1 February 2014 | Volume 9 | Issue 2 | e88611

Dezvoltarea metodei transformării mediate a Agrobacterium tumefaciens în sensibila plantă Mimosa pudica

Hiroaki Mano1, Tomomi Fujii2, Naomi Sumikawa1¤a, Yuji Hiwatashi1,2¤b, Mitsuyasu Hasebe1,2*

1 Division of Evolutionary Biology, National Institute for Basic Biology, Okazaki, Japan, 2 School of Life Science, Graduate University for Advanced Studies, Okazaki, Japan

Abstract

Sensibila plantă Mimosa pudica reprezintă un punct de interes pentru cercetători datorită spectaculoaselor sale mișcări ale frunzelor ca răspuns al atingerii lor sau a unor stimuli externi. Deși variate aspecte ale mișcărilor ei au fost elucidate prin demersuri histologice, fiziologice, biochimice și comportamentale, lipsa materialelor/metodelor genetice au restrâns investigația mecanismelor moleculare implicate în aceste procese. Pentru a sări peste acest obstacol, s-a dezvoltat o metodă de transformare genetică pentru M. pudica mediată de Agrobacterium tumefaciens. S-a descoperit că nodul cotiledonar al explantului se potrivește cu transformarea mediată de Agrobacterium datorită înaltei sale capacități de a forma muguri, ceea ce a fost indus cel mai eficient într-un mediu ce conținea 0.5 mg/ml de citochinină sintetică, 6-benzilaminopurină (BAP). Înrădăcinarea mugurilor regeneranți a fost eficient indusă prin cultivarea pe mediu umed spongios. Întreaga procedură pentru generarea plantelor transgenice a obținur o frcvență de transformare de 18,8%, ceea ce este comparabil cu frecvențele obținute la alte legume sensibile, cum ar fi soia (Glycine max) și mazărea (Pisum sativum). Gena străină a fost integrată în genomul gazdă și a fost transmisă de-a lungul generațiilor, fără a afecta mișcările plantei. Această metodă de transformare oferă un mecanism genetic pentru a studia genele implicate în realizarea mișcărilor plantei Mimosa pudica.

Citation: Mano H, Fujii T, Sumikawa N, Hiwatashi Y, Hasebe M (2014) Development of an Agrobacterium-Mediated Stable Transformation Method for theSensitive Plant Mimosa pudica. PLoS ONE 9(2): e88611. doi:10.1371/journal.pone.0088611

Editor: Boris Alexander Vinatzer, Virginia Tech, United States of America

Received October 29, 2013; Accepted January 7, 2014; Published February 12, 2014

Copyright: 2014 Mano et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Comm o ns Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.

Funding: This work was supported in part by Grants-in-Aid for scientific research from Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology and Japan Society for the Promotion of Science, Japan. https://www.jsps. g o.jp/english/e-grant s/. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.

* E-mail: mhaseb e @nibb.ac.jp

¤a Current address: Electronics-Inspired Interdisciplinary Research Institute, Toyohashi University of Technology, Toyohashi, Japan¤b Current address: National Plant Phenomics Centre, Institute of Biological, Environmental and Rural Sciences, Aberystwyth University, Aberystwyth, UnitedKingdom

Introducere

Fiind fixate în sol, plantele înrădăcinate au dezvoltat o varietate de strategii pentru a supraviețui factorilor de stres externi. În lipsa sistemelor muscular și nervos, ce joacă rolul principal în motilitatea animală, unele plante au dobândit abilitatea de a efectua mișcări rapide ale frunzelor ca și răspuns la stimulii externi [1]. Frunzele speciei leguminoase Mimosa pudica efectuează mișcări în câteva secunde [2] de la atingerea lor sau supunerea lor la alte tipuri de stimulări [3]. Această mișcare rapidă pare să reducă r iscuri le unui a tac [4] speri ind prădător i i [1], micșorând astfel zona de vizibilitate a frunzelor [1] sau expunerea spinilor protectori care sunt de obicei situați în spatele frunzelor [5]. Acest mecanism fiziologic al mișcării plantei a fost studiat intens încă din secolul 19 [6]. Aceste mișcări sunt cauzate de o rigidizare a celulelor datorită absorbției apei într-o jumătate a internodului [7], ce este situat la baza fiecărui pețiol primar [6].

Imaginile RMN (Rezonanță magnetică nucleară) au demonstrat că apa este translocată de la jumătatea extensoare către cealaltă jumătate (flexoare [7]) a internodului în timpul mișcării [8]. La nivel celular, celulele din jumătatea extensoare a internodului se contractă urmând evacuarea apei intercelulare [9,10], proces ce este acompaniat de o mare ejecție de ioni de K+ și Cl- [11,12,13,14]. Aceste mișcări rapide ale apei și ionilor sunt dificil de explicat printr-un simplu model de difuzie [12,15], sugerând acel special mecanism, cum ar fi co-transportorii sau proteinele contractile ce sunt implicate în acest proces [15]. Studii farmacologice și citologice indică faptul că prin fragmentarea citoscheletului [16,17], defosforilarea reziduurilor de tirozină [17,18], și schimbări la nivelul Ca2+ [10,19] în celulele internodale participă în mișcarea plantei. Reacția de mișcare poate fi propagată pe o anumită distanță de către acțiunea unui potențial electric [20], care mai apoi este transmis prin țesutul lemnos [20,21] și prin țesutul liberian [22]. Substanțele chimice contribuie și ele de asemenea în transmiterea pe scară largă a mișcărilor [23].

Agrobacterium-Mediated Transformation of M. pudica

În ciuda multelor progrese în înțelegerea fiziologiei mișcărilor plantei Mimosa pudica,mecanismele genetice ce subliniază acest fenomen rămân încă nedescoperite din cauza lipsei mijloacelor genetice pentru această specie. Până acum, u exista nicio tehnică pentru introducerea genelor dorite în genomul plantei. Transformarea genetică mediată cu Agrobacterium este foarte folosită pentru a genera plante transgenice [27] și este o technică bine stabilită în modelarea unor leguminoase ca Medicago truncatula [28] ș i Lo tus j apon icus [29]. However, Totuși, transformarea altor leguminoase “recalcitrante”, inclusiv Mimosa pudica rămâne o provocare din cauza frecvenței scăzute a formării mugurilor in vitro și din cauza dificultății transferării genelor în celulele generatoare de muguri [30,31,32].

În aceste studiu s-a dezvoltat o metodă eficientă de transformare mediată cu Agrobacterium în Mimosa pudica. Pentru a evita obstacolele descrise mai sus s-a examinat frecvența formării mugurilor la mai multe tipuri de explante și s-a selectat explantul nodal cotiledonar ca și material de început deoarece formează muguri la cea mai înaltă frecvență față de restul explantelor testate. S-a descoperit că vectorul super-binar pSB111 [33], ce arată îmbunătățiri ale transformării datorită prezenței unor gene virulente [34], crește numărul celulelor transformate în nodul cotiledonar. Mai mult, s-a demonstrat că, controlarea pH-ului în timpul cultivării este necesară pentru o transformare eficientă. Metoda eficientă de transformare stabilită pentru Mimosa pudica poate fi folosită pentru a continua studii genetice cu privire la mișcările acestei plante.

