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DETERMINACIÓN DE IL-12 Y TNFα
EN CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA HUMANA ESTIMULADAS CON EL POLISACÁRIDO PURIFICADO DE Cryptococcus
neoformans
MARIA PAULINA AYCARDI MORINELLY
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
POSGRADO EN BIOLOGÍA
Santafé de Bogotá, D.C. Febrero de 2003
DETERMINACIÓN DE IL-12 Y TNFα
EN CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA HUMANA ESTIMULADAS CON EL POLISACÁRIDO PURIFICADO DE Cryptococcus
neoformans
MARIA PAULINA AYCARDI MORINELLY
DIRECTOR
JOHN MARIO GONZALEZ M.D; Ph.D.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
Bogotá, D.C. Febrero de 2003
DETERMINACIÓN DE IL-12 Y TNFα
EN CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA HUMANA ESTIMULADAS CON EL POLISACÁRIDO PURIFICADO DE Cryptococcus
neoformans
MARIA PAULINA AYCARDI MORINELLY
_______________________ _____________________ Manuel Franco, Ph.D. Adriana Cuellar, M.Sc. JURADO JURADO
_________________________ Marta Mesa Villanueva, M.Sc.
JURADO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
Bogotá, D.C. Febrero de 2003
DETERMINACIÓN DE IL-12 Y TNFα
EN CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA HUMANA ESTIMULADAS CON EL POLISACÁRIDO PURIFICADO DE cryptococcus
neoformans
MARIA PAULINA AYCARDI MORINELLY
_________________________________ Dra. ANGELA UMAÑA DECANO ACADEMICO
FACULTAD DE CIENCIAS
_____________________________________
Dr. LUIS ALEJANDRO BARRERA DIRECTOR PROGRAMA DE POSTGRADO
FACULTAD DE CIENCIAS PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
Bogotá, D.C. Febrero de 2003
Los criterios expuestos, las opiniones expresadas y las conclusiones anotadas son de exclusiva responsabilidad del autor, y no comprometen en
absoluto a la PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA.
Artículo 23 de la Resolución del 13 de julio de 1946.
Estatutos de la Pontificia Universidad javeriana
AGRADECIMIENTOS
GRACIAS A TI PADRE CELESTIAL
Y A TODAS LAS PERSONAS E
INSTITUCIONES QUE ME APOYARON EN ESTE TRABAJO
EN ESPECIAL .............
A LA UNIVERSIDAD DE CORDOBA Y A LA PONTIFICIA
UNIVERSIDAD JAVERIANA.
TABLA DE CONTENIDO
Pág
1. INTRODUCCIÓN
2. OBJETIVOS 5
2.1. OBJETIVO GENERAL 5
2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS 5
3. ANTECEDENTES BIBLIOGRAFICOS 6
3.1. CARACTERIZACIÓN INMUNOLÓGICA DE LOS POLISACÁRIDOS 6
3.2. ALGUNAS CITOCINAS QUE MEDIAN Y REGULAN LA INMUNIDAD
INNATA Y LA INMUNIDAD ADAPTATIVA 8
3.2.1. Interferón gamma (IFN-γ ) 8
3.2.2. Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α ) 9
3.2.3. Interleucina-12 (IL-12) 11
3.3. CARACTERIZACIÓN GENERAL DE Criptococcus neoformans 12
3.4. PRINCIPALES FACTORES DE VIRULENCIA Criptococcus neoformans 14
3.4.1. Cápsula de polisacáridos 14
3.4.1.1. Componentes de la cápsula de Criptoccus neoformans 17
3.4.1.1.1. Glucuronoxilomanano (GXM) 17
3.4.1.1.2. Galactoxilomanano (GalXM) 17
3.4.1.1.3. Manoproteina (MP) 18
3.4.2. Melanina 19
3.4.3. Manitol 21
3.5. ACCIÓN PATÓGENA DE Criptococcus neoformans 21
3.6. RESPUESTA INMUNE A Criptococcus neoformans 22
3.6.1. Defensa celular no especifica contra Criptococcus neoformans 23
3.6.1.1. Polimorfonucleares 23
3.6.1.2. Monocitos/Macrófagos 24
3.6.1.3. Células NK 26
3.6.1.4. Sistema del complemento 28
3.6.2. Defensa humoral especifica contra Criptococus neoformans 29
3.6.2.1. Anticuerpos 29
3.6.3. Defensa celular especifica contra Criptococcus neoformans 33
3.7. PRODUCCIÓN DE CITOCINAS EN A Criptococcus neoformans 34
3.7.1. Respuesta de citocinas a Criptococcus neoformans en ratones 34
3.7.2. Respuesta de citocinas a Criptococcus neoformans en humanos 38
4. MATERIALES Y METODO 42
4.1. TIPO DE ESTUDIO 42
4.2. CULTIVO DE Criptococcus neoformans 42
4.3. OBTENCIÓN DEL POLISACÁRIDO CAPSULAR Y PURIFICACIÓN
DEL GXM 42
4.4. DETERMINACIÓN DE PROTEINAS EN EL GXM 43
4.5. OBTENCIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE
PERIFERICA (CMSP) 43
4.6. EVALUACIÓN DEL EFECTO DE SOBRENADANTES DE CULTIVOS
CELULARES SOBRE EL CRECIMIENTO DE Criptococcus neoformans 44
4.6.1. Obtención de sobrenadantes 44
4.6.2. Efecto de sobrenadantes de cultivos celulares sobre el crecimiento
de Criptoccus neoformans 45
4.7. DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE
Criptococus neoformans EN MEDIO LIQUIDO 46
4.8. EFECTO DEL MEDIO DE CULTIVO Y SUS COMPONENTES SOBRE
EL CRECIMIENTO DE Criptococcus neoformans 46
4.9. EFECTO DEL INTERFERON γ RECOMBINANTE HUMANO SOBRE
CULTIVOS DE Criptoccus neoformans 47
4.10. ESTIMULACIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEARES TOTALES PARA
DETECCIÓN DE CITOCINAS INTRACELULARES 48
4.11. FENOTIPIFICACIÓN DE POBLACIONES CELULARES 48
4.12. EVALUACIÓN DE CITOCINAS POR CITOMETRÍA DE FLUJO 49
4.13. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 50
5. RESULTADOS 51
5.1. DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE PROTEINAS EN EL GXM
POR SDS-PAGE 51
5.2. EFECTO DE SOBRENADANTES DE CÉLULAS MONONUCLEARES
DE SANGRE PERIFERICA CULTIVADAS EN PRESENCIA DE GXM SOBRE
EL CRECIMIENTO DE Criptococcus neoformans 52
5.3. CURVA DE CRECIMIENTO DE Criptococcus neoformans EN MEDIO
LIQUIDO 55
5.4. ENSAYO DE INHIBICIÓN Y CURVA DE CRECIMIENTO DE
Criptococus neoformans EN MEDIO LIQUIDO 57
5.5. EFECTO DEL MEDIO DE CULTIVO Y SUS COMPONENTES SOBRE
EL CRECIMIENTO DE Criptococcus neoformans 59
5.6. EFECTO DEL INTERFERON γ RECOMBINANTE HUMANO SOBRE
EL CRECIMIENTO DE Criptococcus neoformans 61
5.7. DETERMINACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE IL-12 Y TNF-α EN
RESPUESTA AL GXM 65
5.8. PRODUCCIÓN DE IL-12 Y TNF-α POR MONOCITOS ACTIVADOS 70
6. DISCUSIÓN 73
CONCLUSIONES 85
RECOMENDACIONES 86
BIBLIOGRAFÍA 88
RESUMEN
Cryptococcus neoformans es un hongo oportunista que produce enfermedad en
individuos con deficiencias celulares incluyendo a los individuos con SIDA. El
principal factor de virulencia de este hongo es su cápsula de polisacáridos, la cual
está compuesta aproximadamente en un 90% del polisacárido Glucuronoxilomano
GXM. La cápsula de C. neoformans representa uno de los mayores factores de
virulencia de la levadura con propiedades toleragénicas.
En este trabajo se evaluó la capacidad del GXM de inducir la producción de
sustancias solubles como las citocinas y el efecto de estas sobre el crecimiento
del hongo.
Se cultivaron 1x103 UFC /pozo de C. neoformans en placas de cultivo de 96 pozos
en presencia de sobrenadantes al 100 y al 50% obtenidos de cultivos in vitro de
poblaciones de células mononucleares de sangre periférica humanas estimuladas
con GXM a 10μg/ml durante 24 y 48 horas. Al término de cada tiempo, se
sembraron en agar sabouraud para el recuento de las unidades formadoras de
colonias (UFC) y para la evaluación de su efecto en la inhibición del crecimiento
del hongo. Igualmente, se utilizó una metodología en Sabouraud líquido similar a
la empleada para evaluar la actividad de agentes quimioterapéuticos sobre el
crecimiento de la levadura, con el propósito de evaluar la actividad inhibitoria de
los sobrenadantes al 100 y al 50%. Así mismo, se evaluó el efecto directo de
factores solubles como el IFN-γ sobre el crecimiento de C. neoformans
adicionando IFN-γ Recombinante Humano a concentraciones de 1, 10 y 100U/ml
a los cultivos de la levadura in vitro.
Adicionalmente se determinó mediante citometría de flujo la producción
intracelular de IL-12 y TNF-α en células mononucleares totales de sangre
periférica humanas estimuladas con GXM.
Se demostró que sobrenadantes de células mononucleares estimuladas con GXM
no presentaron capacidad inhibitoria del crecimiento de hongo a las 24 y 48 horas
de cultivo, pero se pudo comprobar que el IFN-γ a una concentración de 100U/ml
presenta una tendencia a bloquear el crecimiento de la levadura alcanzando el
máximo de inhibición a las 24 horas de cultivo.
El GXM no estimuló la producción IL-12 y TNF-α en linfocitos T CD4+, CD8+ , NK
ni monocitos, probablemente porque este efecto depende de diversos factores
séricos o porque posiblemente sea incapaz de estimular las vías de señalización
necesarias para estimular la liberación de estos factores solubles.
1. INTRODUCCIÓN. En los últimos años, los polisacáridos se han convertido en blanco de estudio para
muchos inmunólogos porque son antígenos que frecuentemente hacen parte de
las paredes y cápsulas de muchos microorganismos infecciosos constituyendo su
principal factor de virulencia, como es el caso de Cryptococcus neoformans.
Cryptococcus neoformans es un hongo patógeno que ataca particularmente a
personas que padecen inmunodeficiencias celulares o pacientes con el virus de la
inmunodeficiencia humana “VIH” (95, 96, 188) ocasionando meningoencefalitis (5,
97). El principal factor de virulencia de esta levadura lo constituye su cápsula,
compuesta en un 90% del polisacárido Glucuronoxilomanano (GXM) (42).
Ha sido demostrado que la interacción directa de células mononucleares de
sangre periférica (CMSP) humana con Cryptococcus neoformans puede inhibir el
crecimiento de la levadura in vitro (119, 120, 121, 161, 164, 165) y que durante la
defensa del huésped contra este agente infeccioso participan citocinas que
pueden actuar como mediadores positivos o negativos de la respuesta,
regulándose y actuando sobre diferentes tipos celulares que participan tanto en la
inmunidad innata como en la inmunidad adaptativa (122-127). Dentro de las
citocinas reportadas se encuentran principalmente Interferón gama (IFN-�),
Interleucina 12 (IL-12) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-�) .(16, 92, 173,
177, 178, 179). Este patrón de citocinas es requerido para la iniciación de una
respuesta Th1 protectora, la cual parece ser fundamental para la eliminación de la
levadura en pulmón y cerebro (100, 172, 177).
Estudios previos realizados en nuestro laboratorio, sugerían que sobrenadantes
obtenidos de cultivos de células mononucleares de sangre periférica (CMSP)
humana depletadas de monocitos y enriquecidas en NK estimuladas con la
levadura, inhibían el crecimiento del hongo in vitro y que células mononucleares
de sangre periférica de humanos depletadas de monocitos, producian IFN-� en
respuesta al GXM de Cryptococcus neoformans (217).
Para comprender mejor la regulación de la secreción de citocinas y sus efectos en
respuesta al polisacárido capsular de Cryptococcus neoformans y siguiendo la
línea de investigaciones preliminares del Grupo de Inmunobiología, en este trabajo
se evaluó por citometría de flujo la inducción in vitro de IL-12 y TNF-� intracelular
en células mononucleares totales de sangre periférica humana estimuladas con el
polisacarido GXM de Cryptococcus neoformans y con Forbol Miristato Acetato
(PMA) en combinación con el Ionóforo de calcio Ionomicina. Existen varios
estudios in vitro que describen la visualización por citometría de flujo de la
producción de citocinas en células mononucleares de sangre periférica humana
cuando se utilizan activadores celulares como la PMA/Ionomicina (206-210) por
esta razón, este estímulo farmacológico se aplicó como control positivo en
experimentos de este trabajo.
Igualmente, se determinó el efecto directo de los sobrenadantes obtenidos de
cultivos de células mononucleares totales de sangre periférica humana
estimuladas con GXM de Cryptococcus neoformas y del IFN-� recombinante
humano sobre los cultivos del hongo in vitro. Aún no existen reportes que
describan el efecto directo del interferón gamma recombinante humano sobre el
crecimiento de Cryptococcus neoformas, los trabajos publicados han sido
ralizados para evaluar la eficacia terapeútica de esta citocina en el tratamiento de
la criptococosis sistémica en ratones (211).
La determinación del efecto potencial del GXM y de los otros componentes de la
cápsula de polisacáridos de Cryptococcus neoformans en la inducción de
mediadores solubles o citocinas por células mononucleares de sangre periférica
humana, es un área de investigación bastante interesante en la actualidad, ya que
el entendimiento de la respuesta de citocinas y sus efectos potenciales sobre la
inmunidad del huésped, mejora nuestra comprensión sobre la patogenicidad de
esta levadura y la de muchos microorganismos infecciosos que poseen grandes
cápsulas de polisacáridos.
Es importante mencionar, que en la literatura no existen reportes de ensayos
utilizando sobrenadantes de CMSP humanas estimuladas con GXM, para
determinar el efecto inhibitorio de estos sobre el crecimiento de la levadura, ni
tampoco han sido reportados estudios donde se haya determinado el efecto del
GXM en la inducción de citocinas por CMSP humanas evaluado por citometría de
flujo. Los trabajos reportados han sido realizados midiendo citocinas en
sobrenadantes de cultivos de células mediante técnicas como ELISA, RT-PCR
utilizando cepas de la levaduras capsuladas, acapsuladas, la cápsula completa, el
Glucuronoxilomanano (GXM), el Galactoxilomanano (GalXM) o la manoproteína
(MP).
2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo General Evaluar la producción in vitro de mediadores solubles inducidos por el
Glucuronoxilomanano (GXM) de Cryptococcus neoformas en células
mononuclares totales de sangre periférica humana.
2.2 Objetivos Específicos
2.2.1 Evaluar por citometría de flujo la inducción in vitro de IL-12 y TNF-α
intracelular en linfocitos TCD4+, CD8+, células NK y monocitos humanos
estimulados con el polisacárido GXM de Cryptococcus neoformans.
2.2.2 Determinar el efecto de los sobrenadantes obtenidos de cultivos de células
mononucleares totales de sangre periférica humana estimuladas con GXM, sobre
el creciminto de C. neoformans in vitro.
2.2.3 Determinar el efecto directo del IFN-γ recombinante humano en el
crecimiento in vitro de C. neoformans.
3. ANTECEDENTES BIBLIOGRAFICOS 3.1 Caracterización inmunológica de los polisacáridos.
Los polisacáridos conforman un grupo heterogéneo de polímeros de diferente
longitud y composición, conocidos con el nombre de glucanos. Los polisacáridos
están constituidos de más de diez unidades repetitivas de azúcares simples
unidos a través de enlaces glucosídicos.
A diferencia de las proteínas y ácidos nucleicos, los polisacáridos forman cadenas
simples o ramificadas capaces de asumir solo un limitado número de
conformaciones debido a las restricciones estéricas sobre la libertad de rotación
de las unidades de azúcar, por lo cual estas moléculas son poco flexibles y por lo
general no pueden plegarse y formar estructuras globulares como las proteínas
(1).
Los antígenos polisacáridos son grandes moléculas polivalentes, compuestos de
múltiples epítopes antigénicos idénticos que pueden inducir el entrecruzamiento
de inmunoglobulinas de membrana sobre las células B, activándolas sin la ayuda
de las células T, por lo tanto no requieren ser presentados en el contexto del
complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHC II) (2, 3, 4).
