Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der Serinpromediatum.ub.tum.de/doc/601134/document.pdfEwa Zeslawska, Dr. Uwe Jakob undProf. Dr. Robert Huber (Abteilung Strukturforschung)

Max-P lanck- Ins t i tu t fü r B iochemie

Mar t ins r i ed

Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren

der Serinproteasen uPA und FXa

Neuartige Wirkstoffe zur anti-metastatischen bzw. anti-thrombotischen

Therapie

Dissertation

Stefan Sperl

Martinsried 2000

online: http://tumb1.biblio.tu-muenchen.de/publ/diss/allgemein.html

Max-P lanck- Ins t i tu t fü r B iochemie

Mar t ins r i ed

Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der

Serinproteasen uPA und FXa

Neuartige Wirkstoffe zur anti-metastatischen bzw. anti-thrombotischen Therapie

Stefan Sperl

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Chemie der Technischen

Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

genehmigten Dissertation.

Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. Dr. Adelbert Bacher

Prüfer der Dissertation: 1. apl. Prof. Dr. Luis Moroder

2. Univ.-Prof. Dr. Johannes Buchner

3. Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Hiller

Die Dissertation wurde am 13.06.2000 bei der Technischen Universität München

eingereicht und durch die Fakultät für Chemie am 18.07.2000 angenommen.

Teile der vorliegenden Arbeit wurden wie folgt zusammengefaßt:

Publikationen:

Sperl, S.; Bergner, A.; Stürzebecher, J.; Bode, W.; Moroder, L. (2000). Urethanyl-3-

Amidinophenylalanine Derivatives as Inhibitors of Factor Xa; X-Ray Crystal Structure

of a Trypsin/Inhibitor Complex and Modeling Studies. Biol. Chem. 381, 321-329.

Sperl, S.; Jacob, U.; Arroyo de Prada, N.; Stürzebecher, J.; Wilhelm, O. G.; Bode, W.;

Magdolen, V.; Huber, R.; Moroder, L. (2000). (4-aminomethyl)-phenylguanidine

derivatives as non-peptidic highly selective inhibitors of human urokinase. X-ray crystal

structure of an uPA/inhibitor complex at 1.8 Å resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

97, 5113-5118.

Zeslawska, E.; Schweinitz, A.; Karcher, A.; Sondermann, P.; Sperl, S.; Stürzebecher, J.;

Jacob, U. (2000). Crystals of the urokinase type plasminogen activator variant βc-uPAin complex with small molecule inhibitors open the way towards structure based drug

design. J. Mol. Biol. 301, 465-475.

Magdolen, V.; Arroyo de Prada, N.; Sperl, S.; Muehlenweg, B.; Luther, T.; Wilhelm, O.

G.; Magdolen, U.; Graeff, H.; Reuning, U.; and Schmitt, M. (2000). Natural and

synthetic inhibitors of the tumor-associated serine protease urokinase-type plasminogen

activator. Adv. Exp. Med. Biol. 477, 331-342.

Bürgle, M.; Sperl, S.; Stürzebecher, J.; Schmalix, W.; Kessler, H.; Magdolen, V.; Wilhelm,

O. G.; Schmitt, M. (2000). Urokinase and its Receptor (CD87): new targets for tumor

therapy. in: Proteinase and peptidase inhibition: recent potential targets for drug

developement. (Smith, J. & Simons, C., ed.), Gordon & Breach Science Publishers,

Lausanne, Suisse. (im Druck).

Schmitt, M.; Wilhelm, O. G.; Reuning, U.; Krüger, A.; Harbeck, N.; Lengyel, E.; Graeff,

H.; Gänsbacher, B.; Kessler, H.; Bürgle, M.; Stürzebecher, J.; Sperl, S.; Magdolen, V.

(2000). The urokinase plasminogen activator system as a novel target for tumour

therapy. Fibrinolysis & Proteolysis 14, 114-132.

Patentanmeldungen:

Sperl, S., Moroder, L., Magdolen, V., Stürzebecher, J., Wilhelm, O. G. (1999). Selektive

Inhibitoren des Urokinase -Plasminogen Aktivators. (DE 199 403 89.9)

Sperl, S., Jacob, U., Arroyo de Prada, N., Stürzebecher, J., Wilhelm, O. G., Bode, W.,

Magdolen, V., Huber, R., Moroder, L. (2000). Hochselektive Inhibitoren des Urokinase-

Plasminogenaktivators. (DE 100 137 15.6)

Sperl, S., Stürzebecher, J, Moroder, L. (2000). Derivate des (R)-3-Amidinophenylalanins

als Inhibitoren des Faktors Xa (eingereicht).

Vorträge:

Sperl, S. (1998). Design and synthesis of substrate-based inhibitors of urokinase. 16th

Winter School on Proteinases and their Inhibitors. Recent Developments. Tiers, Italien.

Sperl, S. (1999). New Lead Structures for uPA and Factor Xa Inhibitors. 17th Winter

School on Proteinases and their Inhibitors. Recent Developments. Tiers, Italien.

Sperl, S. (1999). Design und Synthese von selektiven uPA Inhibitoren. 4. Jenaer

Proteolysetag, DFG-Rundgespräch, Erfurt.

Sperl, S. (2000). Design, Synthesis and X-Ray Structure of a new class of selective uPA

Inhibitors. International Symposium on Proteinase Inhibitors and Activators – Strategic

Targets for Therapeutic Intervention, Oxford, UK.

Poster:

Sperl, S.; Jacob, U.; Arroyo de Prada, N.; Stürzebecher, J.; Wilhelm, O. G.; Bode, W.;

Magdolen, V.; Huber, R.; Moroder, L. (2000). Design, synthesis and X-ray crystal

structure of a new class of selective uPA-inhibitors. 15th International Congress on

Fibrinolysis and Proteolysis, Hamamatsu, Japan.

Meinen Eltern

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Juni 1997 bis Juni 2000 am Max-

Planck-Institut für Biochemie in Martinsried unter Anleitung von Herrn Prof. Dr.

Luis Moroder angefertigt.

Mein besonders herzlicher Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Luis

Moroder, der mir diese sehr interessante Aufgabe gestellt hat. Er hatte immer ein

offenes Ohr für unkonventionelle Ideen und ließ mir gleichzeitig den nötigen

Freiraum zur Ausgestaltung des Themas und zur Umsetzung der Ideen. Darüber

hinaus möchte ich mich bei ihm auch für die übertragene Verantwortung innerhalb

der Arbeitsgruppe und das mir damit erwiesene Vertrauen bedanken.

Desweiteren bedanke ich mich recht herzlich bei allen Kooperationspartnern, ohne

die diese interdisziplinäre Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Ich danke

Ewa Zeslawska, Dr. Uwe Jakob und Prof. Dr. Robert Huber (Abteilung

Strukturforschung) für die Röntgenstrukturanalyse des uPA/Inhibitor-Komplexes,

Dr. Andreas Bergner und Prof. Dr. Wolfram Bode (Abteilung Strukturforschung)

für die Röntgenstrukturanalyse des Trypsin/FXa-Inhibitor-Komplexes und die

Durchführung der Modelling-Experimente,

PD Dr. Jörg Stürzebecher, Christa Böttner und Reiner Sieber (Klinikum der

Universität Jena, Zentrum für vaskuläre Biologie und Medizin, Erfurt) für die

rasche Bestimmung der Inhibitionskonstanten und die pharmakokinetischen

Untersuchungen,

Nuria Arroyo de Prada und Dr. Viktor Magdolen (Klinikum rechts der Isar der

Technischen Universität München) für die Toxizitätsuntersuchungen und die

zahlreichen interessanten und hilfreichen Diskussionen,

Prof. Dr. Marianne Jochum und Prof. Dr. Hans Fritz für die finanzielle

Unterstützung durch den Sonderforschungsbereich 469 der LMU München.

Mein weiterer Dank gilt:

PD Dr. Olaf G. Wilhelm (Wilex Biotechnology GmbH, München) für sein großes

Vertrauen und Interesse an meiner Arbeit.

Der ganzen Arbeitsgruppe „Bioorganische Chemie“, die mich sehr freundlich

aufgenommen hat und deren Mitglieder mich stets nach Kräften unterstützt haben.

Namentlich hervorheben möchte ich Constanze Müller, die sehr viel Zeit und

Geduld bewies, um einen ehemaligen „Anorganiker“ in einen brauchbaren

bioorganischen Chemiker zu konvertieren. Günther Loidl, der mich bei etlichen

Gläsern Wein den Frust über nicht-inhibierende „Inhibitoren“ vergessen ließ.

Bernhard Gabriel und Norbert Schaschke danke ich für die zahlreichen

Diskussionen bei Syntheseproblemen. Besonders danken möchte ich Jürgen Musiol,

der zu jedem Problem stets hilfreiche Literatur bereithielt, aber auch für die netten

Kaffeepausen. Lissy Weyher und Sigi Bauer danke ich für die zuverlässige

Durchführung der Massenspektrometrie ebenso wie Hans Stocker für seine Hilfe

bei allen technischen Fragen. Meinem „Nachfolger“ Markus Michael Müller

wünsche ich weiterhin viel Erfolg und danke ihm, daß er mich diese Arbeit

weitgehend ungestört schreiben ließ. Vielen Dank auch an Bernd Mühlenweg, der

sich drei Jahre mit mir eine Stelle teilen mußte und während unserer

„Gründungsphase“ viel Engagement bewies.

Bei meiner WG (Ela, Flo, Julia und Amely) bedanke ich mich herzlichst für die

lustige Zeit und für das große Verständnis, wenn ich mich mal wieder um die

Hausarbeit gedrückt habe.

Besonderer Dank gebührt schließlich meinem cariñito Nuria, die mir durch ihre

unendliche Liebe die Freizeit versüßt und immer für mich da ist.

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung __________________________________________________________ 1

1.1. Klassifizierung der Proteasen _____________________________________________ 1

1.2. Struktur trypsin-ähnlicher Serinproteasen __________________________________ 2

1.3. Struktur der aktiven Zentren von Faktor Xa, uPA, Thrombin, tPA und Trypsin __ 4

2. Urokinase Inhibitoren ________________________________________________ 7

2.1. Die Rolle von uPA bei der Tumorprogression und Metastasierung ______________ 7

2.2. Der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator__________________________________ 10

2.3. Das uPA-uPAR-System _________________________________________________ 12

2.4. Klinische Relevanz von uPA, uPAR, PAI-1 und PAI-2 _______________________ 13

2.5. Inhibition des uPA-uPAR-Systems – Prinzipielle Therapieansätze______________ 14

2.6. uPA-Inhibitoren _______________________________________________________ 16

2.6.1. Natürliche uPA-Inhibitoren _________________________________________________ 16

2.6.2. Synthetische uPA-Inhibitoren________________________________________________ 18

2.7. Zielsetzung____________________________________________________________ 21

2.8. Ergebnisse und Diskussion ______________________________________________ 22

2.8.1. Tripeptid-Methylketone ____________________________________________________ 22

2.8.2. Phenylguanidin-Derivate als selektive uPA-Inhibitoren____________________________ 27

3. Faktor Xa Inhibitoren________________________________________________ 51

3.1. Die Blutgerinnungskaskade ______________________________________________ 51

3.2. Natürliche und synthetische FXa Inhibitoren _______________________________ 54

3.3. Zielsetzung____________________________________________________________ 59

3.4. Ergebnisse und Diskussion ______________________________________________ 60

3.4.1. Inhibition von FXa und verwandten trypsin-ähnlichen Serinproteasen ________________ 60

3.4.2. Synthese von 3- und (4-Amidino)-Phenylalanin-Derivaten _________________________ 63

3.4.3. Röntgenstrukturanalyse des FXa-Inhibitors 84 im Komplex mit Trypsin und Modelling-

Experimente _____________________________________________________________ 64

3.4.4. Einfluß der Chiralität von Amidino-Phenylalanin-Derivaten auf die Inhibition von FXa __ 69

4. Zusammenfassung und Ausblick _______________________________________ 73

4.1. uPA-Inhibitoren _______________________________________________________ 73

4.2. FXa-Inhibitoren _______________________________________________________ 74

5. Summary __________________________________________________________ 77

5.1. uPA-inhibitors_________________________________________________________ 77

5.2. fXa-inhibitors _________________________________________________________ 78

6. Experimenteller Teil _________________________________________________ 80

6.1. Materialien und Methoden ______________________________________________ 80

6.2. Enzymkinetik _________________________________________________________ 82

6.2.1. Ermittlung der Inhibitionskonstanten (Ki-Werte)_________________________________ 82

6.2.2. Eingesetzte Enzyme und Substrate zur Ki-Wert-Bestimmung _______________________ 82

6.3. Röntgenstrukturanalyse des Inhibitor/uPA Komplexes _______________________ 83

6.3.1. Kristallisation mit Benzamidin als Inhibitor_____________________________________ 83

6.3.2. Soaking des uPA-Inhibitors 75 und Röntgenstrukturanalyse ________________________ 84

6.4. Röntgenstrukturanalyse des Faktor Xa Inhibitor 84/Trypsin-Komplexes ________ 85

6.5. Modelling-Experimente mit Faktor Xa Inhibitoren __________________________ 87

6.6. In vivo Eliminationsstudien ______________________________________________ 87

6.7. Toxizitätsstudien am uPA Inhibitor 75 ____________________________________ 88

6.8. Synthese der uPA Inhibitoren ____________________________________________ 89

6.8.1. Tripeptid-Methylketone ____________________________________________________ 89

6.8.2. nicht-peptidische Inhibitoren / Phenylguanidine _________________________________ 90

