Aus dem Institut far Technologie und Vorratspflege der Humboldt-Universitat zu Berlin (Direktor: Prof. Dr. J . HERRMANN)

Die Aktivitat von Glucoseoxydase in Abhangigkeit von Temperatur, Wassergehalt und pH-Wertl

J. HERRMANN, J. VOCEL und M. KOLLER

Glucoseoxydase (fl-D-Glucose : 0,oxidoreductase; EC I . I -3.4) stellt bekanntlich ein seit einer Reihe von Jahren sowohl ana lybch [I] wie auch technologisch [2] vielseitig einsetzbares Enzym dar, dessen Reaktionsmechanismus aufgekliirt ist. Da der lebensmitteltechnologische Einsatzbereich der Glucoseoxydase noch diskutiert wird, hielten wir es fur nicht unwichtig, einige uns zur Verfiigung stehende F’riiparate auf ihre Wirksamkeit systematisch zu studieren.

Von den lebensmitteltechnologischen Verfahren, die sich des Einsatzes von Glucoseoxydase bedienen, interessieren besonders 2 Moglichkeiten :

a) Entfevnung der nuu in gevingev Menge uovhandenen Glucose, um sekund&e Reaktionen hintanzuhalten, z. B. Verhinderung der MAlLLARD-Re&tiOn bei Trocknung und hgerung von Eiprodukten;

b) Entfevnung von Sauevstoff aus Lebensmitteln und -verpackungen ; Anwendungsmoglich- keiten sind Hintanhaltung der Verfhbung von Obstsaften, Schutz von oxydationsanfWgen Produkten (Fette, Vitamine, Farb- und Aromastoffe), Verhinderung der Verfarbung von abgepacktem Fleisch und Klse, Vermeidung von Oxydationserscheinungen bei Trockenpul- vern (Kaffee, Tee, Milch, Fruchttrockensaften), Unterdruckung des Wachstums aerober Mikro- organismen, z. B. von Hefen (Stabilisierung von Wein, Bier usw.), Unterdriickung der oxyda- tiven Korrosion von WeiDblechdosen usw.

Von den Moglichkeiten zur Ermittlung der Aktivitat der Glucoseoxydase werden bei den vorliegenden Versuchen herangezogen einmal die titrimetrische Erf assung der aus Glucose gebildeten Gluconsaure, zum anderen die manometri- sche Messung des Sauerstoffverbrauches. Erstrebt werden weitere Erfahrungen uber die Einsatzmoglichkeiten des Enzyms auf dem Gebiet der abgepackten Lebensmittel; damit ist vorgezeichnet, den EinfluB von PH, Temperatur und Feuchtigkeit zu ermitteln.

Material und Methoden

r . Verwendete Enzym$rafiarate a) Glucoseoxydase des VE B Arzneimittelwerk Dresdert mit hoher Aktivitat, als

Verunreinigung wenig Katalase enthaltend , in Wasser vollstandig loslich. Die- ses Praparat durfte auf Grund seines hohen Preises in erster Linie fur analytische Zwecke, weniger fur lebensmitteltechnologische Zwecke geeignet sein.

b) Katalase (VEB Arzneimittelwerk Dresden). Wasserloslichkeit des grau- grun gefarbten Praparates sehr gering.

In Anlehnung an einen Vortrag bei der Hauptjahrestagung der Chemischen Gesellschaft in der DDR am 21. Oktober 1964 in Leipzig, Fachverband Lebensmittelchemie.

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c) Glucoseoxydase ungarischer HerkunfP mit geringer Aktivitat, aus Aspergil- lus niger gewonnen, neben Verunreinigungen auch Katalase in gr0Berer Menge enthaltend; teilweise in Wasser loslich. Dieses Praparat, als Nebenprodukt bei der Fructoseherstellung aus Melasse anfallend, diirfte trotz seiner relativ gerin- gen Aktivitat wegen der Preisgiinstigkeit fur den Einsatz in der Lebensmittel- industrie geeignet sein.

