mykosen 15 (6) : 255-264 (1972) Eingegangen am 16. Marz 1971

Aus den Laboratorien fur Mikrobiologie der Abteilung Biologische Forschung der Firma Dr. Karl Thomae GmbH., Biberach an der R ia

Die Pathogenitat von SproOpilzen im Tierexperiment

A. WILDFEUER

In der experimentellen Bewertung der lokalen Wirkung von Praparaten gegen C. albi- cans hat sich die kutane Candidosis des Kaninchens bewahrt. C. albicans fuhrt in dieser Versuchsanordnung zu einer superficialen Infektion, deren Verlauf von der Zahl der SproBzellen im Inoculum abhangt (WILDFEUER 1972). Die Bedeutung dieses SproBpilzes als primarer Krankheitserreger wird heute auch fur die menschliche Haut akzeptiert (WINNER et al. 1964).

Die Pathogenitat des in Therapieversuchen eingesetzten C. albicans-Stammes wurde rnit 13 weiteren SproBpilzen in Infektionsversuchen verglichen. Ein Ziel der vorliegenden kutanen Untersuchungen war es zu iiberpriifen, ob sich die Sproi3pilze in ihrer Affinitat zu der Haut des Kaninchens und des Menschen ahnlich verhalten. Die intravenose Injek- tion der Hefen bei Kaninchen und Maus sollte zusatzlich die pathogenen Eigensmaften der verwendeten Stamme charakterisieren.

I. Methodik Die 14 SproRpilze und die verwendeten Nahrmedien sind in Tabelle 1 angegeben.

Infektionsmodus 1. Klrtane Infektion: Die Haut der Kaninchen (RussenlBib. Himalajan $, ca. 1 kg schwer, mit

FUKO Pellet gefiittert, gehalten bei 22O C k 0,5' C und 55-60 X relativer Feuchtigkeit) wurde in der Unterbauch- und Leistengegend mit Pilca" depiliert und oberflichlich skarifiziert. Die Infektion des ca. 100 cm' grogen Hautareals erfolgte mit je 1,0 ml Suspension der 3-5 Tage alten SproSpilzkulturen. Fur die Beurteilung des mykotischen Geschehens wurden von jedem Tier 7 Tage nach der Infektion 6 Schuppen oder Krusten entnommen und auf die in der Tabelle 1 genannten Nahrboden iibertragen. Zur Isolierung der Bakterien, die sich auf der Kutis angesiedelt haben, wurde die gleiche Anzahl der Proben auf Fleischextraktagar (HALL- MANN 1953) verteilt. 3 weitere Schuppen wurden mikroskopisch untersucht.

2. Intravenose Infektion: Die Kaninchen (Bastarde, $ und 0, 2-3 kg schwer) erhielten die an- gegebene Zahl von Hefezellen in 1,0 ml iiber die Ohrvene und die Mause (NMRI, d , 18-20 g schwer) in O,2 ml physiologischer NaC1-Losung uber die Schwanzvene injiziert. Gestorbene Tiere wurden seziert und von Lunge, Herz, Leber, Milz, Nieren sowie im Falle der rnit Krypto- kokken infizierten Tiere zusatzlich vom Gehirn Kulturen angelegt. Die iiberlebenden Tiere wurden 28 Tage nach der Infektion getotet und in gleicher Weise untersucht.

11. Ergebnisse Nach der kutanen Infektion der Kaninchen werden C. albicans L (Abb. 1 u. 2), C. pa-

rapsilosis und Torulopsis glabrata besonders zahlreich in den Schuppen oder Krusten nachgewiesen. Auch C. tropicalis und C. krusei (Abb. 3) fuhren no& zu einer intensiven Besiedelung der Haut. Dieses trifft nicht zu fur den zweiten C. albicans-Stamm, der in dem untersuchten Material seltener gefunden wird. Bei C. stellatoidea (Abb. 4) konnte die

') Hersteller: Fa. Olivin, Wiesbaden

256 A. WILDFEWER

Abb. 1 : C . albicans L, Hyphen im Hautmaterial eines Kaninmens 7 Tage p. i. KOH- Praparat (Vergr. 450 : 1)