Materiale și metode

Conceperea vectorilor T-ADN și prepararea celulelor de Agrobacterium

Un fragment de ADN ce conținea secvența de codificare a proteinei sintetice verde fluorescentă (sGPF) [35] a fost amplificată prin PCR din pUGW4 [36] folosind o pereche de primeri (59-AAAGT CGACT CGTGA GCAAG GGCGA GGAG-39 și 59-TTGAG CTCTT ACTTG TACAG CTCGT CCATG C-39) și subclonată în vectorul pCR-Blunt II-TOPO (Life Technologies, Carlsbad, USA). Un fragment de ADN ce conținea primul intron al genei CAT-1 [37] a fost amplif icat din pIG121-Hm [38] cu primerii (59-CTAAG CTTCG CAAGA CCCTT CCTC-39 și 59-ATTTC ACGGG TTGGG GTTTC TACAG GACG T-39), digerat apoi cu SalI și XbaI, și inseraț i în si tul SalI/XbaI din construcția pCR-Blunt II-sGFP. Apoi, un fragment de ADN ce conținea intronul regiunii GFP a fost tăiat prin digestia cu SacI și XbaI, și inserat în situl SacI/XbaI al pIG121-Hm pentru a produce vectorul pIF121-Hm, care în secvența de codificare a genei beta-glucoronidază (uidA) [39] a fost înlocuită cu cea a sGFP. pIF121-Hm a fost apoi introdus în 4 tulpini diferite de Agrobacterium tumefaciens (AGL1, GV2260, EHA101, și LBA4404 [40]) prin electroporare. Un vector super-binar, pSB111-GFP, a fost realizat după metoda lui Komari et al. [33], c u m o d i f i c ă r i l e d e s c r i s e m a i s u s .

Pregătirea cultivării

Mediul de germinare conținea în jumătatea bazală săruri MS (Murashige and Skoog) (1/2 MS; Wako, Osaka, Japan) și 0.2% (w/v) gel (Phytagel; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) la un pH d e 5.8. Mediu l de inducere a mugur i lo r conținea 1/2 MS, 2% (w/v) sucrose, 16 vitamine Gamborg (Sigma-Aldrich), 0.5 mg/ml 6-benzilaminopurină (BAP; Sigma-Aldrich),

și 0.3% gel la un pH d e 5.8. Mediul de selecție a fost preparat prin suplimentarea mediului de inducere a mugurilor cu 15 mg/ml higromycină B (Sigma-Aldrich) și 150 mg/ml sare de cefotaxime (Sanofi K.K., Tokyo, Japan). Mediul de co-cultivare conținea 1/2 MS, 2% sucroză, 16 vitamine Gamborg, 0.5 mg/ml BAP, și 0.1% (w/v) 2-(N- morpholino) acid ethansulfonic (MES; Dojindo Laboratories, Kamimashiki-gun, Japan) la un pH d e 6.1. PH-ul a fost ajustat cu KOH sau HCl. Sterilizarea mediului s-a realizat prin autoclavare la 120uC timp de 20 min sau alternativ, prin filtrare prin membrană 0.22-mm PES PLUS (Asahi Glass, Tokyo, Japan) sau 0.45-mm membrană PVDF (Millex HV; Merck-Millipore, Billerica, USA).

Sterilizarea semințelor

Semințele de Mimosa pudica au fost cumpărate din Sakata Seed (Yokohama, Japan). Aproximativ 400 de semințe au fost bine spălate în 20 ml de etanol de concentrație 70% și puse apoi în vid timp de 10 min în altă soluție de etanol 20 ml de concentrație 70%. Apoi semințele au fost transferate în 20 ml de soluție înălbitor din comerț (TOPVALU Kitchen Bleach; Aeon, Chiba, Japan) ce conținea NaClO, NaOH, și oxid-alkylamine, la concentrații nespecificate de către compania producătoare, puse apoi în vid timp de 10 minute și spălate iar în 20 ml înălbitor de concentrație 50% timp de 30 min cu vibrații de 120 rpm. S e m i n ț e l e a u f o s t c l ă t i t e c u a p ă c a l d ă s t e r i l i z a t ă (60uC) de cel puțin 5 ori și înmuiate apoi în 18 ml apă caldă (60uC) t i m p d e 1 0 m i n . După adiția a 2 ml de PPM (Plant Preservative Mixture; Plant Cell Technology, Washington DC, USA), semințele au fost vidate timp de 10 minute și supuse rotațiilor la 120 rpm timp de 30 min. S e m i n ț e l e a u f o s t p u s e î n t r - u n v a s P e t r i (din plastic, de dimensiuni 606606100 mm; Asahi Glass, Tokyo, Japan) ce conținea 80 ml de GM, lăsate la germinat 25uC timp de 54 până la 60 de ore în întuneric. Puieții cu lungimi de 3-8 mm au fost utilizați pentru experimentele următoare.

Pregătirea explantelor și optimizarea condițiilor de inducere a mugurilor

Explantele au fost pregătite sub un microscop de disecție într-un cabinet cu flux laminar. Puieții au fost împărțiți pe 3 hârtii de filtru înmuiate în COM în vase Petri. După ce învelișul exterior al semințelor a fost înlăturat cu forcepsul, rădăcina primară și cotiledoanele au fost separate de partea rămasă a puietului folosind un bisturiu chirurgical (No. 11; Feather, Osaka, Japan) (Figure 1). Șaisprezece explante au fost plasate pe SIM (25 ml într-un vas 90620 mm) sau derivații acesteia care conțineau concentrații diferite de fitohormoni. Explantele au fost cultivate în cicluri la 25uC sub 12 ore de lumină (12L; cu o intensitate a luminii de 120-180 mmoli m22 s21) / 12 ore întuneric (12D), iar mediul a fost schimbat la fiecare 2 săptămâni. Un Număr de lăstari egal sau mai mare de 2 mm a fost înregistrat pe fiecare explant după 4 sau 6 săptămâni de cultivare.

Transformarea

O porțiune din stocurile de Agrobacterium au fost brăzdate pe un mediul solid LB ce conținea 50 mg/ml higromicină B și cultivate la 30uC timp de 48-60 ore. O singură colonie a fost inoculată în 5 ml de mediu LB lichid conținând 25 mg / ml higromicină B și precultivate la 28uC timp de 24 de ore cu agitare rotativă la 180rpm. După ce agregate mari au fost

Agrobacterium-Mediated Transformation of M. pudicaeliminate prin depunere gravimetrică, cultura lichidă de Agrobacterium a fost din noi inoculată în 40 ml de mediu LB proaspăt lichid conținând 25 mg / ml higromicină B într-un balon de 200 ml la o concentrație de OD600 = 0.15. Apoi, cultura