6.9. Synthese der Faktor Xa Inhibitoren ______________________________________ 111

7. Literaturverzeichnis ________________________________________________ 121

Abkürzungen

Die Nomenklatur der Aminosäuren und Peptide entspricht den Vorschlägen der

IUPAG-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur (Europ. J. Biochem.,

1984, 138, 9-37)

Ac Acetyl

ACN Acetonitril

AcOH Essigsäure

AcOEt Essigsäure-Ethylester

Adoc 1-Adamantyloxycarbonyl

ATF Aminoterminales Fragment des uPA

Boc tert-Butyloxycarbonyl

ber. berechnet

Bz Benzyl

DC Dünnschichtchromatografie

DCC N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid

DCM Dichlormethan

DIEA Diisopropylethylamin

DIPE Diisopropylether

DMF Dimethylformamid

ESI Elektro-Spray-Ionisierung

EtOH Ethanol

FAB Fast Atom Bombardement

Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl

FXa Faktor Xa (aktiviert)

h Stunde(n)

HBTU O-(Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium

Hexafluorophosphat

HOBt 1-Hydroxybenzotriazol

HOSu Hydroxysuccinimid

HPLC High Performance Liquid Chromatographie

HV Hochvakuum

i-PrOH Isopropanol

Ki Inhibitionskonstante

LM Lösungsmittel

M Molar

MS Massen-Spektrometrie

MeOH Methanol

n. b. nicht bestimmt

p. a. Pro Analyse

PAI-1/2 Plasminogenaktivator-Inhibitor Typ 1/2

Pbf 2,2,4,4-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl

pNA p-Nitroanilid

Rf Retentionsfaktor in der Dünnschichtchromatographie

RT Raumtemperatur

TBTU 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-

tetrafluoroborat

TFA Trifluoressigsäure

TFE Trifluorethanol

TIPS 2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl

Tos p-Toluolsulfonyl

tR Retentionszeit in der HPLC

uPA Urokinase-Typ Plasminogenaktivator

uPAR uPA-Rezeptor

Z Benzyloxycarbonyl

1. Einleitung 1

1. Einleitung

1.1. Klassifizierung der Proteasen

Proteolytische Enzyme sind eine große und wichtige Gruppe von Proteinen die eine

Spaltung von Peptidbindungen katalysieren. Eine grobe Einteilung der Proteasen

läßt sich nach ihrem unterschiedlichen Katalysemechanismus vornehmen (Barrett,

A. J. et al. 1998).

A. Endopeptidasen: katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen im

inneren der Polypeptidkette

1. Serin-Proteasen Serin, Histidin und Aspartat im aktiven Zentrum

2. Cystein-Proteasen Cystein im aktiven Zentrum

3. Aspartat-Proteasen Aspartat-Reste im aktiven Zentrum

4. Metalloproteasen Metallion im aktiven Zentrum

5. Nicht klassifizierte Proteasen

B. Exopeptidasen: katalysieren die Abspaltung einer oder mehrerer

Aminosäuren vom N- oder C-Terminus des Substrats

1. Aminopeptidasen spalten eine Aminosäure vom N-Terminus ab

2. Dipeptidyl-Peptidasen spalten zwei Aminosäuren vom N-Terminus ab

3. Tripeptidyl-Peptidasen spalten drei Aminosäuren vom N-Terminus ab

4. Carboxy-Peptidasen spalten eine Aminosäuren vom C-Terminus ab

5. Peptidyl-Dipeptidasen spalten zwei Aminosäuren vom C-Terminus ab

Jede der aufgeführten Klassen läßt sich in Unterklassen („Clans“) aufteilen. Die

Serinproteasen werden zum Beispiel nach der Aminosäuresequenz ihrer

katalytischen Reste Asp, His und Ser unterteilt. Für trypsin-ähnliche Serinproteasen

gilt also die sequenzabhängige Reihenfolge His57–Asp102–Ser195, wohingegen

Subtilisin (eine extrazelluläre Endopeptidase aus Bacillus subtilis) die Reihenfolge

1. Einleitung 2

Asp–His–Ser aufweist. Die folgenden Kapitel befassen sich näher mit der Klasse

der trypsin-ähnlichen Serinproteasen.

1.2. Struktur trypsin-ähnlicher Serinproteasen

Die dreidimensionale Röntgenstruktur des Rinder-Trypsins wurde bereits 1974

aufgeklärt (Huber, R. et al. 1974) und entwickelte sich zum Prototypen der

Serinproteasen mit Argininspezifität. Die Tertiärstrukturen dieser Enzyme zeigen

ein stark konserviertes Strukturmerkmal, obwohl die Primärstrukturen stark

voneinander abweichen können. Das allgemeine Nummerierungssystem der

Aminosäurereste folgt dem der homologen Protease Chymotrypsin. Chymotrypsin

hat eine beinahe identische Tertiärstruktur wie Trypsin, obwohl die beiden Enzyme

weniger als 50% Identität in der Primärstruktur aufweisen und Chymotrypsin eine

Substratspezifität für aromatische Reste besitzt. Die Positionen von

„Schlüsselresten“, wie jenen der katalytischen Triade (Asp102, His57 und Ser195) und

Asp189 am Boden der S1-Spezifitätstasche, sind in allen trypsin-ähnlichen

Serinproteasen identisch.

Die Tertiärstruktur dieser Proteasen besteht vorwiegend aus β-Faltblättern. Sie ist

charakterisiert durch 2 Domänen, wobei jede Domäne ein „β-barrel“ ausbildet. Die„Active-Site Cleft“ mit der katalytischen Triade ist genau zwischen den beiden

Domänen lokalisiert (Abbildung 1). Jede der „barrel“-ähnlichen Domänen ist aus 6

anti-parallel laufenden Strängen aufgebaut, wobei 4 der 5 verbindenden „loops“

Haarnadel-Schleifen sind. Neben wenigen, kurzen Helices besitzen alle Enzyme

eine lange C-terminale α-Helix (Abbildung 1, rot).

Mitte Mai 2000 verzeichnete die Brookhaven Protein-Datenbank 160

Röntgenkristallstrukturen von Trypsin, 97 von Thrombin, 4 von Faktor Xa und 2

vom Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (uPA). Viele dieser Strukturen sind

Komplexe mit synthetischen oder natürlichen Inhibitoren, die aufgeklärt wurden,

um die Bindung und Selektivität der Inhibitoren rationell verbessern zu können. Die

1. Einleitung 3

Tatsache, daß es vergleichsweise wenige Röntgenstrukturen von FXa und uPA gibt,

spiegelt die Schwierigkeiten wieder, die bei der Kristallisation dieser beiden

Enzyme auftreten. Da aber gerade diese Enzyme interessante Zielmoleküle in der

Therapie schwerwiegender Erkrankungen darstellen, kann man die hohe strukturelle

Ähnlichkeit der trypsin-ähnlichen Serinproteasen nutzen und Komplexstrukturen

von FXa- oder uPA-Inhibitoren mit Trypsin anfertigen.

Abbildung 1: Richardson-Diagramm der Tertiärstruktur von β-Trypsin imKomplex mit dem Thrombin-Inhibitor NAPAP (PDB-Code:

1PPC). Die Sekundärstrukturelemente α-Helix und β-Faltblattsind dargestellt als helikales Band bzw. verdrehte Pfeile (Bode,

W. et al. 1990)

1. Einleitung 4

Anschließend überlagert man die Trypsin/Inhibitor-Komplexstruktur mit einer

bekannten Struktur des Targetenzyms und erhält so Informationen über den

Bindungsmodus des Inhibitors (Banner, D. W. et al. 1991; Bode, W. et al. 1990;

Gabriel, B. et al. 1998; Matsuzaki, T. et al. 1989; Renatus, M. et al. 1998; Stubbs,

M. T. et al. 1995; Turk, D. et al. 1991).

1.3. Struktur der aktiven Zentren von Faktor Xa, uPA, Thrombin, tPA

und Trypsin

Obwohl Sekundär- und Tertiärstruktur aller trypsin-ähnlichen Serinproteasen

identisch sind, unterscheiden sie sich doch in einigen Bereichen entscheidend in der

Aminosäuresequenz (Primärstruktur). Gerade diese Unterschiede sind es aber, die

für die Selektivität der einzelnen Proteasen verantwortlich zeichnen. In Abbildung 2

sind die strukturellen Gemeinsamkeiten und Unterschiede der aktiven Zentren (S1-

S3/S4) von Faktor Xa, uPA (Urokinase-Typ Plasminogenaktivator), Thrombin, tPA

(Gewebe-Typ Plasminogenaktivator) und Trypsin schematisch dargestellt (Renatus,

M. et al. 1998).

Allen trypsin-ähnlichen Serinproteasen gemeinsam ist die relativ tiefe,

argininspezifische S1-Tasche. Die selektive Erkennung der basischen

Argininseitenkette erfolgt über die Ausbildung einer Salzbrücke zwischen der

positiv geladenen Guanidiniumfunktion des Arginins und der negativ geladenen

Carboxylgruppe des Asp189 am Boden der S1-Tasche. In uPA und Trypsin ist

außerdem die Bildung einer Wasserstoffbrücke zwischen der Seitenkette des Ser190-

Restes und der ε-NH Gruppe der Guanidinofunktion möglich. DieseWechselwirkung ist bei Thrombin, FXa und tPA nicht möglich, da diese Enzyme

anstelle von Serin eine Alanin-Mutation besitzen.

In der S2-Region gibt es bereits größere Unterschiede. Durch den sogenannten „60-

Insertion-Loop“ – bestehend aus Tyr60A, Pro60B, Pro60C und Trp60D – ist diese Region

1. Einleitung 5

zusammen mit His57, Ser214 und Leu99 in Thrombin zu einer großen, lipophilen

Tasche ausgebildet, die z. B. Prolinreste in P2 sehr gut beherbergen kann. Bei uPA

tritt hingegen der entgegengesetzte Effekt auf. Hier ist die S2-Tasche durch den

„99-Insertion-Loop“ aus Thr98A und Leu98B in Verbindung mit His99 stark

verkleinert, so daß in dieser Region nur kleine Aminosäurereste wie Glycin binden

können. Dieser „99-Loop“ hat Auswirkungen bis in die S3/S4-Region, die in uPA

ebenfalls räumlich beschränkt und sehr hydrophob ist.

