DIPLOMARBEIT / DIPLOMA THESIS

Titel der Diplomarbeit / Title of the Diploma Thesis

„Charakterisierung der biologischen Aktivität eines neu synthetisierten Triazols (MGtr2.HCl)

an isolierten Organen von Cavia porcellus“

verfasst von / submitted by

Stefan Grote

angestrebter akademischer Grad / in partial fulfilment of the requirements for the degree of

Magister der Pharmazie (Mag. pharm.)

Wien, 2015 / Vienna, 2015

Studienkennzahl lt. Studienblatt / degree programme code as it appears on the student record sheet:

A 449

Studienrichtung lt. Studienblatt / degree programme as it appears on the student record sheet:

Diplomstudium Pharmazie

Betreut von / Supervisor: Ao. Univ.-Prof. Dr. Christian Studenik

   

Inhaltsverzeichnis  1. Zielsetzung 1

2. Einleitung 2

2.1 Neurotrope Spasmolytika 2

2.1.1 Parasympatholytika 2

2.1.1.1 Belladonna - Alkaloide 3

2.1.1.2 Quaternisierte Atropinderivate 3

2.1.1.3 Tertiäre Parasympatholytika 3

2.1.2 Sympathomimetika 3

2.2 Muskulotrope Spasmolytika 4

2.2.1 Schlafmohn - Alkaloide und Derivate 4

2.2.2 Muskulotrope Spasmolytika als Antihypertensiva 4

2.2.2.1 Arterielle Dilatatoren 4

2.2.2.1 Arterielle und venöse Dilatatoren 5

2.2.2 Andere Muskulotrope Spasmolytika 6

2.3 Neurotrop-muskulotrope Spasmolytika 7

2.4 Weitere Spasmolytika 7

2.4.1 Synthetische Prokinetika 7

2.4.2 Natürliche Prokinetika 7

3. Material und Methodik 9

3.1 Testsubstanz 9

3.2 Nährlösung 10

3.3 Lösungsmittel 12

3.4 Versuchstiere 13

3.5 Herstellung der Versuchspräparate 14

3.5.1 Herz 15

3.5.1.1 Atrium cordis dextrum 15

3.5.1.2 Arteria pulmonalis 18

3.5.1.3 Musculus papillaris 18

3.5.2 Aorta descendens 19

3.5.3 Ileum terminale 21

3.6 Versuchskonfiguration und Apparaturanordnung 22

3.6.1 Messprinzip 22

3.6.2 Apparatur I 23

3.6.3 Apparatur II 25

3.6.4 Herstellung der Versuchslösungen 27

3.7 Versuchsabfolge 29

3.7.1 Versuchsabfolge Musculus papillaris 30

3.7.2 Versuchsabfolge Atrium cordis dextrum 32

3.7.3 Versuchsabfolge Aorta descendens 33

3.7.4 Versuchsabfolge Arteria pulmonalis 34

3.7.5 Versuchsabfolge Ileum terminale 34

3.7.6 Versuchsabfolge Ileum terminale MGtr2-Wirkmechanismus 35

3.8 Datenauswertung 36

3.8.1 Datenauswertung Musculus papillaris 36

3.8.2 Datenauswertung Atrium cordis dextrum 37

3.8.3 Datenauswertung der glattmuskulären Präparate 38

3.9 Statistik 39

4. Ergebnisse 40

4.1 Versuchsergebnisse an glattmuskulären Präparaten 40

4.1.1 Wirkung von MGtr2 auf die Aorta descendens 40

4.1.2 Wirkung von MGtr2 auf die Arteria pulmonalis 44

4.1.3 Wirkung von MGtr2 auf das Ileum terminale 47

4.2 Wirkung von MGtr2 auf den Musculus papillaris 50

4.3 Wirkung von MGtr2 auf das Atrium cordis dextrum 53

4.4 Ermittlung des Wirkmechanismus von MGtr2 am Ileum terminale 56

4.4.1 Beeinflussung der MGtr2-Wirkung durch 30 µmol/l Nitro-L-Arginin 56

4.4.1 Beeinflussung der MGtr2-Wirkung durch 100 µmol/l Nitro-L-Arginin 60

5. Diskussion 63

5.1 Wirkung auf die glattmuskulären Organe 63

5.1.1 Wirkung auf die Aorta descendens 64

5.1.2 Wirkung auf die Arteria pulmonalis 64

5.1.3 Wirkung auf das Ileum terminale 64

5.1.4 Wirkung auf das Ileum terminale nach Zugabe des eNOS-Inhibitors NO-L-Arg 65

5.2 Wirkung auf die quergestreifte Herzmuskulatur 65

5.2.1 Wirkung auf den Musculus papillaris 66

5.2.2 Wirkung auf das Atrium cordis dextrum 66

5.3 Konklusion 66

6. Zusammenfassung 67

7. Literaturverzeichnis 68

8. Danksagung 70

9. Curriculum vitae 71

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1. Zielsetzung

Viele Schwefelwasserstoff-freisetzende Verbindungen üben vasodilatierende Effekte an der

glatten Muskulatur aus, haben jedoch meist auch einen Einfluss auf die quergestreifte

Herzmuskulatur. Im Rahmen dieser Diplomarbeit sollten die Wirksamkeit sowie

unerwünschte Nebenwirkungen eines potentiell spasmolytisch wirkenden Triazols analysiert

werden, mit dem Bestreben eine gewebsselektive Wirkung nachweisen zu können. Die zu

prüfende Substanz MGtr2 des Departments für Pharmazeutische Chemie wurde hierzu an

isolierten und präparierten Organen des Meerschweinchens getestet. Glattmuskuläre Präparate

der Aorta descendens, Arteria pulmonalis und des Ileum terminale dienten der

Veranschaulichung vasodilatierender und spasmolytischer Wirkungen, das Atrium cordis

dextrum und der Musculus papillaris der Betrachtung unerwünschter chronotroper bzw.

inotroper Effekte.

Anhand der Kontraktionskraftregistrierung konnten Konzentrations-Wirkungskurven erstellt

werden, die durch Bestimmung der EC50 eine Beurteilung der Wirksamkeit ermöglichten.

An den Präparaten, die eine besondere Affinität gegenüber MGtr2 aufwiesen, wurde mittels

eines Enzyminhibitors und Blockade der endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase der

eventuell zugrundeliegende Wirkmechanismus studiert.  

  2

2. Einleitung

Spasmolytika, auch als Antispasmodika bezeichnet, sind Pharmaka, die den Tonus der glatten

Muskulatur verringern. Als Spasmus wird die unwillkürliche Kontraktion der glatten oder

quergestreiften Muskulatur definiert. Antispasmodika wirken an der Muskulatur der Gefäße,

der Bronchien und des Gastrointestinaltraktes (u.a.). Je nach Wirkmechanismus werden

Spasmolytika in neurotrope, muskulotrope und neurotrop-muskulotrope Spasmolytika

unterteilt (Ammon 2014).

Die Wirkung kann durch Rezeptorblockade (z.B. Parasympatholytika), Rezeptoraktivierung

(z.B. Betasympathomimetika) oder über andere Mechanismen (myotrope Agentien) erfolgen

(Pschyrembel 2013).

2.1 Neurotrope Spasmolytika

Neurotrope Spasmolytika wirken sowohl als Inhibitoren des Parasympathikus als auch durch

Rezeptoraktivierung des Sympathikus.

Hauptindikationen der neurotropen Spasmolytika sind Spasmen das Gastrointestinal-Traktes,

der Harn- und Gallenwege sowie der weiblichen Geschlechtsorgane. Außerdem werden sie

bei bradykarden Herzrhythmusstörungen, Parkinson, in der Ophthalmologie und als wichtige

Bronchodilatatoren verwendet (Mutschler 2008).

2.1.1 Parasympatholytika

Der Neurotransmitter Acetylcholin ist der wichtigste neuronale Überträger des

Parasympathikus und wirkt über nicotinerge (n-Typ) als auch über muskarinerge (m-Typ)

Rezeptoren. Während n-Typ Rezeptoren vor allem an den Ganglien und Endplatten

vorkommen, ist der Muscarin-Rezeptor an den glatten Muskeln, dem Herz und den Drüsen

lokalisiert. Acetylcholin wird in den cholinergen Neuronen durch die Cholinacetyltransferase

aus Cholin und Acetyl-Coenzym A synthetisiert (Lüllmann 2010).

Neurotrope Spasmolytika wirken als kompetitive Antagonisten des Acetylcholins an den

m-Cholinozeptoren (Oberdisse 2002).

Sie stehen den peripheren Muskelrelaxantien gegenüber, welche Nikotinrezeptoren der

Skelettmuskulatur und der vegetativen Ganglien blockieren (Estler 2007).

Die Blockade der muskarinergen Rezeptoren verhindert die Wirkung des Acetylcholins, was

zur Erschlaffung der glatten Muskulatur führt (Mutschler 2008).

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2.1.1.1 Belladonna - Alkaloide

Die ersten Verbindungen, die als Parasympatholytika registriert wurden, sind die Belladonna-

Alkaloide Atropin und Scopolamin (Estler 2007).

Atropin kommt in der Natur in vielen Solanaceenarten, wie Tollkirsche und Stechapfel vor.

Der Troparsäureester wird als Mydriatikum, Spasmolytikum des Magen- und Darmtraktes

und der ableitenden Harnwege, in der Narkosevorbereitung zur Verminderung der

Speichelsekretion sowie bei Bradykardien angewendet (Oberdisse 2002).

Während Atropin und Scopolamin peripher ähnliche Effekte ausüben, wirkt Scopolamin

zentral dämpfend (Estler 2007).

Die therapeutische Verwendung des Scopolamins liegt im Bereich der Ophthalmologie

und der Antiemetika, die als transdermale therapeutische Systeme (s. Scopoderm) bei

Reisekrankheiten angewendet werden (Mutschler 2008).

2.1.1.2 Quaternisierte Atropinderivate

Die quartären Parasympatholytika besitzen einen ionisierten Stickstoff, weshalb ihre

Wasserlöslichkeit gesteigert ist. Ipratropium und Tiotropium stellen propylierte bzw.

methylierte Atropinderivate dar, die als Spasmolytika zur Behandlung der COPD eingesetzt

werden und der Behandlung bradykarder Herzrhythmusstörungen dienen (Lüllmann 2010).

Das butylierte Scopolaminderivat Buscopan wird bei Magen-Darm-Koliken angewendet

(Mutschler 2008).

2.1.1.3 Tertiäre Parasympatholytika

Während Tropicamid als Mydriatikum in der ophthalmologischen Diagnostik genutzt wird

kommt Pirenzepin als Ulkustherapeutikum zum Einsatz (Mutschler 2008).

Die neuartigen Arzneistoffe Fesoteradin, Solifenacin und Darifenacin wirken über

M3-Rezeptoren und werden zur Behandlung der Blasenentleerungsstörung Dranginkontinenz

angewendet (Lüllmann 2010).

2.1.2 Sympathomimetika

Des Weiteren können neurotrope Spasmolytika die Aktivierung des Sympathikus bewirken.

Als Sympathomimetika ahmen sie die Wirkung der Neurotransmitter Adrenalin und

Noradrenalin nach, Catecholamine die in adrenergen Neuronen aus Tyrosin synthetisiert

werden, und agieren durch selektive Erregung der ß1- und ß2-Rezeptoren (Oberdisse 2002).

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Selektive ß2-Rezeptor Agonisten werden zur Behandlung des Asthma bronchiale eingesetzt.

Durch Rezeptoragonismus kommt es zu einer G-Protein gekoppelten Proteinkinase-A

Aktivierung. Fenoterol, Salbutamol und Terbutalin werden sowohl inhalativ als auch oral

angewendet und wirken 3-6 Stunden. Die Wirkstoffe Salmeterol (inhalativ) und ehemals

Clenbuterol (oral) besitzen eine verlängerte Wirkung und wirken 12-24 Stunden (Mutschler

2008).

2.2 Muskulotrope Spasmolytika

Muskulotrope Spasmolytika wirken unabhängig der vegetativen Innervation direkt an der

glatten Muskulatur und führen zu deren Relaxierung (Oberdisse 2002).

Die Wirkmechanismen sind dabei nicht gänzlich aufgeklärt (Estler 2007).

2.2.1 Papaver - Alkaloide und Derivate

Prototyp ist das heute auf Grund der fehlenden Selektivität obsolete Papaverin, das bis zu

1 % im Rohopium des Schlafmohns (Papaver somniferum) enthalten ist. Die Wirkung von

Papaverin schließt die Erschlaffung der glatten Muskulatur sämtlicher Bereiche des Körpers

ein (Mutschler 2008).

Der Wirkmechanismus beruht auf der Hemmung von Phosphodiesterasen und der Erhöhung

von intrazellulärem cAMP und cGMP. Papaverin wurde zur Relaxierung des Gastrointestinal-

und Urogenitaltraktes sowie der Bronchien verwendet. Zu den Nebenwirkungen zählten

Hypotonus und Arrhythmien (Oberdisse 2002).

Der gegenwärtig neue Wirkstoff Tiropamid wirkt durch den gleichen molekularen

Mechanismus und unterscheidet sich lediglich durch sein Nebenwirkungsprofil, das zusätzlich

zum Blutdruckabfall zentralnervöse Beeinträchtigungen wie Schläfrigkeit umfasst (Oberdisse

2002).

Hymecromon ist ebenfalls ein Papaverin-ähnliches Agens und wird als krampflösender

Arzneistoff in der Therapie von Beschwerden des Oberbauches verwendet (Mutschler 2008).

2.2.2 Muskulotrope Spasmolytika als Antihypertensiva

2.2.2.1 Arterielle Dilatatoren

Calciumkanalblocker wirken durch Blockade der langsamen, spannungsgesteuerten L-Typ

Ca2+-Kanäle und erzeugen durch Erweiterung der Ateriolen und Arterien negativ ino-,

chrono- und dromotrope Effekte. Auf die venösen Gefäße haben sie keinen Einfluss. Die

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1,4-Dihydropyridine wie z.B. Amlodipin werden zur Behandlung von Agina pectoris und

Hypertonie eingesetzt, die Phenylalkylamine wie z.B. Verapamil und Gallopamil darüber

hinaus für die Therapie von Arrhytmien und KHK verwendet (Mutschler 2008).

Kaliumkanalöffner, zu denen die Wirkstoffe Minoxidil, Diazoxid (obsolet) und Nicorandil

gehören, bewirken die Öffnung von ATP kontrollierten K+-Kanälen, besonders des inward

rectifier Kir6.2. Die anschließende Hyperpolarisation führt zur verminderten

Reizempfindlichkeit glattmuskulärer Zellen, außer an jenen der Kapazitätsgefäße. Minoxidil

findet vor allem bei therapieresistenten Hypertonikern, Nicorandil bei vasospastischer Angina

Verwendung. Zur Hypertoniebehandlung wird ebenfalls Dihydralazin genutzt, dessen

Wirkmechanismus nicht genau bekannt ist. Für die Monotherapie jedoch ist Dihydralazin

ungeeignet, daher wird es nur in Kombinationen mit anderen Antihypertensiva genutzt (Estler

2007).

2.2.2.1 Arterielle und venöse Dilatatoren

Na-Nitroprussid wirkt durch Aktivierung der Guanylatzyklase und nachfolgend über cGMP-

Anstieg NO-Konzentrations steigernd, es wird zur Behandlung von Bluthochdruckkrisen in

Notfallsituationen verwendet. Allerdings wirkt es auf venöse und arterielle Gefäße

gleichermaßen dilatierend. Bosentan, ein Agonist der Endothelin Rezeptoren ETA und ETB

wird als Orphan-Drug bei der Behandlung pulmonaler Hypertonien angewendet (Estler 2007).

Eine Sonderstellung nehmen die Nitrite und Nitrate ein, zu denen Glyceroltrinitrat und ISMN

gehören. Sie erweitern, durch Bildung und Freisetzung von NO, vor allem Venen und größere

Arterien, nicht aber die Arteriolen (Estler 2007).

NO ist einer der bedeutendsten physiologischen Vasodilatatoren (Lüllmann 2010).

Die zuvor unbekannte Substanz wurde von Furchgott Anfang der 80er Jahre als

„endothelium-derived-relaxing factor“ (EDRF) bezeichnet. Grund der Bezeichnung war der

Befund Furchgotts, dass viele Vasodilatatoren bei Entfernung des Gefäßendothels ihre

Wirkung verloren und daher nicht direkt auf die glatten Muskelzellen wirken konnten

(Aktories 2009).

Später zeigte sich, dass die Wirkung der bereits bekannten Nitrovasodilatatoren auf der

Aktivierung der löslichen Guanylylcyclase in den glatten Muskelzellen und der

anschließenden Bildung von cGMP basierte. Die Guanylylcyclaseaktivierung wiederum

wurde durch die NO-Bildung und Freisetzung bewirkt. NO fungierte durch Diffusion in die

glatten Muskelzellen als Wirkungsvermittler (Aktories 2009).

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Auch im Körper wird NO synthetisiert und stellt damit den kleinsten bekannten

Neurotransmitter dar (Aktories 2009).

