Determinación de Coliformes Fecales y Totales

REPORTE DE PRÁCTICA

PROFESORA:Guillermina Castillo Rivera

ALUMNO:Mariana Del Carmen García Sandoval

NO. CONTROL:09070113

MATERIA:Tratamiento de Aguas Residuales

DETERMINACIÓN DE COLIFORMES FECALES Y TOTALESPROY-NMX-AA-042-SCFI-2005

CALIDAD DEL AGUA.-DETERMINACION DEL NUMERO MÁSPROBABLE (NMP) DE COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES

FECALES (TERMOTOLERANTES) Y ESCHERICHIA COLIPRESUNTIVA (CANCELARÁ A LA NMX-AA-042-1987)

INTRODUCCIÓN

La presencia y extensión de contaminación fecal es un factor importante en la determinación de la calidad de un cuerpo de agua. Las heces contienen una variedad de microorganismos y formas de resistencia de los mismos, involucrando organismos patógenos, los cuales son un riesgo para la salud pública al estar en contacto con el ser humano. El examen de muestras de agua para determinar la presencia de microorganismos del grupo coliforme que habitan normalmente en el intestino humano y de otros animales de sangre caliente, da una indicación sensible de dicho tipo de contaminación fecal. Dada la limitada capacidad de algunos miembros del grupo de organismos coliformes para sobrevivir en agua; sus números también pueden emplearse para estimar el grado de contaminación fecal.

PRINCIPIO DEL MÉTODO

El método se basa en la inoculación de alícuotas de la muestra diluida o sin diluir, en una serie de tubos de un medio de cultivo líquido conteniendo lactosa.Los tubos se examinan a las 24 y 48 horas de incubación ya sea a 35 a- 37°C. Cada uno de los que muestren turbidez con producción de gas se resiembra en un medio selectivo para confirmación.Se lleva a cabo la incubación de estos medios selectivos hasta por 48 horas a 35 - 37 °C para la detección de organismos coliformes y por 24 horas a 44.0 ± 1 °C para organismos coliformes fecales (termotolerantes) y E. coli.

Mediante tablas estadísticas, se lleva a cabo el cálculo del numero más probable (NMP) de organismos coliformes totales, organismos coliformes fecales (termotolerantes) y E. coli que puedan estar presentes en 100 mL de muestra a partir del número de tubos que den resultados confirmativos positivos.

OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta Norma Mexicana establece un método para la detección y enumeración en agua de organismos coliformes totales, organismos coliformes fecales (termotolerantes) y Escherichia coli presuntiva (E. coli) mediante el cultivo de un medio líquido en tubos múltiples y el cálculo de sus números más probables (NMP) en la muestra.

Este método es aplicable en todo tipo de agua, incluyendo aquellos que contienen una cantidad apreciable de materia en suspensión.La selección de las pruebas usadas en la detección y confirmación del grupo de organismos coliformes, incluyendo E. coli, puede verse como una parte de la secuencia continua. El grado de confirmación con una muestra en particular depende parcialmente de la naturaleza del agua y de las razones para realizar el examen. En la practica la detección de E. coli presuntiva, como se define en el punto 4.8 de esta norma da usualmente una indicación satisfactoria de la contaminación fecal.

REACTIVOS: Caldo Lactosado Caldo bilis lactosa verde brillante Medio EC.

MATERIAL Y EQUIPO

1 parrilla eléctrica Autoclave Incubadora para coliformes Baño maría Bata Cubre bocas 15 campanas Durham 15 tubos de ensayo 4 pipetas de 10 ml 1 pipeta de 5ml 1 pipeta de 1 ml 1 espátula 1 frasco bacteriológico 3 matraces de 125 ml 1 gradilla 1 perilla 1 agitador 1 matraz erlenmeyer de 500ml 1 vaso de precipitado de 50 ml 1vaso de precipitado de 250ml 1 vaso de precipitado de 500 ml

PLAN DE TRABAJO

Mayra y Juan de dios se encargaran de realizar la preparacion de los medios. Yuliana y nataly también se encargaran de realizar lavar, envolver el material y esterilizarlo.

