Bol. San. Veg. Plagas, 31: 287-297,2005

Distribución y diversidad de los tipos de compatibilidadvegetativa de Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr en castañosde Castilla y León

O. AGUÍN, M. MATA, J. P. MANSILLA, A. B. MARTÍN, J. M. SIERRA

Se ha estudiado la distribución y diversidad de Cryphonectria parasítica, ascomice-to responsable del chancro, en masas de castaños de la Comunidad Autónoma de Casti-lla y León durante los años 2003 y 2004. Se recogieron 261 muestras de corteza de árbo-les sintomáticos, confirmándose la presencia de C.parasítica en el 91% de las muestrasanalizadas. Los caracteres morfológicos y la extracción del dsRNA no identificó ningu-na cepa como hipovirulenta. A partir del estudio de 239 aislados de C. parasítica, sedetectaron 8 tipos de compatibilidad vegetativa (ve). Tres fueron compatibles con lascepas europeas de referencia. El tipo ve 1 fue compatible con EU1, el tipo ve 2 conEU12 y el tipo ve 6 con EU28. La mayoría de los aislados se incluyeron en el tipo ve 1.En León se detectaron 4 tipos ve, en Zamora 6 y en Burgos 1. Se estableció una mediade 3.6 tipos ve por provincia. El mayor índice de diversidad de Shannon se detectó enZamora con un 1,42. La baja diversidad de los tipos ve de C. parasítica encontrados enCastilla y León facilitará la implantación de un programa de control biológico.

O. AGUÍN, M. MATA, J. P. MANSILLA. Estación Fitopatológica "Do Areeiro". Excma.Diputación Provincial. Subida a la Robleda s/n. 36153 Pontevedra, www.efa-dip.orgA. B. MARTÍN, J. M. SIERRA. Centro de Sanidad Forestal de Calabazanos. Consejería deMedio Ambiente. Junta de Castilla y León. Polígono Industrial de Villamuriel, s/n. Villa-muriel de Cerrato, 34190 Palencia.sanidad.forestal@jcyl.es

Palabras clave: Castanea sativa, Castilla y León, chancro, diversidad genética

INTRODUCCIÓN

Cryphonectria (Endothia) parasítica(Murrill) Barr, identificado en 1906 comoDiaporthe parasítica (Murrill), es un asco-miceto responsable de la enfermedad deno-minada chancro del castaño. Este hongo, deorigen asiático, fue introducido en Europa,concretamente en Genova (Italia), en 1938(BIRAGHI, 1946). La enfermedad se extendiórápidamente ocasionando una gran destruc-ción de los castaños europeos {Castaneasativa Mili); en 1967 la mayoría de las áreascultivadas con castaños estaban afectadas(ALLEMANN et al, 1999).

En España, Rodríguez Sardina identificóen 1940 a Endothiella gyrosa Sacc. comocausante de una sintomatología similar alchancro en una plantación de castaños asiá-ticos {Castanea crenata Sieb. et Zuce.) enCorgoma de Valdeorras (Galicia). Pero laprimera vez que se hace referencia a Endot-hia parasítica como responsable del chancrodel castaño es en Vizcaya en 1947 (ELORRIE-

TA, 1949). En la actualidad, C. parasíticaafecta gravemente a los sotos del norte de laPenínsula Ibérica (HOMS et al., 2002).

Cryphonectria parasítica está encuadradoen la lista A2 de la EPPO (European PlantProtection Organization) como patógeno de

Figura 1. Vista aérea de castaños en Castropetre (León).

cuarentena y recogido en la legislación espa-ñola en el Anexo II, Parte A, Sección II, letrac) del Real Decreto 58/2005, de 21 de enero,por el que se adoptan medidas de proteccióncontra la introducción y difusión en el terri-torio nacional y de la Comunidad Europeade organismos nocivos para los vegetales oproductos vegetales, así como para la expor-tación y tránsito hacia países terceros.