Los polisacáridos presentan elevado peso molecular y son degradados
pobremente, de tal forma que el procesamiento proteolítico que ocurre con los
antígenos proteicos no es efectivo para este tipo de antígenos, así que pueden
persistir por largos periodos de tiempo en los tejidos linfoides. Contrario a las
proteínas, los polisacáridos no presentan los requerimientos estructurales
necesarios para ser procesados y presentados por moléculas del complejo mayor
de histocompatibilidad y ser reconocidos por linfocitos T (4).
Sin embargo, existen evidencias que demuestran que los polisacáridos pueden
interactuar directamente con las células T a través de mecanismos que aún no se
conocen (2). Adicionalmente, se ha determinado que los polisacáridos pueden
interactuar también con los monocitos a través del complejo receptor CD14/TLR4
(TLR4) expresado en la superficie de estas células (7,8) y con las células NK a
través del receptor NKR-P1(9).
La interacción directa de los polisacáridos con células del sistema inmune, puede
inducir señales intracelulares para la liberación de citocinas que pueden amplificar
la señal protectora frente a estos antígenos (7, 8,9). Los mecanismos implicados
en estas interacciones no se conocen plenamente y son objeto de estudio en la
actualidad.
Muchos microorganismos patógenos para el hombre, poseen grandes paredes o cápsulas de polisacáridos que están en contacto continuo con el organismo, y que actúan como factores de virulencia. La inmunidad innata juega un papel importante en la generación de los primeros mecanismos para el control de estos agentes infecciosos y puede determinar la calidad de la respuesta específica que se generará posteriormente. Los polisacáridos son antígenos importantes en la respuesta inmune por lo que en los últimos años, se han convertido en blanco de estudio para muchos inmunólogos.
3.2 Algunas citocinas que median y regulan la inmunidad innata y la
inmunidad adaptativa.
Las citocinas constituyen una serie diversa de proteínas que incluyen linfocinas,
interleucinas monocinas y factores estimulantes de colonias (CSF) (10). Las
citocinas son producidas por una variedad de tipos celulares como los
macrófagos, células T, fibroblastos, células endoteliales, hepatocitos y células
estromales del bazo y timo (10). Las citocinas realizan gran cantidad de funciones
en la respuesta inmune a patógenos, que involucra el reclutamiento y estimulación
de células efectoras inmunes (10). Algunas citocinas implicadas en la respuesta
inmune frente a patógenos microbianos son:
3.2.1 Interferon gama (IFN-�).
EL IFN� es producido principalmente por células T y células NK activadas por
antígenos, mitógenos ó aloantigenos. Es producida por linfocitos T CD4 y T CD8.
La síntesis de este factor es inducida entre otros por IL-12 y el factor de
crecimiento de fibroblastos (FGF) (11, 12). El IFN� es una proteína dimérica con
sub-unidades de 146 aminoácidos y es glicosilada en dos sitios. Han sido
descritas dos formas de la proteína activa biológicamente de 20 y 25 kDa. Ambas
están glicosiladas en la posición 25. El IFN� puede existir en una forma asociada
con la matriz extracelular. El gen humano del IFN� tiene una longitud aproximada
de 6 kb, contiene 4 exones y se encuentra en el cromosoma 12 q24.1. El IFN�
tiene varios receptores con masas moleculares entre 70 y 160 kDa expresados en
todos los tipos de células humanas excepto en los eritrocitos maduros. El receptor
expresado en monocitos y otras células hematopoyéticas tiene una masa
molecular de 140 kDa. La expresión del receptor del IFN� sobre monocitos de
sangre periférica humana es incrementados significantemente por GM-CSF (11,
12).
IFN� tiene actividad antiviral y antiparasitaria y también puede inhibir la
proliferación de gran cantidad de células normales y transformadas (20). IFN�
sinergiza con TNF-� y TNF-� para inhibir la proliferación de varios tipos celulares.
La principal actividad biológica del IFN� parece ser la de inmunoregulador en
contraste con los otros interferones los cuales son principalmente antivirales (11,
12).
3.2.2 Factor de necrosis tumoral (TNF ó TNF-�/caquexina).
El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-�) es una citocina proinflamatoria
multifuncional que actúa como mediador en la defensa del huésped contra la
infección frente a bacterias gram negativas y frente a otros microorganismos
infecciosos. Es principalmente producida por los macrófagos (13), aunque células
T estimuladas por el antígeno, células NK y mastocitos activados pueden también
secretar esta proteína (14). El TNF-� humano es una proteína no glicosilada de
17 kDa y un tamaño de 157 aminoácidos. TNF-� forma dímeros y trímeros. La
forma de 17 kDa del factor es producida por el procesamiento de una proteína
precursora de 233 aminoácidos. El gen del TNF-� tiene una tamaño
aproximadamente de 3.6 kb y contiene 4 exones. El transcrito primario tiene un
tamaño de 2762 nucleótidos y codifica la proteína precursora. En humanos el gen
se localiza en el cromosoma 6p23-6q12. Aproximadamente 500-10000 receptores
de alta afinidad para TNF-� son expresados en todos los tipos celulares
somáticos con excepción de los eritrocitos (14, 15).
TNF-� tiene funciones autocrinas y paracrinas que son beneficiosas para el
huésped. Estimula a los fagocitos mononucleares y a otros tipos de células a
producir citocinas involucradas en la inducción local de moléculas de adhesión en
las células endoteliales vasculares, lo que resulta en la acumulación de fagocitos
en los lugares de inflamación. También ha sido implicada en la supresión de las
actividades antifagocíticas de Cryptococcus neoformans (16). TNF-� activa a los
linfocitos, polimorfonucleares y macrófagos para que aumenten sus potenciales
antimicrobiales y a que disparen el estallido respiratorio y la vía radicales
dependiente de óxido nítrico (NO). Estimula además, en cooperación con la IL-12
a las células asesinas naturales (NK) para que produzcan IFN-�, el cual juega un
papel importante en los mecanismos de defensa tempranos del huésped contra
patógenos microbianos como Cryptococcus neoformans y en la diferenciación de
células Th1 (17). TNF-� aumenta la expresión de moléculas del complejo mayor
de histocompatibilidad clase I (MHC clase I), potenciando la lisis de las células
infectadas por virus por los linfocitos T citolíticos. La principal función fisiológica de
TNF es estimular el reclutamiento de neutrófilos y monocitos al sitio de la infección
y activar a estas células para erradicar a los microbios (14).
3.2.3 Interleucina - 12 (IL-12).
Es una citocina heterodimérica compuesta de dos cadenas polipeptidicas, la
cadena p35 expresada constitutivamente y una cadena p40 inducible, las cuales
están unidas covalentemente por puentes disulfuro para formar la proteína p70
activa biológicamente (18). La sub-unidad p35 tiene una estructura en dominio
globular de cuatro �- hélices. El componente p40 de la IL-12 es homólogo al del
receptor de la IL-6, que contiene un dominio de Ig y una estructura WSXWS.
Muchas células pueden sintetizar la sub-unidad p35, pero solo las células
presentadoras de antígenos profesionales (APCs) producen el componente p40.
IL-12 es el principal mediador de la respuesta inmune innata temprana a microbios
intracelulares y es un inductor clave de la inmunidad mediada por células en la
respuesta inmune adaptativa. La principal fuente de IL-12 son los fagocitos
mononucleares activados y las células dendríticas (19), aunque las células B
activadas pueden también secretar esta citocina (18).
El receptor para la IL-12 es un heterodímero compuesto de la sub-unidad �1 y �2.
Ambas cadenas son requeridas para la unión de alta afinidad de la citocina, pero
solo la cadena �2 esta involucrada en la señalización. La señalización a través de
este receptor involucra la vía de las proteínas cinasas JAK/STAT (19). Estudios de
unión indican que el verdadero receptor de la IL-12 se expresa en las células T y
NK activadas. La IL-12 estimula la producción de IFN-� en células NK y linfocitos
T, estimula la diferenciación de linfocitos T ayudadores CD4+ a células Th1
productoras de IFN-�. La IL-12 aumenta la función citolítica de células NK y
linfocitos T CD8+ activados (19). De esta manera, la IL-12 es un importante
regulador de la fase efectora de las reacciones inmunitarias mediadas por células
y sirve a esta función activando directamente a algunas células efectoras, y
regulando el desarrollo de otras (20).
3.3. Caracterizacion general de Cryptococcus neoformans.
C. neoformans es una levadura redonda u oval de pared gruesa que puede
presentarse sola o rodeada por una cápsula de polisacáridos. Esta levadura
puede causar micosis sistémica fatal o criptococosis en huéspedes
inmunocomprometidos o que presentan defectos de la inmunidad celular (5, 188).
Recientes estudios in vivo demuestran que C. neoformans es un patógeno
intracelular facultativo que puede sobrevivir dentro de los macrófagos acumulando
el polisacárido intracelular en vesículas citoplasmáticas (28). C. neoformans es de
tamaño variable entre 4 a 20�m; en muy contadas ocasiones produce una
pseudohifa, aunque bastante corta. Las colonias son fácilmente visualizadas por
microscopio de luz con tinción negativa con tinta china (29). La cápsula excluye
físicamente la partícula de tinta formando un halo alrededor de la pared celular
(30). C. neoformans se reproduce asexualmente por gemación y sexualmente
para formar basidiosporas. Las colonias germinan con rapidez en agar glucosado
de Saboureaud a temperatura ambiente o a 37º C, adquiriendo un aspecto liso,
mucoso, brillante, con poca elevación y de color cremoso o ligeramente pardo. El
hongo es un saprofito en la naturaleza, con distribución universal que se puede
encontrar con frecuencia en el suelo, en las excretas de las palomas, así como en
los lugares de nidación de estas aves. Los mayores factores de virulencia de C.
neoformans lo constituyen su elaborada cápsula de polisacáridos, la melanina, el
manitol, y el apareamiento de tipo � (31, 83, 84, 85).
Cryptococcus neoformans ha sido clasificado en serotipos de acuerdo a las
diferencias antigénicas o variaciones de la estructura del Glucuronoxilomanano
(GXM). Sin embargo, estudios serológicos han demostrado que muchos epítopes
antigénicos son compartidos con varias cepas y en consecuencia, han sido
descritos solamente unos pocos serotipos. Además, pueden existir diferencias en
la estructura del polisacárido entre aislados asignados a un serotipo específico
(32).
Se han descrito cuatro tipos serológicos de C. neoformans conocidos como A, B,
C y D, pero debido a que algunas cepas presentan características tanto del
serotipo A como del serotipo D, fue constituído un nuevo serotipo llamado AD
(33). Los Serotipos A, D y AD corresponden a la variedad neoformans el cual tiene
distribución mundial asociado al suelo y a excretas de aves; generalmente es
responsable de criptococosis en individuos inmunocomprometidos
particularmente, pacientes con SIDA. Los serotipos B y C corresponden a la
variedad C. gatti, el cual se encuentra geográficamente restringido a climas
tropicales o subtropicales asociados a árboles de eucalyptus y usualmente causa
infección en individuos inmunocompetentes (29). Recientemente, ha sido
propuesto que el serotipo A constituya una tercera variedad llamada grubii (34).
Los serotipos A y D pueden conjugarse y producir organismos basidiomicetos que
presentan un estado perfecto (sexuado) designado como Filobasidiella
neoformans var. neoformans (30, 35). Los serotipos B y C se clasifican como C.
neoformans var. gatti debido a que las cepas B y C forman un estado perfecto
distinto, designado como Filobasidiella neoformans, var. Bacillispora (36, 37).
3.4 Principales factores de virulencia de C. neoformans.
3.4.1 Cápsula de polisacáridos.
La cubierta de C. neoformans está compuesta de una rígida pared celular
constituida principalmente de glucanos (38); un polisacárido capsular,
glucuronoxilomanano (GXM) y de dos antígenos carbohidratos menores,
galactoxilomanano (GalXM) y manoproteínas (MP) (39, 40)., GalXM y MP
constituyen aproximadamente entre el 10- 12% de la masa capsular. GXM,
GalXM, y MP son aislados del medio de crecimiento por precipitación selectiva con
etanol y con bromuro de hexadeciltrimetilamonio (41). Los tres antígenos son
serológicamente distintos y por lo menos dos de estos componentes, GXM y MP,
tienen efectos separados sobre el sistema inmune. (42).
El tamaño de la cápsula oscila entre �1�m y �50�m dependiendo de la cepa, de
las condiciones ambientales y de crecimiento. Durante la exposición inicial al
microorganismo, la cápsula podría estar ausente o pequeña, pero es rápidamente
sintetizada in vivo (43). La cápsula de polisacáridos está involucrada en
mecanismos que le permiten a la levadura adaptarse a cambios en las
condiciones ambientales. Así, cuando los nutrientes y el agua son escasos, la
síntesis de la cápsula es reprimida. Además, en condiciones áridas, la cápsula
hidrofílica colapsa y protege a la levadura de la deshidratación (44).
Evidencias experimentales indican que la cápsula es un factor de virulencia
importante de C. neoformans. Cepas acapsulares obtenidas naturalmente o por
mutagénesis presentan virulencia reducida, comparada con cepas capsuladas (45,
46, 47, 48). Se han descrito tres genes designados como CAP59 (49), CAP64 (50)
y CAP10 (51) implicados en la formación de la cápsula y un gen relacionado con la
síntesis de manosa denominado MAN1(52). La deleción de alguno de estos genes
resulta en un fenotipo acapsular el cual es avirulento. Cuando un mutante de C.
neoformans deficiente de cápsula es complementado con el gen faltante, la
virulencia se restaura (49,53). En general, C. neoformans se presenta densamente
capsulado cuando se encuentra infectando los tejidos de mamíferos. Sin embargo,
cuando se encuentra en medio de cultivo artificial la densidad de la cápsula es
variable y depende de la cepa (53, 54). Concentraciones fisiológicas del ión
bicarbonato y de dióxido de carbono (CO2) estimula marcadamente la síntesis de
la cápsula (55).
Adicionalmente, han sido postulados una gran cantidad de mecanismos mediante
los cuales la cápsula de C. neoformans ayuda a eludir la defensa del huésped, por
esta razón representa uno de los mayores factores de virulencia de la levadura
con propiedades toleragénicas (56-61). El principal mecanismo mediante el cual la
cápsula le permite a C. neoformans eludir la defensa del huésped, es inhibiendo
la fagocitosis, debido a que presenta una superficie que no puede ser fácilmente
reconocida por los fagocitos (56, 58, 59). En ausencia de opsoninas, la mayoría
de las células fagocíticas no podrían unirse a cepas capsuladas de C. neoformans.
Otros efectos que le han sido atribuidos a la presencia de la cápsula o a
polisacáridos capsulares purificados de C. neoformans incluyen, inhibición de la
migración de neutrófilos (60), inhibición de la respuesta de hipersensibilidad de
tipo retardado (61,62), deregulación de la secreción de citocinas (63,64),
inhibición de la respuesta de células T (65, 66), inhibición de la acumulación de
leucocitos (66), inhibición de la presentación de antígenos (67,68) y supresión de
la respuesta de anticuerpo específica (69).
3.4.1.1 Componentes de la cápsula de Cryptococcus neoformans.
3.4.1.1.1 Glucuronoxilomanano (GXM).
GXM es un polisacárido de elevado peso molecular que compone
aproximadamente el 90% de la cápsula y uno de los principales factores de
virulencia de C. neoformans. Consiste de manosa, xilosa, ácido glucorónico y
grupos O-acetilo (42). GXM ha sido detectado en altos niveles en los fluidos
corporales de pacientes infectados y se piensa que es liberado durante la
replicación de la levadura y luego se deposita en tejidos como el bazo y el hígado
(86). La estructura del GXM consiste de un esqueleto lineal de unidades de
manosa con uniones �- 1,3 con substituciones similares de grupos glucuronilo en
cada serotipo, pero con diferentes substituciones de los residuos xilosa y grado de
O-acetilación de los grupos hidroxilo (31,42,43). Estas variaciones en la estructura
del Glucuronoxilomanano generan distintos patrones de antigenicidad que
permiten tipificar a C. neoformans en los serotipos A, B, C, D, AD.
