558 A 1 b r e e h t B e t h e : Ueber d. Neurofibrillen i. d. GanglienzeUen etc.

Zeiss: Apoehr. 2,0ram. Comp.-Ocul. No. 6. Methodik: wie bei Fig. 35 und 39.

Fig. 43. Kleine Ganglienzelle aus der Molekularschicht des Kleinhirns vom Hund. Diese Zellen liegen parallel zur Oberflache zwi- schen den dicken Forts~tzen der Purkinje ' sehen Zellen. Die Forts~.:ze der Zelle sind nur in ihrem Anfangstheil gezeichnet. VergrSsserung und Methodik wie bei Fig. 34.

(Aus dem Kgl. Preuss. Institut fiir Serumforschung und Serumpriifung in Steglitz.)

Die vitale F~rbung, eine Darstellungsmethode der Zellgranula.

Von

Dr. L . ~ [ i c h a e l i s .

Hierzu Tafel XXXIL

Vorliegende Untersuchungen wurden in dem K(inigl. Preuss. Institut ftir Serumforschung und Serumprtifung angestellt, auf Anregung und unter steter Beeinflussung des Herrn Geh. Medic.- Rath Prof. Dr. E h r 1 i c h. Ich ftihle reich verpflichtet, Fierrn GeL Rath E h r 1 i c h ftir die kostbaren Anregungen, die ieh yon ihm jederzeit empfangen babe, sowie ftir die unerschSpfliche Liebenswtirdigkeit, mit der er mir die Hilfsmittel seines Instituts und seiner privaten wel~hvollen Farbstoffsammlung zur Verftigung stellte, meinen herzlichsten Dank auszusprechen.

Obgleich begreiflicher Weise schon den ersten Mikroskopi- kern, die sich mit dem Studium der Zelle befassten, nieht ent- gehen konnte, dass in vielen Zellen k~irnige Einschltisse enthalten. sind, so kam es doch frtiher nicht zu einffehenderen allgemeinen Untersuchungen tiber die Zellgranula, soweit sie in der normalen Zelle vorhanden sind. Viel eher lernte man die pathologiseher Weise in den verschiedenartigsten Zellen auftretenden ,Eiweiss- kfrnehcn" kennen, die in Verbindung mit einer allg'emeinen Ver- griisscl'tmg der Zelle das Wesen des yon V i r e h o w mit dem

Die vi tale F~irbung', elne Dar s t e l l ungsme thode der Zellgranula. 559

Namen der trtiben Schwellung belegten Degenerationsprocesses ausmachen. Zwar ist schon frt~hzeitig die granulare Structur e i n z e 1 n e r Zellarten in normalem Zustande erkannt worden z. B. in den Pankreaszellen (B e r n h a r d) und den Leberzellen (S c b i f f). Die Ursache far die so lange dauernde Vernach- l~ssigung der Zellk(irnchcn ist folgende.

In der ersten Epoche der Mikroskopie, in der man vorzags- weise die frisehe Zelle untersuchte, fehlte es noeh an den opti- schen Hilfsmitteln, um die oft sehr kleinen und schwaeh lieht- brechenden K(~rnchen zur Anehauung zu brinffen. In der zweiten Epoche, als die optischen und teehnischen Hilfsmittel vervoll- kommnet waren, beschrankte man sieh nut allzu sehr auf die Untersuehung" fixirter Zellen.

So sch~ttzenswerth auch sonst die Fixationsmethoden sind, far die Ei'kenntniss der Granula konnten sie kaum etwas leisten. Was der Alkohol yon den Zellen ttbrig" lasst, das sind oft nut Trtimmer; ich denke z. B. an die Leberzelle. Es geniigt, ein paar frische derartige Zellen ohne jede Zusatzfltissigkeit mit der Immersionslinse zu betrachten, um alle die KClrnehen zu erkennen, welehe yon allen Fixationsmitteln fast allein alas A 1 t m a n n- sehe Gemiseh yon Kaliumbichromat und Osmiumsiiure in der Weise fixirt, (lass sie bei tier Naehbehandlung mit Alkohol nicht zerst(irt werden.

Man hatte sieh an das Bild, das die tiblichen Fixations- mittel uns yon tier Zelle liefern, so gew~Shnt, dass die Zellein- schltisse, die uns die A 1 t m a n n 'sehe Methode zeigt, und die zum allergr(issten Theil aueh in der frischen Zelle siehtbar sind, stark auf ihre --- ich m(ichte sagen ,Echtheit" in Zweifel ge- zogen wurden ( F i s c h e r). :Man muss allerdings zugestehen, dass die Untersuehung der Granula in dcr frischen Zelle manche Sehwierigkeit bietet; daher kommt es, dass man wohl schon lange yon dem ,,k(~rnigen Aussehen" des Protoplasma sprach, class aber der Begriff des ,,Granulum" uns erst handgreiflich wurde, als E h r 1 i c h die speeifischen Farbereaetionen der K srnchen der Mastzellen und Leukocyten auffand, und obwohl aueh sonst z.B. in den Zellen der Speicheldrtisen und der Leber KSrnchen bekannt waren, so kammerten sich die Histologen so wenig um die Granula der Leukoeyten, wie die meisten Kliniker um die tier anderen Zellcn, his A1 t m a n n e i n e ~Iethode land, die eine

Archly f. mikrosk. Anat. Bd. 55 37

560 L. Yfichaelis:

grosse Zahl yon ZellkSrnehen darstellte 1). Mit vollem Recht sind aber gegen die Beweiskraft der A1 t m a n n'schen Methode Bedenken wach geworden, da A 1 t m a n n in seinem grossen Werke nur wenig dazu beigetragen ha~ zu beweisen, dass seine Methode keine Knnstproducte lieferte.

Er war daher gereehtfertigt, die Granula wieder in der frisehen Zelle aufzusuchen und sich zu ihrer Darstellung der yon E h r l i e h eingefiihrten v i t a l e n F i i r b e m e t h o d e zu bedienen. Man wird freilich einwenden, dass grade die Einwir- kung der Farbstoffe auf die lebende Zelle wiederum Kunstpro- ducte schaffen kann. Es bleibt eben nichts ttbrig, als in jedem einzelnen Fall, wo wir eine vitate Fi~rbung der Granula erhalten, kritiseh zu Werke zu gehen, und nur das fur praformirt zu halten, was man entweder in der ungefarbten, frisehen Zelle yon vorne herein sieht, oder was uns eine zweite, v011ig versehiedene Methode in ganz gleieher Weise zeigt. Diese Entseheidung wird in Zukunft noch leiehter sein, da wir in der ktirzlieh yon B e n d a (Verh. d. physiol. Gesellsch. Berlin, 10. Dee. ~899) angegebenen Methode ein neues Mittel zur Darstellung der Granula besitzen.

