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DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE
TD de Microbiologie4ème année PharmacieAnnée Universitaire 2019-2020 Par : Dr Lounis Assia
Pr Ag Benammar Sonia
Plan
I. Introduction
II. Indications
III. Diagnostic virologique
IV. Diagnostic direct
Microscopie électronique
Isolement viral
Détection directe des Ags
viraux
Techniques de biologie
moléculaire
V.Diagnostic indirect=
Sérologie
VI. Conclusion
Bibliographie
Introduction
Les virus sont des agents infectieux et potentiellement pathogènes ,
ce sont des entités nucléoprotéiques possédant un seul type d’acide
nucléique; se reproduisent a partir de leur matériel génétique et sont
incapable de croitre et de se diviser .
Le diagnostic des infections virales humaines a donc des caractéristiques particulières, imposées par la petite taille des virus, la nécessité d’un hôte cellulaire pour leur réplication.
Le diagnostic virologique définit un ensemble de principes méthodes et stratégies visant à identifier, quantifier et suivre les infections viraleshumaines.
Indications
le diagnostic ne doit pas être pratiqué de façon systématique chaque fois
qu’une infection virale est suspectée.
Les principales indications sont :
La gravité présente ou potentielle, pour le malade ou son entourage de
l ’infection virale suspectée
La mise en route et le suivi d’une chimiothérapie antivirale
Le criblage virologique des dons de sang; d’organe, de tissu, de cellule
l’évaluation du risque d’infection ou, au contraire, de la protection vis-à- vis
de l’exposition potentielle ou avérée à un virus
L’identification d’une épidémie menaçant une communauté
Diagnostic virologique
Le diagnostic virologique repose sur 2 approches :
* Le diagnostic direct : décelant dans les produits biologiques la présence du
virus ou de ses composants, antigènes ou génomes viraux
* Le diagnostic indirect : décelant l'apparition dans le sang d'une
réponse immunitaire sous forme d'anticorps spécifiques du virus.
Ces deux approches ne s'excluent pas et sont parfois complémentaires
Diagnostic direct :
Prélèvements :
Prélèvements ne nécessitant pas de milieu de transport : amener au
laboratoire le
prélèvement
1. Dans un tube sec stérile : selles, urines, LCR, prélèvements liquides divers
2. Dans un tube contenant de l'EDTA : sang total
Prélèvements effectués avec un écouvillon stérile immergé dans un
milieu de transport fourni par le laboratoire : gorge, vésicules,
conjonctives
Diagnostic direct :
Frottis sur lame = l' écouvillon est exprimé sur la lame de verre par le
préleveur), acheminer à sec, à température ambiante.
Les prélèvements sont correctement identifiés et bien refermés.
Fiche de renseignements cliniques correctement remplie.
Diagnostic direct :
Les échantillons biologiques envoyés par poste et susceptibles de
contenir des virus doivent être emballés et acheminés conformément à la
réglementation prévue pour le transport des matières infectieuses (triple
emballage)
Acheminer le prélèvement le plus rapidement possible au laboratoire
( < 1 h ), sinon conservation à + 4°C (quelques heures), - 80°C ++ ou
dans de l’ azote liquide (au delà de 36 h).
Diagnostic direct :
1. Microscopie Electronique
Utilisée dans des cas très particuliers
Elle permet :
• De visualiser les virus (diagnostic de groupe) et de les quantifier
• Tout produit pathologique contenant une grande quantité de virus
(106 particules /ml de selles ). En dessous la sensibilité est faible
Microscopie électronique : virus grippal Première image (24/01/2020) au microscope
électronique du nouveau Coronavirus (Centers for
Disease Control and Prevention)
2. Isolement viral
Cette méthode de référence permet d’isoler le virus, de
l’identifier et de le purifier pour obtenir une souche virale
Systèmes cellulaires utilisés pour cet isolement viral :
1. Culture cellulaire +++
2. Œuf de poule embryonné: est réservée à l’étude de quelques virus
particuliers (virus grippal notamment).
3. Animal (coxackies virus)
Aucun système ne permet l’isolement de tous les virus
Culture cellulaire
En pratique, on a recours essentiellement aux cultures cellulaires.
La multiplication des cellules est effectuée dans un milieu stérile, sur un support
plastique auquel elles adhèrent pour former une couche monocellulaire, ou en
suspension
Différents types de culture cellulaire :
1. Les cellules primaires ou dites de premier explant (rein de singe…)
2. Les cellules diploïdes de fibroblastes embryonnaires humains
(MRC5…)
3. Les cellules de lignées continues sont des cellules hétéroploïdes transformées,
immortalisées (MDCK) ou obtenues à partir de tissus cancéreux (HEp2).
