Upload
others
View
34
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Univerza v Mariboru
Fakulteta za naravoslovje in matematiko
Oddelek za biologijo
DIPLOMSKA SEMINARSKA NALOGA
Sandra ZVONAR
Maribor, 2011
Univerza v Mariboru
Fakulteta za naravoslovje in matematiko
Oddelek za biologijo
Sandra ZVONAR
Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom
DIPLOMSKA SEMINARSKA NALOGA
Kvantitative determination of reductive sugars with DNS reagent
GRADUATION SEMINAR THESIS
Mentorica: doc. dr. Jana AMBROŢIČ DOLINŠEK
Maribor, 2011
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
II
Univerza v Mariboru
Fakulteta za naravoslovje in matematiko
MENTORSTVO
Diplomska seminarska naloga je nastala pod mentorstvom doc. dr. Jane Ambroţič
Dolinšek s Fakultete za naravoslovje in matematiko Univerze v Mariboru. Delo sem
opravljala v laboratoriju za fitofiziologijo oddelka za biologijo na Fakulteti za naravoslovje
in matematiko Univerze v Mariboru.
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
III
Univerza v Mariboru
Fakulteta za naravoslovje in matematiko
IZJAVA
Podpisana Sandra Zvonar, rojena 31. 1. 1988, študentka Filozofske fakultete Univerze v
Mariboru, študijskega programa biologija in geografija, izjavljam, da je diplomska
seminarska naloga z naslovom Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS
reagentom pri mentorici doc. dr. Jani Ambroţič Dolinšek avtorsko delo. Diplomska
seminarska naloga je nastala kot rezultat lastnega dela. Vsi privzeti podatki so citirani
skladno z mednarodnimi pravili o varovanju avtorskih pravic.
Maribor, 10. 6. 2011 Sandra Zvonar
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
IV
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom.
Diplomska seminarska naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in
matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
POVZETEK
Redukcijski sladkorji so primarni produkt fotosinteze in se uporabljajo za transport
molekul za energijo. So vir materialov za tvorbo proteinov, polisaharidov, lipidov in
celuloze. Vsebujejo karbonilne skupine, kar pomeni, da delujejo v različnih reakcijah kot
redukcijsko sredstvo. Namen te diplomske seminarske naloge je bil poiskati in preizkusiti
metodo za kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev v rastlinskem tkivu s pomočjo
spektrofotometra SpectroVis. V diplomski seminarski nalogi so podane teoretične osnove
o ogljikovih hidratih in spektrofotometriji ter rezultati, analiza in evalvacija preizkusa
izbrane metode, ki je najprimernejša za izvajanje na srednjih šolah in fakultetah zaradi
izjemne natančnosti, preprostosti in dostopnosti vseh potrebnih materialov in
pripomočkov.
Ključne besede: ogljikovi hidrati, redukcijski sladkorji, spektrofotometrija, DNS reagent.
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
V
Zvonar, S.: Kvantitative determination of reductive sugars with DNS reagent.
Graduation Seminar Thesis. University of Maribor, Faculty of Natural Sciences and
Mathematics, Department of Biology, 2011.
ABSTRACT
Reductive sugars are the primary product of photosynthesis and are used to transport
molecules for energy. They are a source of materials to form proteins, polysaccharides
lipids and cellulose. They contain carbon groups, which means that they work in different
reactions as a reductive medium. The purpose of this dissertation is to show and test the
method for kvantitative determination of reductive sugars in vegetation tissue with the help
of a spectrophotometer SpectroVis. In this graduation seminar thesis we give the
theoretical background of carbohydrates and spectroscopy, with the results, analysis and
the evaluation of the test of the chosen method. This method is suitable for secondary
schools and universities because of its precision, simplicity and accessibility of all
necessary materials and equipment.
Key words: carbohydrates, reductive sugars, spectroscopy, DNS reagent.
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
VI
KAZALO
Kazalo vsebine
1 UVOD ............................................................................................................................ 1
1.1 Namen diplomske seminarske naloge ..................................................................... 3
1.2 Cilji diplomske seminarske naloge ......................................................................... 4
1.3 Hipoteza .................................................................................................................. 4
2 TEORETIČNE OSNOVE ............................................................................................. 5
2.1 Ogljikovi hidrati v rastlinah .................................................................................... 5
2.1.1 Monosaharidi ................................................................................................... 5
2.1.1.1 Redukcijski sladkorji ................................................................................ 8
2.1.2 Disaharidi ........................................................................................................ 9
2.1.3 Polisaharidi .................................................................................................... 11
2.1.3.1 Rezervni polisaharidi.............................................................................. 11
2.1.3.2 Strukturni polisaharidi ............................................................................ 12
2.2 Sinteza ogljikovih hidratov v Calvinovem ciklu .................................................. 14
2.3 Spektrometrija ....................................................................................................... 17
2.3.1 Elektromagnetno valovanje ........................................................................... 17
2.3.2 Kvantitativno vrednotenje ............................................................................. 19
3 MATERIAL IN METODE .......................................................................................... 23
3.1 Kvantitativna ocena redukcijskih sladkorjev po metodi z DNS reagentom (3,5-
dinitrosalicilno kislino) .................................................................................................... 23
3.1.1 Priprava na izvedbo metode in varnostni ukrepi ........................................... 23
3.1.2 Material .......................................................................................................... 24
3.1.3 Postopek ........................................................................................................ 25
3.1.3.1 Priprava DNS reagenta (reagenta iz 3,5-dinitrosalicilne kisline) ........... 25
3.1.3.2 Priprava umeritvene krivulje .................................................................. 26
3.1.3.3 Priprava ekstrakta iz rastlinskega materiala ........................................... 36
4 REZULTATI ............................................................................................................... 38
4.1 Rezultati preizkusa metode ................................................................................... 38
4.2 Rezultati anketnega vprašalnika ........................................................................... 42
5 RAZPRAVA ................................................................................................................ 45
5.1 Analiza rezultatov preizkusa metode .................................................................... 45
5.2 Analiza rezultatov anketnega vprašalnika ............................................................ 46
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
VII
6 ZAHVALA .................................................................................................................. 49
7 LITERATURA IN VIRI .............................................................................................. 50
8 PRILOGE ...................................................................................................................... 1
Kazalo slik
Slika 1: Monosaharidi (a) fruktoza, (b) glukoza, (c) galaktoza ............................................. 5
Slika 2: (a) Dihidroksiaceton, (b) D-gliceraldehid in (c) L-gliceraldehid ............................. 6
Slika 3: Shematski pregled D-aldoz ...................................................................................... 7
Slika 4: D-sedoheptuloza in D-manoheptuloza ..................................................................... 7
Slika 5: Shematski pregled D-ketoz ...................................................................................... 8
Slika 6: Fehlingov test z glukozo .......................................................................................... 9
Slika 7: Saharoza ................................................................................................................. 10
Slika 8: Laktoza ................................................................................................................... 10
Slika 9: Maltoza ................................................................................................................... 10
Slika 10: Škrob in glikogen ................................................................................................. 12
Slika 11: Celuloza ................................................................................................................ 12
Slika 12: Zgradba rastlinske celične stene ........................................................................... 14
Slika 13: Calvinov cikel ...................................................................................................... 15
Slika 14: Spekter elektromagnetnega valovanja .................................................................. 18
Slika 15: Prehajanje svetlobe skozi kiveto .......................................................................... 20
Slika 16: Shematski prikaz spektrofotometra ...................................................................... 22
Slika 17: SpectroVis ............................................................................................................ 30
Slika 18: Program LoggerPro – Experiment ....................................................................... 31
Slika 19: Program LoggerPro – Calibrate – Spectrometer: 1 .............................................. 31
Slika 20: Program LoggerPro – Calibrate Spectrometer ..................................................... 32
Slika 21: Program LoggerPro – Finish Calibration ............................................................. 32
Slika 22: Program LoggerPro – OK .................................................................................... 33
Slika 23: Zbiranje podatkov – Collect ................................................................................. 34
Slika 24: Ustavitev zbiranja podatkov – Stop Collection .................................................... 34
Slika 25: Moţnosti grafa – Graph Options .......................................................................... 35
Slika 26: Moţnosti osi – Axes Options ............................................................................... 35
Slika 27: Zbriši in nadaljuj – Erase and Continue ............................................................... 36
Slika 28: Umeritvena krivulja za glukozo ........................................................................... 40
Slika 29: Umeritvena krivulja za fruktozo .......................................................................... 40
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
VIII
Slika 30: Odgovori anketirancev na 7. točko: "Metoda mi je pripomogla k laţjemu
razumevanju snovi." ............................................................................................................ 42
Slika 31: Odgovori anketirancev na 8. točko: "Metoda je uporabna pri študiju izpitnega
gradiva pri predmetu Fitofiziologija." ................................................................................. 43
Slika 32: Odgovori anketirancev na 9. točko: "Metoda je dosegla moja pričakovanja." .... 43
Slika 33: Namen, za katerega bi anketiranci še uporabili to metodo .................................. 44
Kazalo preglednic
Preglednica 1: Priprava DNS reagenta ................................................................................ 26
Preglednica 2: Priprava standardnih raztopin glukoze ........................................................ 28
Preglednica 3: Priprava standardnih raztopin fruktoze ....................................................... 28
Preglednica 4: Priprava raztopin za umeritveno krivuljo za glukozo .................................. 29
Preglednica 5: Priprava raztopin za umeritveno krivuljo za fruktozo ................................. 30
Preglednica 6: Absorbance različnih masnih koncentracij glukoze .................................... 38
Preglednica 7: Absorbance različnih masnih koncentracij fruktoze ................................... 39
Preglednica 8: Rezultati vzorcev ......................................................................................... 41
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
1
1 UVOD
Ogljikovi hidrati so najbolj pogoste organske molekule v naravi in so primarne molekule
za shranjevanje energije, poleg tega pa lahko tvorijo različne strukturne komponente ţivih
celic (Raven in Echhorn, 2005, str. 16). V večini rastlin sta škrob in saharoza glavna
končna produkta fotosinteze, mesto in potek njunega nastanka pa sta prostorsko ločena
(Jha in Dubey, 2005, str. 342). Škrob (prehodna ali začasna oblika škroba oziroma
primarni škrob) se sintetizira v kloroplastih, saharoza pa v citoplazmi. Podnevi se ogljik,
asimiliran v procesu fotosinteze, porabi za sintezo škroba v kloroplastu ali pa je
transportiran v citosol za sintezo saharoze. Ta je lahko transportirana v nefotosintetske dele
rastline. Trioza fosfati iz Calvin-Bensonovega cikla se lahko v kloroplastih sintetizirajo v
ADP-glukozo, iz katere se sintetizira škrob, lahko pa se preko Pi translokatorja
transportirajo v citosol, kjer se sintetizirajo v saharozo. Ponoči se škrob v kloroplastu
razcepi na maltozo in glukozo, ki se preko maltoza-glukoza translokatorja transportirata v
citosol. Tu se pretvorita v heksoza fosfate, iz katerih se sintetizira saharoza. Saharoza se
kot vir energije porablja za rast in kot zaloţni sladkor skladišči v nefotosintetskih delih
rastlin. Tu se tvori škrob v obliki gostih granul, imenovanih amiloplasti, ki predstavljajo
posebno vrsto plastidov (Taiz in Zeiger, 2010, str. 224). Škrob je torej zaloţna oblika
rezervnega sladkorja, saharoza pa transporta oblika sladkorja (Jha in Dubey, 2005, str.
342).
Redukcijska sladkorja glukoza in fruktoza ter neredukcijski sladkor saharoza se
sintetizirajo v procesu fotosinteze v listih. Iz listov (vir) so nato transportirani v preostale
rastlinske organe (ponor), kot so korenine, plodovi, gomolji, kjer se uporabijo kot vir
energije v respiratornem metabolizmu ali za rast oziroma sintezo kompleksnih ogljikovih
hidratov, kot je škrob, in biosintezo strukturnih polisaharidov, kot je celuloza (Jha in
Dubey, 2005, str. 342). Rezultati številnih analiz kaţejo na to, da se po floemu rastlin
transportirajo predvsem neredukcijski sladkorji. Redukcijska sladkorja, kot sta glukoza in
fruktoza, vsebujeta redukcijsko aldehidno ali keto skupino, ki je v saharozi spremenjena v
alkoholno skupino ali kombinirana s podobno skupino drugega sladkorja. Saharoza je
glavna transportna oblika sladkorja najverjetneje zato, ker je manj reaktivna kot njene
redukcijske komponente (Taiz in Zeiger, 2010, str. 224).
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
2
Saharoza, trekaloza, glukoza, fruktoza in majhne količine drugih substanc, kot so
aminosladkorji, sladkorni alkoholi, sladkorni fosfati in uronska kislina, so topni sladkorji v
rastlinah. Škrob in celuloza pa sta netopni obliki ogljikovih hidratov (Prado in sod., 1998,
str. 58).
Sladkorji so jeseni in pozimi shranjeni v obliki zaloţnih sladkorjev za nadaljnjo uporabo
spomladi, ko se začne rast. Takrat se saharoza transportira na mesto porabe (ponor), kjer se
hidrolizira v redukcijske oblike sladkorjev, ki se nato uporabijo v metaboličnih procesih in
tako zagotovijo potrebno energijo za rast. Zato je jeseni v rastlinskih tkivih veliko
zaloţnega sladkorja, redukcijskih sladkorjev pa zelo malo. Spomladi, ko poganjajo
poganjki, pa je v rastlinah prisotna velika količina redukcijskih sladkorjev.
Eden večjih izzivov za rastlinske biokemike je vprašanje, kako nastajajo produkti
fotosinteze v kloroplastih in kako je njihova biosinteza povezana z metabolizmom v celici
in v drugih rastlinskih organih (Taiz in Zeiger, 2010, str. 224). Danes vemo, da je
poznavanje statusa ogljikovih hidratov v rastlinah zelo pomembno za razumevanje
številnih biokemičnih procesov, ki se odvijajo v rastlinah (Prado in sod., 1998, str. 58).