Die Methode der v i ta len Fi i rbung. Die erste und bis vor kurzem die einzige bekannte vitale

Fiirbung ist die yon E h r I i e h entdeekte Fi~rbnng der Nerven dutch Methylenblau. Die Anwendung" der F~trbemethode mit Methylenblau zur Darstellung der Granula wurde yon O. S ch u l t z e und M i t r o p h a n o w besehrieben.

Die anderen kSrnchenfiirbenden Farbestoffe wurden yon E h r 1 i c h eingeftihrt. VerOffentlicht ist bisher nur die Methode mit : N e u t r a l r o t h ~ welches er z. B. bei Kaulquappen derar~ anwendete, dass er sie in einer ganz dtinnen (1 : 1000000) L0sung des Farbstoffs schwimmen liess~ wii]lrend gr~isseren Thieren der Farbstoff injieirt wurde (Ztsehr. f. wiss. Mikrosk. 1893). Aueh G a 1 e o t t i (Ztschr. f. wiss. Mikr. XI) erhielt mit mehreren Farb- stoffen gewisse Granula in vielen Epithelzellen gef~trbt. Er machte dabei gleiehzeitig die Beobaehtung, dass sich alas eigentliehe Proto- plasma nicht farbt, so lange die Zelle noeh nicht abgestorben ist.

1) Dass auch diese Methode nicht etwa eine ganz a l l g e m e i n e Methode zur Darstellung der Granula ist, zeig't z. B. der Umstand, dass die neutrophilen Granula der Leukocyten durch sie nicht zur Anschauung. gebracht werden ktinnen.

Die vitale Fiirbung, eine Darstellungsmethode der Zellgranula. 561

Bei weitem nicht alle Farbstoffe vereinigen alle die Eigen- schaften in sich, die sie fiir die vitale Farbung geeignet machen. Diese Eigenschaften sind theils specifischer, tbeils allgemeiner Natur. Die s p e c i f i s c h e n Eigenschaften bestehen in der Affinit~tt zu gewissen Gewebselementen, yon denen bisher Nerven und Zellgranula die wichtigste Rolle spielen, und einem gewissen Grade yon Ungiftigkeit, weft sonst der Tod erfo]gt, bevor der Farbstoff gentlgend eingedrungen ist.

An a l l g e m e i n e n Eigenscbaften muss man yon dem Farbstoff verlangen, dass er gentigend in Wasser, fur eine ge- wisse Abart der vitalen F~trbung (s. u.) auch in physiologiseher Kochsalzl~sung 15slich ist, ferner muss der Farbstoff wegen der vielfachen alkalisehen Reaction der Gewebe insofern alkalibe- st~tndig sein, als die Farbbase 1) wenigstens etwas wasserl~slieh sein muss.

Dagegen kann ein dutch Alkalien hervorgerufener blosser Farben u m s c h 1 a g sogar yon Nutzen sein, weft durch diesen die Reaction der gefitrbten Elemente ermittelt werden kann.

Man kann den Farbstoff auf versehiedene Weise zur Ein- wirkung auf die lebende Zelle bring'en. Ich nenne vier Methoden:

1. die Injection in das Gefitsssystem des lebenden Thieres. 2. Die subeutane Injection. 3. Die Resorption vom Darmcanal oder der Haut aus. 4. Die postmortale F~rbung.

Die Injection in das Gef~tsssystem ist entweder eiae ein- malige Injection einer starkeren FarblSsung in eine Vene oder in das Herz, die bei weitem bessere Metbode abet ist allmahliche Infusion einer ganz verdtinnten LSsung in physiologischer Koch- salzlSsung.

Die subcutane Injection setzt eine hohe L~slichkeit des Farbstoffes voraus, da man fiir sic gesattigter LSsungen bedarfi Die Resorption vom Darmcanal und der Haut wurde zuerst yon O. S e h u I t z e bei Kaulquappen angewendet, indem er dem Aquariumwasser Farbstoff zusetzte. Diese Methode ist mit Vor- theil nur flir Wasserthiere anzuwenden.

Die vierLe Methode, die ich als die postmortale bezeichnet

1) Die bisherigen Versuche sind sammtlich mit basischen Farbstoffen ausgefiihr t worden.

562 L. Michaelis:

habe, besteht darin~ dass man ganz kleine, dem soeben getSdteten Thier entnommene Organsttickchen in eine m6glichst dtinne L0- sung des Farbstoffes in phys. Kochsalzwasser cinlegt.

Dieses Verfahren ist i~hnlieh der D o g i e l'sehen Nerven- fi~rbungsmethode, bei der man die 0rganstticheken mit einer ver- hitltnissmlissig starken L6sung yon Methylenblau (1 : 1500) betupft und, vor dem Eintrockenen geschiitzt, liingere Zeit liegen li~sst. Ftir die Darstellung der KSrnchen ist aber entschicden die obeu beschriebene Anwendung ganz verdtinnter (bis 1 :100000)L6- sungen vorzuziehen, und dann gentigt das einfache Betupfen nicht, sondern man bedarf einer gr~isseren Menge Farbl6sung. Der Vortheil so dtinner LSsungen ist der, dass die K(irnchen- f~trbung rciner wird, d.h. dass sich nicht auch die Zellkerne oder das Protoplasma mitf/trben. Die Farbung ist als gelungen zu betrachtcn, wenn, abgesehen yon ciner ganz leichten Imbibition des Gewebes mit Farbstoff nichts als die K(irnchen gef/irbt sind. Sobald eine Kernfiirbung odcr sonstig'e ,Nebenfiirbung" eintritt, ist die Zelle als todt zu betrachten und verliert die Fi~rbung den Character d e r v i t a I e n F~rbung.