Die S3/S4-Region von Faktor Xa ist größer als die von uPA und ebenfalls sehr

hydrophob. Am Ende dieser Region befindet sich jedoch ein elektronegativer

Hohlraum, der von Glu97 und den Carbonyl-Sauerstoffen von Ile75 und Thr98 erzeugt

wird. Dieser Bereich kann z. B. von bis-basischen synthetischen Inhibitoren für eine

weitere ionische Interaktion genutzt werden (Gabriel, B. et al. 1998). Allerdings

besitzen auch tPA und Thrombin diesen elektronegativen Bereich, so daß auf diese

Weise keine selektiven FXa-Inhibitoren erzeugt werden können. Andererseits ist die

S3/S4-Region von tPA durch die räumliche Nähe der Arg174-Seitenkette weniger

hydrophob als die entsprechende Region in FXa, Trypsin oder Thrombin.

1. Einleitung 6

HN

O

OO

NH2

NH2N

O O

Asp189

Tyr99

Thr98

Asp97Thr175

Arg174

Trp215

Leu217

δ− δ−

δ−

OH

HN

O

OO

O O

Asp189

Tyr99

Thr98

Glu97Ile175

Phe174

Trp215

Glu217

δ− δ−

δ−

OH

O

O

O O

Asp189

His99

Trp215

Arg217

NH

HN

NH2H N2

NH

NH

Leu98BThr98AHO

OH

Tyr272

HN

O

O

O O

Asp189

Leu99

Thr98

Asn97

Gln175

Trp215

Ser217

δ−

δ−

HO

O N

HN

O

OO

O O

Asp 189

Thr 98

Arg 97Val 175

Ile 174

Trp 215

Glu 217

δ− δ−

δ−

O

O

Leu 99

Trp 60D

Pro 60C

Pro 60B

Tyr 60A

OH

Faktor Xa uPA

Thrombin

tPA Trypsin

Abbildung 2: Schematische Darstellung der aktiven Zentren von FXa, uPA,

Thrombin, tPA und Trypsin

2. Urokinase Inhibitoren 7

2. Urokinase Inhibitoren

2.1. Die Rolle von uPA bei der Tumorprogression und Metastasierung

Bei der Tumorinvasion wandern Tumorzellen aus einem Primärtumor aus, um an

einer entfernten Stelle des Körpers einen Sekundärtumor (Metastase,

Tochtergeschwulst) zu bilden. Dafür sind eine Reihe aufeinanderfolgender

Vorgänge notwendig, welche als metastatische Kaskade bezeichnet werden

(Abbildung 3) (McKinnell, R. G. et al. 1998; Reuning, U. et al. 1998).

Der Prozeß der Metastasierung beinhaltet die Loslösung einzelner Tumorzellen aus

dem Primärtumor-Zellverband, die Adhäsion an und Invasion dieser Zellen durch

die extrazelluläre Matrix, Intravasation, den Transport mit dem allgemeinen

Blutkreislauf, erneute Adhäsion an die Basalmembran, Extravasation und

anschließend erneute Invasion der Zellen durch die extrazelluläre Matrix um die

Metastase zu bilden.

Für den Abbau der extrazellulären Matrix ist eine gerichtete proteolytische Aktivität

der Tumorzelle nötig. Diese wird durch verschiedene proteolytische Systeme

vermittelt, die miteinander interagieren und sich gegenseitig aktivieren (Koblinski,

J. E. et al. 2000). Im Einzelnen sind es

(1) die Serinproteasen Plasmin, uPA und tPA) (Danø, K. et al. 1985; Schmitt, M.

et al. 1997)

(2) die Matrixmetalloproteinasen (MMPs) (Cockett, M. I. et al. 1998; Kahari, V.

M. et al. 1999; Kleiner, D. E. et al. 1999; Westermarck, J. et al. 1999)

(3) die Cysteinproteinasen, z. B. Cathepsin B, H und L (Michaud, S. et al. 1998;

Sloane, B. F. 1990)

(4) die Aspartatproteinasen, z. B. Cathepsin D (Garcia, M. et al. 1996; Rochefort,

H. et al. 1996; Rochefort, H. et al. 1999)


Klonale Expansionund Wachstum

Adhäsion an undInvasion durch die

Basalmembran

Intravasation

Tumorzellhaufen

MetastaseMetastase

Basal-membran

Basal-membran

Primär-tumor

Transformierte Zelle

Metastatischer Subklon

Invasion durch dieExtrazellulärmatrix

Interaktion mitLymphozyten

Tumorzellhaufen

Adhäsion an dieBasalmembran

Extravasation

Metastase

Basal-membran

Basal-membran

Lymphozyt

Vene

Blutplättchen

Basal-membranExtrazellulär-

matrix

Abbildung 3: Weg der Krebszelle vom Primärtumor zum Ort der Metastase nach

McKinnell, R. G. et al. (1998)


uPA/uPAR

Plasminogen

Plasmin

pro-uPA/uPAR +

+Abbau von EZM- Fibrin- Fibronektin- Proteoglykane

Cathepsin B, L

+

pro-MMPs MMPs

+

-

PAI-1,2

+

Abbau vonBasalmembran-Kollagen-

TIMPs

α2-Antiplasmin

-

CystatineSteffine

-

Abbildung 4: Aktivierungskaskade der perizellulären Plasmin-Proteolyse

Eine zentrale Rolle bei der Tumorinvasion und Metastasierung spielt uPA

(Abbildung 4). Nach Bindung des Zymogens pro-uPA an den

zelloberflächengebundenen uPA-Rezeptor (uPAR, CD87) wird uPA rasch durch die

Cathepsine B oder L aktiviert. Die proteolytische Aktivität wird durch die Bindung

an den Rezeptor auf die Zelloberfläche fokussiert. Plasminogen wird durch den

uPA-uPAR-Komplex zu Plasmin aktiviert, das verschiedene Bestandteile der

extrazellulären Matrix abbauen kann. Desweiteren ist Plasmin durch einen positiven

„Feedback“-Mechanismus in der Lage, erneut uPA zu aktivieren. Zum anderen

werden durch uPA auch Matrixmetalloproteasen aktiviert, die schließlich zum

Abbau von Basalmembran-Kollagenen beitragen. Diese proteolytischen Prozesse

ermöglichen den Krebszellen schließlich die Invasion in benachbartes Gewebe

sowie die Metastasierung. Wegen der zentralen Rolle des uPA an diesen

pathologischen Prozessen, stellt die Inhibition der proteolytischen Aktivität des

Plasminogenaktivators ein vielversprechendes Ziel in der Tumortherapie dar.


2.2. Der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator

Der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (Urokinase, uPA, EC 3.4.21.31) wurde

erstmals bereits 1966 von White und Mitarbeitern aus Urin isoliert, wovon sich

auch der Name ableitet (White, W. F. et al. 1966). Das Interesse an diesem Enzym

stieg sprunghaft an, nachdem der schwedische Gynäkologe Åsted entdeckte, daß

uPA sehr stark von humanen Ovarialkarzinomzellen produziert wird (Åstedt, B. et

al. 1976). Inzwischen ist bekannt, daß uPA von einer Vielzahl normaler und

maligner Zellen synthetisiert und sekretiert wird (Danø, K. et al. 1985).

uPA wird als einkettiges Zymogen pro-uPA exprimiert, das aus 411 Aminosäuren

aufgebaut ist, 12 Disulfidbrücken enthält und mit Asn302 über eine

Glykosylierungsstelle verfügt (Wun, T. C. et al. 1982). Das Proenzym besteht aus

drei Domänen, wie in Abbildung 5 dargestellt.

• „Growth-Factor-Like Domain“ (GFD) uPA1-44:

In der N-terminalen GFD-Domäne befindet sich die Bindungsstelle zum

zelloberflächenassoziierten uPA-Rezeptor (Pollanen, J. J. 1993; Stoppelli, M.

P. et al. 1985). Diese Domäne besitzt eine starke Sequenzhomologie mit dem

epidermalen Wachstumsfaktor („Epidermal Growth Factor“, EGF) (Gunzler,

W. A. et al. 1982; Steffens, G. J. et al. 1982). Trotz dieser Homologie besteht

keine Affinität zwischen EGF und uPAR .

• Kringle-Domäne uPA45-135:

Diese Domäne besitzt Affinität zum extrazellulären Matrix-Proteoglykan

Heparin.

• Protease-Domäne uPA136-411:

In dieser C-terminalen Domäne befinden sich die Reste His204, Asp255 und

Ser356, die zusammen die katalytische Triade der Serinprotease bilden

(Strassburger, W. et al. 1983).


Abbildung 5: Schematische Darstellung der Domänen von pro-uPA

Durch enzymatische Spaltung, z. B. durch Plasmin, Kallikrein, Cathepsin D oder L,

der Peptidbindung zwischen Lys158 und Ile159, wird das inaktive, einkettige pro-

uPA zum zweikettigen HMW-uPA („high molecular weight uPA“) aktiviert. Die A-

Kette (uPA1-158) ist nach der Spaltung mit der B-Kette (uPA159-411) über eine

Disulfidbrücke zwischen Cys148 und Cys279 verknüpft. Erst durch die mit der

Spaltung einhergehende Konformationsänderung wird das aktive Zentrum

exponiert. HMW-uPA kann durch weitere Proteolyse in das aminoterminale

Fragment (ATF, uPA1-135) und „low molecular weight uPA“ (LMW-uPA, uPA136-

411) weiter prozessiert werden. LMW-uPA besitzt die volle proteolytische Aktivität

(Ellis, V. et al. 1991), kann aber nicht mehr an der uPA-Rezeptor binden.

Die Röntgenkristallstruktur der uPA-B-Kette, die das katalytische Zentrum enthält,

wurde erstmals 1995 von Spraggon und Mitarbeitern beschrieben (Spraggon, G. et

al. 1995). Die Auflösung dieser Struktur war mit 2,5 Å vergleichsweise gering. Erst

kürzlich wurden hochaufgelöste Röntgenstrukturen der uPA-B-Kette im Komplex

mit bekannten, synthetischen Inhibitoren veröffentlicht (Nienaber, V. et al. 2000)


(mehrere Komplexstrukturen, Auflösung: =1,5 Å), (Katz, B. A. et al. 2000)

(Auflösung 1,75, PDB-Code: 1C5X).

2.3. Das uPA-uPAR-System

Der uPA-Rezeptor (uPAR, CD 87) ist ein aus 313 Aminosäuren aufgebautes,

hochglycosyliertes (Kohlenhydratanteil 30%) Protein mit einem auffällig hohen

Cysteinanteil (Danø, K. et al. 1994). Der Rezeptor besteht aus 3 strukturell

ähnlichen Domänen und einem C-terminalen GPI-Anker, wobei die N-terminale

Domäne die GFD-Bindungsstelle enthält (Behrendt, N. et al. 1991), über die uPA

an uPAR bindet. Da uPAR keine Transmembrandomäne besitzt, ist eine

Signaltransduktion nur durch Wechselwirkung mit anderen Transmembranproteinen

möglich.

Der wichtigste natürliche Inhibitor des uPA ist der Plasminogenaktivator-Inhibitor

Typ 1 (PAI-1; siehe Kapitel 2.6.1). PAI-1 hemmt sowohl HMW-uPA als auch

LMW-uPA in freier oder rezeptorgebundener Form, tPA und in geringerem Maße

auch Plasmin.

Sobald sich auf der Zelloberfläche ein trimärer Komplex aus uPAR, uPA und PAI-1

gebildet hat, wird dieser mittels des Macroglobulinrezeptors (CD 91) in die Zelle

internalisiert (Casslen, B. et al. 1998; Conese, M. et al. 1995; Nykjaer, A. et al.

1997). Dort werden PAI-1 und uPA lysosomal abgebaut, während der uPAR auf der

Zelloberfläche regeneriert wird und erneut uPA binden kann. Bei Tumorzellen wird

der uPAR an die Migrations-/Invasionsfront regeneriert, wodurch die gerichtete

proteolytische Aktivität zustande kommt.

