Détection Détection génotypique de la génotypique de la

résistance des résistance des bactéries aux bactéries aux antibiotiques antibiotiques

DES de Bactériologie 10 Mars 2006

Détection phénotypiqueDétection phénotypique AvantagesAvantages

Rendu du résultat en catégorie clinique S, I, RRendu du résultat en catégorie clinique S, I, R Appréciation du niveau d'expressionAppréciation du niveau d'expression Détection de nouveaux mécanismesDétection de nouveaux mécanismes Faible coûtFaible coût

InconvénientsInconvénients Nécessite une culture pureNécessite une culture pure Délai : 24-48HDélai : 24-48H Antibiothérapie probabiliste parfois non Antibiothérapie probabiliste parfois non

adaptéeadaptée Problème de détection de certaines résistancesProblème de détection de certaines résistances

Détection génotypiqueDétection génotypique AvantagesAvantages

Peut-être réalisée sur tout type de prélèvement Peut-être réalisée sur tout type de prélèvement parfois sans culture préalableparfois sans culture préalable

Possibilité d'une réponse rapide < 2 heuresPossibilité d'une réponse rapide < 2 heures Antibiothérapie adaptée précoceAntibiothérapie adaptée précoce

InconvénientsInconvénients On ne détecte que ce que l'on connaîtOn ne détecte que ce que l'on connaît Réponse : présence ou absenceRéponse : présence ou absence On ne détecte pas le niveau d'expression (sauf On ne détecte pas le niveau d'expression (sauf

quantification des ARNm)quantification des ARNm) Coût variable mais > méthode phénotypiqueCoût variable mais > méthode phénotypique Faux négatifs : variabilité géniqueFaux négatifs : variabilité génique Faux positifs : gènes silencieuxFaux positifs : gènes silencieux

Intérêt de la détection Intérêt de la détection génotypiquegénotypique

DélaiDélai Meilleure prise en charge du patient (isolement, Meilleure prise en charge du patient (isolement,

traitement)traitement) Diminution du coût de l’antibiothérapie, des Diminution du coût de l’antibiothérapie, des

complicationscomplications Bactéries à croissance difficile (Bactéries à croissance difficile (M. tuberculosis, H. M. tuberculosis, H.

pyloripylori)) EfficacitéEfficacité

Détection des SARM, des ERV, Détection des SARM, des ERV, -lactamases-lactamases Mécanisme de résistance (épidémiologie)Mécanisme de résistance (épidémiologie)

-lactamases-lactamases Enzymes inactivant les aminosidesEnzymes inactivant les aminosides

Plan Plan Résistance aux anti-tuberculeuxRésistance aux anti-tuberculeux Détection des SARMDétection des SARM Détection des ERVDétection des ERV Détection des Détection des ββ-lactamases-lactamases Résistance aux aminosidesRésistance aux aminosides Résistance aux MLSRésistance aux MLS Résistance aux quinolonesRésistance aux quinolones Résistance aux tétracyclinesRésistance aux tétracyclines Antibiogramme par génotypageAntibiogramme par génotypage

Détection de la résistance Détection de la résistance chez chez Mycobacterium Mycobacterium

tuberculosistuberculosis

Épidémiologie en France en 2001Épidémiologie en France en 2001

RifampicineRifampicine IsoniazideIsoniazide MultirésistanceMultirésistance

Résistance Résistance primaireprimaire

1.04 %1.04 % 3.8 %3.8 %0.9 %0.9 %

Résistance Résistance SecondaireSecondaire

4.9 %4.9 % 9.8 %9.8 %

Méthodes phénotypiques de Méthodes phénotypiques de détectiondétection

Méthode des proportionsMéthode des proportions On détermine le nombre de On détermine le nombre de

mutants résistantsmutants résistants Rapport entre le nombre de Rapport entre le nombre de

colonies sur milieu avec C° colonies sur milieu avec C° critique d’ATB et milieu témoin critique d’ATB et milieu témoin sans ATBsans ATB

Résistance :Résistance : Si > 1% : RMP, INH, EMBSi > 1% : RMP, INH, EMB Si > 10% : PZASi > 10% : PZA

Méthodes adaptées en milieu Méthodes adaptées en milieu liquideliquide

Méthodes Méthodes automatiséesautomatisées(BACTEC)(BACTEC)

Détermination des CMI (E-Détermination des CMI (E-test)test)

Méthodes phénotypiques de Méthodes phénotypiques de détectiondétection

Avantages :Avantages : Très bonne sensibilité : Gold-standard Très bonne sensibilité : Gold-standard

encore aujourd’huiencore aujourd’hui

Inconvénients :Inconvénients : Délai : 3 semaines (gain de 1 à 2 Délai : 3 semaines (gain de 1 à 2

semaines avec les méthodes en milieu semaines avec les méthodes en milieu liquide et automatisées)liquide et automatisées)

Problème du pyrazinamide :Problème du pyrazinamide : Actif seulement en milieu acideActif seulement en milieu acide Inhibe la croissance du BKInhibe la croissance du BK Résultats souvent ininterprétables et non Résultats souvent ininterprétables et non

reproductiblesreproductibles

Méthodes génotypiquesMéthodes génotypiques Mécanismes de résistance aux antituberculeuxMécanismes de résistance aux antituberculeux