Abb. 2: C. albicans L, Pseudomycel und Hefetellen im Hautmaterial eines Kaninchens 7 Tage p. i. KOH-Praparat (Vergr. 800 : 1)

mykosen 15, Heft 6 (1972)

Die Pathogenitat von Sproflpilzen im Tierexperiment

Abb. 3 : Candida krusei, Pseudomycel im Hautmaterial eines Kaninhens 7 Tage p. i. KOH- Praparat (Vergr. 500 : 1)

Abb. 4: Candida stellatoidea, Pseudomycel und Hefezellen im Hautmaterial eines Kanin- &ens 7 Tage p. i. KOH-Praparat (Vergr. 7.50 : 1)

mykosen 15, Heft 6 (1972)

25 7

258 A. WILDFEUER

Tab. 1: Nghrmedien' (Ha 1 1 ma n n) fur die Kultivierung der Sproapilze * Oxytetracyclin 100 pg/ml

S p r o B p i l z Anzuchten des I s o l i e r u n g yon

Inoculums inneren Organen Haut NHhrbd. / Temperat. OC Nahrbd. / Temperat. OC Nahrbd. / Temperat. OC

C. albicans ,L"

C. albicans ATCC 10231

C. guilliermondii CBS 566 C. krusei CBS 537 C. parapsilosis CBS 604 C. pseudotropicalis CBS 607

C. stellatoidea CBS 1905

C. tropicalis CBS 94 C. neoformans 3082 R. rubra 49 S. carlsbergensis ATCC 9080 S. cerevisiae ATCC 9763 T. glabrata CBS 138 T. cutaneum CBS 2466

Blutagar mit Mu- cin u. Glucose- 37 Sabouraudagar 37 Sabouraudagar 27 Zusatz') Blutagar mit Mu- cin u. Glucose- 37 Sabouraudagar 37 Sabouraudagar 27 Zusatz Sabouraudagar Sabouraudagar Sabouraudagar Bierwurzagar

Sabouraudagar

Sabouraudagar Bierwurzagar Sabouraudagar Bierwirzagar Bierwurzagar Sabouraudagar 4 X Malzagar

27 Sabouraudagar 37 Sabouraudagar 37 Sabouraudagar 37 Bierwfrzagar

37 Sabouraudagar

37 Sabouraudagar 27 Bierwurzagar 27 Sabouraudagar 37 Bierwiirzagar 37 Bierwurzagar 37 Sabouraudagar 27 4 X Malzagar

27 Sabouraudagar 37 Sabouraudagar 37 Sabouraudagar 37 Bierwurzagar

Sabouraudagar 37 Bierwurzagar

4 X Malzagar 37 Sabouraudagar 27 Bierwfrzagar 27 Sabouraudagar 37 Bierwurzagar 37 Bierwurzagar 37 Sabouraudagar 37 4 X Malzagar

27 27 27 27 27 27 27 27 27 27 27 27 27 27

~

'.) Die Zusammensetzung ist in einer fruheren Mitteilung (WILDFEUER 1972) enthalten

T e r t k e i m e

C . albicanr L C. albicans ATCC 10231

C. guilliermondii CBS '566

C. krurei CBS 537

C. parapsiloris CBS 604

C. pseudotropicalis CBS 607

C. stellatoidea CBS 1905

C. tropicalis C. neoformanr 3082

R. rubra 49

S. carlrbergeasir ATCC 9080

S. cerevisiae ATCC 9763

T. glabrata CBS 138

T. cutaneum CBS 2466

Mikroskopitrher Befund

pilz + I Zahl der Ticre

8 1 8

2 1 8

4 1 6

5 I 12

6 1 6

2 1 6

9 I 12

6 1 6

5 1 6

2 1 6

3 1 6

3 1 6

5 1 6

3 1 6

Kultureller Befund (Mittelwert)

Bakterien SproSpilze Zahl d. poi. Proben von 6 Zahl d. DOS. P r a m yon 6 1 2 - 3 4 5 6 1 2 - 3 4 5 6

Abb. 5: Zusammenfassung der Befunde

mykosen 15, Heft 6 (1972)

Die Pathogenitat von SproBpilzen im Tierexperiment 259

off ensichtliche Diskrepanz, die sich aus den mikroskopischen und kulturellen Untersuchun- gen ergibt, trott der verwendeten 3 Nahrboden nicht erklart werden. Die iibrigen unter- suchten 7 Sprodpilzarten kommen nur in geringer Zahl in den Hautproben vor (siehe Abb. 5 und Tab. 2). Als Bakterien werden vor allem Staphylococcus aureus und Staphylo- coccus albus angeziichtet. Ein antagonistisches Verhalten der Bakterien und Sprodpilze ist den Ergebnissen nicht zu entnehmen (siehe Abb. 5).