2 . Aktivitatsmessung

a) Titration der gebildeten Gluconsaure nach UNDERKOFLER [3j.

Substratliisung: In etwa 950 ml dest. Wasser werden 3,o g Eisessig und 2,92 g Kochsalz (DAB 6) gelost und mit 33%iger Natronlauge auf P H 51 eingestellt; man fiillt auf 1000 ml auf; darin werden 30 g Glucosemonohydrat gelost ; die Substratlosung sol1 bis zum Gebrauch I Std. stehen. Ausfuhrung der Bestimmmg : 25 ml der gepufferten Substratlosung werden in einem 30 cm hohen GlasgefaB (Durchmesser 3 cm) im Thermostaten auf 35 "C erwarmt. Wahrend dieser Zeit wird das zu testende Enzympraparat in Wasser gelost ; I ml dieser Losung (ca. 15 Glucoseoxydase-Einheiten enthaltend) wird in das ReaktionsgefaB gegeben ; beim Blindversuch wird die Enzymlasung zwecks Inaktivierung vor der Zugabe in das ReaktionsgefaB ca. 30 Sek. aufgekocht. Zur Unterdriickung des Schaumens wird ein Tropfen Silicon01 zugegeben. Durch jedes ReaktionsgefaB wird mittels eines Einleitungsrohres ein kraftiger Luft- strom (700 cma/Min.) geleitet. Nach genau 15 Min. gieBt man den Inhalt der ReaktionsgefaBe in je einen 300 ml-Weithals-Erlenmeyerkolben, der 10 ml O,I n-Natronlauge enthalt. Die ReaktionsgefaOe und die Einleitungsrohre wer- den dreimal mit dest. Wasser ausgespiilt und das Waschwasser der Liisung zu- gefugt. Diese Fliissigkeit wird mit 0,05 n-Salzsaure gegen Phenolphthalein zuriicktitriert,

Berechnung : ml 0,05 n-HC1 d. Blindwertes .- ml 0,05 n-HCI d. Versuchs). 3.1000

mg Enzym in I ml Enzymlosung -. __

= Glucoseoxydase-Einheiten pro Gramm (U/g)

b) Manometrische Bestimmung des Sauerstof fwerbrauchs nach SCOTT [4]. Substratlosung: Durch Losen von D-Glucose in Acetatpuffer (PH 51) wird eine 3%ige Losung hergestellt. Bestimmung : Von der Losung des Enzyms in der Substratfliissigkeit werden aliquote Teile in mehreren WARBURG-GffaBen in iiblicher Weise auf den Sauer- stoffverbrauch gepriift (30 "C, 30 Min., Schiittelfrequenz 12011 Min.).

DefinitionsgemaS entspricht eine Glucoseoxydase-Einheit der Menge Enzym, die einen Sauerstoffverbrauch von 10 pl O,/Min. (unter bestimmten Reaktions- bedingungen) bewirkt. Dementsprechend erfolgen die Aktivitatsangaben in

2 Fur die freundliche Uberlassung des Praparates sowie auch fur die Reratung sci an dicwr Stelk Herrn Dr. G. NAGY, Rudapest, bestens gedankt.

Aktivitat von Glucoseoxydase 661

wichtsanderung des in Wageglaschen enthaltenen Reaktionsgemisches bei den untersuchten Luft- feuchtigkeiten ermittelt. 25.8

Die Berechnung der Sorptionsisotherme wurde

387

46, I 6 6 3 5

Glucoseoxydase-Einheitenlg. Die titrimetrisch und manometrisch ermittelten Aktivitaten zeigten innerhalb der methodisch bedingten Fehlergrenzen gute ifbereinstimmung.