Die Synthese erfolgt durch Spaltung der Aminosäure Arginin mittels NO-Synthasen (NOS).

Dabei entsteht neben NO auch Citrullin. Je nach anatomischer Lage der Synthase werden die

Formen endotheliale- (eNOS), neuronale- (nNOS) und induzierbare NO-Synthase (iNOS)

unterschieden (Lüllmann 2010).

Die eNOS ist durch die NO-Synthese in den Endothelien maßgeblich an der Regulierung des

Gefäßtonus beteiligt, in dem es diesen verringert. Des weiteren vermindert das Enzym die

Thrombocytenaggregation und das Wachstum glatter Muskelzellen, weshalb es auch als

Gefäßprotektivum bezeichnet wird (Aktories 2009).

Peripher vermittelt eNOS über NO im Gastrum die postprandiale Magenerweiterung.

Außerdem wird durch Beteiligung von NO die relaxierende Phase der Darmperistaltik und die

Erweiterung der männlichen Schwellkörper kontrolliert (Aktories 2009).

Auch in den Bronchien spielt NO eine wichtige relaxierende Rolle (Lüllmann 2010).

Im ZNS ist neben der nNOS ebenfalls das Enzym eNOS vertreten, das durch NO-Produktion

modulierend wirkt (Lüllmann 2010).

Die induzierbare Synthase (iNOS) ist in Entzündungszellen lokalisiert und wirkt durch NO-

Bildung cytotoxisch auf Krankheitserreger (Lüllmann 2010).

2.2.2 Andere muskulotrope Spasmolytika

Weitere muskulotrope Spasmolytika sind Theophyllin und die Vasodilatatoren. Das

Methylxanthinderivat Theophyllin hat neben der Lungen-, Nieren- und Koronargefäß-

dilatierenden Wirkung auch einen gefäßverengenden Effekt auf die intracranialen Arteriolen.

Hauptanwendung findet es in der Behandlung von Kopfschmerzen und als

Bronchospasmolytikum (Estler 2007).

Zu den Vasodilatatoren gehören das Prostaglandin Iloprost, das vor allem bei schweren

Durchblutungsstörungen intravenös appliziert wird sowie der Ca2+-Kanalblocker Cinnarizin

und Cyclandelat, die bei Durchblutungsstörungen zentraler und peripherer Art eingesetzt

werden können. Die Anwendung der zuletzt genannten Wirkstoffe ist therapeutisch fraglich

(Estler 2007).

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2.3 Neurotrop-muskulotrope Spasmolytika

Die Spasmolytika dieser Wirkgruppe besitzen neben der muskulotropen auch eine

anticholinerge Wirkung (Oberdisse 2002).

Zu ihnen gehören die Wirkstoffe Mebeverin, Drofenin und Denaverin sowie Oxybutynin.

Mebeverin, ein Reserpinabkömmling und Denaverin werden zur Spasmusokkupierung an

Kolon bzw. Gastrointestinaltrakt und ableitenden Harnwegen eingesetzt (Rang 2007,

Mutschler 2008).

Oxybutynin wird darüber hinaus bei häufigem und nächtlichem Harndrang verwendet

(Oberdisse 2002).

Für die Behandlung des Colon irritabile werden die parasympatholytisch und glattmuskulär-

relaxierend wirkenden Arzneistoffe Propanthelin und Dicycloverin verwendet (Rang 2007).

2.4 Weitere Spasmolytika

Anders als die bereits besprochenen Spasmolytika wirken die synthetischen und natürlichen

Magen- und Darmmotilitäts beeinflussenden Arzneimittel weder über die para- und

sympathische Nerveninnervierung, noch über direkten Angriff an der glatten Muskulatur.

2.4.1 Synthetische Prokinetika

Die Wirkstoffe Metoclopramid (MCP) und Domperidon fördern die gastrale und duodenale

Motilität und kommen bei gastrointestinalen Komplikationen und

Magenentleerungsstörungen sowie zur Resorptions-fördernden Maßnahme vor der

Anwendung von Migräne-Therapeutika zum Einsatz (Mutschler 2008).

MCP wirkt durch Antagonismus an D2-Rezeptoren, weshalb es auch antiemetogen agiert und

innerviert 5HT3-Rezeptoren. Durch die ausgeprägte Bluthirnschranken Permeabilität zählten

extrapyramidale Nebenwirkungen zu den häufigsten Komplikationen. Daher ruht derzeit die

Zulassung (Mutschler 2008).

Domperidon löst weniger zentralnervöse Nebenwirkungen aus, auf Grund der verminderten

Bluthirnschrankengängigkeit (Mutschler 2008).

2.4.2 Natürliche Prokinetika

Zur Behandlung leichter gastrointestinaler Spasmen, Flatulenzen und Dyspepsien werden vor

allem Kümmelfrüchte (Carvi fr.) und das daraus gewonnene ätherische Öl, welches als

Hauptbestandteil Carvon enthält, verwendet (Hänsel 2010).

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Als Carminativa finden ebenfalls Fenchelfrüchte (Foeniculi amari fr.) und Anisfrüchte (Anisi

fr.) Verwendung. Sie wirken spasmolytisch sowie abführend und können dadurch

schmerzhafte Verkrampfungen vermindern (Teuscher 2012).

Außerdem werden als Spasmolytika Kamillenblüten (Matricariae fl.), Pfefferminzblätter

(Menthae pip. fol.), Kardamomenfrüchte (Cardamomi fr.), Melissenblätter (Melissae fol.) und

Wacholderbeeren (Iuniperi pseudo-fr.) angewendet, die meist als Infusa zubereitet

eingenommen werden (Hänsel 2010).

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3. Material und Methodik

3.1 Testsubstanz

MGtr2, die im Rahmen der Versuche zu prüfende Substanz ist ein Triazol-Derivat.

Bereitgestellt wurde das Derivat vom Department für Pharmazeutische Chemie der Fakultät

für Lebenswissenschaften.

Abbildung 1: Strukturformel MGtr2

 

 

             Nomenklatur: 3-Phenyl-5-(3-propoxyphenyl)-4H-1,2,4-triazol Hydrochlorid

Molekulargewicht: 315.80 g/mol

Eigenschaften: Kristallines, geruch- und farbloses Pulver  

Löslichkeit:

Geringe Löslichkeit in Wasser, Wasseralkoholgemischen und konzentriertem Ethanol.

Mäßige Löslichkeit in Elektrolytlösungen.

Ausgeprägte Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln (s. 3.3)

 

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3.2 Nährlösung

Um sowohl die Lebensfähigkeit der isolierten Organe zu garantieren, als auch den Versuch

unter möglichst physiologischen Bedingungen zu ermöglichen war vor Testbeginn eine

frische Tyrode-Elektrolytlösung (nach Maurice Vejux Tyrode) zu bereiten. Dabei handelt es

sich um eine nach Vorschrift von Reiter (Reiter 1967) hergestellte Krebs-Henseleit-Lösung.

Diese ergänzt die Ringerlösung, welche NaCl, K+- und Ca2+-Ionen enthält, um die

Bestandteile Glucose, MgCl2 und PO43-, wodurch neben Osmolarität und Euhydrie auch eine

Nährstoffversorgung der Gewebe erzielt wird. Der pH-Wert der Nährlösung wurde durch die

Begasung mit dem Gasgemisch Oxymix (95 % O2 + 5 % CO2) (Magnus 1904) während der

Herstellung, als auch im weiteren Verlauf der Versuchsdurchführung im euhydrischen

Bereich von pH 7,2 - 7,4 gehalten (s. 3.6). Dadurch konnte ein für das Gewebe reizfreies

Arbeiten gestattet und ein körperähnlicher Gasgehalt des Blutes simuliert werden.

Für den täglichen Versuch wurden jeweils 2 l Lösung hergestellt (s. Tabelle 2). Dabei wurde

für die Herstellung der Nährlösung frisch destilliertes Wasser sowie eigens bereitete

Stammlösungen verwendet (s. Tabelle 1). Über Büretten wurden aus diesen nacheinander

aliquote Volumina entnommen und in einem 2 l Messkolben aufgenommen. Anschließend

wurde die erforderliche Menge α-D-Glucose-Monohydrat auf einer Oberschalenwaage

eingewogen, hinzugegeben und der Kolben mit destilliertem Wasser bis zu einem Füllstand

von ca. 1,5 l aufgefüllt. Nach 20 minütiger Begasung mit Oxymix, um den pH-Wert von

7,2 – 7,4 und den erforderlichen Gasgehalt der Lösung einzustellen, konnte eine ca. 6 °C kalte

CaCl2-Lösung tropfenweise mit einer Pasteurpipette beigemischt werden. Die langsame

Zugabe des CaCl2 sowie der genaue pH-Wert waren dabei von Bedeutung, um die Entstehung

von schwerlöslichen Calciumsalzen zu vermeiden, die eine zu geringe Calciumkonzentration

der Gesamtlösung und damit eine Unterversorung der Gewebe bedeutet hätten. Die Folge

wäre eine deutliche Abnahme der Lebensdauer der Muskelpräparate gewesen. Nach Affüllen

des Messkolbens mit destilliertem Wasser bis zum Eichstrich wurde die Lösung durch Hin-

und Herschwenken homogenisiert.

Die Tyrodelösung wurde im Folgenden neben der Präparation der Organe und der

Organaufbewahrung, auch für die Reinigung und Befüllung der Organbäder und die

Herstellung der Kaliumchloridlösungen zur Muskelkontraktion verwendet

(s. 3.6). Während der Präparation und Versuchsdurchführung wurde die Tyrodelösung unter

Luftausschluss bei Raumtemperatur gelagert und hieraus für die jeweiligen Anwendungen

Einzelvolumina entnommen.

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Tabelle 1: Zusammensetzung der Tyrodelösung

Substanz Molare Masse

(g/mol)

Stocklösung Stocklösung/

Tyrode (ml/l)

Konzentration

(mmol/l)

NaCl 58,44 100,25 g/5 l 33,60 115,01

KCl 74,55 50,33 g/5 l 35,00 4,73

NaHCO3 84,01 125,00 g/5 l 83,70 24,91

MgSO4 120,37 147,02 g/5 l 1,18 0,29

KH2PO4 136,09 62,00 g/250 ml 1,18 2,15

CaCl2 110,98 34,00 g/250 ml 3,2 3,92

Glucose 180,16 Reinsubstanz 1,98 10,99

Tabelle 2: Einzelvolumina der 2 l Tyrodelösung

Substanz Volumen,

Menge

NaCl 67,20 ml

KCl 70,00 ml

NaHCO3 167,40 ml

MgSO4 2,36 ml

KH2PO4 2,36 ml

CaCl2 6,40 ml

Glucose 3,96 g

   

     

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3.3 Lösungsmittel

Für die vollständige Lösung der Substanz MGtr2 war, auf Grund der geringen Wasser- und

Alkohollöslichkeit, die Verwendung des Lösungsmittels Dimethylsulfoxid (DMSO) nötig.

Hierbei war die restlose Solventation der Testsubstanz erforderlich, um die Wirkung an den

Organpräparaten repräsentativ veranschaulichen zu können. Nur der gelöste Anteil der

Substanz kann durch die Zellmembranen der Organpräparate permeieren und einen

intrazellulären Effekt hervorrufen.

DMSO ist eine farb- und geruchlose Flüssigkeit, die über eine ausgeprägte Hygroskopizität

verfügt und zu den organischen Lösungsmitteln zählt. Neben den lösungsvermittelnden

Eigenschaften besitzt DMSO auch eine Wirkung auf zelluläre Strukturen, die besonders im

dermatologischen Bereich genutzt wird. Durch die starke Lipophilität und die damit

verbundene, ausgeprägte Fähigkeit obere Hautschichten zu penetrieren, wird

Dimethylsulfoxid verwendet, um Schmerzzustände im Zusammenhang mit Blutergüssen zu

vermindern und gleichzeitig einen abschwellenden Effekt zu bewirken. Außerdem wird

DMSO in der Dermatologie als Transportvermittler für Arzneistoffe genutzt. Auf das

Gefäßsystem und die glatten Muskelzellen des Gastrointestinaltraktes konnten

Kontraktionsstärke und –frequenz beeinflussende Effekte beobachtet werden. In hohen

Konzentrationen hingegen geht von dem Sulfoxid (s. Abbildung 2) eine zytotoxische

Wirkung aus (Sexton 1979, Sperling 1979).

Diese Eigenwirkungen mussten während der Versuche berücksichtigt werden, um die isolierte

Wirkung des Triazolderivates betrachten zu können. Hierzu wurde ein Korrekturfaktor, der in

vorangegangenen Versuchsreihen eruiert wurde, verwendet mit dem die gewonnenen

Ergebnisse zu multiplizieren waren.

Abbildung 2: Strukturformel von Dimethylsulfoxid

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3.4 Versuchstiere

Für die Durchführung der Versuche wurde das gemeine Hausmeerschweinchen Cavia

porcellus verwendet (Simpson 1945, Wagner 1976).

Meerschweinchen werden seit mehreren Jahrhunderten in Tierversuchen eingesetzt. Erste

Erwähnung finden sie bei Lavoisier 1780 (Lane-Petter 1963, Wagner 1976).

In vivo Versuche zur Untersuchung der Darmmotilität wurden bereits 1904 durch Magnus

und 1933 durch Straub und Viaud beschrieben (Vogel 2002), die Wirkung unterschiedlicher

Spasmolytika auf glattmuskuläre Präparate von Ratten durch Maggi und Meli ausführlich

dokumentiert (Maggi 1982).

Die Testung des Triazolderivates erfolgte am Stamm TRIK. Der TRIK-Stamm, der einer

Grazer Aufzucht entstammte, ist für die Arbeit im Labor optimiert und stellt somit keine

Wildform dar. Im Department für Pharmakologie der Universität Wien lebten die Tiere

artgerecht in Rudeln zusammen (Wagner 1976). Täglich wurde ein Tier ausgewählt, wobei

darauf geachtet wurde keine trächtigen Tiere zu verwenden. Ausgewählt wurden männliche

und weibliche Tiere, im Alter von wenigen Wochen und einem durchschnittlichen Gewicht

von 300 - 500 g (Magnus 1904). Jedes Tier war zuvor in keinerlei andere Testversuche

eingebunden. Für die Organentnahme wurde das Tier per Genickbruch getötet, um eine

schnelle und wenig qualvolle Methode zu erlauben, bei der Tier und Organe möglichst

geringen Belastungen ausgesetzt waren. Mit der Verwendung von CO2 oder der inhalativen

Anästhetika sowie dem Einschläfern mittels Pentobarbital stehen weitere schonende

Methoden der Tötung zur Verfügung (Vogel 2002). Besonders das Herz stellt bei Stress des

Tieres und der darauf folgenden Freisetzung von Catecholaminen ein anfälliges Organ dar,

dessen Nutzung nach zu starker Beanspruchung nur noch eingeschränkt möglich ist. Nach

zügiger Eröffnung der Bauchdecke und des Thorax durch Verwendung einer Episiotomie-

Schere wurde zunächst das schlagende Herz entnommen und rasch in Tyrodelösung

überführt, um dessen Aktivität bestmöglich erhalten zu können. Es folgten die Entnahme des

terminalen Ileums, dessen proximales Ende zwecks besserer Orientierung mit einem

Bindfaden abgebunden wurde und die Isolierung der Aorta thoracica/abdominalis entlang der

Columna vertebralis durch anfänglich erfolgenden Radialschnitt und anschließende laterale

Schnitte entlang des umgebenden Bindegewebes, die ebenfalls einzeln in mit Tyrodelösung

befüllten Bechergläsern aufgenommen und zur Erhaltung der Organfunktion mit dem

Gasgemisch Oxymix begast wurden.

 

  14

3.5 Herstellung der Versuchspräparate

Für die Untersuchung der Testsubstanz an den isolierten Organen waren diese zunächst in

geeignete Präparate zu überführen. Darauf konnten die Organe in die Prüfapparaturen

eingesetzt und untersucht werden. Hierzu wurden zuvor gereinigte Präparierschalen aus Glas

verwendet, auf deren Boden eine dünne ringförmige Scheibe aus Kork als Unterlage für die

Organe installiert wurde. Vor der Befüllung der Präparierschalen mit frischer Tyrodelösung

war außerdem ein schmaler Gummischlauch, der sich dem Innenradius der Präparierschale

anpasste, in die Schale einzubringen, um den Auftrieb der darunterliegenden Korkscheibe

durch die Tyrodelösung zu vermeiden. Ferner wurde durch den Gummischlauch auch ein

Abtreiben des Organs unter die Korkscheibe verhindert. Die einzelnen Organe konnten

anschließend den begasten Bechergläsern entnommen werden und wurden während der

Präparation durch Präpariernadeln auf der Korkscheibe fixiert. Hierbei musste darauf geachtet

werden die Verweildauer der Organe außerhalb der begasten Tyrodelösung möglichst gering

zu halten und während der Präparation rasch zu arbeiten, da während der Präparateherstellung

keine Oxymixbegasung möglich war. Dadurch konnte eine unnötige Belastung der Organe

vermieden und eine einwandfreie Funktion der Präparate während der Versuchsdurchführung

sicher gestellt werden.