Tab. 2: Ergebnisse der mikroskopischen Untersuchung von Hautmaterial der Kaninchen 7 Tage nach der kutanen Infektion rnit SproBpilzen

- = mikroskopisch negativ

M i k r o s k o p i s c h e r B e f u n d SproBpilz Mycelphase ,Yeast"-phase

Hyphen Pseudomycel Hefezellen

zahlreich zahlreich oval, z. T. mit Blastosporen, in mittlerer Zahl oval, z.T. rnit Blastosporen, in mittlerer

ausgepragt Zahl vereinzelt

C. albicans L

C. albicans ATCC 10231

wenig

C. guiiliermondii CBS 566

- oval z. T. mit Blastosporen, vereinzelt

C. krusei CBS 537 - zahlreich langlich, i n geringer bis mittlerer Zahl C. parapsilosis CBS 604 C. pseudotropicalis CBS 607 C. stellatoidea CBS 1905 C. tropicalis CBS 94 C. neoformans 3082 R. rubra 49 S. carlsbergensis ATCC 9080 S. cerevisiae ATCC 9763 T. glabrata CBS 138 T. cutaneum CBS 2466

- oval z. T. mit Blastosporen, zahlreich, mit- unter haufenformig angeordnet -

vereinzelt oval z. T. rnit Blastosporen, vereinzelt

-

- vereinzelt oval z. T. mit Blastosporen, zahlreich

oval z. T. rnit Blastosporen, in mittlerer vereinze*t Zahl, mitunter haufenforrnig angeordnet

oval z.T. rnit Blastosporen, ofters auch langlich', in geringer bis mittlerer Zahl

oval z.T. rnit Blastosporen, in geringer Zahl, mitunter haufenformig angeordnet oval z. T. mit Blastosporen, in mittlerer Zahl, mitunter haufenforrnig angeordnet oval z. T. mit Blastosporen, zahlreich, mit- unter haufenformig angeordnet

- - - - oval z. T. rnit Blastopsoren, vereinzelt

- -

- - - -

vereinzelt -

* diese ,,elongate" Zellen fehlen den auf Bierwurzagar gewachsenen Kolonien

Die Kaninchen sterben nur nach der intravenosen Injektion von C. albicans L. Von den anderen nach 28 Tagen getoteten Tieren wachst allein aus dem Gehirn eines Kaninchens C. neoformans. Aus den Organen der iibrigen Kaninchen konnten trotz der hohen In- fektionsdosis von 200 Mio keine Sprodpilze isoliert werden (siehe Tab. 3). C. albicans L erzielt ebenfalls an den iv. infizierten Mausen die hochste Sterberate. C. albicans ATCC 10231 wird in seiner Pathogenitat an der Maus von C. neoformans, C. tropicalis und

mykosen 15, Heft 6 (1972)

260 A. WILDFEUER

Tab. 3: Ergebnisse der intravenosen Infektion des Kaninhens mit Sproapilzen

Zeichenerklarung: + = 28 Tage post infectionem etotet - = Organe ohne sichtbare pati.-anat. Veranderung oder kulturell negativ

von den Kaninchen starben

path.-anat. verandert positiv Kulturell Hefezellen Tier- Tage Makroskopisch

Sproi3pi1z pro Tier Nr. p.1.