a fost incubată la 28uC cu agitare rotativă de 180 rpm timp de aproximativ 4 ore. Celulele de Agrobacterium au fost recoltate apoi prin centrifugare la 5000g timp de 10 min la 25uC, înmuiate în 20 ml COM, centrifugate din nou. În final, suspensia Agrobacterium a fost suplimentat cu 40 mg / ml acetosiringonă, 0,2% (greutate / volum) D-glucoză, și, în unele cazuri, 0,03% (v / v) Silwet L-77. 20 dintre nodurile cotiledonare ale explantelor au fost înmuiate în 10 ml de suspensie de Agrobacterium cu (sau fără) 0,03% Silwet L-77 într-o eprubetă de sticlă (16.56165 mm). În unele cazuri, explantele au fost tratate cu ultrasunete cu o Branson Sonifier 150 (Branson Ultrasonics, Danbury, SUA) cu cât 3 pulsări cu durată de 5 secunde la puterea de ieșire maximă (14 W). Explantele au fost menținute sub presiune normală sau de vid (20,8 MPa) timp de 10 minute și apoi au fost colectate cu un filtru de ceai. Explantele au fost transferate într-un vas de plastic (90615 mm) ce conținea 10 ml de suspensie de Agrobacterium fără Silwet L-77. Alternativ, explantele au fost transferate direct în vasul de plastic fără a suferi sonicizare, vid, sau tratament Silwet L-77. Apoi vasul a fost sigilat cu Parafilm (Bemis, Neenah, SUA) și cultivat timp de 3 zile la 25uC în întuneric. Pentru a monitoriza schimbările de pH în mediu de co-cultivare, 200 ml de mediu a fost luat ca probă la un anumit interval de timp și pH-ul a fost măsurat cu ajutorul unui pH-metru compact (Twin pH AS-212; As One, Osaka, Japan). După co-cultivare, explantele sunt transferate la SEM (25 ml într-un vas 90615 mm) cu forcepsul. Fiecare explant a fost ulterior cultivat pe SEM până la un calus-GFP pozitiv ce a crescut 2 mm lungime. Calusul-GFP pozitiv a fost chirurgical excizat din explant și împodobit de țesut GFP- negativ. Calusul excizat a fost cultivat pe SEM timp de încă 5 zile și apoi cultivat pe SIM (25 ml într-un vas de 90620 mm), cu mediul schimbat la fiecare 5 zile. După inițierea alungirii, calusul a fost transferat într-un vas conținând 80 ml de SIM și a continuat să fie cultivat, cu mediul schimbat la fiecare 10 zile, până când lăstarii au dezvoltat cel puțin două frunze compuse.Inducerea rădăcinii și formarea plantelor întregi A fost turnat Vermiculit (Fujimi Engei, Shizuoka, Japonia) într-un vas la o adâncime de aproximativ 3 cm, sterilizat prin autoclavare, și apoi irigat cu apă sterilizată, mediu de cultivare, sau soluție fitohormon. Mediul de cultivare și apa au fost consolidate cu 0,3% și 1,5% Phytagel, respectiv, au fost preparate (80 ml per vas). Diferite concentrații de Phytagel au fost folosite pentru mediul de cultivare și de apă din cauza dificultăților de solidificare a mediului la concentrații scăzute de sare. Explantele regenerate de 2 până la 3 cm lungime și care aveau două sau mai multe frunze compuse, au fost tăiați cu foarfeca de disecție și plasațo pe vermiculit sau mediu gumă gelan într-o matrice 3x3 pentru fiecare cutie. Lăstarii au fost păstrați la 25uC sub 12L (cu o lumină de intensitate 120-180 mmoli m22 s21) / 12D cicluri fără schimbarea mediului și astfel rădăcinile formate de lăstari au fost numărate și măsurate la fiecare 7 zile. Douăzeci și șapte de explante care se dezvoltă din trei explante independente (n = 9 fiecare) au fost examinate pentru fiecare condiție experimentală. Când lungimea rădăcinii exlpantei regenerate a atins 3 cm lungime, plantula a fost transferată într-un vas de plastic moale (75x65 mm) care conținea un volum egal de sol cu cel de cultură granulată (Nippi Engei Baido 1; Nihon Hiryo, Tokyo, Japonia) și vermiculit. Au fost cultivate la 27uC sub

14L (cu o intensitate a luminii de 50-120 mmol m22 s21) / 10D cicluri timp de aproximativ 1 lună și apoi transferate într-un vas mai mare (120x100 mm). Nutrient lichid(Grad ridicat Hyponex, Hyponex Japonia, Osaka, Japonia) a fost ocazional adăugat după ce inflorescențe au devenit vizibile. Fiecare inflorescență a fost închisă într-un mic sac de plastic cu 1 zi înainte de înflorire și de autopolenizare. Semințele colectate au fost depozitate la temperatura camerei într-un desicator.

Analiza Southern blot

Pentru extracția ADN-ului genomic, frunze imature au fost prelevate. Frunzele (100-200 mg greutate în stare proaspătă) au fost congelate în azot lichid și zdrobit până la o pulbere fină cu un mojar cu pistil. Soluția astfel rezultată a fost transferată într-un tub conic de 50 ml, combinat cu 20 ml de tampon CTAB 26 [2% (m / v) bromură de hexadeciltrimetilamoniu (CTAB), 1,4 M NaCl,EDTA 20 mM, 100 mM Tris-HCl (pH 8,0)], care a fost încălzită doar până sub punctul de fierbere, și centrifugată imediat. Apoi proba a fost suplimentată cu 0,1% (v / v) 2-mercaptoetanol și s-a incubat la 60uC timp de 1 oră cu agitare reciprocă la 80 rpm. După adăugarea a 20 ml de cloroform, eșantionul a fost amestecat pe un rotator timp de 10 min și s-a centrifugat la 10,000g timp de 30 minute la 25uC. Partea apoasă superioară a fost transferată într-un tub nou, suplimentat cu 1/10 volum de 10% (g / v) care conținea CTAB 0,7 M NaCl, și re-extrasă cu cloroform. Probasoluție a fost combinată cu un volum egal de 2-propanol și centrifugată la 10,000g timp de 30 min la 25uC. Precipitatul a fost clătit cu 5 ml de etanol 70%, timp de 10 min, și s-au resuspendat în 400 ml de TE uscat la aer [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA] conținând 0,1 mg / ml RN-ază. Proba a fost incubată la 37uC timp de 1 oră cu agitare reciprocă la 80 rpm, apoi suplimentată cu 1 mg / ml proteinază K, și în continuare incubată la 56uC timp de 30 min cu agitare. ADN-ul genomic din extract a fost purificat (Qiagen, Venlo, Olanda) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Fragmente de ADN genomic digerate cu EcoRI (5 mg pe bandă) au fost supuse electroforezei în 0,7% SeaKem GTG agaroză (Takara Bio, Otsu, Japonia), în 16 ml tampon TAE. Apoi fragmentele de ADN au fost transferate pe o membrană Hybond N + (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) folosind vidul VacuGene XL Sistem Blotting (GE Healthcare). Hibridizarea Southern a fost realizată folosind AlkPhos și sistemul de detectare cu CDP-Star (GE Healthcare). Sonda ADN sGFP a fost preparată prin PCR cu primeri (59-ATGGT GAGCA AGGGC GAGGA GC-39 și 59-TTACT TGTAC AGCTC GTCCA TGCC-39) și vectorul pSB111-GFP a fost utilizat ca matriță. Hibridizarea și spălările primare ulterioare au fost efectuate la 55uC și 65uC. Semnalele de hibridizare au fost detectate folosind un analizator de imagine LAS- 3000 Mini luminescent (Fujifilm, Tokyo, Japonia).