3.4.1.1.2 Galactoxilomanano (GalXM).
Galactoxilomanano es un polisacárido heterogéneo de aproximadamente 275 kDa,
compuesto de galactosa, glucosa, xilosa y manosa. Es un componente menor que
constituye aproximadamente el 7% del material capsular y al igual que el GXM,
GalXM se encuentra en los fluidos corporales de pacientes infectados (87).
GalXM no se une covalentemente a la pared celular y parece estar asociado con
otros componentes que han sido pobremente caracterizados (88). GalXM es
fácilmente separado de GXM utilizando concavalina A (Con A) sobre una
cromatografía en columna. Han sido aislados y purificados los GalXMs de varios
serotipos de C. neoformans. Los análisis de estos GalXMs indicaron que no hay
una entidad molecular única común para todos los serotipos (89). Los efectos
biológicos del GalXM han sido poco estudiados, pero se conoce que GalXM
presenta propiedades antigénicas y químicas diferentes a las del GXM ( 89,90).
3.4.1.1.3 Manoproteína ( MP).
La manoproteína se encuentra en menor proporción como componente del
material capsular de C. neoformans y desde el punto de vista estructural solo se
ha empezado a caracterizar. La MP puede ser recobrada de los filtrados de cultivo
y detectada después del clivaje de la pared por métodos mecánicos (91). Se han
detectado anticuerpos reactivos para MP en suero humano (91). La MP es el
antígeno responsable de la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) (94). MP
está compuesto principalmente de manosa y en menor proporción galactosa y
xilosa (42) . Algunos residuos de manosa son reactivos con concanavalina A. Esta
afinidad ha sido utilizada para separar MP de GXM y GalXM (43). El estudio
químico de preparaciones de polisacáridos por cromatografía en columna
utilizando Con A reveló que la fracción que corresponde a MP es la más activa
serológicamente y que los aminoácidos predominantes en esta fracción con 21%
de proteínas eran serina, treonina y alanina. La naturaleza de la unión entre
carbohidratos y proteínas no ha sido determinada. (91).
MP difunde lentamente a través de la densa capa interna de la pared, pero migra
más rápidamente en la porción exterior menos densa. Esta particularidad es
compatible con la observación por microscopia electrónica de que hay una
distribución asimétrica de MP en la pared celular (91). MP es considerado un
antígeno inmunopotenciador involucrado en la inducción de la respuesta inmune
mediada por células (16, 93, 94). También promueve la activación de las células T
(94) y la inducción de la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-�) en
monocitos (92). Recientemente, también fue demostrado que MP induce una
fuerte y temprana producción de IL-12 en monocitos humanos (93).
3.4.2. Melanina.
En 1962, Staib observó la formación de un pigmento café en cultivos de C.
neoformans sobre un medio que contenía extracto de Guizotia abyssinica (71).
Estudios posteriores demostraron que este pigmento se debía a la deposición de
melanina en la pared celular de este hongo (70). La síntesis de melanina es
catalizada por una feniloxidasa unida a la membrana sobre un sustrato específico
para componentes fenólicos que contienen grupos hidroxilos y grupos aminos
como la dihidroxifenilalanina (DOPA) (72,73). C. neoformans no posee las
tirosinasas necesarias para la producción endógena de dihidrofenoles; por esta
razón, la producción de melanina se hace a partir de compuestos difenólicos que
la levadura toma del medio. Esta característica de C. neoformans de producir
melanina fue originalmente descrita como la base de pruebas diagnósticas para
diferenciar C. neoformans de otras levaduras (5, 70, 71, 72). Actualmente, la
síntesis de melanina es considerada como un factor de virulencia importante de C.
neoformans. La importancia de la producción de melanina en la virulencia de C.
neoformans fue reportartada en mutantes de C. neoformans carentes de melanina
las cuales fueron menos virulentas en ratones que cepas productoras de
melanina.
La melanina es un recolector de intermediarios de oxigeno reactivo, como el anión
superóxido y otros radicales libres (76). C. neoformans melanizado es menos
susceptible que C. neoformans no melanizado a oxidantes antimicrobiales
producidos por fagocitos estimulados (77). De esta manera, un mecanismo por el
cual la melanina podría actuar como un factor de virulencia es haciendo a la
levadura resistente relativamente al ataque de los leucocitos. Esta hipótesis fue
apoyada por la evidencia de que C. neoformans melanizado es más resistente a
la fagocitosis mediada por anticuerpos y al efecto antifúngico de macrófagos
murinos que los organismos no melanizados (77). Otra evidencia a este hecho, es
que cepas de C. neoformans altamente productoras de melanina generan en el
huésped un decrecimiento de la linfoproliferación y de la producción de TNF-�,
comparada con cepas que producen pequeñas cantidades de melanina (78). Otra
característica que presentan las cepas productoras de melanina es que son más
resistentes a la anfotericina B, afectando así, la eficacia de los tratamientos en
individuos inmunodeficientes.
3.4.3. Manitol.
Cryptococcus. neoformans produce y secreta manitol (hexitol D-manitol) in vitro y
en animales de experimentación con cryptococcosis (79,80). EL manitol es un
recolector del radical hidroxilo, que es un intermediario de oxigeno reactivo
generado por los neutrófilos en el curso del estallido respiratorio (81). El manitol
puede actuar como un factor de virulencia protegiendo al hongo de los radicales
hidroxilos generados durante la respuesta inmune del huésped (82), por esta
razón, la producción de manitol por C. neoformans ha sido correlacionada con un
incremento en la resistencia al estrés por calor, estrés osmótico, y con la
resistencia a daños ocasionados por intermediarios de oxígeno reactivo,
contribuyendo de esta manera a la patogenicidad de este agente fúngico (82).
3.5 Acción patógena de C. neoformans.
C. neoformans es un patógeno oportunista cuya vía de entrada es el tracto
respiratorio, infecta principalmente a pacientes inmunocomprometidos incluyendo
el 6 al 8% de pacientes con VIH/SIDA, pacientes con linfocitopenia linforeticular
maligna e idiopática, (95) con fallas renales crónicas, órganos transplantados (96)
y bajo terapias con corticoesteroides (95). La criptococosis se adquiere por
inhalación de basidiosporas o de la levadura desecada. Se disemina del pulmón al
sistema nervioso central, ocasionando meningoencefalitis (97). C. neoformans no
elabora ninguna toxina, por lo tanto, el tejido infectado se encuentra solo alterado
por la multiplicación del organismo. Cuando la infección se encuentra avanzada,
se incrementa la necrosis y la disfunción orgánica. Algunas veces, los pacientes
pueden presentar lesiones cutáneas aisladas o múltiples, en la cara o cuero
cabelludo, generalmente indoloras. La diseminación de las infecciones
criptococales son la principal causa de micosis fatales en pacientes con SIDA,
debido a que esta infección es difícil de erradicar con terapias antifúngicas y a
menudo requiere de un tratamiento largo y exhaustivo para reducir la carga
antigénica (5). La morbilidad, mortalidad y tasas de incidencia son bastante altas,
lo que sugiere que las terapias no son completamente efectivas (5). Los
sobrevivientes pueden padecer de pérdida visual, parálisis del nervio craneal y
demencia (98). La criptococosis pulmonar puede ser asintomática o producir solo
expectoración, que puede ser sanguinolenta; puede progresar o permanecer
estable durante periodos prolongados (35).
3.6 Respuesta inmune a C. neoformans.
La baja frecuencia de infecciones criptococales sintomáticas a pesar de la alta
frecuencia de exposición al patógeno, sugiere que las barreras físicas y la
inmunidad no específica proporcionan una adecuada defensa para proteger al
huésped contra la infección. Por lo tanto los huéspedes mamíferos son
inicialmente protegidos de Cryptococcus neoformans por una combinación de
barreras físicas, condiciones desfavorables para el crecimiento del hongo, y una
multitud de células efectoras capaces de eliminar o inhibir el crecimiento de este
patógeno. Todos estos mecanismos constituyen la primera línea de defensa
natural del huésped (35, 141).
Ha sido demostrado que cuando Cryptococcus neoformans logra establecerse
exitosamente en los tejidos del huésped, se requiere de una interacción entre la
inmunidad innata y la adquirida para el control de la infección y la eliminación del
hongo (98, 99). Uno de los primeros mecanismos de defensa que se induce es la
respuesta inflamatoria granulomatosa (98) la cual necesita de la participación de
la inmunidad mediada por células, fundamental para la protección contra la
criptococosis (61); sin embargo, existe gran cantidad de evidencias que
demuestran que tanto los mecanismos inmunes mediados por células así como
los mediados por anticuerpos pueden tener profundos efectos sobre la infección
criptococal. Además, ambos mecanismos cooperan en la resolución de la
infección y cada arma inmune es más efectiva en la presencia de la otra (103 ).
3.7.1. Defensa celular no específica contra C. neoformans.
3.7.1.1 Polimorfonucleares.
Las células polimorfonucleares (PMN), o neutrófilos son componentes efectores
del sistema de defensa inmune natural contra C. neoformans. Los PMN pueden
eliminar eficientemente a algunas cepas de C. neoformans por procesos de
fagocitosis (111) y a través de mecanismos oxidativos y no oxidativos. Los
mecanismos oxidativos lo constituyen la generación del H2O2, e intermediarios del
oxigeno reactivo, como el radical hidróxilo entre otros (81).
Los mecanismos no oxidativos están asociados a fracciones de gránulos de los
PMN que contienen múltiples componentes como las proteínas catiónicas,
peptidos antimicrobianos y calprotectinas que pueden eliminar o inhibir a C.
neoformans (81). Ademas, los PMN pueden secretar factores solubles en
respuesta a la levadura o a su polisacárido capsular como las citocinas IL-1, TNF-
� y IL-8 (112). También, mediante la activación de la vía alterna del complemento
por C. neoformans se generan las fracciones C3a y C5a las cuales son
responsables de la liberación de citocinas inducida por PMN (115). Los PMN son
más efectivos para eliminar cepas de C. neoformans con cápsulas pequeñas o
ausentes que cepas con cápsulas, debido a la dificultad que presentan los PMN
para ingerir cepas capsuladas en ausencia de opsoninas como el complemento o
de anticuerpos unidos a la cápsula (113, 114).
Estudios del grupo de Murphy demostraron actividad quimiotáctica para el GXM en
presencia o ausencia de suero (116). Sin embargo, no es clara la manera como
contribuye este efecto en la inflamación in vivo. En realidad, recientes datos
indican que el GXM induce la pérdida de la L-selectina en la superficie de los
neutrófilos. Debido a que la L-selectina es una molécula que transporta a los
neutrófilos dentro de los tejidos, la regulación negativa de esta molécula en la
superficie de los neutrófilos podría evitar su migración al sitio de infección (60). La
inhibición de la infiltración de leucocitos a los sitios de inflamación podría ser
también el resultado de la unión del GXM a CD18 (LFA-1) sobre los PMN,
bloqueando de esta manera la interacción de CD18 con su ligando (ICAM-1) sobre
el endotelio (116).
3.7.1.2 Monocitos / Macrófagos.
Los macrófagos juegan un papel crítico en la defensa del huésped contra C.
neoformans. Los monocitos y los macrófagos pueden ingerir la levadura y matarla,
además de que pueden regular la respuesta de las células T a través de
actividades accesorias y secretoras. La incapacidad de los macrófagos para matar
al hongo podría estar asociada con la persistencia y latencia de la infección (101).
Existen pruebas de que el GXM inhibe la fagocitosis y de que el complemento y la
opsonización anticuerpo específica juega un papel importante en facilitar el
proceso (102). Además, los macrófagos no necesariamente matan a la levadura
capsulada después de ingerirla, de hecho el hongo puede residir y sobrevivir en el
fagolisosoma ácido (104).
El papel del GXM, en la supresión de la fagocitosis y muerte de C. neoformans es
minimizado cuando los macrófagos son activados con IFN-�, resultando en una
actividad funguicida extracelular en ausencia de opsoninas o de anticuerpos (105).
Además de interferir con la internalización de C. neoformans por macrófagos, se
cree que el material capsular también regula la actividad secretora de las células
presentadoras de antígenos (APCs). Esta función no ha sido extensamente
investigada pero existen algunas evidencias de la regulación del GXM en la
secreción de citocinas y coestimulación durante el proceso de presentación
antigénica (67). Recientemente, ha sido demostrada la existencia de un complejo
receptor llamado CD14/TLR4 expresado sobre células fagocíticas, específico para
GXM (8). Aunque se desconoce como intervienen estos receptores en la ingestión
de C. neoformans por macrófagos, ha sido descrito como participan en la
regulación de la secreción de citocinas por células fagocíticas (8).
Igualmente ha sido demostrado que la cápsula de polisacáridos de C. neoformans
regula la expresión de la molécula B7.1 (CD80) sobre las APCs y que tiene un
efecto supresor en la expresión de la molécula MHC de clase II y de la molécula
B7.1 (106,107). En particular, GXM regula negativamente la expresión de
moléculas de MHC clase II (61) y regula positivamente la expresión de la molécula
CD40 sobre los monocitos (108,109). De esta manera, el GXM puede influir en el
tipo de respuesta inmune a través de sus efectos sobre el crecimiento y
diferenciación de las células T (110).
3.7.1.3 Células NK.
Diversas investigaciones han proporcionado evidencias de que las células NK
están involucradas en la protección contra C. neoformans. La eliminación de
células NK utilizando anticuerpos anti- células NK en ratones, puede alterar el
curso de la infección con C. neoformans resultando consecuentemente en un
incremento de la carga fúngica en el pulmón (117), sin tener efecto sobre las
unidades formadoras de colonias en otros órganos o sobre la tasa de
supervivencia de los ratones (118). Murphy y colaboradores caracterizaron la
interacción entre las células NK y C. neoformans. Demostraron que las células NK
de preparaciones de linfocitos esplénicos murinos tienen actividad lítica directa
contra la levadura (119, 120, 121). Los gránulos de las células NK contienen
citolisina que puede resultar mortal para la levadura. Además, las células NK
secretan una variedad de citocinas, que pueden contribuir a la protección contra C.
neoformans activando a células efectoras y promoviendo respuestas inflamatorias
efectivas (122).
Se ha comprobado que la interacción de las células NK humanas con el hongo
lleva a una disminución de la producción de citocinas como TNF� y GM-CSF
(123) pero estimula la inducción de INF-� (124), el cual ha sido implicado como
uno de los factores que inducen protección (125-127). Igualmente, se ha
demostrado que la activación de células NKT (V�14+) pre-estimuladas con un
antígeno timo independiente producen INF-� el cual inhibe el crecimiento del C.
neoformans in vivo (127). Además se ha determinado la contribución de la IL-18
en la resistencia a la infección con C. neoformans en ratones con una defectuosa
síntesis de IL-12 a través de la inducción de la producción de INF-� por las células
NK (126).
Otras investigaciones han documentado sobre como la actividad anticríptococal de
las células NK se observa marcadamente deteriorada en pacientes con SIDA
(128). Estos investigadores encontraron que la actividad de las células NK puede
ser restaurada adicionando IL-12 exógena, indicando que el defecto es reversible.
Estas observaciones sugieren que la deficiencia de células NK funcionales en
pacientes con SIDA contribuye a la susceptibilidad de estos individuos a la
infección por C. neoformans (128)
3.7.1.4 Sistema del complemento.
C. neoformans no capsulado activa el sistema del complemento tanto por la vía
clásica como por la vía alterna (135). La activación de la vía clásica se caracteriza
por la deposición de fragmentos C3b sobre la superficie celular (129),
posiblemente debido a la presencia de anticuerpos reactivos con glicanos en
suero humano normal unidos a la superficie de la levadura (130, 134).
Contrariamente, cepas capsuladas de C. neoformans no son capaces de activar la
vía clásica del complemento. Esto puede resultar de la ausencia de anticuerpos
específicos a GXM en suero humano normal o a su incapacidad para iniciar la
activación de la vía clásica del complemento (131). Sin embargo, tanto cepas
capsuladas como no capsuladas son capaces de iniciar la activación de la vía
alterna del complemento con un limitado número de sitios para la deposición de
C3b sobre la pared celular o sobre cápsula respectivamente.
A pesar de que Cryptococcus capsulado puede activar el sistema del
complemento (132), el GXM purificado es relativamente pobre en esta capacidad
(133). GXM libre puede tener propiedades biológicas diferentes que el GXM
ensamblado dentro de la estructura capsular (110). De otro lado, células efectoras
naturales, incluyendo los monocitos presentan receptores CR1, CR3, y CR4 para
el complemento. Cuando estos receptores son bloqueados, hay una disminución
significativa de la unión de C. neoformans opsonizado a los monocitos. La
expresión de receptores CR3 es regulada por citocinas como el factor de necrosis
tumoral alfa (TNF-�) y por el factor estimulante de colonias granulocito-macrófago
lo que incrementa eficientemente la ingestión de C. neoformans opsonizado (136).