Mode d’actionMode d’action - MutationsMutations- %age de R lié à ces mutations%age de R lié à ces mutations

RifampicineRifampicineinhibe l’ARN polymérase par inhibe l’ARN polymérase par fixation à sa sous unité fixation à sa sous unité ββ

- Gène - Gène rporpoBB

- > 96 %- > 96 %

IsoniazideIsoniazideInhibe la synthèse des acides Inhibe la synthèse des acides mycoliques de la paroimycoliques de la paroi

-Gènes Gènes katkatG, G, inhinhA, A, ahpahpC, …C, …- ≈ ≈ 85-90 %85-90 %

PyrazinamidePyrazinamideIntervient sur la synthèse des Intervient sur la synthèse des AG à chaînes courtes (complexe AG à chaînes courtes (complexe FasFas1)1)

- Gène - Gène pncpncAA

- 72 à 97 %- 72 à 97 %

EthambutolEthambutol

Inhibe la synthèse des acides Inhibe la synthèse des acides mycoliques de la paroi par mycoliques de la paroi par fixation à l’arabinosyl fixation à l’arabinosyl transférasetransférase

-Gène Gène embembBB- 47 à 65 %47 à 65 %

Méthodes génotypiquesMéthodes génotypiques Tous les antituberculeux ne sont pas de bonnes ciblesTous les antituberculeux ne sont pas de bonnes cibles

Antituberculeux %age de souches R avec mutation

connue

Nombre de gènes impliqués

Difficulté des méthodes

phénotypiques

Meilleures cibles par ordre de

priorité

Rifampicine 95 1 0 1

Isoniazide 85-90 4 0

Pyrazinamide 70-90 1 ++++ 2

Ethambutol 50-70 1 +/-

Streptomycine 70 2 0

Kana / amikacine 50 ? 1 +/-

Fluoroquinolones 95 1 + 3

Méthodes génotypiquesMéthodes génotypiques

1ère étape : amplification génique 1ère étape : amplification génique (PCR)(PCR)

2ème étape :2ème étape : (SSCP, hétéroduplex, restriction...)(SSCP, hétéroduplex, restriction...) Hybridation avec des sondes Hybridation avec des sondes

oligonucléotidiques (Inno-Lipa-Rif-TB, oligonucléotidiques (Inno-Lipa-Rif-TB, puces Genechip)puces Genechip)

SéquençageSéquençage

Résistance à la Rifampicine : mutation Résistance à la Rifampicine : mutation du gène du gène rporpoBB

511 513 516 521 526 531 533

Leu Gln Asp Ser His Ser Leu

Pro Leu Tyr Leu Tyr Leu Pro

Pro Val Asp Trp

Arg

Leu

90 % des mutations de R = 10 % 35 % 45 %

Mutations de la région 510 – 533 (sous unité Mutations de la région 510 – 533 (sous unité ββ))

Hybridation : recherche de mutations Hybridation : recherche de mutations du gène du gène rporpoBB

Bandelette Inno-LiPA-Rif-TB®

Hybridation : recherche de mutations Hybridation : recherche de mutations du gènedu gène rpo rpoBB

Exemple de Bandelette Inno-LiPA-Rif-TB®

Hybridation : recherche de mutations Hybridation : recherche de mutations des gènes des gènes rporpoB et B et katkatGG

Bandelette GenoType® MTBDR

Hybridation avec puce Hybridation avec puce GeneChip : mutations du GeneChip : mutations du

gène gène rporpoBB

Puce GeneChip

Millions de sondes identiques par unité

20 µm

1.28 cm

400.000 unités par puce

Hybridation avec puce Hybridation avec puce GeneChip : mutations du GeneChip : mutations du

gène gène rporpoBB5’ T G C A C T T G A C A T A G G C T G T

5’ T G C A C T T G A A A T A G G C T G T

5’ T G C A C T T G A C A T A G G C T G T

5’ T G C A C T T G A G A T A G G C T G T

5’ T G C A C T T G A T A T A G G C T G T

G C A C T T G A C A T A G G C T G T A

G C A C T T G A C C T A G G C T G T A

G C A C T T G A C G T A G G C T G T A

G C A C T T G A C T T A G G C T G T A

A C T T G A C A T A G G C T G T A

A

C

G

T

Séquence cibleMarquée (fluo)

Sondes pour la 1ère base

Sondes pour la 2ème base

GeneChip Sequence Analyser

Avantages et inconvénients Avantages et inconvénients de l’hybridationde l’hybridation

Avantages :Avantages : RapiditéRapidité Se (90-95 %) et Sp (Se (90-95 %) et Sp (≈≈100 %)100 %) Résistance à RMP est prédictive de multirésistance Résistance à RMP est prédictive de multirésistance

(incite à différer le traitement)(incite à différer le traitement) Inconvénients : Inconvénients :

Coût ++Coût ++ Ne détecte que les mutations connues Ne détecte que les mutations connues

PCR et séquençagePCR et séquençage

Amplification des gènes de Amplification des gènes de résistancerésistance rporpoB, B, pncpncA +++A +++ autres : autres : katkatG, G, inhinhA, A, embembB …, plutôt en B …, plutôt en

recherche et épidémiologierecherche et épidémiologie Puis séquençage des ampliconsPuis séquençage des amplicons Comparaison sur une banque de Comparaison sur une banque de

données avec la liste des mutations données avec la liste des mutations connuesconnues