La gravedad de los daños que C. parasiti-ca causa en los castaños ha llevado a la bús-queda de métodos eficaces de control. En losúltimos años, los estudios se han centrado enel control biológico mediante la utilizaciónde cepas hipo virulentas, que son menospatógenas y pueden transmitir su efecto a lascepas normales virulentas, provocando lacicatrización espontánea de los chancros(GRENTE, 1965).

La hipovirulencia consiste en una atenua-ción de la virulencia provocada por la infec-ción de C. parasitica con un hipovirus que

posee un ARN de doble cadena (dsRNA). Elvirus se transmite por anastomosis hifales,produciendo la conversión de la cepa viru-lenta en hipovirulenta (ANAGNOSTAKIS, 1977;CHOI y Nuss, 1992). Hasta hace poco tiem-po, la diferenciación entre cepas hipoviru-lentas y virulentas se basaba únicamente encaracterísticas morfológicas de los aislados,como: ausencia de cuerpos de fructificacióny coloración, crecimiento y textura del mice-lio, lo que llevaba en algunos casos a resul-tados confusos. En los últimos años, se handesarrollado técnicas de biología molecularque permiten la determinación rápida y fia-ble de las cepas hipovirulentas (VALDEZATE

é?fa/.,2001).Se ha podido demostrar que la compati-

bilidad vegetativa entre cepas de este hongoes uno de los principales factores que afectaa la dispersión natural del hipovirus, y quepor lo tanto influye en el éxito del controlbiológico del chancro del castaño (MILGRO-

OM et al, 1996; CORTESI et al., 1998). Paraque se produzca la conversión de la cepavirulenta en hipovirulenta, ambas deben per-tenecer al mismo grupo de compatibilidad;este proceso resultará más eficaz si se utili-zan cepas hipovirulentas obtenidas espontá-neamente en la zona donde se quiere realizarel control (MANSILLA et al., 2000). Cuantosmenos grupos de compatibilidad existan enuna zona, más efectivo será el control basa-do en el fenómeno de la hipovirulencia,como se ha demostrado en Francia (GRENTEy BERTHELAY-SAURET, 1978) y en Italia(BisiACH<?/a/., 1995).

En Castilla y León, según datos del IIInventario Forestal Nacional de 1995, loscastañares puros de C. sativa ocuparían unas17.126 ha, desglosadas en 9.292 ha en laprovincia de León (siendo más abundante enlas comarcas noroccidentales) y 7.834 ha enSalamanca (Fig. 1). Estas cifras han podidofluctuar cuantiosamente debido sobre todo ados causas: por un lado, la superficie actualpoblada por castaños sería sensiblementemayor de la reflejada si tenemos también encuenta las masas mixtas; por otro, podríanestar notablemente reducidas si tenemos encuenta el azote de incendios, el abandono delos cultivos, y la incidencia de las enferme-dades de la tinta y el chancro, incrementadasobre todo en los últimos 50 años.

Desde el 2000, se han llevado a caboregularmente muéstreos de material sinto-mático en masas de castaño de las provinciascastellano leonesas (León, Zamora, Burgos,Avila, Salamanca), que han permitidoconstatar un aumento en la presencia de C.parasitica en las provincias de León, Zamo-ra y Burgos (HERNÁNDEZ, comunic. perso-nal). La provincia de León, que cuenta conmayor número de sotos, es la que se encuen-tra más dañada por la acción de este hongo.

El castaño se cultiva principalmente parala producción de fruto, por lo que las laboresde poda, injertado, gradeos y otras, resultanel principal agente difusor de la enfermedaddel chancro. La mayor parte de las masasafectadas son de propiedad privada, lo cualhace muy difícil un control para la correcta

realización de labores culturales. No obstan-te algunas masas cultivadas para la produc-ción de madera en monte bajo, como es elcaso de pequeños castañares residuales alnorte de la provincia de Burgos, también sehan visto colonizadas por este patógeno.