Die Herstellung der Präparate erfolgte unter Vergrößerung durch eine Stereolupe, die

außerdem über eine geeignete Lichtquelle verfügte. Dabei kamen neben der Präparierschale

und der Stereolupe Scheren für die Freilegung des Präparates aus größeren Gewebeverbänden

zum Einsatz sowie Federscheren um kleinere Geberückstande am Präparat entfernen zu

können (Magnus 1904). Kleinste Gewebereste wurden über Pinzetten abgetragen. Die

Reinigung der Präparate wurde mittels Pasteurpipetten durchgeführt (Magnus 1904). Die

fertiggestellten Präparate wurden anschließend in durch Oxymix begaste und Tyrodelösung

enthaltende Bechergläser eingebracht und erst unmittelbar vor der Einführung in die

Testapparatur aus der Nährlösung entnommen.

  15

Abbildung 3: Arbeitsplatz

1 Stereolupe, 2 Lichtquelle, 3 Präparierschale, 4 Korkring, 5 Gummischlauch,

6 Präparierbesteck

3.5.1 Herz

Das Herz stellte während der Versuchsdurchführungen die Bezugsquelle für die Präparate der

Papillarmuskeln (M. papillaris), des linken Vorhofes (Atrium cordis dextrum) und der

Pulmonalarterie (Arteria pulmonalis) dar. Bei der Gewinnung der kardialen Substrukturen

war darauf zu achten, diese den übrigen Präparationen voran zu stellen und durch zügiges

Arbeiten optimale Herzaktivität zu bewahren. Da bei der Organentnahme zunächst Teile des

herzumgebenden Bindegewebes, insbesondere das aus Adipozyten bestehende Fettgewebe

und Reste von Lungengewebe am Organ verblieben, mussten diese vor der eigentlichen

Öffnung des Organs entfernt werden. Das Herz, das anschließend in die Präparierschale mit

Tyrodelösung eingebracht wurde, konte durch mehrmaliges Wechseln der umgebenden

Tyrodelösung vom Blut befreit werden und schlug während der Präparation und den

folgenden Tests stetig weiter. Um die Organeröffnung zu erleichtern wurde das Herz mit zwei

Nadeln an der Basis und der Spitze fixiert und daraufhin durch feine Schnitte mittels

Federschere geöffnet.

3.5.1.1 Atrium cordis dextrum

Das Herz, welches als Pumporgan für die Zirkulation des körpereigenen Blutvolumens eine

zentrale Rolle spielt, erhält das aus dem Körperkreislauf stammende sauerstoffarme Blut über

  16

die zuführende untere und obere Hohlvene, die in den rechten Vorhof münden. Von dort fließt

das Blut über die Trikuspidalklappe, den rechten Ventrikel und die Pulmonalklappe in die

Lungenarterien, wird in den Lungenkapillaren verteilt und durch die Atmung von CO2 befreit

und anschließend mit O2 angereichert. Sauerstoffreiches Blut fließt über die Lungenvenen,

den linken Vorhof und die Mitralklappe in den linken Ventrikel, aus dem es durch

rhythmische Kontraktionen in Aorta und folglich den Körperkreislauf gepumpt wird.

Der Rhythmus der Kontraktionen wird durch die zur Automatie befähigten Gewebe des

Sinusknoten und des Atrioventrikularknoten generiert, welche elektrische Impulse erzeugen.

Die Lokalisation des Sinusknoten befindet sich im Gewebe des rechten Vorhofes (Atrium

cordis dextrum) lateral der Einmündung der oberen Hohlvene (Vena cava supp.), wodurch

dessen Isolation für die Herstellung eines Präparates zweckmäßig war und daher ein

möglicher chronotroper Effekt der Testsubstanz überprüft werden konnte. Für die Entnahme

wurde der rechte Vorhof durch eine Inzision entlang des Sulcus coronarius (s. Abbildung 4)

vom rechten Ventrikel getrennt. Für das Einsetzen des Präparates in die Prüfapparatur wurden

folgend kleine Haken aus Silberdraht, durch Annähen mit einem Bindfaden geeigneter Stärke

und Reißfähigkeit, am Organpräparat angebracht. Bis zu Beginn der Tests wurden die

Präparate in begasten, Tyrodelösung enthaltenden Bechergläsern aufbewahrt.

  17

Abbildung 4: Anatomie des Herzens - Querschnitt (Netter FH 2003)

  18

3.5.1.2 Arteria pulmonalis

Die Arteria pulmonalis, die proximal der Aufspaltung in die linken und rechten

Lungenarterien auch als Lungenschlagader (Truncus pulmonalis) bezeichnet wird (s.

Abbildung 4), wurde im Anschluss an die Präparation des rechten Vorhofes vorsichtig heraus

gearbeitet. Diese Teilstruktur des Herzens wurde ausgewählt, da der Truncus pulmonalis eine

anatomische Struktur des Körpers darstellt, die über glattmuskuläre Zellen verfügt. Wie auch

am Ileum terminale und der Aorta descendens konnte dadurch auf eine mögliche Wirkung der

Substanz auf glatte Muskelzellen geprüft werden, die im Fall des Truncus pulmonalis einer

Vasodilatation entsprochen hätte.

Da es sich bei diesem Abschnitt der A. pulmonalis um ein nur ca. 0,5 cm großes Element

handelt, musste besonders umsichtig vorgegangen werden. Aus dem erhaltenen Stück des

Truncus pulmonalis wurden daraufhin feine Ringe durch einzelne Radialschnitte hergestellt.

Diese Ringelemente hatten jeweils eine Breite von ca. 3 mm, sodass insgesamt ein bis zwei

Teilpräparate gewonnen werden konnten. Anschließend wurden die Teilpräparate in

Tyrodelösung hältige, mit Oxymix begaste Bechergläser bis zu ihrer Verwendung aufbewahrt.

3.5.1.3 Musculus papillaris

Die letzten für die Testreihen benötigten kardialen Substrukturen stellten die Papillarmuskeln

(Musculus papillaris) dar. Für die Entnahme der Papillarmuskeln war die endgültige Öffnung

der Herzkammern notwendig. Insgesamt konnten aus der rechten Herzkammer drei und aus

der linken Herzkammer zwei Papillarmuskeln gewonnen werden. Hierzu wurde ausgehend

von der Arteria pulmonalis die rechte Herzkammer entlang des Septums bis hin zur

terminalen Herzspitze geöffnet. Daraufhin wurde pro Muskel jeweils ein Silberdrahthaken mit

einem Bindfaden am Sehnenansatz der Papillarmuskeln angenäht. Anschließend wurde der

Papillarmuskel durch einen vorsichtigen Schnitt vom Endokard getrennt und auf das

Vorhandensein von Resten der Pukinjefasern geprüft. Diese mussten wenn vorhanden entfernt

werden, da sie während des Ablaufs des Versuches Störquellen darstellten, die durch pulsatile

Freisetzung von Catecholaminen den regelmäßigen Kontraktionsrhythmus der

Papillarmuskeln negativ beeinflussten und einen repräsentativen Test der Substanz nicht

möglich gemacht hätten.

Der Papillarmuskel charakterisierte im Rahmen der Versuche einen anatomischen Vertreter

mit dessen Hilfe die eventuelle positiv oder negativ inotrope Wirkung des Triazolderivates

begutachtet werden sollte.

  19

Zuletzt wurden die Papillarmuskeln bis zu ihrer Verwendung in den Apparaturen in

Bechergläsern mit Tyrodelösung, unter Begasung durch das Gasgemisch Oxymix, gelagert.

Abbildung 5: Papillarmuskelpräparat

1 Papillarmuskel, 2 Sehnenansatz, 3 Silberdrahthaken, 4 Naht

3.5.2 Aorta descendens

Der absteigende Teil der Hauptschlagader (Aorta descendens) wurde, wie auch der Truncus

pulmonalis, verwendet zwecks Testung einer möglichen vasodilatatorischen Wirkung auf

glatte Gefäßmuskelzellen. Die Aorta, welche das mit Sauerstoff angereicherte Blut aus dem

linken Herz in die Körperperipherie verteilt, nimmt ihren Weg entlang der Columna

vertebralis und mündet im Beckenraum. Ein ca. 3-5 cm großer Abschnitt der Aorta

descendens wurde entlang der Wirbelsäule (s. 3.3), nach vorangegangener Entfernung der

Lunge und des Diaphragmas, isoliert. Dabei, wie auch bei der weiteren Präparation, war

darauf zu achten die Aorta nicht zu stark zu dehnen, um deren uneingeschränkte Funktion zu

gewährleisten.

Durch präzise Schnitte entlang der Aorta wurden muskuläre und fibröse Geweberückstände

entfernt. Das Präparat durfte indessen weder überdehnt noch durch die Schnitte beschädigt

werden. Ähnlich der Präparation der Arteria pulmonalis wurde das Präparat anschließend in

ca. 3 mm breite Ringe zerteilt, die ohne weitere Installation von Silberdrahthaken für die

Testung verwendet werden konnten und bis zu ihrem Gebrauch in Bechergläsern gelagert

wurden, welche Tyrodelösung enthielten und mittels Oxymix begast wurden.

  20

Abbildung 6: Anatomische Lage der Aorta descendens (Netter FH 2003)

  21

3.5.3 Ileum terminale

Der Krummdarm (Ileum) stellt eine Verbindung zwischen dem auf den Zwölffingerdarm

(Duodenum) folgenden Leerdarm (Jejunum) und dem Dickdarm (Colon) dar. Für die

Versuche sollte dieser anatomische Teil verwendet werden, um neben einer potenziellen

vasodilatatorischen Wirkung auch die Untersuchung eines in Betracht kommenden

spasmolytischen Effektes zu prüfen. Hierbei wurde das Endstück des Krummdarms (Ileum

terminale) dem Tier entnommen (s. 3.3) und anlässlich der besseren Orientierung am

proximalen Ende mittels Bindfaden abgebunden.

Für die Verwendung des terminalen Ileums musste der in Tyrodelösung und unter

Oxymixbegasung aufbewahrte Dünndarm in Teilpräparate zerteilt werden. Dafür wurden vom

terminalen Ileum einzelne Fragmente durch den Schnitt mir einer Schere abgetrennt. Die

gesonderten Elemente hatten eine Größe von ca. 2 cm (Magnus 1904), wobei die Enden der

Segmente durch schräge Schnitte derart gestaltet wurden, dass ein Anbringen der

Silberdrahthaken an deren spitzen Enden gewährt werden konnte. Dadurch war es während

des Versuches möglich den Verschluss des Darmlumens zu verhindern und eine den

physiologischen Abläufen möglichst ähnliche Zirkulation der Testsubstanz durch das

Darmlumen zu simulieren (s. Abbildung 7). Am Schluss wurde das Darmstück mit Hilfe einer

Pasteurpipette gereinigt (Magnus 1904) und auf Durchlässigkeit geprüft wobei es zwecks

Funktionserhaltung nicht überdehnt werden durfte.

Abbildung 7: Längsansicht eines Segments des Ileum terminale

1 Ileumsegment, 2 Darmlumen, 3 Silberdrahthaken, 4 Bindfaden

  22

3.6 Versuchskonfiguration und Apparaturanordnung

Für die Versuchsdurchführung wurden die in begaster Tyrodelösung gelagerten Präparate

einzeln entnommen und in zwei unterschiedliche Apparaturen eingesetzt. Beide Apparaturen

bestanden dabei aus einem aus Glas bzw. Kunststoff gefertigten Trog, der die Aufnahme des

Organbades und des Präparates gestattete und einem diesen Trog umgebenden Wasserbad.

Dieses sollte während des Versuchs eine konstante Temperatur des Organbades ermöglichen

und ferner einen dem Körper ähnlichen Zustand simulieren. Die Böden der Tröge konnten

durch feine Perforationen (Glas- und Kunststofffritten) ein Anströmen des Gasgemischs

Oxymix ermöglichen, wodurch der pH-Wert stabil gehalten, als auch die

Sauerstoffversorgung der Gewebe gewährleistet wurde.

Um die Testung der Substanz an den Präparaten der Papillarmuskeln durchzuführen, wurde

die Apparatur I verwendet. Die Versuche an Atrium cordis dextrum, Arteria pulmonalis,

Aorta descendens und Ileum terminale wurden in der Apparatur 2 ausgeführt. Beide

Apparaturen funktionierten nach dem gleichen Messprinzip und unterschieden sich lediglich

durch ihren Aufbau und die Möglichkeit der Organbefestigung.

3.6.1 Messprinzip

Die mögliche Auswirkung des Substanzeffektes auf die jeweiligen Organpräparate wurde

innerhalb der Versuche durch Kraftmesser registriert. Da alle Präparate Myocyten

unterschiedlicher Art enthielten, die durch Zustandsänderungen Kontraktions- oder auch

Entspannungsmodi durchlaufen können, war es möglich die Kondition der Präparate durch

deren Kontraktionsprofile zu erfassen. Hierzu wurden die Präparate an deren unteren Enden

starr fixiert, indessen die oberen Präparatehaken mit einem Silberdraht verknüpft wurden, der

zur Auslenkung befähigt war und die Wegänderungen in Folge von Organkontraktionen auf

einen Kraftwandler übertrug. Der Kraftwandler war nach dem Prinzip eines

Dehnungsmessstreifens (DMS) aufgebaut, auf dem eine konstante Spannung lag und bei

gleichbleibendem Widerstand ein konstanter Stromfluss registriert wurde. Die Grundlage

bildet das Ohmsche Gesetz, das den Stromfluss als den Quotient der Spannung und des

Widerstandes definiert. Wurde durch die Substanz eine Kontraktion der Myocyten

hervorgerufen, bewirkte dies eine proportionale Auslenkung des Silberdrahtes, einhergehend

mit einer hierzu proportionalen Dehnung des DMS. Die DMS-Dehnung hatte in weiterer

Folge eine proportionale Zunahme des Widerstandes zur Folge, wodurch wiederum ein

verringerter Stromfluss verzeichnet wurde, der der Widerstandsänderung proportional war.

  23

Das registrierte elektrische Signal wurde hieraufhin durch einen Verstärker (Transbridge TM,

4-Channel Transduce Amplifier, World Precision Instruments) potenziert und durch einen

Flachbettschreiber (Recorder BD - 112, Dual Channel, Kipp & Zonen) auf Millimeterpapier

übertragen.

Abbildung 8: Aufbau der elektrischen Leitung

 

3.6.2 Apparatur I

Um das Triazolderivat an den Präparaten der Papillarmuskeln testen zu können, wurde die

Apparatur I verwendet (s. Abbildung 9). Vor Beginn des Versuches war das Präparat

herzustellen (s. 3.4.1.3) und bis Testbeginn in Tyrodelösung hältigen Bechergläsern, die

zusätzlich begast wurden, aufzubewahren. Bevor der Versuch begonnen werden konnte,

musste der Trog der Apparatur mit destilliertem Wasser und anschließend mit Tyrodelösung

gespült werden, um etwaige Verunreinigungen zu beseitigen. Die Flüssigkeit wurde dabei

jeweils durch die Verwendung von Spritzen aus der Apparatur entfernt. Anschließend konnte

das Wasserbad, welches die Papillarmuskelkammer umgab, aufgeheizt werden, dessen

Zieltemperatur 35 ± 1 °C war und durch eine Heizspirale erwärmt wurde.

Mittels eines Messzylinders wurden 25 ml der Tyrodelösung abgemessen und in den

gereinigten, 27 ml fassenden Trog eingefüllt. Anschließend wurde die Gaszufuhr aktiviert,

wodurch das Gasgemisch durch den perforierten Boden der Papillarmuskelkammer das

Organbad mit dem Sauerstoff – Kohlenstoffdioxidgemisch anreichern konnte. Zur Sättigung

des Organbades mit Sauerstoff, der pH-Werteinstellung von 7,2 – 7,4 und zwecks Erreichen

  24

der erforderlichen Badtemperatur mussten vor dem Einbringen des Präparates weitere zehn

Minuten vergehen.

Abbildung 9: Apparatur I

Daraufhin konnte das Präparat dem Becherglas entnommen werden und wurde zügig in die

Apparatur eingespannt. Während des Einbringens des Papillarmuskelpräparates war darauf zu

achten, das Präparat möglichst kurze Zeit der Umgebungsluft auszusetzen und vorzugsweise

geringe mechanische Belastungen auf das Element auszuüben, um dessen korrekte Funktion

während des Versuches zu ermöglichen. Das Präparat wurde an den Silberdrahthaken (s.

Abbildung 7) über den Silberdraht mit dem Kraftwandler verbunden, der Teil des Stativs

war. Das untere Ende des Papillarmuskelpräparates wurde unterdessen zwischen einer

Plexiglasscheibe und einer Kathode aus Platin eingesetzt und durch eine Schraube fixiert.

Die Kathode schaffte dabei die Voraussetzung für die Vermessung der Papillarmuskeln, die

durch fehlenden Automatismus nicht zur selbständigen Erregung befähigt waren und deshalb

durch einen Accupulser A 310 - Stimulus Isolator (World Precision Instruments, USA)

rhythmisch in verschieden Frequenzen und Hz-Stärken gereizt werden mussten.

