.- RESULTADOS Y DISCUSIONES.............................................................................................. 43
3.1 Germinación in vitro de la semilla de palo fierro (Olneya tesota) y
Obtención de plántulas asépticas donadoras de explantes,
(hoja, tallo y yema axilar) ...................................................................................................... 43
3.2 Determinación de la dosis óptima de fitorreguladores de crecimiento
auxina y citocinina en los explantes (hojas, tallo, y yema axilar para
la multiplicación masiva de palo fierro (Olneya tesota) ............................................ 43
3.3 Formación de callo......................................................................................................................... 44
3.3.1 Análisis estadístico para ver el efecto de explante y dosis
sobre la formación de callo......................................................................................... 45
3.3.1.1 Análisis de varianza para observar el efecto de la dosis
y explantes en diámetro de callo............................................................. 49
3.3.1.2 Comparación promedio para determinar la dosis óptima
de reguladores en diámetro de callo......................................................... 49
3.4 Análisis de la variable “color” para determinar la dosis óptima de
reguladores de crecimiento para la propagación de palo fierro
(Olneya tesota)............................................................................................... 50
l. REVISION DE LITERATURA
1.1 El palo fierro (Olneya tesota) Desde el punto de vista ecológico, el palo fierro está considerado como una especie
clave porque modifica el hábitat al crear microambientes mediante una sombra difusa
que protege a otras especies de la radiación directa, altas temperaturas y
depredadores, sus profundas raíces obtienen agua del subsuelo, por lo que debajo
de su copa el suelo es más húmedo que en el resto del desierto, hecho por el que
también se le llama especie nodriza. Debajo de su copa se desarrollan 31 especies
del desierto de las cuales 8 son cactáceas amenazadas. El palo fierro es también
utilizado como hábitat, forraje, y sitio de anidación por diferentes insectos, aves,
mamíferos y reptiles; el venado bura y el berrendo se alimentan de los renuevos de
sus ramas y el borrego cimarrón se protege debajo de su copa. Su existencia
permite la de muchas otras especies en el desierto. (http://sepultura.semarnat.gob.mx/upsec/programas/prog_cvs/palof.htm)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Árbol de palo fierro (Olneya tesota) en el medio ambiente
Fuente://www.scenicdrive.org/pdiron.htm................................................... 8
Figura 2. Flor de palo fierro (Olneya tesota) en el medio ambiente
Fuente://www.scenicdrive.org/pdiron.htm.................................................. 8
Figura 3. Distribución de palo fierro (Olneya tesota) en el noroeste de México
Fuente://sepulturasemarnat.gob.mx/ups/prog_cus/palof.htm.................... 9
Fuente://www.scenicdrive.org/pdiron.htm................................................. 13
Fuente://www.scenicdrive.org/pdiron.htm................................................. 13
Fuente://www.scenicdrive.org/pdiron.htm.................................ñ............. 14
Figura 7. Plántas asépticas de palo fierro (Olneya tesota) germinadas in
vitro, obtenidas en el laboratorio de cultivo de tejidos, ITSON, 2002.. 38
Figura 8. Plántas de palo fierro (Olneya tesota) germinadas in vitro,
seleccionadas para la micropropagación, ITSON, 2002.......................... 39
Figura 9. Siembra de explantes en campana de flujo laminar, ITSON, 2002......... 40
Figura 10. Acomodo de los tratamientos en el cuarto de incubación,
ITSON, 2002........................................................................................ 41
Figura 12. Formación de callo, ITSON, 2002.......................................................... 44
Figura 13. Clasificación de la regresión logística, ITSON, 2002............................. 45
Figura 14. Histograma de probabilidades estimadas, ITSON, 2002....................... 46
Figura 15. Porcentajes de color verde en los para las nueve dosis de
fitorreguladores explantes (hoja, tallo, y yema axilar,
ITSON, 2002........................................................................................ 52
Figura 17. Formación de callo, ITSON, 2002........................................................ 55
LISTA DE TABLAS
Fuente: ([email protected])................................................. 10
Tabla 2. Clasificación de los principales factores no biológicos que afectan
al desarrollo del cultivo in vitro.
Fuente: (http://www.etsea.udl.es)......................................................................... 15
Fuente: (http:/www.etsea.udl.es)............................................................. 17
Fuente:(http://perso.wanadoo.es/pedrogruen/hormonas_vegeta
Fuente:(http://perso.wanadoo.es/pedrogruen/hormonas_vegeta-
Fuente: (http://www.etsea.udl.es/invitro/luz.htm)..................................... 28
Tabla 7. Arreglo en las dosis de fitorreguladores, ITSON, 2002........................... 36 Tabla 8. Diseño de los tratamientos en el cuarto de incubación.
ITSON, 2002............................................................................................ 36
Tabla 9. Resultados de criterios de medición de ajustes al modelo de los
Datos, ITSON, 2002................................................................................. 47
ITSON, 2002.......................................................................................... 48
Tabla 11. Análisis de varianza para la variable diámetro de callo, ITSON,
2002...................................................................................................... 49
Tabla 12. Comparación promedio en diámetro de callo para determinar
la dosis óptima de re guiadores de crecimiento, ITSON, 2002.............. 50
Tabla 13. Análisis de coloración (verde, blanco y café), ITSON, 2002.................. 53
encuentra con categoría de protección especial por la (NOM-059-1994), su madera
es ampliamente requerida para la elaboración de artesanías, carbón vegetal y forraje
para ganadería. La extinción de esta planta afectará la estabilidad y diversidad del
ecosistema, ya que su presencia, provee los micro habitas necesarios para otras
plantas y animales catalogados como amenazados o en peligro de extinción. Esta
especie es de propagación lenta de forma natural, una alternativa para la
propagación de esta especie es la técnica de cultivo de células y tejidos vegetales la
cual minimiza el tiempo y aumenta la propagación de especies en condiciones
controladas. Esta investigación se realizó en laboratorio de cultivo de tejidos
vegetales del ITSON, se llevó acabo en dos meses de Febrero a Marzo del 2002,
el experimento se desarrolló en dos fases; la primera consistió en germinar las
semillas de palo fierro (Olneya tesota), en la segunda se utilizaron los explantes hoja,
tallo y yema axilar, en medio MS con diferentes combinaciones de auxina (ANA) y
citocinina (BAP) en dosis de 0.0 a 0.2 mg/ml, incluyendo un testigo. Se aplicó un
diseño bifactorial arreglado en bloques al azar. Se realizó análisis de regresión
logística para determinar el efecto de dosis y explante sobre la formación de callo,
encontrando mayor efecto en yema axilar y en la dosis 6 (0.0, a 0.2 mg/ml ), a su
vez donde se formo callo. Se realizó análisis de varianza para ver el efecto de
dosis y explante sobre diámetro de callo, no se encontró efecto en el tipo de explante
para diámetro de callo, pero si se presentaron efectos en dosis. Se realizó una
comparación de medias, por el método de Duncan al 90 por ciento de confiabilidad,
encontrándose un promedio mayor en los tratamientos 3, 9, 6, 8, 4. Se realizaron
tablas de contingencia, para la variable “color” determinándose: oxidación, clorosis y
coloración normal. La oxidación para dosis de reguladores fue mayor en el testigo, y
para el explante en tallo, a su vez el que presentó mejor coloración fue en el
explante yema axilar, en el explante hoja, se presentó un índice mayor de clorosis.
El porcentaje de contaminación en la última etapa de este experimento fue igual a
cero.
INTRODUCCIÓN
El palo fierro (Olneya tesota) es una especie endémica, y única dentro del género
Olneya, su distribución abarca el desierto de Sonora, la península de Baja California
y regiones desérticas de Arizona y California, en Estados Unidos. Esta especie
ofrece sombra, refugio y alimento a otras muchas especies, por lo que es
considerada una planta nodriza, bajo su sombra se crea un ambiente fértil y húmedo
que mitiga el extremoso clima del desierto, propiciando la germinación y crecimiento
de otras plantas. Es de crecimiento lento y puede vivir hasta 1000 años. El palo fierro
es una especie muy longeva, lo que la convierte casi en un recurso no renovable. Su
extremosa longevidad ha hecho que muchas otras especies de plantas hayan tenido
la oportunidad de evolucionar junto con él. Esto hace que sea para las especies de
corta vida y las anuales de un microhábitat especial. Tiene una amplia utilidad en
fabricación de productos artesanales, producción de carbón, alimento para ganado,
por lo que se le considera como una planta con protección especial de acuerdo con
la Norma Oficial Mexicana, bajo la clave NOM-059-ECOL-1994, SEDESOL (1994),
actualmente la NOM-059-ECOL-2001. Esta especie vegetal se encuentra en la
categoría de amenazada en peligro de extinción, debido a que es explotada
irracionalmente por todas sus propiedades, (López, 1990).
