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Diagnóstico Parasitológico
Taís Rondello Bonatti
1
• Protozoários intestinais
CDC, 2016
Introdução
Giardia duodenalis
- Prevalência: 8 a 30% em países emdesenvolvimento; 0,4 a 7,5% em paísesdesenvolvidos
Cryptosporidium spp.
- 30 a 50% das mortes por diarreia emcrianças abaixo de 5 anos
Entamoeba histolytica
- 50 milhões de casos e 100 mil mortes porano
2
Introdução
• Helmintos transmitidos pelo solo
CDC, 2016
Ascaris lumbricoides
• 807 milhões – 1,1 bilhão
Trichuris trichiura
• 609 – 795 milhões
Ancilostomatídeos (Necator americanus eAncylostoma duodenale)
• 576 – 740 milhões
3
Introdução
• Parasitos do sangue e tecidos
CDC, 2016
Leishmania spp.
• Cutânea: 700 mil a 1,2 milhões novos casos por ano
• Visceral: 200 mil a 400 mil novos casos por ano
Plasmodium spp.
• 2015: 214 milhões de novos casos de malária e 438.00mortes
4
Introdução
• Brasil: decréscimo da prevalência (?) - muitas doenças não são denotificação obrigatória
• Aumento da consciência sobre a importância das doenças parasitárias
• Médicos: não vão realizar os exames mas precisam entender ascapacidades e limitações de cada método
Garcia, 2007; CDC, 2016 5
Abordagem ao paciente:
• Necessidade do histórico completo: particularmente viagens
• Sintomas podem ser sutis e mudar ao longo do tempo
• Histórico geral também é importante: ocupação, hobbies, atividades de lazer, dieta, medicamentos
• Dificuldade no diagnóstico clínico
• Não permite diferenciação específica do agente infeccioso
Introdução
6
Introdução
• Necessidade do diagnóstico laboratorial
• Diagnóstico incorreto: procedimento e interpretação
• Tratamento do paciente: demonstração definitiva do agenteetiológico
Garcia, 2007. 7
PARASITOS INTESTINAIS
8
Exame parasitológico de fezes
EPF ou exame coproparasitológico:Análise laboratorial a partir de amostra(s) de fezes
Não faz parte dos exames complementaressolicitados
Parasitoses intestinais não consideradas nahipótese diagnóstica
- Médico desconhece o EPF
Exames baratos, não invasivos, de fácil execução
- Evita a realização de exames mais invasivos, onerosos e complexos9
Exame parasitológico de fezes
Reforçar as instruções de
seguir as recomendações da coleta do material
MédicoParticipação ativa: quem vai realizar a
coleta
Paciente
10
Colheita e preservação das amostras
• Maioria parasitos intestinais: detecção por exame de fezes• Outras amostras: urina, escarro, secreções urogenitais, aspirados, tecidos,
conteúdo duodenal, amostras obtidas por biópsia
• Fezes eliminadas no vaso sanitário ou no solo: inadequadas
Urina: destruição de trofozoítos
Presença de organismos de vida livre
11
Colheita e preservação das amostras
• Estágios usuais de diagnóstico:
• Ovos e larvas de helmintos
• Cistos, oocistos e trofozoítos de protozoários
12
Colheita e preservação das amostras
• Identificação segura e correta:
• Critérios morfológicos
• Colheita adequada
• Boa preservação da amostra
Fragmentos de alimentos, células vegetais, grãos de pólen, outros artefatos. 13
Colheita das amostras: Cuidados
• Fezes emitidas espontaneamente
• Detecção e identificação qualidade da amostra entregue nolaboratório
• Quantidade mínima: 20 a 30g de fezes
• Fezes pastosas ou mucosas: esfregaços corados
• Fezes formadas: técnicas de concentração
• Nunca devem ser incubadas a 37oC ou congeladas
14
Colheita das amostras: Cuidados
• Fezes emitidas espontaneamente
• Uso de antidiarreicos, antibióticos, antiácidos, vaselina e óleosminerais: amostra insatisfatória para análise• Antibióticos: afetam flora intestinal - diminuição ou ausência temporária dos