Da die isolirten, tiberlebenden Organstlickchen ein starkes Sauerstoffbedtirfniss haben und die zur Anwendung gelangenden Farbstoffe meist leicht zu Leukok(irpern reducirbar sind, so ist es rathsam, die Farbung in flacheu Schalen vorzunehmen, in denen die Organsttiekehen nicht auf dem Boden einer tiefen Fltissig'keitsschicht, yore Lnftsauerstoff abgeschnitten liegen, son- dern in denen die Fltissigkeitsschicht die Sttickchen nur gerade ausreichend bedeckt. Im anderen Falle tritt eine Reduction des in die Zellen eingedrungenen Farbstoffes statt einer F~trbung tin.

Es fragt sich nur, ftir welche Fiille die Injection, fiir welche die postmortale Fitrbung geeigneter ist. Das ist yon einer chemi- sehen'Eigenschaft des Farbstoffes abhi~ngig. Man kann ni~mlich die Farbstoffe in k t i p e n b i l d e n d e und n i c h t v e r - k ttp e n d e eintheilen. Die ktipenbildenden Farbstoffe hubert die Eigenschaft, dass ihre Leukok6rper durch die blosse Bertihrung mit der Luft wieder in die ursprtlngliehen Farbstoffe zurtickver- wandelt werden, w~thrend die LeukokSrper der nicht verktipen- den Farbstoffe entweder gar nicht wieder zu Farbstoffen zurtick- oxydirt werden kSnnen, oder bei der Oxydatioll einen andcre~l Farbstoff liefern.

Die vitale F~irbung, eine Darstellungsmethode der Zellgranula. 563

Zu der ersten Klasse gehSren z.B. die Thiazine (Methylenblau, Thionin), zur zweiten die Azofarben (Bismarckbraun, Congoroth).

Wenn man nun eine Injection mit einem Farbstoff macht, so dringt dieser in die Gewebe ein und wird yon den Gewebs- elementen, zu denen er Affinitiit hat, angezogen, oder, falls er keine specifische Affiniti~t hat, imbibirt er das Gewebe diffus. hllmahlich wird er aber yon den trotz der besten Blutzufuhr stets in Sauerstoffuuterbilanz befindlichen Zellen theilweise oder sogar viillig reducirt, und damit entfiirbt. Die LeukokSrper bleiben aber nicht au den Elementen haften, die der Farbstoff bevorzugte, sondern sie imbibiren alas ganze Gewebe diffus. Daraus resultirt eine Ueberschwemmung der Gewebe mit dem LeukokSrper. Setzt man nun die so beschaffenen Gewebe der Luft aus, so wird sich auch nur in dem Fall die ursprtingliche F~trbung wiederherstellen, dass der Farbstoff ktipenbildend ist; ja dann wird sogar die s p e c i f i s c h e Fiirbung sich nieht nur wiederherstellen, sondern sie wird intensiver werden als sie ur- sprtinglich war (cfr. das Sauerstoffbedtirfniss yon E h r li c h, 1885). War der Farbstoff abet nieht ktipenbildend, so ist die F~trbung mit der Reduction fiir immer verloren. Man kann somit zwi- schen einer d i r e c t e n F a r b u n g unterscheiden, die einfach dureh das Eindringen des Farbstoffes in das Gewebe zu Stande kommt, und einer i n d i r e e t e n F~trbung, die aus einer Ueberschwemmung der Gewebe mit dem LeukokSrper und nach- tri~g]icher Oxydation besteht, u n d d i e n u r b e i K i i p e n b i l d e n d e n F a r b s t o f f e n m ( i g l i e h i s t . Es liisst sich leicht verstehen, dass die indirecte Fiirbung viel werthvoller ist, als die directe. Die direete Fi~rbung kann niemals eine ge- wisse Intensit~tt tibersehreiten, well fortw~ihrend Farbstoff redu- eirt wird; ja naeh dem Tode des Thieres und somit dem Still- stand des Respirationsapparates kann die Reduction so pliitzlieh und vollsti~ndig eintreten, dass man bei der Section yon der direeten Fiirbung niehts mehr zu sehen bekommt.

D a r a u s fo lg t , da s s d ie V o r t h e i l e der v i t a l e n In- j e c t i o n e ines F a r b s t o f f e s nut dann ye l l zur G e l t u n g kommen , w e n n d i e s e r F a r b s t o f f l e i e h t v e r k t i p t , dass also bei nicht verktipenden Farbstoffen die Injection vor der viel bequemeren postmortalen Farbung" zum mindesten keinen Vortheil, wohl aber Nachtheil bietet.

564 L. Michael is :

Chemisches fiber die angewandten Farbstoffe.

Unter einer sehr grossen Zahl yon Farbstoffen haben sich drei Typen als bcsonders geeignet ftlr die Kih'nchenfiirbung herausgestellt.

1. Die Thiazine. 2. Die Phenazine. 3. Die Safraninazofarbstoffe. Unter den Farbstoffen der ersten Gruppe ist wegen seiner

LSslichkeit und Alkalibestiindigkeit das M e t h y 1 e n b I a u der geeigneteste. Chemisches fiber dasselbe anzugeben, ist wohl iiberfiiissig, nut sei erwahnt, dass stets mit zinkfreiem Methylen- blau yon den H(iehster Farbwerken ffearbeitet wurde. Das Con- centrationsoptimum ftir die postmortale Fi~rbung" ist etwa 1:50000.

Unter den P h e n a z i n e n ist das geeignetestc das Neu- tralroth (Dimethyldiamidotoluphenazin). Seine Base isr gelb und etwas wasserlSslich. Das Neutralroth ist sehr wenig in physiologischer Kochsalzl(isung l~islieh (weit weniger als 1 : 1000), aber doch bei weitem genfigend ffir die postmortale Fitrbun~. Das Optimum der Concentration ist etwa 1:50000.

Dieselben biologisehen wie chemischen Eigenschaften hat das um zwei Methylgruppen i~rmere symmetrische Diamidotolu- phenazin, wahrend das rothviolette Diaethyldimethyldiamidotolu- phenazin wegen der sehr geringen Lfslichkeit seiner (ebenfalls gelben) Base unbrauchbar ist.

Der Leukok(irper des Neutralroths ist sehwer l(islich und krystallisirt haufi~- in den Geweben in btischelf(irmig ange- ordneten l~adeln aus, die nicht v(illig farblos sind, sondern ein der Farbbase ganz iihnliehes Gelb besitzen.