En este trabajo se demuestra que existe una necesidad de ayudar a que esta planta
palo fierro (Olneya tesota) se pueda propagar de una forma más rápida para que
siga dando beneficios al medio ambiente, como evitar modificaciones en flora y fauna
conservando la biodiversidad, y a su vez se pueda aprovechar en comunidades
rurales bajo ninguna restricción.
JUSTIFICACIÓN
El palo fierro (Olneya tesota) es una planta de la familia de las leguminosas, que se
encuentra con sobreprotección especial por la Norma Oficial Mexicana (NOM-059-
ECOL-2001), es de un amplio uso comercial, su madera es requerida para la
elaboración de artesanías, carbón vegetal, en la obtención de combustibles, como
forraje para ganadería y las tribus como los Seris y Yaquis, que aparte le han dando
un uso alimenticio y medicinal. La reducción del número de estas plantas afecta
también, la estabilidad y diversidad del ecosistema por siglos, ya que provee los
microhábitats necesarios para la existencia de otras plantas y animales catalogados
como amenazados o en peligro de extinción. Es una planta de propagación lenta de
forma natural, por lo que se hace necesario la aplicación de las técnicas de cultivo de
células y tejidos vegetales para minimizar el tiempo y aumentar su propagación en
condiciones controladas. En investigaciones anteriores a esta con Olneya tesota se
ha identificado que los explantes más reactivos, son, hoja y tallo y yema axilar. El propósito de esta investigación fue obtener la concentración combinada de
fitorreguladores (auxina y citocinina) utilizada en los explantes hoja, tallo y yema
axilar, que permita aumentar al máximo la micropropagación masiva de esta
especie. Ya que la producción de esta planta en forma masiva en un corto tiempo
ayudará a minimizar riesgos en pérdida de la biodiversidad existente en nuestro
entorno, y así se podrá aprovechar sin restricción para sus múltiples aplicaciones.
OBJETIVO GENERAL
Determinar la combinación óptima de fitorreguladores auxina y citocinina, para lograr
la micropropagacion de palo fierro (Olneya tesota), a partir de los explantes hoja,
tallo y yema axilar.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Inducir la germinación in vitro de semillas de palo fierro (Olneya tesota).
Obtener plántulas de palo fierro asépticas donadoras de explantes a partir de
las semillas germinadas in vitro.
Inducir una respuesta con los explantes (hoja, tallo y yema axilar) de la planta
de palo fierro, utilizando diferentes combinaciones de auxina y citocinina.
Determinar la combinación óptima de fitorreguladores auxina y citosina, en el
medio de cultivo MS aplicada en los tres diferentes tipos de explantes (hoja,
tallo, yema axilar) de la planta de palo fierro.
Analizar estadísticamente los datos obtenidos y derivar conclusiones.
HIPÓTESIS
Es posible inducir la germinación in vitro de semillas de palo fierro (Olneya
tesota) en un medio de cultivo adecuado.
Es factible obtener plántulas asépticas de palo fierro al aplicar un método de
desinfección idóneo.
Existe la posibilidad de obtener una combinación óptima de fitorreguladores
tipo auxina y citocinina, para la multiplicación masiva de palo fierro a partir de
los explantes: hoja, tallo y yema axilar.
SUPUESTOS
Las condiciones de asepsia que se utilizaron durante todas las etapas son las
más recomendables para trabajar en condiciones in vitro.
El lapso de tiempo explorado para la asepsia de las semillas usadas en esta
investigación es el más adecuado.
Las semillas utilizadas se consideran las más reactivas para tener in vitro le
plántula.
El tipo de reguladores de crecimiento son los utilizadas por anteriores
investigaciones en esta planta palo fierro (Olneya tesota).
Las condiciones de luz, temperatura y fotoperíodo existentes en el cuarto de
incubación fueron adecuadas para la realización de la investigación.
Las plantas seleccionadas fueron las que presentaron mejores características.
El diseño estadístico es adecuado para esta investigación
Revisión de literatura 7
Subdivisión: Angiosperma Clase: Dicotiledoneas Orden: Fabales Familia: Fabaceae,
Subfamilia: Caesalpiniaceae Genero: Olneya Especie: tesota 1.1.2 Descripción botánica Árbol perenne de corona amplia, de 10 a 18 m de altura, y un tallo de 0.45 m de
diámetro aproximadamente, produce troncos masivos, de corteza gris, hojas pinadas
de 18-24 foliolos de color verde grisáceo con un par de espinas cortas y agudas
(figura 1), flores en racimos cortos de color púrpura a blanco (figura 2). Su raíz esta
compuesta, por raíces primarias y secundarias de color café claro, florece de Mayo a
Junio, sus frutos contienen de una a ocho semillas color café claro. Es una especie
de lento crecimiento, estimándose su ciclo de vida entre 600-800 años. (http://sepultura.semarnat.gob.mx/upsec/programas/prog_cvs/palof.htm).
Figura 1. Árbol de palo fierro (Olneya tesota) en el medio ambiente Fuente: http:(//www.scenicdrive.org/pdiron.htm)
Figura 2. Flor de palo fierro (Olneya tesota) en medio ambiente Fuente: (http://www.scenicdrive.org/pdiron.htm)
1.1.3 Distribución de palo fierro (Olneya tesota)
El palo fierro, (Olneya tesota), es un género monotípico de la familia fabaceae. Es
considerada como el árbol de mayor altura del desierto sonorense y endémica a
“MegaMéxico I” (Rzedowski 1991). Se distribuye en los Estados de Sonora, Baja
California y Baja California Sur en México, y Arizona y California en E.U.A, en
elevaciones desde el nivel del mar a 800 mts (Solis y Molina 1992). Su hábitat natural
se restringe a las subdivisiones del desierto sonorense denominadas como: Costa
Central del Golfo (Central Gulf Coast), Valle del Bajo Río Colorado (Lower Colorado
River Valley), Altiplano de Arizona (Arizona Upland), Planicies de Sonora (Plains of
Sonora) y El desierto de Vizcaíno (Vizcaino Desert) (Brown 1982). Es una planta
común en sistemas xeroriparios, parte media y superior de bajadas desérticas y en
cordilleras volcánicas y graníticas (Solís y Molina 1992; Búrquez y Quintana 1994).
Figura 3. Distribución de palo fierro (Olneya tesota) en el noroeste de México Fuente: (http://sepultura.semarnat.gob.mx/upsec/programas/prog_cvs/palof.htm)
1.1.4 Usos del palo fierro (Olneya tesota) La tabla 1 muestra los diferentes usos del palo fierro (Olneya tesota) entre las tribus,
como los Mayos, Seris, Yaquis y Papagos. (htt://www.cideson.mx/conserv/monitor/plantas.html)
Madera
• Combustible como leña y carbón. • Construcción de habitaciones “ horcón”. • Fabricación de utensilios, “sonajas de pascola y
raspadores. • Para la música del venado, la cruz de los
rosarios.
Mayos “ejea” Yaquis “uu ejea” Seris “comiitin” Papagos “Ho idkam”
Medicina
• Diarrea (trozo de la corteza, cocer con agua). • Encías hinchadas y dientes flojos (raíz
machacada). • Asma (macerar hojas y tomar). • Insolación (remojar trozo y tomar). • Fortalecer la sangre y dolor de riñón (flor se
cose con agua y tomar). • Empacho (cáscara con sal, tomar en ayunas). • Dolor de estomago (cocer cáscara y tomar).
Tabla 1. Usos del palo fierro (Olneya tesota) Fuente: ([email protected])
1.2 Causas y consecuencias de especies en peligro de extinción en México Las causas de que las especies en México se encuentran en peligro de
desaparecer son
• La destrucción de su hábitat natural.
