Upload
others
View
2
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Diagnós(co Molecular de infecciones: al lado de la cama del
inmunocomprome(do Dr. Juan Pablo Torres Torre;
Pediatra Infectólogo – Doctor en Ciencias Médicas
Depto. de Pediatría y Cirugía Infan<l Oriente
Unidad de Infectología – Hospital Calvo Mackenna
Facultad de Medicina, Universidad de Chile
Sub Director de Inves<gación
Clínica Las Condes
XXVIII CONGRESO CHILE NO DE INFECTOLOGÍA, LA SERENA 2011
• La infección es la primera causa de mortalidad en niños con cáncer y neutropenia febril (NF). Similar en pacientes trasplantados
• Diagnós<co e<ológico NF: Hasta 20 -‐ 30% • Es relevante conocer agente de la infección para iniciar tratamiento an<microbiano adecuado.
• Predicción del riesgo de infección severa
Problema
Problema Neutropenia
Febril
Bajo Riesgo IBI (1/3) Alto Riesgo IBI (2/3)
Sin Sepsis (3/4) Sepsis (1/4)
Fallece No Fallece
PINDA, 2010
20-25% Diagnóstico Etiológico
60% Diagnóstico Etiológico
80% Diagnóstico Etiológico
British Medical Bulletin 2002; 61: 97-114
Diagnós<co molecular vs convencional
Cul(vo IFI/IFD ELISA Sondas PCR
Rapidez + +++ +++ ++ ++/+++
Sensibilidad ++ / +++ ++ ++ ++ ++++
Especificidad +++ ++ ++ +++ ++++
Facilidad + + +++ + ++
Ventajas Diagnós<co Molecular
Resultados más rápidos
Técnicas estandarizadas, automa<zadas
Microorganismos de dibcil crecimiento
Mayor sensibilidad y especificidad
Inves<gación
Limitaciones Diagnós<co Molecular
Falsos (+): Contaminación
Falsos (-‐): Extracción ADN, inhibidores, par<dores
Mayor costo (rela<vo)
Debe sospechar agente infeccioso
No informa sensibilidad an<microbianos
Diagnós<co Molecular de Infecciones Paciente Inmunocomprome<do
• Infecciones virales • Infecciones bacterianas • Infecciones fúngicas
• Predicción de la infección (e(ología, severidad)
VIRUS
Infección por CMV An<genemia versus PCR cuan<ta<va
Farfán M, Torres JP, Vergara A y cols. Rev Chil Infectol 2011;28:113-17
Infección por CMV An<genemia versus PCR cuan<ta<va
Farfán M, Torres JP, Vergara A y cols. Rev Chil Infectol 2011;28:113-17
Infecciones virales
POSITIVOS (n)
NEGATIVOS (n)
TOTAL (n)
Rendimiento (+)
Citomegalovirus 345 1601 1946 18%
Epstein Barr 360 899 1259 40%
Adenovirus 6 603 609 1%
• Período 2009-‐2011: Total PCR cuan<<vas = 2308 • Pacientes TMO, Tx hepá<co, Tx renal, otro • Muestras: sangre, tejido, LBA, LCR, fluídos • PCR <empo real cuan<ta<va CMV, VEB, ADV
Centro Estudios Moleculares U de Chile – HLCM, 2011
Infecciones virales Onco + TMO (n=1506)
POSITIVOS (n)
NEGATIVOS (n)
TOTAL (n)
Rendimiento (+)
Citomegalovirus 250 1088 1338 19%
Epstein Barr 105 611 716 15%
Adenovirus 5 576 581 1%
Trasplante hepá(co (n=241)
POSITIVOS (n)
NEGATIVOS (n)
TOTAL (n)
Rendimiento (+)
Citomegalovirus 8 163 171 5%
Epstein Barr 115 80 195 59%
Trasplante renal (n=262)
POSITIVOS (n)
NEGATIVOS (n)
TOTAL (n)
Rendimiento (+)
Citomegalovirus 13 209 222 6%
Epstein Barr 37 166 203 18%
Centro Estudios Moleculares U de Chile – HLCM, 2011
Infecciones virales
• CMV: Detección de infección, no enfermedad
Infecciones virales
• CMV: Detección de infección, no enfermedad • ADV: Bajo número de detecciones
5 (+)/581 (1%) determinaciones
3 (+) / 30 (10%) pacientes
3 (+) / 13 (23%) vigilancia post TMO
Lucero Y. Centro Estudios Moleculares U de Chile – HLCM, 2011
Infecciones virales
• CMV: Detección de infección, no enfermedad • ADV: Bajo número de detecciones
• VEB: Detección precoz, Sd linfoprolifera<vo
• Muestra nasofaríngea: -‐ Detección 17 virus respiratorios
-‐ Plataforma PCR-‐microarrays de baja densidad (Genomica®)
Detección molecular virus respiratorios
Caracterís(cas clínicas y de laboratorio al ingreso 331 episodios de NF en niños con cáncer
Torres JP y cols. Fondecyt 11080113
Distribución de microorganismos detectados en NF alto/bajo riesgo IBI en 331 episodios de NF
Torres JP y cols. Fondecyt 11080113
Torres JP y cols. Fondecyt 11080113
Estacionalidad de las infecciones respiratorias virales en 331 episodios de neutropenia febril
Torres JP y cols. Fondecyt 11080113
Presencia de sintomatología respiratoria en pacientes con y sin detección de virus respiratorio.