Zanimivo je, da stres vpliva na nivo redukcijskih sladkorjev v rastlinah. Različni okoljski
stresni dejavniki vplivajo na metabolizem sladkorjev in razporejanje fotoasimilatov v
rastočih rastlinah, kar vodi v akumulacijo topnih sladkorjev v tkivih. Akumuliranje
sladkorjev pod vplivom stresa prispeva k osmoregulaciji in ima pomembno vlogo pri
zaščiti biomolekul in membran (Jha in Dubey, 2005, str. 342). Tretiranje kalic s teţko
kovino arzenom povzroči povečano akumulacijo topnih sladkorjev, tudi redukcijskih. Tako
stresni dejavniki, kot so slanost, navzočnost teţkih kovin, npr. arzena ali kadmija, povečajo
akumulacijo topnih sladkorjev in s tem prispevajo k vzdrţevanju osmotskega ravnovesja v
celicah, mobilizirane rezerve ogljikovih hidratov pa naj bi omogočale podporo bazalnega
metabolizma v stresnem okolju (Jha in Dubey, 2005, str. 346).
Namen diplomske seminarske naloge je vpeljava metode za določanje redukcijskih
sladkorjev v rastlinskem tkivu. Redukcijski sladkorji poleg saharoze spadajo med topne
sladkorje in so tisti sladkorji, ki so prvi produkti fotosinteze ali se sproščajo iz zaloţnih
sladkorjev. Zanje je značilno, da imajo prosto aldehidno (glukoza na 1. C atomu) ali keto
(fruktoza na 2. C atomu) skupino. Ta aldehidna skupina je reducent, ki reducira baker
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
3
(Cu2+
+ e- → Cu
+) v bazičnem okolju, zato morajo biti ti sladkorji sposobni preiti v
aciklično obliko (Boyer, 2005, str. 186).
Glukozo, ki ima aldehidno skupino, uvrščamo med aldoze in jo je mogoče oksidirati v
karboksilno kislino (Gros in sod., 2010). Sposobnost redukcije ogljikovih hidratov je
odvisna od prisotnosti aldehidne ali keto skupine, to pa lahko dokaţemo s preprostim
kemijskim preizkusom s Fehlingovim reagentom. Ta vsebuje bakrove(II) ione (Cu2+
), ki se
reducirajo do bakrovega(I) oksida (Cu+), ki ga prepoznamo po rjavo-oranţni oborini
bakrovega oksida (Cu2O) (Bavec in sod., 2008, str. 25). Saharoza spada med neredukcijske
sladkorje. Ti lahko imajo namesto ketonske aldehidno funkcionalno skupino, ki ne more
reducirati bakrovih(II) ionov, zato ti sladkorji pri uporabi Fehlingove raztopine ne
povzročijo nastanka obarvane oborine (Gros in sod., 2010).
Na vajah pri predmetu Fitofiziologija smo do sedaj izvajali samo kvalitativen dokaz za
prisotnost redukcijskih sladkorjev. V naši nalogi pa smo ţeleli poleg kvalitativne metode
uvesti metodo za kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev, in sicer takšno, ki jo je
mogoče izvesti s pomočjo obstoječe opreme. Pri tem smo imeli v mislih spektrofotometer
SpectroVis proizvajalca Vernier, ki ga pogosto vključujejo v laboratorijsko delo v srednjih
šolah.
Izmed metod za določanje redukcijskih sladkorjev z uporabo spektrofotometra (Nelson-
Somogyijeva metoda, antronska metoda, metoda z DNS reagentom) smo se odločili za
vpeljavo take, ki čim bolje ustreza naslednjim kriterijem: ni omejena na določeno skupino
sladkorjev, kot so aldoze, pentoze, ketoze, uronska kislina; ne vsebuje strupenih kemikalij,
ki so jedke in draţilne; ne zahteva časovno potratne ter teţavne priprave vzorcev. Zaradi
potrebe po hitri, enostavni, natančni, varni in finančno nezahtevni metodi za določanje
koncentracije redukcijskih sladkorjev v rastlinskem tkivu je namen te diplomske
seminarske naloge poiskati in razviti najustreznejšo metodo z uporabo spektrofotometra.
1.1 Namen diplomske seminarske naloge
Namen diplomske seminarske naloge je poiskati kvantitativne metode za določanje
redukcijskih sladkorjev in izmed najdenih metod izbrati tisto, ki je v vseh pogledih
najprimernejša za izvajanje v gimnaziji in na fakulteti. Biti mora dovolj natančna, ne
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
4
preveč dolga in zahtevna, sistematična, z uporabo manj strupenih kemikalij in
instrumentov, ki so dosegljivi vsaki gimnaziji in fakulteti.
1.2 Cilji diplomske seminarske naloge
Cilji diplomske seminarske naloge so:
poiskati kvantitativno metodo za določanje redukcijskih sladkorjev v rastlinskem
tkivu, jo preizkusiti in dodelati;
preizkusiti najdeno metodo pri vajah iz Fitofiziologije skupaj s študenti 4. letnika
smeri Biologija in ... ter študenti 3. letnika programa Ekologija z naravovarstvom;
na podlagi anketnega vprašalnika, ki so ga izpolnili študenti, vključeni v raziskavo,
narediti evalvacijo metode.
1.3 Hipoteza
Pred samim preizkusom metode smo postavili dve delovni hipotezi:
metoda je dovolj natančna, da zazna redukcijske sladkorje poleg čebule tudi v travi;
med redukcijskima sladkorjema glukozo in fruktozo bo prve v rastlinskih ekstraktih
bistveno več.
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
5
2 TEORETIČNE OSNOVE
2.1 Ogljikovi hidrati v rastlinah
Ogljikovi hidrati so najbolj pogoste organske molekule v naravi in so primarne molekule
za shranjevanje energije v večini ţivečih organizmov. Poleg tega lahko tvorijo različne
strukturne komponente ţivih celic (Raven in Echhorn, 2005, str. 16).
Ogljikovi hidrati so naravne organske snovi, zgrajene iz ogljika, vodika in kisika v
razmerju 1 : 2 : 1. Njihova splošna formula se glasi (CH2O)n, kjer je n ≥ 3 (Voet in sod.,
2002, str. 196).
Najenostavnejši ogljikovi hidrati so majhne molekule, poznane pod imenom sladkorji.
Večji ogljikovi hidrati so sestavljeni iz več sladkorjev. Razlikujemo med tremi glavnimi
skupinami ogljikovih hidratov, ki so klasificirane glede na število enot sladkorja:
monosaharidi ali enostavni sladkorji, kot so riboza, glukoza in fruktoza, ki so
sestavljeni iz ene same molekule sladkorja;
disaharidi ali sestavljeni sladkorji iz dveh sladkorjev, kot so saharoza (pesni ali
trsni sladkor, tudi namizni sladkor), maltoza (sladni sladkor) in laktoza (mlečni
sladkor), ki so sestavljeni iz dveh kovalentno povezanih molekul sladkorja, in
polisaharidi ali sestavljeni sladkorji iz več molekul sladkorjev (Raven in Echhorn,
2005, str. 16).
2.1.1 Monosaharidi
Monosaharidi ali enostavni sladkorji so najenostavnejši ogljikovi hidrati. So aldehidni ali
ketonski derivati iz linearne verige polihidroksi alkoholov, ki vsebuje vsaj tri ogljikove
atome (Boyer, 2005, str. 180). Slika 1 prikazuje molekularno shemo fruktoze, glukoze in
galaktoze.
Slika 1: Monosaharidi (a) fruktoza, (b) glukoza, (c) galaktoza
(Medical Physiology/Basic Biochemistry/Sugars: Reference. (2010). Prevzeto 24. april 2011 iz The Full Wiki:
http://www.thefullwiki.org/Medical_Physiology/Basic_Biochemistry/Sugars)
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
6
Aldehid je spojina, pri kateri je C atom karbonilne skupine vezan na vsaj en H atom, keton
pa je spojina, pri kateri je C atom karbonilne skupine vezan na dve ogljikovi skupini.
Klasificirani so glede na kemijsko naravo njihove karbonilne skupine, to je ogljikov atom z
dvojno vezjo, vezan na kisikov atom, in število C atomov, ki jih sestavljajo. Če je
karbonilna skupina aldehid, se sladkor imenuje aldoza, če pa je karbonilna skupina keton,
se sladkor imenuje ketoza (Voet in sod., 2002, str. 196). To so torej spojine z empirično
formulo (CH2O)n, ki imajo eno samo aldehidno skupino ali keto skupino ter več
hidroksilnih skupin. Med najmanjše ogljikove hidrate sodijo trioze, ki imajo 3 atome
ogljika. V to skupino ogljikovih hidratov uvrščamo gliceraldehid (GA) (ogljikov hidrat z
aldehidno skupino) in dihidroksiaceton (DHA) (ogljikov hidrat s keto skupino). Slika 2
prikazuje obe obliki trioz. Večina monosaharidov ima eno hidroksilno skupino na vsakem
ogljikovem atomu razen na tistem, ki ima karbonilno skupino (aldehid ali keton).
Gliceraldehid obstaja v dveh stereoizomerih, kar označujeta predponi D- in L-, ki
predstavljata absolutno konfiguracijo. V naravi je gliceraldehid v konfiguraciji D- in ga
uporabljamo kot standard za določanje konfiguracije D- in L- pri drugih molekulah s
kiralnim centrom (Boyer, 2005, str. 180).
Slika 2: (a) Dihidroksiaceton, (b) D-gliceraldehid in (c) L-gliceraldehid
(Carbohydrates and their chemistry. (2008). Prevzeto 23. april 2011 iz Tutornext: http://www.tutornext.com/carbohydrates-their-
chemistry/2923)
Pri tetrozah s 4 atomi ogljika poznamo dve aldozi, eritrozo in treozo ter eno ketozo,
eritrulozo. Monosaharidi s 5, 6 in 7 atomi ogljika se imenujejo pentoze, heksoze oziroma
heptoze. Tudi pri njih ločimo aldoze in ketoze. Z naraščanjem števila ogljikovih atomov
narašča tudi število moţnih stereoizomerov. Slika 3 prikazuje vse moţne stereoizomere D-
aldoz od n = 3 do n = 6. D-riboza in D-2-deoksiriboza sta najbolj razširjeni aldopentozi in
sta komponenti RNA in DNA. D-glukoza, D-manoza in D-galaktoza so najbolj razširjene
aldoheksoze. D-manoza in D-galaktoza sta epimera glukoze, saj se od D-glukoze
stereokemijsko razlikujeta samo pri enem kiralnem centru, in sicer C2 za manozo in C4 za
galaktozo. Najpomembnejša hektoheptoza je D-sedoheptuloza, ki jo prikazuje Slika 4 (a)
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
7
(Boyer, 2005, str. 181). Ima enako strukturo kot fruktoza, le da ima dodaten ogljikov atom.
Najdemo jo v korenju. D-manoheptulozo najdemo v avokadu (Zamora, 2011).
Slika 3: Shematski pregled D-aldoz
(Carbohydrates and their chemistry. (2008). Prevzeto 23. april 2011 iz Tutornext: http://www.tutornext.com/carbohydrates-their-
chemistry/2923)
Slika 4: D-sedoheptuloza in D-manoheptuloza
(Zamora, A. (2011). Carbohydrates – Chemical Structure. Prevzeto 24. april 2011 iz Scientific Psychic:
http://www.scientificpsychic.com/fitness/carbohydrates.html)
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
8
Slika 5 prikazuje vse moţne stereoizomere D-ketoz od n = 3 do n = 6. Vse prikazane
ketoze imajo ob tistem kiralnem centru, ki je najbolj oddaljen od karbonilne skupine,
enako absolutno konfiguracijo kot D-gliceraldehid (D-GA) na C2. D-fruktoza je v naravi
najbolj razširjena ketoza (Boyer, 2005, str. 181).
Slika 5: Shematski pregled D-ketoz
(Carbohydrates and their chemistry. (2008). Prevzeto 23. april 2011 iz Tutornext: http://www.tutornext.com/carbohydrates-their-
chemistry/2923)
2.1.1.1 Redukcijski sladkorji
Ogljikovi hidrati vstopajo v številne oksidoredukcijske reakcije. Mnoge od njih so del
metabolične razgradnje do CO2 in H2O in so biološko pomembne, nekatere pa lahko
uporabljamo za identifikacijo in analizo ogljikovih hidratov (Boyer, 2005, str. 186).
Mnogi oksidanti, med katerimi je najbolj poznan Fehlingov reagent, se uporabljajo za
identifikacijo redukcijskih sladkorjev. Slika 6 prikazuje oksidacijo glukoze s Fehlingovim
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
9
reagentom. Pri vseh sladkorjih je za oksidacijo najbolj občutljiva aldehidna skupina, saj
imajo aldehidi na karbonilno skupino poleg radikala vezan še vodikov atom, medtem ko
imajo ketoni vezana le dva radikala. Redukcijski sladkorji so tisti, ki imajo prosto
aldehidno ali keto skupino. Ta skupina je reducent, zato morajo biti ti sladkorji sposobni
preiti v aciklično obliko (Boyer, 2005, str. 186).
Slika 6: Fehlingov test z glukozo
(Tausch, M. W. (brez datuma). Hydrolysis of β-Cyclodextrin and Detection of the Degradation Product. Prevzeto 24. april 2011 iz
Chemie und ihre Didaktik: http://www.chemiedidaktik.uni-wuppertal.de/disido_cy/cyen/exp/03_hydrolyse.htm)
V celici encimi za katalizacijo redukcijskih ogljikovih sladkorjev potrebujejo koencim
NADH ali NADPH. Deoksisladkorji so ena od oblik reduciranih ogljikovih hidratov. Ti
imajo vodik namesto kakšne od hidroksilnih skupin. Nastajajo v celici pri redukciji s
pomočjo NADPH in encimov oksidoreduktaze oziroma dehidrogenaze. Najpomembnejša
je 2-deoksiriboza, ki je sestavni del DNA (Boyer, 2005, str. 187).
2.1.2 Disaharidi
Disaharid saharoza je transportna oblika sladkorja v rastlinah. Čeprav je glukoza
večinoma transportni sladkor v mnogih ţivalih, so sladkorji v rastlinah pogosto
transportirani kot disaharidi. Saharoza je sestavljena iz glukoze in fruktoze (Raven in
Echhorn, 2005, str. 17). Glukoza in fruktoza vsebujeta redukcijsko aldehidno ali keto
skupino, ki je v saharozi spremenjena v alkoholno skupino ali kombinirana s podobno
skupino drugega sladkorja. Saharoza je glavna transportna oblika sladkorja najverjetneje
zato, ker je manj reaktivna kot njene redukcijske komponente (Taiz in Zeiger, 2010, str.