Sin embargo, no debe olvidarse que existen otros efectos indirectos de la actividad
humana que pueden a la larga conducir a una alteración más rápida de las
posibilidades de sobrévivencia de una especie como:
• La introducción de nuevos organismos competidores o predadores en las
comunidades.
• La eliminación de otras especies que efectúan alguna función importante
como servir de alimento, polinizar las flores, dispersar las semillas.
Finalmente, la reducción y fragmentación de la población de una especie causa
también pérdida de la variabilidad genética, con la consecuente disminución de la
adaptabilidad a los cambios y por lo tanto de su potencialidad para sobrevivir al
efecto de las alteraciones del ambiente. (http://sepultura.semarnat.gob.mx/upsec/programas/prog_cvs/palof.htm)
1.2.1 La Norma Oficial Mexicana “NOM-ECO-1994”, y “NOM-ECOL-059-2001” En 1994 se expide la Norma Oficial Mexicana NOM-ECOL-059-1994, que "establece
el número de especies amenazadas y en peligro de extinción y especifica acciones
para su conservación". Esta Norma fue un avance importante por preservar la
riqueza biológica del país. Sin embargo, en la práctica esta Norma presentó
deficiencias en cuanto a terminología, y aplicabilidad. Se vio la necesidad de
actualizarla y de establecer un sistema que permitiera medir la vulnerabilidad de las
especies, así como eliminar términos ambiguos como el de especie "rara". Es así
como se analiza y publica en el 2001 la NOM-ECOL-059-2001, la cual especifica la "
Protección ambiental-Especies nativas de México de flora y fauna silvestres-
Categorías de riesgo y especificaciones para su inclusión, exclusión o cambio-Lista
de especies en riesgo". Esta norma viene a sustituir la de 1994 e incluye términos y
observaciones que no tenía la anterior. (http:/espanol.geocites.com/pmayen/nom.html).
1.3 Definición de el cultivo in vitro Pierik (1987) define cultivo in vitro de plantas superiores como: El cultivo en medio
nutritivo, bajo condiciones estériles, de plantas, semillas, embriones, órganos,
explantes, tejidos, células y protoplastos de plantas superiores.
El término cultivo in vitro es un término muy genérico que se refiere más bien a la
metodología usada. En sentido estricto, in vitro quiere decir "dentro de vidrio", es
decir, el cultivo de plantas o de alguna de sus partes (pero también de células y
tejidos animales) dentro de recipientes de vidrio en condiciones de ambiente
controlado.
1.3.1 El entorno del cultivo de tejidos
El estudio de cualquier fenómeno biológico en condiciones de laboratorio exige
reproducir de la forma más aproximada posible todos los factores que puedan incidir
en el fenómeno estudiado cuando este sucede en la naturaleza. Este principio
general se aplica también al cultivo in vitro de plantas.
Reproducir en condiciones de laboratorio todos los factores que conforman el biotipo
de la planta en la naturaleza es técnicamente muy complejo. Por esa razón, se
realiza una simplificación de la realidad escogiendo aquellos factores que se puedan
mantener controlados. Cuando no se realiza el estudio con todo ser vivo sino con
solo una parte de él (explante), a la dificultad de reproducir las condiciones naturales
se debe añadir la dificultad de suministrar a la parte estudiada en cuestión, en todo
aquello que antes se obtenía del sistema completo.
Figura 4. Artesanías obtenidas de la manufactura de palo fierro (Olneya tesota) Fuente: (http://www.scenicdrive.org/pdiron.htm)
Figura 5. Artesanías de palo fierro (Olneya tesota) Fuente:(http://www.scenicdrive.org/pdiron.htm)
1.4 Principales factores no biológicos que afectaran al desarrollo del cultivo in
vitro El cultivo in vitro de plantas superiores es una técnica que exige un control absoluto
del ambiente, tanto físico como químico, en el que se sitúa al explante. Conviene, por
tanto, conocer cuales son los principales factores que conforman el ambiente del
explante y que deberán ser controlados (tabla 2).
Ambiente químico
pH
Micropropagación
Tabla 2. Clasificación de los principales factores no biológicos que afectan al desarrollo del cultivo in vitro Fuente: (http://www.etsea.udl.es)
1.4.1 El medio de cultivo
Las plántulas pueden crecer en muchos medios dependiendo de la especie. Todos
los medios contienen como fuente de energía a los carbohidratos, un rango de
minerales, vitaminas, aminoácidos, reguladores de crecimiento y/o extractos de
plantas tales como, pulpa de banana, o extracto de papa y agar como medio
solidificante. (http://www.etsea.udl.es)
1.4.1.1 Condiciones del medio de cultivo Las semillas al igual que las plantas pueden crecer y desarrollarse sobre medios
diferentes, dependiendo de la especie. Los medios de cultivo son esterilizados en
autoclave. El cuarto de crecimiento debe estar condicionado, 16 horas de fotoperíodo
y un rango de temperatura entre 22-25° C. Algunas semillas son germinadas en la
oscuridad o con poca luz, 8 horas de oscuridad con lámpara que proporciona de
2500 a 3000 lux, provistos de fluorescencia de luz blanca, por ejemplo las orquídeas
se pueden propagar a través de cultivo in vitro utilizando semillas (Arditti 1982) y
yemas vegetativas (Morel 1984).
Se necesitan varias etapas para que las plántula puedan se transportada al
invernadero se necesitan de un tamaño de 5 a 15 cm, la plántula crecida es removida
de los frascos y establecidos en el invernadero. Luego del segundo replante, cuando
las plántulas desarrollan varias hojas y un sistema radicular óptimo, son extraídos del
frasco y sometidos al proceso de aclimatación. Para dicho efecto se prepara el
sustrato donde se va desarrollar. El éxito de la micropropagación frecuentemente
produce más plántulas para ser distribuidos a todo el mundo. Como las plantas son
expendidos in vitro, ellos no presentan ningún problema.
(http://www.etsea.udl.es)
1.4.1.2 Requerimientos nutritivos para el crecimiento in vitro
Los requerimientos nutritivos para un crecimiento in vitro óptimo varían con la
especie, e incluso son específicos de acuerdo a la parte de la planta que se esté
cultivando y a la respuesta que se desea obtener. Debido a estas necesidades
específicas se han desarrollado muchas formulaciones para los medios de cultivo, de
entre las que se encuentran el medio de Murashige y Skoog.
1.4.1.3 Formulaciones para los medios de cultivo in vitro El medio MS, o de Murashige y Skoog (1962), es muy usado, particularmente si el
objetivo es regenerar plantas; existen numerosas variaciones comerciales de este
medio. El medio B5 o de Gamborg et al. (1968), o sus varios derivados, ha sido de
un gran valor en el cultivo de células y protoplastos, y también es utilizado
eficazmente en regeneración de plantas. La diferencia principal entre los medios MS
y B5 es la menor concentración de nitratos en B5. El medio WPM (1980) de baja
concentración de sales está especialmente indicado para especies leñosas.
1.5 Reguladores de crecimiento El término "substancias reguladoras del crecimiento" más general y abarca a las
substancias tanto de origen natural como sintetizadas en el laboratorio que
determinan respuestas a nivel de crecimiento, metabolismo ó desarrollo en la planta,
tabla 3. (http://perso.wanadoo.es/pedrogruen/hormonas_vegetales_y_reguladores.htm)
1. Auxinas
2. Citocininas
3. Giberelinas
4. Etileno
1.5.1 Auxinas El nombre auxina significa en griego 'crecer' y es dado a un grupo de compuestos
que estimulan la elongación ácido indolacético (IAA) es la forma predominante, sin
embargo, evidencia reciente sugiere que existen otras auxinas indólicas naturales en
plantas aunque la auxina se encuentra en toda la planta, la más altas
concentraciones se localizan en las regiones meristemáticas en crecimiento activo. Se le encuentra tanto como molécula libre o en formas conjugadas inactivas. Cuando
se encuentran conjugadas, la auxina se encuentra metabólicamente unida a otros
compuestos de bajo peso molecular. Este proceso parece ser reversible. (http://perso.wanadoo.es/pedrogruen/hormonas_vegetales_y_reguladores.htm)
1.5.1.1 Concentración de las auxinas La concentración de auxina libre en plantas varía de 1 a 100 mg/kg peso fresco. En
contraste, la concentración de auxina conjugada ha sido demostrada en ocasiones
que es sustancialmente más elevada. Hormonas (http://perso.wanadoo.es/pedrogruen/hormonas_vegetales_y_reguladores.htm)
1.5.1.2 Características de las auxinas Una característica sorprendente de la auxina es la fuerte polaridad exhibida en su
transporte a través de la planta. La auxina es transportada por medio de un
mecanismo dependiente de energía, alejándose en forma basipétala desde el punto
apical de la planta hacia su base. Este flujo de auxina reprime el desarrollo de brotes
axilares laterales a lo largo del tallo, manteniendo de esta forma la dominancia apical.