Juan y yuliana realizaran las siembras.

PROGRAMA DE ACTIVIDADES

HORA ACTIVIDAD1 dia antes de la practica Lavando el material y esterilizando,

7:00am Tomar la muestra del paso del zacate8:00am Estar preparados con todo el equipo de

seguridad y los materiales que se utilizaran.8:15am Hablar de lo que se va realizar y despejar

dudas.8:20am Preparacion de los medio, lactosado9:00am Esterilizando el medio

10:00am sembrando11:00am Inoculando los medios de cultivo.

NOTA: SE TUVO QUE CONTINUAR EN HORAS EXTRA DEBIDO A QUE ES UN POCO LARGA. Y PORQUE SE TIENE QUE ESPERA PARA VER LOS CULTIVOS.

DIAGRAMAS

ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL.

Envolver todo el material con papel tipo estraza colocar en la olla de presión, al marcar la válvula 15 lb dejar 15 min mas sobre la parrilla sacar y guardar el material.

Preparar el caldo lactosado doble concentración;Preparar el caldo lactosado concentración sencilla.

Al tener las preparaciones de los caldos se verterán 10ml en 5 tubos del caldo de

doble concentración y 10ml en 10 tubos

del caldo de concentración sencilla

Al terminar la esterilización del medio, se

dejara enfriar y se procederá a hacer las

diluciones de la muestra y se hará la siembra.

Se cerraran bien y se pondrán a esterilizar en la olla de presión.

PRUEBAS PRESUNTIVASPreparación de la muestra e inoculación del medio.

ETAPA CONFIRMATIVA

Se miden con una pipeta otros 10ml de la dilución de la muestra anterior y se afora.

Para realizar la siembra se utiliza la tercera dilución.

Después de 24 horas se examinan los tubos. Aquellos que presentan una pequeña burbuja de gas dentro de las campanas Durham se consideran positivos.

Se va a agregar a los 5 tubos de concentración doble 10 ml de muestra, a 5 tubos con concentración sencilla se agregan 1 ml de muestra, y a los otros 5 tubos se les agrega 0.1 ml de muestra.

Incubar los tubos que no presenten formación de gas otras 24 horas.

De la dilución anterior se mide con la pipeta otros 10 ml y se vierte en un segundo matraz y se afora con agua esterilizada

Se mide con la pipeta de 10ml de muestra y se agregan a un matraz limpio y esterilizado, se

afora con agua esterilizada a 100.

Una vez preparados los medios colocamos 10 ml de caldo

verde brillante en cada uno de

los 10 tubos con campana

(tubos largos).

Se coloca 5 ml de caldo escherichia coli en cada uno de

los 10 otros tubos (tubos más pequeños)

Se prepara caldo bilis lactosa verde brillante y medio E.coli

Los ponemos a esterilizar

en la olla de presión,

cuando la válvula marque

a 15 lb de presión se deja por 15 min.

Una vez esterilizados los tubos y el

medio, se le afloja un poco la tapa y se dejan enfriar una vez enfriados se

prepara el área de trabajo para resembrar

Resembrar a partir de cada tubo de medio de aislamiento que muestre un resultado positivo en uno o más tubos de medio confirmativo para detectar la producción de gas e indol.

PRUEBA CONFIRMATIVA DE COLIFORMES FECALES

La formación de gas dentro de 48 horas de incubación total, constituye una prueba confirmativa de la presencia de

coliformes totales.

se acercan hacia el mechero los tubos que dieron positivos al caldo lactosado y se pasa uno a uno la boca por el mechero y se le

introduce el asa bacteriológica, esta de inmediato se introduce en el tubo con caldo verde brillante y

se tapa el tubo

PROCEDIMIENTO ESCRITO Y GRAFICO

Esterilización del material y el agua, preparación del caldo lactosado.