224). To je oblika, v kateri so sladkorji v rastlinah transportirani iz fotosintetskih celic
(primarno v listih), kjer so sintetizirani, do drugih delov rastlin. Saharoza, ki jo uţivamo
kot namizni sladkor, je komercialno pridelek iz sladkorne pese in sladkornega trsa, kjer se
kot zaloţna oblika sladkorja ne akumulira škrob, ampak kar saharoza (Raven in Echhorn,
2005, str. 17).
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
10
Pri sintezi disaharida iz dveh molekul monosaharida se odcepi voda in formira nova vez
med molekulama monosaharida. Kemično reakcijo, pri kateri nastane disaharid iz dveh
monosaharidov (na primer saharoza iz glukoze in fruktoze), imenujemo dehidratacijska
sinteza ali kondenzacijska reakcija. Formacija večine organskih polimerov iz njihovih
podenot je povzročena z dehidracijsko sintezo (Raven in Echhorn, 2005, str. 17).
Pri obratni reakciji, na primer, ko se disaharid razcepi na svoje monosaharidne podenote,
se doda molekula vode. Ta cepitev, ki se zgodi, kadar je disaharid uporabljen kot vir
energije, je poznana pod imenom hidroliza. Hidrolizne reakcije so energijsko potratni
procesi, ki so pomembni pri energijskemu transferu v celicah (Raven in Echhorn, 2005, str.
17). Slika 7, Slika 8 in Slika 9 prikazujejo molekularno shemo treh najpogostejših
disaharidov: saharoze, laktoze in maltoze.
Slika 7: Saharoza
(Carbohydrates and their chemistry. (2008). Prevzeto 23. april 2011 iz Tutornext: http://www.tutornext.com/carbohydrates-their-
chemistry/2923)
Slika 8: Laktoza
(Carbohydrates and their chemistry. (2008). Prevzeto 23. april 2011 iz Tutornext: http://www.tutornext.com/carbohydrates-their-
chemistry/2923)
Slika 9: Maltoza
(Carbohydrates and their chemistry. (2008). Prevzeto 23. april 2011 iz Tutornext: http://www.tutornext.com/carbohydrates-their-
chemistry/2923)
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
11
Maltoza je disaharid, zgrajen iz dveh podenot glukoznih monomerov. Prisotna je v
kalečem ţitu, koruznem sirupu in je produkt deloma hidroliziranega škroba. Je redukcijski
sladkor in jo lahko tako kot glukozo in fruktozo uporabimo kot standard za določanje
redukcijskih sladkorjev v neznanem vzorcu (Construction of maltose standard curve by
DNS method, 2010).
2.1.3 Polisaharidi
Polisaharidi so dolge linearne ali razvejane molekule z več sto ali tisoč monosaharidnimi
enotami. Razlikujemo med rezervnimi in strukturnimi polisaharidi (Bavec in sod., 2008,
str. 23).
2.1.3.1 Rezervni polisaharidi
Rastlinski škrob in ţivalski glikogen sodita med v naravi najbolj razširjene rezervne
polisaharide (Bavec in sod., 2008, str. 23). Ta dva polisaharida sta v celicah shranjena kot
citosolni delci, imenovani granule. Škrob je v kloroplastih rastlinskih celic, kjer nastaja z
uporabo energije, ki jo celica pridobi pri fotosintezi, glikogen pa najdemo v jetrih in
mišičnih celicah ţivali. Oba polisaharida imata veliko hidroksilnih skupin, zato z
vodikovimi vezmi veţeta veliko vode (Boyer, 2005, str. 193). Med rezervne polisaharide
sodita še dekstran in inulin, ker pa se ta diplomska seminarska naloga tiče rastlinskih
ogljikovih hidratov, bomo v nadaljevanju podrobneje opisali le škrob.
Škrob je primarni zaloţni polisaharid v rastlinah. Glede na količino ga prekaša samo
celuloza. Kloroplasti so mesto sinteze škroba v listih (Taiz in Zeiger, 2010, str. 225).
Zgrajen je iz verig glukoznih molekul, kar prikazuje Slika 10. Sestavljata ga dve
komponenti:
amiloza, ki je nerazvejan polimer D-glukoz, ki so povezane z α(1→4) O-
glikozidnimi vezmi, in
amilopektin, ki je razvejan polimer D-glukoz, ki so povezane z α(1→4) O-
glikozidnimi vezmi, vsakih 24–30 glukoznih enot pa še z α(1→6) O-glikozidno
vezjo.
Amiloza in amilopektin se skladiščita v obliki škrobnih zrn znotraj rastlinskih celic (Raven
in Echhorn, 2005, str. 17).
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
12
Slika 10: Škrob in glikogen
(Carbohydrates and their chemistry. (2008). Prevzeto 23. april 2011 iz Tutornext: http://www.tutornext.com/carbohydrates-their-
chemistry/2923)
V ţitu, kot so na primer pšenica, rţ in ječmen, so polimeri fruktoze, imenovani fruktani,
glavni zaloţni polisaharidi v listih in steblih. Ti polimeri so vodotopni in se lahko
skladiščijo v veliko večjih koncentracijah kot škrob (Raven in Echhorn, 2005, str. 17).
Polisaharidi morajo biti hidrolizirani v monosaharide in disaharide, preden so lahko
uporabljeni kot vir energije ali transportirani po ţivih sistemih. Rastline razcepijo svoje
škrobne rezerve, ko potrebujejo monosaharide in disaharide za svojo rast in razvoj (Raven
in Echhorn, 2005, str. 17).
2.1.3.2 Strukturni polisaharidi
Polisaharidi so prav tako pomembni strukturni gradniki. V rastlinskem svetu je najbolj
razširjen strukturni polisaharid celuloza. Je glavna strukturna komponenta lesa in
rastlinskih vlaken (Boyer, 2005, str. 196). Kar polovica vsega organskega ogljika ţivega
sveta vsebuje celulozo, kar jo uvršča med najbolj razširjene organske komponente, kar jih
poznamo. Les je na primer iz 50 % celuloze, bombaţna vlakna pa so skoraj čista celuloza
(Raven in Echhorn, 2005, str. 17). Med strukturne polisaharide sodijo še agar, hitin,
peptidoglikan, hialuronska kislina in hondroitin, več pozornosti pa bomo namenili celulozi,
ki je pomemben gradnik celičnih sten rastlinskih celic. Strukturo celuloze prikazuje
Slika 11.
Slika 11: Celuloza
(Carbohydrates and their chemistry. (2008). Prevzeto 23. april 2011 iz Tutornext: http://www.tutornext.com/carbohydrates-their-
chemistry/2923)
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
13
Celuloza je polimer, zgrajen iz monomerov glukoze, kot sta škrob in glikogen, vendar med
njimi obstaja pomembna razlika. Škrob in glikogen sta lahko takoj uporabljena kot vir
energije za skoraj vse vrste ţivečih organizmov, a le nekaj mikroorganizmov (nekateri
prokarioti, protozoi in fungi) ter le redke ţivali, kot je na primer srebrna ribica (Lepisma
saccharina), so sposobni sami hidrolizirati celulozo. Govedo, termiti in ščurki lahko
uporabijo celulozo kot vir energije le zato, ker je ta razgrajena s pomočjo
mikroorganizmov, ki ţivijo v njihovih prebavnih trakovih (Raven in Echhorn, 2005, str.
17).
Da bi razumeli razliko med strukturnimi polisaharidi, kot je celuloza, in rezervnimi
polisaharidi, kot je škrob ali glikogen, moramo ponovno pogledati zgradbo molekule
glukoze. Molekula glukoze je pravzaprav veriga šestih atomov ogljika, in kadar je v
raztopini, kot je to na primer v celici, prevzame obliko obroča. Ena oblika obroča je
poznana kot α-glukoza, druga pa kot β-glukoza. α in β obliki sta v ravnovesju z določenim
številom molekul, ki ves čas spreminjajo obliko iz ene v drugo, ter z verigo kot
posrednikom. Škrob in glikogen sta oba v celoti zgrajena iz α-glukoznih podenot, medtem
ko je celuloza v celoti zgrajena iz β-glukoznih podenot. Ta na pogled majhna razlika ima
velik učinek na tridimenzionalno strukturo molekul celuloze, ki so dolge in nerazvejane.
Kot rezultat tega je celuloza nerazgradljiva za encime, ki zlahka razgradijo škrob in
glikogen. Ko so molekule glukoze enkrat vgrajene v rastlinsko celično steno v obliki
celuloze, niso več dosegljive rastlinam kot vir energije (Raven in Echhorn, 2005, str. 18).
Molekule celuloze tvorijo fibrilni del rastlinske celične stene. Dolge, toge molekule
celuloze se veţejo v mikrofibrile. Vsaka mikrofibrila sestoji iz na stotine verig celuloze. V
celičnih stenah rastlinskih celic so celulozne mikrofibrile vgrajene v matriks, ki vsebuje še
dve drugi sestavini, hemicelulozo in pektin (Raven in Echhorn, 2005, str. 18).
Hemiceluloze so polisaharidi, ki zapolnjujejo celulozno ogrodje ter so na celulozne
mikrofibrile vezani z vodikovimi vezmi. Hemiceluloze poveţejo mikrofibrile v mreţo in
tako stabilizirajo celično steno. Pektini so zelo heterogeni, razvejeni in močno hidrirani
polisaharidi z veliko galakturonske kisline. Pektini določajo poroznost stene, zagotavljajo
nabito površino, regulirajo povezovanje med celicami v območju osrednje lamele in
delujejo kot prepoznavne molekule, ki opozorijo celico na prisotnost simbiontskih
organizmov, patogenov ali ţuţelk (Dermastia, 2007, str. 42). Zgradbo rastlinske celične
stene prikazuje Slika 12.
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
14
Slika 12: Zgradba rastlinske celične stene
(Sticklen, M. B. (2008). Scitable. Nature Education. Prevzeto 23. maj 2011 iz Plant genetic engineering for biofuel production: towards
affordable cellulosic ethanol. Nature Reviews Genetics 9, 433–443: http://www.nature.com/scitable/content/plant-plasma-membrane-
and-cell-wall-structure-14713218)
2.2 Sinteza ogljikovih hidratov v Calvinovem ciklu
Zelene rastline porabljajo ATP in NADPH, ki sta produkta svetlobne reakcije fotosinteze,
za pretvorbo anorganskega ogljika iz CO2 v preproste organske spojine v ogljikovih
reakcijah fotosinteze. Te nato uporabijo za sintezo glukoze, saharoze, škroba in drugih
ogljikovih hidratov. Za ogljikove reakcije fotosinteze neposredno ni potrebna svetloba,
pomembna pa sta produkta svetlobnih reakcij fotosinteze – ATP in NADPH, pri čemer
med ogljikovimi atomi nastanejo nove vezi, anorganski CO2 pa se reducira in vgradi v
novonastajajoče sladkorje aldehide in alkohole. Reakcije, ki sestavljajo te metabolične
procese, imenujemo Calvinov cikel, ki ga prikazuje Slika 13 (Boyer, 2005, str. 478).
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
15
Slika 13: Calvinov cikel
(Cellular Processes. Step 2: Calvin Cycle. (brez datuma). Prevzeto 23. maj 2011 iz Cellupedia:
http://library.thinkquest.org/C004535/calvin_cycle.html)
3-fosfoglicerat (3P-GA) nastaja v reakciji, ki jo katalizira encim ribuloza-1,5-bifosfat-
karboksilaza/oksigenaza (RuBisCO). Encim katalizira adicijo CO2 na ribuloza-1,5-
bifosfatu in s tem omogoči vezavo anorganskega ogljika v organske molekule. Nastane
nestabilni intermediat s šestimi ogljikovimi atomi, ki razpade na dve molekuli 3-
fosfoglicerata, spojine s tremi ogljikovimi atomi. To fazo Calvinovega cikla imenujemo
faza karboksilacije (Boyer, 2005, str. 478–479).
Druga faza Calvinovega cikla se imenuje faza redukcije. 3-fosfoglicerat, ki nastaja v stromi
kloroplastov, se v metabolični poti, ki je podobna obratni poti glikolize, porabi za sintezo
glukoze. Pri fosforilaciji karboksilne skupine (C1) 3-fosfoglicerata nastane 1,3-
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
16
bifosfatglicerat (1,3-P-GA). Ta se reducira z reakcijo, ki jo katalizira encim gliceraldehid-
3-fosfat-dehidrogenaza (GA-3-P-dehidrogenaza), ki potrebuje koencim NADPH. Ta
koencim je v analogni reakciji pri glukogenezi, ki poteka v citosolu, NADH. Nastane
gliceraldehid-3-fosfat (GA-3-P) (Boyer, 2005, str. 479).
Sinteza ogljikovih hidratov iz gliceraldehid-3-fosfata poteka tako kot pri glukogenezi. Med
ogljikovimi hidrati, ki jih sintetizirajo rastline, so pomembnejši monosaharida glukoza in
fruktoza, disaharid saharoza, rezervni polisaharid škrob in strukturni polisaharid celuloza.
Glukoza in fruktoza nastajata kot fosforilirana derivata glukoza-1-fosfat (G-1-P) ali
glukoza-6-fosfat (G-6-P) in fruktoza-6-fosfat (F-6-P). Fosforilirani monosaharidi se
porabijo za sintezo disaharida saharoze ali za sintezo škroba. Saharoza nastane iz UDP-
glukoze in fruktoza-6-fosfata. Večina saharoze nastaja v citosolu rastlinskih celic iz DHA-
P, ki se v citosol prenese iz strome kloroplastov. Škrob se sintetizira s postopnim
dodajanjem aktivirane glukoze (ADP-glukoza) na ţe obstoječe polisaharidne verige škroba
(Boyer, 2005, str. 480).
Calvinov cikel se zaključi v zadnji vazi regeneracije ribuloze-1,5-bifosfata. Da
nadomestimo šest ogljikovih atomov, ki so se porabili za sintezo ene molekule glukoze, se
mora Calvinov cikel šestkrat ponoviti. Pri tem v cikel vsakokrat vstopi nova molekula
CO2. Za vsako molekulo CO2, ki se vgradi v ogljikov hidrat, se porabijo tri molekule ATP
in dve molekuli NADPH. Le dve od dvanajstih molekul gliceraldehid-3-fosfata zapustita
ciklus in se porabita za sintezo nove molekule glukoze. Preostalih deset molekul
gliceraldehid-3-fosfata pa se v seriji reakcij porabi za regeneracijo šestih molekul ribuloza-
1,5-bifosfata. V reakciji transketolacija pride do prenosa enote z dvema ogljikovima atoma
s ketoze na aldozo. Tako nastane nova aldoza in ketoza (Boyer, 2005, str. 480).