Travail sous hotte à flux laminaire
Flacons de culture cellulaire Mise en culture = ˃ Incubation des
cultures à l’étuve durant une période
différente d’un virus à un autre
Observation au microscope des ECP (effet cytopathogène) caractéristiques d’ espéces de virus
Avantages de la culture cellulaire :
Les techniques de culture de virus sont indispensables pour
effectuer des titrages de virus et quantifier le nombre de virus
infectieux
Mise en évidence du virus infectieux (multiplication virale)
Etude de la sensibilité aux antiviraux.
Bonne sensibilité
Inconvénients :
Prélèvements dans de bonnes conditions pour avoir du virus
infectieux
Technique longue et coûteuse
Certains virus sont non cultivables (HAV, HBV ,HCV,
Coxsackie A,Rotavirus)
Subjectivité de la lecture : expérience de l'observateur.
3. Détection directe des antigènes viraux
Mise en évidence des antigènes viraux intracellulaires par immunofluorescence++
-IF directe:
Utilise directement un Ac spécifique du virus marqué à la fluorescéine
-IF indirecte:
On met un Ac spécifique non marqué et on ajoute un anticorps
anti-IgG marqué à la fluorescéine => sensibilité +++
Nécessité de cellules intactes :
Si pauvreté en cellules = résultats faussement négatifs
Problèmes techniques : éliminer le mucus importante , pas d'automatisation
Antigènémie pp65 du CMV positive
3. Détection directe des antigènes viraux
La détection d'antigènes solubles (indépendants de tout support
cellulaire) dans les produits pathologiques liquides ou extraits
liquides, s'effectue selon plusieurs techniques :
1.Elisa direct : l'anticorps monoclonal utilisé est marqué
avec un système enzymatique
2. Elisa indirect : anti IgG spécifique d'espèce marquée
avec une enzyme meilleure sensibilité
3. Détection directe des antigènes viraux
Agglutination de particules de latex sensibilisées par desAcs
Test au latex où une suspension de particules de latex enrobées
d'anticorps antiviraux est mélangée à un extrait liquide de produits
biologiques ;
les particules de latex vont se trouver agglutinées par
l'intermédiaire de l'antigène viral correspondant,
A l'œil nu, la suspension de particules de latex, d'homogène va
devenir granuleuse
Avantages de la détection directe des antigènes viraux
1. Conservation et transport des prélèvements moins strictes
2. Facilité de mise en oeuvre
3. Rapidité d'exécution
4. Grande spécificité de ces techniques
5. Nombreux tests commercialisés
Inconvénients
1. Faible sensibilité : infections où la réplication virale est importante
2. Coût relativement élevé
4. Détection du génome viral (ARN ou ADN)
Diagnostic direct moléculaire
Trois méthodes principales dominent la routine :
1- L’ hybridation moléculaire
2- L’amplification génique ( PCR)
3- Le séquençage nucléotidique.
4. Détection du génome viral (ARN ou ADN)
Détection des génomes viraux directement dans les produits biologiques
Aapplicable à tous les virus, à priori,
Permet de :
1. Porter le diagnostic d'infection par des virus difficilement ou non
cultivables (Parvovirus B19, HCV)
2. Raccourcir le délai de diagnostic de certains virus cultivables (CMV, VZV)
3. Détecter une réplication virale active = quantification de l'ADN ( ou charge
virale par PCR quantitative) de l'HBV, de l'ARN du HIV ou de l'HCV …
4. Conclure un diagnostic face à des profils sérologiques d'interprétation
douteuse ou à une phase pré-sérologique de la maladie.
5. Comparer les souches virales entre elles : études épidémiologiques
V. Diagnostic indirect
Principe
Il consiste à rechercher dans le sérum la présence d’anticorps
spécifiques d’une infection virale, au moyen d'antigènes viraux.
La détection peut être qualitative ou quantitative et porter sur les
anticorps totaux, sur les IgG ou sur les IgM théoriquement spécifiques
d'une primo-infection.
Principales techniques utilisés
Toutes utilisent une réaction de type antigène/anticorps, dans
laquelle l'antigène viral est apporté par le réactif de détection, et
l'anticorps présent ou non dans le sérum testé
(Voir TD principales techniques sérologiques)
Conclusion :
Les examens virologiques deviennent particulièrement contributifs grâce au
développement de nouvelles techniques rapides sensibles et spécifiques pour
la détection des virus.
Elles permettent le diagnostic et le suivi thérapeutique d’infections
chroniques (HIV, HBV) ou d’infections sévères chez les sujets immuno-
déprimés.
Il faut souligner la nécessité de contacts entre cliniciens et biologistes pour
orienter le choix des examens, cibler les recherches selon chaque pathologie
observée et adapter les traitements
Références
H.Agut, D.Boutolleau, S.Burrel Diagnostic virologique EMC 2017
T.Mourez, S.Burre, D.Boutolleau, S.Pillet Traité de virologie medicale2019
M. SEGHIER DIAGNOSTIC DES INFECTIONS VIRALE Faculté deMédecine d’Alger2016