1 2 2 3

4 3 1 3

3 5 4 7 1 7

4 Mio 2 10 3-4 +

100Mio

C. albicans L 20 Mio 2 4

- Leber, Nieren -

Lunge, Herz, Leber, Milz, Nieren Lunge, Herz, Leber, Milz, Nieren Lunge, Hen, Leber, Milz, Nieren Lunge, Leber, Nieren

Hen, Leber, Nieren Lunge, Herz, Leber, Milz, Nieren Herz, Nieren Lunge, Herz, Leber, Nieren

Leber, Nieren Nieren Lunge, Herz, Leber, Nieren Nieren Herz, Leber, Milz, Nieren Nieren Leber, Nieren

-

-

- - 100Mio 1-4 + -

C. albicans - ATCC 10231 2~~~~ :=: - C. parapsilosis CBS 604 200 Mio 1-3

4 -t- +

- Lunge

C. tropicalis 1-: +7:' - - Nieren

Gehirn

- CBS 94 C. neoformans 3082 4 +

- - 200Mio '-' + -

intercurrent gestorben: starke Cystitis

Die je 4 Kaninchen uberleben 28 Ta e und ihre Organe sind kulturell negativ nach der iv. Infektion mit 200 Mio Zellen folgender Sproipilze: C. guilliermondii CBS 566, C. krusei CBS 537, C. pseu- dotropicalis CBS 607, C. stellatoidea CBS 1905, R. rubra 49, S. carlsbergensis ATCC 9080,

S. cerevisiae ATCC 9763, T. glabrata CBS 138, T. cutaneum CBS 2466

sogar C. stellatoidea ubertroffen (siehe Tab. 4). Die meisten der an C. albicans-Sthmen gestorbenen Tiere haben die fur diese Infektion charakteristischen multiplen Nieren- abszesse. Anderen Organen fehlen bei der Aspektion eindeutige pathologisch-anatomische Veranderungen. Kulturell wird der SproBpilz in den Nieren aller Tiere nachgewiesen. Aus den iibrigen Organen gelingt seine Isolierung weniger regelmaaig. Aber auch bei dem Infektionsverlauf von C. tropicalis, C. parapsilosis, C. stellatoidea und T. glabrata steht das pathologisch-anatomische Bild der Nieren im Vordergrund. Selbst C. parapsilosis und T. glabrata, die innerhalb des gepruften Zeitraumes keinen Todesfall bedingen, veranlas- sen bei einem Teil der Tiere die Abszedierung der Nieren und sehr haufig einen pilzposi- tiven Organbefund. Die Isolierung von C. krusei und C. pseudotropicalis gelingt nur aus den Nieren einzelner Mause. C. guilliermondii ist als einzige Species ihrer Gattung selbst kulturell in keinem Tier nachzuweisen. Im Gegensatz zum Genus Candida sind bei der Kryptokokken-Infektion vornehmlich Gehirn und Lunge in das Krankheitsgeschehen ein- bezogen. S. carlsbergensis, S. cerevisiae, R. rubra und T. cutaneum verursachen keine sichtbaren pathologischen Veranderungen und konnen auch in den inneren Organen nicht nachgewiesen werden.

mykosen 15, Heft 6 (1972)

Tab

. 4:

Erg

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28 Tg. p.

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3 4

5 6 7 8 9 10 1

1 12 13 14 1

5 16 17 1

8 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

2 M

io

10

331111

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1 200 000

10

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10

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10

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BS 2466

262 A. WILDFEUER

Abb. 6: Cryptococcus neoforrnans, rnit einer ,,elongate" Zelle irn Hautrnaterial eines Kanin- chens 7 Tage p. i. KOH-Praparat (Vergr. 2500 : 1 )

Abb. 7: Trichosporon cutaneurn, Mycel irn Hautrnaterial eines Kaninchens 7 Tage p. i. KOH-Praparat (Vergr. 850 : 1)

mykosen 15, Heft 6 (1972)

Die Pathogenitat von Sproapilzen im Tierexperiment 263

111. Besprechung der Ergebnisse

Die Angaben verschiedener Autoren zu dem Vorkommen der Sprodpilze auf der Haut, Schleimhaut oder in den Korpersekreten des Menschen und uber ihre pathogene Bedeutung ergeben kein einheitliches Bild. Die Beurteilung der atiologischen Rolle von Hefen, die in Hautlasionen gefunden werden, ist haufig besonders schwierig. Dies gilt sicherlich auch fur die Interpretation der kutanen Infektionsversuche am Kaninchen, in denen die Haufig- keit der nachgewiesenen Sproapilze als ein Kriterium fur ihre Pathogenitat bewertet wird. Ein Teil der 14 Sprodpilze zeigt in den tierexeprimentellen Untersuchungen ein ahnliches Verhalten wie auf der Haut des Menschen.