Vse reakcije Calvinovega cikla lahko zapišemo v obliki spodnje enačbe (Boyer, 2005, str.
481):
6 CO2 + 12 NADPH + 12 H+ + 18 ATP + 12 H2O C6H12O6 + 12 NADP
+ + 18 ADP + 18 Pi
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
17
2.3 Spektrometrija
Vse metode, ki nam dajo določene odgovore o kvaliteti in kvantiteti izoliranih molekul in
njihovih lastnostih, navadno prištevamo med fizikalnoanalitske metode. Te metode so
različne vrste kromatografije, elektroforeze in spektrometrije (Turk in sod., 1997, str. 68).
Spektrometrija izkorišča razliko v optičnih lastnostih molekul v različnih področjih
elektromagnetnega spektra. Med te metode uvrščamo (Turk in sod., 1997, str. 68):
ultravijolično (UV) spektrometrijo,
vizualno (VIS) spektrometrijo (kolorimetrijo),
infrardečo (IR) spektrometrijo,
ramensko spektrometrijo,
cirkularni dikroizem (CD) in optično rotacijsko disperzijo (ORD),
fluorescenco.
Najbolj uporabni in razširjeni med njimi sta UV in VIS spektrometriji, s katerima merimo
absorpcijo svetlobe neke čiste snovi v področju ultravijoličnega in vidnega dela
svetlobnega spektra (Sepčić, 2004, str. 59).
Pojav same absorpcije temelji na dejstvu, da molekule absorbirajo svetlobo, kar pa je
odvisno od njihove strukture in okolja, ki jih obdaja (Anderluh in sod., 2009, str. 93).
2.3.1 Elektromagnetno valovanje
Svetlobo lahko opišemo kot elektromagnetno valovanje. Ti elektromagnetni valovi se
sinusno širijo skozi prostor. Kadar tako valovanje zadene ob molekulo, se svetloba odkloni
ali absorbira (Anderluh in sod., 2009, str. 93). Slika 14 prikazuje spekter
elektromagnetnega valovanja.
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
18
Slika 14: Spekter elektromagnetnega valovanja
(Sašo. (24. oktober 2004). Kvarkadabra. Časopis za tolmačenje znanosti. Prevzeto 24. maj 2011 iz Spekter elektromagnetnega
valovanja: http://www.kvarkadabra.net/mediagallery/popup.php?s=20060326214527911&sort=0)
Frekvenca elektromagnetnega valovanja (ν) je v relaciji z njegovo valovno dolţino (λ) in s
hitrostjo svetlobe (c) (Pingoud in sod., 2002, str. 239):
kjer je:
λ valovna dolţina (cm),
c hitrost svetlobe (3 · 1010
cm/s),
ν frekvenca (št./s ali Hz).
Človeško oko lahko zazna svetlobo v razmeroma kratkem obsegu valovnih dolţin, in sicer
med 400 nm in 800 nm. Energija valovanja enega fotona je podana z enačbo (Pingoud in
sod., 2002, str. 240):
ki jo v skladu z enačbo
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
19
preuredimo in dobimo:
kjer je:
h Planckova konstanta (6,6 · 10-34
Js),
c svetlobna hitrost (3,0 · 108 m/s),
λ valovna dolţina (nm).
Iz tega je razvidno, da ima svetloba s krajšo valovno dolţino večjo energijo od svetlobe z
daljšo valovno dolţino.
Hmelak Gorenjakova (2010, str. 43) navaja: »Osnova spektrometrične metode je, da vzorec
raztopine absorbira elektromagnetno valovanje iz izvora energije.« Količina absorbirane
energije je sorazmerna koncentraciji snovi v raztopini (Hmelak Gorenjak, 2010, str. 43).
2.3.2 Kvantitativno vrednotenje
Del svetlobnega valovanja, ki ga absorbira neka snov v raztopini, lahko poveţemo s
koncentracijo te snovi v raztopini (Hmelak Gorenjak, 2010, str. 46). Na podlagi teh
zakonitosti lahko s pomočjo spektrometra kvantitativno določimo koncentracijo snovi v
raztopini. Raztopina mora biti pri tem popolnoma bistra.
Skozi kiveto, v kateri imamo neko raztopino, vodimo svetlobo točno določene valovne
dolţine z intenziteto I0. Del te svetlobe se bo v raztopini absorbiral, del pa preseval skozi
kiveto. Slepi vzorec pripravimo zato, da umerimo intenziteto vhodnega ţarka (I0), saj pri
prehodu svetlobe skozi raztopino prihaja poleg absorpcije svetlobe še do drugih fizikalnih
pojavov (Hmelak Gorenjak, 2010, str. 46).
Če presvetlimo raztopino določene snovi z monokromatsko svetlobo intenzitete I0 in če
snov svetlobo absorbira, bo imela prepuščena svetloba manjšo intenziteto I (glej Sliko 15),
to razmerje med intenzitetama prepuščene in vpadne svetlobe pa imenujemo transmitanca
(T) (Anderluh in sod., 2009, str. 94).
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
20
Slika 15: Prehajanje svetlobe skozi kiveto
(Taiz, L. in Zeiger, E. (2010). Principles of Spectrophotometry. Prevzeto 6. junij 2011 iz Plant Physiology:
http://5e.plantphys.net/image.php?id=70)
Transmitanca je torej del svetlobe, prepuščene skozi homogeni vzorec. Enaka je razmerju
med intenziteto izhodnega ţarka oziroma intenziteto vpadne svetlobe (I) in intenziteto
vhodnega ţarka oziroma intenziteto prepuščene svetlobe (I0) (Hmelak Gorenjak, 2010, str.
46):
kjer je:
T transmitanca,
I intenziteta izhodnega ţarka,
I0 intenziteta vhodnega ţarka,
k konstanta,
l dolţina poti svetlobe v raztopini.
To enačbo lahko v logaritemski obliki zapišemo kot:
( )
Leta 1852 sta Beer in Bernard ugotovila, da tudi ob upoštevanju koncentracije (c) velja
podobna odvisnost. Beerov zakon opisuje povezavo transmitance s koncentracijo raztopine
in dolţino poti (Hmelak Gorenjak, 2010, str. 47):
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
21
( )
Eksponentno zvezo lahko z logaritmiranjem in uvedbo pojma absorbance (A)
pretvorimo v linearno obliko (Hmelak Gorenjak, 2010, str. 47). Dobljeno zvezo
imenujemo Beer-Lambertov zakon, ki opisuje zvezo med absorbanco in koncentracijo
snovi v kiveti. Pravi, da je velikost absorbance (A) premo sorazmerna s koncentracijo snovi
(c), dolţino optične poti svetlobnega ţarka (l) in molarnim ekstinkcijskim koeficientom (ε),
ki je značilen za določeno snov (Anderluh in sod., 2009, str. 94).
Absorbanca je brez enote. Dolţina optične poti (l), ki jo merimo v cm, in molarni
ekstinkcijski koeficient (ε) [cmˉ1 molˉ
1 L] sta pri določanju koncentracije neke snovi
konstantna (Hmelak Gorenjak, 2010, str. 47).
Absorbanca je s transmitanco povezana:
Če ţelimo izmeriti koncentracijo neke snovi v raztopini, moramo prej pripraviti standardne
raztopine, narisati umeritveno krivuljo in iz nje odčitati koncentracijo snovi, saj nam
podatek o absorbanci neke snovi v vzorčni raztopini še ne da podatka o njeni koncentraciji
(Hmelak Gorenjak, 2010, str. 47).
Slika 16 prikazuje shemo spektrofotometra. Njegove komponente so vir svetlobe,
monokromator s prizmo, s katerim izbiramo valovno dolţino, nosilec za vzorec,
fotodetektor in snemalnik ali računalnik. Valovno dolţino svetlobe spreminjamo z
obračanjem prizme v monokromatorju. Graf absorbance (A) v odvisnosti od valovne
dolţine (λ) imenujemo spekter (Taiz in Zeiger, 2010, str. 166).
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
22
Slika 16: Shematski prikaz spektrofotometra
(Taiz, L. in Zeiger, E. (2010). Principles of Spectrophotometry. Prevzeto 7. junij 2011 iz Plant Physiology:
http://5e.plantphys.net/image.php?id=71)
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
23
3 MATERIAL IN METODE
Predmet raziskave v tej diplomski seminarski nalogi je določanje redukcijskih sladkorjev v
rastlinskem tkivu. Z omenjeno metodo smo ţeleli kvantitativno določiti količino
redukcijskih sladkorjev v rastlinskem tkivu. Ker je ta metoda nestandardna, deloma
improvizirana in pravzaprav temelj obravnave v tem delu, smo natančno napisali protokol
same izvedbe od materialov do rezultatov, tako da je to razumljivo tako dijakom in
študentom, ki imajo s to temo neposreden stik, kot tudi ostalim, ki bi jih stvar zanimala in
bi ţeleli metodo tudi sami preizkusiti. Metode od pridobivanja materiala do raziskovalnih
tehnik so tekom tega poglavja natančno opredeljene.
Klasična in najbolj uporabljana je Nelson-Somogyijeva metoda. Pri tej metodi redukcijski
sladkorji, ki jih segrevamo z alkaličnim bakrovim tartratom, reducirajo baker v bakrov
oksid. Posledica delovanja arzenmolibdenove kisline na bakrov oksid je redukcija
molibdenove kisline v molibden, ki je modre barve. Modro barvo nato primerjamo s
standardi raztopin v kolorimetru pri 620 nm (Sadasivam in Manickam, 2007, str. 5).
Alternativa Nelson-Somogyijevi metodi za kvantitativno oceno redukcijskih sladkorjev je
metoda z reagentom 3,5-dinitrosalicilne kisline (DNS reagentom), ki je preprosta,
občutljiva in sprejemljiva ter primerna za obdelavo večjega števila vzorcev v danem času
(Sadasivam in Manickam, 2007, str. 6), zato smo se odločili, da vpeljemo to metodo.
3.1 Kvantitativna ocena redukcijskih sladkorjev po metodi z DNS reagentom
(3,5-dinitrosalicilno kislino)
3.1.1 Priprava na izvedbo metode in varnostni ukrepi
Pred vsakim preizkusom se je nanj treba dobro pripraviti in se seznaniti z varnostnimi
ukrepi. V prilogi so zato priloţena navodila za varno delo z napravami, ki jih bomo
uporabili tekom preizkusa te metode, in sicer Navodilo za varno delo z analitsko tehtnico
(glej Prilogo A), Navodilo za varno delo z avtomatsko pipeto (glej Prilogo B) in Navodilo
za varno delo s spektrofotometrom SpectroVis (glej Prilogo C). Obvezen del laboratorijske
opreme so zaščitne rokavice in zaščitna halja.
Ker je ta metoda zelo natančna in občutljiva, je treba steklovino, pipete, tipse in ostali
pribor po koncu vsakega preizkusa dobro očistiti z detergentom, ga dobro sprati z vodo,
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
24
nazadnje pa tudi splakniti z destilirano vodo. Prav tako ne smemo pozabiti na čiščenje
delovne površine.
Na koncu preizkusa metode vse uporabljene raztopine zlijemo v posodo za posebne
odpadke, saj so nekatere izmed njih strupene in škodujejo okolju.
3.1.2 Material
Analizirani vzorec:
trava,
mesnati luskolisti čebule.
Pripomočki:
spektrofotometer SpectroVis (Vernier),
program LoggerPro3,
računalnik,
kivete,
vata,
puhalka z destilirano vodo,
1000 ml čaša za odpadno tekočino,
epruvete,
stojalo za epruvete,
pipete,
tipsi,
erlenmajerice s pokrovčki,
čaše,
lij,
filtrirni papir,
terilnica s pestilom,
noţek,
podlaga za rezanje,
vodna kopel (1000 ml čaša napolnjena z vodo do oznake 500 ml),
kuhalnik,
analitska tehtnica,
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
25
steklene palčke,
dozirne ţličke,
papirnate brisače,
alkoholni flomaster.
Kemikalije:
destilirana voda (H2O),
glukoza v prahu (C6H12O6),
fruktoza v prahu (C6H12O6),
3,5-dinitrosalicilna kislina (C7H4N2O7) (draţilno, Xi, Irritant),
natrijev hidroksid (NaOH) (strupeno, T, Toxic), (jedko, C, Corrosive),
kristalni fenol (C6H5OH) (strupeno, T, Toxic), (jedko, C, Corrosive),
natrijev sulfit (Na2O3S),
kalij-natrijev tartrat (C4H4KNaO6*4H2O).
3.1.3 Postopek
3.1.3.1 Priprava DNS reagenta (reagenta iz 3,5-dinitrosalicilne kisline)
V prvo 50 ml čašo natehtamo 1 g 3,5-dinitrosalicilne kisline, v drugo 200 mg
kristalnega fenola in v tretjo 50 mg natrijevega sulfita. Z alkoholnim flomastrom na
čaše napišemo njihovo vsebino. V 100 ml čašo natehtamo 1 g natrijevega
hidroksida in dopolnimo z destilirano vodo do oznake 100 ml. Dobro premešamo.
Tako dobimo 1% raztopino NaOH. Nekaj te raztopine vlijemo v čaše, v katere smo
prej natehtali kemikalije, in dobro premešamo. Raztopine iz vseh treh čaš vlijemo v
100 ml bučko. Vse tri čaše splaknemo z 1% raztopino NaOH in vse skupaj
prelijemo v 100 ml bučko. Preostanek 1% raztopine NaOH prelijemo v 100 ml
bučko. Bučko označimo z nalepko, na katero napišemo DNS reagent in datum.
Raztopino hranimo pri temperaturi 4 °C. V primeru daljšega hranjenja raztopine
lahko natrijev sulfit dodamo, ko bomo raztopino uporabili, saj natrijev sulfit ob
dolgem hranjenju poslabša kakovost reagenta (Sadasivam in Manickam, 2007, str.
6).