Síntomas Virus Respiratorio(+)
Virus Respiratorio (-‐)
p
Coriza 29% 17% 0.04
Signología Pulmonar
23% 10% 0.02
Tos 34% 24% NS
Odinofagia 11% 7% NS
Torres JP y cols. Fondecyt 11080113
Torres JP y cols. Fondecyt 11080113
Edad (años)
Riesgo IBI
Virus Respiratorio detectado
Hipotensión PCR al ingreso (mg/L)
Presentación Clínica Resultado
12 Bajo Influenza A No 53 Leucemia refractaria Muerte
2 Bajo Influenza A No 135 Neumonia Favorable
3 Alto Parainfluenza No 13 Neumonia Favorable
17 Bajo Parainfluenza Sí 141 Neumonia + Shock Favorable
1 Bajo Parainfluenza Sí 104 Proc<<s + Shock Favorable
7 Alto VRS Sí 208 Neumonia + Shock Favorable
11 Bajo VRS No 6 Neumonia Favorable
Caracterís<cas episodios NF con ingreso UTI
Torres JP y cols. Fondecyt 11080113
Infecciones Respiratorias Virales
• Las infecciones respiratorias virales fueron el principal agente de infección detectado, tanto en NF de alto y bajo riesgo IBI.
• Pacientes con detección virus respiratorio, sin detección convencional o molecular de infección bacteriana, tuvieron evolución favorable.
• Coinfecciones virales y viral-‐bacteriana no fueron más
graves. • Conocer precozmente la e<ología de las NF ayudaría a
op<mizar el manejo de estos pacientes.
BACTERIAS
Detección molecular de bacterias
• Obj: Aumentar la detección del patógeno en episodios de neutropenia febril
• Muestra: Sangre directa • Hora 0 y 24 • Validación de PCR en <empo real para las infecciones bacterianas que más se asocian a mortalidad en NF en niños:
-‐ Staphylococcus aureus -‐ Escherichia coli
-‐ Pseudomonas aeruginosa
Santolaya ME y cols. Ped Infect Dis J 2011;11:957-61
Santolaya ME y cols. Ped Infect Dis J 2011;11:957-61
Santolaya ME y cols. Ped Infect Dis J 2011;11:957-61
Gram negativos Gram positivos Hongos
Escherichia coli Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) Serratia marcescens Enterobacter (cloacae/aerogenes) Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Stenotrophomonas maltophilia
Staphylococcus aureus CoNS 1 Streptococcus pneumoniae Streptococcus spp. Enterococcus faecium Enterococcus faecalis
Candida albicans Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida glabrata Candida krusei Aspergillus fumigatus
F G(+) G(-) Probe A
Probe B
Probe C
for Microorganism X
for Microorganism Y
for Microorganism Z
Detección múl<ple patógenos bacterianos
Detección múl<ple patógenos bacterianos
• Sep<fast en 141 episodios de NF vs Hemocul<vos
• HC: n=44 35/141 (25%)
• HC + SF: n=78 61/141 (43%)
p=0.002
J Clin Microbiol 2010;48:3510-16
Sep<fast hora 0 y 24 en 17 episodios de NF
No. Blood Culture SeptiFast 0 hour SeptiFast 24 hour
1 Negative Not done Negative
2 Negative Not done Negative
3 Negative Not done Negative
4 Negative Not done Negative
5 Negative Negative Negative
6 Negative Negative Negative
7 Negative Enterobacter Negative
8 Negative Negative E. coli
9 E. coli E. coli + Stenotrophomonas Negative
