(C2H5OH)

Development of biotechnology-based biofuels Prof. Carlo V. Bruschi

Senior Scientist & Group Leader Microbiology/Yeast Molecular Genetics group

ICGEB Ğ Areas Science Park, Trieste

Seminar on The Role of Agricultural Biotechnologies for Production of Bioenergy in Developing Countries

FAO Headquarters, Iran Room

12 October 2007

"Broadly defined, biotechnology is the manipulation of living organisms to produce goods and services useful to human beings." (From: "Modifying Africa" of F. Wambugu).

Microbial agro-industrial biotechnology stems from the traditional

practices and products developed by farmers and their families for use

on the farm or in the homestead. These practices can be improved

greately by the correct implementation of genetic engineering

Ethical concerns: Modern biotechnology is often seen as unnatural,

but in fact it relies on most of the same spontaneous processes occuring

in nature and leading to improvement through selction

THE ICGEB, AT ITS LOCATION OF TRIESTE PROMOTES BASIC AND

ADVANCED SCIENTIFIC TRAINING IN THE AREA OF MICROBIAL

BIOTECHNOLOGY FOR ITS APPLICATIONS IN AGRO-INDUSTRY.

AMONG THE ICGEB MEMBER COUNTRIES SEVERAL AFRICAN

COUNTRIES ARE ALREADY TAKING ADVANTAGE OF THE ICGEB

PROGRAMMES (http://www.icgeb.org)

AREAS OF RESEARCH AND TRAINING UNDERGOING AT ICGEB:

Utilization of genetically selected yeast strains enriched for particular

aminoacids (lysine, methionine) for animal feed, and for cellulose and

hemicellulosa digestion. (Microbiology, Trieste)

Study of plant growth-promoting bacteria (Pseudomonads).

Development of insect and pesticide-resistant crops (N.D.)

Studies towards the production of stress (drought)-resistant plants (N.D.)

• Areas of Primary concern for Developing Countries

• Epidemiology of food-related diseases and

genetic susceptibilities

• Impact of new technologies on food

production

• Chemical contaminants and pathogens

• Safer production and healthier foodstuffs

from agriculture

• Animal feed and impact on human health

• Environmental health risks

ROLE OF TECHNOLOGY PARKS AND INCUBATORS

IN TECHNOLOGY TRANSFER

Successful experiences in creating technology parks/ incubators

providing a basic infrastructure to transform ideas into products and

services can serve as model for developing Countries.

For example, given the comparative advantage of diversified

ethanol production in the world, particular emphasis could be

focussed upon research and transformation of agricultural products

in such technology parks.

It would also be advisable to set up technology parks near existing

institutions to attract foreign contract research funds to perform

applied research in situ.

Science

Social

needsTechnology

Innovation

Innovation for Development

Food Safety and Health Risks

Background and Aims:

• Assuring health and well-being of citizens

• Food intake and environmental factors

• Safer and health promoting foods

• Controlled and integrated production systems

• From farm to fork – consumer protection as the driver

• Epidemiology of food-related diseases and genetic susceptibility

- Diet, lifestyle and health- Measuring dietary intake and risk

assessment- Influence of genetic variability

• Traceability

• Chemical contaminants and pathogens- Analysis and detection- Improved prevention and measurement control- Prion detection, mapping, transfer mechanisms

• Safer production and healthier foodstuffs- Conventional vs. organic vs. GMOs- Improved animal welfare, husbandry and waste

management

• Animal feed and impact on human health

• Environmental health risks

Respiration (O2 + dispensable mitochondria, ρ+ , ρρ+ , ρρ+ , ρρ+ , ρ−−−−, ρ, ρ, ρ, ρ0000) and Fermentation (anaerobic) convert sugars (hexoses): sucrose>fructose>glucose>maltose = CO2 + ethanol

THE ICGEB MANDATE

To provide a Centre of excellence for research and training in genetic engineering and biotechnology

addressed to developing countries

THE STRUCTURE

TRIESTE COMPONENT(ITALY)

NEW DELHI COMPONENT(INDIA)

THEICGEB

+

A NETWORK OF AFFILIATED CENTRES

ICGEB IS ONE CENTRE, MADE OF TWO COMPONENTS AND A NETWORK OF

AFFILIATED CENTRES

67 Signatory States, 51 Member States, 2 Components: Trieste (Italy) - New Delhi (India) and a network of 35 Affiliated Centres