A pesar de esta situación hasta el momen-to no se había realizado ningún estudio sobrelas poblaciones de Cryphonectria parasiticaen esta región, por eso el objetivo de este tra-bajo fue conocer la distribución del chancroen castaños de Castilla y León, detectarcepas hipovirulentas, y determinar los gru-pos de compatibilidad vegetativa, como pasoprevio al establecimiento de un programa decontrol biológico.

MATERIAL Y MÉTODOS

1. Localización y muestreo de Crypho-nectria parasitica

En León se inspeccionaron 111 localidadesen las que vegetaban masas adultas de C. sati-va y 68 de reciente repoblación, recogiéndose211 muestras de corteza con síntomas de laenfermedad. En Burgos se visitaron dosmasas, de las que se tomaron 30 muestras,mientras que en Zamora, se inspeccionaronsiete y se obtuvieron 20 muestras.

Una vez en el soto o castañar selecciona-do, se buscaron árboles con característicasexternas de la enfermedad como: hincha-

Figura 2. Árbol afectado por Cryphonectriaparasitica.

Figura 3. Hendiduras y grietas longitudinalescaracterísticas del chancro del castaño.

Figura 4. Micelio de Cryphonectria parasitica situadodebajo de la corteza.

miento de corteza, hendiduras longitudina-les, presencia de cuerpos de fructificación,etc. (Figs. 2, 3 y 4).

2. Recogida de material vegetalUna vez seleccionado el árbol con sínto-

mas de chancro, se localizó la zona de avancedel hongo, delimitando los bordes de lalesión, y se cortaron tiras de la corteza lesio-nada que incluían la zona subcortical. Serecogió una sola muestra por chancro y árbol.Las muestras de corteza se guardaron en bol-sas debidamente codificadas que se conserva-ron a 4 °C hasta su remisión a laboratorio.

La zona dañada se cubrió con una capa de"mastic" cicatrizante con acción fungicida.Todo el instrumental empleado se desinfectócon hipoclorito sódico al 50% antes de tomaruna nueva muestra. Cada punto de muestreoquedó localizado mediante coordenadasUTM.

3. Aislamiento de Cryphonectria para-sitica

En el laboratorio, cada muestra de cortezase troceó en pequeños fragmentos ( 3 x 2cm), que se sometieron, en condiciones

asépticas, a una desinfección superficialmediante un tratamiento en primer lugar conhipoclorito sódico al 50% y después conagua destilada estéril, ambos pasos en agita-ción durante 30 segundos.

Posteriormente los fragmentos se lavaronen dos soluciones, de etanol y de hipocloritosódico al 50% respectivamente, y se sembra-ron en placas Petri con medio PDA (PatataDextrosa Agar, Difco) suplementado conmetionina (100 mg/L) y biotina (1 mg/L)(PDAmb). Las placas se mantuvieron en estu-fa de cultivo en oscuridad a 24±1°C. Des-pués de 4-5 días de incubación, se transfirióun fragmento del micelio crecido a unanueva placa de medio de cultivo PDA y seincubó en las mismas condiciones.

4. Identificación de cepas de Cryphonec-tria parasitica virulentas e hipovirulentas

La identificación de la virulencia de losaislados de C. parasitica se basó en primerlugar en los criterios morfológicos descritospor GARBELOTTO et al. (1992): color de lascolonias, presencia o ausencia de picnidios,textura y grado de crecimiento en el mediode cultivo.

Para detectar aislados hipovirulentos, serealizó la extracción del dsRNA del hipovi-rus. Para ello el micelio se hizo crecer en elmedio de cultivo PDA sobre celofán y semantuvo en oscuridad en estufa de cultivo a24±1°C. Una vez que el hongo cubría lasuperficie de toda la placa, se retiró el celofány el micelio resultante se liofilizó. A partir delmaterial liofilizado se realizó el método deextracción con celulosa CF 11 (MORRIS yDODDS, 1979). A continuación se hizo unaelectroforesis en gei de agarosa al 0,8% entampón TBE IX a 100 voltios durante 60minutos. En cada prueba se incluyó un con-trol positivo (micelio hipovirulento suminis-trado por el Dr. Cortesi) y otro negativo(ausencia de dsRNA), además del marcadorX Hind III. Después de la electroforesis el geise tiñó en una solución de bromuro de etidiodurante 30 minutos, se capturó la imagen enel sistema de documentación SYNGENE y seanalizó mediante el programa de densiome-tría 1-D Manager (TDI, Madrid).