Über den Stativschlitten wurde, nach erfolgter Fixierung des Präparates am Kraftwandler und

der Elektrode, das Stativ soweit abgesenkt, dass das Papillarmuskelpräparat vollständig von

  25

der durch Oxymix begasten und auf 35 ± 1 °C temperierten Tyrodelösung umgeben war. Über

den Feintrieb konnte das Präparat vorgespannt werden, was zur Standardisierung und

Vergleichbarkeit der Testreihen und der besseren Kontraktionskraft der Präparate nötig war

(s. 3.7.1).

3.6.3 Apparatur II

Für die Versuche an den Präparaten der Arteria pulmonalis, des Atrium cordis dextrum, der

Aorta descendens und des Ileum terminale wurde die Apparatur II (s. Abbildung 10)

verwendet. Im Unterschied zur Apparatur I bestand der Trog zur Aufnahme des Organbades

bei der Apparatur II aus doppelwandigem Glas. In den Zwischenraum der beiden Glaswände

wurde durch einen Temperaturregler auf 37 ± 1 °C erwärmtes Wasser eingeleitet, wodurch

das Eintauchen des Organgefäßes in ein äußeres Wasserbad überflüssig war und das

Organbad auf eine physiologische Temperatur erwärmt werden konnte, die während des

gesamten Versuches konstant gehalten wurde. Die Oxymixbegasung erfolgte bei den

Versuchen mittels der Apparatur II nicht wie bei den Papillarmuskeltests über eine Fritte des

Gefäßbodens, sondern das Gasgemisch wurde seitlich angeströmt und garantierte während der

Versuche die pH-Wertstabilisierung im für das Präparat euhydrischen Bereich (7,2 – 7,4)

sowie die Sauerstoffversorgung der Organe. Hierzu wurde über einen Hauptregler der

Gasleitung ein Gasdruck von ca. 1,5 bar gewählt. Die Feinjustierung der Gaszufuhr konnte

über Schraubklemmen vorgenommen werden, die an den zum Organbad führenden

Gummischläuchen angebracht waren. Dadurch war es möglich eine sanfte Begasung des

Organs einzustellen, bei der die mechanische Belastung für das Präparat minimiert wurde.

Über einen zentralen Auslass im Boden des Glasgefäßes konnte mit Hilfe eines

Kunststoffschlauches, der durch einen Knickschalter kontrolliert wurde, die Organbadlösung

abgelassen und gewechselt werden. Dies war nötig um das Organgefäß, wie auch bei den

vorbereitenden Maßnahmen der Papillarmuskeltests, vor Beginn der Versuche mittels

destilliertem Wasser und Tyrodelösung zu säubern, woraufhin es mit zuvor durch einen

Messzylinder abgemessenen 25 ml der Tyrodelösung befüllt wurde. Für das kleinere

Organgefäß war ein Tyrodevolumen von 8 ml abzumessen. Nach zehn minütiger Begasung

und Erwärmung des Organbades auf 37 ± 1 °C konnten die einzelnen Organpräparate

vermessen werden.

Hierzu wurden die Präparate rasch den Bechergläsern entnommen und derart in die Apparatur

II eingesetzt, dass das Organpräparat die Aufhängevorrichtung, welche mit dem Kraftwandler

  26

verbunden war, mit dem unteren Ende der Organhalterung, an den dem ein Silberdrahtstück

befestigt wurde, überbrückte (s. Abbildung 10). Die Präparate der Arteria pulmonalis und der

Aorta descendens konnten durch ihre Ringstruktur ohne weitere Vorkehrungen eingelegt

werden, während die Präparate des Atrium cordis dextrum und des Ileum terminale durch

vorab installierte Silberdrahthaken (s. 3.4) an den Aufhängevorrichtungen fixiert wurden. Der

Feintrieb regulierte die exakte Vorspannung, die für die Präparate notwendig war.

Abbildung 10: Apparatur II

  27

3.6.4 Herstellung der Versuchslösungen

Für die Applikation der Substanz in die entsprechenden Organbäder war täglich erneut eine

Lösung mittels DMSO herzustellen. Aus der gewonnenen Stammlösung wurden im

Anschluss aliquote Volumina mittels Eppendorf Pipette entnommen und in die

Präparategefäße eingebracht. Dabei wurden für die beiden unterschiedlichen

Organbadvolumina 8 ml und 25 ml verschiedene Stammlösungen durch unterschiedliche

Einwaagen (s. Tabelle 3) bereitet. Die Einwaage musste daher so gewählt werden, dass sich

durch Lösen der Substanz in 100 µl   DMSO und Applikation der gesamten Lösung, im

jeweiligen Organbad eine Endkonzentration von 100 µmol/l einstellte. Für die erforderliche

Einwaage wurde das Molekulargewicht der Substanz verwendet und dividiert durch das

DMSO-Volumen (100 µl) und das Volumen der Tröge als Anteil von 100 (4 bzw. 12,5).

Tabelle 3: Substanzeinwaagen

Substanz Volumen des Organbades

(ml)

Einwaage der Substanz

(mg)

MGtr2 8 0,25

MGtr2 25 0,79

Von der fertiggestellten Lösung des Triazols wurden anschließend, nach vorangegangener

Präparation der Organe, Vorbereitung der Apparaturen und Installation der Organpräparate in

den Versuchsanlagen, aliquote Volumina steigender Größe entnommen und mittels einer

Eppendorf Pipette in das Organbad überführt (s. Tabelle 4). Bedeutend war hierbei besonders

umsichtig bei der Applikation der Substanzlösung vorzugehen und weder Kraftwandler,

Präparat, noch Organgefäß zu berühren, da durch die große Empfindlichkeit des

Kraftwandlers bereits geringe Erschütterungen eine Störung der Messung hervorgerufen

hätten.

Hierbei wurde bei jedem Versuch ein gleichbleibendes Pipettierschema eingehalten das mit

der Applikation von 3 µl der Stammlösung begann, um eine Anfangskonzentration von 3

µmol/l im Organgefäß zu erzielen. Alle weiteren 45 Minuten wurde das nächst größere

Volumen appliziert bis mit der letzten Injektion eine Badkonzentration von 100 µmol/l

erreicht war.

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Tabelle 4: Pipettierschema

Konzentration des

Organbades

(µmol/l)

Volumen der

Stammlösung

(µl)

3 3

10 7

30 20

100 70

Des Weiteren waren für die Versuche an den Präparaten der Arteria pulmonalis, Aorta

descendens und des Ileum terminale, welche glattmuskuläre Zellen enthielten, eine Lösung

für das Bewirken einer chemischen Kontraktion herzustellen. Anders als die Gewebe des

Musculus papillaris und des Atrium cordis dexter, die während des Versuches rhythmische

Kontraktionsänderungen durchliefen, mussten die Organpräparate, welche aus glatten

Muskelzellen bestanden durch einen chemischen Zusatz dauerkontrahiert werden. An den

vorkontrahierten Präparaten der Lugenarterie und der absteigenden Aorta konnte im

Anschluss auf eine mögliche Vasodilatation getestet werden, während an den kontrahierten

Präparaten des terminalen Krummdarms eine etwaige Spasmolyse überprüft wurde. Die

chemische Kontraktion wurde durch den Zusatz einer Kaliumchloridlösung erzielt, die täglich

frisch herzustellen war.

Für die jeweiligen Organpräparate waren zwei unterschiedliche Kaliumchloridlösungen zu

verwenden, die sich durch ihre Salzkonzentrationen voneinander unterschieden. Hierzu wurde

die erforderliche Menge KCl (s. Tabelle 5) auf einer Oberschalenwaage eingewogen und in

einen 100 ml Messkolben appliziert. Daraufhin wurde der Messkolben mit Tyrodelösung bis

zur Eichmarkierung aufgefüllt und der Inhalt durch Schwenken homogenisiert. Um die

Vorkontraktion der Organe zu erreichen wurden dem Messkolben 25 ml bzw. 8 ml der

Kaliumchloridlösung entnommen und in die Organgefäße eingebracht (s. 3.7).

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Tabelle 5: Herstellung der Kaliumchloridlösungen

Präparat KCl/Tyrodelösung

(g/100 ml)

Konzentration der Lösung

(mmol/l)

Ileum terminale 0,45 60

Arteria pulmonalis, Aorta

descendens 0,67 90

3.7 Versuchsabfolge

Zu Versuchsbeginn wurde die Heizspirale des Wasserbades eingeschaltet, die durch eine

Erwärmung die Temperatur des Wassers innerhalb von ca. 20 Minuten auf 35 ± 1 °C bzw.

37 ± 1 °C erhöhte. Darauf wurde das Organgefäß durch die Verwendung von destilliertem

Wasser und Tyrodelösung gereinigt, wodurch den Versuch störende Verunreinigungen

entfernt wurden. Anschließend konnte die Stromzufuhr für den Kraftwandler, den Verstärker

und die Flachbettschreiber aktiviert werden. Bei der Papillarmuskelvermessung wurde

zusätzlich ein Pulser zur Stimulation des Präparates eingeschaltet.

In die Tröge der Apparaturen wurde hierauf das benötigte Volumen Tyrodelösung

eingebracht und die Gaszufuhr eingeschaltet, wobei ein Druck von ca. 1,5 bar an der

Hauptleitung eingestellt wurde. Durch die Feinregler wurde eine milde Begasung der

Organgefäße justiert und 20 Minuten bis zum Einsetzen der Präparate gewartet, bis die

endgültige Badtemperatur, die Sauerstoffsättigung der Tyrodelösung und die pH-

Werteinstellung erreicht waren.

Die unterdessen, nach der Isolation der Organe, hergestellten Versuchspräparate konnten

sodann den Bechergläsern entnommen und möglichst rasch in die Apparaturen eingesetzt

werden. Es folgte die Vorspannung der Präparate zwecks Standardisierung der

Versuchsreihen.

Im Anschluss mussten mindestens 45 Minuten verstreichen, in denen sich die Organpräparate

an die physikochemischen Bedingungen des Organbades anpassen konnten. Dann wurde

überprüft ob die Organe konstante Zustände hinsichtlich der an ihnen zu prüfenden Parameter

angenommen hatten. Im Fall des Papillarmuskels war dies eine gleichbleibende

Kontraktionskraft, beim rechten Vorhof eine konstante Schlagfrequenz und bei der

  30

Pulmonalarterie, der absteigenden Aorta und dem terminalen Krummdarm eine

unveränderliche Dauerkontraktion.

Es folgte die Zugabe der Substanzlösung durch ein bestimmtes Pipettierschema (s. Tabelle 4).

Nach jeder Zugabe der aktuellen Konzentration wurde auf dem Millimeterpapier ein Vermerk

eingezeichnet, der den Beginn des neuen Intervalls markierte.

Die jeweilige Konzentration wirkte im Anschluss 45 Minuten auf das Präparat ein, indes die

Muskelparameter durch den Flachbettschreiber permanent aufgezeichnet wurden, ehe die

nächst höhere Konzentration injiziert werden konnte.

Das Ende eines Versuches war deshalb jeweilig nach einer Messdauer von 180 Minuten

erreicht. Nach Beendigung eines Versuchstages mussten die Organbehältnisse entleert und

anschließend mit 2 %iger Salzsäure und einer Bürste gereinigt werden. Zuletzt wurden die

Apparaturtröge mit destilliertem Wasser gespült.

3.7.1 Versuchsabfolge Musculus papillaris

Die Präparate der Papillarmuskeln wurden durch die Verwendung der Apparatur I vermessen.

Nachdem die Badtemperatur von 35 ± 1 °C erreicht und das Organbad mit Sauerstoff

aufgesättigt worden war, konnte das bereits hergestellte Papillarmuskelpräparat den

Bechergläsern entnommen und in die Apparatur I eingesetzt werden. Da die Präparate der

Papillarmuskeln besonders sensible Elemente darstellten, die bereits bei geringen

mechanischen und physikalischen Belastungen beeinträchtigt wurden, war darauf zu achten

möglichst rasch und vorsichtig zu arbeiten, um die Qualität der Organfunktion nicht zu

schmälern.

Das Präparat wurde sodann derart in die Apparatur eingespannt, dass der Silberdrahthaken am

Sehnenansatz mit dem Silberdraht des Kraftwandlers verbunden wurde und das untere Ende

zwischen der Plexiglasscheibe und der Platinelektrode eingeklemmt wurde (s. 3.6.2). Durch

Absenken des Stativschlittens wurde das Präparat in das Organbad eingelassen. Für die

Vorspannung wurde am Flachbettschreiber eine Sensitivität von 5 mV gewählt und der

Schreiber auf dem Nullpunkt positioniert. Anschließend konnte durch Betätigung des

Feintriebs eine Vorspannung mit einer Kraft von 3,92 mN reguliert werden, die mittels

Wanderung des Flachbettschreibers entlang einer Zentimeterskala vom Nullpunkt bis zu einer

4 cm Markierung abgelesen wurde. Hierbei entsprach 1 cm der Skalierung einer Kraft von

0,98 mN. Durch die Vorspannung sollte eine Standardisierung der Versuche und erhaltenen

Ergebnisse erzielt werden, da ohne einheitliche Justierung die Versuchsergebnisse von der

  31

Arbeitsweise des jeweiligen Testdurchführers abhängig gewesen wären. Nach erfolgter

Vorspannung konnte der Accupulser für die Stimulation der Präparate aktiviert werden.

Anders als bei den zur Automatie befähigten Geweben des Atrium cordis dextrum und den

durch chemische Kontraktion aktivierten glattmuskulären Präparaten musste für die

Kontraktion der Papillarmuskelpräparate eine elektrische Stimulierung erfolgen. Dabei wurde

am Accupulser eine Reizdauer von 3 ms mit einer Frequenz von 1 Hz eingestellt, um während

des gesamten Versuches das Präparat mit konstant bleibenden Rechteckimpulsen reizen zu

können. Die Stromstärke der Reizung war abhängig von der Schwellenstromstärke des

aktuellen Präparates. Den Beginn stellte eine Stromstärke von 2 mV dar, die so lange erhöht

wurde, bis es zur ersten Kontraktion der Papillarmuskelpräparate kam. Daraufhin wurde eine

Versuchsstromstärke von 110 % der Schwellenstromstärke ausgewählt. Damit sollte

verhindert werden, dass durch eine zu hohe Stromstärke und Reizung der Präparate, eine

rasche Entleerung der Catecholaminspeicher ausgelöst wurde, die eine Abnahme der

Kontraktionskraft bedeutet hätte. Anschließend wurde das Präparat für 45 Minuten im

Organbad belassen, die der Akklimatisierung der Papillarmuskeln dienen sollte. Zur

Überprüfung einer Konstanz im zu testenden Parameter der Kontraktionskraft, wurden nach

den 45 Minuten durch das Senken des Flachbettschreibers erste Aufzeichnungen ausgeführt.

Hierzu wurden, über einen Zeitraum von 15 Minuten und im Abstand von jeweils fünf

Minuten jedes Mal sechs Kontraktionsamplituden aufgezeichnet. Ein konstanter inotroper

Zustand des Organpräparates war erreicht, wenn sich die Höhe der einzelnen Amplituden um

maximal 1 mm von einander unterschieden. Außerdem musste vom Präparat ein Mindestmaß

an Kontraktionskraft ausgehen, das einer Amplitudenhöhe von ≥ 2 cm bei einer Sensitivität

von 1 mV des Flachbettschreibers entsprach. Konnte diese Kontraktionskraft nicht erreicht

werden, musste für die Untersuchung der Substanz ein neues Präparat verwendet werden.

Im Anschluss wurde zu den konstant schlagenden Papillarmuskelpräparaten Einzelvolumina

der Substanzstammlösung in steigender Größe pipettiert, wobei nach einem gleichbleibenden

Pipettierschema vorgegangen wurde (s. Tabelle 4). Die einzelnen Konzentrationen des

Triazols wirkten für 45 Minuten auf das Präparat ein, in denen alle fünf Minuten sechs

Kontraktionsamplituden aufgezeichnet wurden, ehe die nächst höhere Konzentration

eingebracht wurde.

  32

3.7.2 Versuchsabfolge Atrium cordis dextrum

Für die Vermessung des rechten Vorhofes wurde die Apparatur II verwendet, die in gleicher

Art und Weise für den Versuch vorbereitet wurde, wie die Apparatur I, mit dem Unterschied,

dass das Organbad auf 37 ± 1 °C aufgeheizt wurde. Die im Vorfeld bereiteten

Vorhofpräparate (s. 3.5.1.1) mussten für die Versuchsdurchführung möglichst rasch und unter

geringster Vordehnung des Präparates während des Einsetzens, in die Apparatur eingehängt

werden, da die Eigenständigkeit der Schlagfunktion von der Versorgung der Gewebe mit

Sauerstoff und Nährlösung abhängig war. Das Vorhofpräparat wurde derart in die Apparatur

eingefügt, dass der Silberdrahthaken an jenem Ende des Präparates, das über restliches

Fettgewebe verfügte, an der oberen Aufhängevorrichtung angebracht wurde. Da Fett an der

Oberfläche von Flüssigkeiten schwimmt, war so es möglich die korrekte Positionierung des

Präparates im Organbad einzustellen. Der zweite Haken des Präparates wurde am unteren

Ende der Organhalterung fixiert. Die Position des Präparates durfte durch das in das

Organbad einströmende Gas nicht beeinflusst werden, weshalb die Gaszufuhr nicht zu stark

eingestellt werden durfte.