3. p~-Abhlingigkeit der Aktivitiit Diese Untersuchungen bedienen sich der titrimetrischen (Glucoseoxydase

ungarischer Herkunft) wie auch der manometrischen Methode (Glucoseoxydase des VEB Dresdener Arzneimittelwerk). Einstellung des Acetatpuffers auf die gewunschten pn-Werte durch Zugabe von 33yoiger Natronlauge ; dabei wurde den in Lebensmitteln herrschenden pa-Bereichen besondere Aufmerksamkeit gewidmet.

4 . Temperatzcrabhangigkeit der Aktivitat Es wurde das Dresdener Glucoseoxydasepraparat unter Zusatz von Katalase

eingesetzt. Die Messung erfolgte auf manometrischem Wege bei 10, 20, 30, 40. 50, 55 und 60 "C. In je 20 ml der acetatgepufferten Substratlosung mit 3% D-Glucose wurden 1,6 mg Glucoseoxydase und I,O mg Katalase gelost.

5. Abhiilzgigkeit der Aktivitlit von der Fewhtigkeit Die Messungen erfolgten nach Einstellung der Gleichgewichtsfeuchtigkeit

manometrisch bei 25 "C mit einem trockenen Gemisch aus z,o mg Katalase,

_- 70 55 45 35

97 mg Glucose, 258 mg KH,PO, und 14 mg N+HPO, ; fur innige Vermischung der Reaktions- partner war Sorge getragen. Tab. I gibt diemit

Tabelle I Relative Luftfeuchtigkeit ~

und zuzeharine

Darin bedeuten b [yo] = Wassergehalt des Gutes im Gleichgewichtszustand mit der relativen Luftfeuchtigkeit

a [yo] = Anfangswassergehalt g [yo] = Gewichtsanderung wahrend der Lagerung.

Tragt man b in prozentualer Abhangigkeit von der relativen Luftfeuchtigkeit auf, so erhalt man die Adsorptionsisotherme, die vom Reaktionsgemisch wie vom reinen Phosphatgemisch bestimmt wird. Der Anfangswassergehalt a betrug fur das Reaktionsgemisch 5,4y0, fur das Phosphatgemisch 2,0%. Bis zur Erzie- lung der gewunschten Gleichgewichtsfeuchtigkeit des Gemisches Enzym-Sub- strat-Phosphat (nach den ermittelten Sorptionsisothermen waren dazu min-

662 HERRMANN/VOGEL/KOLLER

; t + rr d

2 E 500 P -t -2

-

Die rnit Hilfe der titrimetrischen wie auch manometrischen Methode bestimm- te Aktivitat des ungarischen Enzyms in Abhangigkeit vom pn-Wert zeigt die ubliche Glockenform (Abb. I) rnit einem pn-Optimum von P H 6,3; das Enzym entfaltet im Bereich zwischen PR 5,5 bis 73 fast seine voile Aktivitat. Die Litera- tur gibt als pa-Optimum den Wert 5.6 (30 "C) an. KCSAI u. a. [5] ermittelten [\

I , , , , , , , , , , demgegenuber an einem aus Penicillium z c 6 8 10 amaaakiense aewonnenen knstallisier-

Y " ten Praparat von bisher hochstem er- reichten Reinheitsgrad ein optimales PH von 7,o; als untere Aktivitatsgrenze ge-

PH- Abb. I. pa-Abhangigkeit der Glucose-

oxydase-Aktivitdt

ben sie PH 3,5 an. Neben den beiden genannten Arten finden Penicillium glaucum [6] sowie Penicillium notatum [7] zur Gewinnung der Glucoseoxydase Venvendung.