40% raztopino Rochellejeve soli (kalij-natrijevega tartrata) pripravimo tako, da v
50 ml čašo natehtamo 20 g kalij-natrijevega tartrata, dopolnimo z destilirano vodo
do oznake 50 ml in dobro premešamo. Raztopino hranimo v 50 ml bučki, ki jo
označimo z nalepko, na katero napišemo 40% Rochellejeva sol in datum
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
26
(Sadasivam in Manickam, 2007, str. 6). Preglednica 1 prikazuje natančna razmerja
kemikalij za pripravo DNS reagenta in Rochellejeve soli.
Preglednica 1: Priprava DNS reagenta
Kemikalije Količina
1% raztopina
NaOH
natrijev hidroksid 1 g
destilirana voda do oznake 100 ml
3,5-dinitrosalicilna kislina 1 g
kristalni fenol 200 mg
natrijev sulfit 50 mg
40% raztopina
Rochellejeve soli
kalij-natrijev tartrat 20 g
destilirana voda do oznake 50 ml
(Sadasivam, S. in Manickam, A. (avgust 2007). Biochemical Methods. Prevzeto 30. marec 2011 iz New Age International:
http://www.newagepublishers.com/samplechapter/000091.pdf)
Rochellejeva sol, ki je sestavni del DNS reagenta, ovira proaktivno delovanje sulfita,
vendar je nujno potrebna za obstojnost barve. Iz tega razloga jo dodamo mešanici
redukcijskih sladkorjev in DNS reagenta šele po tem, ko se razvije barva po tretiranju v
vreli vodni kopeli. Rochellejeva sol prepreči nastajanje reagenta iz raztopljenega kisika.
Fenol poveča intenziteto nastale barve, najboljši učinek pa ima pri 0,2% koncentraciji.
Natrijev sulfit najučinkoviteje stabilizira barvo, pridobljeno s pomočjo fenola, pri 0,05%
koncentraciji. Dinitrosalicilna kislina najbolje reducira glukozo pri 1% koncentraciji, za
kar pa je potrebno bazično okolje, ki ga dobimo z 1% raztopino natrijevega hidroksida
(Lorenz Miller, 1959, str. 426).
3.1.3.2 Priprava umeritvene krivulje
S pomočjo umeritvene krivulje lahko ocenimo koncentracijo redukcijskih sladkorjev v
nekem vzorcu. Umeritvene krivulje za glukozo in fruktozo (lahko tudi za maltozo)
naredimo s pomočjo 3,5-dinitrosalicilne kisline, iz katere je DNS reagent. Glukoza,
fruktoza ali maltoza reducirajo rumeno obarvano alkalno 3,5-dinitrosalicilno kislino v
oranţno do rdeče obarvano 3-amino-5-nitrosalicilno kislino. Intenziteta barve je odvisna
od koncentracije redukcijskih sladkorjev v raztopini (Construction of maltose standard
curve by DNS method, 2010). Razliko v intenzivnosti barve izmerimo s
spektrofotometrom pri valovni dolţini 512 nm. Različni avtorji navajajo različne valovne
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
27
dolţine, pri katerih naj bi merili absorbanco vzorcev. Večina jih navaja valovno dolţino
540 nm, ker pa smo mi pripravo DNS reagenta povzeli po Sadasivam in Manickam (2007,
str. 6), smo upoštevali njuno navedbo 510 nm, ki smo jo zaradi laţjega odčitavanja
spremenili na 512 nm. Vernierjev program LogerPro pri meritvah s spektrofotometrom
SpectroVis rezultate merjenja poda v obliki tabele in grafa (glej Prilogo D, E in F). Tabela
prikazuje absorbance, odčitane pri valovnih dolţinah 507,5 nm, 512 nm, 515 nm, 518,1
nm, ne pa tudi pri 510 nm. To bi sicer lahko odčitali iz grafa, vendar smo se zaradi
velikega števila meritev in manjše moţnosti za napako pri odčitavanju odločili, da
odčitamo absorbanco pri valovni dolţini 512 nm. To je tudi območje, kjer se oranţno-
rdeča barva absorbira. Serijo standardnih raztopin glukoze in fruktoze v epruvetah z znano
količino DNS reagenta 5 min segrevamo v vreli vodni kopeli, nato pa s spektrofotometrom
izmerimo njihovo absorbanco. Na koncu izdelamo umeritveno krivuljo za glukozo in za
fruktozo, kjer na osi x navedemo podatke za masno koncentracijo glukoze oziroma
fruktoze v mg/ml, na osi y pa podatke za absorbanco v nm.
Osnovna standardna raztopina glukoze (1 mg/ml)
V 100 ml merilno bučko natehtamo 100 mg glukoze in z destilirano vodo dopolnimo do
oznake 100 ml. Dobro premešamo (Gros in sod., 2010).
Osnovna standardna raztopina fruktoze (1 mg/ml)
V 100 ml merilno bučko natehtamo 100 mg fruktoze in z destilirano vodo dopolnimo do
oznake 100 ml. Dobro premešamo.
Priprava standardnih raztopin glukoze
Pripravimo 8 erlenmajeric z volumnom 100 ml in jih označimo s črkami od Ag do Hg. V
vsako erlenmajerico odpipetiramo drugo količino raztopine glukoze, in sicer 2,0, 4,0, 6,0,
8,0, 10,0, 12,0 14,0 in 16,0 ml. Vseh 8 erlenmajeric z destilirano vodo dopolnimo do
oznake 50 ml in dobro pretresemo. Dobimo raztopine glukoze z masnimi koncentracijami
0,04 mg/ml, 0,08 mg/ml, 0,12 mg/ml, 0,16 mg/ml, 0,20 mg/ml, 0,24 mg/ml, 0,28 ml/mg in
0,32 mg/ml. Preglednica 2 prikazuje razmerja raztopin za pripravo standardnih raztopin
glukoze (Gros in sod., 2010).
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
28
Preglednica 2: Priprava standardnih raztopin glukoze
Erlenmajerica Ag Bg Cg Dg Eg Fg Gg Hg
Volumen osnovne standardne
raztopine glukoze (ml) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0
Volumen destilirane vode (ml) 48,0 46,0 44,0 42,0 40,0 38,0 36,0 34,0
Masna koncentracija glukoze γg.r.
(mg/ml) 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,24 0,28 0,32
(Gros, N., Harrison, T., Štrumbelj Drusany, I. in Kapun Dolinar, A. (3. avgust 2010). Science In School. Prevzeto 30. marec 2011 iz
Spektrometrija v šoli: eksperimenti z izkustvenim pristopom: http://www.scienceinschool.org/2010/issue14/spectrometer/slovene)
Priprava standardnih raztopin fruktoze
Pripravimo 8 erlenmajeric z volumnom 100 ml in jih označimo s črkami od Af do Hf. V
vsako erlenmajerico odpipetiramo drugo količino raztopine fruktoze, in sicer 2,0, 4,0, 6,0,
8,0, 10,0, 12,0 14,0 in 16,0 ml. Vseh 8 erlenmajeric z destilirano vodo dopolnimo do
oznake 50 ml in dobro pretresemo. Dobimo raztopine fruktoze z masnimi koncentracijami
0,04 mg/ml, 0,08 mg/ml, 0,12 mg/ml, 0,16 mg/ml, 0,20 mg/ml, 0,24 mg/ml, 0,28 ml/mg in
0,32 mg/ml. Preglednica 3 prikazuje razmerja raztopin za pripravo standardnih raztopin
fruktoze.
Preglednica 3: Priprava standardnih raztopin fruktoze
Erlenmajerica Af Bf Cf Df Ef Ff Gf Hf
Volumen osnovne standardne
raztopine fruktoze (ml) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0
Volumen destilirane vode (ml) 48,0 46,0 44,0 42,0 40,0 38,0 36,0 34,0
Masna koncentracija fruktoze γf.r.
(mg/ml) 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,24 0,28 0,32
Priprava raztopin glukoze za merjenje s spektrofotometrom SpectroVis
V slepo epruveto nalijemo 3 ml destilirane vode in 3 ml DNS reagenta. V ostale epruvete,
označene s številkami od 1g do 8g, dodamo 3 ml ustrezne standardne raztopine glukoze in 3
ml DNS reagenta. Vse epruvete damo za 5 min v vrelo vodno kopel, nato pa jih ohladimo,
da so še vedno tople, ter dodamo v vsako po 1 ml Rochellejeve soli. Epruvete dobro
pretresemo. V vse epruvete dodamo še 3 ml destilirane vode, jih pretresemo in ohladimo
na sobno temperaturo. Preglednica 4 prikazuje razmerja raztopin za pripravo umeritvene
krivulje za glukozo (Sadasivam in Manickam, 2007, str. 6).
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
29
Preglednica 4: Priprava raztopin za umeritveno krivuljo za glukozo
Epruveta Slepag 1g 2g 3g 4g 5g 6g 7g 8g
Standardna raztopina
glukoze (merilna bučka) / A B C D E F G H
Standardna raztopina
glukoze (ml)
3,0 ml
destilirane
vode!
3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0
DNS reagent (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0
Raztopina Rochellejeve
soli (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Destilirana voda (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0
(Sadasivam, S. in Manickam, A. (avgust 2007). Biochemical Methods. Prevzeto 30. marec 2011 iz New Age International:
http://www.newagepublishers.com/samplechapter/000091.pdf)
Priprava raztopin fruktoze za merjenje s spektrofotometrom SpectroVis
V slepo epruveto nalijemo 3 ml destilirane vode in 3 ml DNS reagenta. V ostale epruvete,
označene s številkami od 1f do 8f, dodamo 3 ml ustrezne standardne raztopine fruktoze in 3
ml DNS reagenta. Vse epruvete damo za 5 min v vrelo vodno kopel, nato pa jih ohladimo,
da so še vedno tople, ter dodamo v vsako po 1 ml Rochellejeve soli. Epruvete dobro
pretresemo. V vse epruvete dodamo še 3 ml destilirane vode, jih pretresemo in ohladimo
na sobno temperaturo. Preglednica 5 prikazuje razmerja raztopin za pripravo umeritvene
krivulje za fruktozo.
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
30
Preglednica 5: Priprava raztopin za umeritveno krivuljo za fruktozo
Epruveta Slepaf 1f 2f 3f 4f 5f 6f 7f 8f
Standardna raztopina
fruktoze (merilna bučka) / A B C D E F G H
Standardna raztopina
fruktoze (ml)
3,0 ml
destilirane
vode!
3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0
DNS reagent (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0
Raztopina Rochellejeve
soli (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Destilirana voda (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0
Merjenje absorbance s spektrofotometrom SpectroVis
S spektrofotometrom SpectroVis izmerimo absorbanco raztopine v vsaki epruveti posebej
pri valovni dolţini 512 nm (A512).
Priključitev naprave SpectroVis na računalnik: napravo SpectroVis, ki jo
prikazuje Slika 17, poveţemo z računalnikom.
Slika 17: SpectroVis
(SpectroVis Spectrophotometer. (2008). Prevzeto 22. maj 2011 iz The Caliper. Vernier: Measure. Analyze. Learn:
http://www.vernier.com/caliper/spring08/svis.html)
Zaženemo program LoggerPro: z dvojnim klikom na ikono zaţenemo program
LoggerPro.
Umeritev SpectroVisa: kiveto napolnimo do ¾ z destilirano vodo in jo postavimo v
nosilec za kivete SpectroVis. V programu LoggerPro kliknemo jeziček Experiment (glej
Sliko 18) in nato Calibrate ter Spectrometer: 1 (glej Sliko 19). Nato počakamo, da steče
kalibracija. Potem kliknemo gumb Finish Calibration (glej Sliko 21). Ko je kalibracija
končana, kliknemo gumb OK, kot prikazuje Slika 22 (Vernier, 2008, str. 1).
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
31
Slika 18: Program LoggerPro – Experiment
Slika 19: Program LoggerPro – Calibrate – Spectrometer: 1
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
32
Slika 20: Program LoggerPro – Calibrate Spectrometer
Slika 21: Program LoggerPro – Finish Calibration
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
33
Slika 22: Program LoggerPro – OK
Merjenje absorbance: kiveto napolnimo do ¾ z vzorčno raztopino in jo vstavimo
v nosilec za kivete v SpectroVis. Kliknemo Collect, kot prikazuje Slika 23, in po
pribliţno 5 sekundah kliknemo Stop, kot prikazuje Slika 24. S klikom na desni
gumb miške se nam odpre pogovorno okno, kjer kliknemo na Graf Options, kot
prikazuje Slika 25. Odpre se pogovorno okno Graph Options, kjer kliknemo na
jeziček Axes Options, kot prikazuje Slika 26. V okvirčku Y – Axis pri okenčku Top
vtipkamo 2,500 in shranimo nastavitve s klikom na Done. Tako smo os y
prilagodili našim meritvam. Ko ţelimo opraviti novo meritev, kliknemo Collect in
odpre se pogovorno okno Erase Data?. Kliknemo Erase and Continue (glej Sliko
27) in nadaljujemo z zbiranjem novih podatkov. Grafe sproti shranjujemo. To
naredimo za vse standardne raztopine glukoze in fruktoze ter odčitamo absorbanco
pri valovni dolţini 512 nm (A512) (Vernier, 2008, str. 4–6). Opozorilo: Na začetku
meritev s spektrofotometrom SpectroVis opravimo dve poskusni meritvi, da se
naprava ogreje, sicer lahko dobimo napačne rezultate.
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
34
Slika 23: Zbiranje podatkov – Collect
Slika 24: Ustavitev zbiranja podatkov – Stop Collection
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
35
Slika 25: Možnosti grafa – Graph Options
Slika 26: Možnosti osi – Axes Options
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
36
Slika 27: Zbriši in nadaljuj – Erase and Continue
Priprava umeritvene krivulje: pripravimo umeritveno krivuljo – glukozno
specifično absorbanco v odvisnosti od koncentracije glukoze in fruktozno
specifično absorbanco v odvisnosti od koncentracije fruktoze.
3.1.3.3 Priprava ekstrakta iz rastlinskega materiala
Natehtamo 1 g trave in jo ob dodajanju destilirane vode stremo v terilnici. Ekstrakt
prefiltriramo v 100 ml čašo. Čašo napolnimo z destilirano vodo do oznake 100 ml in jo
označimo. Enako naredimo za mesnate luskoliste čebule, le da jih natehtamo 0,100 g, saj
čebula vsebuje mnogo več sladkorja kot trava.