Die Vorspannung erfolgte durch Aktivierung des Schreibers und der Auswahl einer

Startsensitivität von 5 mV. Um die Schläge besser auswerten zu können, wurde die

Aufzeichnungsgeschwindigkeit auf 5 mm pro Sekunde eingestellt, wodurch es möglich war

bei einer Aufnahme von 12 Sekunden, eine Schlagfrequenz für eine Minute zu errechnen.

Anschließend wurde der Flachbettschreiber auf den Nullpunkt eingestellt und durch den

Feintrieb eine Vorspannung von 10,19 mN justiert, die einer Strecke von 10,4 cm entlang der

Zentimeterskala entsprachen. Im Anschluss daran konnte sich das Organ innerhalb von 45

Minuten an die Umgebung im Organbad gewöhnen worauf die Überprüfung auf konstante

Kontraktionsfrequenz erfolgte. Hierzu wurde im Abstand von fünf Minuten für jeweils 12

Sekunden aufgezeichnet, was bei einer Geschwindigkeit von 5 mm/s einer Strecke von 6 cm

auf dem Millimeterpapier entsprach. Anschließend wurde die Zahl der Kontraktionen auf der

Strecke von 6 cm gezählt und mit dem Faktor fünf multipliziert, um die Schlaganzahl pro

Minute zu erhalten.

War die Zahl der Schläge an drei aufeinander folgenden Messungen ± 1 konnte mit der

Zugabe der Stammlösung begonnen werden, wobei das in Tabelle 4 beschriebene

Pipettierschema eingehalten wurde. Die Substanzkonzentration wurde ebenfalls alle 45

Minuten erhöht. Während der 45 Minuten Intervalle wurde alle 5 Minuten für jeweils 12

Sekunden eine Aufnahme durchgeführt und die Anzahl der Vorhofkontraktionen durch

Auszählen bestimmt.

  33

3.7.3 Versuchsabfolge Aorta descendens

Die Versuche der absteigenden Aorta wurden, wie auch die Tests der anderen

glattmuskulären Präparate, mittels Apparatur II ausgeführt. Dafür musste die Apparatur

entsprechend vorbereitet werden (s. 3.7.1). Im Vorfeld war die bereits isolierte Aorta in

geeignete Teilpräparate zu überführen, welche Ringelemente darstellten, die frei von

jeglichen Geweberückständen der Lunge oder des Fettgewebes waren.

Diese Ringstrukturen konnten, im Unterschied zu den Präparaten des rechten Vorhofs und des

terminalen Ileums, ohne die Anbringung von Silberdrahthaken in die Apparatur II eingelegt

werden, indem die Silberdrähte der oberen und unteren Organhalterung durch den Ring

geführt wurden ohne diesen zu überdehnen. Ein Überdehnen hätte deine

Kontraktionsverminderung des Präparates bedeutet und war daher zu vermeiden. Ein

Mindestmaß an Spannung war jedoch erforderlich, damit beim nachfolgenden Eintauchen in

das Organbad durch Senken des Stativs, das Aortenpräparat durch die Tyrodelösung nicht von

der Halterung gespült wurde.

Die Vorspannung erfolgte durch Aktivierung des Verstärkers und des Flachbettschreibers, an

dem eine Sensitivität von 10 mV eingestellt und mittels Feintrieb eine Vorspannung von

19,6 mN justiert wurde. Es folgte die 20 minütige Akklimatisierungsphase, nach der die

Schreiberempfindlichkeit auf 5 mV vermindert wurde, der Schreiber auf den Nullpunkt

eingestellt und bei einer Aufzeichnungsgeschwindigkeit von 1 mm/s der Schreiber auf das

Millimeterpapier gesenkt wurde. Im Unterschied zur Aufzeichnung der

Papillarmuskelpräparate und der Präparate des rechten Vorhofs, wurde bei der Vermessung

der Aorta keine intermittierende Aufnahme gewählt, sondern eine permanente Registrierung

der Kontraktionskraft eingestellt. Anschließend wurde durch Betätigen des Knickschalters die

Tyrodelösung des Organbades abgelassen und je nach Fassungsvolumen des Organgefäßes

8 ml bzw. 25 ml einer zuvor bereiteten 90 mmolaren Kaliumchloridlösung in das Organgefäß

eingebracht, wodurch das Aortenpräparat chemisch kontrahiert wurde. Die Kontraktion war

am Flachbettschreiber durch einen Kurvenzug zu erkennen, der nach einer bestimmten Zeit

ein Maximum der Kontraktionskraft verzeichnete, aus dem die Kurve in einen Plateauzustand

überging, der durch keine weitere Zunahme der Kontraktion charakterisiert war. Dieser

Zustand stellte die Voraussetzung für den Beginn der Substanzzugabe dar und konnte in

Abhängigkeit des Präparates nach frühestens 45 bis hin zu 180 Minuten erreicht werden.

Außerdem musste die Kontraktionskraft des Präparates eine Mindestgrenze überschreiten, die

ausgehend vom Nullpunkt einer Wegstrecke mit der Höhe von 5 cm entsprach.

  34

Waren diese Bedingungen erfüllt, konnte die Substanzlösung injiziert werden, wobei die

Intervallzeiten und das Pipettierschema (s. Tabelle 4) eingehalten wurden, die auch bei den

Versuchen an den anderen Organen verwendet wurden.

3.7.4 Versuchsabfolge Arteria pulmonalis

Die Versuchsdurchführung an der Arteria pulmonalis war vergleichbar mit der Abfolge an

den Präparaten der Aorta descendens. Es wurden ebenso die ringförmigen Präparate, die

zuvor wie in 3.5.1.2 beschrieben bereitet wurden, mit Hilfe der Apparatur II vermessen. Nach

der erfolgten Installation der Organpräparate in der Apparatur, konnte das Stativ in das

Organbad gesenkt werden und die Vorspannung durchgeführt werden.

Hierbei kam es zu einer geringen Abweichung im Vergleich zu den Versuchen an der Aorta,

da die Vorspannung mit einer Kraft von 9,81 mN bei einer Sensitivität von 5 mV stattfand.

Nach der Akklimatisierung und der Zugabe einer 90 mmolaren KCl-Lösung, wurde ebenso

das Erreichen eines Kontraktionsplateaus oberhalb der 5 cm - Markierung abgewartet und die

Substanz in denselben Konzentrationen und Zeitintervallen appliziert. In gleicherweise

wurden am Ende des Versuches die Daten ausgewertet.

3.7.5 Versuchsabfolge Ileum terminale

Die Präparate des terminalen Ileums, die vor Beginn des Versuches herzustellen waren,

konnten wie auch die Präparate der Aorta descendens mittels der Apparatur II untersucht

werden. Hierfür war die Apparatur in der gleichen Art und Weise für den Versuch

vorzubereiten, wie bei den zuvor geschilderten Versuchsabläufen. Die Krummdarmpräparate

verfügten jedoch über zwei Silberdrahthaken (s. Abbildung 7), mit deren Hilfe sie in die

Apparatur eingesetzt wurden. Dabei war zu beachten, dass das Präparat korrekt an der

Halterung angebracht werden musste, ohne ein Verdrehen des Ileumsegmentes auszulösen,

welches das Lumen des Teilstückes verschlossen und damit eine einwandfreie Zirkulation der

Substanz verhindert hätte. Auch musste ein Überdehnen vermieden werden, um die

Funktionsfähigkeit zu erhalten.

Nach dem Absenken des Stativs in die temperierte und begaste Tyrodelösung und der

Aktivierung des Verstärkers und des Schreibers, erfolgte die Vorspannung bei 5 mV auf eine

Kraft von 4,92 mN, die durch eine Wanderung des Schreibers entlang der Zentimeterskala bis

zu einer 5 cm – Markierung abgelesen wurde. Bei den Versuchen am Ileum terminale musste

  35

die Vorspannung in besonders ruhiger Art erfolgen, da eine zu schnelle Spannungssteigerung

eine Funktionsbeeinträchtigung bedeutet hätte.

Nach einer 20 minütigen Assimilierungsperiode wurde der Schreiber auf den Nullpunkt

nachjustiert, die Tyrodelösung abgelassen und durch eine 60 mmolare Kaliumchloridlösung

(s. Tabelle 5) ersetzt. Anschließend musste die Mindestkontraktionskraft, die einer Strecke

des Schreibers vom Nullpunkt bis oberhalb der 5 cm – Marke entsprach, erreicht werden und

die Plateauphase der Kurve eintreten. Dabei war beim Ileum terminale der Kurvenzug

dadurch gekennzeichnet, dass nach einer gewissen Zeit ein Kontraktionsmaximum vorlag, das

im Unterschied zu den Präparaten der Aorta und der Pulmonalarterie nicht direkt in das

Plateau überging, sondern zuvor einen Kurvenabfall verzeichnete, auf ein Niveau das oft nur

noch der Hälfte des Maximums entsprach, ehe die konstante Kontraktion erzielt wurde.

Jene Präparate, deren Kontraktionskraft zu gering waren oder bei denen keine

Kontraktionskonstanz erreicht wurde, mussten verworfen werden. Die Zugabe der

Testsubstanz und die Versuchsdauer erfolgten simultan zu den anderen Versuchen.

3.7.6 Versuchsabfolge Ileum terminale MGtr2-Wirkmechanismus

Im Zuge der Datenauswertung und der dadurch gewonnenen Ergebnisse, konnte

herausgefunden werden auf welches Organ die Testsubstanz den größten Effekt ausübte. Das

Triazol MGtr2 hatte dabei die stärkste Wirkung auf die Teilsegmente des Ileum terminale

(s. 4.1.3). Um den genauen Mechanismus der Wirkung zu untersuchen, wurde analysiert ob

die Wirkung von MGtr2 durch eine Stimulierung der endothelialen Stickstoffmonoxid-

Synthase (eNOS) ausging oder ob die Spasmolyse durch andere Prozesse zustande kam.

Hierzu wurde der Standardversuch am terminalen Ileum modifiziert in dem ein Blocker der

eNOS eingesetzt wurde, der die Funktion des Enzyms und eventuelle Stimulierung durch die

Substanz verhindert sollte. Bei Wirkung des Triazols über das endotheliale Enzym sollte in

Folge der vorangegangen Blockade die Spasmolyse ausbleiben bzw. vermindert werden. Für

die Versuchsdurchführung wurde ebenfalls die Apparatur II verwendet, die vor Testbeginn in

gleicher Art und Weise vorbereitet werden musste. Das Ileumpräparat wurde durch die

gleiche Vorgehensweise hergestellt und ebenso in die Apparatur eingesetzt, bei 5 mV auf eine

Kraft von 4,92 mN vorgespannt und nach einer 20 minütigen Phase, in der sich das Präparat

an das Organbad gewöhnen konnte, durch den Zusatz der 60 mmolaren Kaliumchloridlösung

kontrahiert. War die Mindestkontraktionskraft erreicht und konnte diese in einem konstanten

Zustand gehalten werden erfolgte allerdings nicht die Zugabe der Substanz, sondern zunächst

  36

die Gabe einer Lösung von Nitro-L-Arginin (NO-L-Arg), welche die Blockade der eNOS

auslösen sollte.

Hierzu wurde durch das Lösen im Ultraschallbad eine Stammlösung von NO-L-Arg in KCl

haltiger Tyrodelösung hergestellt, welche bei vollständiger Applikation eine

Endkonzentration von 100 µmol/l im Organbad bewirkte. Für die Bereitung der Stammlösung

wurden 0,54 mg NO-L-Arg eingewogen und in 100 µl KCl-haltiger Tyrodelösung gelöst. Die

Konzentration der in die Organbäder injizierten eNOS-Lösung betrug zunächst 30 µmol/l,

was der zuvor ermittelten EC50 von MGtr2 an den Ileumsegmenten entsprach (s. 4.1.3). Nach

45 minütiger Einwirkung von NO-L-Arg, während der die Kontraktionskraft permanent

aufgezeichnet wurde, war die Lösung der Substanz ebenfalls in einer Konzentration von

30 µmol/l zuzusetzen. Nach einer weiteren dreiviertel Stunde konnte der Versuch beendet und

die Kontraktionskraft-Zeit-Kurven mit den Kurven, die ohne die Zugabe von NO-L-Arg

erhalten worden waren, verglichen werden. Durch diesen ersten Versuch konnte überprüft

werden ob die gesamte Wirkung der Substanz über die eNOS ausging, was bereits bei der

geringen Konzentration des Blockers einer verminderten Spasmolyse entsprochen hätte, oder

ob nur ein gewisser Teil der Wirkung durch eNOS-Beteiligung zu Stande kam, wodurch

eventuell keine Verminderung der Spasmolyse erfasst worden wäre. In einem zweiten

Versuch wurde daher die Konzentration der zugegebenen NO-L-Arg Lösung auf 100 µmol/l

erhöht, um die gesamte eNOS zu blockieren. Anschließend wurde auf die Verringerung der

spasmolytischen Wirkung von MGtr2 geprüft.

3.8 Datenauswertung

3.8.1 Datenauswertung Musculus papillaris

Durch die Versuche an den Papillarmuskelpräparaten sollte der inotrope Einfluss der

Substanz analysiert werden. Als eine die Inotropie beeinflussende Wirkung, wird jener Effekt

definiert, der die Kontraktionskraft des Herzens in positiver oder negativer Weise modulieren

kann. Die Aufzeichnung erfolgte diskontinuierlich im Unterschied zu den Versuchen an den

glattmuskulären Präparaten. Hierzu wurden während eines Versuches insgesamt fünf Mal,

jeweils für die Dauer von 45 Minuten, alle fünf Minuten eine Aufzeichnung über sechs

Kontraktionsamplituden durchgeführt (s. 3.7.1), deren Höhe die Kontraktionskraft definierten.

Die Amplitudenhöhe wurde dabei durch Ausmessen mit einem Lineal bestimmt und in cm

  37

angegeben. Der Mittelwert der letzten sechs Amplituden des ersten Intervalls wurde, durch

Multiplikation mit dem Eichfaktor 0,39 (s. Tabelle 6), als Kontrollwert definiert und mit

100 % Kontraktionskraft festgelegt. Der verwendete Eichfaktor orientierte sich dabei an der

eingestellten Stromstärke in mV und war nötig um die abgemessene Strecke in

cm in die vorliegende Kraft in mN umzurechnen. Jene Eichfaktoren wurden beim

Papillarmuskelpräparat aber auch bei den anderen Versuchen verwendet.

Durch die anschließende Zugabe der Substanz in steigender Konzentration und gleichzeitig

erfolgender Aufzeichnung der Kontraktionskraft, konnten die konzentrationsabhängigen

Auswirkungen der Substanz erfasst und in Relation zum Kontrollwert durch Prozentangaben

festgehalten werden. Außerdem musste bei der Auswertung die Eigenwirkung des

verwendeten Lösungsmittels DMSO berücksichtigt werden und die Ergebnisse nach oben

oder unten korrigiert werden.

Tabelle 6: Eichfaktoren

Spannung

(mV) Eichfaktor

2 0,39

5 0,98

10 1,96

3.8.2 Datenauswertung Atrium cordis dextrum

Anhand der verwendeten Vorhofpräparate sollte der chronotrope Einfluss des Triazols

analysiert werden. Die Chronotropie beschreibt die Kontraktions- bzw. Schlagfrequenz des

Herzens, weshalb bei den Versuchen an den Präparaten des Vorhofes nicht die

Kontraktionskraft sondern die Häufigkeit der Schläge pro Minute bestimmt wurde. Diese

wurde in 45 minütigen Intervallen ermittelt, in denen alle fünf Minuten eine Aufzeichnung für

12 Sekunden erfolgte, die bei einer Aufzeichnungsgeschwindigkeit von 5 mm/s, einer 6 cm

langen Strecke auf dem Millimeterpapier entsprach. Die einzelnen Schläge wurden durch

Auszählen bestimmt und durch Multiplikation mit dem Faktor 5 auf die Schlaganzahl pro

Minute umgerechnet. Die letzte Messung des ersten Intervalls diente als Kontrollwert, der mit

1 definiert wurde. Bei den übrigen Intervallen wurde ebenfalls die letzte Messung für die

Auswertung verwendet und bezogen auf den Kontrollwert in Prozent angegeben. Übte die

  38

Substanz einen Chronotropie beeinflussenden Effekt aus, wurde dies durch eine Änderung der

Schlaganzahl ersichtlich.

 

3.8.3 Datenauswertung der glattmuskulären Präparate

Die Aufzeichnungen der glattmuskulären Präparate dienten bei den Organpräparaten der

Arteria pulmonalis und der Aorta descendens der Prüfung einer möglichen

vasodilatatorischen Wirkung durch MGtr2, während die Ileumpräparate zwecks Testung eines

eventuellen spasmolytischen Effektes analysiert wurden. Der hierzu registrierte Parameter

repräsentierte die Abnahme der Kontraktionskraft einer vorangegangenen Dauerkontraktion.