Im Gegensatz dazu wird der trimäre Komplex aus uPAR-uPA-PAI-2 (siehe Kapitel

2.6.1) nicht internalisiert, sondern auf der Zelloberfläche prozessiert. Durch

Spaltung des Komplexes entstehen 2 Fragmente: Ein 70 kD großes Fragment, das

PAI-2 und das aktive Zentrum von uPA enthält und ein 22 kD-Fragment, das das

ATF von uPA sowie uPAR enthält. Das ATF bleibt an uPAR gebunden und


verhindert dadurch die erneute Bindung von uPA an den Rezeptor (Ragno, P. et al.

1995; Ragno, P. et al. 1998).

Somit kann PAI-2 als „wirklicher“ Inhibitor von uPA und uPAR betrachtet werden,

während PAI-1 zwar die proteolytische Aktivität von uPA inhibiert, der uPAR aber

nach erfolgter Internalisierung des trimären Komplexes wieder auf die

Zelloberfläche zurückkehrt und erneut uPA binden kann. Dieser Unterschied ist ein

Grund für die unterschiedliche prognostische Relevanz von PAI-1- und PAI-2-

Konzentrationen in Tumoren (siehe Kapitel 2.4).

2.4. Klinische Relevanz von uPA, uPAR, PAI-1 und PAI-2

Nach der chirurgischen Entfernung eines soliden Tumors muß anhand geeigneter,

experimentell bestimmbarer Parameter das Risiko einer Neuerkrankung abgeschätzt

werden, um die Art und Intensität einer notwendigen Nachbehandlung (z. B.

Chemotherapie oder Bestrahlung) festzulegen. Seit einigen Jahren haben sich die

Bestandteile des uPA-uPAR-Systems zu wichtigen prognostischen Markern bei

einer Vielzahl von Krebserkrankungen entwickelt. Allein in den letzten 5 Jahren

sind weit über Hundert Veröffentlichungen zu diesem Thema erschienen. Der

interessierte Leser sei deshalb an dieser Stelle nur auf einige neuere Reviews

verweisen: (Allgayer, H. et al. 1997; Duffy, M. J. et al. 1999; Harbeck, N. et al.

1998; Look, M. P. et al. 1999; Pappot, H. et al. 1995; Reuning, U. et al. 1998).

Untersuchungen haben ergeben, daß hohe uPA-Werte nach der operativen

Entfernung verschiedener Tumoren mit einer schlechten Prognose für das

krankheitsfreie Überleben des Patienten verbunden sind. PAI-1-Werte stellten sich

mit der Zeit als noch bessere prognostische Marker heraus. Interessanterweise sind

es ebenfalls hohe Werte dieses uPA-Inhibitors, die eine schlechte Prognose

bedeuten, obwohl zunächst die proteolytische Aktivität von uPA gehemmt wird.

Eine mögliche Erklärung dieses Phänomens ist die Tatsache, daß der uPAR nach

Internalisierung des trimären Komplexes aus PAI-1/uPA/uPAR an der


Invasionsfront der Tumorzelle regeneriert wird und es nach Bindung von uPA

wieder zur gerichteten Proteolyse kommt.

Untersuchungen des uPAR-Gehalts zeigten ebenfalls, daß hohe Antigenwerte im

Tumorgewebe, aber auch im Blut, mit einer schlechten Prognose korrelieren, wenn

auch mit geringerer Signifikanz. Im Gegensatz zu den anderen Komponenten des

PA-Systems korrelieren hohe PAI-2-Werte mit einer guten Prognose für

rezidivfreies und Gesamtüberleben.

2.5. Inhibition des uPA-uPAR-Systems – Prinzipielle Therapieansätze

Wie in den Kapiteln 2.1-2.3 erläutert, spielt uPA eine zentrale Rolle in der Plasmin-

aktivierungskaskade und damit in den Prozessen der Tumorinvasion und

Metastasierung. Im vorangehenden Kapitel wurde gezeigt, daß hohe uPA- und

uPAR-Werte mit einer schlechten Prognose für das Überleben eines Krebspatienten

einhergehen. Aus diesen Befunden ergeben sich vier unterschiedliche Ansatzpunkte

zur therapeutischen Interaktion mit dem uPA-uPAR-System wie in Abbildung 6

erläutert.


GPI

GFD

Kringle

Protease

uPAR

GFD

Kringle

Protease

GFD

Kringle

Protease

GPI

uPAR

Inhibitor desaktiven Zentrums

uPA-Antagonist

uPAR-Antagonist

Inhibition derGenexpression(Antisense)

Aktives Zentrum

Abbildung 6: Inhibitionsmöglichkeiten des uPA/uPAR-Systems

• Reduktion der uPA- und/oder uPAR-Expression durch Antisense-Nukleotide

• uPAR-Antagonisten: Die Blockade des uPAR führt zu einer langsamerenAktivierung von uPA und vor allem zur Aufhebung der Zelloberflächen-

fokussierung der proteolytischen Aktivität. Hierzu wurden z. B. zyklische,

vom ATF abgeleitete Peptide entwickelt, die etwa genauso gut an den

Rezeptor binden wie uPA selbst (Burgle, M. et al. 1997).

• uPA-Antagonisten: ähnlich wie uPAR-Antagonisten können auch uPA-Antagonisten die Fokussierung der Proteolyse auf die Zelloberfläche

verhindern. Als möglicher Ansatzpunkt erwies sich „löslicher“ uPAR der

mit zelloberfächengebundenem uPAR um die Bindungsstelle zu uPA

konkurriert (Behrendt, N. et al. 1996)


• synthetische „uPA-Active-Site“-Inhibitoren zur Verringerung derproteolytischen Aktivität von uPA. Solche Inhibitoren müssen

hochspezifisch sein, da sonst auch verwandte Serinproteasen gehemmt

werden, wodurch sich eventuell schwere Nebenwirkungen ergeben könnten.

2.6. uPA-Inhibitoren

Die proteolytische Aktivität von uPA wird durch 2 natürliche Inhibitoren reguliert.

Wegen der zentralen Rolle von uPA in pathologischen Prozessen wie der

Tumorinvasion und der Metastasierung, werden zunehmend auch synthetische

Inhibitoren als potentielle Arzneimittel interessant. Für eine Zusammenstellung

natürlicher und synthetischer Inhibitoren siehe auch Magdolen, V. et al. (2000).

2.6.1. Natürliche uPA-Inhibitoren

Die Aktivität des uPA/uPAR-Systems wird durch die Plasminogenaktivator-

Inhibitoren Typ 1 (PAI-1) und Typ 2 (PAI-2) reguliert [für Reviews zu diesen

Inhibitoren siehe Egelund, R. et al. (1997) und Ny, T. et al. (1997)]. Diese beiden

Inhibitoren gehören zur Serin-Protease-Inhibitor Superfamilie (Serpine) und

besitzen 55% Sequenzhomologie (33% Aminosäureidentität). Die strukturelle

Ähnlichkeit der beiden Proteine wurde durch Röntgenkristallstrukturen aktiver

Mutanten bewiesen [PAI-1: PDB-Code: 1B3K (Sharp, A. M. et al. 1999); PAI-2:

PDB-Code: 1BY7 (Harrop, S. J. et al. 1999)]. Beide Inhibitoren hemmen sowohl

uPA als auch tPA („Tissue-Type Plasminogen Activator“) durch Bildung eines 1:1

Komplexes. Aktives PAI-1 ist nur metastabil (Halbwertszeit etwa 2 h) und geht

spontan in eine latente, inaktive Konformation über. Durch Einführen von 4

Punktmutationen kann die Halbwertszeit allerdings auf über 140 h verlängert

werden (Berkenpas, M. B. et al. 1995). In vivo wird die Halbwertszeit von aktivem

PAI-1 durch Bindung an das extrazelluläre Matrix- und Plasma-Protein Vitronektin

auf etwa 4 h verdoppelt (Kanse, S. M. et al. 1996). Im Gegensatz zu PAI-2, wird


PAI-1 mit einem Signalpeptid (21 Aminosäuren) synthetisiert und von den Zellen in

glycosylierter Form sezerniert. Dem Inhibitor PAI-2 hingegen fehlt ein spaltbares

Signalpeptid. Es liegt zu 80% in nicht-glycosylierter Form intrazellulär vor (Ny, T.

et al. 1997).

Zwei weitere Serpine, die neben Thrombin, Trypsin, Plasmin bzw. Protein C auch

uPA und tPA hemmen, sind die Inhibitoren der Proteinase Nexin-1 und des Protein-

C. Unter physiologischen Bedingungen reagieren sie allerdings wesentlich

langsamer mit den Plasminogenaktivatoren als PAI-1 und PAI-2 (Andreasen, P. A.

et al. 1997; Sprengers, E. D. et al. 1987). Aprotinin und der Tumor-assoziierte

Trypsininhibitor (TATI) wurden ebenfalls als Inhibitoren von uPA beschrieben. Die

Inhibitionskonstanten dieser Enzyme gegen uPA liegen jedoch im mikromolaren

Bereich, so daß diesen Inhibitoren keine physiologische Bedeutung zukommt.

Tabelle 1: Natürliche uPA-Inhibitoren

Inhibitor Inhibition von uPA Literatur

PAI-1 k2=1-2 x 107 mol-1 s-1 (Thorsen, S. et al. 1988)

PAI-2 k2=2,4 x 106 mol-1 s-1 (Thorsen, S. et al. 1988)

Tumor-Associated TrypsinInhibitor (TATI) Ki = 0,3 µM (Turpeinen, U. et al. 1988)

Aprotinin Ki = 27 µM (Lottenberg, R. et al. 1988)


2.6.2. Synthetische uPA-Inhibitoren

Verglichen mit der Vielzahl reversibler synthetischer Inhibitoren die gegen andere

trypsin-ähnliche Serinproteasen wie z. B. Thrombin (Hauptmann, J. et al. 1999)

oder FXa (siehe Kapitel 3.2) entwickelt wurden, gibt es nur sehr wenige effiziente

uPA-Inhibitoren. Das gemeinsame Strukturmerkmal dieser uPA-Inhibitoren ist eine

basische Amidino- oder Guanidinogruppe, die die Ausbildung einer Salzbrücke zu

Asp189 in der S1-Tasche ermöglicht. Eine Übersicht bekannter uPA-Inhibitoren ist

in Tabelle 2 zusammengestellt. Die meisten dieser Verbindungen zeigen kaum oder

keine Selektivität für uPA, sondern hemmen auch Enzyme des Verdauungstraktes

(Trypsin) sowie der Blutgerinnungskaskade (z.B. Faktor Xa und Thrombin). Die

besten Verbindungen weisen lediglich Inhibitionskonstanten im niederen

mikromolaren Bereich auf.

Billström und Mitarbeiter konnten bei oraler Gabe des Inhibitors p-Amino-

Benzamidin im Mausmodell eine klare Verlangsamung des Wachstums von DU145

Tumoren feststellen (Billström, A. et al. 1995). Das Diuretikum Amilorid stellt

einen selektiven uPA-Inhibitor mit einer allerdings relativ hohen

Inhibitionskonstante von 7 µM dar. Im Mausmodell wurde gezeigt, daß Amilorid

die Bildung von Lungenmetastasen verhindert (Vassalli, J. D. et al. 1987). Die

derzeit potentesten und selektivsten "Active-Site" uPA-Inhibitoren sind die

substituierten Benzo[b]thiophen-2-Carboxamidine B-428 und B-623 mit einem Ki-

Wert von 0,53 bzw. 0,16 µM (Towle, M. J. et al. 1993). Für einen dieser

Inhibitoren, B-428, konnte gezeigt werden, daß diese Verbindung uPA-vermittelte

Prozesse wie die proteolytische Degradation von extrazellulären Matrixproteinen,

Tumorzelladhäsion, -migration und -invasion in vitro effektiv inhibieren kann

(Alonso, D. F. et al. 1996a). Desweiteren hemmt der synthetische Inhibitor in einem

syngenen Mammakarzinom-Maus-Modell die lokale Tumorinvasion (Alonso, D. F.

et al. 1996b; Alonso, D. F. et al. 1998) sowie die Metastasierung von Ratten-uPAR

überexprimierenden Zellen in einem syngenen Modell für Ratten-Prostata-


Karzinom (Rabbani, S. A. et al. 1995). Bei einer Kombinationstherapie mit dem

Anti-Östrogen Tamoxifen konnte ebenfalls eine Verringerung des Tumorvolumens

und von Metastasen in einem Ratten-Mammakarzinom-Modell beobachtet werden

(Xing, R. H. et al. 1997).