Das Neutralroth wird dureh Alkalien, auch kohlensaure Alkalien gelb gefiirbt, w~thrend Sauren ibm tin fuehsinartiges Roth verleihen. Es wird daher in Zukunft noch als vorztiglieher biologiseher Indicator Verwendung finden.

Die S a f r a n i n a z o f a r b s t o f f e haben im Molektil zwei chromophore Gruppen, die ffir die Safranine eharakteristische Azoniumgruppe und die Azogruppe. Sic werden dargestellt, in- dem man ein Safranin diazotirt und an ein Phenol oder ein Amin kuppelt.

Es hat sieh nun herausffestellt, dass yon den sehr zahlreiehen

Die vitale Fiirbung', eine Darstellung'smethode der Zellgranula. 565

untersuchten Farbstoffen aus dieser Gruppe nur zwei spezifische K0rnchenfarbstoffc sind; nur yon einem liess sich die genaue Constitution in Erfahrun~ bringen. Es ist das D i a e t h y l s a- f r a n i n a z o d i m e t h y [ a n i 1 i n yon der Constitution:

N /\/\/\ N-N--S~

(C~Ho)~N-J I I I/ , , )--N(CH3)~

N-, I CI

/ \ J F \ /

Dieser Farbstoff ist dunkelgrtin, leieht 15slich, alkalibe- standig, aber als Azok0rper nicht verk0pbar. Er kommt yon den H(ichster Farbwcrken unter dem Namen ,Janusgriin ~ in den Handel. Reducirt man ihn mit Zinkstaub im Reagenzglas, so wird er erst roth, dann farblos.

Die erstc Reaction zei~t die Sprengung der Azogruppe an, die zweite die Reduction der Azoniumgruppe. Durch naehtriig- liche Oxydation wird die rothe Farbe des Safranins leieht wieder- hergestellt, w~thrend die grtine Farbe nicht wiederkehrt. D er- s e l b e P r o c e s s f i nde r auch im O r g a n i s m u s s tat t . Das wunderbarste an diesem Farbstoff ist aber, dass er, i~hnlich dem Methylenblau, die Nerven f~rbt, nur dass er wegen seiner Unver- ktipbarkeit dem Methylenblau gegeniiber im Nachtheil ist. Herr Geheimrath E h r l i c h hat dartiber in der Sitzung des Vereins ftir inhere Medicin vom 1. Dee. 1898 berichtet.

Aendert man das Molektil des Farbstoffes nur ganz wenig, nimmt man statt des DiaethyI- ein Dimethyl-Safranin. so ist die k(irnchenf~trbende Eigenschaft sofort vernichtet. Das Coneentra- tionsoptimum ftir die postmortale Fi~rbung ist etwa 1:30000.

Der bei der Verkiipung entstehende rothe Safraninfarbstoff hat keine Verwandtschaft zu KSrnchen oder Nerven, mit Aus- nahme der K~rnehen der Nierenepithelien.

Beobaehtet man die Reduction unter dem Mikroskop~ so sieht man, dass mit dem allm~thlichen Abblassen der gTtinen Kiirnchenfi~rbung eine ganz leiehte d i f f u s e R0thung des Pra- parats entsteht, die spi~terhin aueh abblasst. Die Nierenk0rnehen dagegen halten die rothe Reductionsstufe noch lest.

566 L. Michaelis :

In fast allen Zellarten lassen sich K0rnehen mit Hilfe der vitalen Farbemethode darstellen, u n d e s ware jetzt meine Auf- ffabe, die Reaction der einzelnen Organe gegen die Farbstoffe im Einzelnen zu untersuchen. Da ich aber ~tusserer Verhitltnisse wegen die Untersuehung abbreehen musste, so will ich im Folgen- den nur diejenigen Orffane besprechen, mit denen ieh reich bis- bisher am Genauesten befasst habe. Ich verweise im Uebrigen auf die Darstellung der Granula der Darmepithelien, wie sie 0. S c h u 1 t z e durch Methylenblau bei Kaulquappen ~rreicht hat, ferner auf die Untersuehungen yon M i t r o p h a n o w (Biol. Centralbl. 1889) und G a l e o t t i (Zeitschr. f. wiss. Mikr. XI).

1. Die Granula der Leberzellen.

In der Leberzelle wurden K0rnchen schon yon S c h i f f (Arch. f. physiol. Heilkunde 1857 p. 263) beschriebcn. S c h i f f Melt sie far GlykogenkiJrnchen, was B o c k und H o f m a n n (Virchows Archiv LVI p. 201) als Irrthum erkannte. Spitter wurden diese K(irnchen yon E h r I i e h (in F r e r i c h s, Zeitschr. f. klin. Med., 1883) beschrieben, und in neuester Zeit hat A 1 t- in a n n ihnen eine ausftihrliche Untersuchung gewidmct.

Ich m0chte hier nur eine neue Darstcllungsmethode dieser Kiirnehen den bisherigen .hinzuftigen. Gelegentlich eiuiffer Me- thylenblauinjeetionen fiel es mir auf, wie wohl schon vielen an- deren Beobachtern, dass die Leber eine grosse Menge des Farb- stories zurtickbeh~tlt. Wenn man z. B. einem narkotisirten Meer- sehweinchen die Bauchhaut abpraparirt, dureh ein in das Baach- fell geschnittenes Fenster eine Darmschlinge vorfallen l~isst und durch ein zweites Fenster die Leber beobachtet, und nun in eine Mesenterialvene sine stiirkere Methylenblauliisung injicirt, so be- obaehtet man im Augenblick der Injection eine starke Bli~uung der Leber, die zu intensiv ist und zu lange andauert, als dass sie nur auf der F~trbung des Blutes in den Gefassen beruhen k(innte. Dis mikroskopische Betrachtung zeigt, dass die Bliiuung auf einer Fi~rbung der Zel]granula beruht. Fig. 1 zeigt solehe Zellen. Unter dem Deckglas blassen sie abet sehr raseh ab, wer- den aber an den i~ussersten Ri~ndern des Pritparates allmahlich wieder gebl~tut. Bei dieser Verktipung kann zweierlei eintreten. Entweder ist die Zelle noeh lebengflihig und sind die K0rnchen noch unverandert; dann tritt wieder eine reine Ktirnehenfarbung

Die vit~ale F~irbung, eine Darstellungsmethode tier Zellgranula, 567

ein, bei v611ig negativer Kernfarbung, oder die Zelle ist inzwisehen abgestorben, und dann tritt zuerst eine F~rbung" des Kernes, spater auch des Protoplasmas ein, wt~hrend die KSrnehen den Farbstoff nicht mehr bevorzugen. Mitunter erscheinen sogar dann die KSrnchen als helle Flecke atif blauem Grunde: eine n e g a- t i r e K6rnchenfarbung. Vom Kern f~rbt sich zuerst immer das KernkSrperchen.