ICGEB: an intergovernmental organisation

NEW DELHI COMPONENT

INSTRUMENTS OF ACTION

• RESEARCH PROJECTS

• LONG TERM TRAINING

• SHORT TERM TRAINING

• COLLABORATIVE RESEARCH PROGRAMME

• COOPERATION WITH INDUSTRIAL SECTOR

• SCIENTIFIC SERVICES

• INSTITUTIONAL SERVICES

SUMMARY OF THE ACTIVITYOF THE ICGEB (1988-2004)

• INTERNATIONAL PUBLICATIONS: 1,220

• LONG TERM FELLOWSHIPS: 481 awarded; 797 MAN/YEARS

• SHORT TERM TRAINING: 5,826 persons trained

• RESEARCH GRANTS: 232 awardedfor a total of US$ 12,163,781.00

• PATENTS: 30 filed

• TECHNOLOGY TRANSFER

AGREEMENTS: 65 signed

INSTITUTIONAL ACTIVITIES

COOPERATION AGREEMENT WITH THE UNITED NATIONS SECRETARIAT. UN AND ICGEB COOPERATE IN ACTIVITIES RELATED TO

• SAFE AND SUSTAINABLE USE OF GENETIC ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY

• PROTECTION OF BIODIVERSITY

• BIOSAFETY AND RISK ASSESSMENT

• IMPLEMENTATION OF ARTICLE X OF THE CONVENTION ON BIOLOGICAL DISARMAMENT

“THE MILLENNIUM DEVELOPMENT GOALS MAY BE MORE EASILY MET WITH THE EXTENSIVE APPLICATION OF MODERN BIOTECHNOLOGY

IN AGRICULTURE AND HEALTH”

(Report of the Secretary-General on “Impact of new biotechnologies, with particular attention to sustainable development, including food security, health and economic productivity”- 2003)

MILLENIUM DEVELOPMENT GOALS

TAKES NOTE OF THE PROPOSAL OF THE SECRETARY GENERAL FOR AN INTEGRATED

FRAMEWORK FOR BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT WITHIN THE UN SYSTEM AND

THE NEED FOR STRENGTHENING CO-ORDINATION BETWEEN THESE RELEVANT

ORGANISATIONS AND BODIES IN THE AREA OF

BIOTECHNOLOGY

GENERAL ASSEMBLYRESOLUTION 58/200 -

DECEMBER 2003

THE IANCB HAS BEEN ESTABLISHED IN MAY 2004 BY A CLUSTER OF INTERNATIONAL ORGANISATIONS IN

ORDER TO:

• ELABORATE JOINT STUDIES• STRENGTHEN THE ADVISORY ROLE IN BIOTECHNOLOGY OF THE UN• ASSESS THE IMPACT OF BIOTECHNOLOGY, IN DEVELOPING COUNTRIES• ESTABLISH A COMMON PORTAL FOCUSED ON BIOTECH-RELATED ACTIVITIES LINKED TO THE EXISTING SCIENCE AND TECHNOLOGY DEVELOPMENT NETWORK• ASSIST UNCTAD IN THE PREPARATION OF THE

REPORT TO THE UNITED NATIONS GENERAL ASSEMBLY

INTER-AGENCY NETWORK FOR CO-OPERATION IN BIOTECHNOLOGY

“THE UNITED NATIONS AND THE INTERNATIONAL CENTRE FOR GENETIC ENGINEERING AND

BIOTECHNOLOGY …CO-OPERATE IN ACTIVITIES RELATED TO THE SUSTAINABLE AND SAFE USE OF GENETIC ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY”

ACCORDINGLY, ICGEB IS PRESENTLY CHAIRING THE INTER-AGENCY NETWORK FOR CO-OPERATION IN BIOTECHNOLOGY AND IS TO PLAY A KEY ROLE IN ASSISTING UNCSTD IN THE PREPARATION OF THE

REPORT TO THE GENERAL ASSEMBLY.

UN - ICGEB Co-operation Agreement

April, 2001

SCHEMA DEL PROCESSO PILOTA

Distillazione di etanolo

Fermentazione per inoculo

Produzione di etanolo

Vasca con B. pumilus

Decanter per separazione lignina/cellulosa

Macinazione criogenica

CRISCAT

Trasferimento calore al metano

Omogeneizzazione meccanica

Vasca di idratazione

ACCUMULO

MALIC

+Microbi ruminali

Modello di criomacinatore a scambio termico (CRISCAT)