Bedingt durch die geringe Aktivitat des ungarischen Praparates lie13 sich die untere pa-Grenze nicht rnit Sicherheit errnitteln; es ist aber bekannt, daI3 in diesem Bereich die Kurve konkav zur Abszisse verlauft. Unsere Ergebnisse stehen rnit den Angaben der Literatur (Aktivitatsbereich PR 3,0-9,0; volliger Verlust bei PR 2,o) weitgehend in ubereinstimmung. Beriicksichtigt man, dal3 auch Katalase in verdiinnten Losungen ihre Aktivitat bei PB ca. 3,o einbiil3t $1, dann ergibt sich, daB Glucoseoxydase bei sauren Lebensmitteln mit einem P H -

Wert < 3,o praktisch nicht mehr anwendbar ist. Aktivitatsmessungen von Enzymen in Bereichen auBerhalb ihrer Stabilitat

sind bekanntlich relativ und nur bei Einhaltung gleicher MeDzeiten unterein- ander vergleichbar. Deshalb ist bei Untersuchungen der PB- bzw. auch der Temperaturabhiinggkeit zu beriicksichtigen, daB kurzzeitige Messungen, ins- besondere rnit hoheren Enzymkonzentrationen, zu gunstigeren Werten fuhren, da Aktivitatsverluste durch niedrige pH-Werte bzw. hiihere Temperaturen noch

Aktivitat von Glucoseoxydase 663

nicht gravierend in Erscheinung treten. Dem ist bei der Auswertung der titri- metrisch bzw. manometrisch wahrend 15 bzw. 40 Min. ermittelten Werte Rechnung zu tragen. SchlieDlich entsprechen aber diese langen Einwirkungs- zeiten von Saure bzw. Temperatur gerade den in der Praxis herrschenden Bedin- gungen; denn die Bindung des Luftsauerstoffes aus dem Kopfraum einer Flasche oder Konservendose erfolgt nicht sofort, sondern erst wahrend einer Iangeren Reaktionsphase.

Abb. 2 veranschaulicht die Temperaturabhangigkeit der Fermentaktivitiit. Dabei reprasentiert der linke Kurvenast die Steigerung der Reaktionsgeschwln- digkeit gemaiB der V'ANT Hom'schen Regel mit einem fur die meisten enzymati- schen Reaktionen giiltigen Q,,-Wert von ca. 2, wahrend die gegenlaufige Wir- kung der Temperatur in der Inaktivierung des Fermentproteins mit einem angenommenen Q,,-Wert von 10 ihren Ausdruck findet. Aus diesen beiden Kurven ergibt sich als Resultante die dargestellte Optimumskurve.

0 10 20 30 40 50 60 T P C ] -

Abb. 2. Temperaturabhangigkeit der Fermentaktivitat [g]

Das Dresdener Enzympraparat, manometrisch gepruft, entfaltet nach Abb. 3 die hochste Aktivitat bei pk 6,6, hohere (74) wie auch insbesondere tiefere PH- Werte (51 und weniger) sind erwartungsgemao mit einem Aktivitatsabfall ver- bunden. Dem schematischen Verlauf der Kurven gemail3 Abb. 2 entsprechen die Inaktivierungskurven bei PH 2,98 bzw. 3,2, wohingegen die iibrigen Kurven abweichende Tendenz zeigen. Dies durfte mit einer Uberlagerung der Tempera- turabhangigkeit der Aktivitat der beiden an der Reaktion beteiligten Enzyme - Glucoseoxydase, Katalase - wie auch nach Inaktivierung von Katalase in der destruktiven Wirkung des entstehenden Wasserstoffperoxids gegenuber Katalase und evtl. auch Glucoseoxydase zu erklaren sein.

Als obere Grenze wurde bei niedrigen pa-Werten eine Temperatur von 50 bis 55 "C, bri hoheren pa-Werten eine solche von 55-60 "C ermittelt. Bei kurz- dauernder Temperatureinwirkung (z. B. Kurzzeiterhitzung) diirften auch hohere Temperaturen ohne Inaktivierung der Glucoseoxydase anwendbar sein. Die eigenen Werte iiber Thermostabilitat des Enzyms (50-55 "C) stimmen im wesentlichen rnit denen anderer Autoren iiberein. Bei Untersuchungen von UNDERKOFLER [3] sind allerdings Praparate mit offenbar hoherer Temperatur-

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stabilitat venvendet worden; so konnten von ihm nach 6-std. Erhitzung auf 60 "C bei PH 5 0 noch 55%, nach 1,5-min. Erhitzung auf 80 O C noch 10% der ursprunglichen Aktivitat nachgewiesen werden.