3.7.2 Defensa humoral específica contra C. neoformans.
3.7.2.1 Anticuerpos.
El papel de los anticuerpos contra GXM ha sido extensamente estudiado en
cryptococcosis experimental y su efecto benéfico ha sido claramente demostrado.
Estos anticuerpos prolongan la supervivencia, reducen la carga del hongo en los
tejidos y aumentan la eficacia terapéutica de agentes antifúngicos convencionales
(137,138). Los anticuerpos contra GXM son importantes factores opsónicos que
están presentes en el suero tanto de individuos VIH positivos como de VIH
negativos (150).
La eficacia protectora de los anticuerpos contra GXM puede favorecer algunas
funciones celulares como la promoción de la formación de granuloma (140), la
fagocitosis (141-144), la activación del complemento (145) y el incremento de la
respuesta inmune celular. Esta última, es probablemente el resultado de la
interacción compleja de anticuerpos monoclonales contra GXM con células
fagocíticas, que resulta en la inducción de la síntesis de citocinas proinflamatorias
(144) y en la modulación del papel de las células presentadoras de antígenos
(APC). Adicionalmente, una regulación positiva por anticuerpos monoclonales anti-
GXM afecta una variedad de funciones de las APC tales como la expresión de
moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHCII), la expresión
de la molécula B7 y la producción de IL-12 (106). De esta manera, los anticuerpos
monoclonales contra GXM podrían tener efectos benéficos como recolectores de
GXM, inhibiendo de este modo sus efectos deletéreos y ayudando a incrementar
la respuesta inmune celular (144).
La combinación de estos efectos podría ser crucial en la inducción de la
activación óptima de las células T y en la generación de una respuesta protectora
Th1. En efecto, ha sido observado un aumento en la proliferación de las células T
en presencia de anticuerpos monoclonales anti-GXM al igual que un incremento
en la producción de IL-2 y de IFN-� (144).
Es posible que anticuerpos monoclonales contra GXM estimulen una regulación
positiva de la respuesta de células T a C. neoformans, a través de la modulación
de la función de las APC. El efecto sobre las células T parece ser crucial para la
protección, ya que se observó en modelos experimentales, que el efecto protector
de anticuerpos monoclonales contra GXM se perdía en ratones deficientes de
células T CD4 (145). Además, se ha demostrado que la administración pasiva de
anticuerpos monoclonales contra GXM promueve eficientemente la eliminación
parcial del GXM de la circulación y del GXM que se encuentra asociado a los
tejidos del huésped infectado. En consecuencia, los anticuerpos monoclonales
contra GXM podrían ser efectivos para eliminar muchos de efectos
inmunosupresores generados por este polisacárido sobre las células inmunes,
como la inhibición de la activación de las células T (65, 66), inhibición de la
secreción de las citocinas proinflamatorias (63, 64), incremento de factores
inhibitorios (25, 182, 183, 185), regulación negativa de las APC (67, 68) y
posiblemente podría ser efectivo para la eliminación de la inhibición del IFN� y de
la inducción de IL-4 (108). Sin embargo, es factible que bajo algunas
circunstancias la unión de anticuerpos a GXM podría formar complejos antígeno-
anticuerpo los cuales son deletéreos para el huésped, Savoy et al. (200)
reportaron que la administración de anticuerpos (Ig)G1 a ratones infectados
crónicamente, podría resultar en una citotoxicidad letal aguda (200). Este
fenómeno está relacionado al isotipo del anticuerpo y parece que es ocasionado
por la toxicidad del factor activador de plaquetas liberado como consecuencia del
entrecruzamiento del receptor Fc por el complejo antígeno-anticuerpo (201, 202).
De otro lado, estudios realizados utilizando el modelo de cryptococosis
experimental en ratones han demostrado que el isotipo del anticuerpo contra GXM
o contra el polisacárido capsular se correlaciona con la protección. La
transferencia pasiva de un monoclonal IgG1 o IgM anti-GXM protege a ratones
infectados (146), mientras que anticuerpos contra el polisacárido capsular de
isotipo IgG3 no son protectores (147). Sin embargo, si se induce cambio de isotipo
a IgG1 estos inducen protección e impiden la diseminación cerebral de C.
neoformans (148). Anticuerpos monoclonales IgG2a e IgG2b anti GXM también
prolongan la vida de ratones pero son menos efectivos que el IgG1 (148). Se
demostró que la acción protectora de estos anticuerpos IgG1 se debe a su
capacidad de unirse a receptores específicos de la región Fc mejorando el
proceso de fagocitosis (147).
En un estudio reciente in vivo con ratones infectados se demostró que cepas
resistentes a la infección CBA/J y BALB/C) producen niveles más elevados de
anticuerpos IgG1 anti GXM que las cepas susceptibles (C57BL/ 6) (203). En otros
estudios se ha determinado que en humanos la respuesta a GXM está sesgada
por el isotipo IgG2 tanto en individuos VIH positivos como en individuos VIH
negativos (149).
En conclusión, la actividad protectora de anticuerpos monoclonales contra GXM es
el resultado de múltiples efectos que conllevan a la eliminación parcial del GXM, a
la inhibición de su efecto inmunosupresor asociado, y a la regulación positiva de
gran cantidad de funciones inmunes celulares (110).
3.7.3 Defensa celular específica contra C. neoformans.
La importancia de la inmunidad mediada por células y en particular, la importancia
de las células T en la protección contra la infección por C. neoformans ha sido
establecida en diversos estudios animales. Los primeros experimentos que
mostraron la importancia del papel de la respuesta celular mediada por linfocitos
en la protección a C. neoformans provienen de los estudios realizados en ratones
atímicos (150,151). La posibilidad de eliminar poblaciones específicas de linfocitos
T permitió demostrar que tanto las poblaciones de linfocitos T CD4+ (152) como
las de linfocitos T CD8+ son requeridas para el control de la infección (153,154).
Estudios experimentales utilizando ratones inmunizados con el polisacárido
capsular demuestran que hay actividad linfocítica directa contra el hongo (155). En
humanos, expuestos y no expuestos a C. neoformans los linfocitos presentaron
proliferación in vitro en respuesta al hongo completo (156,157).
En estudios in vitro utilizando células humanas se demostró la existencia de
mecanismos de cooperación entre la inmunidad innata y adquirida (158). Células
linfoides de CMSP humanas in vitro mostraron interacción directa con el hongo
(159, 160), y una inhibición del crecimiento del mismo (160). Además, CMSP
estimuladas con IL-2 mostraron una alta actividad antifúngica (162,163). Tanto los
linfocitos T como los linfocitos NK en donde la IL-2 se comporta como el principal
factor de crecimiento y diferenciación, fueron postuladas como las células
participantes en la inhibición del crecimiento del hongo (162,163). Sin embargo, se
demostró purificando ambos grupos celulares que la mayor parte de la inhibición
se debía a la fracción de linfocitos T, aunque las células NK también presentaron
inhibición pero menos marcada; en estos estudios ni los sobrenadantes de cultivo,
ni lisados de linfocitos mostraron la actividad antifúngica (164,165). Se demostró
que la interacción directa del hongo con linfocitos T y NK llevan a la producción de
IFN-� y se postuló a esta citocina como una de las moléculas efectoras (124).
Ambas subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ son igualmente activadas por
el hongo (153,166).
3.8 Producción de citocinas en respuesta a C. neoformans.
Ha sido demostrado que muchas citocinas tienen un importante papel en la
defensa del huésped contra C. neoformans. La importancia de las citocinas
individuales en la protección contra esta levadura ha sido establecida
principalmente en ratones, y la mayoría de los estudios acerca de la función de las
citocinas en humanos han sido realizados in vitro.
3.8.1 Respuesta de Citocinas a C. neoformans en ratones.
Estudios realizados por Buchanan y Murphy (167,168) en ratones detectaron la
presencia de IFN-�, IL-2, y IL-5 en grandes concentraciones, sugiriendo que estas
citocinas contribuyen de manera importante a las reacciones de hipersensibilidad
de tipo retardado (DTH) que se encuentran en los tejidos (167,168). La función de
IL-5 en la respuesta murina a estos antígenos no es clara (168). IL-5 ha sido
asociada con neumonía eosinofilica en ratones C57BL/6 originada de la infección
intratraqueal con C. neoformans (169).
En el tejido pulmonar la expresión del patrón de citocinas en respuesta a C.
neoformans es algo diferente. Análisis de la expresión de citocinas asociadas a
TH1 y a TH2 en los pulmones de ratones BALB/c infectados intratraquealmente,
reveló una más fuerte y temprana expresión de citocinas asociadas a TH2 y al
factor de crecimiento transformante � (TGF-�) en estadios tempranos de la
infección, con poca o ninguna expresión de citocinas asociadas a TH1 como IL-2
e IFN-� (170).
La admistración exógena de IL-12 protegió a los ratones de la infección en el
modelo pulmonar en ratón (171). La IL-12 estimula la producción de IFN-� por las
células NK y facilita el desarrollo de linfocitos TH1, los cuales a su vez producen
más IFN-� y IL-2 (171). De esta manera, IL-12 está asociado con una respuesta
inflamatoria más fuerte que reduce la carga fúngica en los pulmones (172). El
tratamiento de ratones con IL-12 después de la infección intravenosa reduce el
número de levaduras en el tejido cerebral, pero no en el tejido del bazo y del tejido
pulmonar (172). Además, la IL-12 parece ser esencial para el desarrollo de una
respuesta inflamatoria efectiva en el pulmón (172).
Sin embargo, ratones deficientes de IL-12 pueden continuar presentado
resistencia a la infección. Esta resistencia parece estar dada por la producción de
IL-18 (127), IL-18 aplicada en ratones protege de la infección y este mecanismos
parece ser dependiente de la inducción de IFN-� (173, 126). Ambas citocinas IL-
12 e IL-18 actúan de forma sinérgica para eliminar la infección (174,175). Se
postuló entonces un mecanismo basado en la interacción del hongo con los
linfocitos T y NK los cuales inducen la producción de IFN-� que a su vez activa los
macrófagos mejorando su actividad antifúngica (176). Los linfocitos estimulados
con IL-12 e IL-18 producen citocinas que potencian la actividad el macrófago
(176). El IFN-� es una citocina proinflamatoria que tiene múltiples efectos sobre
las células inmunes del huésped. El IFN-� incrementa la actividad de los
macrófagos murinos contra C. neoformans in vitro (176) y puede activar a los
macrófagos alveolares para la actividad anticriptococal in vivo (126). El IFN-�
estimula a los macrófagos murinos para que produzcan óxido nítrico sintetasa, el
cual puede generar óxido nítrico (NO) que se asocia con el control de la infección
a nivel pulmonar (176). El IFN-� también podría tener un importante papel en el
incremento de la eficacia terapéutica de la anfotericina B, la cual aumenta la
producción de óxido nítrico por macrófagos murinos activados con IFN-� (204).
El IFN-� parece ser necesario para el efecto mediado por anticuerpos contra la
infección por C. neoformans. Los anticuerpos protectores no median protección en
ratones deficientes de células T, pero la administración de IFN-� restaura su
eficacia. Esta observación indica que el IFN-� es una citocina crítica en la
modulación del efecto tanto de la respuesta inmune humoral como celular contra
C. neoformans (173).
El papel del TNF-� en experimentos realizados en ratones ha mostrado resultados
menos claros; sin embargo, se ha demostrado que esta citocina pro-inflamatoria
producida por monocitos/macrófagos es importante como una señal celular para
coordinar la respuesta inflamatoria y estimular a las células fagocíticas para la
acción antifúngica. La neutralización de esta citocina con anticuerpos anti-TNF-�,
puede incrementar la infección en algunas cepas de ratón (177). La administración
de TNF-� a ratones con infección criptococal letal puede prolongar la sobrevida
(17). El TNF-� puede actuar sinérgicamente con el factor estimulante de colonias
granulocito-macrófago (GM-CSF) para activar la fagocitosis de C. neoformans
mediada por células. Cepas acapsulares de C. neoformans son más rápidamente
fagocitadas a través de receptores manosa y �-glucano sobre macrófagos
murinos estimulados con TNF-� y GM-CSF(205). Esta observación puede ser
relevante para la patogénesis criptococal ya que las cepas de C. neoformans en el
medio ambiente son a menudo pobremente encapsuladas (205). Esto sugiere por
consiguiente, que la interacción inicial hongo-puésped involucra células
criptococales pobremente capsuladas y macrófagos alveolares, y que la
producción de cepas altamente capsuladas se da luego del etablecimiento de la
infección (205).
Otros estudios han reportado igualmente, que TNF-� puede proteger a ratones de
infeccione cerebrales (178). Células de ratones infectados que no producen o
producen bajos niveles de TNF-�, pueden restablecer la secreción de esta
citocina por la aplicación de IL-12 (171). Esta citocina parece actuar mas en la
fase inicial de la respuesta inmune. Recientemente se pudo establecer que la
secreción de esta citocina en respuesta a C. neoformans puede también estar
controlada a nivel del complejo de receptores CD14/TLR4 expresado en la
superficie de células fagocíticas (8).
3.8.2 Respuesta de Citocinas a C. neoformans en humanos.
Varias investigaciones in vitro han sido realizadas con células de humanos para
tratar de definir los patrones de citocinas secretadas en respuesta a C.
neoformans. Estos estudios han sido efectuados utilizando la levadura completa,
la cápsula de polisacáridos ó el GXM purificado e inclusive con la manoproteína.
La incubación de células mononucleares de sangre periférica humana (CMSPH)
con Criptococcus muertos por calor, estimula a estas células a eliminar los
subsecuentes inóculos de la levadura viva (161). Un estudio posterior reveló que
la incubación de CMSPH o macrófagos broncoalveolares con C. neoformans
muertos por calor estimuló la producción de TNF-�, implicando a esta citocina en
dicho efecto (63). Sin embargo el papel exacto de TNF-� en la estimulación de la
actividad antifúngica de células efectoras no es claro: La incubación de CMSPH
con TNF-� no incrementó sus propiedades antifúngicas, pero la producción de
TNF-� podría ser un evento crucial en el reclutamiento de células inflamatorias al
foco de infección. La observación de que C. neoformans induce la producción de
TNF-� por leucocitos podría tener un paralelo in vivo: pacientes con meningitis
criptococal asociada a SIDA presentaron altos niveles de TNF-� en el fluido
cerebroespinal. Dado que el TNF-� induce la replicación del virus del SIDA en
células infectadas, es posible que la infección concurrente del virus del SIDA y C.
neoformans pueda acelerar la progresión del SIDA a través del efecto del TNF-�
(63).
Igualmente, se ha demostrado que CMSP humanas estimuladas C. neoformans
con cápsulas pequeñas producen TNF-� especialmente por los monocitos, en
presencia de complemento (16). Se determinó entonces cual de los componentes
de la cápsula inducía la secreción de TNF-� y cuales eran los factores que
participaban en este fenómeno (16, 92, 179). Inicialmente se evaluaron
componentes como el GXM, el GalXM y las manoproteínas (MP1 y MP2). De
manera interesante, se encontró que la inactivación del complemento en el suero
inhibía la secreción TNF-� al ser estimuladas con GXM, la secreción de TNF-�
era restaurada por la adicción de suero humano normal. GalXM y las
manoproteínas inducían la secreción de TNF-� que no dependía del complemento
(16, 179). Sin embargo, la secreción de la citocinas en células estimuladas con
manoproteínas dependieron de otros factores distintos al complemento y a los
anticuerpos séricos, además fue bloqueada por la presencia de anticuerpos anti-
CD14 (17). Este factor fue identificado como la proteína de unión a manosa (MBP)
que media la unión especialmente de MP2 al receptor CD14 en los monocitos
(92).
Las CMSP humana producen IL-12 en respuesta a C. neoformans (180). Las
CMSPH de individuos VIH positivos producen significativamente menos cantidad
de IL-12 que los individuos VIH negativos, sugiriendo que la infección por el VIH
produce defectos en la expresión de IL-12 (180). La actividad anticriptococal de las
células NK de pacientes con infección por el VIH puede ser restaurada in vitro por
la adición de IL-12 (180). La deficiencia en IL-12 puede ser responsable de la
disminución de la actividad de las células NK contra C. neoformans en pacientes
con infección por VIH (180).