organismos nas fezes
• Exames com aplicação de contraste:• Bário e bismuto: excesso de substâncias cristalinas – podem destruir
trofozoítos devido à ação abrasiva
• Colheita deve ser adiada por período de 7 a 10 dias ou feita antes do exame
15
Colheita das amostras
• Frasco: boca larga, capacidade de 50mL, limpos, vedados, acondicionadosem plástico transparente
• Identificação do frasco:• Nome, número de identificação, nome do médico, data e horário da
colheita
16
Colheita das amostras
17
Colheita das amostras
• Amostras múltiplas
• Intermitência da passagem de certos parasitos a partir doshospedeiros• Cistos de Giardia duodenalis: 2 a 3 até 7 a 8 dias
• Distribuição não uniforme dos ovos de helmintos• Enterobius vermicularis: liberação esporádica
• Estágios dos protozoários• E. histolytica (colite amebiana): trofozoítos mais numerosos na superfície do
que no centro do bolo fecal
• Limitações das técnicas de diagnóstico
18
Colheita das amostras
• Amostras múltiplas
• Esquemas mais utilizados (antes de iniciar o tratamento):
• Após o tratamento:
• Protozoários: três a quatro semanas
• Helmintos: uma a duas semanas; tênia – cinco a seis semanas
Três amostras em dias alternadosNão ultrapassar 10 dias
Seis amostras em dias alternadosNão ultrapassar 14 dias
19
Colheita das amostras
• Fezes emitidas com o uso de laxantes
• Apenas com solicitação médica: amebíase, giardiose, estrongiloidíase
• Indicação: série de exames negativa
• Laxantes salinos: menos danos morfológicos aos parasitos• Fosfato de sódio, sulfato de sódio tamponado
• Fezes induzidas por purgativos devem ser totalmente colhidas elevadas imediatamente ao laboratório
• Indicada para clínicas e hospitais
20
Colheita das amostras
• Estabilidade das amostras
Amostras líquidas
• Análise em 30 minutos
Amostras pastosas
• 1 hora após a evacuação
Amostras sólidas
• 24 horas após excreção
Quando não for possível: material deverá ser
preservado
21
Preservação da amostra fecal
• Amostras que não são entregues imediatamente ao laboratório
• Refrigeração: 3oC a 5oC (temporariamente)• Recipientes hermeticamente fechados
• Ovos e larvas de helmintos e cistos: viáveis por vários dias
• Larvas de Strongyloides stercoralis e ancilostomatídeos: podem sofreralterações
22
Preservação da amostra fecal
• Uso de conservantes
• Três partes de conservante para uma parte de fezes
Não precisam ser enviadas imediatamente ao laboratório
Não necessitam de manutenção em baixas temperaturas
Análise não precisa ser feita imediatamente
23
Preservação da amostra fecal
• Conservantes mais usados
• Solução de formaldeído
• Concentrações:• 5%: cistos de protozoários
• 10%: oocistos de coccídios, esporos de microsporídios, ovos e larvas dehelmintos
• Neutra: mais eficaz na manutenção das características morfológicas: soluçãode formaldeído tamponada com fosfato de sódio
• Manutenção da amostra: até 1 mês
24
Preservação da amostra fecal
• Formaldeído a 5% e 10% (tamponada e não tamponada)
- Excelente preservador deamostras fecais (cistos, oocistos,esporos, ovos e larvas de helmintos)
- Fácil preparação e longo períodode validade
- Organismos são fixados entre 2 e 4horas (Exceção: A. lumbricoides)
- Não preserva os trofozoítos deprotozoários
- Morfologia dos parasitos não épreservada adequadamente para ascolorações permanentes
Van
tage
ns
Desvan
tagens
25
Preservação da amostra fecal
• Conservantes mais usados
• Fixador de Schaudinn
• Fezes frescas ou amostras da superfície da mucosa intestinal
• Preparações de esfregaços permanentes: protozoários intestinais