Merjenje absorbance vzorcev s spektrofotometrom SpectroVis
V eno epruveto odpipetiramo 3 ml ekstrakta trave, v drugo pa 3 ml ekstrakta mesnatih
luskolistov čebule. V obe epruveti dodamo 3 ml DNS reagenta. Epruveti 5 min segrevamo
v vreli vodni kopeli in ju nato ohladimo pod tekočo vodo iz pipe, tako da sta še vedno
topli. V obe epruveti dodamo 1 ml Rochellejeve soli ter ju dobro pretresemo. Dodamo še 3
ml destilirane vode in epruveti pretresemo. Epruveti ohladimo na sobno temperaturo in
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
37
izmerimo absorbanco pri valovni dolţini 512 nm (A512) (Sadasivam in Manickam, 2007,
str. 6).
Račun
S kriţnim računom izračunamo koncentracijo glukoze in fruktoze, prisotne v obeh vzorcih,
z uporabo standardnega grafa.
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
38
4 REZULTATI
4.1 Rezultati preizkusa metode
Pri kvantitativnem določanju redukcijskih sladkorjev v rastlinskem tkivu smo se
osredotočili na determinacijo koncentracije glukoze in fruktoze v travi in čebuli. Da smo
lahko določili koncentracijo redukcijskih sladkorjev v vzorcu trave in čebule, smo morali
najprej narediti umeritveni krivulji različnih masnih koncentracij glukoze in fruktoze. Ker
ima čebula veliko več sladkorja kot trava, smo se odločili, da naredimo ekstrakt iz 1 g trave
in iz 0,1 grama čebule, sicer bi morali narediti bistveno obseţnejši umeritveni krivulji.
Posameznim vzorcem z različnimi masnimi koncentracijami glukoze in fruktoze smo po
dodanem DNS reagentu in tretiranju v vreli vodni kopeli s spektrofotometrom SpectroVis
izmerili absorbanco. Zaradi ţelje po natančnosti smo naredili po tri serije meritev in
izračunali povprečno absorbanco, rezultate meritev pa smo prikazali v Preglednici 6 in 7.
Preglednica 6: Absorbance različnih masnih koncentracij glukoze
Masna
koncentracija
glukoze γg.r.
(mg/ml)
Absorbanca (A) Glukozno
specifična
absorbanca
(A – Aslepa)
1. meritev 2. meritev 3. meritev
Povprečna
absorbanca
(Ā)
0,00 0,551 0,527 0,524 0,526 0,000
0,04 0,537 0,528 0,527 0,528 0,002
0,08 0,538 0,532 0,528 0,533 0,007
0,12 0,648 0,641 0,636 0,642 0,116
0,16 0,765 0,763 0,757 0,762 0,236
0,20 0,892 0,889 0,882 0,888 0,362
0,24 0,981 0,971 0,971 0,974 0,448
0,28 1,007 1,069 1,082 1,053 0,527
0,34 1,117 1,123 1,116 1,119 0,593
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
39
Preglednica 7: Absorbance različnih masnih koncentracij fruktoze
Masna
koncentracija
fruktoze γf.r.
(mg/ml)
Absorbanca (A) Fruktozno
specifična
absorbanca
(A – Aslepa)
1. meritev 2. meritev 3. meritev
Povprečna
absorbanca
(Ā)
0,00 0,505 0,501 0,501 0,502 0,000
0,04 0,505 0,505 0,505 0,505 0,003
0,08 0,492 0,509 0,509 0,503 0,001
0,12 0,585 0,584 0,583 0,584 0,082
0,16 0,704 0,725 0,730 0,720 0,218
0,20 0,832 0,816 0,820 0,823 0,321
0,24 0,952 0,944 0,945 0,947 0,445
0,28 1,097 1,083 1,083 1,088 0,586
0,32 1,187 1,172 1,181 1,180 0,678
Po opravljenih meritvah smo v obliki grafa v MS Excelu izdelali umeritveni krivulji za
glukozo in fruktozo. Na abscisni osi so v mg/ml prikazane vrednosti masnih koncentracij
glukoze oziroma fruktoze, na ordinatni osi pa so prikazane vrednosti glukozno oziroma
fruktozno specifičnih absorbanc, ki smo jih izračunali tako, da smo povprečno absorbanco
vzorca z masno koncentracijo glukoze oziroma fruktoze 0,00 mg/ml odšteli od povprečnih
absorbanc vseh ostalih vzorcev različnih masnih koncentracij. Slika 28 in Slika 29
prikazujeta umeritveno krivuljo za glukozo in umeritveno krivuljo za fruktozo. Tako smo
dobili podatke, na podlagi katerih smo lahko določili koncentracijo glukoze in fruktoze v
travi in čebuli.
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
40
Slika 28: Umeritvena krivulja za glukozo
Slika 29: Umeritvena krivulja za fruktozo
Po izdelavi umeritvenih krivulj smo izmerili še absorbanco vzorca trave in čebule.
Rezultati so prikazani v Preglednici 8. Iz umeritvenih krivulj smo odčitali koncentracijo
glukoze oziroma fruktoze v mg/ml glede na izračunano glukozno oziroma fruktozno
specifično absorbanco obeh vzorcev. Sledil je izračun koncentracije glukoze in fruktoze v
1 g trave in v 1 g čebule. Izračun smo izvedli po sklepnem računu, znani podatki pa so bili
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 0,04 0,08 0,12 0,16 0,2 0,24 0,28 0,32
Glu
ko
zno
sp
ecif
ičn
a a
bso
rba
nca
(A
– A
slep
a)
Koncentracija glukoze (mg/mL)
Glukozno specifična absorbanca v odvisnosti od masne
koncentracije glukoze
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 0,04 0,08 0,12 0,16 0,2 0,24 0,28 0,32
Glu
ko
zno
sp
ecif
ičn
a a
bso
rba
nca
(A
– A
slep
a)
Koncentracija fruktoze (mg/mL)
Glukozno specifična absorbanca v odvisnosti od masne
koncentracije fruktoze
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
41
1 g vzorec trave, 0,1 g vzorec čebule in koncentracija glukoze oziroma fruktoze v mg/ml.
Postopek računanja prikazujejo izračuni (1), (2), (3) in (4).
Preglednica 8: Rezultati vzorcev
Vzorec
Absorbanca (A) Glukozno
specifična
absorbanca
(A – Aslepa)
Fruktozno
specifična
absorbanca
(A – Aslepa)
1.
meritev
2.
meritev
3.
meritev
Povprečna
absorbanca
(Ā)
Trava 0,627 0,671 0,678 0,659 0,133 0,157
Čebula 0,548 0,551 0,546 0,548 0,022 0,046
Izračuni
(1) Koncentracija glukoze v 1 g trave (2) Koncentracija fruktoze v 1 g trave
0,13 mg/ml … 1 g 0,12 mg/ml … 1 g
X … 1 g X … 1 g
X =
X =
X = 0,13 mg/ml X = 0,12 mg/ml
(3) Koncentracija glukoze v 1 g čebule (4) Koncentracija fruktoze v 1 g čebule
0,09 mg/ml … 0,1 g 0,10 mg/ml … 0,1 g
X … 1 g X … 1 g
X =
X =
X = 0,90 mg/ml X = 1,00 mg/ml
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
42
4.2 Rezultati anketnega vprašalnika
Namen te diplomske seminarske naloge ni bil samo poiskati ustrezno metodo za
kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev in jo dodelati, temveč jo tudi preizkusiti in
evalvirati skupaj s študenti 4. letnika študijske smeri Biologija in … ter s študenti 3. letnika
študijske smeri Ekologija z naravovarstvom pri laboratorijskih vajah predmeta
Fitofiziologija. Pri izvedbi in evalvaciji metode je sodelovalo 10 študentov. Za potrebe
evalvacije izbrane metode smo sodelujoče študente anketirali in naredili analizo anketnih
rezultatov. Anketni vprašalnik se nahaja v Prilogi G. V tem poglavju so predstavljeni le
tisti rezultati, ki jih je bilo smiselno prikazati v obliki grafa, ostali pa so komentirani v
naslednjem poglavju. Slike 30, 31, 32 in 33 podajajo odgovore anketirancev v obliki
grafičnega prikaza. Rezultati anketnega vprašalnika so sluţili kot pomoč pri objektivni
evalvaciji izbrane metode. Analiza rezultatov je podana v naslednjem poglavju.
Slika 30: Odgovori anketirancev na 7. točko: "Metoda mi je pripomogla k lažjemu razumevanju snovi."
40%
50%
0% 10%
0%
Odgovori anketirancev na 7. nalogo: "Metoda mi je pripomogla k
lažjemu razumevanju snovi."
popolnoma se strinjam
se strinjam
ne vem
se ne strinjam
popolnoma se ne strinjam
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
43
Slika 31: Odgovori anketirancev na 8. točko: "Metoda je uporabna pri študiju izpitnega gradiva pri
predmetu Fitofiziologija."
Slika 32: Odgovori anketirancev na 9. točko: "Metoda je dosegla moja pričakovanja."
30%
50%
20%
0% 0%
Odgovori anketirancev na 8. nalogo: "Metoda je uporabna pri
študiju izpitnega gradiva pri predmetu Fitofiziologija."
popolnoma se strinjam
se strinjam
ne vem
se ne strinjam
popolnoma se ne strinjam
50% 50%
0%
0%
0%
Odgovori anketirancev na 9. nalogo: "Eksperiment je dosegel moja
pričakovanja."
popolnoma se strinjam
se strinjam
ne vem
se ne strinjam
popolnoma se ne strinjam
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
44
Slika 33: Namen, za katerega bi anketiranci še uporabili to metodo
20%
10%
50%
10%
10%
Namen, za katerega bi anketiranci še uporabili to metodo
ne vem
ne razumem navodil
reduktivne sladkorje v plodovih
reduktivne sladkorje v različnih
rastlinskih organih
količino plastidov v zelenih
rastlinah
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
45
5 RAZPRAVA
Rezultati kvantitativne metode za določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom so
bili pričakovani. Na koncu lahko potrdimo prvo zastavljeno hipotezo, da je izbrana metoda
resnično zelo natančna in da zazna redukcijske sladkorje tudi v travi. Drugo hipotezo o
tem, da bo v vzorcih bistveno večja količina glukoze kot fruktoze, pa smo ovrgli. Izkazalo
se je namreč, da je v obeh vzorcih podobna količina tako glukoze kot fruktoze, vendar pa
je slednje več v vzorcu mesnatih luskolistov čebule kot v vzorcu trave.
5.1 Analiza rezultatov preizkusa metode
Na sploh smo bili presenečeni, da smo lahko s to metodo resnično zaznali redukcijske
sladkorje tudi v travi, pa če prav je bilo le-teh zelo malo. Rezultate merjenja absorbance v
vzorcu ekstrakta trave in mesnatih luskolistov čebule prikazujeta Preglednica 8 in
Priloga F. Na podlagi vnaprej pripravljene umeritvene krivulje za glukozo (glej Sliko 28)
in fruktozo (glej Sliko 29) smo določili masno koncentracijo glukoze in fruktoze v obeh
vzorcih. Koncentracijo glukoze in fruktoze v 1 g trave in 1 g mesnatih luskolistov čebule
smo izračunali po sklepnem računu, kar prikazujejo računi (1), (2), (3) in (4). V 1 g trave je
bilo pribliţno 0,13 mg/ml glukoze in 0,12 mg/ml fruktoze. V 1 g mesnatih luskolistov
čebule pa je bilo pribliţno 0,90 mg/ml glukoze in 1,00 mg/ml fruktoze.
Preglednica 6 in Preglednica 7 prikazujeta rezultate merjenja absorbance vzorcev z
različnimi masnimi koncentracijami glukoze in fruktoze, s pomočjo katerih smo izdelali
umeritveni krivulji. Vsi rezultati so v obliki slik priloţeni na koncu diplomske seminarske
naloge v Prilogi D in Prilogi E. Ker so namenjeni izključno izdelavi umeritvene krivulje,
jih ne bomo posebej interpretirali, lahko pa sluţijo kot vodilo tistim, ki bodo to metodo
sami preizkušali.
Prvi dve polji prvega sklopa meritev absorbance masnih koncentracij glukoze, ki jih
prikazuje Preglednica 6, smo označili sivo. To smo storili zato, ker ta dva rezultata močno
odstopata od ostalih dveh in nista zanesljiva, zato ju tudi pri izračunu povprečne
absorbance nismo upoštevali. To se nam je dogajalo redno na začetku vsakega poskusa,
vendar vselej le pri prvih dveh meritvah. Sklepamo, da je do tega prišlo zato, ker smo
merili prehitro, preden se je aparat ogrel. Menimo, da spektrofotometer potrebuje določen
čas, da se meritve stabilizirajo. Zaradi ţelje po čim večji natančnosti smo tudi izvedli po tri
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
46
serije meritev in izračunali povprečno absorbanco, v navodilih pa dodali, da je treba na
začetku opraviti dve poskusni meritvi, da se spektrofotometer SpectroVis ogreje.
5.2 Analiza rezultatov anketnega vprašalnika
Pri izpolnjevanju anketnega vprašalnika (glej Prilogo G), namenjenem oceni kvantitativne
metode za določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom, so sodelovali študentje 4.
letnika študijske smeri Biologija in … ter študentje 3. letnika študijske smeri Ekologija z
naravovarstvom, oboji s Fakultete za naravoslovje in matematiko Univerze v Mariboru.
Anketni vprašalnik so izpolnili po preizkusu omenjene metode, pri katerem smo jih
usmerjali in jim pomagali. Dobili so natančna navodila in morali v sklopu vaj pri predmetu
Fitofiziologija iz tega pripraviti poročilo, ki je obsegalo rezultate in njihovo analizo.
V prvem sklopu vprašanj (od 3. do 6. točke, Priloga G) so študentje ocenjevali vajo z
ocenami od 1 do 10, pri tem je ocena 1 pomenila najslabše, ocena 10 pa najboljše.
Razumljivost navodil so študentje ocenili v povprečju z oceno 8,9, teţavnost metode s 7,1;
dolţino metode s 7,8 in natančnost metode z 8,8. Iz ocen sklepamo, da so navodila dobro
razumljiva. Teţave z razumevanjem navodil so nastopile, če študenti niso bili zbrani in
pripravljeni, saj so le-ta zelo obseţna in podrobna, ravno to pa je tudi vzrok za niţje
ocenjeno teţavnost metode.