Tabelle 2: Synthetische uPA-Inhibitoren

Inhibitor Inhibition vonuPA

Literatur

NH2NH

NH2

p-Amino-Benzamidin

Ki = 82 µM(Billström, A. et al. 1995;Geratz, J. D. et al. 1981;Jankun, J. et al. 1997)

NH

NH2NH

R

mono-subst. Phenylguanidine

Ki = 6 µM(Yang, H. et al. 1990)

NH

NH2R

Benzamidine

Ki = 5 µM (Stürzebecher, J. et al. 1978)

N

N NH NH2

NHO

NH2

Cl

NH2

Amilorid

Ki = 7 µM(Jankun, J. et al. 1997;Vassalli, J. D. et al. 1987)

NH

NNH

NH2

R

5-Amidinobenzimidazole undAmidinoindole

Ki > 4 µM(Geratz, J. D. et al. 1981;Tidwell, R. R. et al. 1983)


Inhibitor Inhibition vonuPA

Literatur

SH

R

NH

NH2

Benzo[b]thiophen-2-Carboxamidine

Ki [µM]:

B428: 0,53

B623: 0,16

(Alonso, D. F. et al. 1996a;Alonso, D. F. et al. 1996b;Alonso, D. F. et al. 1998;Rabbani, S. A. et al. 1995;Swiercz, R. et al. 1999;Towle, M. J. et al. 1993;Xing, R. H. et al. 1997)

O

NH O

R

S O

NH2NH

3-Amidinophenylalanin-Derivate

Ki ≥ 0,5 µM(Stürzebecher, J. et al. 1999)

Pyr-Leu-Arg-H (Peptidaldehyd) IC50 = 11 µM(Kawada, M. et al. 1995;Saino, T. et al. 1988)

Ecotin Variante: M84R + D70R Ki = 50 pM(Yang, S. Q. et al. 1998a;Yang, S. Q. et al. 1998b)


2.7. Zielsetzung

In den vorangehenden Kapiteln wurde die hohe klinische Relevanz des Urokinase-

Typ Plasminogenaktivatorsystems in der Tumorprogression und Metastasierung

näher erläutert. Ziel dieser Arbeit war es, Inhibitoren der proteolytischen Aktivität

von uPA als Leitstrukturen für Therapeutika zu entwickeln. Aufgrund der, auf

medizinische Anwendung hin ausgerichteten Themenstellung, sollten die

Inhibitoren eine möglichst hohe Selektivität gegenüber den strukturverwandten,

trypsin-ähnlichen Serinproteasen aufweisen. Aus dem gleichen Grund sollte es sich

um reversible Inhibitoren, also ohne „Active-Site“-reaktive Gruppe handeln.

Desweiteren sollte das Molekulargewicht aus pharmakokinetischen Gründen nicht

über 500 D betragen.

Als Ausgangspunkt für die Inhibitorenentwicklung diente die Röntgenkristall-

struktur, die 1995 von Spraggon und Mitarbeitern publiziert wurde (Spraggon, G. et

al. 1995). Da die Selektivität sehr wichtig war, sollten alle Verbindungen auch auf

die Inhibition der trypsin-ähnlichen Serinproteasen Thrombin, FXa, tPA, Trypsin

und Plasmin untersucht werden.

Mit vielversprechenden Leitstrukturen sollten Röntgenkristallstruktur-

Untersuchungen durchgeführt werden, um das rationelle Design noch aktiverer

Hemmstoffe zu ermöglichen.


2.8. Ergebnisse und Diskussion

2.8.1. Tripeptid-Methylketone

Modelling der Tripeptid-Methylketone

Bis vor kurzem war nur eine einzige Röntgenkristallstruktur von uPA im Komplex

mit dem irreversiblen Inhibitor H-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon bekannt

(Spraggon, G. et al. 1995). Dieser Inhibitor bildet unter Abspaltung eines

Chloridions eine kovalente Bindung zwischen dem Imidazolring des His57 und der

Methylengruppe des Inhibitors aus. Desweiteren bildet die Seitenkette von Ser195

mit dem Keton ein Halbketal (siehe Abbildung 7), das durch Wasserstoffbrücken

mit Gly193 NH und Ser195 NH stabilisiert ist.

Ausgehend von dieser Struktur wurden Tripeptid-Methylketone als reversible

Inhibitoren synthetisiert, die keine kovalente Bindung mit His57 eingehen können.

Durch Angriff des Ser195 O? an das Keton, ist auch bei diesen Verbindungen die

Halbketalbildung prinzipiell möglich. Dieses Halbketal ist ein Analogon des

tetraedrischen Übergangszustands, der während der Substratspaltung auftritt.

Allerdings können Ketone durch Serinproteasen nicht gespalten werden und eignen

sich deshalb als Inhibitoren, die den genannten Übergangszustand stabilisieren.


Ser

His

195

57NH N

H

NH2NH

NH

CH2

N

NH

NH2+

NH2

O

ON

O O

O O

S1-TascheS3-Tasche

Gly193

O O

NH2+

NH2

NH

Asp189

Arg217

Abbildung 7: Bindungsmodus des irreversiblen Inhibitors H-Glu-Gly-Arg-

Chloromethylketon an uPA (Spraggon, G. et al. 1995). Wasserstoffbrücken sind als

gestrichelte rote Linien, kovalente Bindungen als durchgezogene rote Linien

dargestellt.

Neben der, direkt aus der Röntgenstruktur entnommenen Peptidsequenz, wurden

auch noch weitere Sequenzen synthetisiert. Eine Studie von Song-Hua Ke (Ke, S.

H. et al. 1997) mit verschiedenen peptidischen Substraten ermittelte eine Präferenz

von uPA für die Sequenz Ser-Gly-Arg (P3-P1), so daß davon auszugehen ist, daß

auch der analoge Tripeptid-Methylketon-Inhibitor eine höhere Affinität zu uPA

besitzen sollte. Modelling-Experimente mit der bekannten uPA-Röntgenstruktur

(Spraggon, G. et al. 1995) ergaben, daß sich der P2-Rest Glycin auch durch das

starrere Prolin ersetzten läßt, wodurch man die Flexibilität des Inhibitors

einschränken und damit den entropischen Verlust bei der Bindung an das Enzym

verringern könnte.


Festphasensynthese nach der Fmoc-Strategie

Zur Synthese von Methylketonen aus Peptiden sind 2 verschiedene Methoden

gebräuchlich. Die von John S. McMurray und Douglas F. Dyckes beschriebene

Abwandlung der Dakin-West-Reaktion (Dakin, H. D. et al. 1928; McMurray, J. S.

et al. 1985) hat allerdings den Nachteil, daß die C-terminale Aminosäure während

der Reaktion vollständig racemisiert. Eine weitere Methode stellt die Umsetzung

von N-Methoxy-N-Methylamiden (Weinrebamid) mit Methyl-Grignard-Reagenz

dar (Nahm, S. et al. 1981) (Abbildung 8).

R N

O

Me

OMe MeMgBr

THF NMe

OMeRMe

O Mg

R Me

OH3O+

Abbildung 8: Synthese von Methylketonen aus Weinrebamiden

Die N-Methylgruppe des Weinrebamids kann auch durch einen mit einem

polymeren Träger verbundenen Linker ersetzt werden (Dinh, T. Q. et al. 1996). Zur

Synthese der Tripeptid-Methylketone wurde eine Festphasensynthese nach Fmoc-

Strategie an einem Weinreb AM-Harz (NovaBiochem) gewählt (Abbildung 9). Da

das Weinrebamin sehr wenig nukleophil ist, wurde die erste Aminosäure [Fmoc-

Arg(Pbf)-OH] mit HATU/HOAt/DIEA im Verhältnis 1:1:1:2 mit einem 4-fachen

molaren Überschuß an den Harzlinker gekoppelt. Der weitere Aufbau der

Peptidkette erfolgte standardmäßig mit 4 Äquivalenten Fmoc-Xaa-

OH/TBTU/HOBt/DIEA (1:1:1:2). Die Fmoc-Abspaltung war nach 2

aufeinanderfolgenden Zyklen von 3 min und 12 min mit 20% Piperidin in DMF

quantitativ. Im letzten Schritt wurde das seitenkettengeschützte Produkt mit 20

Äquivalenten Methyl-Grignard-Reagenz in absolutem THF unter gleichzeitiger


Ausbildung des Methylketons vom Harz abgespalten. Die Schutzgruppenabspaltung

erfolgte schließlich in 95% TFA.

PNOMe

ArgFmoc

PNOMe

HCH3 +Arg

PNOMe

Fmoc

1. Piperidin2. Fmoc-Xaa1-OH/ HOBt/HBTU/DIEA

1. Piperidin2. Fmoc-Xaa2-OH/ HOBt/HBTU/DIEA

PNOMe

ArgXaa1Fmoc

1. Piperidin2. Fmoc-Arg(Pbf)-OH/ HOAt/HATU/DIEA

PNOMe

ArgXaa1Xaa2Fmoc

PNOMe

ArgXaa1Xaa2Ac

Xaa1Xaa2Ac

1. CH3MgBr2. H+

1. Piperidine2. Ac2O

Abbildung 9: Synthese von Tripeptid-Methylketonen am polymeren Träger


Inhibition von uPA und strukturverwandten Enzymen

Alle dargestellten Tripeptid-Methylketone wurden auf Inhibition von uPA und den

strukturverwandten Serinproteasen Plasmin, FXa, Thrombin und Trypsin untersucht

(Tabelle 3). Die Inhibitionskonstanten aller getesteter Verbindungen waren größer

als 1 mM (mit Ausnahme von Verbindung 3, die Trypsin mit 12 µM hemmt).

Aus diesen Ergebnissen wird ersichtlich, daß die Hemmwirkung des irreversiblen

Inhibitors H-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon praktisch ausschließlich durch

Bildung einer kovalenten Bindung mit His57 erzielt wird und nicht durch

Wechselwirkung mit den uPA-Bindungstaschen S1-S3. Daraus folgt direkt, daß der

irreversible Inhibitor praktisch keine Selektivität gegenüber den verwandten

Serinproteasen aufweisen kann und deshalb in vivo nicht verwendet werden kann.

Auf der Basis von Peptidaldehyden, die den tetraedrischen Übergangszustand

besser stabilisieren können als Methylketone, könnten vermutlich auch uPA-

Inhibitoren entwickelt werden. Aus oben genannten Gründen würde aber auch mit

solchen Inhibitoren das Selektivitätsproblem nicht zufriedenstellend gelöst werden.

Deshalb wurde schließlich mit der Entwicklung kleiner, organischer Moleküle als

uPA-Inhibitoren ein vollkommen neuer Weg eingeschlagen (Kapitel 2.8.2).

Tabelle 3: Struktur-Wirkungsbeziehung der Tripeptid-Methylketone auf dieInhibition von uPA und verwandten Serinproteasen

Ki [µM]Nr. Sequenz

uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin

(1) Ac-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000

(2) Ac-Glu-Gly-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000

(3) H-Glu-Pro-D,L-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 12

(4) Ac-Glu-Hyp-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000

(5) Ac-Ser-Hyp-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000


2.8.2. Phenylguanidin-Derivate als selektive uPA-Inhibitoren

Strukturbasiertes Inhibitordesign

Abbildung 10 zeigt das katalytische Zentrum der Röntgenkristallstruktur von uPA

im Komplex mit dem irreversiblen Inhibitor H-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon

(Spraggon, G. et al. 1995). Aus dem Bindungsmodus dieses substratähnlichen

Inhibitors lassen sich einige wichtige Rückschlüsse für das Inhibitordesign ziehen:

• Das natürliche Substrat Plasminogen wird von uPA nach Arginin 560 gespalten.Die Guanidinogruppe des Arginins interagiert dabei mit der Seitenkette von

Asp189 in der S1-Tasche über eine Salzbrücke.