Dafür wurde im Gegensatz zu den bereits beschriebenen Herzpräparaten eine kontinuierliche

Aufzeichnungsmethode gewählt.

Den Beginn der Aufnahme der Kontraktionskraft stellte die Zugabe der KCl-Lösung und die

dadurch ausgelöste chemische Kontraktion dar. Nachdem die Plateauphase mit einer

Mindesthöhe (s. 3.7.3) erreicht wurde, konnte deren Höhe durch die Distanz zum Nullpunkt

in cm abgemessen werden und wurde folglich als Kontrollwert (= 1) definiert. Nach der

Zugabe der ersten Substanzkonzentration, die im Fall einer vasodilatatorischen bzw.

spasmolytischen Wirkung einen konzentrationsabhängigen Abfall des Kurvenzugs bedeutete,

wurde an der durchgehenden Kurve ein Vermerk eingezeichnet (s. 4.1). Als Wert der

verbliebenen Kontraktionskraft nach Zugabe der entsprechenden Konzentration, wurde

unmittelbar vor der Zugabe der nächst höheren Substanzkonzentration, nach 45 Minuten die

Resthöhe des Kurvenzugs bestimmt und in Relation zur Ausgangshöhe der Kontrollkurve

gesetzt. Wurde die Kontraktionskraft durch die Zugabe der Substanz auf ein Niveau von 0 %

des Ausgangswertes vermindert, war das Versuchsende vor dem eigentlichen Ende der

Testzeit erreicht.

Die erhaltenen Werte der Strecken auf dem Millimeterpapier konnten durch die

Multiplikation mit den jeweiligen Eichfaktoren (s. Tabelle 6) in Kraftwerte in mN

umgerechnet werden.

  39

3.9 Statistik

Die bei der Vermessung der Kontraktionskraft erhaltenen Werte in cm wurden zunächst durch

den Eichfaktor in mN umgerechnet und anschließend in Prozent des Kontrollwertes

angegeben. Die Schlagfrequenz des Vorhofes (Schläge/min.) konnte direkt in die

prozentualen Anteile transformiert werden. Außerdem wurden die erhaltenen Werte je nach

Organ durch einen Faktor erhöht bzw. erniedrigt, der die Eigenwirkung des verwendeten

Lösungsmittels DMSO berücksichtige.

Pro Organ wurden mehrere Tests durchgeführt aus denen die Versuchsergebnisse in das

arithmetische Mittel (fc bzw. f) sowie die dazu gehörige Standardabweichung (SEM)

umgerechnet wurden. Durch die Verwendung des Programms Sigma-Plot 9.0 konnten

Konzentrations-Wirkungskurven erstellt werden, bei denen auf der Abszisse die

Konzentration von MGtr2 in µmol/l und auf der Ordinate die Kontraktionskraft in mN bzw.

die Anzahl der Schläge pro Minute abgetragen wurden. Konnte eine Wirkung durch die

Substanz beobachtet werden, war es möglich die EC50 zu ermitteln, die einer Konzentration

entsprach, bei der 50 % des maximal zu erwartenden Effektes ausgelöst wurden.

Zur Beurteilung der Signifikanz der ermittelten Versuchsergebnisse wurde der Student-t-Test

verwendet, der Messergebnisse mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit kleiner als 5 % (p < 0,05)

bzw. 1 % (p < 0,01) als signifikant und Ergebnisse mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit

kleiner als 0,1 % (p < 0,001) als statistisch hochsignifikant definierte.

  40

4. Ergebnisse  Im Folgenden sollen die Ergebnisse der Versuche an den Präparaten der einzelnen Organe

aufgeführt werden, indem zu jedem Organ jeweils eine Tabelle der einzelnen

Versuchsergebnisse, die daraus abgeleitete Konzentrations-Wirkungskurve und eine

Originalabbildung der Versuchsaufzeichnung zur Veranschaulichung dienen. Die berechneten

Mittelwerte (fc bzw. f) und Standardabweichungen (± SEM) beinhalten dabei bereits eine

Korrektur durch Berücksichtigung der DMSO-Eigenwirkung.

4.1 Versuchsergebnisse an glattmuskulären Präparaten

4.1.1 Wirkung von MGtr2 auf die Aorta descendens

Um auf eine mögliche vasodilatatorische Wirkung von MGtr2 auf glatte Gefäßmuskelzellen

zu testen, wurden insgesamt fünf Versuche durchgeführt. Dabei wurde der Versuch wie in

3.7.3 beschrieben durchgeführt.

Nach der Zugabe der Kaliumchloridlösung in einer Konzentration von 90 mmol/l, der

folgenden chemischen Kontraktion und Eintreten einer stetigen Dauerkontraktion, trat bei der

auf dem Millimeterpapier aufgezeichneten Kontraktionskraftkurve eine Plateauphase ein,

deren Abstand zur Nulllinie als Kontrollwert definiert wurde (= 100 %). Dieser betrug am

Organ Aorta descendens 19,29 ± 2,71 mN. Die im Folgenden durch die Substanzzugabe

entstehenden Senkungen der Kurve wurden ebenfalls durch die Distanz zur Nulllinie erfasst

und anschließend als Anteil des Kontrollwertes angegeben. Die Absenkung der Kurve konnte

daher als Nachlass der Kontraktionskraft, im Fall der Präparate der Aorta descendens als

Vasodilatation definiert werden.

  41

Tabelle 7: Versuchsergebnisse der Aorta descendens unter Einfluss von MGtr2

MGtr2

(µmol/l)

fc ± SEM

(mN)

fc ± SEM

(%)

Versuche

(n)

Irrtums-

warscheinlichkeit

(P)

Kontrolle 19,29 ± 2,71 0,00 ± 0 5 -

3 19,19 ± 2,62 - 0,31 ± 0,64 5 n.s.

10 18,71 ± 2,60 - 2,94 ± 1,20 5 n.s.

30 16,67 ± 2,63 - 14,40 ± 2,78 5 0,05

100 13,31 ± 2,70 - 33,29 ± 4,98 5 0,05

Aus den vier durchgeführten Versuchen und deren Versuchsergebnissen wurde das

arithmetische Mittel der Kontraktionskraft (mN) und der Abnahme der Kontraktionskraft (%)

gebildet sowie deren Standardfehler bestimmt. Im Anschluss wurde die

Irrtumswahrscheinlichkeit berechnet um eine Aussage über die statistische Signifikanz der

Messerergebnisse zu erhalten.

Die Messergebnisse konnte durch das Programm Sigma Plot 9 in eine graphische Darstellung

überführt werden, die einer Konzentrations-Wirkungskurve entsprach.

  42

Abbildung 11: Konzentrations-Wirkungs-Kurve der Aorta descendens

Konz.(µmol/l)3 10 30 100

Abn

ahm

e de

r Kon

trakt

ions

kraf

t (%

)

-100

-75

-50

-25

0

0

Aortan = 5, MGtr2.HCl

 

Der Graph zeigt die Abhängigkeit der Kontraktionskraft von der Zugabe der Testsubstanz in

verschiedenen Konzentrationen. Auf der Abszisse wurde hierzu die Konzentration

semilogarithmisch aufgetragen in der Einheit µmol/l. Die Ordinate zeigt die Abnahme der

Kontraktionskraft vom Kontrollwert in Prozent. Die Punkte der Kurve symbolisieren die

Mittelwerte der Kontraktionskraftabnahme bei den unterschiedlichen Substanz-

konzentrationen. Die von den Punkten abgehenden senkrechten Geraden stellen die Größe der

SEM dar (Rubin 1978).

Der Kurvenzug veranschaulicht, dass MGtr2 selbst in der höchsten Konzentration von

100 µmol/l keine Abnahme der Kontraktion um 50 % verursachte und somit die EC50 nicht

erreicht wurde. Daher lag ein nur mäßiger vasodilatatorischer Effekt an der Aorta descendens

vor.

  43

Abbildung 12: Originalabbildung der Kontraktionskraft der Aorta descendens unter Einwirkung von MGtr2

Die Kurve veranschaulicht den mäßigen vasodilatatorischen Effekt von MGtr2 auf die

Präparate der Aorta descendens. Bei den Versuchen konnte die EC50 nicht erreicht werden.

45 Minuten

1 cm = 0,98 mN

3 µmol/l

10 µmol/l

30 µmol/l

100 µmol/l

  44

4.1.2 Wirkung von MGtr2 auf die Arteria pulmonalis

MGtr2 wurde an der Arteria pulmonalis getestet, um wie auch an der Aorta descendens auf

einen möglichen Kontraktionskraft beeinflussenden Effekt zu testen, der einer Vasodilatation

entsprach. Hierzu wurden fünf Versuche durchgeführt, deren Ablauf bereits in 3.7.4

beschrieben wurde. Die Ringpräparate wurden nach Ablassen der Tyrodelösung und durch die

Gabe einer 90 mmolaren KCl-Lösung kontrahiert. Konnte die Beständigkeit der

Dauerkontraktion erreicht werden, wurde die Höhe der Kontraktionskraft bestimmt und als 1

definiert. Der Kontrollwert betrug 16,72 ± 1,37 mN.

Nach der Zugabe des Triazols konnte bei einer Senkung der aufgezeichneten Kurve eine

Vasodilatation erfasst werden. Die Resthöhe des Graphen wurde als Anteil des Kontrollwertes

beschrieben. Die Tabelle 8 enthält die in mN umgerechneten Resthöhenwerte und die

Abnahme der Kontraktionskraft in Prozent als arithmetisches Mittel (fc) sowie deren SEM.

Die DMSO-Eigenwirkung ist bereits berücksichtigt. Im Unterschied zur Testung an der Aorta

wurde durch die Zugabe von MGtr2 an der Pulmonalarterie eine deutlich stärkere

Vasodilatation erreicht, die einer EC50 von 59,5 µmol/l entsprach. Durch die Zugabe von

100 µmol/l nahm die Ausgangskontraktion um insgesamt 60,85 ± 3,87 % ab.

Tabelle 8: Versuchsergebnisse der Arteria pulmonalis unter Einfluss von MGtr2

MGtr2

(µmol/l)

fc ± SEM

(mN)

fc ± SEM

(%)

Versuche

(n)

Irrtums-

warscheinlichkeit

(P)

Kontrolle 16,72 ± 1,37 0,00 ± 0 5 -

3 15,15 ± 1,46 - 9,82 ± 2,00 5 n.s.

10 14,13 ± 1,70 - 16,64 ± 4,06 5 0,05

30 10,91 ± 1,64 - 36,14 ± 5,85 5 0,05

100 6,47 ± 0,73 - 60,85 ± 3,87 5 0,01

  45

Abbildung 13: Konzentrations-Wirkungs-Kurve der Arteria pulmonalis

Konz.(µmol/l)3 10 30 100

Abn

ahm

e de

r Kon

trakt

ions

kraf

t (%

)

-100

-75

-50

-25

0

0

ARTERIA PULMONALISn = 5, MGtr2.HClEC50= 59,5 µmol/l

 

Die Konzentrations-Wirkungskurve gibt den Zusammenhang der Erhöhung der

Substanzkonzentration und der zugehörigen Abnahme der Kontraktionskraft wieder. Hierzu

wurde auf der Abszisse die Konzentration semilogarithmisch in µmol/l und auf der Ordinate

der Effekt, durch Verringerung der Ausgangskontraktion, in Prozent aufgetragen. Die

Markierungen auf der Kurve stellen die Mittelwerte der Messwerte bei der jeweiligen

Konzentration dar, wobei die vertikalen Linien die dazugehörige SEM angeben.

Im Unterschied zu den glattmuskulären Präparaten der Aorta descendens ist eine deutlich

stärkere Vasodilatation feststellbar deren EC50 bei einem Wert von 59,5 µmol/l liegt. Durch

Zugabe der gesamten Substanzlösung wird eine Relaxation der Gefäßmuskelzellen von

60,85 ± 3,87 % des Ausgangswertes erzielt.

  46

Abbildung 14: Originalabbildung der Kontraktionskraft der Arteria pulmonalis unter Einwirkung von MGtr2

Die Kurve zeigt die Abnahme der Kontraktionskraft nach

Zugabe von MGtr2 in unterschiedlichen Konzentrationen. Eine deutliche Vasodilatation wird

ab einer Konzentration von 30 µmol/l erzielt.

3 µmol/l

10 µmol/l

30 µmol/l

100 µmol/l

45 Minuten

1 cm = 0,98 mN

  47

4.1.3 Wirkung von MGtr2 auf das Ileum terminale

An den Segmenten des terminalen Ileums sollte MGtr2 hinsichtlich einer möglichen

spasmolytischen Aktivität getestet werden. Hierzu wurden vier Versuche durchgeführt, deren

Ablauf den Schilderungen von 3.7.5 folgte. Die an ihren Haken in die Apparatur II

eingesetzten Präparate wurden nach der Akklimatisierungsphase durch eine 60 mmolare

Kaliumchloridlösung chemisch kontrahiert. Die Kraft der konstanten Dauerkontraktion wurde

als Kontrollwert mit 100 % definiert und entsprach 8,72 ± 1,53 mN. Durch Zugabe des

Triazols in steigender Konzentration konnte eine Abnahme der Kontraktionskraft durch den

Abfall des Kurvenverlaufs registriert werden. Die verbliebene Kraft wurde in Relation zum

Kontrollwert gesetzt und in Prozent angegeben.

Unter den glattmuskulären Organen konnte MGtr2 an den Elementen des terminalen Ileums

den stärksten Effekt verursachen. Die Kontraktionskraft des Darmes nahm bereits bei einer

Konzentration von 3 µmol/l ab. Eine Spasmolyse von 50 % wurde bei einer Konzentration

von 29 µmol/l erreicht. Durch Zugabe der gesamten Stammlösung von MGtr2 nahm die

Kontraktionskraft der Darmsegmente um 74,95 ± 5,70 % ab.

Die Tabelle 9 zeigt die Versuchsergebnisse der vier Versuche. Angegeben sind die

Mittelwerte der Kontraktionskraft sowie deren Standardfehler. Außerdem ersichtlich sind die

Abnahmen der Kontraktionen und die dazu gehörigen SEM. Die Irrtumswahrscheinlichkeit

veranschaulicht die statistische Signifikanz der erhaltenen Werte.

Tabelle 9: Versuchsergebnisse des Ileum terminale unter Einfluss von MGtr2

MGtr2

(µmol/l)

fc ± SEM

(mN)

fc ± SEM

(%)

Versuche

(n)

Irrtums-

warscheinlichkeit

(P)

Kontrolle 8,72 ± 1,53 0,00 ± 0 4 -

3 8,54 ± 1,55 - 2,33 ± 0,84 4 0,05

10 7,61 ± 1,29 - 12,55 ± 0,60 4 0,05

30 4,26 ± 0,78 - 51, 28 ± 0,72 4 0,01

100 2,45 ± 1,05 - 74,95 ± 5,70 4 0,01

  48

Abbildung 15: Konzentrations-Wirkungs-Kurve des Ileum terminale

Konz.(µmol/l)3 10 30 100

Abn

ahm

e de

r Kon

trakt

ions

kraf

t (%

)

-100

-75

-50

-25

0

0

Terminales Ileumn = 5, MGtr2.HClEC50= 29 µmol/l

 

Die Kurve veranschaulicht den konzentrationsabhängigen Abfall der Kontraktionskraft durch

MGtr2. Auf der Abszisse sind die Konzentrationen in halblogarithmischer Art in der Einheit

µmol/l aufgetragen. Die Ordinate beinhält die Abnahme der Kontraktionskraft in Prozent. Die

Markierungen des Kurvenzuges zeigen die Mittelwerte der Versuche bei der jeweiligen

Konzentration an, deren Senkrechten die dazugehörigen Standardfehler. Der Kurvenverlauf

weist einen starken Abfall der Kontraktion ab einer Konzentration von 10 µmol/l auf. Eine

Verringerung der Ausgangskontraktionskraft um 50 % wird bereits ab einer Konzentration

von 29 µmol/l erzielt, weshalb die Affinität der Präparate des Ileum terminale gegenüber

MGtr2 als bedeutender im Vergleich zu den Organpräparaten der Aorta descendens und der

Arteria pulmonalis angesehen werden können.

  49

Abbildung 15: Originalabbildung der Kontraktionskraft des Ileum terminale unter Einwirkung von MGtr2

Der Kurvenlauf verdeutlicht den spasmolytischen Effekt von MGtr2 auf das Ileum. Bereits

bei einer Konzentration von 10 µmol/l erfolgte ein starker Abfall der Kontraktion. Eine

Substanzkonzentration von 100 µmol/l bewirkte die vollständige Spasmolyse des Ileums.