Rezultate

Optimizarea condițiilor de inducere a lăstarilorS-a examinat formarea lăstarilor de la mai multe explante provenite de la răsaduri M. pudica în vârstă de 2 zile (Figura 1). După o cultivare de 4 săptămâni în prezența a 0,5 mg / ml 6-benzilaminopurină (BAP), 97% (31 din 32) din hipocotile s-au asociat cu nodul cotiledonar (Figura 1D), denumite în continuare explante nod cotiledonare, au format lăstari în jurul nodului (Figura 1F, H). Frecvențe mai mici de formare a lăstarilor au fost observate la cotiledoane izolate (5 din 32) și la hipocotile (10 din 32), și formarea lăstarilot nu a avut

Agrobacterium-Mediated Transformation of M. pudicaloc în jumătățile bazale ale hipocotile, rădăcini, sau cotiledoane care nu aveau pețiol (Figura 1 H). Aceste rezultate indică faptul că țesuturile în și din jurul nodurilor cotiledonare de M. pudica au capacitatea de a forma muguri, la fel ca cele ale altor specii leguminoase [30,31,32].

Concentrațiile optimizate în acest studiu (fitohormoni și citokinina BAP), afectează numărul de lăstari formați pe nodul

cotiledonar în alte leguminoase [41,42,43]. Lăstarii au fost induși mai eficient pe nodul cotiledonar în prezența a 0,5 mg / ml BAP. Frecvența de formarea de explante cotiledonare pețiolate a fost examinată, de asemenea, la diferite concentrații de fitohormoni, dar numai 2.160.4 formează pe explant sau mai putine au fost induse, chiar și după o perioadă mai lungă de cultivare (n = 32; 6 săptămâni; Figura 1J).

Figura 1. Formarea explantelor de M. explante pudica. A-E. Pregătirea explantelor. Un răsad de 2 zile cultivat în întuneric (A) a fost împărțit în rădăcină, cotiledoane cu pețiol (B), și partea rămasă (C). Liniile punctate în (A), (C), și (E) indică pozițiile de tăiere. Cercul de la (D) indică poziția nodului cotiledonar. Hc, hypocotyl. F, G. Formarea nodului cotiledonar (F) și cotiledon pețiolat (G) Explantele după 4 și 6 săptămâni de cultivare în prezența a 0,5 mg / ml BAP (H). Compararea frecvenței explantelor ce formează lăstari după 4 săptămâni de cultivare cu 0,5 mg / ml de BAP (n = 32). I, J. Efectele BAP și NAA privind formarea nodului cotiledonar (I) și cotiledon pețiolat (J) Explante după 4 și 6 săptămâni de cultivare. Distribuția numărului de lăstari formați per explant (n = 32). Limitele inferioare și superioare indică intervalul de valori în decurs de 1,5 ori în intervalul intercuartilic de la centru și cercurile indică aberanțe. S-au observat diferențe semnificative între cele două grupuri [P, 0,05 de testul Fisher cu reglare P-valoare Holm lui (H) sau testul-Steel Dwass (I, J)]. Baruri Scale, 1 cm (A, F, G), 1 mm (B-D). doi: 10.1371 / journal.pone.0088611.g001

Pe baza acestor observații, nodul cotiledonar a fost selectat ca țesutul țintă pentru infecția cu Agrobacterium, și explante fost cultivate în mediu suplimentat cu 0,5 mg / ml BAP în experimentele ulterioare. Transformarea mediată cu Agrobacterium a nodurilor cotiledonare

Pentru transformarea mediată cu Agrobacterium a celulelor nodurilor cotiledonare,s- au pregătit două tipuri de vectori binari: un vector convențional binar, pIF121-Hm, și un vector super-binar, pSB111-GFP, care posedă genele de virulență suplimentare [33,34]. Regiunea T-ADN al fiecărui vector poartă o genă reporter intron-sGFP (Figura 2A), care poate fi folosită pentru a vizualiza selectiv celulele transformate în țesuturile vegetale vii, dar nu etichetează celulele Agrobacterium [37]. Infecția cu Agrobacterium tumefaciens este declanșată de activarea transcripțională a genelor sale virulente [44] ca răspuns la compuși fenolici, cum ar fi acetosiringonă [45], monozaharide [46,47]. Am examinat astfel efectele suplimentării mediului de co-cultivare cu acetosiringonă, D-glucoză, și MES tampon ajustat la pH 5.8, singur sau în combinație, privind eficiența transformării (Figura 2B). Numărul de semnale GFP-pozitive în nodul cotiledonar au crescut în prezența acetosiringonei și MES (Figura 2B). Deși adăugarea de glucoză a crescut în continuare eficiența transformării explantelor tratate cu acetosiringonă și tampon MES, creșterea nu a fost semnificativă (Figura 2B). Cu toate acestea, întrucât adăugarea de glucoză are un potențial de a crește eficiența de transformare, s-au folosit toți cei trei compuși în experimentele ulterioare. O comparație a doi vectori binari și tulpini de Agrobacterium a demonstrat că eficiența de transformare a fost mai mare atunci când pSB111-GFP a fost combinat cu tulpina Agrobacterium LBA4404 decât atunci când pIF121-Hm fost combinat cu oricare din cele patru tulpini de Agrobacterium diferite (Figura 2C). Aceste rezultate sugerează că adăugarea de ingone acetosyr și a unui tampon capabil să mențină un pH acid poate spori eficiența transformării lui M. pudica, la fel ca și utilizarea unui vector super-binar. Am evaluat mai mult efectul pH-ului asupra infecției cu Agrobacterium. După cum a fost raportat anterior [49], adăugarea de MES pe suporturi de cultivare a redus cantitatea de schimbări de pH în timpul autoclavării (Figura S1A). Cu toate acestea, scăderea pH-ului după autoclavare nu a fost cauza directă a eficienței infecției, deoarece nodurile cotiledonare de explante cultivate pe filtre sterilizate și mediu fără buffer nu au avut aproape niciun semnal pozitive, la fel ca și cele cultivate pe autoclavizat, mediu non -buffered (Figura S1B). O scădere similară a pH-ului a fost observată în mediul non-tamponat care conținea numai Agrobacterium, dar nu singur sau în mediu care conține numai explante (Figura 3A), sugerând că acidifierea vizibilă a mediului de co-cultivare a fost cauzată în principal de Agrobacterium în mediu . Pentru a îmbunătăți în continuare eficiența transformării, s-au examinat efectele sonicării [51] și infiltrarea în vid [52] înainte de perioada de co-cultivare. Comparativ cu experimentul de control nici unul din tratamentele individuale sau combinate, nu au modificat în mod semnificativ numărul de semnale GFP-pozitive după 10 zile de selecție (Figura 2E). Pe de altă parte, numărul de explante formează muguri GFP-pozitivi (Figura 2F). O creștere semnificativă, a fost observată în cazul explantelor tratate numai cu Silwet L-77 (Figura 2F), sugerând că detergentul facilitează infectarea cu celule de Agrobacterium care sunt

capabile de a forma lăstari, care sunt situați adânc în interiorul nodului cotiledonar.Utilizarea suplimentară de iradiere sonoră și / sau vid, în combinație cu tratamentul Silwet L-77 a redus apariția de muguri GFP pozitivi (Figura 2F), posibil datorită daunelor crescute a celulelor de la nodul cotiledonar. Luate împreună, eficiența de transformare a nodului cotiledonar de M. pudica a fost mult îmbunătățită prin trei factori diferiți: utilizarea vectorului super-binar, adăugarea de tampon MES la mediul de co-cultivare și tratamentul tranzitoriu cu Silwet L-77 înainte de co-cultivare.