.\bb. 3. Temperaturabhangigkeit der Glucoseoxydase-Aktivitat bei verschiedenen pR-Werten

Erlluterung: O---O = PH 6,6 x- x = PH 7,4 0 ---0 = pH 5,1

Die Sorptionsisothermen des reinen Phosphat bzw. des Gemisches Enzym-Glucose-Phosphat weisen gemaB Abb. 4 gleichsinnigen Verlauf auf. Dies entspricht den Erwartungen, da der uber- wiegende Anteil des Enzym-Glucose-Phosphat- Gemisches sich aus Phosphaten zusammensetzt.

Abb. 5 veranschaulicht die Abhangigkeit qder Enzymaktivitat von der relativen Luftfeuchtig- keit. Erganzend sei bemerkt, da13 bei den einbe- zogenen relativen Luftfeuchtigkeiten von 25 bzw. 3,7% im untersuchten Zeitraum von 24 Std. eine Aktivitat nicht mehr nachgewiesen werden konnte. Bei Luftfeuchtigkeiten von 96 bzw. teilweise be- reits bei 82,5y0 tritt eine Verfliissigung des Enzym- Glucose-Phosphat-Gemisches ein. Unter diesen Bedingungen muB die Moglichkeit des Wachstums von Bakterien bzw. Schimmel in Rechnung ge- stellt werden. Der gleichsinnige Kurvenverlauf der in Abb. 7 wiedergegebenen Untersuchungen berech- tigt jedoch zu dem SchluB, da5 selbst bei einer evtl. eingetretenen Infektion die Aussagekraft der erhaltenen Ergebnisse nicht oder nur unwesentlich beeinfluBt wird.

Bemerkenswert ist der in Abb. 6 dargestellte geradlinige Verlauf des Sauerstoffverbrauches in den ersten Stunden ; dieser Prozess entspricht

A- A = p H 4 . d also einer Reaktion 0. Ordnung, wie man sie bei normalen Enzymreaktionen mit hohem Substrat- angebot findet. Verfolgt man den Substratumsatz

uberlangere Zeit (Abb. 7), so wird ein Umbiegen der Geraden unter Annaherung an einen Grenzwert deutlich. Als Erkl%rung sind mehrere Moglichkeiten denkbar, wenngleich ahnliche Kurven z. B. fur die Lezithinspaltung in Gerstenmalzschrot- mischung von ICKER u. a. [IO] vorliegen; zusatzlich konnte von ihnen nachge- wiesen werden, daB das Umbiegen der Kurven nicht auf eine Inaktivierung der Enzyme zuriickzufuhren ist. Neben den allgemein gultigen GesetzmaBigkeiten fur das Ansteigen der Enzymaktivitat bei hoherer Gleichgewichtsfeuchtigkeit sind bei Glucoseoxydase als spezifisch einflu5nehmende Faktoren in Retracht zu ziehen :

a) Glucoseoxydase ist substratspezifisch fiir @-n-Glucose. Die verwendete Glucose lag in der a-Form vor; ihre Umwandlung mit hinreichender Geschwin- digkeit in die @-Form kann nur in waBriger Losung erfolgen; bei wasserarmen

@--@ = PH 3,Z A- A = PH 2,98

Aktivitat von Glucoseoxydase 665

Medien lauft dieser ProzeB verzogert ab und wird damit zum begrenzenden Faktor.

b) Unter der Voraussetzung, daI3 Katalase bei geringer Luftfeuchtigkeit ihre Aktivitat einbiiBt, konnte das gebildete, zu weiterem Umsatz nicht befahigte Wasserstoffperoxid eine Inaktivierung von Glucoseoxydase bewirken.