• Verglichen mit der S2-Tasche in Thrombin, ist die S2-Tasche von uPA durchdie Insertion von Thr97A und Leu97B im sogenannten „99-Loop“ stark

verkleinert. In der P2-Position des Substrats oder Inhibitors sind aus diesen

sterischen Gründen kleine Aminosäurereste wie Glycin bevorzugt.

• Ebenso wie in Thrombin gibt es eine S3/S4-Tasche die vorwiegend von denhydrophoben Seitenketten aromatischer Aminosäuren gebildet wird.

Ein möglicher uPA-Inhibitor sollte somit ein Argininmimetikum in P1, einen

kleinen Spacer in P2 und einen hydrophoben Rest in P3 enthalten.


Abbildung 10: Röntgenkristallstruktur von uPA im Komplex mit dem irreversiblen

Inhibitor H-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon

Untersuchung verschiedener Argininmimetika

Zunächst wurden verschiedene Kopfgruppen synthetisiert und auf ihre

inhibitorische Wirkung getestet (Tabelle 4). Alle enthalten einen hydrophoben

Benzolring, substituiert mit basischen Amidino- bzw. Guanidino-Gruppen.

Prinzipiell sind alle diese Derivate also in der Lage an Asp189 in der S1-Tasche über

eine Salzbrücke zu binden.

Benzamidin (111) und Phenylguanidin (6) inhibieren uPA im mikromolaren

Bereich. Benzylcarbamidin (112), das zu Phenylguanidin isoster ist, hatte hingegen


keine inhibitorische Aktivität auf die untersuchten trypsinartigen Serinproteasen.

Wegen der besseren Selektivität wurde aufgrund dieser Ergebnisse Phenylguanidin

(6) als Kopfgruppe gewählt.

Tabelle 4: Struktur-Wirkungsbeziehung verschiedener Argininmimetika

Ki [µM]Nr. Formel


(111)NH2

NH81 350 410 220 35

(6) NH

NH2NH

30 > 1000 > 1000 > 1000 163

(112) NH2NH

> 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000

(7) NH NH2

NH> 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000

Screening verschiedener Phenylguanidin-Derivate – Suche nach einem

geeigneten P2-Spacer

Im nächsten Schritt wurde versucht, einen P2-Spacer geeigneter Länge zu finden.

Sämtliche Derivate der 4-Guanidino-Benzoesäure (8-11), des 4-Guanidino-Anilins

(31), sowie des 4-Guanidino-Phenylalanins (15, 18, 21) zeigten keine oder nur sehr

geringe hemmende Wirkung auf uPA (Tabelle 5). Interessanterweise sind die zu

Verbindung 18 und 21 analogen 3- bzw. 4-Amidino-Phenlalaninderivate als Serin-

proteaseinhibitoren bekannt (Gabriel, B. 1998; Gabriel, B. et al. 1998;

Stürzebecher, J. et al. 1999). Durch die Guanidinofunktion scheint sich also eine


völlig andere Bindungsgeometrie zu ergeben. Derivate von 3-Guanidinobenzylamin

erfüllen offensichtlich ebensowenig die strukturellen Voraussetzungen für einen

uPA-Inhibitor (66, 73, 74) wie Sulfonamid-Derivate des 4-Guanidinobenzylamins

(37–45). Einzig und allein Urethanyl- oder Acyl-Derivate des 4-

Guanidinobenzylamins (28, 29, 47, 49, 50) zeigten die gewünschte uPA Inhibition.

Während die Acyl-Derivate 47, 49 und 50 zumindest Trypsin noch mit

vergleichbaren Inhibitionskonstanten hemmen wie uPA, konnte für die

Urethanylderivate 28 und 29 keine Hemmwirkung auf Trypsin, Thrombin, FXa und

Plasmin nachgewiesen werden. Das tert-Butyloxycarbonyl-Derivat (29) wurde nun

als neue Leitstruktur für weitere Derivatisierungen eingesetzt.

Tabelle 5: Substituierte Phenylguanidine – Suche nach einem geeigneten Spacer umdie S2-Tasche zu überbrücken.

Ki [µM]Nr. Formel


(8) NNH

NH2NH

O

O

O

O

59 400 >1000 36 500

(9) NH

NH2NH

O

N MeMeO

100 100 >1000 >1000 >1000

(10) ONH

NH2NH

O

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(11) NH

NH2NH

O

OMe >1000 n. b. >1000 >1000 >1000


Ki [µM]Nr. Formel


(15)NH

NH2NH

NH

OO

OOMe

200 >1000 >1000 85 >1000

(18) NHNH2

NH

NH

OO

OOMe

>1000 300 >1000 >1000 >1000

(21) NHNH2

NH

NH

OOMe

SO

O>1000 >1000 >1000 54 >1000

(37)NH

NHNH2

NH

SO

O

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(38) NHNH

NH2

NH

SO

O

FF

F

F F

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(39) NH

NHNH2

NH

SO

ONH

O >1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(41) NH

NHNH2

NH

SO

OCF3

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(42) SN

NH

NHNH2

NH

SO

ONH

O

240 >1000 >1000 >1000 >1000


Ki [µM]Nr. Formel


(43) NHNH

NH2

NH

SO

OF3C

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(44)SO

ON

OCF3

NH

NHNH2

NH

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(45)S

O

OS

O

O

O

NH

NH NH2

NH

NH

NHNH2

NH

>1000 >1000 >1000 >1000 63

(66)NH

NHNH2

NH

ONH >1000 450 600 >1000 >1000

(73)NH

S NH

NH2 NH

O

O >1000 >1000 1300 >1000 >1000

(74)NH

O

ONH

NH2 NH

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(31)NH

ONH

NHNH2O

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(28) NHNH

NH2

NHO

O 16 >1000 >1000 >1000 >1000


Ki [µM]Nr. Formel


(29) NH

NHNH2

NHO

O 36 >1000 >1000 >1000 >1000

(47)NH

NHNH2

NHO

NH

OO

37 n. b. >1000 >1000 >1000

(49)NH

NHNH2

NHO

NH

SO

O

NH

O

21 >1000 >1000 >1000 42

(50)NH

NHNH2

NHO

NH

SO

O

32 >1000 >1000 >1000 36

Einfluß der hydrophoben Wechselwirkungen in P3

Im nächsten Schritt sollten die hydrophoben Wechselwirkungen optimiert werden.

Hierzu wurde die tert-Butylgruppe der Leitstruktur 29 sukzessive durch andere

Alkyl-, Zykloalkyl- und aromatische Gruppen ausgetauscht (Tabelle 6). Bei allen

durchgeführten Variationen stellten wir fest, daß der Einfluß der hydrophoben

Wechselwirkungen weitaus geringer war als der Einfluß des geeigneten P2-Spacers

(siehe Tabelle 5). So bewegen sich die Inhibitionskonstanten nur im Bereich

zwischen 10 und 50 µM. Der bis-basische Inhibitor 54 hebt sich mit einer

Inhibitionskonstante von 2,8 µM etwas aus diesem Umfeld ab. Durch die zwei

Guanidino-Benzylaminreste in einem Molekül ist die Konzentration des Inhibitors

formal aber doppelt so hoch, d. h. hätte der Inhibitor nur eine Guanidinofunktion,


wäre der Ki-Wert etwa 6 µM. Deshalb ist auch nicht davon auszugehen, daß die

zweite Phenylguanidin-Einheit außerhalb der uPA-„Active-Site“ bindet, während

der erste Phenylguanidinrest in der S1-Tasche gebunden ist. Eine deutlichere

Verbesserung der Inhibitionskonstante findet man für diese Verbindung allerdings

in Bezug auf Tryptase, die ein Tetramer mit vier katalytisch aktiven Untereinheiten

bildet. Für die Kopfgruppe 4-Guanidino-Benzylamin (59) wurde gegen Tryptase

eine Inhibitionskonstante von 200 µM ermittelt. Durch den bis-basischen Inhibitor

54 verbessert sich hier der Ki auf 1 µM, was zumindest teilweise für bivalentes

Binden (gleichzeitiges Binden in zwei Untereinheiten der Tryptase) spricht.

Wegen der beobachteten leichten Präferenz für den sperrigen und inerten

Adamantylrest (Verbindung 36) und wegen der kommerziellen Verfügbarkeit der

benötigten Derivate, wurde der Inhibitor 36 als Leitstruktur für die weiteren

Optimierungsschritte gewählt.

Tabelle 6: Optimierung der hydrophoben Wechselwirkungen in P3

Ki [µM]Nr. Formel


(29) NH

NHNH2

NHO

O 36 >1000 >1000 >1000 >1000

(33) NH

NHNH2

NH

O

O

27 >1000 >1000 >1000 >1000

(34) NH

NHNH2

NHO

O 51 >1000 >1000 >1000 >1000


Ki [µM]Nr. Formel


(35) NH

NHNH2

NHO

O 52 >1000 >1000 >1000 >1000

(36) NH

NHNH2

NHO

O 13 >1000 >1000 >1000 >1000

(32) NH

NHNH2

NH

NH2

NH

46 >1000 >1000 >1000 >1000

(59)NH

NHNH2

NH2

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(53) NHNH NH2

NH

O

O

NN 11 >1000 >1000 >1000 >1000

(52)NH

NH

NH2NH

O

O

NO2

MeOOMe

35 >1000 >1000 >1000 >1000

(28) NHNH

NH2

NHO

O 16 >1000 >1000 >1000 >1000

(51)O2N

NH

NH

NH2NH

O

O 12 200 >1000 >1000 36

(54) NHNH

NH2

NH

O

OO

ONH

NH

NHNH2

2,8 47 >1000 >1000 11


Ki [µM]Nr. Formel


(64) NH

NHNH2

NHO

NH

OO

70 390 >1000 >1000 >1000

(65)NH

NHNH2

NHO

NH252 250 >1000 >1000 >1000

Untersuchung der Wasserstoffbrücken-Donor/Akzeptor-Eigenschaften des P2-

Spacers

Als nächstes wurde untersucht, welche Atome des P2-Spacers für die Bindung zum

Enzym wichtig sind. Hierzu wurden einzelne Atome durch isostere Gruppen mit

anderen Wasserstoffbrücken-Donor- bzw. Akzeptoreigenschaften ausgetauscht

(Tabelle 7). So wurde zum Beispiel der Wasserstoffbrückenakzeptor O (Verbindung

36) durch die inerte Gruppierung CH2 (Verbindung 58) bzw. den Donor NH (75)

ausgetauscht. NH als H-Brückendonor scheint an dieser Stelle stark bevorzugt zu

sein, so daß sich die Inhibitionskonstante auf 2,4 µM verbesserte (75). Tauscht man

den Harnstoff in Verbindung 75 durch den isosteren Thioharnstoff (60) aus, ist

keinerlei uPA-Inhibition mehr zu messen. Beim Austausch des benzylischen NH in

Verbindung 75 durch die inerte Methylengruppe (62) verschlechtert sich die

Inhibitionskonstante auf 120 µM. Dieser Austausch beeinflußt auch die Selektivität,

so daß Plasmin vergleichbar gehemmt wird. Das Verkürzen des P2-Spacers von

Verbindung 75 um ein Atom in Verbindung 63 führte ebenso zu einer

Verschlechterung der uPA-Inhibition wie auch der Austausch der Adamantylgruppe


durch einen Phenylring (Verbindung 77, Ki=29 µM). Der zu Verbindung 77 analoge

Thioharnstoff (55) hemmt uPA nicht-kompetitiv (allosterisch) bei einer

Konzentration von 1 µM, während Trypsin mit Ki=37 µM kompetitiv gehemmt

wird. Diese Beispiele zeigen gut, wie wichtig jedes einzelne Atom eines kleinen

Inhibitors für eine hohe Affinität zum Enzym sein kann.