10 E. coli S. aureus Negative
11 E. coli + CoNS Streptococcus pneumoniae Negative
12 E. coli + CoNS Negative S. aureus
13 Enterobacter Negative Klebsiella + Enterobacter
14 P. aeruginosa + Enterobacter Negative Negative
15 Gram-negative Bacillus Enterobacter S. aureus
16 S. aureus Not done S. aureus
17 S. aureus Negative Negative
Sakurai H, Vergara I, Torres JP y cols. Comunicación personal
Blood Cultures (time 0 hour)
SeptiFast
time 0 hour (n=12) time 24 hour (n=17) total (n=17)
Positive Negative Positive Negative Positive Negative
Positive 1 1 2 1 3 2
Negative 7 3 7 7 6 6
SeptiFast (0 hour) SeptiFast (24 hour) SeptiFast (total)
Sensitivity 13% 22% 33%
Specificity 75% 88% 75%
Positive predictive value 50% 67% 60%
Negative predictive value 30% 50% 50%
Positive Likelihood ratio 0.50 1.78 1.33
Negative Likelihood ratio 1.17 0.89 0.89
Sakurai H, Vergara I, Torres JP y cols. Comunicación personal
Sep<fast hora 0 y 24 en 17 episodios de NF
Detección múl<ple patógenos bacterianos
• MALDI-‐TOF en 212 hemocul<vos posi<vos
-‐ Sin iden<ficar: 42/212 (19%) -‐ Iden<ficación: 162/170 (95%)
J Clin Microbiol 2010;48:444-47
Neutropenia Febril <18a
Bajo Riesgo Alto Riesgo 2. Estudio variables bioquímicas: - NU, glicemia, PCR, IL-8. 3. Estudio variables moleculares: - RPC E coli, S aureus, P aeruginosa al ingreso en muestra sangre directa
Sin Sepsis Sepsis
Fallece No Fallece
1. Estudio variables clínicas: - Clasificación episodio NF (alto o bajo riesgo de IBI) - T°, conciencia, hemodinamia, diuresis
Sangre Sangre
ANF
1. Estudio viral molecular: - RPC múltiple 17 virus respiratorios (VRS, ADV, Influenza, hMPV, Parainfluenza, Coronavirus, Rinovirus)
Consentimiento Asentimiento
VIRUS BACTERIAS
Microorganismos detectados en 199 episodios de neutropenia febril
n= 120/199
Torres JP, Santolaya ME y cols. IDSA 2010, Vancouver.
HONGOS
109Sangre
109Suero
105Sangre
105Suero
PCR <empo real Aspergillus fumigatus • Límite de detección 280 fg ADN A. fumigatus/reacción
Ducasse K y cols. Congreso SOCHINF 2010
PCR <empo real Aspergillus fumigatus
Ducasse K y cols. Congreso SOCHINF 2010
Negativo Positivo0
1
2
3Galactomanano
Dogma Central Biología Molecular
DNA RNA Proteína
Transcriptasa Reversa cDNA
PCR RT-PCR
Microarrays
Microarrays
• Pequeño vidrio o chip de 1-‐2 cm2 • Muestras de DNA ordenadas en el vidrio
• Detectan miles de secuencias de DNA o RNA
Lancet Infect Dis 2004;4:100-11
Genómica y Proteómica HUMANA
INFECTOMA
Genómica y Proteómica PATÓGENO
FARMACOMA
Efecto DROGAS Genómica y Proteómica HUMANA
Efecto DROGAS Genómica y Proteómica PATÓGENO
HOSPEDERO MICROORGANISMO
Microorganismo
Virochip
J Pediatr 2008;153:76-83
Hospedero
Ramilo O, Mejías A. Cell Host & Microbe 2009
Blood 2007;109:2066-77
Virus vs Bacterias
91%
95%
87%
Blood 2007;109:2066-77
Training Test
S. aureus (Gram +) vs E. coli (Gram -‐)
95% 85%
Perfiles transcripcionales iden<fican patrones específicos de infección