BioEthosBioEthosProject plan : 3 FASIProject plan : 3 FASI

FaseFase 1: 1: RicercaRicerca ScientificaScientifica -- ICGEBICGEBIngegnerizzazione dei ceppi di lievito1.1 produzione ceppi transgenici per digerire la cellulosa in collaborazione con la PiattaformaNazionale ITSusChem1.2 ottimizzazione genomica per� incrementare la percentuale di etanolo prodotto ad usoindustriale; l’ottimizzazione verra’ realizzata tramite l’impiego di tecniche di miglioramentogenomico in collaborazione con l’Universita’ di Oxford e grazie ad un sistema sviluppato e brevettato dal laboratorio YMG dell’ICGEB

FaseFase 2: 2: SviluppoSviluppo -- AREA/Talent AREA/Talent SrlSrl/ICGEB/ICGEB

2.1 Verifica in laboratorio di digestione della cellulosa da materiale criomacerato (ICGEB), sviluppo di sistemi di controllo (Talent Srl)2.2 sviluppo di impianto pilota con utilizzo di locali dell’AREA di ricerca per lo smaltimento dirifiuti chimici; come ricaduta vi sara’ la creazione di un Centro di Fermentazione (AREA)

Fermentazioni pilota

FaseFase 3: 3: ImplementazioneImplementazione industrialeindustriale --CartiereCartiere Burgo/Endesa/GasNaturalBurgo/Endesa/GasNatural

Trasferimento di frigorie3.1 Utilizzo del freddo prodotto dai rigassificatori (Endesa/GasNatural) per la criomacerazione con conseguente digestione di cellulosa di scarto (Cartiere Burgo) e produzione industriale di BioEtanolo. In questa fase e’ presente il coinvolgimento didistributori petrolchimici.

TempisticaTempistica didi attuazioneattuazione del del progettoprogetto

0 1 2 3 t(anni)

ICGEBITSusChem

ICGEB(Oxford)

Talent/ICGEB/

Reg. FVG?

AREA/NuoviPartners

Burgo/Endesa/

GasNatural/Db.Petrolchimici

Fasi

Ricerca

Sviluppo

Produzione(Implementazioneindustriale)

1.1 Nuovi lieviti 1.2 Ottimizzazione

2.1 Verifiche 2.2 Imp. Pilota

3.1 Trasferimento frigorie

DIAGRAMMA DI PROCESSO

MALIC

cippatoFASE 1Pre-trattamento interno

Macinazionemeccanica

Macinazionebiogenica

PAD

Batteri & Lieviti

AcidoVanillico

Proposta di Progetto:

Produzione di bioetanolo con lieviti ingegnerizzati,

via fermentazione di derivati vegetali criomacerati

nella regione Friuli Venezia-Giulia

Responsabile: Prof. Carlo V. BruschiHead, Yeast Molecular Genetics Group ICGEB

AREA Science Park, Trieste

Department of Genetics and Developmental Biology

University of Salzburg, Austria

Collaboratori:

Dr. Sergio StibelliTalent S.r.l, Trieste

Paolo ManderSister - Liaison Office

AREA Science Park, Trieste

Dr. Valentina Tosato

La linea pilota sarˆ basata sulle apparecchiature per la macinazione criogenica, la separazione della lignina, il s istema di fermentazione per la preparazione dellÕ inoculo, la produzione e distillazione dellÕ etanolo. Il processo che si sperimenterˆ sarˆ del tipo SSCF ( Simultaneous Saccharification and Co- Fermentation) con la variante di: i) non avere enzimi in soluzione, ii) avere un unico agente microbico, il lievito S. cerevisiae ingegnerizzato con enzimi cellulasi ed emicellulasi espressi sulla superficie cellulare e iii) in grado di trasformare zuccheri in una pi� alta percentuale di alcol. Questo processo innovativo, derivante dallÕevoluzione del precedente SSCF, verrˆ indicato con la nuova sigla CEDY (Cellulose to Ethanol Directly by Yeast). La fermentazione � un processo complesso ma noto nelle sue variabili e caratteristiche mentre pi� necessaria � la comprensione dei meccanismi di adesione e catalisi degli enzimi endo- ed eso-glucanasi, cellobioidrolasi ed i corrispondenti per lÕ emicellulosa, ai siti di legame e di catalisi sulla cellulosa ed emicellulosa . Questa dinamica regola i tempi e lÕ efficacia del processo. Il glucosio e lo xilosio saranno metabolizzati dal lievito nello stesso momento della sua produzione per cui mancherˆ lÕ inibizione da metaboliti. La concentrazione del lievito aumenterˆ fino a livelli stazionari in cui sarˆ rimosso dal bioreattore per mantenere il processo nella fase esponenziale. Il tasso alcolico massimo attuale � del 13 %, nella fase di ingegneria genetica si cercherˆ di portarlo al 20 Ğ 26% con un notevole guadagno economico nel processo.