C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei und T. glabrata erweisen sich beiin Kaninchen als dermotrop. C. stellatoidea, C. pseudotropicalis und C. guilliermondii, die von der menschlichen Haut selten isoliert werden (MARPLES 1965, GENTLES et al. 1969), besitzen auch fur das Kaninchen nur eine schwache epidermale Affinitat. C. neoformans, zu dessen Pradilektionsstellen beim Menschen die Haut ebenfalls nicht gehort (CROUNSE et al. 1955, MARPLES 1965), wird nur vereinzelt kultiviert. Die in den Schuppen vorkommenden ,,elongate" und ,,germ-tube-like" Zellen (Abb. 6) werden allerdings als Obergang des SproSpilzes zur parasitaren Gewebsform gedeutet. S. carlsbergensis, S. cerevisiae, R. rubra und T. cutaneum geben, trotz gelegentlicher Isolierung und mikroskopischen Nachweises bei einzelnen Tieren, keinen Hinweis auf eine dermale Pathogenitat. Unter 100 von Ekzematikern isolierten Hefestammen finden GOTZ et al. (1957) S. cerevisiae 12 mal. S. carlsbergensis und R. rubra sind in dieser Zusammenstellung wie auch in der Obersicht von FRIEDRICH (1968) nicht vertreten und scheinen das gesunde wie kranke Integument im allgemeinen nicht zu besiedeln. T. cutaneum (Abb. 7) schadigt vor allem das mensch- liche Haar und wird von der Haut meist nur als Saprophyt (BOHME 1965) isoliert.

Bereits die kutanen Infektionsversuche zeigen, dad die beiden C. albicans-Stamme unterschiedliche pathogene Eigenschaften haben. Die fur die Haut besonders pathogene C. albicans L entfaltet auch nach der iv. Infektion an Kaninchen und Mausen eine wesent- lich starkere krankmachende Wirkung. Eine Erklarung dafiir konnte sich aus der unter- schiedlichen Haltung der Hefen ergeben: C. albicans L wird seit ihrer Isolierung vor etwa 2 Jahren uber Mausepassagen gehalten, die nur durch eine Subkultur unterbrochen werden. Die Kultivierung von C. albicans ATCC 10231 erfolgt hingegen allein auf kunstlichen Nahrmedien.

Bemerkenswert erscheint, dad die Maus bei iv. Infektion gegenuber mehr Sprodpilz- arten empfanglich ist als das Kaninchen. Die Empfindlichkeit des Kaninchens bleibt in diesen Versuchen auf C. albicans beschrankt und darf nicht in gleichem Made auch fur andere SproSpilze erwartet werden. Die an den iv. infizierten Kaninchen und Mausen gewonnenen Ergebnisse stimmen im Bereich der vergleichbaren Infektionsdosis weitgehend mit den Befunden von SCHIRREN et al. (1960) uberein. Das verschiedenartige Verhalten der SproBpilze in den beiden iv. infizierten Tierarten demonstriert, dad es sehr schwierig ist, aufgrund solcher Versuche ihre pathogenen Eigenschaften fur den Menschen zu beurtei- len. Ein eindrucksvolles Beispiel liefert die Resistenz des Kaninchens gegenuber der iv. Applikation von 200 Mio C. neoformans-Zellen. Im Gegensatz zu den Species von Can- dida wird gerade dieser Sproapilz fur den Menschen und viele Tiere, sobald er in das Korperinnere eingedrungen ist, als obligat pathogen eingestufi (GEDEK 1968). Der Wert, den die kutanen Infektionsversuche am Kaninchen fur eine Prognose zur Pathogenitat von Sprodpilzen auf der menschlichen Haut haben, wird noch in weiteren Untersuchungen uberprufi. Auf jeden Fall aber bestatigen die Ergebnisse der dermalen Infektion die beson- dere Eignung des C. albicans L-Stammes fur chemotherapeutische Priifungen und lassen erwarten, dai3 die antimykotische Wirkung von Praparaten in der gleichen Versuchs- anordnung auch gegen andere dermotrope Sprodpilze bestimmt werden kann.