El movimiento de la auxina fuera de la lámina foliar hacia la base del pecíolo parece
también prevenir la abscisión. La auxina ha sido implicada en la regulación de un
número de procesos fisiológicos tabla 4. (http://perso.wanadoo.es/pedrogruen/hormonas_vegetales_y_reguladores.htm)
2. Aumentar el crecimiento de los tallos
3. Promover la división celular en el cambium vascular y difrenciación del xilema
secundario
5. Estimular el desarrollo de frutos
6. Fototropismo
8. Promover la floración en algunas especies
9. Promover la síntesis de etileno (influye en procesos de maduración de los frutos)
10. Favorece el cuaje y la maduración de los frutos
11. Inhibe la abscisión ó caída de los frutos
Tabla 4. Funciones de las auxinas Fuente:(http://perso.wanadoo.es/pedrogruen/hormonas_vegetales_y_reguladores.htm)
1.5.2 Citocininas
Las citocininas son hormonas vegetales naturales que estimulan la división celular en
tejidos no meristemáticos. Inicialmente fueron llamadas quininas, sin embargo,
debido al uso anterior del nombre para un grupo de compuestos de la fisiología
animal, se adaptó el término citoquinina (citocinesis o división celular). Son
producidas en las zonas de crecimiento, como los meristemos en la punta de las
raíces. La zeatina es una hormona de esta clase y se encuentra en el maíz (Zea
mayz). Las mayores concentraciones de citocininas (citoquininas) se encuentran en
embriones y frutas jóvenes en desarrollo, ambos sufriendo una rápida división
celular. La presencia de altos niveles de citoquininas puede facilitar su habilidad de
actuar como una fuente demandante de nutrientes. Las citoquininas también se
forman en las raíces y son translocadas a través del xilema hasta el brote. Sin
embargo, cuando los compuestos se encuentran en las hojas son relativamente
inmóviles, otros efectos generales de las citoquininas en plantas se observan en la
tabla 5. (http://fai.unne.educ.ar/biologia/planta/auxinas.htm)
1.5.3 Giberelinas
El Ácido giberélico (GA3) fue la primera de esta clase de hormonas en ser
descubierta. Las giberelinas son sintetizadas en los primordios apicales de las hojas,
en puntas de las raíces y en semillas en desarrollo. Su principal función es
incrementar la tasa de división celular mitosis, además de ser encontradas en el
floema, las giberelinas también han sido aisladas de exudados del xilema, lo que
sugiere un movimiento más generalmente bidireccional de la molécula en la planta.
1. Estimulan la división celular y el crecimiento
2. Inhiben el desarrollo de raíces laterales
3. Rompen la latencia de las yemas axilares
4. Promueven la organogénesis en los callos celulares
5. Retrasan la senescencia ó envejecimiento de los órganos vegetales
6. Promueven la expansión celular en cotiledones y hojas
7. Promueven el desarrollo de los cloroplastos.
Tabla 5. Funciones de las citocininas Fuente:(http://perso.wanadoo.es/pedrogruen/hormonas_vegetales_y_reguladores.htm)
1.5.4 Etileno El etileno, siendo un hidrocarburo, es muy diferente a otras hormonas vegetales
naturales. Aunque se ha sabido desde principios de siglo que el etileno provoca
respuestas tales como geotropismo y abscisión, no fue sino hasta los años 1960 que
se empezó a aceptar como una hormona vegetal. Se sabe que el efecto del etileno
sobre las plantas y secciones de las plantas varía ampliamente. Ha sido implicado en
la maduración, abscisión, senectud, dormancia, floración y otras respuestas.
El etileno parece ser producido esencialmente por todas las partes vivas de las
plantas superiores, y la tasa varía con el órgano, tejidos específicos y su estado de
crecimiento y desarrollo.
Se ha encontrado que las alteraciones en la tasa sintética de etileno están
asociadas cercanamente al desarrollo de ciertas respuestas fisiológicas en plantas y
sus secciones, por ejemplo, la maduración de frutas climatéricas y la senectud de
flores. Ya que el etileno está siendo producido continuamente por las células
vegetales, debe de existir algún mecanismo que prevenga la acumulación de la
hormona dentro del tejido. A diferencia de otras hormonas, el etileno gaseoso se
difunde fácilmente fuera de la planta. Esta emanación pasiva del etileno fuera de la
planta parece ser la principal forma de eliminar la hormona. Técnicas como la
ventilación y las condiciones hipobáricas ayudan a facilitar este fenómeno durante el
período poscosecha al mantener un gradiente de difusión elevado entre el interior del
producto y el medio que lo rodea. La concentración interna de etileno se controla
principalmente por la tasa de síntesis en lugar de la tasa de remoción de la hormona. (ttp://perso.wanadoo.es/pedrogruen/hormonas_vegetales_y_reguladores.htm)
1.6 El pH del medio de cultivo Se conoce poco la influencia del pH del medio nutritivo en el cultivo in vitro. Se
supone que el pH en el rango 5.0-5.5 es apto para el crecimiento con un máximo
alrededor de 6.0. Un pH bajo (menor de 4.5), o alto (mayor que 7), generalmente
frena el crecimiento desarrollo in vitro. (PIERIK, 1990)
1.6.1 Importancia del pH en el medio de cultivo Si el pH es demasiado bajo, pueden presentarse las siguientes complicaciones
(Butenko, 1968).
La auxina IAA y el ácido giberelico se hacen menos estables.
El agar pierde su rigidez.
Algunas sales (fosfato o hierro) pueden precipitar.
La vitamina B1 y el ácido pantoténico se hacen menos estables.
Se retarda la absorción de iones amonio.
El pH varía con el autoclavado, si se parte de un pH en el rango 5.0-7.0
generalmente sufre un descenso (Skirvin et al., 1986).
Si el pH disminuye de forma apreciable durante el cultivo de tejidos (licuándose el
medio), se deberá hacer un nuevo preparado de pH requerido. Generalmente los
cultivos de tejidos son capaces de auto-tamponado: ajustándose los pHs demasiado
altos o bajos a los valores requeridos.
Si se parte de un pH 6, este puede caer con facilidad hasta 5.5 o incluso más bajo,
durante el crecimiento (Skirvin et al., 1986). Si durante la preparación del medio, el
pH queda demasiado bajo o demasiado alto puede ser corregido con NaOH o HCl
(0.1N) (PIERIK, 1990).
1.7 La temperatura La temperatura a la que está expuesto el explante cultivado in vitro afecta a la
mayoría de procesos fisiológicos y por consiguiente es un factor fundamental a
controlar. (htt://www.etsea.udl.es/invitro/temperat.htm) 1.7.1 Efecto de la temperatura El control de la temperatura es importante porque afecta el crecimiento del cultivo ya
que es un factor que induce determinados procesos fisiológicos. Así, temperaturas
bajas (del orden de 4-5ºC) permiten superar los períodos de dormancia de algunas
especies leñosas y la conservación prolongada de determinados cultivos in vitro;
mientras que una temperatura constante de 20º C induce la formación de raíces en la
mayoría de coníferas. En general, cada especie tiene un intervalo de temperaturas
en el que se produce el crecimiento óptimo. Este intervalo puede variar en función
del genotipo, del órgano del que se ha obtenido el explante, de la época del año, de
la edad de la planta madre, del fotoperíodo, etc. Una complicación adicional se
produce por el hecho de que puede existir interacción entre la temperatura óptima de
crecimiento y otros factores como la luz, la composición del medio. (htt://www.etsea.udl.es/invitro/temperat.htm)
1.8 La luz La luz es uno de los factores principales que determinan el desarrollo de los
organismos autótrofos, en ello radica la importancia de controlarla en cultivos in vitro.