Viel bequemer und auch sicherer als die intraven6se In- jection des Farbstoffes ist die subcutane Injection. Man giebt einer ausgewachsenen Maus in Abst~nden yon 10 Minuten his 3 mal je 1 ccm concentrirter MethylenblaulSsung subcutan. Es tritt dann eine iiusserlich sichtbare Blaufitrbung der Zunge und der Conjunctiva ein. Sobald die Maus die Hinterbeine yon sieh streekt oder in Krampfe verfallt, wird sie get6tet. Die Leber ist dann tier blau und bietet das besehriebene mikroskopisehe Bild, besonders wenn man kleine Stiiekehen der Leber in der feuehten Kammer eine Weile der Luft aussetzt. Uebl'igens sind die K6rnehen nieht an allen Stellen der Leber gleich gut, sondern es tritt auch an manehen Stellen schon wahrend des Lebens ein 1.oealer Zelltod mit Kernfarbung und AufhSren der reducirenden Eigensehaften ein.

Die p o s t m o r t a 1 e Farbung gelingt gerade bei der Leber nieht so leieht, immer nur an ganz besehrankten Stellen und naeh sehr langer Einwirkung einer MethylenblaulSsung im Verhaltniss ~'on 1: 50000. Aueh mit SafraninazodimethylaniIin lassen sich KSrnehen der Leberzellen darstellen, abet dutch die subeutane Methode aus oben erwahnten Grtinden weniger gut als dureh Methylenblau.

Beim Froseh gelingt die Farbung tier Leberk6rnchen viel sehwieriger als bei den Saugethieren; am leichtesten noch durch subeutane Injection yon 1 ecru cone. L6sung yon Safl'aninazodi- methylanilin.

Die F o r m der Leberk6rnehen ist bei der Maus und dem Meerschweinehen in den meisten Fallen regelmassig kugelrund. Sie sind gleichmassig in der Zelle vertheilt und lassen nur far den Kern und die Fetttr6pfehen grSssere Liieken frei. Mitunter aber haben die Granula stellenweise die Form yon kurzen, geraden St~bchen. Unter welchen Beding'ungen das der Fall ist, habe ich nieht ermitteln kSnnen. Es hat jedenfalls nichts mit dem

568 L. Michaelis:

Erniihrungszustand zu thun, wie man mit Rficksicht auf die A 1 t m a n n 'schen Angaben ftir die Froschleber vermuthen k(~nnte. Denn sowohl solehe Miiuse, die bis zur Ersch(ipfun~" gehungert hatten, als auch solehe, die stark gemiistet waren, deren Leber yon Fett strotzte, zeigten nur runde Granula.

W~thrend die bisher besehriebenen K(irnehen mit aller Sieher- heit priif6rmirte Gebilde sind, weft sie aueh im ungefiirbten Zu- stand zu erkennen sind, so kommen wir jetzt zu einer zweiten Art yon K6rnehen in der Leberzelle, fiber deren Echtheit sich noch nichts Bestimmtes aussagen li~sst, weft sie weder in der ungefitrbten ZeIle siehtbar sind, noch dutch irgend eine andere Methode als die zu besprechende dargestellt werden k(innen. Allerdings erhalt man sie mit dieser Methode mit so grosser Constanz, dass sie sieherlich der Beobachtung werth sind.

Die Methode ist die Fiirbung mit N e u t r a l r o t h ; am besten durch subcutane Injection einer Maus mit 1 cem concen- trirter wassriger L(isung. Naeh einer Stunde ist die Reaction mit Sieherheit eingetreten. Alle Leberzellen haben dann n~tm- lieh in ihrer peripheren Zone einen Kranz sehr kleiner rother KSrnehen (Fig. 2). Die durch Methylenblau gefiirbten Kiirnehen haben zum Neutrah'oth gar keine Verwandtschaft.

Ausser durch Neutralroth erh~tlt man die KSrnchen auch dutch das um zwei Methylgruppen ~trmere s. Diamidotaluphenazin. Auch bei der postmortalen Fiirbung in einer Neutralrothliisung 1:50000 erh~tlt man sie. Ja sogar wenn man die postmortale F~irbung mit Methylenblau oder Safraninazodimethylanilin an- wendet, so missglfickt rnitunter die vorhin besehriebene K6rnchen- f~trbung und man erh~tlt das typische Bild der mit Neutralroth darstellbaren K~irnchen, die ieh als R a n d k (~ r n e h e n, im Gegensatz zu den anderen~ den C e n t r a l k t i r n c h e n be- zeichnen m~chte.

Dass man an der Leberzelle eine periphere Schieht erkennen kann, die frei ist yon den eentralen KSrnchen, hat sehon E h r- l i c h naehgewiesen, indem er Leberzellen auf dem Deckglas an- trocknete and ein typisehes Trockenpritparat herstellte. Die peri- pheren Kiirnehen sind noch nicht besehrieben worden, und es bleibt nur tibrig die Grfinde ftir and gegen die Annahme der Praformation dieser KSrnehefi auseinanderzusetzen. Es ist immer- bin auffiillig und spricht einigermasseu ftir die Pritformation, dass