Die Analyse aller durchgeführten Derivatisierungen ergab folgende Ergebnisse (

Abbildung 11):

NH

NHNH2

NHO

NH

wichtigsehrwichtig

wichtig

essentiell

kann ersetztwerden

Abbildung 11: Analyse des Inhibitors 75, basierend auf den durchgeführten

Derivatisierungen

• Die 4-Guanidino-Benzyleinheit ist essentiell für die Bindung in der S1-Tascheund läßt keine Veränderungen zu

• Der anschließende Harnstoff ist für gute Inhibitionskonstanten wichtig; dasErsetzen einzelner Atome in dieser Gruppe und die damit verbundene

Abnahme der uPA-Inhibition, stützt die Annahme, daß die Harnstoffgruppe

in drei Wasserstoffbrücken involviert ist.

• Die Art und Größe der hydrophoben Gruppe (hier Adamantan) spielt eineuntergeordnete Rolle – durch andere Derivate mit Wasserstoffbrücken-

Donor/Akzeptoreigenschaften läßt sich die uPA-hemmende Wirkung des

Inhibitors eventuell noch verbessern


Tabelle 7: Optimierung des P2-Spacers durch Austausch einzelner Atome durchisostere Gruppen mit anderen Wasserstoffbrücken-Donor/Akzeptor-eigenschaften

Ki [µM]Nr. Formel

uPA Plasmin FXa Thrombin tPA

(36) NH

NHNH2

NHO

O 13 >1000 >1000 >1000 >1000

(58) NH

NHNH2

NHO

40 >1000 >1000 >1000 n. b.

(75) NH

NHNH2

NHO

NH 2,4 >1000 >1000 600 >1000

(62) NH

NHNH2

CH2O

NH

120 130 >1000 >1000 n. b.

(60) NH

NHNH2

NHS

NH >1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(77) NH

NHNH2

NHO

NH

29 170 >1000 >1000 >1000

(76) NH

NHNH2

NHO

NH 7,4 200 220 >1000 n. b.

(63) NH

NHNH2

NHO

102 460 >1000 >1000 n. b.


Ki [µM]Nr. Formel

uPA Plasmin FXa Thrombin tPA

(56)NH

NH

NH2NH

O

18 >1000 >1000 >1000 >1000

(78) NH

NHNH2

NHO

NHO

Cl37 180 >1000 >1000 n. b.

(55) NH

NHNH2

NHS

NH

nicht-

kompetitiv>1000 >1000 >1000 n. b.

Synthese des Inhibitors N-Adamantyl-N'-(4-Guanidinobenzyl)-Harnstoff (75)

Zur Synthese von N-Adamantyl-N'-(4-Guanidinobenzyl)-Harnstoff (Abbildung 12)

geht man vom kommerziell erhältlichen p-Aminobenzylamin aus. Im ersten Schritt

wird die Aminomethylgruppe mit tert-Butyloxycarbonyl geschützt (22).

Anschließend erfolgt die Umsetzung mit einem bis-Benzyloxycarbonyl-geschützten

Guanidinylierungsreagenz (Feichtinger, K. et al. 1998). Nach Abspaltung der Boc-

Schutzgruppe (23) wird das freie Amin mit Adamantylisocyanat zum

Adamantylharnstoff umgesetzt. Im letzten Schritt wird die Guanidinofunktion durch

katalytische Hydrierung an einem Pd-Katalysator entschützt um Inhibitor 75 zu

erhalten.


NH2

NH2

BOC2O (NH-Z)CF3SO2 N C (NH-Z)

NH

NH2

NH

N

Z

Z

H2/Pd/C

NHNH

N

Z

Z

NH

O

NH H

HH

NH2

NH

O

O *HCl

1.

2. 6M HCl/Dioxan

NHNH2

NH

NH

O

NH H

HH

1-Adamantylisocyanat/TEA

(75)

(23)(22)

Abbildung 12: Synthese des Inhibitors N-Adamantyl-N'-(4-Guanidinobenzyl)-

Harnstoff (75)

Röntgenkristallstruktur-Untersuchung des uPA/Inhibitor-75-Komplexes

In Kooperation mit der Arbeitsgruppe für Strukturforschung ist es gelungen die

rekombinant hergestellte uPA-B-Kette im Komplex mit Benzamidin zu

kristallisieren. Da Benzamidin ein schwacher uPA-Inhibitor ist, konnte es im

Kristall mittels der „Soaking“-Technik durch den Inhibitor 75 ersetzt werden.

Abbildung 13 zeigt die halbtransparente Oberflächendarstellung der

Röntgenstruktur von uPA im Komplex mit dem Inhibitor 75. Das Enzym ist in der

Standardorientierung für Serinproteasen abgebildet, das heißt die „Active-Site

Cleft“ verläuft von links nach rechts.


Abbildung 13: Halbtransparente Oberflächendarstellung des uPA/Inhibitor 75-

Komplexes

Wie erwartet bindet der Phenylguanidinteil in die S1-Tasche unter Ausbildung der

canonischen Salzbrücke zu Asp189. Die Harnstoffgruppe durchquert das katalytische

Zentrum und plaziert den sperrigen Adamantylrest in die S1'-Tasche.


Abbildung 14: Vergleich der Bindungsmodi des irreversiblen Inhibitors H-Glu-

Gly-Arg-Chloromethylketon (C-Atome in gelb) und des Inhibitors

75 (C-Atome in grün)

Wie oben erläutert, wurde der Inhibitor ursprünglich dahingehend entwickelt, daß er

die Taschen S1-S3 von uPA zur Bindung nutzt. Substratähnliche Inhibitoren wie

das in Abbildung 14 gezeigte Tripeptid-Chloromethylketon (C-Atome in gelb)

würden in diese Taschen binden. Der Inhibitor 75 (C-Atome in grün) durchquert in

unerwarteter Weise das aktive Zentrum und plaziert den hydrophoben Rest in die

S1’-Tasche. Dieser völlig neue Bindungsmodus ermöglicht es erstmals die

gestrichene Seite der „Active-Site“ für strukturbasierte Verbesserungen des

Inhibitors zu nutzen.

Das Schema in Abbildung 15 zeigt den experimentellen Bindungsmodus des

Inhibitors 75 in uPA.


NH

NH2NH2

NH

O

NH

OO

+

-

O

H2O

Ala183

Asp189

OHO

O

Gly219

Ser190

H2O

O

Ser214

H2O

NH2

O

Gln192

SS

Cys58

Cys42NH

NHis57

NH

Gly193

BackboneGly 193Asp194Ser195

2.72Å

2.67Å

2.90Å

2.58Å

2.82Å

2.90Å

2.66Å

2.91Å

3.20Å

3.10Å

2.78Å

Abbildung 15: Bindungsmodus des Inhibitors 75 (blau) an uPA (wichtige Reste in

schwarz). Wasserstoffbrückenbindungen sind als rote, punktierte

Linien wiedergegeben.

Neben der canonischen Salzbrücke zu Asp189 ist die Guanidinofunktion noch in

zwei weitere Wasserstoffbrücken zu Gly219 O und der Seitenkette von Ser190

involviert. Interessanterweise binden die Stickstoffatome der Harnstoffgruppe über

Wassermoleküle einerseits zu Ser214 O und andererseits zur Seitenkette von Gln192.

Das Sauerstoffatom der Harnstoffgruppe formt eine starke Wasserstoffbrücke mit

Gly193 N. Wie bereits auf Seite 36 gezeigt, ist das Austauschen eines Atoms der

Harnstoffgruppe stets mit einem Verlust an Hemmwirkung des Inhibitors

verbunden. In Anbetracht der Tatsache, daß die Harnstoffgruppe in drei

Wasserstoffbrücken involviert ist, läßt sich dieser Befund sehr leicht erklären.


Die Adamantylgruppe ist an hydrophoben Wechselwirkungen beteiligt. Zum einen

mit den „Backbone“-Atomen zwischen Gly193 und Ser195, mit der Disulfidbrücke

zwischen Cys58 und Cys42 und schließlich mit der hydrophoben Ebene des

Imidazolrings von His57.

Der Inhibitor durchquert die „Active-Site“ ohne direkte Wechselwirkung mit den

katalytischen Resten Ser195 und His57. In der aktiven Konformation dieser Reste

wäre das Binden des Inhibitors im gefundenen Bindungsmodus aus sterischen

Gründen nicht möglich. Um die Bindung des Inhibitors dennoch zu ermöglichen,

müssen die Seitenketten von Ser195 und His57 eine andere Konformation einnehmen.

Abbildung 16: Umordnung der „Active-Site“-Reste His57 und Ser195 durch die

Bindung von Inhibitor 75. (violett: aktive Konformation der

katalytischen Triade; grün: umgeordnete Konformation während

der Bindung des Inhibitors 75)


In violett ist in Abbildung 16 die natürliche, aktive Anordnung der katalytischen

Triade dargestellt, wie man sie auch in der Röntgenstruktur von uPA im Komplex

mit Benzamidin vorfindet. Der Imidazolring von His57 bildet Wasserstoffbrücken-

Bindungen zu Asp102 und Ser195.

Während der Bindung des Inhibitors 75 werden diese Reste nun aus Platzgründen

umgeordnet, wie in Abbildung 16 in gün dargestellt. Dabei wird das ursprüngliche

Netz aus Wasserstoffbrücken zerstört. Um den damit verbundenen energetischen

Verlust wenigstens teilweise zu kompensieren, wird ein Wassermolekül neu in die

Struktur eingefügt. Dieses Wassermolekül ist nahezu perfekt tetraedrisch zwischen

Ser195, His57, Asp102 und Ser214 koordiniert.

Die hier beobachtete Umordnung zeigt ganz klar die Grenzen der heutigen

Modellingprogramme, die solche Adaptionen des Enzyms nicht berücksichtigen

können. Deshalb war es auch nicht möglich, den gefundenen Bindungsmodus mit

dem Computerprogramm FlexX vorherzusagen.

Diskussion der Selektivität des Inhibitors 75

Wie aus Tabelle 8 hervorgeht, besitzt der Inhibitor eine sehr hohe Selektivität. Die

wichtigsten Enzyme der Blutgerinnungskaskade sowie tPA und Plasmin, die für die

Fibrinolyse notwendig sind, werden von diesem Inhibitor nicht beeinflußt.

Wodurch die hohe Selektivität für uPA zustande kommt, ist aber trotz gelöster

Röntgenkristallstruktur nicht einfach zu verstehen. Im Falle von Thrombin, FXa

und tPA ist Ser190 durch Ala ersetzt (siehe Abbildung 15). Dadurch kann in diesen

Enzymen die Wasserstoffbrücken-Bindungskapazität der Guanidinogruppe nicht

vollständig abgesättigt werden. Desweiteren ist in Thrombin (Bode, W. et al. 1989)

und FXa (Padmanabhan, K. et al. 1993) die S1'-Tasche durch die Seitenketten von

Lys60F bzw. Gln61 kleiner als in uPA. In tPA befinden sich die geladenen

Seitenketten von Arg39 und Glu60A nahe an der S1'-Tasche, und würden die


hydrophoben Wechselwirkungen der Adamantylgruppe stören. Aus sterischen

Gründen wäre auch die notwendige Umorientierung des His57 (siehe Seite 44) in

Thrombin, FXa und tPA stark gehindert. Die synergistische Wirkung aller dieser

und wahrscheinlich noch weiterer kleiner Unterschiede, wird also letztlich zur

beobachteten hohen Selektivität des Inhibitors 75 beitragen.

Tabelle 8: Inhibitionskonstanten von Inhibitor 75 für verschiedene Serinproteasen

Ki [µM]Inhibitor

uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin tPA TryptasePlasma-

KallikreinFXIIa

75 2,4 >1000 >1000 600 46 >1000 400 >1000 >1000

Strukturbasierte Vorschläge zur Verbesserung der Leitstruktur 75

Die genaue Kenntnis des Bindungsmodus des Inhibitors 75 wird in Zukunft die

Optimierung dieser Leitstruktur stark vereinfachen. In diesem Kapitel sollen einige

Verbesserungsvorschläge vorgestellt werden, die wahrscheinlich eine stärkere

Bindung des Inhibitors zum Enzym ermöglichen würden und somit die

Inhibitionskonstante verbessern könnten (Abbildung 17).