10 µmol/l

45 Minuten

1 cm = 0,98 mN

0 % Restkontraktion vor

Intervallende erreicht

3 µmol/l

30 µmol/l

100 µmol/l

  50

4.2 Wirkung von MGtr2 auf den Musculus papillaris

Die Auswirkung des Triazols auf die Kontraktilität des Herzens wurde an den Präparaten der

Papillarmuskeln simuliert. Hierzu wurden die Organpräparate in die Apparatur I (s. 3.6.2)

eingesetzt und der Versuch wie in 3.7.1 beschrieben durchgeführt. Um die Beeinflussung der

Inotropie durch MGtr2 zu untersuchen, wurden sechs Versuche durchgeführt. Nach der

Aktivierung der elektrischen Kontraktion der Organpräparate durch den Accupulser und dem

Erreichen eines konstanten Schlagrhythmus mit gleichbleibender Kontraktionskraft, wurde

die Kontraktilität der Präparate bestimmt und als Kontrollwert mit 100 % definiert. Der

Referenzwert stellte eine Kontraktionskraft von 1,29 ± 0,17 mN dar.

Im Anschluss wurde die substanzabhängige Beeinflussung der Inotropie durch die Änderung

der aufgezeichneten Amplitudenhöhen registriert und die Größe der Schlagkraft als Anteil des

Kontrollwertes angegeben. Dabei wurde ersichtlich, dass MGtr2 nur einen geringen Einfluss

auf die Inotropie der Papillarmuskeln hat.

Die Tabelle 10 zeigt die Mittelwerte der Schlagkrafthöhen der sechs Versuche in mN sowie

die Abnahme der Kontraktionsfähigkeit in Prozent. Außerdem sind die dazugehörigen

Standardfehler angegeben. Die Irrtumswahrscheinlich gibt Auskunft über die statistische

Signifikanz der aufgezeichneten Messwerte.

Tabelle 10: Versuchsergebnisse des Musculus papillaris unter Einfluss von MGtr2

MGtr2

(µmol/l)

fc ± SEM

(mN)

fc ± SEM

(%)

Versuche

(n)

Irrtums-

warscheinlichkeit

(P)

Kontrolle 1,29 ± 0,17 0,00 ± 0 6 -

3 1,15 ± 0,14 - 8,36 ± 5,52 6 n.s.

10 0,96 ± 0,13 - 19,64 ± 12,15 6 n.s.

30 0,99 ± 0,11 - 21,18 ± 5,43 6 n.s.

100 1,25 ± 0,18 - 1,21 ± 9,89 6 n.s.

  51

Abbildung 16: Konzentrations-Wirkungs-Kurve des Musculus papillaris

Konz.(µmol/l)3 10 30 100

Abn

ahm

e de

r Kon

trakt

ions

kraf

t (%

)

-100

-75

-50

-25

0

25

0

Papillarmuskeln = 6, MGtr2.HCl

 

Der Kurvenverlauf stellt den Einfluss von MGtr2 auf die Kontraktilität des Herzens dar. Die

x-Achse gibt die Substanzkonzentration in µmol/l semilogarithmisch an, auf der y-Achse

befindet sich die in Prozent angegebene Abnahme der Kontraktionskraft. Die Markierungen

der Kurve stellen die Mittelwerte der vermessenen Kontraktionskraft dar, mit durch die

Senkrechten symbolisierten dazugehörigen SEM. Durch Erhöhung der Substanzkonzentration

auf bis zu 30 µmol/l wurde ein negativ inotroper Einfluss von - 21,18 ± 5,43 % des

Referenzwertes aufgezeichnet. Allerdings wurde durch eine weitere Steigerung der

Konzentration auf insgesamt 100 µmol/l die negative inotrope Beeinflussung wieder geringer

auf insgesamt - 1,21 ± 9,89 % des Kontrollwertes. Anhand der Amplituden wurde ersichtlich,

dass der Effekt durch MGtr2 auf die Kontraktilität des Herzens mäßig ist, eine EC50 konnte

nicht erzielt werden.

  52

Abbildung 17: Originalabbildung der Kontraktionskraft des Musculus papillaris unter Einwirkung von MGtr2

Die Amplituden demonstrieren, dass mit zunehmender Triazolzugabe die Kontraktionskraft

zunächst bis zu einer Konzentration von 10 µmol/l vermindert wird. Ab einer Konzentration

von 30 µmol/l stagniert der Inotropie beeinflussende Effekt MGtr2s und ist ab einer

Konzentration von 100 µmol/l sogar rückläufig. Dadurch stellt sich nahezu das Ausgangslevel

der Kontraktilität ein.

10 µmol/l

30 µmol/l

100 µmol/l

1 cm = 0,98 mN

3 µmol/l

Kontrolle

  53

4.3 Wirkung von MGtr2 auf das Atrium cordis dextrum

Die Präparate des rechten Vorhofes dienten innerhalb der fünf getätigten Versuche der

Testung auf einen möglichen Chronotropie beeinflussenden Effekt von MGTr2. Hierzu wurde

die Apparatur 2 verwendet, an der die Prüfungen wie in 3.7.2 beschrieben durchgeführt

wurden. Da die zur Automatie befähigten Gewebe des rechten Vorhofes ohne eine zusätzliche

chemische bzw. elektrische Reizung kontrahierten wurden diese in die begaste Tyrodelösung

eingelassen und konnten nach Erlangen einer konstanten Schlagfrequenz für die Versuche

verwendet werden. Die Anzahl der pro Minute getätigten Schläge wurde als Kontrollwert

festgelegt und mit einer Schlagfrequenz von 100 % definiert, was einer Frequenz von

199,00 ± 11,66 Schlägen pro Minute entsprach. Im Anschluss wurden die Schläge jeweils für

12 Sekunden aufgenommen. Dies kam einer Strecke von 6 cm gleich. Durch Auszählung der

Einzelkontraktionen und Multiplikation mit dem Faktor fünf, konnte die Schlaganzahl pro

Minute erhalten werden, die anschließend in Beziehung zum Kontrollwert gesetzt und in

Prozent des Referenzwertes angegeben wurde. Dabei wurde ersichtlich, dass MGtr2 bis zu

einer Konzentration von 30 µmol/l so gut wie keinen Effekt auf den rechten Vorhof ausübte.

Allerdings fiel bei Erreichen einer Konzentration von 100 µmol/l die Kontraktionsfrequenz

schlagartig auf null ab, was einer stark negativ chronotropen Wirkung des Triazols entsprach.

Tabelle 11 enthält die Schlagfrequenz in Schläge/Minute, die Abnahme der Frequenz in

Prozent sowie die dazu gehörigen Standardfehler. Durch die angegebene

Irrtumswahrscheinlich wird die statistische Signifikanz der Messerwerte beurteilt.

Tabelle 11: Versuchsergebnisse des Atrium cordis dextrum unter Einfluss von MGtr2

MGtr2

(µmol/l)

f ± SEM

(x/min.)

f ± SEM

(%)

Versuche

(n)

Irrtums-

warscheinlichkeit

(P)

Kontrolle 199,00 ± 11,66 0,00 ± 0 5 -

3 203,00 ± 15,54 1,59 ± 1,98 5 n.s.

10 203,00 ± 16,17 1,60 ± 2,63 5 n.s.

30 197,00 ± 15,94 - 1,28 ± 3,53 5 n.s.

100 0,00 ± 0,00 - 100 ± 0,00 5 0,001

  54

Abbildung 18: Konzentrations-Wirkungs-Kurve des Atrium cordis dextrum

Konz.(µmol/l)3 10 30 100

Abn

ahm

e de

r Sch

lagfre

quen

z (%

)

-100

-75

-50

-25

0

25

0

Rechter Vorhofn = 5, MGtr2.HClEC50 = 55 µmol/l

 

Die Konzentrations-Wirkungskurve des rechten Vorhofes zeigt die Abhängigkeit der

Schlagfrequenz von der zugegebenen Konzentration der Testsubstanz auf. Hierzu wurden auf

der Abszisse die Substanzkonzentration in µmol/l und auf der Ordinate die Schläge pro

Minute aufgetragen. Die Punkte des Kurvenzugs verdeutlichen die Mittelwerte der

Schlaganzahl zur jeweiligen Konzentration, durch die davon abgehenden vertikalen Linien

sollen die zugehörigen SEM angegeben werden.

Die Kurvenentwicklung legt eine nahezu ausbleibende Beeinflussung der Schlagfrequenz

durch MGtr2 bis zu einer Konzentration von 30 µmol/l dar. Durch Erreichen der

Endkonzentration von 100 µmol/l zeigt das Triazol einen stark negativ chronotropen Effekt,

der durch steilen Abfall der Kurve veranschaulicht wird, der einer vollständig ausbleibenden

Kontraktionsfähigkeit entspricht. Die EC50 beträgt daher 55 µmol/l.

  55

Abbildung 19: Originalabbildung der Schlagfrequenz des Atrium cordis dextrum unter Einwirkung von MGtr2

Die Originalabbildung der Schlagfrequenz unter Einwirkung von MGtr2 zeigt, dass durch die

Erhöhung der Substanzkonzentration auf ein Niveau von 30 µmol/l keine signifikante

Auswirkung auf die Häufigkeit der getätigten Schläge zu verzeichnen war.

Eine Konzentrationserhöhung auf das Endlevel von 100 µmol/l hingegen bewirkte einen

starken negativ chronotropen Effekt, der sich durch eine Schlagfrequenz von 0 % des

Kontrollwertes verdeutlichte. Dadurch ergibt sich eine EC50 von 55 µmol/l.

10 µmol/l

30 µmol/l

100 µmol/l

3 µmol/l

Kontrolle

12 Sekunden

  56

4.4 Ermittlung des Wirkmechanismus von MGtr2 am Ileum terminale

Die zu einem Effekt führende Konzentration MGtr2s war an den Segmenten des Ileum

terminale am geringsten, weshalb die Präparate des Krummdarms ausgewählt wurden, um

den Wirkmechanismus des Triazols zu untersuchen.

Während der Versuche sollte überprüft werden, ob der spasmolytische Effekt durch eine

Wirkung über das Enzym eNOS vermittelt wurde oder ob andere Mechanismen für die

Spasmolyse verantwortlich waren. Aktivierung der eNOS bewirkt an Endothelzellen eine

vermehrte Freisetzung des dilatierend wirksamen Stickstoffmonoxid. Dazu wurde das Enzym

innerhalb von zwei getrennten Versuchen durch verschiedene Konzentrationen einer Lösung

von NO-L-Arg in KCl hältiger Tyrodelösung blockiert und im Anschluss die Wirkung von

MGtr2 durch Zugabe der EC50 überprüft.

4.4.1 Beeinflussung der MGtr2-Wirkung durch 30 µmol/l Nitro-L-Arginin

Um zunächst nur einen Teil des Enzyms eNOS zu blockieren, wurde die Konzentration der

NO-L-Arg Lösung von 30 µmol/l gewählt. Dadurch sollte getestet werden, ob die Wirkung

der Substanz nur anteilig oder vollständig von der eNOS abhängig war. Eine sofortige

Verminderung der spasmolytischen Aktivität bei bereits geringen Konzentrationen des

Blockers, hätte die vollständige Abhängigkeit des Effektes MGtr2s von der eNOS aufgezeigt.

Nach Eintreten der konstanten Dauerkontraktion der Ileumsegmente durch vorherige Zugabe

der 60 mmolaren KCl-Lösung, die einer Kraft von 8,92 ± 0,86 mN entsprach und als

Kontrollwert mit 100 % definiert wurde, konnte der eNOS-Blocker appliziert werden um für

45 Minuten auf die endothelialen Enzyme einzuwirken und diese zu hemmen. Währenddessen

wurde die Kontraktionskraft durchgehend aufgezeichnet. Anschließend wurde MGtr2

einmalig in einer Konzentration von 30 µmol/l in das Organbad eingebracht und die

spasmolytische Aktivität des Triazols für 45 Minuten registriert.

  57

Tabelle 12: Wirkung von MGtr2 am Ileum terminale unter Blockade der eNOS (30 µmol/l NO-L-Arg)

Konzentration

(µmol/l)

fc ± SEM

(mN)

Versuche

(n)

Irrtums-

wahrscheinlichkeit

(P)

0 (Kontrolle) 8,92 ± 0,86 4 -

30 (NO-L-Arg) 9,24 ± 0,95 4 -

30 (MGtr2) 4,35 ± 0,70 4 0,05

Tabelle 12 gibt die Mittelwerte der Kontraktionskraft der vier Versuche nach Zugabe des

Blockers und anschließender Applikation von MGtr2 in mN an sowie die dazugehörigen

Standardfehler. Die statistische Signifikanz der Messwerte soll durch die angegebene

Irrtumswahrscheinlichkeit gezeigt werden.

  58

Abbildung 20: Kontraktionskraft des Ileum terminale unter Einwirkung von NO-L-Arg (30 µmol/l) und MGtr2

Darm, Nitro - L - Arginin (30 µM)MGtr2.HCl, 30 µmol/l

n=4

f c[m

N]

0

2

4

6

8

10

12

Kontrolle Nitro-L-Arginin MGtr2.HCl 100 µM 30 µM

 

Auf der Abszisse wurde die Konzentration in µmol/l aufgetragen. Die Konzentration des

Kontrollwertes lag bei 0 µmol/l, die zweite Säule veranschaulicht eine Konzentration von

30 µmol/l NO-L-Arg und der dritte Balken gibt die Kombination von 30 µmol/l NO-L-Arg

und 30 µmol/l MGtr2 an. Auf der Ordinate wurde die Kontraktionskraft der Ileumpräparate

in mN aufgetragen.

Die Balken symbolisieren die erhaltenen Mittelwerte der Konvulsionskräfte in Abhängigkeit

der Konzentration. Die von ihnen abgehenden Vertikalen stellen die Standardfehler der

Messwerte da.

Anhand der graphischen Darstellung wird deutlich, dass eine Konzentration von 30 µmol/l

Nitro-L-Arginin keinen Einfluss auf die spasmolytische Aktivität des Triazols ausübte, das

durch eine Konzentration von 30 µmol/l den gleichen Effekt realisierte, wie ohne den Einfluss

des eNOS-Blockers.

  59

30 µmol/l

MGtr2

45 Minuten

30 µmol/l NO-L-Arg

Abbildung 21: Originalabbildung der Kontraktionskraft des Ileum terminale

unter Einwirkung von NO-L-Arg (30 µmol/l) und MGtr2

Die Kurve der Kontraktionskraft veranschaulicht, dass trotz Zugabe des eNOS-Blockers das

Triazol MGtr2 seinen spasmolytischen Effekt auf das terminale Ileum unbeeinflusst ausübte.

1 cm = 0,98 mN

  60

4.4.1 Beeinflussung der MGtr2-Wirkung durch 100 µmol/l Nitro-L-Arginin

Eine mögliche Teilwirkung des Triazols über die eNOS sollte in einem zweiten Versuch

durch die Zugabe einer 100 µmolaren NO-L-Arg Lösung getestet werden. Durch die

vollständige Blockade der entdothelialen Stickstoffmonoxid Synthase sollte, bei einer

Beteiligung des Enzyms am Wirkmechanismus von MGtr2 die anschließende Spasmolyse in

geringerem Ausmaß erfolgen.

Hierzu wurde das gleichbleibend dauerkontrahierte Organpräparat mit einer 100 µmolaren

Lösung von NO-L-Arg in KCl haltiger Tyrodelösung versetzt. Nach 45 Minuten wurde

MGtr2 in einer Konzentration von 30 µmol/l appliziert und die Beeinflussung des

spasmolytischen Effektes durch den Enzyminhibitor während eines weiteren 45 minütigen

Intervalls überprüft.

Die Tabelle 13 beinhält die erhaltenen Messerwerte der fünf durchgeführten Versuche als

Kontraktionskraft in mN sowie die zugehörigen SEM. P soll Aufschluss über die statistische

Signifikanz der Versuchsergebnisse geben.

Tabelle 13: Wirkung von MGtr2 am Ileum terminale unter Blockade der eNOS (100 µmol/l NO-L-Arg)

Konzentration

(µmol/l)

fc ± SEM

(mN)

Versuche

(n)

Irrtums-

wahrscheinlichkeit

(P)

0 (Kontrolle) 13,24 ± 0,85 5 -

100 (NO-L-Arg) 13,86 ± 0,82 5 -

30 (MGtr2) 6,54 ± 0,18 5 0,05

  61

Abbildung 22: Kontraktionskraft des Ileum terminale unter Einwirkung von NO-L-Arg (100 µmol/l) und MGtr2

Darm, Nitro - L - Arginin (100µM)MGtr2.HCl, 30 µmol/l

n=5

f c[m

N]

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Kontrolle Nitro-L-Arginin MGtr2.HCl 30 µM 30 µM

 

Die Abbildung verdeutlicht den Einfluss der jeweiligen Substanzkonzentrationen auf die

konvulsive Kraft der Ileumpräparate. Hierzu wurden auf der x - Achse die Konzentrationen in

µmol/l angegeben. Auf der y - Achse befindet sich die Kontraktionskraft in mN. Die Balken

legen die Kontraktion der Kontrolle, nach Zugabe von 100 µmol/l NO-L-Arg und der

Mischung von 100 µmol/l NO-L-Arg und 30 µmol/l MGtr2 dar. Die senkrechten Linien

symbolisieren die mit den Messwerten verbundenen SEM.