Die vltale Farbung, eine Darstellungsmethode der Zellg'ranula. 569

es gelingt, mit drei so verschiedenen Farbstoffen, wie dem Neu- tralroth, dem Methylenblau and dem Safraninazodimethylanilin die K(irnchen in genau derselben Anordnung in der Zelle, der- selben GrSsse und Form zu erhalten, and zwar mit allen nur in der Leber der Maus und des Meerschweinchens, dagegen nicht in der Leber der Kreuzotter, des Frosches and des Triton. Beim Frosch and Triton erhalt man aber besonders sch6n mit Safrania- azodimethylanilin sehr hiiufig eine prachtvolle Fi~rbung tier Gallen- capillaren, die aus sehr feinen dieht gedriingten Farbk6rnchen besteht. In diesem Fall ist es sicherlich ein Niederschlag, den der Farbstoff mit irgend einem Gallenbestandtheil bildet. Das brachte mich darauf, ob vielleicht auch bei der Maus die Rand- k6rnchen als unl(isliche Verbindungen eines Gallenbestandtheils mit dem Farbstoff anzusehen seien. Mein Augenmerk richtete sieh zun~tchst auf die Gallensi~uren~ und ich fund in der That, dass das taurocholsaare Natron mit Neutralroth eine, wenn auch nicht ganz complete F~llung giebt, offenbar yon taurocholsaurer Neutralrothbase. Auch Methylenblau g i e b t mit taurocholsaurem Natron eine, wenn auch noch weniger complete FMlung. Safranin- azodimethylanilin erh~tlt dagegen dutch taurocholsaures Natron eine geringe Fluorescenz, ohne einen wesentliehen Niederschlag zu geben. Bei diesen Versuchen wurden die Farbl6sungen im Verhiiltniss 1: 1000, die LSsung des gallensauren Natrons 1:300 verwendet. Wenn also diese Versuehe nicht zu einer bestimmten Auffassung der K6rnchen gefiihrt haben, so kommt nun noch dazu, dass das salzsaure Fuchsia mit taurocholsaurem Natron einen sehr dicken, flockigen Niederschlag bildet, die Leber der Maus dagegen vSllig ungefi~rbt li~sst bei postmortaler Fiirbung.

Ich ziehe kS deshalb vor, fiber das Wesen der Randk6rn- chert noch keine feste Meinung zu fassen.

2. Die Speicheldri isen.

Die vitale KSrnehenfi~rbung der Speieheldrtisen habe ieh am genauesten bei 'der Maus untersueht. Es ist daher angebracht, erst eine Beschreibung des mikroskopischen Baues dieser Drtisen zu geben. Ich will dies nieht nach fixirten und gefi~rbten Pr~- paraten thun, obwohl ieh alle meine Befunde an solchen nach- geprtift habe, sondern einfach beschreiben, was man an frischen Qaetschpriiparaten sieht, gleichzeitig um dadurch den Beweis zu

570 L. Michaelis:

liefern, dass man des Gefriermikrotoms nicht bedarf, um frische Speicheldrtisen aufs genaueste zu analysiren.

Das P a n k r e a s unterscheidet sich nicht yon dem anderer Siiuffethiere. Eine genauere Beschreibung" derselben ist ftir den Fachmann tiberfltissig. Die Verminderung der K~rnchen auf Pilo- carpin-Injection lasst sich beobaehten, wenn man einer Maus 1 mg Piloearpin injieirt und nach etwa drei Stunden zur Untersuehung t6dtet.

Die P a r o t i s der Maus ist eine sehr instructive Drtise. Die seeernirenden DrUsenzellen sind im F@ungszustande mit einer Menge yon KOrnchen geffillt, die ein wenig kleiner als die des Pankreas, aber ebenfalls stark ]ichtbrechend sind. Die An- ordnung der K6rnchen in der Zelle ~thuelt der im Pankreas darin, dass sie besondcrs die Innenzone der Zelle erfiillen; nur ist die Grenze der Innen- und Aussenzone nicht so schaff wie beim Pankreas. Die Zellgrenzen sind sehr scharf contourirt. Auf Pilocarpin reagiren diese Zellen derart, dass die K6rnchen erst geringer an Zahl warden, und dann dureh eine neue Generation yon K(irnchen ersetzt werden, die kleiner und schwiicher lieht- breehend sind. Ausserdem treten naeh Piloearpininjection grosse, unregelmassig runde Secrettropfen in den Zellen auf.

Die S u b m a x i l l a r i s der Maus ist eine grosse Drtise und besteht aus zwei ganz versehieden gebauten Lappen, einem vorderen und einem hinteren.

Der v o r d e r e Lappen ist genau so gebaut, wie die Pa- rotis. Seine Abgrenzung gegen den hinteren Lappen ist nieht seharf zu erkennen.

Der h i n t e r e Lappen besteht aus einem Gefleeht zweier versehieden gebauter Arten yon Tubuli.

Die einen sind aus Zellen zusammengesetzt, die im Ruhe- zustand v(illig, d. h. nieht allein in der Innenzone, mit sehr grossen kugelrunden und stark breehenden K~)rnehen vollgestopft sind (Fig. 3). Die Zellgrenzen sind im frisehen Praparat sehr seharf zu erkennen. Auf Piloearpin reagiren diese Zellen h~ehst eigen- thttmlieh (Fig. 4). Zuerst werden die dem Lumen benaehbarten K(irnehen ausgestossen, withrend gleiehzeitig die tibrigen K(irnchen naeh der Innenzone der Zelle naehrtieken. Bald darauf treten in der nun k(irnchenfl'ei gewordenen Aussenzone der Zelle sehr zahl- reiehe, zierliehe, sehr reffelmassige Stabehen auf, die senkreeht

Die vitale F~rbung, eine Darstellungsmethode der Zellgranula. 571

zur Membrana propria stehen - - ein yon den Zellen der Harn- und Speichelr6hrchen genugsam bekanntes Bild.

Das n/~chste Stadium besteht darin, dass jedes dieser St/~b- chen in eine Reihe sehr kleiner, abet unter sich ganz gleich- m/~ssig grosset K6rnchen zerf/~llt. Jetzt befinden sich in der Zelle zwei Generationen yon Secretk6rnchen: die alten grossen, jetzt nur noch an der Innenzone der Zelie liegenden K6rnehen, und die jungen kleinen, in der Aussenzone gelegenen K6rnchen. Die jungen K6rnehen vergrSssern sich in dem Maasse, wie die alten ausgestossen werden, und zwar derart, dass sie unterein- ander stets genau gleich gross bleiben. Wenn die alte Genera- tion der KSrchen ganz ausgestossen ist, dann ist der ursprting- liche Zustand der Zelle wieder hergestellt. Ich werde diese Zellenart im Folgenden als die ,grobgranulirten Zellen ~ be- zeiehnen.