PCR et séquençagePCR et séquençage AvantagesAvantages : :

Caractérise le type de mutation : substitution de Caractérise le type de mutation : substitution de nucléotide et/ou d’a.a. , nucléotide et/ou d’a.a. , délétion, insertiondélétion, insertion

Portions d’ADN étudiées sont plus longues Portions d’ADN étudiées sont plus longues qu’avec l’hybridation : permet la détection de qu’avec l’hybridation : permet la détection de nouvelles mutations de résistancenouvelles mutations de résistance

InconvénientInconvénient : : Interprétation devant une mutation non Interprétation devant une mutation non

décrite ? : pas toujours de corrélation avec la décrite ? : pas toujours de corrélation avec la résistance clinique, faire une CMI et suivi du résistance clinique, faire une CMI et suivi du patientpatient

Gain de sensibilité ≈ faible par rapport à Gain de sensibilité ≈ faible par rapport à l’hybridation en pratiquel’hybridation en pratique

Recherche directe à partir des Recherche directe à partir des prélèvements ?prélèvements ?

Possible pour les échantillons dont Possible pour les échantillons dont l'ED est très positif (+++ à ++++)l'ED est très positif (+++ à ++++)

Préférer les prélèvements Préférer les prélèvements normalement monomicrobien (LCR) normalement monomicrobien (LCR)

Faux-positifs possibles :Faux-positifs possibles : rporpoB++ : amorces choisies dans les B++ : amorces choisies dans les

régions stables du génomerégions stables du génome pncpncA : moins problématique, gène plus A : moins problématique, gène plus

spécifique des mycobactériesspécifique des mycobactéries

Résistance aux Résistance aux ββ--lactamines : SARMlactamines : SARM

Acquisition d’une PLP additionnelle : PLP2a : très mauvaise affinité pour les β-lactamines résistance croisée à toute cette famille

Synthèse : gène mecA porté par la cassette SCCmec Complexe mec : mecA ± mecI, mecR1 Gènes codant des recombinases (intégration et

excision) : ccrA, ccrB, ccrC Eléments accessoires

Résistances à d’autres antibiotiques Résistances à des métaux lourds (Hg)

Données Données épidémiologiquesépidémiologiques

Portage de Portage de S. aureusS. aureus : 20-40% de la : 20-40% de la population (partie antérieure des fosses population (partie antérieure des fosses nasales) nasales)

Proportion de SARM au sein de l’espèce Proportion de SARM au sein de l’espèce S. S. aureusaureus : 29.5% : 29.5% (CCLIN Sud-est, 2004) (CCLIN Sud-est, 2004)

Dissémination importante par manuportageDissémination importante par manuportage S. aureusS. aureus responsables de 20% des infections responsables de 20% des infections

du site opératoiredu site opératoire ImpactImpact

Sur la mortalité et la morbiditéSur la mortalité et la morbidité Surcoût : séjour + long, antibiothérapie …Surcoût : séjour + long, antibiothérapie …

SARM = 74% de surcoût par rapport au SA méti-S

Détection phénotypique des Détection phénotypique des SARMSARM

Avec les disques d’oxacilline chargés à 5 µg et Milieu de MH, incubation à 30°C ou milieu MH hypersalé à 2 ou 4 %, incubation à 35°C inoculum fort : 107 UFC/ml, incubation 24 h et 48h

Cefoxitine milieu MH sans sel, un inoculum normal, une température d'incubation de 35°C.

Expression hétérogène difficile à détecter Problème des BORSA et des MODSA

Techniques d’agglutination : latex – Ac monoclonaux anti PLP2a

SCNSCN

CASFM : recherche du gène CASFM : recherche du gène mecmecA pour A pour les souches caractérisées intermédiaire à les souches caractérisées intermédiaire à l’oxacilline et pour les infections sévères l’oxacilline et pour les infections sévères des souches caractérisées sensiblesdes souches caractérisées sensibles

15 à 40% des 15 à 40% des S. saprophyticus S. saprophyticus sont sont caractérisés résistantcaractérisés résistant à la céfoxitine alors à la céfoxitine alors qu’elles ne possèdent pas le gène qu’elles ne possèdent pas le gène mecmecAA ou n’expriment pas de PLP2a. Ces ou n’expriment pas de PLP2a. Ces souches sont considérées comme souches sont considérées comme sensibles aux isoxazolyl-pénicillines.sensibles aux isoxazolyl-pénicillines.

Milieux spécifiquesMilieux spécifiques Milieux sélectifsMilieux sélectifs

Métistaph2 Métistaph2 (résistance ofloxacine, céfoxitine et (résistance ofloxacine, céfoxitine et fermentation du mannitol)fermentation du mannitol)

ORSAORSA (résistance oxacilline 2mg/l avec 5,5% de NaCl et (résistance oxacilline 2mg/l avec 5,5% de NaCl et fermentation du mannitol)fermentation du mannitol)

Problème de faux positifProblème de faux positif Milieux chromogènesMilieux chromogènes