Inducerea rădăcinii și formarea plantelor întregi

După o lună sau mai mult de selecție cu higromicină B, celulele transformate în nodul cotiledonar au format calusuri-GFP pozitiv cu muguri (Figura 2I-J). Aceste calusuri au fost chirurgical izolate din explantele și au continuat să fie cultivate pe SIM pentru dezvoltarea ulterioară a mugurilor (Figura 2K-M). Lăstarii bine dezvoltați ce posedau cel puțin două frunze compuse (figura 4A, B) au fost utilizați într-un experiment de inducție a rădăcinii în trei condiții (apă, 1/2 MS, sau jumătate MS care conțineau zaharoză și vitamine) și două materiale de sprijin (gumă gelan sau vermiculit). Pentru ambele materiale de sprijin, mai mari randamente de inducție a rădăcinii s-au obținut cu apă decât cu mediul de cultivare MS (Figura 4E), sugerând că în condițiile precare de nutrienția fost favorizată înrădăcinarea. Vermiculitul a crescut eficiența de inducție a rădăcinii într-o măsură mai mare decât a făcut guma gelan (Figura 4E), posibil datorită permeabilității îmbunătățită a aerului [55]. Rădăcinile au fost induse cel mai eficient de vermiculitul alimentat cu apă, care a dus la înrădăcinare de 81% (22 din 27) din lăstari regenerați după 21 de zile de cultivare (Figura 4E). Această eficiență, împreună cu faptul că lăstarii transformați pot fi ușor înmulțiți pe cale vegetativă pe SIM, asigură inducerea rădăcinii pe aproape toți lăstarii transformați. S-au examinat, de asemenea, efectele a trei auxine, NAA, indol-3-acetic (IAA), și indol-3- butiric (IBA), toate acestea au fost utilizate pentru inducerea rădăcinii în diferite plante [43,56,57, 58]. Nici unul dintre acești compuși, totuși, nu au îmbunătățit eficiența inducției rădăcinii (Figura 4E). Plantulele rezultate au fost transferate la sol după ce rădăcinile lor au ajuns la 3 cm lungime totală (Figura 4C, D). Folosind condițiile optimizate descrise mai sus, am evaluat eficiența de transformare a speciei M. pudica pe parcursul întregii proceduri. Un total de 160 de explante nod cotiledonare au fost supuse la transformarea mediată cu Agrobacterium, și monitorizate timp de 12 luni de la co-cultivare (Figura 5A). 63% (101 din 160) din explante au format calusuri-GFP pozitiv în timpul selecție și mai mult de jumătate din ele (57 din 101) au inițiat alungirea lăstarilor pe SIM. 42 din cei 57 de muguri au dezvoltat două sau mai multe frunze compuse și 30 din aceștia s-a înrădăcinat cu succes și au devenit stabili în sol. Numărul de plante transgenice T0 a continuat să crească chiar și după 12 luni de cultivare (Figura 5A), sugerând că creșterea este eficientă și mai mult în timp. Pe de altă parte, patru plante T0 independente (derivate de la 2,5% din explantelor) a devenit stabile în mai puțin de patru luni (Figura 5A), permițându-ne să recuperăm descendenții lor T1 într-un timp de 8 luni (Figura 5B).

Analizele moleculare și biologice ale plantelor transgenice

S-a efectuat o analiză genomicp Southern blot pe plante regenerate T0 utilizând secvența sGFP ca sondă (Figura 2A).

Printre cele 13 linii independente testate, aproximativ două treimi din plantele transgenice (9 din 13) posedă o singură inserție ADN-T, în timp ce ceilalți (4 din 13) au avut două inserții (Figura 6). Acest model simplu de inserție reprezintă un avantaj al prezenței metodei biolistice, care este folosită pentru a transforma alte specii leguminoase [30,31], dar care de multe ori duce la modele complexe de inserții de ADN [59,60]. Transmiterea transgenei la descendenții T1 a fost confirmată în toate liniile testate (n = 10) prin observarea fluorescenței GFP (Figura 5C).În cele mai multe cazuri (9 din 10), raportul de segregare a fluorescenței GFP într-o descendență T1 refăcută a fost în bună concordanță cu cel așteptat de la numărul de inserții T-ADN (S1 Tabelul 3: 1 și 15: 1 pentru unul și două inserții T-ADN, respectiv). Aceste rezultate prezintă alte dovezi pentru simplitatea de modele de inserție ADN-T produse prin prezenta metodă și indică, de asemenea, natura non-himeră a fiecărei plante T0. Transmiterea transgenei la descendenții T2 a fost de asemenea confirmată de o linie testată (figura 5D), demonstrând transmiterea stabilă a transgenelor între generații. În cele din urmă, plantele transgenice au fost examinate pentru capacitatea lor de a suferi mișcări caracteristice. Toate plantele T0 (n = 70) și T1 (n = 10) au arătat mișcare de circulație ca răspuns la atingere. În concluzie, studiul de față oferă un instrument genetic pentru a investiga mecanismele moleculare care stau la baza mișcările interesante de M. pudica.

Discuții

În acest studiu, s-a dezvoltat un protocol robust pentru transformarea genetică a M. pudica. O îmbunătățire cheie pentru transformarea cu succes a M. pudica fost folosirea tamponului MES pentru a menține pH-ul în timpul co-cultivării. Deși activarea dependentă de pH de gene de virulență Agrobacterium a fost demonstrat anterior [48,50] și în mai multe studii au subliniat importanța de agenți de tamponare în mediul de co-cultivare [61,62], obligația de a stabiliza pH-ul cu agenți de tamponare pare să depindă de sistemul de transformare utilizat. Deși activarea dependentă de pH a genelor de virulență Agrobacterium a fost demonstrată anterior [48,50] și mai multe studii au subliniat importanța agenților de tamponare în mediul de co-cultivare [61,62]; obligația de a stabiliza pH-ul cu agenți de tamponare pare să depindă de sistemul de transformare utilizat. De exemplu, doar un sfert (17 din 67) dintre metodele de transformare pronunțate într-un protocol de carte [27], care acoperă o gamă largă de specii de plante și sisteme de transformare descrie utilizarea reactivilor tampon în timpul preparării Agrobacterium și / sau co-cultivării. Această variabilitate poate fi din cauza diferențelor față de alte condiții care eventual, afectate stabilitatea pH-ului, cum ar fi compoziția mediului de co-cultivare, speciile de plante și țesuturile folosite, tulpinile tumefaciens, și procedurile utilizate pentru a le prepara. Deși un studiu anterior a raportat că MES reduce eficiența de transformare [63], prezentul studiu indică faptul că controlul pH-ului cu agenți de tamponare pot îmbunătăți eficiența de transformare mediată de Agrobacterium. Direcția de schimbare a pH-ului, de asemenea, variat, cu sistemul de transformare utilizat; pH-ul a scăzut sub 4,5 într-o trompetă crin (Lilium x formolongi) sistem [62] și studiul de față, întrucât aceasta a crescut la 7,2 într-o fasole Tepary (Phaseolus acutifolius) [61]. Aceste observații, împreună cu constatarea că pH-ul inițial optim al mediului de co-cultivare (pH 6,1) a fost diferit de cele raportate pentru activarea maximă a genelor de virulență în alte tulpini de tip octopin (pH 5.2-5.3) [48,50 ], indică importanța optimizării pH-ului pentru fiecare sistem de transformare. Eficiența transformarării în studiul de față (18,8%) este