Adicionalmente, ha sido demostrado que las glicoproteínas del VIH, especialmente
la gp120, pueden alterar el patrón de citocinas secretadas por los monocitos en
respuesta a GXM, induciendo IL-10 y disminuyendo la secreción de IL-12 (180).
Estudios con individuos VIH positivos han demostrado que la alteración en la
secreción de IL-12 en presencia de C. neoformans se restaura en con tratamiento
anti-retroviral (181). Como ha sido demostrado, el balance de alguna de estas
citocinas puede sesgar la respuesta hacia Th1 en caso de la IL-12, mientras que la
IL-10 desfavorece la diferenciación de los linfocitos y funciones efectoras de los
monocitos en respuesta a la estimulación con C. neoformans (183). C. neoformans
encapsulado o el GXM inducen la producción de IL-10 por parte de los monocitos
(182) y disminuye la secreción de IL-12, mientras que C. neoformans sin cápsula
induce la producción de IL-12 (183). La presencia de IL-10 a su vez disminuye la
secreción de IFN-� por parte de linfocitos T, además la disminución de la
expresión de moléculas de co-estimuladoras como CD80 (B7.1). El bloqueo de la
IL-10 por medio de anticuerpos induce a) la liberación de IL-12 por los monocitos,
b) la secreción de IFN-� por parte de los linfocitos T, c) mejora la muerte del
hongo por parte de los monocitos. Los monocitos también producen IL-6 en
respuesta a la cápsula (184).
Como se mencionó previamente el IFN-� es un importante factor de protección
frente al hongo, esta citocina al igual que en células de ratones puede ser inducida
de forma directa por los linfocitos humanos al ser activados por el hongo (173).
En general, los diferentes estudios han demostrado que tanto la respuesta
inmune humoral así como la respuesta inmune celular, son importantes en el
control de la infección por Cryptococcus neoformans y que cada mecanismo es
más efectivo en presencia del otro (103, 138).
4. MATERIALES Y METODOS.
4.1 Tipo de estudio.
El presente estudio es de tipo descriptivo y analítico.
4.2 Cultivo de C. neoformans.
C. neoformans serotipo A cepa ATCC 90113 donada por el Instituto Nacional de
Salud (INS) fue cultivada y mantenida durante el tiempo de la investigación con
subcultivos semanales en agar glucosado Sabouraud. Para la activación de la
cápsula se subcultivó la levadura en caldo Sabouraud y se dejó en agitación a 150
r.p.m a 37°C durante 48 horas (41).
4.3 Obtención del Polisacárido capsular y purificación del GXM.
El polisacárido capsular de C. neoformans ( PsC) fue purificado en el laboratorio
de Inmunobiología de la Pontificia Universidad Javeriana por la técnica descrita
por Cherniak (41). Básicamente, el cultivo fue inactivado por calor en autoclave a
121ºC. Posteriormente, fue centrifugado y recuperado el sobrenadante que
contenía el PsC total. El polisacárido fué purificado mediante precipitación con
carbonato de calcio al 5% y etanol al 95%. El precipitado fue separado por
centrifugación a 16000 g durante 4 horas, desecado y almacenado a 4ºC. Para
determinar la presencia de carbohidratos fue utilizada la técnica descrita por
Dubois (218).
Finalmente, el PsC fue diluido en NaCl 0.2 M. Esta solución fue tratada con
ultrasonido por 15 minutos. Luego se adicionaron 3.0 mg de bromuro de
hexadeciltrimetilamonio (CTAB) por cada miligramo de PsC. La precipitación del
GXM fue realizada adicionando CTAB al 0.05% y centrifugando a 12.000 g a 23ºC
durante una hora. El precipitado fue lavado con etanol al 10% y diluido en NaCl
1M. El GXM fue dializado, secado y guardado a 4ºC (41). Para determinar
contaminación con lipopolisacáridos en el GXM purificado fue aplicada la técnica
de Limulus, realizada en el CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS (CIB)
en Medellín. La determinación de LPS por la prueba de Limulus no presentó
reactividad con una sensibilidad 0.25 �g/ml (218).
4.4 Determinación de proteínas en el GXM.
Para determinar la presencia de proteínas en el extracto de polisacárido capsular
de C. neoformans (GXM), se realizaron varias electroforesis de proteínas con
dodecil sulfato sódico sobre gel de poliacrilamida al 12% (SDS-PAGE) en
condiciones denaturantes. La presencia de proteínas se comparó utilizando GXM
purificado y extracto crudo de levadura obtenido mediante disgregación manual y
congelación-descongelación en nitrógeno líquido.
4.5 Obtención de células mononucleares de sangre periférica (CMSP).
Las células se obtuvieron a partir de sangre periférica humana por venopunción de
5 voluntarios sanos. La sangre fue anticoagulada con heparina y las células
mononucleares de sangre periférica fueron obtenidas utilizando la técnica de
gradientes de densidad con Fycoll-Hipaque (Gibco BRL). Las células se cultivaron
en RPMI-1640 completo suplementado con L-glutamina 2 mM,
penicilina/estreptomicina 100 U/mL (GIBCO BRL), suplementado al 10% con
suero fetal bovino SFB (GIBCO), en placas de cultivo de 24 pozos a una
concentración de 2x 106 células/ml. Cada donante fue un experimento
independiente. La viabilidad celular de las CMSP fue realizada mediante exclusión
con azul tripano.
4.6 Evaluación del efecto de sobrenadantes de cultivos celulares sobre el
crecimiento de C. neoformans.
4.6.1 Obtención de sobrenadantes.
Se separaron células mononucleares humanas de un donante sano por gradiente
de Fycoll-Hipaque (Gibco BRL), y se ajustaron a una concentración 1x 106 células
en frascos de cultivo T25 a un volumen final de 4ml. Posteriormente, las células
se estimularon con GXM a 10 �g/ml , esta dosis se encuentra dentro del rango de
concentraciòn de GXM observado clínicamente en suero (214). Como control
negativo se cultivaron las células en RPMI-1640 suplementado al 10% SFB
solamente. Se incubaron por 24 y 48 horas a 37ºC, 5% de CO2. Terminado cada
tiempo se recogieron los sobrenadantes de los cultivos, se fraccionaron y se
almacenaron a -70ºC hasta su estudio.
4.6.2 Efecto de sobrenadantes de cultivos celulares sobre el crecimiento
de C. neoformans.
Se cultivaron 1x103 UFC /pozo de C. neoformans en placas de cultivo de 96
pozos en presencia de 200�l de los sobrenadantes de los cultivos celulares al
100% y 50% y se incubaron a 37ºC 5% de CO2 durante 24 y 48 horas. Al cabo de
los tiempos de cultivo, se hizo una dilución 1/100 de los cultivos de cada pozo, se
sembraron 10�l en agar Sabouraud y se incubaron a 25ºC durante dos días para
el recuento de la UFC (unidades formadora de colonias). Los ensayos se hicieron
por triplicado y se dejaron controles de viabilidad de la levadura en sabouraud
líquido y en RPMI-1640 suplementado al 10% SFB.
Igualmente se utilizó para evaluar la inhibición del crecimiento una metodología en
Sabouraud líquido similar a la utilizada para evaluar la actividad de agentes
quimioterapéuticos sobre el crecimiento del hongo (193,194). Se tomó una colonia
de C. neoformans sembrado por agotamiento en agar y se llevó a 50 ml en caldo
Sabouraud glucosado y se dejó en agitación a 180 r.p.m toda la noche a 37oC. Se
preparó un inóculo a una concentración de 1x106 células/ml y se inocularon 50 ml
de caldo que se dejó en agitación 150 r.p.m a 37oC. Se obtuvieron muestras del
caldo a las 0, 24, 30, 35, 48, 54, 62 y 72 horas las cuales se leyeron por
turbidimetría a 600 nm y se realizó conteo en cámara de Neubauer además de
UFC en agar Sabouraud. Para este ensayo se utilizaron cultivos de C. neoformans
en caldo Sabouraud, RPMI 1640 completo con SFB al 10% y en sobrenadantes de
cultivos de CMSP con o sin GXM a 10 �g/ml, obtenidos a las 24 y 48 horas de
cultivo.
4.7 Determinación de la curva de crecimiento de C. neoformans en medio
líquido.
Se prepararon inóculos de la levadura a una concentración de 1X 105 células en
50 mL de caldo Sabouraud glucosado e inóculos de 2X103 células en 1mL de
medio de cultivo Sabouraud. Posteriormente, se dejaron en agitación a 150 r.p.m
a 37oC y se obtuvieron muestras a las 0, 24, 30, 35, 48, 54, 62 y 72 horas las
cuales se leyeron por turbidimetría a 600 nm y además se realizó conteo en
cámara de Neubauer y de esta manera se determinó la curva de crecimiento de la
levadura en 50 y en 1mL de medio de cultivo.
4.8 Efecto del medio de cultivo y sus componentes sobre el crecimiento
de C. neoformans.
Se tomó una colonia de C. neoformans sembrada por agotamiento en agar
Sabouraud y se llevó a 50 ml en caldo Sabouraud glucosado y se dejó en
agitación a 180 r.p.m toda la noche a 37oC. Se preparó un inóculo a una
concentración de 2x106 células /ml y se colocaron en tubos de ensayo así:
levaduras previamente lavadas en PBS para quitar restos de Sabouraud líquido,
en 1ml de RPMI (GIBCO BRL) al 10% de SFB (GIBCO), levaduras lavadas
previamente en PBS en 1ml de RPMI (GIBCO BRL) sin SFB, levaduras sin lavar
en PBS en 1 ml de RPMI (GIBCO BRL) al 10% de SFB (GIBCO), levaduras sin
lavar en PBS en 1 ml de RPMI (GIBCO BRL) sin SFB. Como control del
experimento se sembraron las levaduras en sabouraud líquido solamente.
Posteriormente, se dejaron en agitación a 150 r.p.m a 37oC y se obtuvieron
muestras a las 0, 24, 30, 35, 48, 54, 62 y 72 horas las cuales se leyeron por
turbidimetría a 600 nm además, se realizó conteo en cámara de Neubauer y de
esta manera se determinó la curva de crecimiento de la levadura.
4.9 Efecto de IFN-� recombinante humano sobre cultivos de C.
neoformans.
Para estos ensayos, se cultivaron 1x103 UFC de C. neoformans en 200�l de
medio líquido de Saubouraud en placas de fondo en U de 96 pozos. A los cultivos
en triplicado se les adicionó IFN-� Recombinante Humano (R & D Systems) a
concentraciones de 1, 10 y 100 U/ml. Como controles del ensayo, se colocaron las
levaduras en caldo Sabouraud y en el diluyente del IFN-� (ácido acético 10mM
con BSA al 0.1%) solamente. Los cultivos se dejaron durante 24 y 48 horas,
tiempos en los cuales se realizó conteo en cámara de Neubauer además de UFC
en agar Sabouraud. En estos ensayos se calculó el porcentaje de inhibición del
crecimiento de C. neoformans al comparar las UFC presentes en los grupos
experimentales con el control, utilizando la siguiente formula:
No. UFC del control - No. UFC en el experimental x 100
No. UFC del control
4.10 Estimulación de células mononucleares totales para detección de
citocinas intracelulares.
Poblaciones de células mononucleares de sangre periférica humana a una
concentración de 2x 106 células/ml fueron estimuladas en pozos por triplicado
con Glucuronoxilomano (GXM) de C. neoformans a 10�g/ml . Como control
positivo, las células se estimularon con Ionomicina a 2 �g/ml y Forbol Miristato
Acetato (PMA) a 50 ng/ml. Como control negativo se dejaron las células en RPMI-
1640 suplementado al 10% SFB solamente. Se incubaron por 12 horas a 37ºC,
5% de CO2. Para concentrar las citocinas a nivel intracelular se adicionó Brefeldin
A a 20 �g/ml y se incubó a 37ºC, 5% de CO2 por 5 horas (206).
4.11 Fenotipificación de poblaciones celulares.
Las células estimuladas, al igual que las no estimuladas se lavaron una vez con
RPMI-1640 (GIBCO BRL) completo suplementado al 10% SFB (GIBCO), y luego
con PBS-SFB al 2%, 0.1%de azida sodio por 5min a 2000 r.p.m y se ajustaron a
2x105 células/tubo (206).
Para marcar los antìgenos de superficie, en tubos por separado se adicionaron
3�l de anti CD3FITC (Pharmigen), 5�l de anti CD56Biotina (Pharmigen), 3�l de
anti CD8FITC (Pharmigen), 4�l de anti CD4PerCP (Pharmigen) y 2�l del control
de isotipo anti IgG1FITC (Pharmigen). Los anticuerpos biotinilados se revelaron
incubándolos durante 30 minutos con 1�l Streptavidina PerCP (Pharmigen).
4.12 Evaluación de citocinas por citometría de flujo.
Las células mononucleares humanas tanto sin activar, como activadas con
PMA/Ionomicina y con GXM marcadas para antígenos de superficie, se fijaron con
100�l de paraformaldehido al 1% durante 5 minutos a 4ºC y luego se
permeabilizaron con 200�l de buffer de permeabilización durante 20 minutos a
temperatura ambiente. Seguidamente, se adicionaron 2�l de IgG1kPE (Pharmigen)
como control de isotipo, 2.5�l de anti TNF�PE (Pharmigen) y 1.5�l anti IL-12PE
(Pharmigen) en los tubos correspondientes, y se dejaron en incubación por 30
minutos a 4ºC. Posteriormente, las células se resuspendieron en 300�l de buffer
de lavado, adquiridas y analizadas en un FACScan; (Becton Dickinson).
Para determinar la producción de IL-12 y TNF� por los linfocitos, primero se
seleccionaron estas células por tamaño y granularidad en la región uno (R1) y
sobre esta región se analizó la producción de IL-12 y TNF� por los linfocitos
CD3+, CD56+, CD4+ y CD8+. Para determinar la producción de IL-12 y TNF� en
las poblaciones CD3-/CD56+ CD3+/CD56+ se hizo una gráfica de CD3 contra
SSC y se seleccionaron dos regiones: R2 (linfocitos CD3-), R3 (linfocitos CD3+) y
sobre estas regiones, se analizó la producción de las IL-12 y TNF� por las células
CD56+ y CD56-.
Para determinar la producción de IL-12 y TNF-� en la población de monocitos
activados primero se analizaron las células de acuerdo a la complejidad interna y a
la expresión de CD4+ es decir, las células que correspondían a los monocitos
(complejidad intermedia y expresión de CD4+ intermedia).
4.13 Análisis estadístico.
Los resultados de los cultivos son mostrados como porcentajes de inhibición,
medias y desviaciones estándar de los conteos realizados por triplicado. Los
resultados por citometría de flujo son los porcentajes de las poblaciones
mostrados como medias y desviaciones estándar. La comparación de los grupos
de células productores de citoquinas, se realizo mediante la prueba Kruskal-Wallis.
Valores de P < 0.05 fueron considerados como significativos.
5. RESULTADOS.
5.1 Determinación de la presencia de proteínas en el GXM por SDS-PAGE.
Con el propósito de analizar la presencia de proteínas en los extractos de GXM
que pudiesen alterar el efecto de este polisacárido en los experimentos utlizando
este material, se realizaron varias electroforesis con dodecil sulfato sódico sobre
gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) al 12% en condiciones denaturantes, que se
colorearon con azul Coomasie que presenta una sensibilidad para detectar
proteínas de 0.2-20 �g . La Figura 1, muestra un gel representativo de tres
realizados y como se observa no se revelaron bandas en el carril que corresponde
a la muestra de GXM (carril 2) comparado con el carril número tres
correspondiente al extracto crudo de levadura, en donde se observan bandas de
mediano y bajo peso molecular.
Peso
molecular1 2 3
94
67 43
30
20 14
Figura 1. Electroforesis de SDS-PAGE al 12% donde se muestra la presencia de bandas de proteínas teñidas con azul de Coomasie. Carril 1 marcador de peso molecular, carril 2 GXM purificado y carril 3 extracto de levadura (C. neoformans).
5.2 Efecto de sobrenadantes de células mononucleares de sangre
periférica cultivadas en presencia de GXM sobre el crecimiento de C.
neoformans.