MRSA IDMRSA ID (résistance céfoxitine et (résistance céfoxitine et -glucosidase des SARM)-glucosidase des SARM) CHROMagar MRSACHROMagar MRSA (résistance céfoxitine et activité (résistance céfoxitine et activité

phosphatase des SARM)phosphatase des SARM) MRSA selectMRSA select (résistance céfoxitine et activité (résistance céfoxitine et activité

phosphatase)phosphatase) Milieu Baird Parker + CiprofloxacineMilieu Baird Parker + Ciprofloxacine (résistance (résistance

à la ciprofloxacine et réduction du tellurite en tellure)à la ciprofloxacine et réduction du tellurite en tellure)

Détection génotypique de la Détection génotypique de la résistance à la méticillinerésistance à la méticilline

Les techniques mixtes Les techniques mixtes (faux positif si mélange (faux positif si mélange bactérien)bactérien) Culture + PCRCulture + PCR

LightCycler MRSA Detection Kit®LightCycler MRSA Detection Kit® Multiplex Multiplex gyrgyrAA/mec/mecAA Multiplex Multiplex nuc/mecnuc/mecAA

Culture + hybridation Culture + hybridation Evigene MRSA®Evigene MRSA®

Culture + PCR + hybridation Culture + PCR + hybridation Genotype®MRSAGenotype®MRSA

Les techniques directesLes techniques directes Genotype®MRSA directGenotype®MRSA direct Test IDI-MRSA®Test IDI-MRSA®

Techniques mixtes : Culture Techniques mixtes : Culture + PCR+ PCR

Détection du gène Détection du gène mecmecA A par PCRpar PCR

PCR-Multiplex (classique PCR-Multiplex (classique ou Real-time) (Light ou Real-time) (Light Cycler®)Cycler®) mecmecAA amorces spécifiques amorces spécifiques

d'espèce d'espèce S. aureusS. aureus : : nucnuc, , gyrgyrAA

Délai : après culture < 3 Délai : après culture < 3 heuresheures

Coût : 3,45 €Coût : 3,45 € Autres cibles : gène Autres cibles : gène femfemA, A,

gène gène sasa442442

mecAgyrA

Culture + hybridation : Culture + hybridation : EVIGENE MRSA® Detection KitEVIGENE MRSA® Detection Kit

DétectionDétection ADNr 16S des ADNr 16S des

staphylocoques (témoin +)staphylocoques (témoin +) Gène Gène nucnuc Gène Gène mecmecAA

Sandwich en plaque de Sandwich en plaque de microtitration avec microtitration avec révélation colorimétriquerévélation colorimétrique

Levi et al. J. Clin. Microbiol. 2003

Délai après culture : < 3h Délai après culture : < 3h Pas d'appareillage de PCRPas d'appareillage de PCR Sensibilité et spécificité = 100%Sensibilité et spécificité = 100% Directement sur les hémocultures dont l‘ED Directement sur les hémocultures dont l‘ED est positifest positif Coût Coût ~ 20€~ 20€

Genotype® StaphylococcusGenotype® Staphylococcus (Hain Life Science)(Hain Life Science)

A partir d'une cultureA partir d'une culture ExtractionExtraction Amplification avec amorces Amplification avec amorces

biotinyléesbiotinylées Hybridation sur bandelettesHybridation sur bandelettes Révélation colorimétrique Révélation colorimétrique

(streptavidine – PAL + substrat)(streptavidine – PAL + substrat) Délai < 5 hDélai < 5 h Genotype®MRSAGenotype®MRSA : detecte : detecte

uniquement uniquement S. aureusS. aureus, , S. S. epidermidis epidermidis et et mecmecAA

Culture + amplification + Culture + amplification + hybridationhybridation

Exemple d’identification de 10 souches de staphylocoques

CC : contrôle conjugué confirmant l’efficacité de la liaison conjugué-substrat

UC : contrôle universel avec sonde hybridant toutes bactéries

PVL : détection des gènes lukS-PV et lukF-PV

5-10 : fragments ARN23S spécifiques des espèces :

5 et 9 : S. aureus

6 : S. haemolyticus

7 : S. epidermidis

8 : S. hominis

9 : S. warneri

10 : S. simulans

Détection directe : Détection directe : Test IDI-MRSA Test IDI-MRSA (GeneOhm (GeneOhm

Sciences)Sciences) SCCSCCmecmec s’insère s’insère

spécifiquement à spécifiquement à l’extrémité 3’ de l’l’extrémité 3’ de l’orforfXX

5 amorces spécifiques de 5 amorces spécifiques de l’extrémité droite de l’extrémité droite de SSCSSCmecmec

1 amorce spécifique de 1 amorce spécifique de orforfXX

3 sondes moléculaires 3 sondes moléculaires (beacon) spécifiques (beacon) spécifiques d’une séquence du gène d’une séquence du gène orforfX située à droite du X située à droite du site d’intégration de site d’intégration de SCCSCCmecmec

Détection directe des Détection directe des SARM (2)SARM (2) Détection sur écouvillon nasal ou sur Détection sur écouvillon nasal ou sur

flacon d’hémocultureflacon d’hémoculture Délai < 2hDélai < 2h Seuil de détection : 25 UFCSeuil de détection : 25 UFC Sensibilité : 100%, Spécificité : Sensibilité : 100%, Spécificité :

96.5%96.5% VPP : 95.2% et VPN : 100%VPP : 95.2% et VPN : 100% Coût : Coût : ~ 30€/test~ 30€/test