• Contém cloreto de mercúrio II na sua fórmula: extremamente tóxicoao homem e ao meio ambiente
26
Preservação da amostra fecal
• Fixador de Schaudinn
- Preservação de fezes frescas ouamostras da superfície da mucosaintestinal
- Excelente preservação detrofozoítos e cistos de protozoários
- Ótimos resultados de coloração:hematoxilina férrica ou tricrômico
- Não recomendado para técnicas deconcentração
- Cloreto de mercúrio II
- Fraca capacidade de adesão àlâmina quando usado para amostraslíquidas ou mucóides
Van
tage
ns
Desvan
tagens
27
Preservação da amostra fecal
• Conservantes mais usados
• Álcool Polivinílico (APV)
• Resina solúvel em água incorporada ao fixador de Schaudinn
• Pó que serve como um adesivo para o material fecal na lâmina demicroscopia
28
Preservação da amostra fecal
• Fixador APV
- Excelente preservador detrofozoítos e cistos para coloraçãode esfregaços permanentes
- Adesão das amostras fecais àslâminas
- Longo período de validade (6meses a 1 ano)
- Organismos fixados em uma ouduas horas
- Contém o cloreto de mercúrio II
- Difícil preparação no laboratório
- Não indicado para técnicas deconcentração
- Ovos de T. trichiura e cistos deGiardia não são facilmenteconcentrados
- Material não pode ser usado emtestes imunológicos
Van
tage
ns
Desvan
tagens
29
Preservação da amostra fecal
• Conservantes mais usados
• MIF = Mertiolato (mercuriocromo), Iodo e Formol
• Ovos ou larvas de helmintos, cistos e oocistos de protozoários
• Exame direto a fresco: imediato ou após várias semanas
30
Preservação da amostra fecal
• Fixador MIF
- Exame direto a fresco: reagentespreservam e coramsimultaneamente
- Fácil preparação
- Longo período de validade
- Estudos epidemiológicos emcampo
- Organismos fixados entre uma deduas horas
- Morfologia dos parasitos é alteradanos esfregaços permanentementecoradosV
anta
gen
sD
esvantagen
s
31
Preservação da amostra fecal
• Conservantes mais usados• SAF = Acetato de Sódio-Ácido Acético-Formaldeído
• Acetato de sódio: tampão
• Bom rendimento: cistos, oocistos e trofozoítos• Trofozoítos de Giardia e amebas (não se conservam em MIF ou formol 10%)
• Fezes formadas e diarreicas
• Substitui fixador de Schaudinn (bicloreto de mercúrio): extremamentetóxico
32
Preservação da amostra fecal
• Fixador SAF
- Concentração e preparação deesfregaços permanentementecorados
- Fácil preparação
- Longo período de validade
- Excelentes resultados de coloração(Hematoxilina férrica)
- Organismos fixados entre 1 e 2horas
- Requer uso de albumina fixadorapara a adesão da amostras à lâmina
- Resultados regulares de coloraçãoquando corados pelo tricrômico
Van
tage
ns
Desvan
tagens
33
Preservação da amostra fecal
• Coletores com preservantes
34
Preservação da amostra fecal
• Coletores com preservantes
TF-Test (Three Fecal Test)
35
Preservação da amostra fecal
• Coletores com preservantes
36
Preservação da amostra fecal
• Coletores com preservantes
37
Fase Analítica
Exame macroscópico
Exame microscópico
38
Exame Macroscópico
• Aspectos:• Consistência
• Odor
• Cor
• Presença ou ausência de:• Sangue, muco, pus, proglotes, vermes adultos, fragmentos de vermes ou
outras condições anormais
• Deve anteceder o exame microscópico
39
Formadas
Semi-formadas
Pastosas
Líquidas
Cistos
Trofozoítos
Ovos e larvas de helmintos: em todos os tipos de amostras fecais
mas dificilmente encontrados em amostras
líquidas
Exame Macroscópico
40
• Tamisação
• Vermes adultos: Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis,proglotes das tênias
• Vantagens: demonstração e colheita de pequenos helmintos,proglotes e escóleces.