La cantidad de luz que incide sobre las superficies fotosintéticas de las plantas
determinará en gran medida la capacidad fotosintética de éstas. (htt://www.etsea.udl.es/invitro/ttipus.htm)
1.8.1 Definición de la luz La luz, definida como una forma de energía radiante que se nos manifiesta mediante
la visión es, en realidad, parte de un fenómeno físico más amplio la energía radiante
(radiación), que puede ser descrito según dos modelos diferentes: el modelo
ondulatorio (radiación electromagnética) y el modelo corpuscular.
Los diferentes tipos de radiación electromagnética se pueden clasificar según sea su
longitud de onda, así podemos obtener un espectro electromagnético formado por las
diferentes longitudes de onda de la radiación electromagnética, que van desde los
10-16 nm hasta los 104 nm. De todas estas longitudes de onda sólo las
comprendidas entre 380 y 775 nm pueden ser percibidas por el ojo humano, ya que
son llamadas de la región visible. Sólo una parte de la energía radiante (la luz y
algunas de las radiaciones infrarrojas y ultravioletas próximas) tiene influencia
conocida sobre el desarrollo de las plantas, a veces, se usa el término luz para
referirse a ese conjunto de radiaciones.
(http:// www.etsea.udl.es/invitro/luz.htm)
1.8.2 Medición de la luz Esta cantidad de luz puede ser medida de formas diversas, midiendo la iluminación
de una superficie y expresándola en lux (en realidad se trata de una unidad definida
en términos de percepción del ojo humano); o bien midiendo la irradiación, es decir,
la energía radiante que llega a una superficie dada en un intervalo de tiempo. La
irradiación puede ser expresada en función de la energía o en función de los fotones. (http:// www.etsea.udl.es/invitro/luz.htm)
1.8.3 Aspectos relacionados con la luz que son importantes en cultivo in vitro
La cantidad de luz: LA IRRADIACIÓN
La calidad de la luz: EL ESPECTRO
La alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad: EL FOTOPERÍODO
1.8.3.1 La irradiación La cantidad de luz que incide sobre las superficies fotosintéticas de las plantas
determinará en gran medida la capacidad fotosintética de éstas. Esta cantidad de luz
puede ser medida de formas diversas, bien midiendo la iluminación de una superficie
y expresándola en lux (en realidad se trata de una unidad definida en términos de
percepción del ojo humano); o bien midiendo la irradiancia, es decir, la energía
radiante que llega a una superficie dada en un intervalo de tiempo. La irradiancia
puede ser expresada en función de la energía o en función de los fotones.
Se asume que las necesidades de luz de los cultivos in vitro son inferiores a las de la
planta in vivo, dado que el medio de cultivo contiene cantidades importantes de
sacarosa, los cultivos in vitro se comportan sólo parcialmente de forma autotrófica.
Además, una irradiación excesiva produciría un aumento notable de la temperatura
dentro del recipiente de cultivo debido al efecto invernadero. (http:// www.etsea.udl.es/invitro/luz.htm)
1.8.3.2 El espectro
La luz es esencial para las plantas debido a que proporciona la energía necesaria
para la fotosíntesis. La clorofila y los demás pigmentos fotosintéticos captan la
energía contenida en diferentes radiaciones para incorporarla a las diversas
reacciones químicas que constituyen el proceso. Pero la luz también puede intervenir
en otros procesos fisiológicos, como el fototropismo, la germinación, la floración.
Todos estos fenómenos no son producidos en igual medida por todos los tipos de luz
(radiaciones de cualquier longitud de onda) sino que algunas radiaciones concretas
tienen un efecto notable mientras que otras tiene poco o ningún efecto. Es por ello
que es preciso conocer el espectro de la radiación que es activo en el proceso
fisiológico estudiado.
La cámara de cultivo deberá reproducir lo mejor posible ese espectro de luz activo,
por lo tanto conviene conocer cual es el espectro que emiten nuestras fuentes de luz
y en que medida se adapta éste a las necesidades de nuestro cultivo.
Las principales fuentes de luz usadas en las cámaras de cultivo son:
Lámparas incandescentes
Lámparas fluorescentes
Lámparas de vapor de mercurio y sodio
De todas ellas, son los fluorescentes las fuente de luz más usada en las cámaras de
cultivo, aunque también se pueden encontrar, generalmente en instalaciones
industriales, lámparas de vapor. (http:// www.etsea.udl.es/invitro/luz.htm)
1.8.3.3 El fotoperíodo
Algunos fenómenos propios del desarrollo de las plantas como la germinación,
floración, entre otros, pueden ser activados por el número de horas diarias de luz
que recibe la planta. De forma análoga, el número de horas de luz que recibe el
explante cultivado in vitro puede afectar a su desarrollo. En general, el mejor
fotoperíodo in vivo será también el mejor fotoperíodo in vitro. (http:// www.etsea.udl.es/invitro/luz.htm)
1.9 La micropropagación La micropropagación de plantas es una área de la biotecnología que se aplica con el
fin de obtener una población en el menor período de tiempo posible.
Se le conoce como una biotecnología de «respuesta rápida», puesto que se logran
resultados en períodos de 3 a 6 meses. Se puede decir, que es además versátil
puesto que se adapta a los requerimientos de cada especie en estudio, al aprovechar
al máximo la totípotencia celular, para canalizarla hacia la propagación. A través de
la micropropagación, a partir de un fragmento (explante) de una planta madre, se
obtiene una descendencia uniforme en condiciones de asepsia este proceso incluye
varias fases (tabla 6). (http:// www.etsea.udl.es/invitro/micropro.htm)
1.9.1 Objetivos de la micropropagación Difieren según los países: los desarrollados buscan variabilidad genética con fines de
“fitomejoramiento”, los que están en desarrollo, buscan la producción y los
“Megadiversos”, buscan utilizarla como herramienta para la conservación de los
recursos fitogenéticos. Los beneficios que de ella se desprenden se los resume
como: “economía de tiempo y recursos”. En efecto, un metro cuadrado de plantas en
el laboratorio, representa una hectárea en el campo. La tasa de crecimiento es
exponencial y finalmente el material obtenido es uniforme. (http:// www.etsea.udl.es/invitro/micropro.htm)
1.9.2 Descripción de las fases de la micropropagación FASE 0: Preparación de la planta madre Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener
explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado.
Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre un
período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses, en un
invernadero, en que se va a intentar cultivar la planta en condiciones sanitarias
óptimas y con un control de la nutrición, del fotoperíodo y de la irradiación recibida.
FASE 0: Preparación de la planta madre
FASE I: Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia
FASE II: Multiplicación de brotes
FASE III: Enraizamiento
FASE IV: Aclimatación
Tabla 6. Fases de la micropropagación Fuente: (http:// www.etsea.udl.es/invitro/luz.htm)
FASE I: Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los fragmentos de planta
madre para eliminar los contaminantes externos, se debe mantener en condiciones
de asepsia.
Se trabajará en cabinas de flujo laminar, se extraerán los explantes del material
vegetal y se pondrán en cultivo en un medio de iniciación dentro de un tubo de
cultivo, para poder controlar la sanidad y la viabilidad de los explantes.
FASE II: Multiplicación de los brotes
Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron de la FASE I
originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varios entrenudos.
Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio
mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados.
Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar.
FASE III: Elección de un medio de enraizamiento de los explantes
Para enraizar los explantes se utilizan principalmente dos métodos:
Enraizamiento in vitro Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio libre
de reguladores de crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operación se
realiza en la cámara de flujo laminar. Este método permite ser mas flexible la hora de
escoger los brotes, ya que éstos obtienen del medio la fuente de energía para
enraizar, y por tanto no es necesario que tengan las hojas muy bien desarrolladas
para realizar la fotosíntesis.
Enraizamiento ex vitro
Los explantes se deben transferir a un sustrato limpio, aunque no necesariamente
estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita.
Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de
organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que
deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía para
enraizar y desarrollarse los explantes deben de plantarse en contenedores cubiertos
por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar en el
laboratorio.
FASE IV: Aclimatación de los explantes enrraizados Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de
manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación.
Tanto si los explantes fueron enraizados in vitro como ex vitro, en el momento en que
se extraen los explantes de los recipientes de enraizamiento están poco adaptados a
crecer en un invernadero, ya que estos explantes han enraizado y crecido en
ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas
perezosos para responder al descenso de la humedad relativa, demasiado lentos
para evitar la desecación del explante.