1,2Huletsky et al.. J. Clin. Microbiol. 2004, Clin Infect. Dis. 2005 3Warren et al. J. Clin. Microbiol. Dec 2004

Detection directe : Detection directe : Genotype®MRSA Direct Genotype®MRSA Direct (Hain (Hain

Life Science)Life Science)

Extraction de l’ADNExtraction de l’ADN Amplification avec des Amplification avec des

amorces biotinyléesamorces biotinylées Hybridation Hybridation Détection d’un fragment Détection d’un fragment

spécifique du SARM spécifique du SARM combiné à la détection des combiné à la détection des SCCmec de type I-IVSCCmec de type I-IV

Entérocoques résistants à Entérocoques résistants à la vancomycine (ERV)la vancomycine (ERV)

Mécanisme Mécanisme : les glycopeptides reconnaissent le : les glycopeptides reconnaissent le résidu D-Ala-D-Ala terminal du pentapeptide résidu D-Ala-D-Ala terminal du pentapeptide pariétal. pariétal. Les types vanC, vanE, vanG possèdent un résidu Les types vanC, vanE, vanG possèdent un résidu D-Ala-D-Ser et vanA, vanB, van D, un résidu D-D-Ala-D-Ser et vanA, vanB, van D, un résidu D-Ala-D-Lac. Ceci diminue la fixation des Ala-D-Lac. Ceci diminue la fixation des glycopeptidesglycopeptides

Entérocoques sont responsables de 5% des Entérocoques sont responsables de 5% des infections nosocomiales (85-95% d’infections nosocomiales (85-95% d’Enterococcus Enterococcus faecalisfaecalis))

Prévalence des ERV : 1-2% pour Prévalence des ERV : 1-2% pour E. faeciumE. faecium, , <0,5% pour <0,5% pour E. faecalis E. faecalis (USA : 20-25% d’ERV en (USA : 20-25% d’ERV en 2003)2003)

Dissémination manuportée +++Dissémination manuportée +++

RésistanceRésistance aux aux Glycopeptides chez les Glycopeptides chez les

EntérocoquesEntérocoquesGénotype Phénotype CMI-Van CMI-Tei Expression Localisation Trf Espèces

Acquis

vanA VanA 64->1000 16-512 Inductible Plasmide + E. faeciumE. faecalisE. avium

vanB VanB 4-1000 0,5-1 Inductible Inconnu + E. faeciumE. faecalis

vanD VanD 64 4 Constitutif - E. faecium

Intrinseque

vanC-1 VanC 2-32 0,5-1 Constitutif Chromosome - E. gallinarum

vanC-2 VanC 2-32 0,5-1 Constitutif Chromosome - E. casseliflavus

VanC-3 VanC 2-32 0,5-1 Constitutif Chromosome - E. flavescens

VanC-3

Détection phénotypique Détection phénotypique (CASFM)(CASFM)

AntibiotiqueAntibiotiqueConcentration Concentration critique (mg/l)critique (mg/l)

Diamètre critique Diamètre critique (mm)(mm)

SS RR SS RR

Vancomycine Vancomycine (30µg)(30µg)

44 >8>8 1717 --

Teicoplanine Teicoplanine (30µg)(30µg)

44 >8>8 1717 - - Détermination des CMIDétermination des CMI

Echec thérapeutiqueEchec thérapeutique Diamètre <17mm Diamètre <17mm Diamètre vancomycine inférieur de 3mm à celui de la Diamètre vancomycine inférieur de 3mm à celui de la

teicoplanineteicoplanine Présence de colonies dans la zone d’inhibitionPrésence de colonies dans la zone d’inhibition Caractérisation I ou R par une méthode automatiséeCaractérisation I ou R par une méthode automatisée Culture sur milieu additionné de vancomycineCulture sur milieu additionné de vancomycine

Milieux spécifiquesMilieux spécifiques

Bouillons Bouillons Bouillon Enterococcosel®Bouillon Enterococcosel® supplémenté supplémenté

en vancomycine en vancomycine 6 mg/L 6 mg/L

*Esculine *Esculine esculétine esculétine coloration noire coloration noire

GélosesGéloses Gélose bile/esculineGélose bile/esculine contenant 6 mg/L ou contenant 6 mg/L ou

8mg/L de vancomycine8mg/L de vancomycine BHI agar et vancomycineBHI agar et vancomycine 6 mg/L ou 6 mg/L ou

8mg/L8mg/L Vancomycine Screen Agar® BDVancomycine Screen Agar® BD

Problème de détection Problème de détection phénotypiquephénotypique

Sensibilité de la culture : Sensibilité de la culture : 58% pour la détection de 58% pour la détection de vanvanBB 80% pour la détection de 80% pour la détection de vanvanAA

Concentration de vancomycine non standardisée Concentration de vancomycine non standardisée (6 ou 8mg/L)(6 ou 8mg/L)

Une concentration de vancomycine de 8mg/l Une concentration de vancomycine de 8mg/l inhibent le développement de certains ERV-inhibent le développement de certains ERV-vanvanBB

Certains entérocoques sont viables mais non Certains entérocoques sont viables mais non cultivablescultivables

Délai >48H pour l’isolement et le traitement du Délai >48H pour l’isolement et le traitement du patientpatient