• Identificação: ácido acético glacial ou Tinta da China (nanquim)
Exame Macroscópico
41
• Tamisação
Exame Macroscópico
PROGLOTE MADURA
- Órgãos reprodutores ♂
e ♀ bem desenvolvidos
PROGLOTE GRÁVIDA-Sem distinção dos órgãos
- Útero ramificado
Vermes Adultos(Ascaris lumbricoides,
Enterobius vermicularis)42
Exames Microscópicos
• Visualização:
• Ovos ou larvas de helmintos
• Cistos, oocistos ou trofozoítos de protozoários
• Processos de enriquecimento e coloração
• Métodos gerais: sedimentação espontânea e centrifugação
43
Exames Microscópicos
• Qualitativos: mais utilizados (presença de formas parasitárias)
• Quantitativos: contagem de ovos nas fezes – intensidade doparasitismo• Pouco utilizados: medicamentos antiparasitários levam em conta o peso
corporal e não a carga parasitária (Stoll-Hausheer e Kato-Katz*)
44
Exames Qualitativos
• Exame Direto a Fresco
• Simples e eficiente: trofozoítos vivos dos protozoários
• Solução salina a 0,85% (cloreto de sódio) e iodo
• Se uso da formalina: não precisa a solução salina
• Amostras não refrigeradas
Princípio: avaliar carga parasitária; diagnóstico rápido
• Movimentação de trofozoítos – com uso de solução salina
45
Exames Qualitativos
• Exame Direto a Fresco
Revisão de lâminas previamente negativas
46
Quantidade grande de
amostra fecal
• Exame Direto a Fresco
• Uso de colorações temporárias:• Núcleos dos trofozoítos de amebas, cistos
• Soluções indicadas: Iodo• Lugol (iodeto de potássio): diferentes concentrações
• Quensel: diferencia os núcleos de três gêneros de amebas• Entamoeba, Iodameba e Endolimax
• Sudan III, álcool etílico, azul de metileno e cloreto de cádmio
Exames Qualitativos
47
• Técnicas de concentração
• Objetivos:
Exames Qualitativos
Aumentar o número de cistos, oocistos e ovos oularvas na preparação
Eliminar a maioria dos detritos fecais
Apresentar os organismos em um estado inalterado:facilitar a identificação
48
• Técnicas de flutuação• Diferença de densidade específica: ovos de helmintos e cistos e
oocistos de protozoários e o material fecal
• Reagentes de alta densidade
• Ovos considerados pesados: Ascaris, Taenia, Schistosoma e Fasciola
Formas Densidade
Ovos e cistos 1,05 a 1,15 g/mL
Exames Qualitativos
49
• Técnicas de flutuação
- Formação na superfície dotubo de uma membrana claracom poucos detritos fecais
- Remoção seletiva de cistose ovos mesmo quandopresentes em pequenosnúmeros
- Alta densidade dosreagentes: colapso daparede dos ovos e cistos –observação deve ser feitaentre 10 e 20 minutos
Van
tage
ns:
D
esvantagen
s:
Exames Qualitativos
50
•Técnicas de flutuação• Flutuação em solução saturada de cloreto de sódio (d=1,20g/mL) =
Técnica de Willis
• Ovos com densidade específica baixa: ancilostomatídeos
• Não recomendado para ovos de trematódeos, E. vermicularis e A.