Por otra parte crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de
una cutícula cérea bien desarrollada, la barrera para evitar la pérdida de agua a lo
largo de toda la superficie de la planta.
Los explantes deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero
disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando
progresivamente la intensidad de luz. (http:// www.etsea.udl.es/invitro/luz.htm)
1.9.3 Propagación por cultivo de tejidos vegetales 1.9.3.1 Cultivo de tejidos organizados El cultivo de órganos es uno de los tipos de cultivos in vitro mas antiguos e incluye el
cultivo de raíces, meristemos, hojas, embriones, óvulos, anteras y otros más. Entre
ellos el cultivo de anteras, embriones y meristemos que revisten un especial interés
debido a su creciente utilización en la propagación y el mejoramiento genético de las
plantas.
Cuando un órgano es sembrado y cultivado en medios sintéticos, el patrón de
desarrollo puede continuar de manera semejante a la que tenía en la planta o
cambiar totalmente. Por ejemplo, un embrión retirado de una semilla e inoculado en
un medio sintético puede crecer y desarrollarse armónicamente hasta formar una
planta normal; sin embargo dependiendo de los arregladores de crecimiento
presentes en el medio, podría favorecerse el desarrollo solo de primordios foliares o
radiculares del embrión, con lo cual habría un crecimiento desproporcionado en una
de las dos partes.
Es posible, inclusive que los reguladores de crecimiento en el medio de cultivo
pudieran inducir el crecimiento irregular y desordenado de las células del embrión, de
tal manera que se obtuviera al final de una masa amorfa de tejido sin una
organización, “callo”, la inducción de pequeños brotes adventicios a lo largo de la
superficie del embrión podría ser otra forma de respuesta durante el cultivo in vitro
(Tineo, 1999).
• Cultivo de yema axilar Cuando se utiliza el método de las yemas axilares, se aísla un ápice del vástago, a
partir del cual se desarrollan las yemas axilares, las axilas de las hojas, bajo la
influencia de una concentración relativamente alta de citocininas. Esta elevada
concentración de citiocininas frena la dominancia apical y permite el desarrollo de
yemas axilares. Si un ápice del vástago contiene varias ramas axilares o laterales, y
se siembra sobre un medio conteniendo citocinina, se producen nuevos vástagos
axilares.
Cuando se produce un número suficiente de vástagos pueden ser enraizados, y las
plántulas obtenidas transplantadas al suelo.
A pesar de los problemas del aislamiento de ápices estériles, el método de los
vástagos axilares para las plantas de roseta, se ha convertido en la práctica, y con
ventaja en el medio de propagación in vitro más importantes, por las siguientes
razones:
1) El método resulta generalmente más simple que otros métodos de
multiplicación.
3) Generalmente se mantiene la estabilidad genética.
4) El crecimiento de las plántulas obtenidas es muy bueno, quizás debido a las
juvenilización y/o falta de infecciones.
Cultivo de tejidos diferenciados Para establecer los cultivos de tejidos se utilizan pequeños segmentos o explantes
de órganos como las raíces, tallos, hojas, pecíolo, embriones, y partes de los
órganos reproductivos. En el cultivo de tejidos se utilizan generalmente medios
semisólidos o medios líquidos estacionarios. A partir de los segmentos inoculados es
posible inducir con cierta facilidad la formación de “callos”.
Por otro lado manipulando los componentes del medio sintético el tejido puede
formar órganos “de novo” (raíces, brotes o embriones).
La respuesta observada durante el tejido depende de la fuente de tejido (tipo de
tejido, composición de la planta, especie, etc.) y las condiciones de cultivo
(composición del medio sintético y el ambiente físico) (Tineo 1999).
• Cultivo de hoja El cultivo de órganos tiene el objeto de alcanzar, a partir de una estructura
organizada, la morfología y la fisiología que lo identifican con los órganos de su
especie. Se ha practicado el cultivo in vitro de órganos muy inmaduros, como son las
secciones de hojas. Se puede lograr un crecimiento satisfactorio en un medio
consistente, que es una solución balanceada de sales minerales y una fuente de
carbohidratos (usualmente sacarosa de 2 al 3 %). El medio con agar se ha usado
perfectamente para primordios grandes, pero el crecimiento y la supervivencia de
primordios muy pequeños se ven favorecidos con un medio de luz oscuridad.
Las hojas que crecen en cultivo desde el primordio hasta la madurez tienen una
forma típica, pero disminuye el tamaño y frecuentemente muestran una reducción en
su complejidad morfología. La reducción del tamaño es el resultado de un
decremento en el número celular y no en el tamaño de las células.
El cultivo de hojas se ha usado también para la propagación masiva: en el cafetero y
violeta africana, se trabaja con secciones de hojas (Hurtado y Merino, 1987).
1.9.4 El callo El callo es un tejido obtenido por medio del aislamiento de órganos o tejidos
diferenciados, los cuales posteriormente son llevados a una desdiferenciación
celular, presentando estas células una proliferación continua, acelerada y de
apariencia desorganizada, que da origen a una masa amorfa de tejido. Esta masa
celular puede presentar diferentes tipos morfológicos, los cuales varían según la
apariencia externa, textura y composición celular (Butcher Ingram, 1974).
1.9.4.1 Ventajas sobre la producción de callo Desde el punto de vista morfológica, la característica mas importante del callo es la
totípotencialidad de sus células, ya que, en general, con un manejo adecuado de las
condiciones nutricionales, hormonales y ambientales, tienen la capacidad de
desarrollar brotes, raíces, embriones, etc., los cuales pueden llegar a formar
plántulas completas, aunque algunas veces (Myerson y Krull, 1982) en Gynura
aurantiaca estas células pueden presentar diferencias morfológicas y fonológicas
con respecto a plantas de la misma especie, propagadas tradicionalmente.
1.9.4.2 Desventajas en la producción de callo Un serio problema asociado con este tejido es el daño o modificación de la citología
nuclear de las células durante el cultivo. Se pueden presentar aberraciones
cromosomicas (Kayak y Yarveking, 1977), mutaciones puntuales (Herke, 1980) y
diferentes tipos de ploidias (Kibler, et al., 1980; Novel, 1980) así como irregularidades
cariocinéticas, que se manifestaran por sus consecuencias implícitas.
2.1 Localización del experimento y material biológico Esta investigación se llevo a cabo en el laboratorio de cultivo de Células y
Tejidos Vegetales localizado en el edificio de los laboratorios LV-700, del Instituto
Tecnológico de Sonora, Unidad Nainari, en el periodo de febrero a mayo del 2002.
El material biológico utilizado fueron, semillas de palo fierro (Olneya tesota)
recolectadas en la Costa de Hermosillo Sonora.
2.2 Diseño del experimento 2.2.1 Arreglo y diseño de los tratamientos Se realizo un diseño relación auxina-citocinina “A-C” de concentraciones de 0.1 a
0.2 mg / ml. la auxina utilizada fue el ácido naftalenacético “ ANA”, y de citocinina
fue la bencilaminopurina ”BAP”. En la tabla 7, se muestra las dosis de
fitorreguladores utilizada en esta investigación. Se realizo un diseño bifactorial de
arreglo al azar con 4 repeticiones (tabla 8).
Tratamiento Concentración de A-C
1 0,0-0,0 2 0,0-0,1 3 0,0-0,2 4 0,1-0,0 5 0,1-0,1 6 0,1-0,2 7 0,2-0,0 8 0,2-0,1 9 0,2-0,2
Tabla 7. Arreglo en las dosis de reguladores, ITSON, 2002.
DISEÑO DE TRATAMIENTOS H = HOJA, T = TALLO, Y =YEMA AXILAR
P H T Y T Y H Y H T H Y T A 4 8 3 5 6 9 9 9 6 3 5 3 R 9 1 9 6 4 4 6 7 8 8 2 6 E 8 2 5 1 3 7 4 4 2 1 4 5 D 2 9 6 3 5 1 2 6 1 4 6 9 6 3 7 2 9 3 3 8 9 6 3 7
A 7 5 4 4 7 6 8 1 5 5 8 4 I 5 4 8 8 1 2 7 2 3 2 7 2 R 1 7 1 7 8 5 5 3 7 9 9 1 E 3 6 2 9 2 8 1 5 4 7 1 8
BLOQUES 1 2 3 4
TEMPERATURA < TEMPERATURA >
+- 2 º c
Tabla 8. Diseño de los tratamientos en el cuarto de incubación, ITSON, 2002.