Détection génotypiqueDétection génotypique

Méthodes mixtes : culture + PCRMéthodes mixtes : culture + PCR PCR multiplex + migration sur gelPCR multiplex + migration sur gel PCR-RFLP : amplification de l’ADN + PCR-RFLP : amplification de l’ADN +

digestion par des enzymes de digestion par des enzymes de restriction et migration sur gelrestriction et migration sur gel

Culture + PCR + hybridation : Culture + PCR + hybridation : Genotype® EnterococcusGenotype® Enterococcus

Méthodes directes : Méthodes directes : PCR temps réel sur écouvillon rectalPCR temps réel sur écouvillon rectal

Technique mixte : Technique mixte : Culture + PCR multiplexCulture + PCR multiplex

MM

600

500

400

300

200

700800900

1,0001,100

1,500

100

vanG (941)vanC-1 (815)/ vanC-2 (827)vanA (732)vanB (647)

vanD (500)

vanE (430)

ddl E. faecium (1,092)

ddl E. faecalis (475)

nuc (218)

S. epidermidis (125)

1,200

bp S. e

pide

rmid

is(se

nsib

le)

vanA

(S. e

pide

rmid

is)

vanA

(E. f

aeci

um)

vanA

( E. f

aeca

lis)

vanB

-1va

nB-2

vanB

-3va

nC-1

vanC

-2va

nD-1

(E. f

aeci

um)

vanD

-4 (E

. fae

cium

)

vanD

(E. f

aeca

lis)

vanE

vanG

E. fae

calis

E. fae

cium

S. a

ureu

sva

nA (S

. aur

eus M

I)

vanA

(S. a

ureu

s PA

)

sensible

Culture + PCR + hybridation : Culture + PCR + hybridation : Genotype® EnterococcusGenotype® Enterococcus

(Hain Life Science)(Hain Life Science) Extraction de l’ADN à Extraction de l’ADN à

partir d'une culturepartir d'une culture Amplification avec Amplification avec

amorces biotinyléesamorces biotinylées Hybridation sur Hybridation sur

bandelettesbandelettes Révélation colorimétrique Révélation colorimétrique

(streptavidine – PAL + (streptavidine – PAL + substrat)substrat)

Délai < 5 hDélai < 5 h Etude sur 105 souchesEtude sur 105 souches

Identification spécificité Identification spécificité 100%100%

Détection du génotype Détection du génotype 100%100%

Eigner et al. J. Clin. Microbiol. 2005

Détection directe dans Détection directe dans des écouvillonnages des écouvillonnages rectauxrectaux PCR temps-réelPCR temps-réel

LightCycler® LightCycler® RocheRoche

Détection Détection vanA/vanB/vanB2,3vanA/vanB/vanB2,3

Sensibilité : 100 %Sensibilité : 100 % Spécificité : 97%Spécificité : 97% VPP : 97%VPP : 97% VPN : 100%VPN : 100% Délai < 4hDélai < 4h

Sloan et al. J. Clin. Microbiol. 2004

ββ-lactamases-lactamases

Production d’enzyme capable Production d’enzyme capable d’hydrolyser le cycle d’hydrolyser le cycle -lactame-lactame

Plusieurs familles d’enzymes : TEM, Plusieurs familles d’enzymes : TEM, SHV, CTX-M, OXA …SHV, CTX-M, OXA …

Mutations ponctuelles responsables Mutations ponctuelles responsables de la production de BLSEde la production de BLSE

35-40% des infections nosocomiales 35-40% des infections nosocomiales sont dues à des entérobactériessont dues à des entérobactéries

3% des entérobactéries expriment une 3% des entérobactéries expriment une BLSEBLSE

BLSE de la famille des BLSE de la famille des TEMTEM

Détection phénotypique Détection phénotypique des BLSEdes BLSE

CMI de la ceftazidime ou CMI de la ceftazidime ou ceftriaxoneceftriaxone

Test de synergieTest de synergie : acide : acide clavulanique – ceftazidime, clavulanique – ceftazidime, aztréonam, céfotaxime ou aztréonam, céfotaxime ou ceftriaxone (CASFM)ceftriaxone (CASFM)

Test de synergieTest de synergie : acide : acide clavulanique – céfépime ou clavulanique – céfépime ou cefpirome en cas cefpirome en cas d’hyperproduction de d’hyperproduction de céphalosporinase (CASFM)céphalosporinase (CASFM)

Inconvénients de la Inconvénients de la détection phénotypiquedétection phénotypique

33% des BLSE non détectées33% des BLSE non détectées Certains sous types n’ont pas le même Certains sous types n’ont pas le même

phénotypephénotype SHV-6 et 8 : faible résistance à la ceftazidimeSHV-6 et 8 : faible résistance à la ceftazidime SHV 2, 2a, 3 : forte R ceftriaxone, céfotaxime, faible R SHV 2, 2a, 3 : forte R ceftriaxone, céfotaxime, faible R

ceftazidimeceftazidime SHV -4, -5, -9, -10, -12 : résistance à toutes les C3GSHV -4, -5, -9, -10, -12 : résistance à toutes les C3G

Problème de détection Problème de détection autres mécanismes : céphalosporinase inductible, autres mécanismes : céphalosporinase inductible,

imperméabilité par modification des porinesimperméabilité par modification des porines effet inoculum : CMI augmentent proportionnellement effet inoculum : CMI augmentent proportionnellement