• Optimierung der hydrophoben Wechselwirkungen in der S1'-Tasche:Insbesondere die hydrophobe Wechselwirkung mit der Disulfidbrücke

zwischen Cys58 und Cys42 dürfte sich durch Einführung eines

Chlorsubstituenten im Adamantylrest deutlich verbessern lassen.

• Optimierung von Wasserstoffbrückenbindungen in des S1'-Tasche:Südöstlich der Adamatylgruppe befindet sich im Kristall ein

Wassermolekül, das zwischen Tyr151 Oγ, Val41 O und Tyr40 O dreifachkoordiniert und somit in der Elektronendichte gut definiert ist. Durch einen

Hydroxymethl-Substituenten am Adamantylrest, ließe sich dieses

Wassermolekül aus der Struktur verdrängen und die Hydroxyfunktion wäre


anschließend nahezu perfekt tetraedrisch koordiniert. Anstelle der

Hydroxymethl-Gruppe könnte z. B. auch eine Carbonsäureamidfunktion

verwendet werden.

• Optimierung der Wasserstoffbrücken-Bindungen der Harnstoffgruppe:Wie in Abbildung 15 dargestellt, binden die Stickstoffatome des bis-

substituierten Harnstoffs über Wassermoleküle an Ser214 O und an die

Seitenkette von Gln192. Durch Substitution der Harnstoff-Stickstoffatome

mit Hydroxyethylfunktionen, ließen sich zwei direkte Wasserstoffbrücken

zwischen dem Inhibitor und dem Enzym verwirklichen, die eine höhere

Bindungsstärke bewirken als die beiden wasservermittelten Bindungen.

Beispiele für die Realisierung eines solchen Inhibitors sind in Abbildung 17 und 18

zusammengefaßt.

NH

NH2NH2

O

Cl

OH

OH

OH

OO

+

-

Asp189

OHO

O

Gly219

Ser190

O

Ser214NH2

O

Gln192

SS

Cys58

Cys42NH

NHis57

NH

Gly193

2.72Å

2.67Å

2.90Å 2.90Å

2.78Å

OH

Tyr151

O

O

Tyr40

Val41

Abbildung 17: Möglicher Bindungsmodus eines strukturbasiert verbesserten

Inhibitors (Änderungen sind in grün dargestellt)


NH

NHNH2

N

O

Cl

NH2

NH2

OH

O

O NH

NHNH2

O

HHH

Cl

NH2

NH2

OH

O

O

NH

NHNH2

O

NH2

OH

O

NH2

O

Abbildung 18: Weitere Strukturvorschläge für Inhibitoren mit verbesserten

Bindungseigenschaften

Untersuchung der Toxizität des Inhibitors 75

Die Zytotoxizität des Inhibitors wurde für drei verschiedenen Krebszellinien

bestimmt, indem steigende Inhibitorkonzentrationen zusammen mit den Zellen

inkubiert wurden und anschließend die Lebensfähigkeit der Zellen bestimmt wurde.

Die abgebildeten Kurven (Abbildung 19) repräsentieren die Ergebnisse nach 48 h

Inkubation, wobei sich nach 24 bzw. 72 h aber sehr ähnliche Resultate ergaben.

Dies bedeutet, daß bestimmte Inhibitorkonzentrationen toxisch wirken, die

Inkubationszeit hingegen scheinbar keinen Einfluß auf die Toxizität einer

bestimmten Konzentration hat. Für zwei Zellinien (MDA-MB-231 und OV-MZ-6)

war der Inhibitor bis zu einer Konzentration von 250 µM nicht toxisch.

Interessanterweise beeinflußte diese Konzentration bereits die Überlebensrate der

Keratinozyten-Krebszellinie A431. Auf jeden Fall liegen die toxischen

Konzentrationen aber 50- bis 100-fach über den Inhibitionskonstanten, was einen

großen therapeutischen „Spielraum“ für Tierexperimente schafft.


0,00

0,04

0,08

0,12

0,16

0,20

0 1 5 10 15 20 50 100

250

500 750 1000

Inhibitor-Konzentration [µM]

Abs

orpt

ion

[560

-640

nm

]

MDA-MB-231 OV-MZ-6A431 Puffer Kontrolle

Abbildung 19: Effekt des Inhibitors 75 auf die Zellproliferation. Die

Pufferkontrolle ist nur für OV-MZ-6-Zellen dargestellt

Pharmakokinetische Charakterisierung

Ein guter Anhaltspunkt für die orale Bioverfügbarkeit einer Substanz ist der

Verteilungskoeffizient zwischen Oktanol und Wasser. Eine sehr gute orale

Aufnahme erhält man normalerweise wenn der Logarithmus des

Verteilungskoeffizienten (logPOktanaol/Wasser) etwa +2 ist. In Übereinstimmung mit der

bei physiologischem pH positiv geladenen

Guanidinogruppe entspricht der Logarithmus des

Verteilungskoeffizienten der Verbindung 75 einem

Wert von –1,3 (experimentell mittels HPLC

bestimmt). Dies bedeutet, daß die orale

Bioverfügbarkeit des Inhibitors wahrscheinlich

eher schlecht ist, sofern keine aktiven

Transportsysteme für diese Verbindung existieren.

SO

NH

O

O

NH

O N

NH2 NHNAPAP


Für Clearance-Studien wurde der Inhibitor intravenös in Ratten appliziert. Die

Dosis betrug 1 mg/kg. Wie in Abbildung 20 dargestellt, wird der Inhibitor 75 sehr

rasch aus der Blutzirkulation eliminiert. Die Eliminationsrate ist vergleichbar mit

der Eliminationsrate des bekannten Thrombin-Inhibitors NAPAP (siehe

Formelzeichnung) der ebenfalls eine basische Gruppe und einen hydrophoben Rest

besitzt. Leider liegen noch keine Ergebnisse bezüglich des Eliminationsweges oder

in Bezug auf den Metabolismus der Verbindung 75 vor.

Abbildung 20: Plasma-Elimination des Inhibitors 75 nach intravenöser

Applikation von 1 mg/ml in Ratten

3. Faktor Xa Inhibitoren 51

3. Faktor Xa Inhibitoren

3.1. Die Blutgerinnungskaskade: ein therapeutischer Ansatz bei

Thromboseerkrankungen

Die Blutgerinnung hat eine Notfallfunktion: größere Blutverluste sollen bei

Gefäßverletzungen vermieden werden. Der Hauptvorgang dieser Gerinnung besteht

darin, daß lösliches Fibrinogen (Faktor I) in unlösliches Fibrin überführt wird, das

anschließend durch Faktor XIIIa zu einem festen Fibringerinsel vernetzt wird.

Hierfür ist ein proteolytischer Katalysator, das Thrombin, notwendig. Durch

Proteolyse wird das Zymogen Prothrombin (Faktor II) in Thrombin umgewandelt.

Diese Aktivierung wird von Faktor Xa (FXa, andere Namen: Plasma-

Thrombokinase, Plasma-Thromboplastin, Stuart-Power-Factor, Autoprothrombin

C) katalysiert. FXa seinerseits wird wiederum durch proteolytische Spaltung aus der

inaktiven Vorstufe Faktor X gebildet. Die komplette Kaskade der einzelnen

Aktivierungsschritte, die letztendlich zur Bildung von Fibrin führt ist in Abbildung

21 dargestellt.

Man unterscheidet zwei unterschiedliche Aktivierungskaskaden die letztlich bei der

Aktivierung von FX zusammenlaufen. Beim intrinsischen System beginnt die

Blutgerinnungskaskade intravasal durch Kontaktaktivierung von FXII an

„Rauhigkeiten“ der endothelialen Auskleidung der Gefäße. Der extrinsische

Aktivierungsprozeß beruht hingegen auf der Freisetzung von FIII („tissue factor,

TF) aus dem endoplasmatischen Retikulum beschädigter oder zestörter

Gewebszellen. Die extrinsische Aktivierungskaskade läuft somit nach einer

Verletzung der Blutgefäße ab, aber auch bei einem Herzinfarkt oder anderen

pathologischen Zuständen (z. B. Entzündung oder Blutvergiftung) wird FIII

freigesetzt. Nach Bindung von FVII an den freigesetzten TF wird FVIIa durch

Autoaktivierung oder durch Proteolyse (Thrombin, FXa, FXIIa) erzeugt. Da beide

Enzymkaskaden bei der Aktivierung von FX zusammenlaufen, spielt der

entstehende FXa eine zentrale Rolle innerhalb des Blutgerinnungssystems.


Faktor XI Faktor XIa

+

Faktor IX Faktor IXa

Ca2+

+

Faktor X Faktor XaCa

2+ +Faktor VIIIa, PL,

+

Prothrombin ThrombinCa

2+ +Faktor Va, PL,

+

+

Fibrinogen Fibrin

Faktor XIIIa

Fibrin(quervernetzt)

+

OberflächeFaktor XIIHMW-KininogenPrekallikrein

+

+

Faktor VIIa Faktor VII

Faktor IX

Faktor X

+

+ PL

+ Faktor III, PL

ThrombinFaktor XaFaktor XIIa

+

+Aktivierung

Co-Faktoren

Legende:

Intrinsischer Weg Extrinsischer Weg

Spaltprodukte

-

+

Plasminogen Plasmin

uPA,tPA

- Abbau FIBRINOLYSE

BLUTGERINNUNG

PL: Phospholipid

Abbildung 21: Die Blutgerinnungskaskade


Die Synthese der Zymogene Prothrombin, FXII, FIX und FX ist Vitamin-K

abhängig. Sie enthalten γ-Carboxyglutaminsäurereste (Gla) die zusammen mitCalciumionen die funktionelle Gla-Domäne bilden und sich dadurch an

Phospholipidmembranen anheften können. Bei Vitamin-K-Mangel kann die

zusätzliche γ-Carboxylgruppe nicht in vorhandene Glutaminsäurereste eingebautwerden. Nach ihrer

Aktivierung sind die

Proteasen ohne Gla-Reste

viel weniger aktiv als jene

mit funktioneller Gla-

Domäne. In diesen

Mechanismus greifen die

oral wirksamen Vitamin-K-

Antagonisten Dicumarol,

Warfarin, Acenocoumarin

und Phenocumaron

(Abbildung 22) ein (Gulba,

D. C. 1996). Allerdings sind bei der Behandlung mit diesen Wirkstoffen auch viele

andere Proteasen betroffen, so daß eine Dauerbehandlung von Patienten nur unter

ständiger ärztlicher Kontrolle möglich ist. Die Anwendung beschränkt sich daher

auf die Prophylaxe nach akuten thrombotischen Ereignissen (Glusa, E. et al. 1996).

Ein weiterer Nachteil der Coumarin-Derivate ist der um 24 bis 36 h verzögerte

Wirkungseintritt nach Behandlungsbeginn, sowie die sich erst nach einigen Tagen

wieder einstellende Normalisierung des Blutgerinnungssystems nach Absetzen des

Medikaments.

Bestehende Blutgerinsel werden durch Plasmin wieder aufgelöst. Zur Fibrinolyse

bei akuten Thrombosen werden deshalb tPA oder andere Plasminogenaktivatoren

intravenös verabreicht (siehe Abbildung 21 unten).

O

OH

O O

OH

O O O

O

OH

O O

OH

O O

OH

NO2

O

Dicumarol Warfarin

Acenocoumarin Phenocoumaron

Abbildung 22: Vitamin-K-Antagonisten als oralwirksame Antikoagulantien


3.2. Natürliche und synthetische FXa Inhibitoren

Die Blutgerinnungskaskade ist ein hochreguliertes System. Bis auf FVIIa werden

alle aktiven Gerinnungsenzyme durch das Glykoprotein Antithrombin III (ATIII)

inhibiert. Durch Heparin wird die ansonsten langsam verlaufende Bildung des

Enzym-Inhibitor-Komplexes zwischen ATIII u

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Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der Serinpromediatum.ub.tum.de/doc/601134/document.pdfEwa Zeslawska, Dr. Uwe Jakob undProf. Dr. Robert Huber (Abteilung Strukturforschung)