lumbricoides
• Cistos de protozoários: retração
Exames Qualitativos
51
•Técnicas de flutuação
Exames Qualitativos
• Coar / filtrar as fezes (fezes frescas)
• Homogeneização (Frasco de boca larga)
• Adição de Solução NaCl
• Homogeneização
• Adição de NaCl (Menisco positivo)
• Lamínula / 10 a 15 min
52
• Técnicas de flutuação• Outras soluções com o mesmo princípio da Técnica de Willis:
• Flutuação em solução saturada de sulfato de zinco (1,18 g/mL)
• Flutuação em sulfato de magnésio e Cloreto de sódio
Exames Qualitativos
53
• Centrífugo – flutuação em solução saturada de sulfato dezinco (d=1,18 g/mL) = Técnica de Faust
• Cistos de protozoários, ovos e larvas de helmintos
• Não é adequada para ovos de trematódeos, cestódeos e A.lumbricoides (inférteis)
• Pode ser usada para fezes preservadas em formaldeído (5% ou 10%),SAF e APV (densidade deve ser ajustada para 1,20 g/mL)
Exames Qualitativos
54
Exames QualitativosRemover o
sobrenadanteSolução de
sulfato de zinco
Recolher a película superficial com alça
650 x g
2 a 3 min650 x g
55
• Técnicas de sedimentação• Objetivos:
• Aumento do número de ovos, larvas, cistos• Separação das gorduras e óleos
• Gravidade (espontânea) ou centrifugação (MIFC)• Formas retidas no fundo do tubo• Detritos suspensos na superfície
• Desvantagem: grande quantidade de detritos fecais
Exames Qualitativos
56
• Técnicas de sedimentação
• Sedimentação espontânea = Método de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)
• Fundamento: sedimentação espontânea em água• Ovos, larvas e cistos
• Vantagens: necessidade mínima de vidraria, dispensável o uso dereagentes e da centrifugação
• Desvantagem: grande quantidade de detritos, dificulta a leitura daslâminas
Exames Qualitativos
57
• Técnicas de sedimentação
• Sedimentação espontânea = Método de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)
Exames Qualitativos
58
• Técnicas de sedimentação• Centrífugo-sedimentação pela formalina-éter ou Centrífugo-Sedimentação
pela formalina-acetato de etila• Cistos de protozoários*
• ovos e larvas de helmintos
• pH da formalina pode afetar a recuperação:
• pH neutro é mais eficaz
Exames Qualitativos
pH Parasito
10 Ovos de Ascaris lumbricoides e S. japonicum
Entre 4,0 e 7,0 Ancislostomatídeos
59
Exames Qualitativos
1 a 2g de fezes em água / filtrar
Completar o tubo com água
Centrifugar650 x g / 1 min
Centrifugar500 x g / 1 min
Ressuspender com formalina (10%/pH neutro)
Repouso por 5 minAdicionar 3 mL de éter (ou acetato de
etila)
Fechar o tuboAgitar vigorosamente (30s)
Analisar o sedimento
60
• Centrífugo-sedimentação pela formalina-éter ou Centrífugo-Sedimentação pela formalina-acetato de etila
Exames Qualitativos
Restos fecais e gordura
Éter
Formalina
Sedimento
61
• Métodos específicos para coccídios
• Centrífugo-flutuação em solução saturada de sacarose = técnica deSheather• Oocistos de Cryptosporidium spp.
• Centrífugo-sedimentação pelo Formaldeído-Éter modificado
• Oocistos de Cryptosporidium spp. e Cyclospora cayetanensis
Exames Qualitativos
63
• Métodos específicos para coccídios
• Coloração de Ziehl-Neelsen• Coloração rosa ou vermelho / Fundo da preparação: azul
Exames Qualitativos
64
Exames Quantitativos
• Produção de ovos X carga parasitária
Ascaris lumbricoides
Trichuris trichiura
Ancilostomatídeos
• Necator americanus
• Ancylostoma duodenale
Schistosoma mansoni
65
Exames Quantitativos
• Estimativa da contagem dos ovos varia em relação direta com a acuidadedo procedimento
• Intensidade da infecção: número de ovos encontrados
• OPG = ovos por grama: índice de densidade dos ovos nas fezes
• OPD = ovos por dia: multiplicação do OPG pelo peso total (g) do materialfecal de 24 horas
OPD = OPG x g
• OPDPF = ovos por dia por fêmeaOPDPF = OPD ÷ número de vermes
66
Exames Quantitativos
• Método de Kato-Katz
• Ovos de helmintos• Não é indicado para protozoários e larvas de helmintos
• Vantagem: quantidade significativa de fezes – 50 a 60 mg
• Lamínulas de celofane: glicerina e solução de verde malaquita• Melhora a visualização da lâmina
• Torna os ovos mais visíveis
• Necessidade de amostras frescas ou refrigeradas
67
Exames Quantitativos
• Método de Kato-Katz
68
Exames Quantitativos
• Método de Kato-Katz
Ovo de Schistosoma mansoni visto em exame de fezes pelo Kato-Katz 69
• Não existe método capaz de diagnosticar ao mesmo tempo todas asformas parasitárias
• Mais gerais: sedimentação espontânea e centrifugação
• Rotina do EPF:• Diagnóstico de vários parasitos intestinais
• Fácil execução e baixo custo
• Importante interação entre médico e laboratório: execução dométodo mais adequado a cada situação
Escolha do Método
70
• Garantia de qualidade no EPF:
• Algumas espécies são evidenciadas apenas por técnicas especiais
• Apenas um exame isolado com resultado negativo não deve serconclusivo
• Produção de cistos, ovos e larvas não é uniforme ao longo do dia
Escolha do Método
71
PARASITOS DO SANGUE E TECIDOS
72
Principais parasitos
Trypanosoma cruzi
Fora das hemácias
Plasmodiumsp.