E. COLI
S. PNEUMONIAE
S. AUREUS
INFLUENZA
RSV
Ramilo O, Mejías A. Comunicación personal. 2008
Nature 2010; 466:973-99
Neutropenia Febril <18a
Bajo Riesgo Alto Riesgo 2. Estudio variables bioquímicas: - NU, glicemia, PCR, IL-8. 3. Estudio variables moleculares: - RPC E coli, S aureus, P aeruginosa - Estudio microarreglos (interacción hospedero/microorganismo)
Sin Sepsis Sepsis
Fallece No Fallece
1. Estudio variables clínicas: - Clasificación episodio NF (alto o bajo riesgo de IBI) - T°, conciencia, hemodinamia, diuresis
4. Caracterizar perfil de expresión génica. 5. Modelo de Predicción Sepsis/No Sepsis
Sangre Sangre
ANF
1. Estudio viral molecular: - RPC múltiple 17 virus respiratorios (VRS, ADV, Influenza, hMPV, Parainfluenza, Coronavirus, Rinovirus)
Consentimiento Asentimiento
2. Estudio perfiles expresión génica: - Microarrarreglos - Predicción: a) Infección viral b) Coinfección virus-bacteria c) Infección bacteriana
Perspec<vas Diagnós<co Molecular
• Conocer gené<ca y epidemiología molecular de enfermedades infecciosas
• Aumento diagnós<co infectológico molecular • Diagnós<co rápido de patógenos (3 – 12 horas) • Iden<ficar nuevos agentes infecciosos o fas<diosos • Nuevas terapias ATB e inmunológicas • Predicción
• Infecciones virales -‐ Seguimiento y detección precoz CMV, ADV, EBV (estrategia an<cipatoria)
-‐ Caracterización infección respiratoria viral / coinfección • Infecciones bacterianas -‐ Op<mización del diagnós<co e<ológico
-‐ Detección precoz múl<ple de patógenos • Infecciones fúngicas -‐ Preliminar. PCR Aspergillus fumigatus
Diagnós<co Molecular de Infecciones Paciente Inmunocomprome<do
• Predicción (microarrays)
-‐ Infección viral versus Infección bacteriana
-‐ Sepsis versus no sepsis
Diagnós<co Molecular de Infecciones Paciente Inmunocomprome<do
Centro Estudios Moleculares
Facultad Medicina U. de Chile
Hospital Luis Calvo Mackenna
Proyectos -‐ RLT-‐PCR Aspergillus
-‐ Farmacogenómica
-‐ Otras PCRs
Fondecyt -‐ Inf. Resp. virales IC
-‐ Inf. Bact. y Sepsis en IC
-‐ Inf. Bact. (E. coli)
PINDA
Perspec(vas
Diagnóstico
Tratamiento Predicción
Agradecimientos
Hospital Calvo Mackenna -‐ María Elena Santolaya
-‐ Milena Villarroel
-‐ José Cofré
-‐ Paulina Coria
-‐ Jacob Cohen
-‐ Antonio Banfi -‐ Jorge Morales -‐ EU Verónica de la Maza -‐ Sra. Rosario Berríos
Hospital Exequiel González Cortés:
-‐ Carmen Salgado
-‐ Marcela Zubieta
Hospital San Juan de Dios: -‐ Mónica Varas
-‐Ana M Alvarez
Hospital San Borja
Arriarán
-‐ Carmen L Avilés
-‐ Pamela Silva
Hospital Roberto del Río: -‐ Juan Todecilla
-‐ San<ago Topelberg
Hospital Sótero del Río
-‐ Ana Becker
-‐ Tamara Viviani
• Centro Estudios Moleculares U. de Chile – Hosp Calvo Mackenna Dr. Mauricio Farfán TM Alejandra Vergara
• Programa Microbiología, ICBM, FM UCh Dr Miguel O’Ryan.
• Na(onwide Childrens Hospital, Columbus, OH, USA -‐ Dr. Octavio Ramilo -‐ Dra. Asunción Mejías -‐ Dra. Mónica Ardura