Abb. 4. Sorptionsisothermen des Glucose- oxydase-Glucose-Phosphat- und des Phos-

phat-Gemisches

3 500-f /

2000 I

Abb. 5 . Abhangigkeit der Glucose- oxydase-Aktivit5t von der relativen

Lu ftfeuchtigkeit

2,s 50 7.5 t[h]-

Abb. 6. Sauerstoffverbrauch in Abhhgigkeit von der Zeit bei verschiedener Gleichgewichts- feuchtigkeit (Anfangsphase mit konstanter Reaktionsgeschwindigkeit)

44 Die Nahrung, Heft 6

666 HERRMANN/VOGEL/KOLLER

c ) Eine Hemmung der Glucoseoxydase-Aktivitat konnte auch durch Bildung von Komplexen aus Glucoseoxydase mit ihren Umwandlungsprodukten Gluco- nolacton bzw. Gluconsaure verursacht sein.

Aus der variierenden Aktivitat der Glucoseoxydase bei verschiedener relativer Luftfeuchtigkeit la13t sich ableiten, dal3 ihre Anwendung als sauerstoffver- brauchendes und damit qualitatsverbesserndes Agens bei sauerstoffempfind- lichen Trockenprodukten (Milch- und Kaffeepulver) nicht ohne weiteres moglich ist. Erst durch Anwendung unter bestimmten Bedingungen (z. B. wasserdampf- dichte, jedoch IuftdurchlaQige Verpackung), wobei die Zugabe des Enzym-

t ~ ~ 9 6 % L , T

fbl Abb. 7. Sauerstoffverbrauch in Xbhangigkeit von der Zeit

bei verschiedener Gleichgewichtsfeuchtigkeit

praparates in feuchtem Zustand zum Trockenprodukt ermoglicht ist, lieBe sich das Enzym erfolgversprechend auch auf diesem Sektor einsetzen.

Zusammenfassung I . In orientierenden Yersuchen wird der miigliche Einsatzbereich von Glucoseoxydase bei

sauren, hitzebehandelten sowie Trockengiitern gepriift. 2. Mit Hilfe der titrimetrischen Gluconsaure- bzw. manometrischen Sauerstoff-Restim-

mung wird die hktivitat von z Glucoseoxydase-Praparaten mit Katalasezusatz bei veachiede- lien p ~ , Temperatur- sowie Feuchtigkeitsbereichen gemessen.

3. Der Verwendungsbereich der Glucoseoxydase erstreckt sich auf Giiter mit einem pH-Wert > 3 : starker saure Produkte kommen fur eine solche Behandlung nicht in Frage.

4. GemaD der Thermostabilitat ist der Einsatz bis zu einer Behandlung von maximal 60 ‘C (ausgenommen Kurzzeiterhitzung) mijglich.

j. Mit sinkender Feuchtigkeit geht ein starker Aktivitatsabfall der Glucoseoxydase einher, so daU ihre.Verwendung bei Trockenprodukten nicht ohne weiteres rnliglich ist.

S u m m a r y

J. HERR~IANN, J. VOCEL and M. KOLLER: The activity of glucose oxidase as affected by temperature, water content and p~ value I . The authors studied in preliminary investigations the possible use of glucose oxidase in

acid, heat-processed and dried products. 2. The activities of z glucose oxidase preparations with admixtures of catalase were measu-

red (with the help of titrimetric gluconic acid and manometric oxygen determinations) at different p ~ , temperature and humidity ranges.

3. The utilization of glucose oxidase is limited to products with a pH > 3; more acid products are not suited for such a treatment.

Aktivititt von Glucoseoxydase 667

4. According to its thermostability, i t can be used for treatments up to 60 'C (with the excep-

5 . The activity of glucose oxidase decreases strongly with decreasing humidity, therefore it tion of short-time heating).

can not be used in dried products.

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