P. vivax
P. falciparum
P. Malariae
Hemácias
Leishmania sp.
Fora das hemácias
Filárias
Wuchereriabancrofti
Mansonellaozzardi
Fora das hemácias
73
• Estirados e Gota espessa
• Sangue total colhido com anticoagulante
• Sedimento de métodos de concentração: Trypanosoma sp. emicrofilárias
• Apenas uma amostra de sangue não é suficiente para o diagnóstico:• Colher entre 6 e 12 horas (3 a 5 dias) para que não haja suspeita de infecção
Esfregaços sanguíneos
74
• Estudo das hemácias, contagem de leucócitos
• Diagnóstico e estudo diferencial de Plasmodium sp. (alta densidade)
Esfregaço Estirado
75
Esfregaço Estirado
Lâmina corada de boa qualidade76
Esfregaço Estirado
77
• Quantidades relativamente grandes de sangue em pequena área
• Coleta:
Esfregaço Espesso (Gota Espessa)
78
Permite detectar a infecção mesmo com parasitemias leves
Esfregaço Espesso (Gota Espessa)
79
Indicada para inquéritos epidemiológicos
Combinação de esfregaços
80
Coloração de esfregaços sanguíneos
Giemsa
- Diferenciação nuclear e/ou citoplasmática (plaquetas,eritrócitos, leucócitos e parasitos)
- Esfregaços estirados (fixados com álcool metílico)
- Gota espessa
Coloração de Leishman
- Esfregaços estirados
- Eosina-azul-de-metileno
81
• Centrifugação do sangue (Creme Leucocitário)
• Leishmania donovani, Trypanosoma sp. e microfilárias• Sangue colhido com EDTA, heparina e/ou citrato de sódio (anticoagulantes)
Concentração do sangue
Esfregaço estirado – pode ser corado
82
• Centrifugação do Micro-Hematócrito
• Utilização de tubos capilares
• Diagnóstico rápido da malária e Doença de Chagas (baixa parasitemia)
Concentração do sangue
83
IMUNODIAGNÓSTICO
84
• Toxoplasmose
• Doença de Chagas (fase crônica)
• Abscesso amebiano
• Leishmaniose visceral
• Esquistossomose (fase crônica)
• Cisticercose
• Hidatidose
• Larva migrans visceral (toxocaríase)
Considerações Gerais
Grande importância da detecção
de anticorpos
85
• Colheita da amostra - depende do sítio de infecção do parasito:• Soro, líquor, urina, fezes, tecidos
• Importância de verificação dos antígenos:
• Imunodiagnóstico
• Interpretação da imunopatologia
• Quantificação de diferentes respostas imunológicas do hospedeiro
• Avaliação do potencial de vacinas
Considerações Gerais
86
• Técnicas que não usam marcadores:
• Detectam / quantificam as consequências da ligação Ag - Ac• Reações de Precipitação• Reações de Aglutinação• Reação de Fixação do Complemento
• Técnicas que usam marcadores:
• Detectam / quantificam diretamente a ligação Ag - Ac• ELISA (Enzyme-liked Immunosorbent Assay)• Imunofluorescência (Direta e Indireta)
Considerações Gerais
87
• Quantificação de precipitados formados pela reação Ag-Ac
• Proporções adequadas de Ag-Ac
• Proporção ideal: zona de
Equivalência
• Atualmente:
Emprego de espectrofotômetros
Reações de Precipitação
Antígenos(solúveis)
Anticorpos
Zona de equivalência: ppt visível
88
• Exemplos:
• Imunodifusão radial dupla
• Imunodifusão radial simples
• Imunoeletroforese
• Imunofixação
Reações de Precipitação
89
• Componente conhecido (Ag ou Ac): ligado à superfície decélulas/partículas – facilita a visualização