2.2.2 Variables medidas Se evaluó la variable formación de callo con análisis de regresión logística
utilizando dosis de reguladores y tipos de explantes, donde se formó callo se
realizó un análisis de varianza para analizar el efecto de dosis y explante sobre
el diámetro de callo, y para determinar el grado de oxidación y clorosis
(despigmentación por ausencia de nutrientes) se utilizó tablas de contingencia
analizando el color verde, blanco y café.
2.3 Desarrollo y metodología de la investigación
La realización de esta investigación fue de dos etapas las cuales se describen a
continuación:
Etapa l: “germinación in vitro de las semillas de palo fierro (Olneya tesota)
para la obtención de plántulas asépticas donadoras de explantes (hoja,
tallo, yema axilar).
Etapa ll:”determinación de la dosis óptima de fitorreguladores auxinas y
citocinina en los explantes; hoja, tallo y yema axilar.
2.3.1 Etapa I: Germinación in vitro de las semillas de palo fierro y obtención de plántulas asépticas donadoras de explantes (tallo, hoja y yema axilar) Antes de iniciar este experimento, se tomó en cuenta la desinfección en toda el
área de trabajo, así como una estricta limpieza personal, debido a que los
microorganismos pueden proliferar mucho mas rápido que las células vegetales.
Se cuidó la esterilidad de todo el equipo que se utilizó y el material, entre estos el
material biológico, para cultivo in vitro. La esterilización de los medios de cultivo,
y material se llevó acabo en el autoclave a 15 lb/in² durante 15 minutos, las pinzas
y cajas en horno a temperatura de 180º C en un tiempo de 2 horas.
Se utilizaron semillas de palo fierro (Olneya tesota) como material biológico las
cuales fueron seleccionadas de un solo árbol en la costa de Hermosillo. Se
lavaron con una solución jabonosa por 2 minutos. En la campana de flujo laminar,
se remojaron en alcohol al 70% por 30 segundos y se sumergieron en hipoclorito
de sodio “cloralex” al 5% por 25 minutos. Posteriormente se les realizaron 3
enjuagues con agua destilada estéril para eliminar el hipoclorito de sodio y por
último se coloco una semilla en un frasco “Gerber” con contenido de 20 ml de
agar-agar enriquecido con sacarosa, sales de Murashigne y Skoog, y
fitoreguladores. Una vez terminado este procedimiento se obtuvó el material
vegetativo para utilizarse en las siguientes fases del experimento figura 7.
Figura 7. Plántulas asépticas de palo fierro (Olneya tesota) germinadas in vitro obtenidas en el laboratorio de cultivo de tejidos. ITSON, 2002.
2.3.2 Etapa II: Determinación de la mejor concentración de fitorreguladores para la micropropagación masiva del palo fierro (Olneya tesota) En esta fase se utilizarán las plántulas obtenidas en la fase anterior y se cuidarán
las condiciones de asepsia necesarias para la siembra. Los pasos ha seguir son
los siguientes:
2.3.1.1 Selección de las plántulas Se seleccionaron las mejores plántulas con características muy semejantes
(homogeneidad) para ser donadoras de los explantes: yema axilar, hoja, tallo,
figura 8.
Figura 8. Plantas de palo fierro (Olneya tesota) germinadas in vitro seleccionadas para la micropropagación. ITSON, 2002.
2.3.1.2 Siembre de los explantes en el medio de cultivo
Se sembraron 108 unidades experimentales, distribuidas en los 9 tratamientos
con 4 repeticiones, observándose su desarrollo figura 9. Cada explante se sembró
en un frasco Gerber con 20 ml de medio de cultivo de Murashige y Skoog (MS)
según los 9 diferentes tratamientos de fitorreguladores tipo auxina (ácido
naftalenacético) y citocinina (6 bencilaminopurina) figura 10.
Figura 9. Siembra de explantes en la campana de flujo laminar, ITSON, 2002. 2.3.1.3 Incubación de los medios sembrados in vitro
Los frascos se colocaron en el cuarto de incubación, a una temperatura de 25º
±2º C y fotoperíodo de 16/8 horas luz, figura 11.
Se realizaron observaciones cada tercer día. Se anotaron resultados, para realizar
los análisis estadísticos y ahí derivar conclusiones.
Figura 10. Acomodo de los tratamientos, en el cuarto de incubación. ITSON, 2002.
Figura 11. Tratamientos en el cuarto de incubación. ITSON, 2002.
lll. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Germinación in vitro de las semillas de palo fierro (Olneya tesota) y obtención de plántulas asépticas donadoras de explantes, (tallo hoja y yema axilar)
Se obtuvieron 40 plántulas asépticas de las semillas de palo fierro (Olneya tesota)
seleccionándose las mas vigorosas para utilizarlas en la etapa dos. El porcentaje de
contaminación en esta etapa fue del 10%.
3.2 Determinación de la dosis optima de reguladores (fitorreguladores) de crecimiento (A-C) en los explantes: hoja, tallo y yema axilar, para la multiplicación masiva de palo fierro (Olneya tesota)
En esta fase, se disectarón los explantes y se les aplicaron las combinaciones en
dosis de reguladores, los resultados se observan en las tablas correspondientes.
3.3 Formación de callo Yerman y Macleod, (1977) indican que la inducción del callo a partir de una porción
vegetal sucede cuando el inóculo ya estéril se pone en contacto con un medio de
cultivo que induzca y mantenga un crecimiento y una división celular continua.
En la figura 12, se observa la formación de callo como una aglomeración de masa,
presentando una variabilidad en su forma como consecuencia de que no existe una
diferenciación. Esta aglomeración presenta una infinidad de células las cuales
pueden ser inducidas para diferenciarlas, y posteriormente dar la formación de
plántulas. De acuerdo con lo anterior se confirma que la formación de callo se
presentó en el experimento por la inducción de los reguladores de crecimiento “A-C”
en combinación de dosis de 0.0 a 0.2 mg/ml. De igual forma los explantes (hoja,
tallo y yema axilar) utilizados también provocaron una reacción positiva para formar
callo.
Figura 12. Formación de callo, ITSON, 2002.
3.3.1 Análisis estadístico para ver el efecto de explante y dosis sobre la formación de callo
En la siguiente figura (13), se muestra la clasificación del modelo de regresión
logística, de un total de 108 casos, 70 presentaron formación de callo, y 38 no
formaron callo. Donde si se presento callo, el modelo clasifica correctamente 67
sobre los 70 con un porcentaje de 95.71, y de los 38 que no formaron callo el
modelo clasifica correctamente 21 con un porcentaje de 55.26. Con esto podemos
decir que si hay un ajuste del modelo con los datos que se utilizaron, se observa que
en total de casos el 81.48% es clasificado correctamente.
Classification Table for CALLO The Cut Value is .50 Predicted .00 1.00 Percent Correct 0 I 1 Observed +-------+-------+ .00 0 I 21 I 17 I 55.26% +-------+-------+ 1.00 1 I 3 I 67 I 95.71% +-------+-------+ Overall 81.48%
Figura 13. Clasificación de la regresión logística, ITSON, 2002. En la figura 14 (histograma) se observan las probabilidades estimadas por el modelo
para todos los sujetos de la muestra, del punto de corte 0.5, hacia el 1 se
representan los valores positivos (formación de callo), y tendiendo a cero los
negativos (no formación de callo).
En el histograma el 1, representa el nivel al que el individuo específico pertenece
realmente y que puede no coincidir con el nivel al que son asignadas según las
probabilidades estimadas a partir de los coeficientes del modelo. Todos los 0,
situados a la derecha de 0.5 corresponden cada uno de ellas a grupos de 1 casos
que no formaron callo, a los que el modelo ha clasificado como que si formaron callo,
y al revés todos los 1 situados al lado izquierdo. Por lo que se observa que solo 3
han sido clasificados incorrectamente, por lo que también el histograma demuestra
que el modelo es muy eficaz.