comparabilă cu eficiența obținută pentru studiile extensive, pe legume recalcitrante, cum ar fi soia (16,4%) [64] și mazărea (13,5%) [65]. Acest nivel de eficiență de transformare este suficient pentru analizele transgenice convenționale care introduc un număr limitat de secvențe ADN străine de interes. Pe de altă parte, o îmbunătățire suplimentară a metodei poate fi necesară pentru proiectii genetice de mare randament, cum ar fi prin inserție mutageneza [66], care se bazează pe un număr mare de plante transgenice. O altă abordare posibilă ar fi de a crește eficiența infecției cu Agrobacterium cu compuși tiol, care sunt eficiente pentru transformarea plantelor de soia [69,70]. O altă abordare ar fi să se crească frecvența de formare a lăstarilor de la calusurile transformate, pentru că numai 30% (30 din 101) din calusurile produse au produs lăstari bine dezvoltați, chiar și după o perioadă lungă de cultivare (Figura 5A). Optimizarea în continuare a condițiilor de cultivare, cum ar fi temperatura, iluminarea, compoziția nutrițională, și fitohormonii, ar spori eficiența transformării și / sau accelera formării lăstarilor. În acest studiu, plantele transgenice au fost recuperate printr-o combinație de selecție cu higromicină și selecție vizuală pe bază de fluorescență, în care calusuri transgenice GFP-pozitive au fost izolate chirurgical din regiunile înconjurătoare netransgenice. Comparativ cu selecția cu higromicină, acest sistem dublu de selecție facilitează și accelerează crearea de plante transgenice T0 care constau în întregime din celule transformate. Pe de altă parte, observările noastre preliminare au indicat că 70% (21 din 30) din lăstarii regenerați (0.5 mm) au prezentat fluorescență GFP după60 de zile de cultivare pe SEM. Acest rezultat sugerează că transformanții poate fi de asemenea recuperați folosind selecția cu antibiotice, cu toate că sunt necesare investigații suplimentare pentru a evalua gradul de recuperare a plantelor transgenice în aceste condiții. În ciuda recentei dezvoltări de noi instrumente genetice inverse, cum ar fi tăierea indusă de un virus genă (VIGS) [71], metoda cu Agrobacterium transformare mediată încă joacă un rol esențial în cercetarea biologiei vegetale. În studiul de față, vom stabili o metodă prin care această tehnică genetică neprețuită poate fi aplicată pe M. pudica, un organism model clasic în fiziologia plantelor.

Figura 6. Analiza genomică Southern blot a plantelor T0. ADN

genomic în 13 plante independente T0 (linii # 1-13) și o plantă

netransformată (C) au fost analizate prin digestie EcoRI și

detectarea secvenței sGFP. Dimensiunea unor benzi este mai

scurtă decât lungimea minimă așteptată de la secvența T-ADN

intact (3,0 kb; Figura 2A), sugerând că secvența ADN-T a suferit

trunchiere și / sau rearanjare.

PLOS ONE | www.ploso n e.org 7 February 2014 | Volume 9 | Issue 2 | e88611

Figura 2. Optimizarea condițiilor de infecție cu Agrobacterium. A. Reprezentarea schematică a regiunilor T-ADN a vectorilor binari. Poziția unei sonde utilizate pentru analiza Southern blot și EcoRI, site-urile de tăiere sunt afișate pentru pSB111-GFP. RB, frontieră dreapta [72]; LB, de frontieră stânga [72]; 35S, 35S CaMV promotor [73]; NP, NOS promotor [74]; T, NOS terminator [74]; I primul intron al ricin CAT-1 gena [37]; nptII, neomicină fosfotransferaza II genă [75]; hpt, higromicină fosfotransferazei genă [76]; și GFP, sGFP genă [35]. B. Efectele co-cultivării în prezența acetosiringonă (AS), D-glucoză, și tampon MES privind eficiența transformării (n = 40).PH-ul fiecare mediu a fost ajustat la 5,8 înainte de autoclavare. C. Efectele tulpinii tumefaciens și vectori privind eficiența de transformare (n = 40). A fost utilizat mediu de co-cultivare conținând acetosiringonă, glucoză, și MES (pH 5,8). D. Efectele pH inițial al mediului de co-cultivare (n = 60). E, F. Efecte de tratare cu ultrasunete, infiltrare vid, și Silwet L-77 înainte de a co-cultivare (n = 60). Numărul de semnale GFP-pozitive din nodul cotiledonar al fiecărui explant a fost numărat după 10 zile de selecție (B-E). Frecvența explantelor ce posedă muguri GFP-pozitivi a fost numărată după 30 zile de selecție (F). S-au observat diferențe semnificative între cele două grupuri [P, 0,05 de testul Steel Dwass (B-E) sau testul exact Fisher cu Holm lui P ajustarea valoarii (F)]. G-J. Câmp Bright (G, I) sau verde fluorescent (H, J) imagini ale explantelor nod cotiledonare după 10 (G, H) sau 30 (I, J) de zile de selecție. K, L. Câmp Bright (K) sau verde fluorescent (L) imagini ale unui calus GFP-pozitiv izolat după 51 de zile de selecție. Mimosa După încă 21 de zile de cultivare (un total de 72 zile), în același calus prezentat în (K) a format mai mulți lăstari cu frunze compuse. Baruri Scale, 1 mm (G-L), 1 cm (M).

Figura 3. Schimbările de pH din mediu în timpul co-cultivării. A. Efectele tulpinii Agrobacterium LBA4404, adăpostirea pSB111-GFP (LBA), explante nod cotiledonare (Exp), și tampon MES (MES) la pH mediu (n = 4). Mediul de co-cultivare a fost ajustat inițial la pH 5,8 și se sterilizează prin filtrare pentru a eluda scăderea pH-ului cauzat de autoclavare. În absența tamponului MES, valorile pH-ului au scăzut deja în momentul în care a fost luat pentru a pregăti suspensia Agrobacterium în mediul de co-cultivare (30 de minute). B. Modificări în pH-ul mediu MES-tamponat ajustat inițial la pH 6,1 (n = 5). Mediul a fost sterilizat prin autoclavare și apoi folosit pentru co-cultivarea Agrobacterium și explantelor. Efectul tratamentului Silwet L-77 în prealabil pentru a co-cultiva a fost de asemenea examinat. PH-ul mediului a fost măsurat la 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 48 și 72 de ore după inițierea cultivării.

Figura 4. Optimizarea condițiilor de inducere a rădăcinii. A-D. Câmp Bright (A, C) și verde fluorescent (B, D) imagini ale unui lăstar transformat înainte (A, B) și după (C, D) 14 zile de cultivare în vermiculit irigat. Bar Scala, 5 mm. E. Compararea condițiilor de inducere a rădăcinii (n = 27). O analiză statistică a fost realizată folosind frecvențele la 14 zile de cultivare. S-au observat diferențe semnificative (P, 0,05 de testul Fisher cu reglare P-valoare Holm a) între două grupuri. 1/2 MS, jumătate-de rezistență săruri MS; SV, 2% zaharoză și 16 Vitamine Gamborg.