• Exemplos:
• Reação de Aglutinação Direta
• Reação de Aglutinação Indireta ou Passiva
• Reação de Hemaglutinação
Reações de Aglutinação
90
• Detecção de anticorpos específicos
• Reconhecimento de anticorpos na superfície dos eritrócitos –aglutinação
• Direta: determinantes antigênicos fazem parte da própria hemácia
• Indireta: hemácias são suporte para antígenos que são adsorvidos àsuperfície
Reações de Hemaglutinação
91
Reações de Hemaglutinação
Hemaglutinação Direta
92
Hemaglutinação Indireta
• Doença de Chagas: Hemaglutinação Indireta
Reações de Hemaglutinação
93
• Detectar Ac fixadores do complemento
• Ac só fixam complemento após a interação com Ag específico
• Etapas:
• 1ª: Soro + extrato antigênico solúvel e complemento
• 2ª: Sistema hemolítico para detectar se complemento está livre ounão
Reação de Fixação do Complemento
94
Reação de Fixação do Complemento
95
Soro + extrato antigênico solúvel e
complemento
Adição do complemento
Adição de células indicadoras
• Enzyme-liked Immunosorbent Assay
• Elevada sensibilidade, especificidade, rapidez e baixo custo
• Marcador é uma enzima que na presença de um substrato altera suacor: diferenciação entre positivo e negativo
ELISA
96
ELISA
97
• Marcação do antígeno ou do anticorpo com fluorocromos
• Direta: usa anticorpo antígeno-específico marcado com substânciafluorescente
• Indireta: detecção de anticorpos dirigidos contra alvo antigênicoespecífico fixado em uma lâmina• Referência na sorologia de muitas parasitoses: toxoplasmose, Doença de
Chagas e malária
Imunofluorescência
98
Direta
Imunofluorescência
Formas amastigotas de Leishmania em esfregaço de aspirado de linfonodo poplíteo
de cão naturalmente acometido por leishmaniose visceral, marcadas pelo anticorpo policlonal anti-Leishmania
conjugado com fluoresceína (Laurenti, 2009)
99
Imunofluorescência
IndiretaOocistos de
Cryptosporidium sp. oocistos (setas
amarelas)
Cistos de Giardiaspp. (setas vermelhas)
Kit para imunofluorescência 100
BIOLOGIA MOLECULAR
101
• Adoção de tecnologias de análise de ácidos nucléicos
• Vantagens: alta sensibilidade e especificidade
• PCR = Polymerase Chain Reaction• Amplificação exponencial in vitro de pequenas quantidades de DNA
• Qualquer sequência alvo de DNA pode ser amplificada
• A localização é feita pelos primers
Considerações Gerais
102
• Extração de DNA e RNA• Sangue, pele, músculos
• Kits comerciais ou fenol / clorofórmio (tóxico)
Reação em Cadeia da Polimerase
103
• Preparo da PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
104
• PCR consiste de três etapas principais:
Reação em Cadeia da Polimerase
105
• Visualização dos resultados:
Reação em Cadeia da Polimerase
106
Resultado da PCR após ser realizada uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida.
IDENTIFICAÇÃO HISTOLÓGICA
107
Protocolo Geral
108
Fixação Processamento Corte
Coloração (Histoquímica e
Imuno-histoquímica)
Montagem
Lâminas histologia
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Granuloma hepático devido a Schistosoma mansoni Amastigotas de T. cruzi em tecido cardíaco