Estudios preliminares de inhibición de C. neoformans utilizando sobrenadantes
obtenidos de CMSP humanas depletadas de monocitos y enrquecidas en NK
estimuladas con GXM, realizados en el Grupo de Inmunobiología de la Pontificia
Universidad Javeriana, sugieren que estos sobrenadantes inhibían el crecimiento
de la levadura de una manera dependiente del tiempo, observándose una mayor
inhibición a las 48 horas de cultivo. Sin embargo, también se notó que el número
de colonias de C. neoformans cultivadas en RPMI 1640 con SFB al 10% (medio
completo o MC), no aumentaba a las 48 horas de cultivo comparado con las
cantidad de colonias a las 24 horas (217). Esto hizo pensar que el medio podía
estar ejerciendo algun efecto inhibitorio incluso mayor que los sobrenadantes,
sobre el crecimiento de la levadura. Por esta razón se diseñaron nuevos ensayos
con algunas variaciones en las condiciones de cultivo (Tipo de suero usado
GIBCO o VECOL, condiciones de cultivo, etc).
Los resultados de estos nuevos experimentos permitieron establecer que C.
neoformans presenta un óptimo crecimiento en caldo Sabouraud, mientras que en
MC tienen un crecimiento más lento inclusive, que con los sobrenadantes al 50% y
al 100% obtenidos de cultivos de CMSP en ausencia y en presencia de GXM a10
�g/ml (Fig. 2A). Al usar los sobrenadantes A (CMSP con GXM 24 horas) , B
(CMSP solas 24 horas), C (CMSP con GXM 48 horas), y D (CMSP solas 48 horas)
se observa que a las 24 horas había un mayor número de levaduras en los
cultivos con sobrenadantes al 100% que en los cultivos con sobrenadantes al
50%. Estos resultados pueden atribuirse a que los sobrenadantes al 50% son
obtenidos de la mezcla volumen por volumen con medio completo fresco,
notándose de nuevo, la influencia del medio fresco con suero en el crecimiento de
la levadura. De otra parte, los resultados muestran que a las 48 horas de cultivo,
las levaduras recuperan su crecimiento en los cultivos con los sobrenadantes al
50% A, B y C (Fig. 2B). Se hace evidente además, que a las 48 horas de cultivo,
se mantiene el efecto inhibitorio sobre el crecimiento de la levadura ejercido por
los sobrenadantes D al 50%.
Estos resultados sugieren por consiguiente, que factores presentes en el medio
pueden estar regulando negativamente el crecimiento del hongo, algunos quizás
actuando como reguladores de acción temprana y otros como reguladores de
acción tardía. Igualmente los resultados permiten pensar que el medio competo
(RPMI con SFB) carece de alguna sustancia que mantiene el crecimiento de la
levadura o algun factor que diminuye la tasa de crecimiento. En las figuras 2A y
2B, se muestra un ensayo dos los dos realizados de forma independientes con
cultivos triplicados en cada condición del experimento.
Debido a que el cultivo de las células humanas se realiza en medio RPMI con SFB
y que los sobrenadantes utilizados en los ensayos contienen este medio de cultivo
no fue posible continuar aplicando esta estrategia para medir el efecto de los
sobrenadantes obtenidos bajo diferentes condiciones sobre el crecimiento de la
levadura.
0
50000
100000
150000
200000
Sabou
raud
MC
Condiciones del cultivo
UFC
0
100000
200000
300000
400000
Sabou
raud
MC
Condiciones del cultivo
UFC
Cultivo por 24 horas
Cultivo por 48 horas
100% 50%100% 50%
100% 50%100% 50%
A B C D A B C D
A B C D A B C D
A
B
0
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Sabou
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MC
Condiciones del cultivo
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Condiciones del cultivo
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Sabou
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MC
Condiciones del cultivo
UFC
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Sabou
raud
MC
Condiciones del cultivo
UFC
Cultivo por 24 horas
Cultivo por 48 horas
100% 50%100% 50%
100% 50%100% 50%100% 50%100% 50%
A B C D A B C D
A B C D A B C D
A
B
Figura 2. Ensayo de inhibición del crecimiento de C. neoformans. A. Figura que muestra el recuento de UFC a las 24 horas de cultivo, se muestra un ensayo de dos realizados de manera independiente. B. Figura que muestra el recuento de UFC a las 48 horas de cultivo, se muestra un ensayo de dos realizados de manera independiente. C. neoformans fue cultivado por 24 y 48 horas con los SND al 100 y al 50%, se utilizó caldo saboraud y medio completo (MC) como controles. El numeral A indica el sobrenadante de CMSP con GXM obtenido a las 24 horas, B indica sobrenadante de CMSP solas obtenido a las 24 horas, C sobrenadante de CMSP con GXM obtenido a las 48 horas y D sobrenadante de CMSP solas obtenido a las 48 horas. Los sobrenadantes de CMSP estimulados con GXM no inhiben el crecimiento de la levadura.
5.3 Curva de crecimiento de C.neoformans en medio líquido.
Para verificar si las condiciones de cultivo de C. neoformans utilizadas en los
ensayos de inhibición podían influir en los resultados obtenidos, se realizaron
cultivos de la levadura en medio Saboraud líquido y como una modificación de la
técnica se adicionaron los sobrenadantes al 100% y al 50% para determinar la
curva de crecimiento. Para esto, las levaduras se centrifugarón previamente para
retirar el medio de culltivo y así poder evaluar el efecto de los sobrenadantes
sobre el crecimiento de la levadura sin la influencia del medio de cultivo. La curva
de crecimiento de C. neoformans, se determina usualmente utilizando el sistema
de crecimiento en 50 mL de caldo de cultivo (193, 194); sin embargo, para poder
evaluar los presentes ensayos de inhibición con los sobrenadantes obtenidos de
CMSP humanas estimuladas y no estimuladas con GXM, se adoptó el sistema de
crecimiento de C. neoformans a 1mL de caldo Saboraud.
Como se puede observar en la figura 3, al realizar la comparación de los
resultados obtenidos por turbidimetría con los resultados obtenidos del recuento
de la levadura en cámara de Neubauer y del recuento de las UFC en agar
Saboraud de los dos sistemas de crecimiento desde la hora cero hasta las 72
horas, se pudo establecer que es posible obtener información del crecimiento del
hongo utilizando el sistema de cultivo en 1mL de caldo Saboraud, alcanzando un
comportamiento similar al observado en el sistema de crecimiento tradicional en
50mL de medio de cultivo.
0,000
0,300
0,600
0,900
1,200
0 h 24 h 30 h 35 h 48 h 54 h 62 h 72 h
Tiem po
Ab
so
rban
cia
0
0,3
0,6
0,9
1,2
0 h 24 h 30 h 35 h 48 h 54 h 62 h 72 h
Tiem po
Ab
so
rban
cia
1,0E+00
1,0E+02
1,0E+04
1,0E+06
1,0E+08
1,0E+10
0 h 24 h 30 h 35 h 48 h 54 h 62 h 72 h
Tiem po
Le
vad
ura
s/m
l
1,0E+00
1,0E+03
1,0E+06
1,0E+09
0 h 24 h 30 h 35 h 48 h 54 h 62 h 72 h
Tiem po
UFC
1,0E+00
1,0E+02
1,0E+04
1,0E+06
1,0E+08
1,0E+10
0 h 24 h 30 h 35 h 48 h 54 h 62 h 72 h
Tiem po
Le
vad
ura
s/m
l
1,0E+00
1,0E+03
1,0E+06
1,0E+09
0 h 24 h 30 h 35 h 48 h 54 h 62 h 72 h
Tiem po
UFC
A
B
C
CULTIVO EN 50ml CULTIVO EN 1ml
0,000
0,300
0,600
0,900
1,200
0 h 24 h 30 h 35 h 48 h 54 h 62 h 72 h
Tiem po
Ab
so
rban
cia
0
0,3
0,6
0,9
1,2
0 h 24 h 30 h 35 h 48 h 54 h 62 h 72 h
Tiem po
Ab
so
rban
cia
1,0E+00
1,0E+02
1,0E+04
1,0E+06
1,0E+08
1,0E+10
0 h 24 h 30 h 35 h 48 h 54 h 62 h 72 h
Tiem po
Le
vad
ura
s/m
l
1,0E+00
1,0E+03
1,0E+06
1,0E+09
0 h 24 h 30 h 35 h 48 h 54 h 62 h 72 h
Tiem po
UFC
1,0E+00
1,0E+02
1,0E+04
1,0E+06
1,0E+08
1,0E+10
0 h 24 h 30 h 35 h 48 h 54 h 62 h 72 h
Tiem po
Le
vad
ura
s/m
l
1,0E+00
1,0E+03
1,0E+06
1,0E+09
0 h 24 h 30 h 35 h 48 h 54 h 62 h 72 h
Tiem po
UFC
A
B
C
CULTIVO EN 50ml CULTIVO EN 1ml
Figura 3. Comparación del sistema de crecimiento de C. neoformans en 50 mL y 1 mL de medio de cultivo líquido. A) Resultados de la lectura a 600nm por turbidimetría B) Recuento realizado en cámara de Neubauer (levaduras/mL) C) Conteo de UFC en agar Saboraud. La curva en 50 mL n=4 y la curva en 1 mL n=2. La dinámica del crecimiento de la levadura en 1 mL fue muy similar a el crecmiento en 50 mL, técnica utilizada comúnmente para evaluar el efecto antifungico de compuestos sobre el C. neoformans.
5.4 Ensayo de inhibición y curva de crecimiento de C. neoformans en medio líquido. Una vez establecido que la curva de crecimiento de C. neoformans en 1mL de
caldo Saboraud se comportaba de una manera similar que en 50mL, se realizaron
nuevos ensayos de inhibición bajo las mismas condiciones de cultivo de los
ensayos preliminares (levaduras en 1mL de sobrenadantes al 100% y 50% V/V).
En la figura 4 se muestra de nuevo que el medio RPMI 1640 al 10% de SFB tuvo
un mayor efecto inhibitorio sobre el crecimiento del hongo que los sobrenadantes
obtenidos de cultivos de CMSP estimuladas y no estimuladas con GXM. En todos
los ensayos, se utilizó como control del crecimiento, la técnica original en la cual
se cultivan las levaduras en 50ml de medio, que mostró el mejor rendimiento. Las
demás condiciones de cultivo con sobrenadantes provenientes de células
estimuladas presentaron un comportamiento intermedio entre el cultivo en 50 mL y
la inhibición que se presenta con el RPMI tanto a las 24 como a las 48 horas de
cultivo. Los resultados del recuento de levaduras por mL fueron similares a los
obtenidos por turbidimetría y a los obtenidos por el recuento de colonias en agar
Saboureaud (datos no mostrados).
Sobrenadante 24 horas
1,0E+00
1,0E+02
1,0E+04
1,0E+06
1,0E+08
1,0E+10
0 h 24 h 30 h 35 h 48 h 54 h 62 h 72 h
Tiempo en horas
No.
de
leva
dura
s x
ml
Sabouraud 50 mlSabouraud 1 mlRPM IGXM 100%SND 100%GXM 50%SND 50%
Sobrenadante 48 horas
1,0E+00
1,0E+02
1,0E+04
1,0E+06
1,0E+08
1,0E+10
0 h 24 h 30 h 35 h 48 h 54 h 62 h 72 h
Tiempo en horas
No.
de
leva
dura
s x
ml
Sabouraud 50 mlSabouraud 1 mlRPM IGXM 100%SND 100%GXM 50%SND 50%
A
B Figura 4. Ensayo de inhibición y curva de crecimiento de C. neoformans en medio liquido. C. neoformans fue cultivado entre 0 h y 72h en 50 mL y 1 mL de caldo Saboraud, 1mL de RPMI 1640 con SFB al 10% y en 1 mL de SNDs al 100% y al 50%. Los resultados muestran la media del recuento de la levadura en cámara de Neubauer con SNDs recolectado a las 24 horas A) y a las 48 horas B). Se muestra un ensayo representativo de dos realizados de forma independiente. GXM indica sobrenadante de CMSP cultivadas con este el polisacárido y SND sin presencia del polisacárido. Los sobrenadantes obtenidos a las 24 y 48 horas de CMSP en presencia de GXM no nhibieron el crecimiento de la levadura. El crecimiento de C. neoformans en medio completo (RPMI y SFB 10%) es menor.
5.5 Efecto del medio de cultivo y sus componentes sobre el crecimiento de C. neoformans. En vista de que el medio de cultivo RPMI 1640 suplementado al 10% con SFB
presentó un mayor efecto inhibitorio sobre el crecimiento de la levadura que con
los sobrenadantes al 50% y 100% obtenidos de CMSP humana estimuladas con
GXM, se evaluó la influencia del medio de cultivo y del suero fetal bovino
inactivado a 56ºC en el crecimiento del hongo. Para esto, se tomó la levadura
lavada previamente en solución PBS 1x, con el fin de quitar restos de Sabouraud
líquido y de esta manera evitar que la variable medio de cultivo influyera en los
resultados, comparándolo con la levadura sin lavar en PBS. Separadamente se
cultivó la levadura en RPMI con y sin suero fetal bovino al 10%, y se determinó la
curva de crecimiento. Como control del experimento se sembró la levadura en
medio Sabouraud líquido solamente. La figura 5 es representativa de dos ensayos
independientes.
Los resultados obtenidos por turbidometría y por recuento de levaduras en cámara
de Neubauer, permitieron verificar que el medio sin SFB tiene mayor efecto
inhibitorio en el crecimiento de la levadura que el medio suplementado con SFB.
Estos resultados hacen pensar, que otros componentes presentes en el medio,
diferentes al suero fetal bovino pueden estar ejerciendo el efecto inhibitorio mayor
sobre el crecimiento de la levadura.
CURVA DE CRECIMIENTO
1,0E-03
1,0E-02
1,0E-01
1,0E+00
1,0E+01
0 h 24 h 30 h 35 h 48 h 54 h 62 h 72 h
Tiempo
Abs
orba
ncia
SabouraudRPMI+SFBRPMIPBS+RPMI+SFBPBS+RPMI
curva de crecimiento
1,E+00
1,E+02
1,E+04
1,E+06
1,E+08
1,E+10
0 h 24 h 30 h 35 h 48 h 54 h 62 h 72 h
Tiempo
leva
dura
s/m
l
Sabouraud
RPMI+SFB
RPMI
PBS+RPMI+SFB
PBS+RPMI
A B
Figura. 5. Efecto del medio de cultivo (RPMI) y del SFB en el crecimiento de C. neoformas. A. Absorbancias ópticas a 600nm por turbidimetría. B. Conteo de levaduras en Cámara de Neubauer. Se observa que en RPMI el crecimiento de C. neoformans es menor, en medio RPMI con SFB se recupera el crecmiento del la levadura.
5.6. Efecto del IFN-γ recombinante humano sobre el crecimiento de C. neoformans.
Debido a que en los experimentos anteriores, la presencia del medio RPMI no
permitió evaluar con claridad la actividad de los componentes presentes en los
sobrenadantes sobre el crecimiento del hongo, se decidió entonces determinar el
efecto directo del IFN-�, dado que este es uno de los principales factores
producido por CMSP estimuladas con C. neoformans y mediador crítico durante la
respuesta temprana del huésped a esta levadura (124,125, 173, 174, 176). En
este caso la levadura fue cultivada en medio líquido de Sabouraud.
Utilizando diversas concentraciones de esta citocina recombinante humana (100U,
10U, 1U) sobre el cultivo de levaduras, se evaluó su efecto sobre el crecimiento de
C. neoformas por recuento en cámara de Neubauer del número de levaduras en
mL y el recuento del número de colonias en agar sabouraud y se comparó con el
crecimiento ideal en el medio líquido de Sabouraud. Los datos mostrados en la
figura 6, son el promedio de 3 experimentos realizados de forma independientes
utilizando triplicados de cada ensayo a las 24 y 48 horas.
En la figura 6, se observa una tendencia a la disminución de la cantidad de
levaduras cuando se utiliza IFN-� a 100 U/mL comparado con la levadura
cultivada en el medio solo o el medio con la presencia de las mismas
concentraciones del diluyente.
igura 6. Efecto del IFN-γ recombinante humano sobre el crecimiento de C. neoformans. A)
Sin embargo, las variaciones entre cada experimento en el número de colonias en
agar y el recuento por mL en cámara de Neubauer, presentan grandes
diferenecias en cuanto a la media y a las desviaciones estandar por lo que se
puede ocultar el fenomeno de inhibición al comparar todos los experimentos.