Il sistema BIT per la bioenergia

3.4 Ingegnerizzazione genetica del lievito

3.4.1 Identificazione dei geni eterologhi degli enzimi necessari Il lievito Saccharomyces cerevisiae, oggi universalmente riconosciuto come il pi� importante microrganismo per le biotecnologie, e di grado GRAS (Generally Recognized As Safe), non possiede la capacitˆ enzimatica per metabolizzare la cellulosa, ma bens“ � estremamente efficiente nella produzione di etanolo partendo da zuccheri semplici quali il glucosio. Di c onseguenza, occorre introdurre nel lievito i g eni codificanti per gli enzimi che degradano la s truttura fibrillare della celulosa fino a ridurla a l ivello del monosaccaride glucosio che la cellula pu˜ assimilare. Di tali geni esistono diversi esempi, alcuni dei quali giˆ studiati ed isolati da laboratori di r icerca, in particolare in Giappone e Finlandia. Verranno quindi isolati i geni codificanti per i seguenti enzimi: i) endoglucanasi II (EGII) dal fungo Trichoderma reesei, ceppo QM9414, in grado di digerire le catene di cellulosa in modo casuale; ii) cellobioidrolasi II (CBHII) dal fungo Trichoderma reesei, ceppo QM9414, in grado di staccare cellobiosio, cio� molecole dimeriche di gl ucosio dallÕestremitˆ della catena di cellulosa; iii) §-glucosidasi I (BGL1) dal fungo Aspergillus aculeatus, ceppo F50, in grado di scindere una molecola dimerica di cellobiosio in due molecole di glucosio. Come miglioramento innovativo dellÕattuale stato dellÕarte, i ceppi transgenici di l ievito cos“ costruiti verranno sottoposti ad u n nuovo sistema di mutagenesi globale per traslocazione cromosomica. In pratica, il ba ckground genetico di questi ceppi verrˆ riarrangiato casualmente su l arga scala sfruttando una rivoluzionaria tecnologia genetica messa a p unto nei laboratori dellÕICGEB dellÕ AREA di Ricerca di Trieste.

3.4.5 Ottimizzazione / Fermentazione La ricerca di condizioni ottimali per la produzione di etanolo verrˆ effettuata sia su piastra, misurando la diminuzione della fluorescenza emessa dalla cellulosa presente. Successivamente i ceppi che daranno i valori pi� alti saranno oggetto di mutagenesi globale tramite induzione di traslocazioni cromosomiche per mezzo del sistema BIT (Bridge-Induced Translocation). La selezione avverrˆ per rivelazione automatica di concentrazione di etanolo per mezzo di appositi sensori enzimatici. I ceppi selezionati verranno testati in mini-fermentatori con diverse composizioni di MALIC ed eventualmente riassoggettati a ulteriori cicli di mutagenesi globale fino a dare risultati soddisfacenti, da testare su scale pilota. Per ultimo, utilizzando le recentissime scoperte del gruppo di Gerald Fink negli USA, sul Òquorum sensingÓ del lievito, si utilizzeranno le due molecole-segnale individuate, il feniletanolo e triptofolo, per aumentare la densitˆ massima delle cellule in terreno liquido nonch� il g rado alcolico prodotto dai ceppi transgenici.

3.1.1.1 Struttura chimica della lignina La lignina � u n polimero amorfo, eterogeneo e c himicamente complesso. LÕeterogeneitaÔ della lignina � dovuta al suo elevato peso molecolare derivante dallÕunione di differenti acidi ed alcoli fenilpropilici (cumarilico, coniferilico e sinapilico). LÕaccoppiamento casuale di questi alcoli dˆ luogo alla struttura tridimensionale complessa della lignina. Nelle figure seguenti sono riportate le strutture chimiche degli alcooli (A) e acidi cinnamici (B), noncheÔ la formula strutturale della lignina (C) proposta da Adler.

A

2

OCH

R R

R R

R R

1

1

1 2

2

OCH

3

3

=

=

=

=

=

=

,

H

H

alcool p-cumarilico

alcool coniferilico

alcool sinapilico

CHCH CH2

OH

R

1

2222

R

B

OCH

R R

R R

R R

1

1

1

2

2

2

OCH

3

3

=

=

=

=

=

=

,

H

H

acido p-cumarico

acido ferulico

acido sinapico

R

COOHCH CH

1R

OH

2222

C