Die anderen Tubuli des hinteren Lappens der Submaxil- ]arts bestehen aus ZeIIen, deren Grenzen nur unter gttnstigen Um- st/~nden erkannt werden, und in denen man an guten Stellen des Praparates ganz matte KSrnchen, oder meist aber ein negatives Bild you Kr einNetzwerk erkennen kann. Das sind die Sehleimzellen. Auf Pilocarpin reagiren sie vor allem dadurch, dass zahlreiche grosse, unregelm/~ssig runde Secrettropfen in ihrem Innern auftreten. Die Ver/~nderungen an den K6rnchen sind wegen ihres schwachen Lichtbreehungsverm6gens sehwer zu be- obaehten.

Nach innen yon der Submaxillaris, you dieser vSllig bedeckt, liegt zu beiden Seiten tier LuftrShre noch eine rothgelbe, ziemlich grosse Driise, deren mikroskopischer Bau sich yon dem der Speichel- drfisen unterscheidet. Sie bestehl; aus Acinis, die kein Lumen besitzen, sondern ganz und g'ar yon grossen Zellen erffillt sind mit einem netz- artigen Protoplasma, in dessert Maschen eine fettartige Subs~;anz Iiegt. Es handelt sich also nicht um eine Speicheldriise. Auch habe ich keinen Ausftihrung'sgang finden k~nnen.

Wie die oben gegebenen Beschreibungen zeigen, kann man an dem ungef/irbten Pr/~parat bet den Speicheldrtisen eine grosse Zahl yon K6rnehen untel'scheiden, um die es nicht Iohnte, die vitale F/~rbung in Anwendung zu bringen. Nur der Vollst/~ndig- keit halber will ich erw/~hnen, dass die Granula sich bet der postmortalen F/trbung am leichtesten mit Neutralroth, dann mit

572 L. Michaelis:

Methylenblau, bei langer Einwirkung schliesslich auch mit Safra- ninazidomethylanilin und mit viclen anderen Farbstoffen farben.

Wahrend sich also diese Kfirnchen mit allen mfiglichen Farb- stoffen aniarben lassen, komme ich jetzt zu einer Art yon Zell- einschlttssen, die nicht in der ungef~rbten Zelle sichtbar sind, und eine ganz specifische Affinit~t zum Safraninazodimethylanilin, und zwar ganz al!ein zn diesem, besitzen. Wenn man n~mlich ein Stiiekchen der Parotis in dcr beschriebenen Art und Weise in einer L~sung dieses Farbstoffes in physiologischem Kochsalz- wasser im Verhaltniss yon 1:30000 f~rbt, so tritt schon nach 40 Minuten das in Fig. 6 wiedergegebene Bild hervor. Die Reaction geht stets mit roller Sicherheit vor sich; nut darf man nattirlich nicht erwarten, dass eine Durchfarbung des ganzen, wcnn aueh noch so kleinen Drtisenstiickes eintritt.

Die auf diese Weise dargestellten Zelleinschltisse sind kleine Fadchen oder Stabchen, welche in grosser Menge in einer Zelle liegen. Die meisten sind leicht cingekrtimmt, einige gerade ge- streckt, andere starker eingeknickt, wieder andere sind so stark eingeknickt, dass sich die beiden Enden fast bertihren, und ferner finden sieh in wechselnder Menge kleine Ringe, die dureh Ein- biegung der Fadchen entstanden zu sein scheinen. An Stelle der Ringelehen sieht man bisweilen auch kleine Dreieckchen oder andere, schwer definirbare Figuren.

Dcr erste Eindruck, den eine so gef~rbte Zelle bictet, ist der, als ob sie mit Bacillen besat sei. Diese F ~ d e h e n findcn sich im Pankreas, in der Parotis und in dem vorderen, der Parotis gleichgebauten Lappen der Submaxillaris der Maus. In dem hinteren Abschnitt der Submaxillaris dagegen finden sie sich nur in den mattgrauulirten Schleimzellen, dagegen nicht in den grobgranulirten Zellen; die Stabchcn, die bei der Reizung in diesen Zellen auftreten, fKrben sieh nieht mit Safraninazodime- thylanilin.

Von den Speieheldriisen anderer Thicre zeigten folgende ~hnliche Fadchen. Beim F r o s e h gelang es, allerdings unter vielen Versuehen nut einmal, nach intraven~ser Injection des Farbstoffes (2)<1,5 ccm einer 4 fach verdiinnten concentrirten Farbl~sung) im Pankreas sehr sch~ne und grosse Fadchcn zur Anschauung zn bringen.

Bci T r i t o n t ~ n i a t u s zeigte das Pankreas nach Farbung

Die vitale Fiirbung, eine Darstellungsmethode der Zellgranula. 573

in einer Farbl6sung 1:50000 ein prachtvolles Bild sehr langer bogenfSrmiger bis ffanz kurzer Fi~dchen. Sehr oft missgltickte die F~rbung.

Der I g e 1 hat im Pankreas, in der Submaxillaris, der Re- trolingualis und der Parotis F~tdchen.

Beim K a n i n e h e n land ich F~tdehen im Pankreas, in der Submaxillaris, Parotis.

Bei der R a t t e in denselben Drtisen. Beim M e e l ' s e h w e i n c h e n im Pankreas, im medialen

wie im lateralen Lappen der Submaxillaris, in der Parotis (wenn man fiberhaupt den kleinen vor dem 0hr gelegenen Lappen der itusseren Submaxillaris als Parotis bezeiehnen will).

Die Fi~dehen sind also ftir eine grosse Zahl yon Driisen charakteristisch u n d e s muss nur noeh der Beweis geliefert wer- den, dass man es hier wirklich mit pri~formirten Gebilden zu thun hat.

Diesen liefert der Umstand, dass bei einigen dieser Drtisen auch die A l t m a n n'sche Methode diese F~tdchen zeigt, am leiehtesten wohl in der Submaxillaris des Meersehweinchens, und dass ferner sehon H e i d e n h a i n ( H e r m a n n ' s Handbuch, V) f~tdige Gebilde im Pankreas beschreibt, die er durch Maceration der Zellen erhalten hat.

Die yon S o 1 g e r besehriebenen Basalfilamente sind da. gegen sieherlich nicht identiseh mit den F~,tdchen.

Die Anordnung der Fiidchen in der Zelle ist bei jeder Drtise eine eharakteristisehe. Ieh will sie nur bei Driisen der Maus beschreiben.

Im Pankreas lieg'en die F~tdehen ganz vorzugsweise an den Randern der Zelle, mit Ausnahme des innern, yon den sog. Zy- mogenk(irnchen eingenommenen Randes. Die Ringelchen dagegen, and auch einige F~tdehen liegen mehr im Innern der Zelle.