Figura 5. Stabilirea plantelor transgenice. A. Timpul de stabilire a plantelor transgenice T0 de la explante nod cotiledonare (n = 160). Fiecare linie indică frecvența explantelor infectate cu Agrobacterium care au ajuns la procesul indicat (B). B. Reprezentarea schematică a întregii proceduri de transformare. C. imagini fluorescente verzi ale răsadurilor T1 de o singură linie de inserție a ADN-T (# 1 din figura 6).Zigotism de T1 al descendenților [non-transformant (2/2), hemozygote (Tg / 2) sau homozigotă (Tg / Tg)] produs de auto-încrucișarea unei plante T0 poate fi determinat pe baza intensității fluorescenței a plantulei. D. imagine fluorescentă verde de răsaduri T2 homozigoți produs de auto-trecerea unei linii de T1 homozigotă. Bar Scale, 2 mm.

Author ContributionsConceived and designed the experiments: HM YH MH. Performed the experiments: HM TF NS. Analyzed the data: HM. Wrote the paper: HM YH MH.

References

1. Braam J (2005) In touch: plant responses to mechanical stimuli. New Phytol 165:373–389.

2. Volkov AG, Foster JC, Ashby TA, Walker RK, Johnson JA, et al. (2010) Mimosa pudica: Electrical and mechanical stimulation of plant movements. Plant Cell Environ 33: 163–173.

3. Roblin G (1979) Mimosa pudica: A model for the study of the excitability in plants.Biol Rev 54: 135–153.

4. Jensen EL, Dill LM, Cahill Jr JF (2011) Applying behavioral-ecological theory to plant defense: light-dependent movement in Mimosa pudica suggests a trade-off between predation risk and energetic reward. Am Nat 177: 377–381.

5. Eisner T (1981) Leaf folding in a sensitive plant: A defensive thorn-exposure mechanism? Proc Natl Acad Sci U S A 78: 402–404.

6. Weintraub M (1952) Leaf movements in Mimosa pudica L. New Phytol 50: 357–382.

7. Satter RL, Galston AW (1981) Mechanisms of control of leaf movements. AnnuRev Plant Physiol 32: 83–110.

8. Tamiya T, Miyazaki T, Ishikawa H, Iriguchi N, Maki T, et al. (1988) Movement of water in conjunction with plant movement visualized by NMR imaging. J Biochem 104: 5–8.

9. Fleurat-Lessard P, Frangne N, Maeshima M, Ratajczak R, Bonnemain JL, et al. (1997) Increased expression of vacuolar aquaporin and H+-ATPase related to motor cell function in Mimosa pudica L. Plant Physiol 114: 827–834.

10. Yao H, Xu Q, Yuan M (2008) Actin dynamics mediates the changes of calcium level during the pulvinus movement of Mimosa pudica. Plant Signal Behav 3: 954–960.

11. Allen RD (1969) Mechanism of the seismonastic reaction in Mimosa pudica.Plant Physiol 44: 1101–1107.

12. Kumon K, Suda S (1984) Ionic fluxes from pulvinar cells during the rapid movement of Mimosa pudica L. Plant Cell Physiol 25: 975–979.

13. Samejima M, Sibaoka T (1980) Changes in the extracellular ion concentration in the main pulvinus of Mimosa pudica during rapid movement and recovery. Plant Cell Physiol 21: 467–479.

14. Toriyama H (1955) Observational and experimental studies of sensitive plantsVI. The migration of potassium in the primary pulvinus. Cytologia (Tokyo) 20:367–377.

15. Morillon R, Lie´nard D, Chrispeels MJ, Lassalles JP (2001) Rapid movements of plants organs require solute-water cotransporters or contractile proteins. Plant Physiol 127: 720–723.

16. Fleurat-Lessard P, Roblin G, Bonmort J, Besse C (1988) Effects of colchicine, vinblastine, cytochalasin B and phalloidin on the seismonastic movement of Mimosa pudica leaf and on motor cell ultrastructure. J Exp Bot 39: 209–221.

17. Kanzawa N, Hoshino Y, Chiba M, Hoshino D, Kobayashi H, et al. (2006) Change in the actin cytoskeleton during seismonastic movement of Mimosa pudica. Plant Cell Physiol 47: 531–539.

18. Kameyama K, Kishi Y, Yoshimura M, Kanzawa N, Sameshima M, et al. (2000) Tyrosine phosphorylation in plant bending. Nature 407: 37.

19. Turnquist HM, Allen NS, Jaffe MJ (1993) A pharmacological study of calcium flux mechanisms in the tannin vacuoles of Mimosa pudica L. motor cells. Protoplasma 176: 91–99.

20. Sibaoka T (1962) Excitable cells in Mimosa. Science 137: 226.21. Samejima M, Sibaoka T (1983) Identification of the excitable cells in the petiole

of Mimosa pudica by intracellular injection of procion yellow. Plant Cell Physiol24: 33–39.

22. Fromm J, Eschrich W (1988) Transport processes in stimulated and non- stimulated leaves of Mimosa pudica - II. Energesis and transmission of seismic stimulations. Trees (Berl West) 2: 18–24.

23. Ricca U (1916) Soluzione d’un problema di fisiologia - La propagazione di stimolo nella ‘‘Mimosa’’. Nuovo G Bot Ital 23: 51–170.

24. Schildknecht H (1983) Turgorins, hormones of the endogeneous daily rhythms of higher organized plants - Detection, isolation, structure, synthesis, and activity. Angew Chem Int Edi Engl 22: 695–710.

25. Ueda M, Yamamura S (1999) The chemistry of leaf-movement in Mimosa pudicaL. Tetrahedron 55: 10937–10948.

26. Visnovitz T, Vila´ gi I, Varro´ P, Kristo´ f Z (2007) Mechanoreceptor cells on the tertiary pulvini of Mimosa pudica L. Plant Signal Behav 2: 462–466.

27. Wang K (2006) Agrobacterium Protocols, 2nd ed. Methods Mol Biol 343. Totowa: Humana Press. 512 p.

28. Frugoli J, Harris J (2001) Medicago truncatula on the move! Plant Cell 13: 458–463.29. Udvardi MK, Tabata S, Parniske M, Stougaard J (2005) Lotus japonicus: legume

research in the fast lane. Trends Plant Sci 10: 222–228.30. Chandra A, Pental D (2003) Regeneration and genetic transformation of grain

legumes: An overview. Curr Sci 84: 381–387.31. Eapen S (2008) Advances in development of transgenic pulse crops. Biotechnol

Adv 26: 162–168.

32. Somers DA, Samac DA, Olhoft PM (2003) Recent advances in legume transformation. Plant Physiol 131: 892–899.

33. Komari T, Hiei Y, Saito Y, Murai N, Kumashiro T (1996) Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers. Plant J 10: 165–174.

34. Komari T, Takakura Y, Ueki J, Kato N, Ishida Y, et al. (2006) Binary vectors and super-binary vectors. Methods Mol Biol 343: 15–41.

35. Chiu W, Niwa Y, Zeng W, Hirano T, Kobayashi H, et al. (1996) EngineeredGFP as a vital reporter in plants. Curr Biol 6: 325–330.

36. Nakagawa T, Kurose T, Hino T, Tanaka K, Kawamukai M, et al. (2007) Development of series of gateway binary vectors, pGWBs, for realizing efficient construction of fusion genes for plant transformation. J Biosci Bioeng 104: 34–41.

37. Ohta S, Mita S, Hattori T, Nakamura K (1990) Construction and expression in tobacco of a b-glucoronidase (GUS) reporter gene containing an intron within the coding sequence. Plant Cell Physiol 31: 805–813.