1. Se llego al laboratorio y se pidió el material a esterilizar2. Se procedió a lavar el material.

3. Se lleno la olla de presión para ponerla a precalentar y esté lista para empezar a esterilizar.

Se esteriliza el área de trabajo con alcohol, y se flamea la mesa, después el asa

bacteriológica la esterilizamos en el mechero

Se repite esta operación para los tubos restantes con caldo verde brillante.

se acercan hacia el mechero los tubos que dieron positivos al caldo lactosado y se pasa uno a uno la boca por el mechero y se le

introduce el asa bacteriológica, esta de inmediato se introduce en el tubo con caldo verde brillante y

se tapa el tubo

Se hace el mismo procedimiento para los 10 tubos que dieron positivos en caldo

lactosado y se repite la

operación descrita antes para hacer la resiembra en el caldo escherichia coli.

Al terminar la resiembra de los tubos con caldo verde brillante, estos se introducen en la estufa de incubación por un periodo de 48 hrs, y los tubos con caldo E.coli se introducen a incubación en baño maría y estos se dejan por un lapso de 24 hrs

4. El material lavado se envolvió en papel de estraza.

5. El material debidamente envuelto se puso en la olla de presión.

6. Se tapó la olla y se espero a que llegara a 15 lb de presión, después de que llego a esa presión se puso la parrilla eléctrica en el numero 7 y se mantuvo esa presión y esa determinada temperatura por 15 min.

7. Después de pasados los 15 min se espero a que la olla se depresionara y se abrió. 8. Se saco el material ya esterilizado y se guardo en la gaveta para el día de la siembra de la

muestra.9. De igual manera se esterilizo el agua que se ocuparía para preparar las disoluciones de la

muestra para la resiembra. 10. Después se pesaron los gr de caldo que se iban a necesitar para preparar los de doble

concentración y concentración sencilla.

11. Se prepararon 50 ml de caldo lactosado de doble concentración y 100 ml de caldo de concentración sencilla.

12. Se metieron los tubos de fermentación tipo Durham en los tubos de ensayo con tapón de rosca.

13. Se procedió a verter en los tubos de ensayo 10 ml de caldo lactosado de doble concentración en 5 tubos de

ensayo.

14. Se llenaron 10 tubos de ensayo con 10 ml de caldo lactosado de concentración sencilla.15. Se procedió a esterilizar el caldo en los tubos, metiéndolos a la olla de presión.

16. Después del tiempo adecuado en la olla (a 15 lb de presión durante 15 min), se sacaron de la olla y se verifico que no hubiera burbujas en las campanas Durham, en caso de tener se abrió poco y cerraba el tubo para sacar el aire en los tubos y se movía un poco el caldo. Tambien los enfriamos con agua, y utilizamos guantes para poder sostenerlos mientras los enfriábamos.

17. Después se pusieron los tubos en un vaso de precipitado de 2000 ml y se metieron al refrigerador para el día de la siembra.

Siembra de la muestra.18. Un miembro del equipo fue el día de la siembra por la muestra ya que debe de ser

analizada al instante, la muestra se recolecto en un frasco bacteriológico previamente esterilizado.

19. Se saco el resto del material esterilizado y se puso en la mesa.20. Se procedió a limpiar la mesa de trabajo con alcohol y se prendió el mechero Fisher.

21. Se saco una pipeta de 10 ml y el primer matraz, se vertieron 10 ml de la muestra en el matraz 1 y se aforó a 100 ml.

22. Después con otra pipeta esterilizada se tomaron 10 ml del primer matraz y se añadieron al 2do y se aforó también a 100 ml.

23. Con otra pipeta se midieron 10 ml del 2do matraz y se pusieron en un 3er matraz el cual también se aforo a 100 ml.

24. Del tercer matraz se tomaron las muestras para sembrar en el caldo lactosado, se inocularon 10 ml en 5 tubos con caldo lactosado de concentración doble, 5 tubos con caldo de concentración sencilla con 1 ml de la muestra del 3er matraz y por ultimo otros 5 tubos de concentración sencilla con 0.1 ml de muestra.

25. Después de sembrar la muestra en los tubos se metieron a la incubadora.

Resiembra:26. Se llego al laboratorio al día siguiente y se observó la presencia de burbujas en la

campana Durham por lo que se determino la presencia de coliformes en la etapa presuntiva.