Die an dem Basalrand der Zelle gele~enen F~tdehen sind im Allgemeinen dem optischeu Quersehnitt der Membrana propria parallel geriehtet, die an den Seitenrandern der Zel[e liegenden Fadchen sind diesen parallel.

In der Parotis ist h~ufig die Anordnung sehr ~hnlieh~ in- dem der Quersehnitt der Zelle yon einem Kranz yon Fadehen umgeben scheint. Die F~tdehen liegen abet stets in der Zelle, wenn auch sehr nahe dem Zellrande. Andere male liegen die

574 L. Michael is :

Fiidchen in der ganzen Zelle zerstreut. Von welchen Umstiinden die verschiedenartige Vertheilung" abhitngt, vermag ich nicht zu saffen; jedenfalls gehen diese Lageveri~nderunffen nicht einfach dem Secretionsstadium parallel.

Die F~tdchen in den Schleimzellen der Submaxillaris bieten kein so sehSnes Bild wie im Pankreas und in der Parotis. Sic f:.trben sich sehwerer an und sind unreffelmitssig gestaltet. Bis- weilen ist aueh hier eine kranzartige Anordnung zu erkennen.

Ieh habe mieh lunge bemtiht, die Bedeutung der Fadchen far den Secretionsvorgang klar zu legen, ohue zu einem con- stanten Ergebniss zu kommen. A I t m a n n giebt far die in der Pa- rotis der Katze befindliehen fadigen Gebilde an, dass sic bet einem gewissen Stadium der Pilocarpinreizung" in junge Seeret- k0rnehen zerfielen.

Sicherlich giebt es Fadehen und stabehenartige Gebilde in der Zelle, die bet gewissen Secretionstadien sieh pl(itzlieh in eine Reihe yon K(irnchen aufl(~sen, wie ieh z. B. oben bet den Sti~behen der grobgranulirten Zellen beschrieben babe und es noeh yon den Stitbehen der N i e r e n epithelien hinzuftigen kanu, die sieh durehaus nieht immer als K(h~ehenreihen erweisen. Abel" bet den Fadehen im Pankreas und den Speieheldrtisen ist es mir trotz aller Voreingenommenheit, es sehen zu wollen, nieht ge- lungen, den gleiehen Vorgang zu beobachten.

Ieh untersuehte viele Drtisen yon ~ausen, die bis zur Er- sch(ipfung gehungert hatten, oder einen Tag lang in einem v011ig leeren Glas gelebt hatten, indem sic nicht einmal Papier zum be- nagen batten, andererseits die Drttsen yon Mausen, welehen Pilo- carpin (gewiihnlich (0,001) oder Eserin (0,0001) injieirt wurde, in allen m(igliehen Zeitriiumen naeh der Injection; Drtisen, die yon Seeretk6rnehen strotzten, und solehe, die fast gar keine Seeretk(irnehen enthielten: niemals babe ieh eine constante Ver- ii.nderung an den Fadehen feststellen ktinnen; ja nieht einmal die Haufigkeit der Ringelehen, die zwisehen weiten Grenzen sehwankt, erwiess ieh als vom Seeretionszustand abhangig.

Und doeh giebt es eiue Thatsaehe, welehe far den gene- tischen Zusammenhang der Seeretionsktirnehen mit den Fitdehen sprieht. Da sieh die Secretionsk(irnehen leieht mit Neutralroth fii.rben, so versuehte ieh eine DoppelP.trbung der Zellen in folgen-

Die vitale Fiirbung', eine Darstellungsmethode der Zellgranula. 575

der LSsung. Janusgl'iin-L6sung" (1 : 1000) 1~0 ; NeutralrothlSsung (1:1000) 0,67; 0 ,85% Kochsalzliisung ad 40.

Hierin f/irbea sieh die F~tdchen stets grtin, die aasgebildeten SecretkSrnchen stets roth, ausserdem sieht man im Pankreas, be- souders in dem ausseren Abschnitte der zeIIen kleinere, offenb~r fling'ere vereinzelte Secretk(irnchen, welche theils roth, theils grtin sind. kuch die Ringelchen werden thefts roth, thefts grtin.

Nun besteht aber kein scharfer Unterschied zwischen den Ringelchen und den jungen SecretkSrnehen, da man oft Ueher- g'iinge zwischen diesen beiden Granulaformen sieht. Da aber andererseits welter oben wahrscheinlich gemacht wurde, dass die Ringelchen in einem genetischen Zusammenhang. mit den F~tdchen stehen, so wtirde es hiermit sehr wahrscheinlieh werden, dass die Kih'nchen in letzer Instanz yon den F~tdehen abstammten. Ich weiss wohl, dass ich reich hiermit in eincn Gegensatz setze zu der yon O g a t a (Arch. f. Physiol. 1883) behaupteten Ent- stehungsweise der Pankl'eask(irnchen, welcher sie yon den Neben- kel'nea ableitet, die ihrerseits aus Nueleolen entsteheu sollen~ ein Befund, der yon G a l e o t t i (Internat. Monatssehr. far Anat. u. Physiol. 1895) nicht vOllig best/itig't win-de. Auch dieser nimmt jedoeh eine Auswandel'ung der K0rnehen aus dem Kern an. Die Beobaehtungen diesel" beiden Autoren bedtirfen aber einer Nach- prtifung, da sie die F/idchen nieht beracksiehtig.t haben, well sie noeh keine ~[ethode zt/ ihrer Darstellung kannten.

Erkl~rang der Abbildungen auf Tafel X X X I I .

Fig-. I.

Fig. 2.

Fig. 3.

Fig. 4. Fig'. 5.

Fi~. 5.

Leberzellen der Maus, durch subcutane Injection yon Methylen- blau g'efhrbt. Leberzellen der Maus, durch subcutane Injection mit Neutral- roth g'ef~trbt. Submaxillaris der Maus; Tubulus mit g'robg'ranulirten Zellen im Fiillung'szustande. Ebenso, 4 Stunden nach Injection yon 1 mg'r Pilocarpin. Pankrcas der Maus, postmortM mit Safraninazodimc:hylanilin g'efarbt. Parotis tier Maus, dieselbe F~trbung-.

Areh iv f mikrosk. Anat. Bd. 55 3~