Z najniţjo oceno so študentje ocenili trajanje metode. Trajanje priprave in izvedbe metode
je zares časovno obseţno, saj sama izvedba od mešanja reagentov do čiščenja steklovine
traja okoli 6 ur. Dolţino metode poveča sprotno spiranje kivete, saj je na razpolago le ena
in ne moremo vnaprej pripraviti vseh vzorcev za merjenje absorbance, vsakega posebej v
svoji kiveti, kar bi deloma skrajšalo dolţino metode. Zamudna je tudi priprava reagenta in
priprava različnih masnih koncentracij glukoze in fruktoze, vendar ta problem lahko
rešimo tako, da vnaprej namešamo večjo količino reagenta in masnih koncentracij glukoze
in fruktoze, saj ti ob hranjenju v hladilniku ne izgubijo kvalitete. Tako se lahko skupina
študentov v primeru pomanjkanja časa osredotoči samo na izvedbo metode, brez
predhodnih priprav. Če pa ţelimo metodi dati večjo didaktično vrednost, je smiselno, da se
študenti naučijo pripravljati reagent in masne koncentracije glukoze in fruktoze, saj s tem
razvijajo sposobnosti in veščine dela z analitsko tehtnico, avtomatsko pipeto, računanja
masnih koncentracij in različnih razmerij kemikalij. Natančnost metode so ocenili precej
visoko, vendar menimo, da bi lahko bila ocena višja, saj se je metoda izkazala za zelo
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
47
natančno, ker zazna tudi minimalne količine redukcijskih sladkorjev. Povprečno oceno
niţa študent, ki ni v celoti razumel navodil in namena metode.
Drugi sklop nalog (od 7. do 9. točke, Priloga G) je od anketirancev zahteval, da glede na
trditev obkroţijo, ali se z njo strinjajo ali ne. Med izbranimi moţnostmi so bili odgovori:
Se popolnoma ne strinjam, Se ne strinjam, Ne vem, Se strinjam, Se popolnoma strinjam.
S trditvijo (točka 7, Priloga G): "Metoda mi je pripomogla k lažjemu razumevanju snovi."
se je 50 % študentov strinjalo, 40 % se jih je popolnoma strinjalo, 10 %, torej eden, pa se s
tem ni strinjal. Rezultate prikazuje Slika 30. Študentom, ki so razumeli navodila, je ta
preizkus pomagal pri razumevanju snovi, saj so pred tem določali redukcijske sladkorje le
s kvalitativno metodo s Fehlingovim reagentom in niso imeli občutka, koliko teh
sladkorjev se dejansko nahaja v izbranem rastlinskem tkivu. Tako so videli, da jih je nekaj
tudi v travi, čeprav sam kvalitativen test tega ni dokazal. Naučili so se tudi delati
umeritveno krivuljo.
S trditvijo (točka 8, Priloga G): "Metoda je uporabna pri študiju izpitnega gradiva pri
predmetu Fitofiziologija." se je 50 % študentov strinjalo, 30 % se jih je s tem popolnoma
strinjalo, dva študenta (20 %) pa tega nista ovrednotila in sta obkroţila Ne vem. Rezultate
prikazuje Slika 31. Ta snov je poleg vsega drugega predvidena tudi na kolokviju in izpitu
iz predmeta Fitofiziologija in večina študentov se strinja, da je bila metoda uporabna pri
študiju za ta predmet.
Na trditev (točka 9, Priloga G): "Metoda je dosegla moja pričakovanja." so rezultati
odgovorov študentov razvidni iz Slike 32. 50 % študentov se s tem popolnoma strinja,
50 % pa se jih s tem strinja. Vsi so potrdili svojo hipotezo, da bo metoda dokazala količino
glukoze in fruktoze v travi in mesnatih luskolistih čebule.
Tretji sklop nalog (od 10. do 11. točke, Priloga G) je anketirance spraševal o tem, ali so
pričakovali takšne rezultate in ali so imeli pri izvedbi metode teţave. Na vprašanji so
morali odgovoriti z da ali ne. Vsi študenti so na prvo vprašanje odgovorili pritrdilno. Nihče
ni imel teţav pri izvajanju metode.
Noben od študentov se nikoli prej ni srečal s to metodo, niti ne bi ničesar spreminjal.
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
48
Namen, za katerega bi anketiranci še uporabili to metodo, je razviden iz Slike 33. Polovica
študentov bi si ţelela to metodo preizkusiti za določanje redukcijskih sladkorjev v različnih
plodovih. Eden izmed študentov je prišel na idejo, da bi na ta način lahko določali
koncentracijo plastidov v zelenih rastlinah, drugi pa bi to metodo uporabil za določanje
redukcijskih sladkorjev v različnih rastlinskih organih. Eden izmed študentov ni predlagal
ničesar, saj ni razumel navodil, dva pa nista imela nobene ideje.
Anketni vprašalnik je pripomogel h kritičnosti do izbrane metode in načina dela. Na
splošno je bila študentom všeč in so jo razumeli, bi pa si ţeleli nekoliko krajša navodila,
glede na to, da so skoraj vsi imeli poleg študijske smeri biologija za vezavo kemijo.
Študentoma študijske smeri biologija in filozofija pa so se navodila zdela zelo dobro
razumljiva, saj nimata veliko kemijskega znanja. Verjetno bi bili rezultati ankete nekoliko
drugačni, če bi bil nabor sodelujočih anketiranih študentov večji in bolj pester glede na
njihove študijske smeri. Kemikom metoda v splošnem naj ne bi delala večjih teţav,
nekemiki pa bi lahko pri manj natančnih navodilih imeli teţave pri razumevanju postopka.
Metodo smo tekom izvajanja s študenti sproti izpopolnjevali in jo v dveh mesecih
izpopolnili. Preden smo jo prvič preizkusili skupaj s študenti, smo jo izvedli sami, da smo
preverili samo ustreznost metode. Rezultati, zbrani v istoimenskem poglavju, so rezultati
zadnjega poskusa, ki smo ga izvedli brez študentov. Imeli smo precejšnjo srečo, da nam je
v tako kratkem času uspelo izpopolniti metodo, je pa res, da smo se na poskus predhodno
dobro pripravili in ga oblikovali s pomočjo različnih virov.
Po vsej verjetnosti bi se dalo metodo še izboljšati, morda s samo pripravo rastlinskega
ekstrakta, ki ne bi vseboval drugih primesi, ali z izbiro natančnejšega spektrofotometra.
Vendar pa namen te metode ni strogo raziskovalni, ampak je v največji meri namenjena
izvajanju dijakov pri pouku biologije in študentov pri vajah iz predmeta Fitofiziologija.
Zato izpolnjuje vse zahteve, saj je dovolj natančna, ni preveč zahtevna in ne vsebuje zelo
strupenih kemikalij ter ne zahteva uporabe kompliciranih naprav.
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
49
6 ZAHVALA
Mentorici doc. dr. Jani Ambroţič Dolinšek se zahvaljujem za nasvete in pomoč z lastnimi
izkušnjami. Za pomoč pri izvajanju metode in usmerjanju pri kemijskih postopkih se
zahvaljujem mag. Tereziji Ciringer. Za vso podporo tekom študija, tako moralno kot
finančno, se zahvaljujem atiju Joţetu in mamici Brigiti ter svoji sestri Nataši in fantu
Dejanu. Za moralno podporo in pomoč pri študiju pa se posebej zahvaljujem sošolcema
Maji Dragšič in Mihi Knehtlu.
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
50
7 LITERATURA IN VIRI
Carbohydrates and their chemistry. (2008). Prevzeto 23. april 2011 iz Tutornext:
http://www.tutornext.com/carbohydrates-their-chemistry/2923
SpectroVis Spectrophotometer. (2008). Prevzeto 22. maj 2011 iz The Caliper. Vernier:
Measure. Analyze. Learn: http://www.vernier.com/caliper/spring08/svis.html
Construction of maltose standard curve by DNS method. (2010). Prevzeto 10. junij 2011 iz
VALUE @ Amrita. Virtual & Accessible Laboratories Universalizing Education:
http://sakshat.amrita.ac.in/VirtualLab/?sub=BIOTECH&brch=BIC&sim=Construct
ion_of_Maltose_By_DNS_Method&cnt=theory
Medical Physiology/Basic Biochemistry/Sugars: Reference. (2010). Prevzeto 24. april
2011 iz The Full Wiki:
http://www.thefullwiki.org/Medical_Physiology/Basic_Biochemistry/Sugars
Ambroţič Dolinšek, J. (2010). Fitofiziologija. Navodila za vaje. Maribor: Univerza v
Mariboru. Fakulteta za naravoslovje in matematiko.
Anderluh, G., Maček, P., Sepčić, K. in Turk, T. (2009). Eksperimentalne metode v
biokemiji. Ljubljana: Študentska zaloţba.
Bavec, A., Zorko, M. in Stojan, J. (2008). Navodila za laboratorijske vaje iz biokemije s
teoretičnim dodatkom. Ljubljana: Študentska zaloţba.
Boyer, R. F. (2005). Temelji biokemije. Ljubljana: Študentska zaloţba.
Cellular Processes. Step 2: Calvin Cycle. (brez datuma). Prevzeto 23. maj 2011 iz
Cellupedia: http://library.thinkquest.org/C004535/calvin_cycle.html
Dermastia, M. (2007). Pogled v rastline. Ljubljana: Nacionalni inštitut za biologijo.
Gros, N., Harrison, T., Štrumbelj Drusany, I. in Kapun Dolinar, A. (3. avgust 2010).
Science In School. Prevzeto 30. marec 2011 iz Spektrometrija v šoli: eksperimenti z
izkustvenim pristopom:
http://www.scienceinschool.org/2010/issue14/spectrometer/slovene
Hmelak Gorenjak, A. (2010). Prevzeto 23. maj 2011 iz Ţivilska kemija z analizo ţivil in
analiza ţivil. Zavod IRC. Ljubljana: http://www.impletum.zavod-
irc.si/docs/Skriti_dokumenti/Zivilska_kemija_z_analizo_in_Analiza_zivil-
Hmelak.pdf
Jha, A. B. in Dubey, R. S. (2005). Effect of arsenic on behaviour of enzymes of sugar
metabolism in germinating rice seeds. Acta Physiologiae Plantarum. Vol. 27. No.
3B, 341–347.
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
51
Likar, M. (2011). Priročnik za varno delo v laboratorijih. Katedra za rastlinsko fiziologijo.
Ljubljana: Univerza v Ljubljani. Biotehnična fakulteta.
Lorenz Miller, G. (1959). Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of
Reducing Sugar. Analytical Chemistry. 31 (3), 456–428.
Pingoud, A., Urbanke, C., Hoggett, J. in Jeltsch, A. (2002). Biochemical Methods. A
Concise Guide for Students and Researchers. Weinheim: Wiley-VCH Verlag
GmbH.
Prado, F. E., Gonzalez, J. A., Boero, C. in Sampietro, A. R. (1998). A Simple and Sensitive
Method for Determining Reducing Sugars in Plant Tissues. Application to Quantify
the Sugar Content in Quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) Seedlings.
Phytochemical Analysis, Vol. 9, 58–63.
Raven, P. H. in Echhorn, S. E. (2005). Biology of Plants. New York: W. H. Freeman and
Company.
Sadasivam, S. in Manickam, A. (avgust 2007). Biochemical Methods. Prevzeto 30. marec
2011 iz New Age International:
http://www.newagepublishers.com/samplechapter/000091.pdf
Sašo. (24. oktober 2004). Kvarkadabra. Časopis za tolmačenje znanosti. Prevzeto 24. maj
2011 iz Spekter elektromagnetnega valovanja:
http://www.kvarkadabra.net/mediagallery/popup.php?s=20060326214527911&sort
=0
Sepčić, K. (2004). Biokemijski praktikum za pedagoge. Ljubljana: Študentska zaloţba.
Sticklen, M. B. (2008). Scitable. Nature Education. Prevzeto 23. maj 2011 iz Plant genetic
engineering for biofuel production: towards affordable cellulosic ethanol. Nature
Reviews Genetics 9, 433–443: http://www.nature.com/scitable/content/plant-
plasma-membrane-and-cell-wall-structure-14713218
Taiz, L. in Zeiger, E. (2010). Plant Physiology (5th ed izd.). Sunderland, MA: Sinauer
Associates Inc., Publishers.
Taiz, L. in Zeiger, E. (2010). Principles of Spectrophotometry. Prevzeto 6. junij 2011 iz
Plant Physiology: http://5e.plantphys.net/image.php?id=70
Taiz, L. in Zeiger, E. (2010). Principles of Spectrophotometry. Prevzeto 7. junij 2011 iz
Plant Physiology: http://5e.plantphys.net/image.php?id=71
Tausch, M. W. (brez datuma). Hydrolysis of β-Cyclodextrin and Detection of the
Degradation Product. Prevzeto 24. april 2011 iz Chemie und ihre Didaktik:
http://www.chemiedidaktik.uni-wuppertal.de/disido_cy/cyen/exp/03_hydrolyse.htm
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
52
Turk, T., Maček, P., Sepčić, K. in Anderluh, G. (1997). Biokemijski praktikum. Ljubljana:
Študentska organizacija univerze v Ljubljani.
Vernier. (2008). Vernier SpectroVis. Spectrofotometer. Beaverton, OR: Vernier Software
& Technology.
Voet, D., Voet, J. G. in Pratt, C. W. (2002). Fundamentals of biochemistry. New York: J.
Wiley, cop.
Zamora, A. (2011). Carbohydrates – Chemical Structure. Prevzeto 24. april 2011 iz
Scientific Psychic: http://www.scientificpsychic.com/fitness/carbohydrates.html
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
1
8 PRILOGE
Kazalo prilog
Priloga A: Navodilo za delo z analitsko tehtnico .................................................................. 2
Priloga B: Navodilo za delo z avtomatsko pipeto ................................................................. 3
Priloga C: Navodilo za varno delo s spektrofotometrom SpectroVis ................................... 5
Priloga D: Rezultati meritev umeritvene krivulje za glukozo ............................................... 7
Priloga E: Rezultati meritev umeritvene krivulje za fruktozo ............................................. 12
Priloga F: Rezultati meritev rastlinskega tkiva.................................................................... 17
Priloga G: Anketni vprašalnik ............................................................................................. 18
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
2
Priloga A: Navodilo za delo z analitsko tehtnico
Navodilo za varno delo z analitsko tehtnico
Območje uporabe Analitsko tehtnico uporabljamo v laboratoriju.