27. Se observaron que solo 12 tubos eran positivos.28. Se prepara el material para empezar la etapa confirmativa, lavando los tubos y las

campanas que se van a utilizar.

29. Se hacen los cálculos para la preparación de los medios de bilis verde brillante y el E. Coli.

Cálculos:Verde Brillante:

40 gr ------------------------ 1000 ml X --------------------------- 120 mlX = 4.8 gr

E. Coli

37 gr ----------------- 1000 ml X --------------------- 120 mlX= 4.44gr

30. Se preparan los dos medios de cultivo y se comienzan a llenar los tubos.31. Los de verde brillante se llenan con 5 ml del medio preparado y los de E. coli con 10 ml.

32. Se ponen los tubos a esterilizar.

33. Después de la esterilización se procede a sembrar de nuevo los 24 tubos.34. Se limpia la mesa de trabajo para proceder a la resiembra. 35. Con ayuda de un haza bacteriológica se toma una muestra de los 12 tubos anteriormente

sembrados para efectuar la resiembra en los nuevos tubos para la etapa confirmativa.

36. Después de efectuada la resiembra los tubos de medio verde brillante se metieron a la incubadora y los de medio E. coli a baño María.

37. Se dejaron por 48 hrs y se observaron los tubos para observar la presencia de burbujas en las campanas Durham.

38. Después de la observación de los tubos se procedió a esterilizarlos, para posteriormente verter los residuos a la tarja del laboratorio.

CÁLCULOS Y FORMULAS

Se puede obtener el número más probable de coliformes fecales y totales por medio de una formula o buscando en las tablas anexadas en la Norma para coliformes.

La formula es:

NMP/100ml= No .de tubos positovos x100

√(ml demuestra en tubos negativos) (ml demuestra en todoslos tubos )

Tabla 1 Índice del NMP y límite confiable de 95 % para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan: 5 tubos con porciones de 10 mL, 5 porciones de 1 mL y 5 porciones de 0.1 mL

RESULTADOS DE TODOS LO EQUIPOS EN TABLA Y LAS NORMAS DE ANÁLISIS Y DEL LIMITE MÁXIMO PERMISIBLE, SEÑALANDO AL EQUIPO QUE PERTENECES.

RESULTADOS:

Tabla 2. Resultados grupales del NMP de coliformes en la etapa presuntiva caldo lactosado.

Equipo Cantidad de tubos

ConcentraciónDel caldo

Cantidad de

muestra [ml]

positivos ResultadoNMX-042

NMP/100 ml

1 5 Doble 10 5 2805 Sencilla 1 45 Sencilla 0.1 3

Tabla 3.1. Resultados grupales del NMP de coliformes en la etapa confirmativa verde Brillante



Cantidad de

muestra [ml]


NMP/100 ml


Tabla 3.2. Resultados grupales del NMP de coliformes en la etapa confirmativa medio E. coli



Cantidad de

muestra [ml]


NMP/100 ml


INTERPRETACIÓN Y ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

Tabla comparativa con la norma:

Etapa presuntiva, Caldo Lactosado:

Equipo # Resultado NMP/100 mL

Norma Máximo permisible NMP/100 mL

Cumple con la norma

Sí NoP.M

1 280 NOM-003-SEMARNAT-

1997

240

Etapa confirmativa:

Caldo Bilis Verde Brillante


Norma Máximo permisible

NMP/100 mL

Cumple con la norma

Sí NoP.M


1997

240

Medio E. coli


Norma Máximo permisible

NMP/100 mL

Cumple con la norma

Sí NoP.M


1997

240

CONCLUSIÓN Y BIBLIOGRAFÍA

El agua de rio, muestra el contenido de coliformes, un bajo contenido de coliformes deacuerdo a los resultados.Solo uno de los equipos no pudo realizar este análisis, puesto que su muestra de agua no dio positivo desde la etapa presuntativa, por lo tanto no continuaron con las prueba.

REPORTE DEL VOLUMEN DE RESIDUO GENERADO POR EQUIPO Y GRUPO.

1 litro aprox.

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Determinación de Coliformes Fecales y Totales