0 ,E+0 0
1 ,E+0 6
2 ,E+0 6
3 ,E+0 6
4 ,E+0 6
5 ,E+0 6
6 ,E+0 6
Sabour aud Diluyente IFN-g 1 00 U. FN-g 1 0 U. IFN-g 1 U.
No
. Le
vad
ura
s /m
L
0,0
5000,0
10000,0
15000,0
20000,0
Sabour aud Diluyente IFN-g 1 00 U. FN-g 1 0 U. IFN-g 1 U.
0 ,E+0 0
1 ,E+0 7
2 ,E+0 7
3 ,E+0 7
Sabour aud Diluyente IFN-g 1 00 U. FN-g 1 0 U. IFN-g 1 U.0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
S abour aud Diluyen t e I FN- g 1 0 0 U. FN- g 1 0 U. I FN- g 1 U.
Recuento en cámara UFC
24H
48H
A B
C D
FMuestra los resultados del recuento de cámara Neubauer a las 24 horas de cultivo. B) Muestra el recuento de UFC/mL a las 24 horas de cultivo. C) Muestra el recuento en cámara de Neubauer a las 48 horas de cultivo. D) Muestra el recuento de UFC/mL a las 48 horas de cultivo. Los datos mostrados son un experimento representativo de tres realizados de forma independiente y por cultivos en triplicado. Se observa una tendencia de el IFNγ a inhibir el crecimiento de la levadura, especialmente a la 24 horas. Sin embargo a las 48 se recupera el crecimiento.
Como ejemplo de cada experimento individual, en la tabla 1 y 2 se muestra los
datos de la media, la desviación estándar y el porcentaje de inhibición del
crecimiento de la levadura a las 24 horas y 48 horas de uno de los tres ensayos
realizados de forma independiente. A pesar de que se observa algun efecto por
parte del medio con el diluyente de la citocina este valor de inhibición es superado
por las diferentes concentraciones del IFN-�, especialmente por la de 100U/mL.
Es de anotar, que el porcentaje de inhibición del crecimiento del hongo al
comparar saboraud e IFN-� a 100U a las 24 horas en el conteo en cámara de
Neubauer, fue del 51% y en el recuento de UFC fue del 54%. Con IFN-� a
10U/mL a las 24 horas se observa un 35% de inhibición del crecimiento de la
levadura pero solo en el recuento en el agar y se disocia totalmente del valor de
inhibición en el recuento con cámara porque no se observa una inhibición sino una
estimulación del crecimiento. Este fenómeno fue observado en este ensayo y se
corroboro a las 48 horas de cultivo. No se puede descartar que al pasar del
recuento en cámara a cultivo en agar en el cual se espera varios dias para que
aparezcan las colonias se ve una disminución de el número de levaduras viables.
Recuento en Agar 24H Recuento en Cámara 24H
Condiciones de Cultivo X SD % de
Inhibición
X SD % de
Inhibición
Sabouraud 933 181
636667 23094
Diluyente de IFN-γ 713 114
24% 538333 48045
16%
Sabouraud + IFN-γ 100 Uds. 433 95
54% 315000 21794
51%
Sabouraud + IFN-γ 10 Uds. 607 261
35% 1085000 113027
-71.0%
Sabouraud + IFN-γ 1 Uds. 973 474
-5.0% 805000 126194
-27%
Tabla 1. Efecto inhibitorio del IFN-γ recombinante humano a diferentes concentraciones sobre el crecimiento de C. neoformans a las 24 horas de cultivo de uno de tres ensayos independientes.
A las 48 horas de cultivo se obtuvo un 15 y 6% de inhibición respectivamente, sin
embargo el diluyente presento 11 % de inhibición al conteo de las levaduras en
cámara. Aun descontando el efecto del medio con diluyente se ve la acción de la
citocina sobre el crecmiento de la levadura, Tabla 1. Es interesante observar que
en los otras condiciones donde se coloca menor cantidad de citoquina se observa
un estimulo al crecimiento. Aunque a las 48 horas, a la concentración de 100 U/mL
todavía se ve un efecto de inhición aunque el número de levaduras aumenta lo
que sugiere un efecto temprano de la citocina.
Recuento en Agar 48H Recuento en Cámara 48H
Condiciones de Cultivo X SD %de
Inhibición
X SD %de
Inhibición
Sabouraud 1216667 485215
12056667 1614817
Diluyente de IFN-γ 1353333 225019
-11% 10683333 1078579
11
Sabouraud + IFN-γ 100 Uds. 1140000 202237
6% 10266667 378594
15%
Sabouraud + IFN-γ 10 Uds. 1870000 485901
-54% 16233333 1020212
-35%
Sabouraud + IFN-γ 1 Uds. 2890000 121244
-138% 13066667 407226
-8%
Tabla 2. Efecto inhibitorio del IFN-γ recombinante humano a diferentes concentraciones sobre el crecimiento de C. neoformans a las 48 horas de cultivo de tres ensayos independientes.
Estos resultados preliminares podrían indicar que el IFN-γ puede ser una de las
moléculas potenciales presente en los sobrenadantes de cultivos de CMSP
estimuladas con GXM, capaz de inhibir el crecimiento de C. neoformans.
5.7. Determinación de la producción de IL-12 y TNF-α en respuesta al GXM.
Con el objetivo de determinar la producción intracelular de IL-12 y TNF-� en
respuesta al GXM, se cultivaron en ensayos independientes, CMSP humanas de
cinco donantes sanos en presencia de GXM a 10�g/ml. Como control positivo, las
células se estimularon con Ionomicina a 2�g/ml y Forbol Miristato Acetato (PMA) a
50ng/ml (206). Como control negativo se dejaron las células en RPMI-1640
suplementado al 10% SFB solamente.
En las CMSP humanas de 5 donantes sanos se encontraron en promedio las
siguientes poblaciones celulares tomando como 100% la población de linfocitos:
Linfocitos CD3+ 72.2%±10.3, linfocitos CD3- 27.8%±10.3, linfocitos CD4+
48.9%±7.3, linfocitos CD8+ 31.0%±5.2, CD56+ 12.7±7.5% linfocitos CD3-, CD56+
39.9±16.5%, linfocitos CD3+CD56+ 3.7±2.8%. Estos valores promedios se
encuentran dentro de los valores normales reportados para estas sub-poblaciones
en otros estudios (216, 217).
Las figuras 7 y 8 muestran la media de producción de TNF-� e IL-12 en las
diferentes poblaciones de linfocitos analizadas. En general, se observó una baja
detección TNF-� en todas las poblaciones celulares, sin embargo en presencia de
PMA/Ionomicina, se observo una tendencia a la producción de TNF-� en los
linfocitos CD3+ y en los linfocitos CD8+. Al comparar los linfocitos CD3+, en los
cutivos estimulados con mitógenos mediante la prueba de Maan-Whitney, se
observa una diferencia significativa frente a cultivos en medio o con GXM de
P=0.001. En linfocitos CD8 se observa una diferencia entre los mitógenos y el
control de P=0.001 y con GXM 0.005. Demostrando que hubo mayor producción
de citocinas en estas dos poblaciones al estimular con PMA/ionomicina. No se
detecta producción de TNF-α en las poblaciones cultivadas con GXM.
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
CD3-CD3+
CD56+
CD4+CD8+
CD3-/CD56
+
CD3+/C
D56+
Población
% d
e cé
lula
sNegativoPMAGXM
Figura 7. Media de la producción de TNF-α en las diferentes poblaciones de linfocitos estimulados de 5 donantes sanos (n=5). Negativo significa el control de las CMSP en medio solo. PMA significa las CMSP estimuladas con PMA/ionomicina y GXM las CMSP cultivadas con este polisacárido. Las barras indican la media de los 5 individuos para cada población celular y sus respectivas desviaciones estandar (SD).
La producción de IL-12 fue my baja en todas las poblaciones estimuladas con
PMA/Ionomicina, excepto para alguna detección en los linfocitos CD3+, Fig 8.
Al comparar la producción de IL-12 en los linfocitos CD3+ estimulados con los
mitógenos se oberva una diferencia significativa frente a el control P=0.001 y con
las células en presencia de GXM.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
CD3-CD3+
CD56+
CD4+CD8+
CD3-/CD56
+
CD3+/C
D56+
Población
% d
e cé
lula
sNegativoPMAGXM
Figura 8. Media de la producción de IL-12 en las poblaciones de linfocitos estimuladas de 5 donantes sanos. n=5). Negativo significa el control de las CMSP en medio solo. PMA significa las CMSP estimuladas con PMA/ionomicina y GXM las CMSP cultivadas con este polisacárido. Las barras indican la media de los 5 individuos para cada población celular y sus respectivas desviaciones estandar (SD).
El nivel de producción de citocinas detectable mediante el uso de estos anticuerpos
monoclonales específicos y la citometría de flujo fue bajo. Estos bajos niveles, se hacen
evidentes cuando se comparan con los reportados en otros trabajos a la misma
concentración de PMA/Ionomicina que la utilizada en estos ensayos (206). Se quizo
indagar si existìa alguna variable que interfiriera con la medición y se evaluaron parámetros
como la activación de las células frente al mitógeno que se utilizó como control positivo de
la prueba. Las células bajo el estímulo de la PMA/Ionomicina mostraron en su aspecto
microscópico claras señales de activación como la presencia de agrupamientos celulares y
aumento de la refringencia, comparada con el grupo control y con el GXM. Además, en las
células estimuladas con PMA/Ionomicina se hizo evidente la regulación negativa de los
marcadores de superficie lo cual es una característica que permite distinguir a las células
activadas. Así, en el grupo estimulado con PMA/Ionomicina se observó que el porcentaje
de células CD4+, CD8+ y CD3-/CD56+ disminuyó notablemente (Tabla 3). Con GXM no
se obsevó regulación negativa de estos marcadores de superficie.
Las diferencias en la expresión de CD4+ y CD56+ fueron estadísticamente
significativas P=0.0012 al comparar mediante la prueba de rangos de Kruskal-
Wallis, el grupo de células control con el grupo de células activadas con los
mitógenos PMA/Ionomicina y no hubo diferencia P= 0.42 para los CD8.
Control PMA/Ionomicina GXM
CD4+ 48.9± 7.3 a 2.8± 1.7 b 50.2± 10.4 a
CD8+ 31.0± 5.2 b 25.9± 5.5 a 30.8± 8.7 b
CD3-/CD56+ 39.9± 16.5 c 6.5± 0.6 b 36.7± 18.4 c
Tabla 3. Disminución de expresión de marcadores de superficie por medio de citometría de flujo en las poblaciones de linfocitos T ayudadores (CD4+), citotóxicos (CD8+) y linfocitos asesino naturales (CD3-/CD56+) estimulados con PMA/ionomicina.
Estos resultados sugieren por consiguiente, que las células se activarón con
PMA/Ionomicina y que no fue detectada estimulación con GXM , al menos por los
parámetros utilizados. De otra parte, probablemente los anticuerpos utilizados
para detectar la producción intracelular de IL-12 y TNF-α, no fueron
suficientemente sensibles. La figura 8 muestra la secreción de TNF-α de uno de
los cinco ensayos realizados de manera independiente.
TNF-
α
CD3 FITC
0.8% 8.1%2.1%
TNF-
α
CD3 FITC
0.8% 8.1%2.1%
Control medio GXM PMA/ionomicina
TNF-
α
CD3 FITC
0.8% 8.1%2.1%
TNF-
α
CD3 FITC
0.8% 8.1%2.1%
Control medio GXM PMA/ionomicina
Figura 8. Secreción de TNF-α por parte de linfocitos estimulados. Gráficas de puntos obtenidos por citometría de flujo, donde se muestra la producción de TNF-α por parte de linfocito. En el eje de las Y se observa la expresión de la citouqina y en el eje de las X se observa la expresión de el marcador de los linfocitos T, CD3 . El porcentaje de linfocitos CD3+ secretores de la citocinas se muestra en su cuadrante correspondiente. Se muestra 1 de los 5 ensayos realizados con CMSP en medio solo, estimulados con PMA/ionomicina y en presencia de GXM.
5.8. Producción de IL-12 y TNF-α por monocitos activados.
Las dos citoquinas aquí determinadas son producidas también por los monocitos.
Con el fin de determinar el porcentaje de monocitos productores de IL-12 y TNF-α,
se analizaron primero las células de acuerdo a la complejidad interna y a la
expresión de CD4+ es decir, las células que correspondían a los monocitos
(complejidad interna moderada y expresión de CD4+ intermedia) y se determinó
entonces, el porcentaje de células productoras de las citocinas en esta región
(figuras 9 y 10). Las tablas 4 y 5 contienen los datos de la media de producción de
TNF-α y IL-12 en monocitos activados de 4 donantes sanos. Del quinto donante
no se obtuvieron suficientes monocitos en la lectura por citometría que no fue
tenido encuenta en estos análisis.
Monocitos productores de TNF-α (%)
Control PMA/Iono GXM Muestra 1 1.0 7.5 1.6 Muestra 2 0.7 3.1 1.2 Muestra 3 0.6 12.4 2.9 Muestra 4 3.6 12.4 4.8 Media 1.5 8.9 2.6 DS 1.4 4.5 1.6
Tabla 4. Producción de TNF-α por monocitos activados de 4 donantes sanos. Los monocitos (complejidad mediana y CD4+ intermedio) fueron analizados por la expresión de TNF-α. Los datos representan el % de células positivas para cada condición menos el ruido de fondo, el cual es obtenido a partir de una grafica de puntos con la ubicación cuadrante de acuerdo el control de isotipos. Para todas las condiciones de cultivo de las células el ruido de fondo aceptado es menor de 1%.
Se observó una tendencia a la producción de TNF-� en los en los monocitos
activados con PMA/Ionomicina, mientras que la producción de IL-12 fue negativa.
No se observó producción deTNF-� y de IL-12 en los monocitos estimulados con
GXM.
Monocitos productores de IL-12 (%)
Control PMA/Iono GXM Muestra 1 1.3 2.3 0.7 Muestra 2 2.7 0.0 1.9 Muestra 3 0.1 2.6 0.1 Muestra 4 1.2 0.6 1.0 Media 1.4 1.6 0.9 DS 1.3 1.4 0.9
Tabla 5. Producción de IL-12 por monocitos activados de 4 donantes sanos. . Los monocitos (complejidad mediana y CD4+ intermedio) fueron analizados por la expresión de Il-12. Los datos representan el % de células positivas para cada condición menos el ruido de fondo, el cual es obtenido a partir de una grafica de puntos con la ubicación cuadrante de acuerdo al control de isotipos. Para todas las condiciones de cultivo de las células el ruido de fondo aceptado es menor de 1%.
En la figura 9, se resumen los resultados de la producción de IL-12 y TNF-α por
parte de los moncitos.
0
2
4
6
8
10
12
14
Control PMA/Iono GXM
% c
élul
as p
ositi
vas
TNF-aIL-12
Figura 9 . Secreción de citocinas por parte de monocitos estimulados. Se muestra la media y las desviaciones estandar respectivas.
6. DISCUSIÓN.
Cryptococcus neoformans es una levadura intracelular facultativa capsulada (28)
que causa meningoencefalitis principalmente en huéspedes
inmunocomprometidos incluyendo a los individuos con SIDA (186,187). El principal
factor de virulencia de este hongo es su cápsula de polisacáridos, la cual está
compuesta aproximadamente en un 90% del polisacárido Glucuronoxilomano
(GXM) (32, 44). La cápsula de C. neoformans representa uno de los mayores
factores de virulencia de la levadura con propiedades toleragénicas (58, 119,
153,189, 190, 192).
La interacción de Cryptococcus neoformans o sus componentes capsulares con
células efectoras tanto del sistema inmune innato como del sistema inmune
adaptativo, capacita a estas células para eliminar o inhibir el crecimiento de este
microorganismo ó para tener el potencial de modular la producción de señales
moleculares o citocinas, consideradas como mediadores críticos durante los
procesos infecciosos generados por este patógeno (158).
En este trabajo se evaluó mediante citometría de flujo la producción intracelular de
IL-12 y TNF-� por CMSP humanas en respuesta al GXM y el efecto directo del
IFN-� y de sustancias presentes en los sobrenadantes de cultivos de CMSP
humanas estimuladas con GXM sobre el crecimiento in vitro de C. neoformans. No
existen todavía reportes en la literatura de estudios similares utilizando citometría
de flujo y el GXM, los trabajos reportados han sido realizados midiendo citocinas
mediante técnicas como ELISA o RT-PCR utilizando la levadura completa, el
polisacárido capsular o el GXM.