Nevarnost Analitska tehtnica je med delovanjem priključena na električno
omreţje.
Lahko pride do razlitja raztopine ali razsutja trdnih snovi, ki jih
tehtamo.
Uporaba 1. Preden začnemo tehtati, se prepričamo, da analitska tehtnica
kaţe vrednost 0.
2. Maso embalaţe je vedno treba odšteti od mase snovi, ki jo
tehtamo. To naredimo s pritiskom na gumb tara.
3. Na površino za tehtanje ne pritiskamo z roko.
4. Pazimo, da ne tehtamo količin, teţjih od najvišje dovoljene
obremenitve tehtnice.
Ukrepi ob
motnjah
Analitsko tehtnico izklopimo.
Razliti ali razsuti material previdno odstranimo s površine za
tehtanje in analitsko tehtnico obrišemo z mehko krpo.
Vzdrževanje Pazimo, da se snovi, ki jih tehtamo, ne polivajo in razsujejo po
površini za tehtanje.
Po vsaki uporabi analitsko tehtnico izklopimo, površino za tehtanje
pa obrišemo z mehko krpo.
Analitske tehtnice ne izpostavljamo agresivni ali vlaţni atmosferi.
Neupoštevanje
navodil
Poškodbe analitske tehtnice.
Nenatančne meritve.
Ogroţanje zdravja.
(Ambrožič Dolinšek, 2010, str. 64 in Likar, 2011, str. 10)
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
3
Priloga B: Navodilo za delo z avtomatsko pipeto
Navodilo za varno delo z avtomatsko pipeto
Območje uporabe Avtomatske pipete uporabljamo za prenos tekočine.
Nevarnost Nevarnost predstavljajo le tekočine, ki se pipetirajo.
Uporaba 1. Izberemo avtomatsko pipeto za ustrezno velikostno območje.
Nikoli ne pipetiramo volumnov, večjih ali manjših od
predpisanih. Minimalni volumni so običajno 10–20 %
celotnega volumna pipete.
2. Z vrtenjem gumba na vrhu avtomatske pipete v levo ali desno
smer nastavimo ţeleni volumen.
3. Konico pipete narahlo potisnemo v eno od zamenljivih
plastičnih konic (tips), zloţenih v posebnih nosilnih škatlah.
Vedno izberemo konico ustrezne velikosti. Tesno prileganje
zagotovimo z nekaj neţnimi pritiski v ustje konice.
4. Pipeto vedno držimo s konico navpično navzdol. Pritisnemo
gumb na vrhu pipete do prve stopnje in potopimo konico v
tekočino, ki jo pipetiramo. Gumb počasi sprostimo, tako da se
konica počasi napolni s tekočino. Počakamo še trenutek, da se
konica popolnoma napolni. Sproščanje in pritiskanje gumba
za pipetiranje naj bo vedno počasno in nežno, v konici ne
smejo nastajati zračni mehurčki.
5. Če pri pipetiranju pomotoma napolnimo tudi konec pipete,
poiščemo pomoč laboranta.
6. Pipeto z raztopino dvignemo nad gladino tekočine in z očmi
grobo ocenimo, ali višina raztopine v konici ustreza izbranemu
volumnu. Še vedno velja, da pipeto držimo s konico
navpično navzdol.
7. Pipeto s tekočino prenesemo v drugo posodo. S konico pipete
se pod kotom 10–15º od navpične stene dotaknemo posode. S
počasnim in neţnim pritiskom na vrhnji gumb pipete konico
izpraznimo. Počakamo trenutek, da izteče vsa tekočina, in s
pritiskom do naslednje, končne stopnje dodatno izpihamo
morebitne ostanke tekočine. Nato vzamemo pipeto iz posode.
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
4
Navodilo za varno delo z avtomatsko pipeto
8. S pritiskom na stranski, manjši in nekoliko niţji gumb
odstranimo plastično konico s pipete. Preden odstranimo
konico, se vedno prepričamo, da je popolnoma prazna.
9. Pred vsako uporabo novega nastavka moramo nastavek sprati
(po zgornjih korakih). Pri tem se v nastavku vzpostavi tanek
film tekočine. Ta film lahko predstavlja napako pri pipetiranju
(v primeru, da izpustimo pranje nastavka), hkrati pa preprečuje
kapljanje tekočine iz nastavka.
Pipeto preizkusimo tako, da ustrezni volumen destilirane vode
stehtamo. Predvidoma 1 mg destilirane vode ustreza 1 µl
oziroma 1 mm³ destilirane vode. Masa izbranega volumna ne
sme odstopati za več kot 1 %. Če vrednosti odstopajo, pipeta ni
natančna in jo je treba umeriti (kalibrirati) ali servisirati.
Ukrepi ob
motnjah Takoj prenehamo pipetirati.
Vzdrževanje V primeru, da je v avtomatsko pipeto prišla tekočina, takoj
obvestimo laboranta.
Neupoštevanje
navodil
Poškodbe avtomatskih pipet.
Nenatančne meritve.
(Ambrožič Dolinšek, 2010, str. 65 in Likar, 2011, str. 14)
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
5
Priloga C: Navodilo za varno delo s spektrofotometrom SpectroVis
Navodilo za varno delo s spektrofotometrom SpectroVis
Območje uporabe Spektrofotometer SpectroVis uporabljamo za določanje
koncentracije snovi v raztopinah in snemanje absorpcijskih
spektrov.
Nevarnost Spektrofotometer SpectroVis je med delovanjem priključen v
računalnik, ki je priključen na električno omreţje.
Lahko pride do razlitja raztopine v kiveti.
Uporaba Kalibracija
1. Kiveto napolnimo do ¾ z destilirano vodo in jo postavimo v
nosilec za kivete SpectroVis.
2. V programu LoggerPro kliknemo jeziček Experiment in nato
Calibrate ter Spectrometer: 1.
3. Počakamo, da steče kalibracija. Potem kliknemo gumb Finish
Calibration.
4. Ko je kalibracija končana, kliknemo gumb OK.
Merjenje s spektrofotometrom SpectroVis
1. Kiveto napolnimo do ¾ z vzorčno raztopino in jo vstavimo v
nosilec za kivete v SpectroVis.
2. Kliknemo Collect in po pribliţno 5 sekundah kliknemo Stop.
3. S klikom na desni gumb miške se nam odpre pogovorno okno,
kjer kliknemo na Graf Options.
4. Odpre se pogovorno okno Graph Options, kjer kliknemo na
jeziček Axes Options.
5. V okvirčku Y – Axis pri okenčku Top vtipkamo 2,500 in
shranimo nastavitve s klikom na Done. Tako smo os y
prilagodili našim meritvam.
6. Ko ţelimo opraviti novo meritev, kliknemo Collect in odpre se
pogovorno okno Erase Data?. Kliknemo Erase and Continue
in nadaljujemo z zbiranjem novih podatkov.
7. Grafe sproti shranjujemo.
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
6
Navodilo za varno delo s spektrofotometrom SpectroVis
Raztopine, ki jih damo v merilno kiveto, morajo biti popolnoma
bistre.
Površina kivete mora biti suha in čista – če ni, jo očistimo s
kosmom vate in malo acetona.
Kivete prijemamo s prsti na obrušenih straneh, in ne na straneh,
skozi katere potuje svetlobni ţarek.
Kiveto napolnimo največ 1/3 do roba. Ko kiveto vstavimo v
spektrofotometer, zapremo pokrov.
Ukrepi ob
motnjah
Če absorpcija zelo niha, vzamemo kiveto ven, jo izpraznimo in
skrbno očistimo ter posušimo.
O razlitju raztopine v spektrofotometru takoj obvestimo laboranta.
Vzdrževanje Pazimo, da ne polivamo raztopin iz kivete znotraj in izven
spektrofotometra SpectroVis.
Kivete po uporabi skrbno speremo in posušimo.
Neupoštevanje
navodil
Nenatančne meritve.
Uničenje SpectroVis-a zaradi morebitnega razlitja tekočin.
(Ambrožič Dolinšek, 2010, str. 64; Likar, 2011, str. 12 in Vernier, 2008)
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in
matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
7
Priloga D: Rezultati meritev umeritvene krivulje za glukozo
Slika 31: Prva meritev absorbance v epruveti 1g
Slika 32: Druga meritev absorbance v epruveti 1g
Slika 33: Tretja meritev absorbance v epruveti 1g
Slika 34: Prva meritev absorbance v epruveti 2g
Slika 35: Druga meritev absorbance v epruveti 2g
Slika 36: Tretja meritev absorbance v epruveti 2g
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in
matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
8
Slika 37: Prva meritev absorbance v epruveti 3g
Slika 38: Druga meritev absorbance v epruveti 3g
Slika 39: Tretja meritev absorbance v epruveti 3g
Slika 40: Prva meritev absorbance v epruveti 4g
Slika 41: Druga meritev absorbance v epruveti 4g
Slika 42: Tretja meritev absorbance v epruveti 4g
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in
matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
9
Slika 43: Prva meritev absorbance v epruveti 5g
Slika 44: Druga meritev absorbance v epruveti 5g
Slika 45: Tretja meritev absorbance v epruveti 5g
Slika 46: Prva meritev absorbance v epruveti 6g
Slika 47: Druga meritev absorbance v epruveti 6g
Slika 48: Tretja meritev absorbance v epruveti 6g
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in
matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
10
Slika 49: Prva meritev absorbance v epruveti 7g
Slika 50: Druga meritev absorbance v epruveti 7g
Slika 51: Tretja meritev absorbance v epruveti 7g
Slika 52: Prva meritev absorbance v epruveti 8g
Slika 53: Druga meritev absorbance v epruveti 8g
Slika 54: Tretja meritev absorbance v epruveti 8g
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in
matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
11
Slika 55: Prva meritev absorbance v slepi epruvetig
Slika 56: Druga meritev absorbance v slepi
epruvetig
Slika 57: Tretja meritev absorbance v slepi
epruvetig
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in
matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
12
Priloga E: Rezultati meritev umeritvene krivulje za fruktozo
Slika 58: Prva meritev absorbance v epruveti 1f
Slika 59: Druga meritev absorbance v epruveti 1f
Slika 60: Tretja meritev absorbance v epruveti 1f
Slika 61: Prva meritev absorbance v epruveti 2f
Slika 62: Druga meritev absorbance v epruveti 2f
Slika 63: Tretja meritev absorbance v epruveti 2f
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in
matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
13
Slika 64: Prva meritev absorbance v epruveti 3f
Slika 65: Druga meritev absorbance v epruveti 3f
Slika 66: Tretja meritev absorbance v epruveti 3f
Slika 67: Prva meritev absorbance v epruveti 4f
Slika 68: Druga meritev absorbance v epruveti 4f
Slika 69: Tretja meritev absorbance v epruveti 4f
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in
matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
14
Slika 70: Prva meritev absorbance v epruveti 5f
Slika 71: Druga meritev absorbance v epruveti 5f
Slika 72: Tretja meritev absorbance v epruveti 5f
Slika 73: Prva meritev absorbance v epruveti 6f
Slika 74: Druga meritev absorbance v epruveti 6f
Slika 75: Tretja meritev absorbance v epruveti 6f
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in
matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
15
Slika 76: Prva meritev absorbance v epruveti 7f
Slika 77: Druga meritev absorbance v epruveti 7f
Slika 78: Tretja meritev absorbance v epruveti 7f
Slika 79: Prva meritev absorbance v epruveti 8f
Slika 80: Druga meritev absorbance v epruveti 8f
Slika 81: Tretja meritev absorbance v epruveti 8f
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in
matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
16
Slika 82: Prva meritev absorbance v slepi epruvetif
Slika 83: Druga meritev absorbance v slepi
epruvetif
Slika 84: Tretja meritev absorbance v slepi epruvetif
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in
matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
17
Priloga F: Rezultati meritev rastlinskega tkiva
Slika 85: Prva meritev absorbance v ekstraktu
čebule
Slika 86: Druga meritev absorbance v ekstraktu
čebule
Slika 87: Tretja meritev absorbance v ekstraktu
čebule
Slika 88: Prva meritev absorbance v ekstraktu trave
Slika 89: Druga meritev absorbance v ekstraktu
trave
Slika 90: Tretja meritev absorbance v ekstraktu
trave
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
18
Priloga G: Anketni vprašalnik
ANKETNI VPRAŠALNIK
Pozdravljeni!
Pri diplomski seminarski nalogi z naslovom Kvantitativna metoda za določanje
redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom moram narediti evalvacijo metode, ki sem jo pri
vajah iz Fitofiziologije opravila z vami. Zato vas lepo prosim, da si vzamete čas in
odgovorite na nekaj vprašanj v povezavi z omenjeno metodo. Anketa je anonimna in bo
uporabljena izključno za evalvacijo pri moji diplomski seminarski nalogi.
1. Smer študija:
2. Letnik:
Na vprašanja od 3 do 6 odgovorite tako, da obkrožite številko – 1 za najslabše ocenjeno in
10 za najboljše.
3. Razumljivost navodil: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
4. Teţavnost metode: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
5. Dolţina metode: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
6. Natančnost metode: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Na vprašanja od 7 do 9 odgovorite tako, da obkrožite podane odgovore glede na
ustreznost navedenih trditev.
7. Metoda mi je pripomogla k
laţjemu razumevanju snovi. Popolnoma se
ne strinjam
Se ne
strinjam
Ne
vem
Se
strinjam
Popolnoma
se strinjam
8. Metoda je uporabna pri študiju
izpitnega gradiva pri predmetu
Fitofiziologija.
Popolnoma se
ne strinjam
Se ne
strinjam
Ne
vem
Se
strinjam
Popolnoma
se strinjam
9. Metoda je dosegla moja
pričakovanja. Popolnoma se
ne strinjam
Se ne
strinjam
Ne
vem
Se
strinjam
Popolnoma
se strinjam
Na vprašanji 10 in 11 odgovorite z obkrožitvijo odgovora Da ali Ne.
10. Ali ste pričakovali takšne rezultate? Da Ne
11. Ali ste imeli kje teţave pri izvedbi? Da Ne
12. Ali ste se ţe kdaj srečali s to metodo? Če ste odgovorili z da, kje ste jo spoznali?
Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska
naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.
19
13. Kaj bi spremenili?
14. Načrtujte raziskavo, v kateri bi uporabili to metodo.
Hvala za sodelovanje.
Sandra Zvonar, absolventka biologije in geografije