à l ’inoculumà l ’inoculum Délai >48HDélai >48H Pas de données épidémiologiquesPas de données épidémiologiques

Détection génotypiqueDétection génotypique PCRPCR : amorces spécifiques des familles : amorces spécifiques des familles

d’enzymes (régions conservées)d’enzymes (régions conservées) PCR-SSCPPCR-SSCP : Single Strand Conformation : Single Strand Conformation

Polymorphism : ne permet pas de détecter Polymorphism : ne permet pas de détecter tous les variants (dépend de la région tous les variants (dépend de la région amplifiée)amplifiée)

PCR-RFLPPCR-RFLP : amplifiats digérés par des : amplifiats digérés par des enzymes de restriction --> électrophorèseenzymes de restriction --> électrophorèse PCR-RFLP : detection de 100% des souches BLSE PCR-RFLP : detection de 100% des souches BLSE

contre 52% pour l ’E-test C3G/C3G+Ac contre 52% pour l ’E-test C3G/C3G+Ac clavulaniqueclavulanique

SHV -3, -4, -7, -13 sont difficilement identifiablesSHV -3, -4, -7, -13 sont difficilement identifiables PCR-RSI PCR-RSI : insertion de site de restriction : insertion de site de restriction

avant la digestion enzymatiqueavant la digestion enzymatique PCR-SSCP + RFLPPCR-SSCP + RFLP

Détection génotypique Détection génotypique (2)(2)

PCR en temps réelPCR en temps réel : amorces : amorces spécifiques des mutations recherchées spécifiques des mutations recherchées (+++ en cas d’épidémies)(+++ en cas d’épidémies)

SéquençageSéquençage : gold standard, détection : gold standard, détection de nouvelles résistancesde nouvelles résistances

Mini-séquençageMini-séquençage (SHV) : fixation de (SHV) : fixation de l’amorce juste avant le site de mutation l’amorce juste avant le site de mutation et détermination de la 1ère base fixéeet détermination de la 1ère base fixée

Puces à ADNPuces à ADN

Les Puces ADNLes Puces ADN

En 2004, détection de 106 En 2004, détection de 106 variants TEM présents variants TEM présents dans les banques de dans les banques de donnéesdonnées

168 sondes 168 sondes oligonucléotidiques oligonucléotidiques déposées en triplicate sur déposées en triplicate sur lame de verre (SNP)lame de verre (SNP)

Nécessité d'une Nécessité d'une infrastructure infrastructure technologique lourdetechnologique lourde

Délai 3,5 hDélai 3,5 h

Mécanismes de Mécanismes de résistances aux résistances aux

aminosidesaminosides Diminution de l ’accumulation intracellulaire de Diminution de l ’accumulation intracellulaire de l ’antibiotiquel ’antibiotique altération de la perméabilité de la membrane externealtération de la perméabilité de la membrane externe diminution du transport au niveau de la membrane diminution du transport au niveau de la membrane

interneinterne efflux actifefflux actif

Modification de la cible : mutation au niveau des Modification de la cible : mutation au niveau des protéines ribosomales (protéines ribosomales (rpsrps)ou de l ’ARN16S ()ou de l ’ARN16S (rrsrrs))

Inactivation enzymatique de l ’antibiotique : ++Inactivation enzymatique de l ’antibiotique : ++ Aminosides Phophotransférases : APHAminosides Phophotransférases : APH Aminosides Nucléotidyltransférases : ANTAminosides Nucléotidyltransférases : ANT Aminosides Acétyltransférases : AACAminosides Acétyltransférases : AAC

Détection génotypique Détection génotypique de la résistance aux de la résistance aux

aminoglycosidesaminoglycosides Intérêt épidémiologiqueIntérêt épidémiologique Multiplicité des mécanismes de résistanceMultiplicité des mécanismes de résistance Détection par PCR des résistances par Détection par PCR des résistances par

production d ’enzymes inactivant production d ’enzymes inactivant l ’antibiotiquel ’antibiotique Chez les cocci à Gram-positif :Chez les cocci à Gram-positif :

APH(3'), ANT(4'), APH(2'')-AAC(6')APH(3'), ANT(4'), APH(2'')-AAC(6') Chez les bactéries à Gram-négatifChez les bactéries à Gram-négatif

Entérobactéries, Acinetobacter et AAC(6')-IEntérobactéries, Acinetobacter et AAC(6')-I

Détection génotypique Détection génotypique de la résistance aux MLSde la résistance aux MLS MécanismesMécanismes

Méthylation de l’ARN23S : gènes Méthylation de l’ARN23S : gènes ermerm Efflux : gène Efflux : gène msrmsrA, A, mefmefAA EnzymesEnzymes

Acétylases (gène Acétylases (gène vatvat)) Lyases (gène Lyases (gène vgbvgb)) Nucléotidyltransférases (gèneNucléotidyltransférases (gène lnu lnuC)C)

Intérêt épidémiologiqueIntérêt épidémiologique Streptocoques (SGA, SGB, pneumocoques,...)Streptocoques (SGA, SGB, pneumocoques,...) StaphylocoquesStaphylocoques

Intérêt diagnostic :Intérêt diagnostic : Helicobacter pyloriHelicobacter pylori CampylobacterCampylobacter