16 + + I I I I F I I R 12 +0 1 11 + E I0 1 11 I Q I0 1 11 I U I0 1 11 I E 8 +0 1 11 1 11 1 + N I0 1 11 1 11 1 I C I0 0 11 1 11 1 I Y I0 0 11 1 11 1 I 4 +0 1 0 1 1 111 1 11 1 11 1 + I0 0 0 0 1 111 1 11 1 11 1 I I0 0 0 0 0 100 0 11 1 00 1 I I0 0 0 0 0 000 0 01 1 00 1 I Predicted --------------+--------------+--------------+--------------- Prob: 0 .25 .5 .75 1 Group: 000000000000000000000000000000111111111111111111111111111111 Predicted Probability is of Membership for 1.00 The Cut Value is .50 Symbols: 0 - .00 1 - 1.00 Each Symbol Represents 1 Case.
Figura 14. Histograma de probabilidades estimadas.
En la tabla 9, se observan los criterios de medición de ajuste del modelo,
representando que tiene un valore de chi-cuadrada de 48.582, con un nivel de
significancia igual a 0, lo cual nos indica que al menos un factor tiene efecto
diferente.
Tabla 9. Resultados de criterios de medición de ajustes del modelo a los datos. ITSON, 2002.
Chi-Square df Significance Model 48.582 10 .0000 Block 48.582 10 .0000 Step 48.582 10 .0000
En la tabla 10 se observan los coeficientes estimados para la regresión logística en la
formación de callo. En el modelo de regresión se utiliza un coeficiente comparativo
para observar el rango de aparición del suceso, este coeficiente comparativa es la
dosis (9) y, el explante(3).
El explante 1 “hoja”, y el explante 2 “tallo”, se compara con el explante 3 “yema
axilar”, los cuales presentan una β negativo por lo que se considera que el explante
yema axilar es mejor. De igual forma el Exp(β) esta por debajo de uno, por lo que se
considera que es más probable tener éxito en el explante 3 para formar callo, que
en el explante 1 y 2, a su vez se observa el R coeficiente de correlación es mucho
mas alejado del 0.
En relación a la dosis de reguladores, de un total de 9 dosis se utilizó la ultima dosis
(9) como comparativa, entre estas se encuentra un testigo, en el cual se observa
que la β es la más pequeña, el margen de error es mayor y el exp(β) es el único
que es igual a cero, lo cual indica que hay cero probabilidad de formar callo en esta
dosis en relación a la dosis 9, de igual forma en las dosis 2, 4, 5, y 7 que por igual
son negativas, pero su margen de error es mucho mas pequeño que el de la dosis 1,
a su vez ningún exp(β) da mayor que uno. En las dosis 3, 6, y 8 se muestra lo
contrario un signo positivo, indicando que son mejores en relación a la dosis 9, pero
en si la que tiene una valor más cercano a uno es la dosis 6, su Exp(β) es el mayor
por lo que se considera que esta dosis es la más propia para formar callo en relación
a la dosis 9.
De lo anterior podremos indicar que la mejor dosis para formar callo es la dosis
numero 6 comparada con la dosis 9. La dosis 6 representa la mejor dosis de
reguladores en la regresión logística para la formación de callo, esta dosis se
compone por 0.1, y 0.2 mg/ml de relación Auxina-Citocinina, a su vez se observa
que se requiere de ambos reguladores de crecimiento, para la formación de callo.
Tabla 10. Parámetros estimados del modelo de regresión logística. ITSON, 2002.
Variable B E.T. Wald gl Sig R EXPLANTE 9.6846 2 .0079 .2014 EXPLANTE (1) -1.7978 .6566 7.4972 1 .0062 -.1981 EXPLANTE (2) -.2428 .6985 .1209 1 .7281 .0000 DOSIS 9.8133 8 .2784 .0000 DOSIS (1) -11.1989 27.6729 .1638 1 .6857 .0000 DOSIS (2) -1.4608 1.0400 1.9731 1 .1601 .0000 DOSIS (3) 1.74E-16 1.1526 .0000 1 1.0000 .0000 DOSIS (4) -.5753 1.0839 .2817 1 .5956 .0000 DOSIS (5) -1.8525 1.0379 3.1856 1 .0743 -.0920 DOSIS (6) .8517 1.3486 .3989 1 .5277 .0000 DOSIS (7) -1.4608 1.0400 1.9731 1 .1601 .0000 DOSIS (8) 7.09E-16 1.1526 .0000 1 1.0000 .0000 Constan 2.5051 .9529 6.9114 1 .008 Continuación tabla 10.
95% CI for Exp(B) Variable Exp(B) Lower Upper EXPLANTE(1) .1657 .0457 .5999 EXPLANTE(2) .7844 .1995 3.0837 DOSIS(1) .0000 .0000 4.915E+18 DOSIS(2) .2320 .0302 1.7816 DOSIS(3) 1.0000 .1045 9.5739 DOSIS(4) .5625 .0672 4.7075 DOSIS(5) .1568 .0205 1.1994 DOSIS(6) 2.3437 .1667 32.9471 DOSIS(7) .2320 .0302 1.7816 DOSIS(8) 1.0000 .1045 9.5739
3.3.1.1 Análisis de varianza para observar el efecto de la dosis y explantes en diámetro de callo Después de observar el efecto sobre la formación de callo se realizo análisis de
varianza para ver si presentan efecto la dosis y explantes sobre el diámetro de callo.
La tabla 11, indica que estadísticamente no existen diferencias significativas entre
los explantes, de esto podemos decir que cualquier explante, hoja, tallo y yema
axilar, inducen a un mismo diámetro de callo.
Para la dosis de reguladores se observa que existen diferencias, por lo que se
realiza una comparación de medias.
Tabla 11. Análisis de varianza para la variable diámetro de callo, ITSON, 2002.
Analysis of Variance for callo - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Explante 0.625702 2 0.312851 1.40 0.2541 B:Dosis 3.63222 8 0.454028 2.04 0.0575 RESIDUAL 13.1619 59 0.223083 TOTAL (CORRECTED) 17.3899 69
3.3.1.2 Comparación promedio para determinar la dosis óptima de reguladores en diámetro de callo
Comparación de medias por el método de Duncan con un 90 porciento de
confiabilidad, tabla 12.
Los tratamientos 3, 9, 6, 8, 4, son diferentes del 1, 2, 5, 7, se observa que la media
menor fue el testigo.
Tabla 12. Comparación promedio en diámetro de callo para determinar la dosis óptima de reguladores de crecimiento, ITSON, 2002.
Multiple Range Tests for callo por tratamiento
Method: 90.0 percent Duncan Dosis Count LS Mean Homogeneous Groups
1 1 0.437869 X 2 6 0.734882 XX 5 6 0.768216 XX 7 7 0.906122 XX 3 10 1.04379 X 9 10 1.16336 X 6 11 1.27922 X 8 10 1.34286 X 4 9 1.34603 X
Las respuestas cualitativas y cuantitativas del crecimiento del callo en cultivo
involucran un sinergismo estrecho y complejo entre el origen del tejido usado para la
primera inducción, la composición del medio y las condiciones físicas que
prevalecen durante esta etapa (Dodds y Roberts, 1982). De acuerdo con lo anterior
se observa que, aparte del las condiciones del medio de cultivo las características
físicas fueron apropiadas para el desarrollo de callo en esta investigación.
3.4 Análisis de la variable color para determinar la dosis óptima de reguldadores de crecimiento para la propagación de palo fierro (Olneya tesota)
Se utilizaron tablas de contingencia para avaluar la variable color. El nivel de color
indica el grado de oxidación (café), el color normal (verde), y clorosis (blanco) que es
la falta de nutrientes mostrando despigmentación, o ausencia de clorofila.
El análisis para los porcentajes de color en callo en relación a los 9 tratamientos se
pueden observar en la figura 15. Aquí podemos analizar que el explante que
presentó mejor color verde fue la yema axilar, seguida por el tallo y por último la
hoja.
3.4.1 Coloración para yema axilar Se observa que todos los tratamientos presentaron coloración verde, como
indicador de respuesta positiva. Esto se observa con mayor efecto en las
concentraciones 2, 3 y 8 representando el 100% de coloración, seguidos por el 1,
4, 6, 9, con un 75% y por último los tratamientos 5 y 7 que fueron los más bajos
con un 50% de coloración, (tabla 12).
A su vez en el explante yema axilar se puede observar que todas las
concentraciones presentaron valores

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