38. Akama K, Shiraishi H, Ohta S, Nakamura K, Okada K, et al. (1992) Efficient transformation of Arabidopsis thaliana: comparison of the efficiencies with various organs, plant ecotypes and Agrobacterium strains. Plant Cell Rep 12: 7–11.

39. Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW (1987) GUS fusions: b-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 6:3901–3907.

40. Hellens R, Mullineaux P, Klee H (2000) A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends Plant Sci 5: 446–451.

41. Geetha N, Venkatachalam P, Prakash V, Sita GL (1998) High frequency induction of multiple shoots and plant regeneration from seedling explants of pigeonpea (Cajanus cajan L.). Curr Sci 75: 1036–1041.

42. Gulati A, Jaiwal PK (1994) Plant regeneration from cotyledonary node explants of mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek). Plant Cell Rep 13: 523–527.

43. Venkatachalam P, Jayabalan N (1997) Effect of auxins and cytokinins on efficient plant regeneration and multiple-shoot formation from cotyledons and cotyledonary-node explants of groundnut (Arachis hypogaea L.) by in vitro culture technology. Appl Biochem Biotechnol 67: 237–247.

44. Gelvin SB (2012) Traversing the cell: Agrobacterium T-DNA’s journey to the host genome. Front Plant Sci 3: 52.

45. Stachel SE, Messens E, Van Montagu M, Zambryski P (1985) Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature 318: 624–629.

46. Cangelosi GA, Ankenbauer RG, Nester EW (1990) Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein. Proc Natl Acad Sci U S A 87: 6708–6712.

47. Shimoda N, Toyoda-Yamamoto A, Nagamine J, Usami S, Katayama M, et al. (1990) Control of expression of Agrobacterium vir genes by synergistic actions of phenolic signal molecules and monosaccharides. Proc Natl Acad Sci U S A 87:6684–6688.

48. Stachel SE, Nester EW, Zambryski PC (1986) A plant cell factor inducesAgrobacterium tumefaciens vir gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A 83: 379–383.

49. De Klerk GJ, Hanecakova J, Ja´ sik J (2008) Effect of medium-pH and MES on adventitious root formation from stem disks of apple. Plant Cell Tiss Organ Cult95: 285–292.

50. Turk SCHJ, Melchers LS, den Dulk-Ras H, Regensburg-Tu¨ınk AJG, Hooykaas PJJ (1991) Environmental conditions differentially affect vir gene induction in different Agrobacterium strains. Role of the VirA sensor protein. Plant Mol Biol 16:1051–1059.

51. Trick HN, Finer JJ (1997) SAAT: sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation. Transgenic Res 6: 329–336.

52. Bechtold N, Ellis J, Pelletier G (1993) In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C R Acad Sci III 316:1194–1199.

53. Clough SJ, Bent AF (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium- mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 16: 735–743.

54. Wu H, Sparks C, Amoah B, Jones HD (2003) Factors influencing successfulAgrobacterium-mediated genetic transformation of wheat. Plant Cell Rep 21: 659–668.

55. Jay-Allemand C, Capelli P, Cornu D (1992) Root development of in vitro hybrid walnut microcuttings in a vermiculite-containing gelrite medium. Sci Hortic (Amsterdam) 51: 335–342.

56. De Klerk GJ, Ter Brugge J, Marinova S (1997) Effectiveness of indoleacetic acid, indolebutyric acid and naphthaleneacetic acid during adventitious root formation in vitro in Malus ‘Jork 9’. Plant Cell Tiss Organ Cult 49: 39–44.

57. Kolla´ rova´ K, Henselova´ M, Liˇskova´ D (2005) Effect of auxins and plant oligosaccharides on root formation and elongation growth of mung bean hypocotyls. Plant Growth Regul 46: 1–9.

58. Rout GR (2006) Effect of auxins on adventitious root development from single node cuttings of Camellia sinensis (L.) Kuntze and associated biochemical changes.

Plant Growth Regul 48: 111–117.59. Dai S, Zheng P, Marmey P, Zhang S, Tian W, et al. (2001) Comparative

analysis of transgenic rice plants obtained by Agrobacterium-mediated transfor- mation and particle bombardment. Mol Breed 7: 25–33.

60. Travella S, Ross SM, Harden J, Everett C, Snape JW, et al. (2005) A comparison of transgenic barley lines produced by particle bombardment and Agrobacterium- mediated techniques. Plant Cell Rep 23: 780–789.

61. De Clercq J, Zambre M, Van Montagu M, Dillen W, Angenon G (2002) An optimized Agrobacterium-mediated transformation procedure for Phaseolus acutifo- lius A. Gray. Plant Cell Rep 21: 333–340.

62. Ogaki M, Furuichi Y, Kuroda K, Chin DP, Ogawa Y, et al. (2008) Importance of co-cultivation medium pH for successful Agrobacterium-mediated transforma- tion of Lilium x formolongi. Plant Cell Rep 27: 699–705.

63. Becker J, Vogel T, Iqbal J, Nagi W (1994) Agrobacterium-mediated transformation of Phaseolus vulgaris. Adaptation of some conditions. Ann Rep Bean Improv Coop37: 127–128.

64. Olhoft PM, Flagel LE, Donovan CM, Somers DA (2003) Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method. Planta 216: 723–735.

65. Grant J, Cooper P (2006) Peas (Pisum sativum L.). Methods Mol Biol 343: 337–345.

66. Krysan PJ, Young JC, Sussman MR (1999) T-DNA as an insertional mutagen inArabidopsis. Plant Cell 11: 2283–2290.

67. Walden R, Fritze K, Hayashi H, Miklashevichs E, Harling H, et al. (1994) Activation tagging: a means of isolating genes implicated as playing a role in plant growth and development. Plant Mol Biol 26: 1521–1528.

68. Ichikawa T, Nakazawa M, Kawashima M, Iizumi H, Kuroda H, et al. (2006) The FOX hunting system: an alternative gain-of-function gene hunting technique. Plant J 48: 974–985.

69. Olhoft PM, Lin K, Galbraith J, Nielsen NC, Somers DA (2001) The role of thiol compounds in increasing Agrobacterium-mediated transformation of soybean cotyledonary-node cells. Plant Cell Rep 20: 731–737.

70. Olhoft PM, Somers DA (2001) L-Cysteine increases Agrobacterium-mediated T- DNA delivery into soybean cotyledonary-node cells. Plant Cell Rep 20: 706–711.

71. Lu R, Martin-Hernandez AM, Peart JR, Malcuit I, Baulcombe DC (2003) Virus-induced gene silencing in plants. Methods 30: 296–303.

72. Wang K, Genetello C, Van Montagu M, Zambryski PC (1987) Sequencecontext of the T-DNA border repeat element determines its relative activity during T-DNA transfer to plant cells. Mol Gen Genet 210: 338–346.

73. Odell JT, Nagy F, Chua NH (1985) Identification of DNA sequences requiredfor activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature 313: 810–812.

74. Depicker A, Stachel S, Dhaese P, Zambryski P, Goodman HM (1982) Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet 1: 561–573.

75. Bevan MW, Flavell RB, Chilton MD (1983) A chimaeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for plant cell transformation. Nature 304: 184–187.

76. Waldron C, Murphy EB, Roberts JL, Gustafson GD, Armour SL, et al. (1985) Resistance to hygromycin B - A new marker for plant transformation studies.Plant Mol Biol 5: 103–108.