Mécanisme de résistance Mécanisme de résistance d’Helicobacter pylorid’Helicobacter pylori

20% de 20% de résistance à la résistance à la ClarithromycineClarithromycine

Modification de Modification de la cible la cible défaut d’affinité défaut d’affinité du macrolide : du macrolide : codée par le codée par le gène gène rrnrrn23S23S

Détection phénotypique de la Détection phénotypique de la résistance chez résistance chez Helicobacter Helicobacter

pyloripylori Souvent délicate :Souvent délicate :

Conditions particulières de transport des Conditions particulières de transport des biopsiesbiopsies

Incubation à 35-37°C en microaérophilieIncubation à 35-37°C en microaérophilie Croissance lente : lecture de l'antibiogramme Croissance lente : lecture de l'antibiogramme

après 3 à 4 joursaprès 3 à 4 jours

cible intéressante pour une détection génotypiquecible intéressante pour une détection génotypique

Détection génotypique : Détection génotypique : PCR temps réelPCR temps réel

Détection de Détection de la résistance à la résistance à la la clarithromycinclarithromycine par PCR e par PCR temps réel temps réel (FRET) (FRET) directement directement sur biopsies sur biopsies gastriquesgastriques

Détection génotypique : Détection génotypique : méthode FISHméthode FISH

Utilise un couple de sondes oligonucléotidiques Utilise un couple de sondes oligonucléotidiques marquées fluorescentes (contre l'ADNr 16S et marquées fluorescentes (contre l'ADNr 16S et 23S)23S)

Méthode Méthode :: hybridationhybridation

observation par microscopie à observation par microscopie à fluorescencefluorescence

Avantages Avantages :: rapide (3 heures)rapide (3 heures)

indépendant de la culture et de la indépendant de la culture et de la PCRPCR

Mécanisme de résistance Mécanisme de résistance aux quinolonesaux quinolones

Modification de la cibleModification de la cible ADN gyrase (AADN gyrase (A22BB22): ): gyrgyrA, A, gyrgyrBB Topoisomérase IV (CTopoisomérase IV (C22EE22): ): parparC, C, parparEE

Diminution de la concentration Diminution de la concentration intracellulaire de l’antibiotiqueintracellulaire de l’antibiotique Diminution de l’expression des porines : Diminution de l’expression des porines :

ompompF, F, ompompC, C, nfxnfxB, B, cfxcfxB, B, oproprFF Efflux actif : Efflux actif : forforA, A, pmrpmrA, A, oproprJ, J, oproprK, K,

oproprMM

Résistance par pallier en fonction du Résistance par pallier en fonction du nombre de mutationsnombre de mutations

Détection génotypique Détection génotypique de la résistance au de la résistance au

quinolonesquinolones Intérêt Intérêt

épidémiologiqueépidémiologique PCR + séquençagePCR + séquençage PCR avec des PCR avec des

amorces spécifiquesamorces spécifiques Mutations Mutations

ponctuelles sur les ponctuelles sur les QRDR (Quinolone QRDR (Quinolone Resistance Resistance Determining Region) Determining Region) : utilisation de puces : utilisation de puces

Mécanisme de résistance Mécanisme de résistance aux cyclinesaux cyclines

Diminution des concentrations Diminution des concentrations intracellulaires d’antibiotiqueintracellulaires d’antibiotique Modification des porines Modification des porines Système d’efflux (+++) : Système d’efflux (+++) : tettetA, A, tettetB, B,

tettetC …C … Modification de la cible : protection Modification de la cible : protection

du ribosome : du ribosome : tettetM, M, tettetQ, Q, oproprA …A … Enzymes inactivant l’antibiotique Enzymes inactivant l’antibiotique

(minoritaire) : (minoritaire) : tettetXX

Détection génotypique Détection génotypique de la résistance aux de la résistance aux

tétracyclinestétracyclines Multiplicité des Multiplicité des

déterminants déterminants (alphabet (alphabet tettet))

Sondes, PCR Sondes, PCR spécifiquesspécifiques

Puces ADNPuces ADN Intérêt Intérêt

épidémiologiquépidémiologiquee

ConclusionConclusion Ce qui est développé en routine :Ce qui est développé en routine :

Détection des SARMDétection des SARM Recherche de résistance à RMP, PZA +/- INHRecherche de résistance à RMP, PZA +/- INH

Ce qui a vocation à être développé : Ce qui a vocation à être développé : Détection des ERVDétection des ERV Détection des résistances chez Détection des résistances chez H. pyloriH. pylori

La détection génotypique des BLSE La détection génotypique des BLSE semble nécessaire (séquençage, puces)semble nécessaire (séquençage, puces)

Quinolones, cyclines, aminosidesQuinolones, cyclines, aminosides Puces semblent incontournables , problème Puces semblent incontournables , problème

du coût ?du coût ?

Puce permettant la détection de Puce permettant la détection de 90 gènes de résistance connus de 90 gènes de résistance connus de

bactéries à Gram positifbactéries à Gram positif

Genres bactériens testésGenres bactériens testés : :

Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus,Lactococcus Bacillus, Listeria, ClostridiumStaphylococcus, Streptococcus, Enterococcus,Lactococcus Bacillus, Listeria, Clostridium

méticilline

Aminosides

Phénicolés

Glycopeptides

Tétracyclines

MLS

ß-lactamines