Inicialmente se evaluó la inhibición del crecimiento de C. neoformans utilizando
sobrenadantes al 100% y al 50% de células estimuladas con GXM. Los resultados
muestran que los sobrenadantes con GXM no inhibieron el crecimiento del hongo;
incluso se observó un crecimiento menor de las levaduras con RPMI-1640
suplementado al 10% de SFB solamente y mucho menor con el RPMI solo
(Figuras 2 y 4).
En un estudio previo realizado en el Laboratorio de Inmunobiología de la PUJ, se
determinó que sobrenadantes obtenidos de cultivos de células mononucleares de
sangre periférica humana enriquecidas en NK y depletadas de monocitos
estimuladas con la levadura, tenían un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de C.
neoformans, y que células mononucleares de sangre periférica de humanos
depletadas de monocitos, produjeron IFN-� en respuesta al GXM de Cryptococcus
neoformans (217).
De otra parte, ha sido reportado que C.neoformans o su componente capsular
GXM, puede inducir en monocitos de humanos la liberación de IL-10, (183, 185)
citocina, considerada como un regulador negativo de la producción de
mediadores solubles como la IL-12 y el TNF-� , los cuales a su vez tienen efecto
regulador positivo en la inducción de IFN-� durante la infección por C. neoformans
(21-28, 100, 182, 183, 185).
Por lo tanto, en las condiciones experimentales utilizadas en los estudios previos,
las células mononucleares sin monocitos, enriquecidas en NK, estimuladas con la
levadura completa, pueden ser capaces de secretar IFN-�, porque tienen menos
posibilidades de ser inhibidas por la IL-10 producida endógenamente por los
monocitos. También es importante señalar, que cuando se utiliza la levadura
completa existe la posibilidad que otros componentes de la cápsula de C.
neoformans diferentes del GXM, como la manoproteína, influya en la estimulación
de estas células para la regulación positiva de IL-12, TNF-� e IFN� (16, 199).
En los ensayos realizados, los sobrenadantes se obtuvieron de células
mononucleares totales estimuladas con GXM, existiendo la posibilidad que los
monocitos presentes, liberaran IL-10 al ser estimulados con este polisacárido. Esto
permite sugerir de este grupo de ensayos, la IL-10 pudo inhibir la liberación de
citocinas proinflamatorias como IL-12, TNF-� e IFN-� por células mononucleares
totales de sangre periférica humana. Por consiguiente, en ausencia de estas
citocinas los sobrenadantes son incapaces de inhibir el crecimiento de la levadura
y esta incapacidad puede ser tan extrema, al punto que el medio de cultivo RPMI
1640 incluso tiene un efecto inhibitorio mayor sobre el crecimiento de la levadura.
Otro punto importante que cabe señalar es que en este trabajo la concentración de
GXM utilizada, así como el tiempo de estimulación de las células en co-cultivo con
el GXM para la obtención de los sobrenadantes, se basó en los experimentos
preliminares realizados en el Laboratorio de Inmunobiología de la PUJ (217).
Además, existen reportes como el publicado por Chuck y Sande (212) quienes
encontraron que el 68% de pacientes de SIDA con criptococosis tuvieron títulos de
antígenos criptococales en suero de aproximadamente 1/1,024 y el 21% tuvo
títulos en suero de 1/10,000 o más altos. Estos títulos podrían corresponder
aproximadamente a 10 y 100 �g de GXM/mL, respectivamente. Por consiguiente,
la concentración de GXM usada este trabajo (10�g/mL) se encuentra dentro del
rango de concentracion observados clinicamente en suero.
Sin embargo, existe la posibilidad de que la incapacidad del GXM para inducir la
liberación de citocinas proinflamatorias por células mononucleares de sangre
periférica humana, haya sido debida a fallas en la aplicación de una cinética
adecuada. Estudios de cinética muestran que niveles apreciables de IL-10
podrían ser detectados 3 horas después del reto de mononucleares de sangre
periférica con cepas de C. neoformans, alcanzando un máximo a las 48 horas.
Esta respuesta es temprana y puede persistir por largo tiempo (64). La presencia
de IL-10 endógeno al inicio de la activación de los macrófagos (3 h) podría ser
importante para la regulación negativa de citocinas como IL-12 y TNF-�.
A pesar de que el RPMI y el suero fetal bovino son utilizados en la mayoría de las
técnicas in vitro para determinar la actividad antifúngica de componentes contra C.
neoformans (193,194), en este estudio encontramos que estos componentes por
sí mismos causaban un desarrollo más lento del hongo, lo que indica
posiblemente la presencia en el medio de cultivo de alguna sustancia que puede
estar influyendo en el desarrollo de la levadura. Sin embargo, en los ensayos
preliminares donde se detectó la llberación de IFN-� por células NK, (217) esta
citocina al parecer presente en los sobrenadantes, tuvo un efecto aún más
potente que el medio de cultivo (RPMI 1640) sobre el crecimiento de C.
neoformans.
Como en el presente trabajo, no se pudo evaluar claramente la actividad de
sustancias presentes en los sobrenadantes sobre el crecimiento de C. neoformans
debido a la influencia del medio de cultivo en los resultados, y posiblemnte a la
incapacidad del GXM para inducir la liberación de citocinas como el IFN-� por
células mononucleares totales de sangre periférica humana, se determinó el
efecto directo del IFN-� sobre los cultivos de la levadura, para corroborar que el
IFN-� es una de las moléculas potenciales presentes en los sobrenadantes de los
ensayos preliminares, que tuvo efecto inhibitorio en el crecimiento C. neoformans.
Con este ensayo se pudo establecer que el IFN-� puede bloquear el desarrollo
del hongo, a pesar de la variabilidad en el número de levaduras interexperimento,
los resultados sugieren un efecto inhibitorio de la citocina a 100U/mL alcanzado a
las 24 horas de cultivo.
Estos resultados permiten lanzar la hipotesis que la levadura posiblemente
expresa receptores que se activan por el IFN-�; sin embargo, no existen
evidencias que permitan apoyar esta idea, al igual que no existen evidencias de
que la concentración de IFN-� que inhibe a la levadura en el presente estudio, se
encuentre presente en tejidos infectados. Asì mismo, puede sugerirse que el
efecto directo del IFN-� sobre la levadura puede inducir en ésta la liberación de
sustancias como enzimas que podrían estar interveniendo en la replicación de la
levadura tal como ha sido descrito para la replicación viral (20).
Los reportes que existen sobre la actividad del IFN-� sobre la levadura involucra
la participación de células inmunes, por ejemplo los estudios que demuestran que
las células NK de ratones tienen actividad antifúngica directa sobre la levadura en
presencia del IFN-� (126), y que anticuerpos anti-IFN-� inhiben la actividad de las
células NK durante los procesos de criptococosis sistémica (125). El efecto del
IFN-� in vivo también fue demostrado en ratones infectados con C. neoformans
(127). Existen otras evidencias que demuestran la interacción directa entre C.
neoformans con células humanas (161) y la producción de citocinas (157), dentro
de las citocinas producidas se encuentra el IFN-� (124) que presentó un pico de
producción medido por RT-PCR a las 18 horas (124).
Además, se ha demostrado que las células como monocitos y células dendríticas
presentan receptores de superficie que le permiten interactuar directamente con la
levadura o el polisacárido, en el caso de los monocitos, a través del complejo
receptor CD14/TLR4 (TLR4) además de los receptores manosa y beta-glucano
expresados en la superficie de estas células (7,8, 205) y a través del receptor
NKR-P1 (CD161) (9) expresado en la superficie de las células NK, induciendo en
estas poblaciones celulares, la liberación de citocinas como el IFN-� que a su vez
pueden estimular a los macrófagos para que activen los mecanismos efectores
para la eliminación de la levadura. Dentro de estos mecanismos se encuentra la
fagocitosis (134,129,145) o la producción de derivados del óxido nítrico (NO)
(195, 196, 197).
De manera similar a los resultados obtenidos en el presente trabajo, otros estudios
realizados con macrófagos peritoneales de ratones estimulados con IFN-�,
mostraron que la actividad antifúngica ideal se encontraba a una concentración de
100U/ml, en este caso mediada por la producción de derivados de óxido nítrico
(NO) (174). En este sistema vimos una actividad antifúngica directa del IFN-� a
esta misma concentración en cultivos del hongo sin células inmunes presentes en
el cultivo, lo que puede indicar un efecto directo.
El hecho de que el IFN-� bloquee el desarrollo del hongo, alcanzando el máximo
pico de inhibición a las 24 horas y que este disminuya a las 48 horas de cultivo,
implica la posibilidad de que la citocina active tempranamente los receptores que
pueden estar expresados en la superficie de la levadura, y que luego de cierto
tiempo pierda actividad o se acumule. IFN-� acumulado en presencia de células
inmunes, puede actuar activando a los linfocitos NK ó induciendo en los
macrófagos la producción de radicales derivados del NO lo que puede permitir la
acción de las células a tiempos posteriores de adicionada la citocina en un sistema
in vitro. Este supuesto por tanto, permite explicar la recuperación de la
proliferación de la levadura posterior a las 48 horas de cultivo, observada en los
presentes ensayos de inhibición del hongo con IFN-� en ausencia de células
inmunes.
Es importante señalar, que se ha demostrado actividad antifúngica del IFN-� a
través de la activación de macrófagos y la producción de radicales derivados del
NO sobre otros hongos como el Histoplasma capsulatum y Paracoccidiodes
brasiliensis (198). Igualmente, se ha demostrado la eficacia terapeútica del rIFN-γ
para el tratamiento de la cryptococosis sistémica experimental en ratones (211,
213, 214), pero no existen estudios que reporten el efecto directo del IFN-� sobre
C. neoformans ni su relevancia biológica.
De otra parte, el GXM al parecer no presenta la capacidad de inducir la liberación
de citocinas como IL-12 y TNF-� e IFN-�, en sobrenadantes obtenidos de
cultivos de CMSP totales humanas. La regulación negativa de IL-12 y TNF-� por
el GXM en los sobrenadantes podría atribuirse a la presencia de otras citocinas
estimuladas por el GXM como la IL-10, actualmente reportada como un regulador
negativo de la producción de IL-12 y TNF-� durante la infección por C.
neoformans (21-28, 182, 183, 185).
Los datos presentados muestran que aun cuando el anticuerpo contra TNF-�
utilizado en el estudio, no fue suficientemente sensible para detectar altos niveles
de la citocina liberada por células estimuladas, se pudo observar que la
producción de TNF-� en respuesta a la PMA/Ionomicina fue siempre mayor que
en respuesta al control negativo y al GXM en linfocitos CD3+ y en monocitos.
Los bajos niveles de deteccción de la citocina, no pudieron atribuirse a la falta de
viabilidad ni de estimulación celular, ya que las células siempre se mostraron
vitales y con claros signos de activación con la PMA/Ionomicina sugerido por la
regulación negativa de los marcadores de superficie celular CD4+ y CD56+.
Los resultados obtenidos de estos experimentos sugieren, que el polisacárido
capsular GXM de Cryptococcus neoformans podría estar ejerciendo algún tipo de
regulación negativa sobre la producción de TNF-� por células mononucleares de
sangre periférica (CMSP) humana. Estos resultados podemos apoyarlos con los
recientes hallazgos realizados por el grupo de Shoham, que demostrò, que la
interacción del GXM con el complejo receptor CD14/TLR4 expresado sobre
células fagocíticas, resulta en una activación incompleta de vías de señalización
intracelular necesarias para la producción de TNF-�, sugiriendo que la interacción
entre GXM y TLR podría representar un mecanismo de deregulación de citocinas
que contribuye a la capacidad del GXM para actuar como un factor de virulencia
(8).
Sin embargo, otros estudios han reportado que el GXM es capaz de inducir la
liberación de pequeñas cantidades de TNF-� en células mononucleares humanas
en presencia de suero humano con suficiente complemento (16, 93). Estos datos
hacen pensar, que la inducción de TNF-� por el GXM es dependiente del
complemento o de otras opsoninas presentes en el suero. Estos supuestos se
confirman con las observaciones realizadas en otras investigaciones en donde
solo C. neoformans opsonizado fue capaz de inducir la liberación de TNF-�,
mientras que esta respuesta no fue observada ni con GXM ni con organismos no
opsonizados (63,78). Es importante resaltar, que en este trabajo, las células
mononucleares humanas se cultivaron en RPMI-1640 suplementado al 10% de
suero fetal bovino (SFB) inactivado a 56ºC, sin complemento y probalemente sin
otras opsoninas como anticuerpos presentes en el suero.
De otro lado, se ha reportado que la manoproteína (MP) de la cápsula de
polisacáridos de C. neoformans es el componente directamente implicado en la
inducción de TNF-� en células mononucleares humanas (16). Por lo tanto, el GXM
utilizado en este trabajo esta muy libre de proteínas, tal como se demostró a
través de una electroforesis de proteínas y colorcaciónde Coomasie (SDS-PAGE)
y ademas no fue capaz de inducir la liberación de TNF-�.
Los presentes resultados, muestran demás que el GXM puede estar inhibiendo la
producción de IL-12 por monocitos. Esta regulación negativa podría ser
igualmente atribuida a factores inhibitorios como la IL-10 liberados por los
monocitos estimulados con GXM (25, 182, 183, 185). Los monocitos son pobres
productores de IL-12 cuando se estimulan con C. neoformans encapsulado, pero
la secreción se incrementa cuando se utilizan cepas de C. neoformans
acapsulares (67). Además, ha sido reportado en un estudio reciente que la
manoproteína también es el componente capsular principalmente responsable de
la inducción de IL-12 en CMSP humanas (199).
Los presentes resultados junto con los datos suministrados por otros trabajos
sugieren, que el GXM de C. neoformans no es capaz de inducir la liberación de
citocinas como la IL-12 y el TNF-� por células mononucleares totales de sangre
periférica humana, y que esta regulaciòn negativa de citocinas inflamatorias podría
estar mediada por la IL-10 como un mecanismo utilizado por la levadura para
inhibir o eludir la defensa del huésped. En La respuesta de citocinas a GXM la
regulación cruzada de IL-10, IL-12, TNF-� e IFN-�, puede tener un papel
importante en la conducción de la respuesta Th y posiblemente, en la modulación
de la función efectora de macrófagos y de procesos inflamatorios.
7. CONCLUSIONES.
Los resultados presentados en este estudio sugieren, que células mononucleares
totales humanas en cocultivo con GXM, son incapaces de liberar citocinas
inflamatorias como IL-12 y TNF-�.
Los sobrenadantes al 50% y al 100%, obtenidos de co-cultivos de células
mononucleares totales humanas estimuladas con GXM, no son capaces de inhibir
el crecimiento de C. neoformans.
Los resultados sugieren que eI IFN-� recombinante humano tiende a bloquear el
desarrollo de C. neoformans, indicando un posible efecto inhibitorio directo de la
citocina a 100 U/mL alcanzado a las 24 horas de cultivo.
8. RECOMENDACIONES.
Se recomienda que para obtener los sobrenadantes de los co-cultivos de células
totales con GXM, se utilicen varias concentraciones de este polisacarido, para
evaluar el efecto de la dosis de GXM en la inducción de mediadores solubles
capaces de inhibir el crecimiento de la levadura.
Igualmente, se recomienda evaluar los tiempos de estimulación de las células con
el polisacárido en la obtención de los sobrenadantes, para determinar la cinética
más adecuada para la inducción de mediadores solubles.
Determinar en los sobrenadantes la presencia de IL-10 mediante técnicas como
ELISA para verificar su efecto supresor en la liberación de otras citocinas como el
FN-� por células mononucleares estimuladas con GXM.
Para la determinación de citocinas intracelulares como IL-12, TNF-� se
recomienda probar otros estímulos como el LPS, para determinar el control
positivo más adecuado en la inducción de estas citocinas. Así mismo, se
recomienda evaluar diferentes concentraciones de GXM en la inducción de
citocinas intracelulares por células mononucleares de sangre periférica humana
para verficar la dosis óptima.
Se recomienda, variar el protocolo de estimulación de las células para la
determinación de citocinas intracelulares, aplicando el Brefeldín A al tiempo que se
apliquen la PMA/Ionomicina o LPS para establecer el protocolo más adecuado, así
como los tiempos de estimulación.
Tratar con anti-IL-10 los cultivos de células mononucleares estimuladas con GXM
para bloquear el efecto de esta citocina en la liberación intracelular de IL-12 y
TNF-� determinada por citometría de flujo.
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