Die Graphik veranschaulicht den ausbleibenden Effekt von NO-L-Arg auf die spasmolytische

Aktivität des Triazols. Durch die vollständige Blockade des Enzyms wird die Wirkung von

MGtr2 nicht vermindert (s. 4.1.3), daher wird weder die gesamte Spasmolyse, noch ein Teil

des Effektes der Testsubstanz über die Aktivierung der endothelialen Stickstoffmonoxid-

Synthase ausgeführt.

  62

Abbildung 23: Originalabbildung der Kontraktionskraft des Ileum terminale

unter Einwirkung von NO-L-Arg (100 µmol/l) und MGtr2

     

         

         

           

         

                             

Der Graph verdeutlicht, dass durch Zugabe des Enzyminhibitors NO-L-Arg in einer

Konzentration von 100 µmol/l und die vollständige Blockade der endothelialen

Stickstoffmonoxid Synthase, der spasmolytische Einfluss von MGtr2 auf die glattmuskulären

Zellen des Ileum terminale nicht negativ beeinflusst wurde.

30 µmol/l

MGtr2

45 Minuten

1 cm = 0,98 mN

100 µmol/l NO-L-Arg

  63

5. Diskussion

Die Arbeit an den isolierten Organen des Cavia porcellus wurde mit dem Ziel durchgeführt,

eine Aussage über die Wirkung des Triazols MGtr2 auf die verschiedenen Arten der

Muskulatur, die durch die unterschiedlichen Organpräparate repräsentiert wurden, treffen zu

können. Dabei wurden die Präparate der glatten Muskulatur verwendet, um an den Organen

Aorta descendens und Arteria pulmonalis nach ausgelöstem künstlichem Vasospasmus eine

mögliche Gefäßmuskeltonus vermindernde Wirkung zu testen und an den Organpräparaten

des Ileum terminale eine Konvulsions-auflösende Spasmolyse zu prüfen.

Die Präparate des Herzens sollten Versuche an der Herzmuskulatur ermöglichen, die an den

Papillarmuskeln die Erprobung eines möglichen inotropen Effektes erlaubten und am rechten

Vorhof Tests zur Betrachtung einer eventuell Schlagfrequenz beeinträchtigenden Wirkung.

Die genaue Vorgehensweise der durchgeführten Versuche sowie die im Anschluss erhaltenen

Ergebnisse sind in den Kapiteln 3 und 4 bereits erörtert worden. Im Folgenden wird die

Beurteilung der einzelnen Versuchsergebnisse genannt.

5.1 Wirkung auf die glattmuskulären Organe

Die Versuche an den glattmuskulären Präparaten der Aorta descendens, Arteria pulmonalis

und Ileum terminale sowie die Registrierung möglicher vasodilatatorischer bzw.

spasmolytischer Effekte konnte nur nach einer vorangegangenen, chemisch ausgelösten

Dauerkontraktion erfolgen, die durch Kaliumchloridlösungen unterschiedlicher Konzentration

erzielt wurde (s. Tabelle 5).

Tabelle 14: Übersicht – Wirkung von MGtr2 an glattmuskulären Organen

Organ

fc ± SEM (%)

bei 100 µmol/l MGtr2

EC50 (µmol/l)

Aorta descendens - 33,29 ± 4,98 > 100

Arteria pulmonalis - 60,85 ± 3,87 59,5

Ileum terminale - 74,95 ± 5,70 29

  64

Tabelle 14 ermöglicht den Vergleich des Effektes von MGtr2 an den verschiedenen

glattmuskulären Organen, indem die Abnahmen der Ausgangskontraktion in Prozent und die

zugehörigen Standardfehler bei einer Endkonzentration von 100 µmol/l gegenüber gestellt

werden. Die erhaltenen EC50 Werte erlauben eine Aussage über die Wirksamkeit des Triazols

an den einzelnen Organen. Insgesamt ist eine deutlich stärkere Wirkung von MGtr2 an den

Organen mit glatter Muskulatur im Vergleich zu den Organpräparaten der quergestreiften

Herzmuskulatur zu beobachten.

5.1.1 Wirkung auf die Aorta descendens

Die vasodilatatierende Wirkung des Triazols auf die Präparate der Aorta descendens waren

innerhalb der fünf Versuche nur mäßig ausgeprägt. Die Endkonzentration von 100 µmol/l

bewirke eine Abnahme des Vasospasmus von 33,29 ± 4,98 %. Abbildung 12 verdeutlicht den

geringen Effekt der Testsubstanz auf die Versuchspräparate. Durch die am Ende im Organbad

befindlichen 100 µmol/l MGtr2 konnte die Ausgangskontraktion nicht um 50 % verringert

werden, weshalb die EC50 oberhalb der eingesetzten Endkonzentration lag.

5.1.2 Wirkung auf die Arteria pulmonalis

An den Organpräparaten der Arteria pulmonalis wurden fünf Tests durchgeführt innerhalb

derer ein deutlicher vasodilatierender Effekt registriert werden konnte. 50 % der Konvulsion

konnten durch eine Konzentration von 59,5 µmol/l aufgehoben werden. Daher waren die

Präparate der Lungenarterie erkennbar affiner gegenüber MGtr2 als die Präparate der Aorta.

Durch die Zugabe der gesamten Substanzlösung wurde die Dauerkontraktion der Segmente

der Lungenarterie um 60,85 ± 3,87 % vermindert.

5.1.3 Wirkung auf das Ileum terminale

Die Teilabschnitte des terminalen Ileums wiesen die stärkste Affinität gegenüber dem Triazol

auf. Anhand der Versuche konnte eine EC50 von 29 µmol/l ermittelt werden, die die

Konzentrationen der 50 prozentigen Kontraktionsabnahme der anderen glattmuskulären

Organe entscheidend unterschritt. Innerhalb der vier durchgeführten Tests wurde durch die

Endkonzentration von 100 µmol/l eine spasmolytische Wirkung erfasst, die einer Abnahme

des Spasmus von 74,95 ± 5,70 % entsprach. Somit war MGtr2 an den Segmenten des Ileum

terminale deutlich wirksamer als an den Präparaten der Aorta und der Lungenarterie.

  65

5.1.4 Wirkung auf das Ileum terminale nach Zugabe des eNOS-Inhibitors NO-L-Arg

Durch die Blockade der eNOS mittels des Enzyminhibitors Nitro-L-Arginin sollte eine

mögliche Beteiligung des endothelialen Enzyms am Wirkmechanismus von MGtr2 untersucht

werden. Das Enzym wurde hierzu durch 30 und 100 µM NO-L-Arg teilweise bzw. vollständig

inhibiert und jeweils vier bzw. fünf Versuche durchgeführt, bei denen die Wirkung des

Triazols betrachtet wurde. MGtr2 wurde in einer Konzentration von 30 µmol/l appliziert.

Die Wirkung der Testsubstanz MGtr2 wurde weder durch die partielle Hemmung, noch durch

die vollständige Blockade des Enzyms eNOS negativ beeinflusst. Dies verdeutlichen die

Graphen der Abbildung 21 und 23. Die Kontraktionskraft nahm in gleichem Ausmaß ab, wie

in den Versuchen, die ohne die Enzyminhibitoren durchgeführt worden waren. Daher scheint

der Wirkmechanismus der Testsubstanz am Ileum terminale ohne Mitwirkung der eNOS

abzulaufen.

5.2 Wirkung auf die quergestreifte Herzmuskulatur

Zwecks Testung einer möglichen chronotropen bzw. inotropen Wirkung der Testsubstanz

wurden die Präparate des Atrium cordis dextrum und des Musculus papillaris verwendet.

Innerhalb der Versuche konnte ein Schlagfrequenz beeinflussender Effekt MGtr2s beobachtet

werden, jedoch keine Kontraktilitäts-modifizierende Wirkung.

Tabelle 15: Übersicht – Wirkung von MGtr2 an der quergesteiften Herzmuskulatur

Organ

fc ± SEM (%)

bei 100 µmol/l MGtr2

EC50 (µmol/l)

Musculus papillaris - 1,21 ± 9,89 > 100

Atrium cordis dextrum - 100 ± 0,00 55

Die Übersicht gibt die Abnahme der Kontraktionskraft bzw. der Schlagfrequenz in Prozent

wieder und die Standardfehler der Messwerte. Die EC50 Werte stellen ein Maß für die

Wirksamkeit des Triazols am Organpräparat dar. Sie verdeutlichen, dass kein inotroper

Effekt, jedoch ein stark negativ chronotroper Effekt zu beobachten war. Dieser wurde nach

Erreichen der Endkonzentration von 100 µmol/l im Organbad erzielt und bewirkte am rechten

Vorhof das vollständige Ausbleiben der Kontraktionsfähigkeit.

  66

5.2.1 Wirkung auf den Musculus papillaris

Innerhalb aller durchgeführten Organversuche stellten die Papillarmuskeln die anatomische

Struktur des Meerschweinchens dar, auf die MGtr2 den geringsten Einfluss ausübte. Während

der sechs durchgeführten Versuche konnte nach Zugabe der gesamten Substanzlösung ein nur

äußerst geringer negativ inotroper Effekt des Triazols erfasst werden, der einer Abnahme, der

als Kontrollwert definierten Kontraktionskraft, von - 1,21 ± 9,89 % entsprach. Allerdings

konnten durch niedrigere Substanzkonzentrationen bereits stärkere Abnahmen der

Kontraktilität erzielt werden (s. Abbildung 16). Die EC50 wurde durch die Konzentration von

100 µmol/l nicht erreicht.

5.2.2 Wirkung auf das Atrium cordis dextrum

Die Schlagfrequenz des rechten Vorhofs wurde durch die Substanz bis zu einer Konzentration

von 70 µmol/l nicht beeinflusst. Erst nach Applikation des letzten aliquoten Teils und dem

Erreichen einer Badkonzentration von 100 µmol/l kam es zu einer starken negativ

chronotropen Wirkung, die durch einen Abfall der Schlagfrequenz auf 0 Schläge pro Minute

charakterisiert wurde (s. Abbildung 18). Die Frequenz der getätigten Schläge pro Minute

nahm somit um 100,00 ± 0 % ab. Während der fünf Versuche entsprach dies einer EC50 von

55 µmol/l.

5.3 Konklusion

MGtr2 stellt kein gewebeselektives Triazol dar. Zwar ist an der glatten Muskulatur ein

bedeutend spasmolytischer Effekt zu verzeichnen, der einer Abnahme des Spasmus von

- 74,95 ± 5,70 % bei einer Substanzkonzentration von 100 µmol/l entsprach, dennoch kam es

bei jener Konzentration ebenso zu vasodalatierenden Effekten an der Arteria pulmonalis und

der Aorta descendens (mäßig ausgeprägt). Bei Erreichen des Endlevels zeigten die

Vorhofpräparate ein vollständiges Ausbleiben der Funktionsfähigkeit. In der Praxis

entsprächen die Befunde womöglich starken Blutdruck-beeinflussenden Effekten sowie

Eintreten des Herzstillstandes. Daher ist MGtr2 für den Einsatz als selektiv spasmolytisch

wirkende Substanz ungeeignet.

  67

6. Zusammenfassung

Im Rahmen dieser Arbeit sollte das potentiell spasmolytisch wirkende Triazol MGtr2

hinsichtlich der Wirksamkeit als auch der unerwünschten Nebenwirkungen erforscht werden

mit dem Bestreben eine gewebsselektive Wirkung nachweisen zu können.

Neben glattmuskulären Präparaten des Ileum terminale, an denen der spasmolytische Einfluss

dargestellt werden sollte, wurden die präparierten Organe Arteria pulmonalis und Aorta

descendens für die Veranschaulichung unspezifisch vasodilatierender Effekte verwendet. Das

Atrium cordis dextrum und der Musculus papillaris dienten der Registrierung ungewollter

chrono- und inotroper Nebeneffekte.

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass MGtr2 einen deutlichen

spasmolytischen Effekt an den Segmenten des Ileum terminale ausübte. Die

Ausgangskontraktion der Präparate wurde bereits durch eine Konzentration von 10 µmol/l um

12,55 ± 0,60 % vermindert, 100 µmol/l führten zu einer Regression von 74,95 ± 5,70 %. Dies

entsprach einer EC50 von 29 µmol/l. Der Effekt resulierte nicht aus einer Involvierung des

Enzyms eNOS. Jedoch wiesen auch die Abschnitte der Arteria pulmonalis eine signifikante

Affinität gegenüber dem Triazol auf, die durch eine Verringerung der Kontraktion von

60,85 ± 3,87 % und eine EC50 von 59,5 µmol/l verdeutlicht wurde. An den glattmuskulären

Organpräparaten der Aorta descendens war der vasodilatierende Einfluss wesentlich geringer

ausgeprägt (- 33,29 ± 4,98 %).

Die Kontraktilität der Papillarmuskeln wurde durch das Triazol nicht maßgeblich

determiniert. Eine Abnahme der Kontraktionskraft von lediglich 1,21 ± 9,89 % wurde erfasst.

An den Präparaten des Atrium cordis dextrum hingegen wurden stark negativ chronotrope

Effekte beobachtet. Bei Erlangen einer Konzentration von 100 µmol/l folgte der sofortige

Herzstillstand. Damit lag keine weitere Kontraktionsfähigkeit vor.

Diese Daten demonstrieren, dass MGtr2 keine selektive Spasmolyse hervorruft und für den

Gebrauch ungeeignet zu sein scheint. Trotz des signifikanten Effektes am Ileum terminale

werden auch die Organe Arteria pulmonalis und Aorta descendens vasodilatierend beeinflusst

und das Atrium cordis dextrum repressiv innerviert. Neben der Spasmolyse bedeuten diese

Effekte möglicherweise Blutdruckabnahme und Herzstillstand.

 

  68

7. Literaturverzeichnis

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Pharmakologie und Toxikologie. 10. überarbeitete Auflage. Urban & Fischer-Verlag,

München

Ammon H (2014) Hunnius Pharmazeutisches Wörterbuch. 11. Überarbeitete und erweiterte

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Estler C, Schmidt H (2007) Pharmakologie und Toxikologie: Für Studium und Praxis. Mit

einem Geleitwort von Eckart von Hirschhausen. 6. Vollständig überarbeitete Auflage.

Schattauer Verlag, Stuttgart

Hänsel R, Sticher O (2010) Pharmakognosie – Phytopharmazie. 9. Auflage. Springer Verlag,

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Lüllmann H, Mohr K, Hein L (2010) Pharmakologie und Toxikologie.

Arzneimittelwirkungen verstehen - Medikamente gezielt einsetzen. 17. Vollständig

überarbeitete Auflage. Georg Thieme Verlag, Stuttgart

Maggi CA, Meli A (1982) An in vivo procedure for estimating spasmolytic activity in the rat

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  70

8. Danksagung

Mein Dank gilt meinem Diplomarbeitsbetreuer Ao. Univ.-Prof. Dr. Christian Studenik, der im

Rahmen der Diplomarbeit ein außerordentliches Betreuungsverhältnis ermöglicht hat. Sowohl

die fachliche Unterstützung als auch das freundschaftliche Umfeld habe ich stets als

motivierend empfunden.

Außerdem möchte ich mich bei Herrn Ao. Univ.-Prof. Dr. Thomas Erker und seiner

Arbeitsgruppe für die Synthese und Disposition des Triazols bedanken, das einen

wesentlichen Bestandteil der Arbeit dargestellt hat.

Ferner danke ich auch Herrn Peter Höflich, der durch die Pflege und Versorgung der

Versuchstiere eine wichtige Grundlage für die Organversuche schuf und im Labor stets die

Harmonie aufrechterhielt.

Besonderer Dank gilt meiner Familie, meinen Freunden und meiner Freundin, die mich in

jedweden Umständen unterstützt haben.

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9. Curriculum vitae

Persönliches

Name: Stefan Grote

Geburtstag: 23.11.1988

Geburtsort: Göttingen, Deutschland

Familienstand: ledig

Staatsangehörigkeit: Deutsch

E-mail: stefan1grote1@gmail.com

Ausbildung

Ab 2009 Studium der Pharmazie an der Universität Wien

2001 - 2008 Hainberg - Gymnasium Göttingen

Abschluss: Abitur (Allgemeine Hochschulreife)

1999 - 2001 Bert - Brecht Orientierungsschule Göttingen

1995 - 1999 Bonifatius Grundschule Göttingen

Praktika/Nebentätigkeiten

2014 - 2015 Tutor im Praktikum Arzneistoffsynthese,

Department Pharmazeutische Chemie - Universität Wien

2012 - 2013 Mentor im Peer-Mentoringprogramm - Universität Wien

2008 - 2009 Zivildienst - Krankentransport Uniklinikum Göttingen

2007 Schulpraktikum - Allgemeinchirurgie Uniklinikum Göttingen

Fachliche Qualifikationen

Isolierung und Präparation von Organen des Cavia porcellus

Instrumentierung von Organbad - Versuchen

Sonstige Fähigkeiten

Deutsch: Muttersprache, Englisch: gut, EDV: gute Kenntnisse in Microsoft Office