rnykosen 15, Heft 6 (1972)

264 A. WILDFEUER

Zusammenfassung

Die Pathogenitat von 14 SproBpilzen, die den Gattungen Candida, Cryptococcus, Saccharomyces, Torulopsis, Rhodotorula und Trihosporon angehoren, wird an Kaninchen und Mausen gepruft. Mit der kutanen Infektion des Kaninchens wird versucht, die epider- male Affinitat der Hefen zu bestimmen. N a h iv. Injektion erweisen sich verschiedene Candida-Species, C. neoformans und T. glabrata als mausepathogen. Die iv. infizierten Kaninchen erkranken nur an C. albicans L und sind trotz einer hohen Infektionsdosis resistent gegenuber anderen SproSpilzen. Die Aussage tierexperimenteller Untersuchun- gen zur Pathogenitat von Hefen wird diskutiert.

Summary

The pathogenicity of yeasts in animal trials The pathogenicity of 14 yeasts of the genera Candida, Cryptococcus, Saccharomyces,

Torulopsis, Rhodotorula and Trichosporon was investigated in rabbits as well as mice. The epidermal behaviour of the yeasts was determined with the cutaneous infection of rabbits. Several Candida species, C. neoformans and T. glabrata proved pathogenic for mice when applied intravenously. Using intravenous injection the rabbits were infected successfully only with C. albicans L strain.

Resumen

Se examina la patogeneidad de 14 levaduras pertenecientes a 10s gkneros Candida, Cryptococcus, Saccharomyces, Torulopsis, Rhodotorula, y Trichosporon en conejos y ratones. Con la infecci6n cutinea del conejo se trata de determinar la afinidad epidkrmica de la levadura. Por via endovenosa varias especies de Candida, C. neoformans, y T. gla- brata mostraron ser pat6genos para ratones. Los conejos infectados por via endovenosa son afectados solo por C.albicans, siendo resistentes a las otras levaduras, a pesar de la elevada dosis de infecci6n. Se discuten las concluciones que pueden obtenerse del experiment0 en el animal sobre la patogeneidad de las levaduras.

Literatur

BOHME, H.: Die Sproflpilzbesiedlung der Haut. Derm. Wschr. 151, 107-117(1965). CROUNSE, R. and LERNER, A.: Crypto- coccosis. AMA Arch. Derm. 77, 210-215 (1958). FRIEDRICH, E.: Sprodpilze auf krankhaft verandertcr Haut. Mykosen 11, 119-126 (1968). GEDEK, B. : Hefen als Krankheitserreger bei Tieren. Fischer Verlag Jena 1968. GENTLES, J. and LA TOUCHE, C. in: The Yeasts, Academic Press 1969, 1, 108- 174. GOTZ, H.; STURDE, H.-C. und GRUBER, E.: Hefebefunde bei Ekzemen und ihre Bedeutung. Arch. klin. exp. Derm. 204, 523-542 (1957).

HALLMANN, L.: Bakteriologische Nahrbo- den. Thieme-Verlag 1953. MARPLES, M.: The ecology of the human skin. Thomas, Springfield 1965. SCHIRREN, C.; RIETH, H. und KOCH, H.: Tierexperimentelle Untersuchungen zur Pathogenitat von Hefepilzen. Arch. klin. exp. Derm. 210, 87-122 (1960).

WILDFEUER, A.: Die experimentelle Be- wertung sprodpilzwirksamer Antimyko- tika unter Einbeziehung der kutanen Can- didamykose des Kanindwns als neuem Kriterium. Mykosen 15 (3) : 119-128 (1972). WINNER, I. and HURLEY, R.: Candida albicans. Little, Brown and Company 1964.

Anschrift des Verfassers: Dr. A. WILDFEUER, 795 Biberach an der Rii3, Postfach 720

mykosen 15, Heft 6 (1972)