5. Estudio de la compatibilidad vege-tativa

El estudio de la compatibilidad vegetativade los aislados de C.parasitica, obtenidos enlas tres provincias muestreadas, se llevó acabo mediante el método de barrera/fusiónen el medio PDAg descrito por POWELL(1995), que contiene caldo de patata dextro-sa (24 g/L), extracto de malta (7 g/L), extrac-to de levadura (2 g/L). ácido tánico (0,8 g/L)y agar (20 g/L), suplementado con el colo-rante bromocresol verde (50 mg/L) que faci-lita la observación de la barrera formadaentre los aislamientos incompatibles (COR-TESI et al, 1996, 1998). Se utilizaron 239aislados, 191 procedentes de León, 28 deBurgos y 20 de Zamora. Los aislados de C.parasitica obtenidos en cada provincia seenfrentaron entre sí en todas las combinacio-nes posibles, y un aislado de cada tipo decompatibilidad vegetativa (ve) resultante seconservó como representante del grupo.

En el desarrollo del método, dos peque-ños fragmentos de cada micelio de 7 días devida media, se enfrentaron en placas Petri a

Figura 5. Aislado virulento de Cryphonecíriaparasitica en el medio de cultivo PDA.

1 cm del margen y separados entre sí por 1mm. En cada placa se incluyeron ocho pares,que se incubaron durante 1 semana a 24±1°Cen oscuridad.

Para la interpretación de los resultados,dos aislamientos se consideraron compati-bles cuando los micelios enfrentados sefusionaron completamente, mientras que unareacción incompatible se apreció por la for-mación de una barrera o línea negra entre losdos micelios visible en la base de la placaPetri.

Se estimó la diversidad de los tipos ve encada provincia expresado como el ratio entreel número de tipos ve y el tamaño de mues-tra (S/N) y el índice de diversidad de Shan-non (ANAGNOSTAKIS et al., 1986; CORTESI etal, 1996 ; ROBIN et al., 2000).

Los grupos de cada provincia se enfrenta-ron entre si y finalmente los ve resultantes enCastilla y León se confrontaron con lascepas de la colección de referencia europea(EU1 aEU64).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Distribución de Cryphonectria para-sitica

Los resultados del muestreo realizadopara evaluar la presencia y la distribución de

Figura 6. Confrontación incompatible (A) y compatible (B) de aislados de Cr\phonectria parasitica en el medio decultivo PDAg.

C. parasitica en Castilla y León se presentanen el Cuadro 1.

Durante el año 2003 se inspeccionaron untotal de 121 puntos recogiendo material sin-tomático de chancro en 261 árboles. Poste-riormente, en el laboratorio se obtuvo un ais-lado de C. parasitica en el 91% de las mues-tras de corteza analizadas (Fig. 6).

En Castilla y León, la presencia de chan-cro se ve, por el momento, limitada a las pro-vincias ya citadas de León, Zamora y Burgos.En León, solamente los ayuntamientos de laparte sur de la Sierra de la Cabrera, donde elcastaño forma pequeños sotos, permanecelibre de chancro. En el resto de municipios,C. parasitica se encuentra presente en por-centajes que varían del 5% al casi 100% delos ejemplares afectados. Los chancros apa-recen tanto en fustes como en ramas, siendomás frecuente su desarrollo a partir de laslabores efectuadas para su formación y pro-

ducción de fruto comercializable. La expan-sión de la enfermedad en la parte occidentalleonesa es actualmente muy rápida, sobretodo en los últimos años, lo que le ha llevadoa colonizar incluso las zonas más alejadas delos principales focos infectivos.

En Zamora, si bien hasta hace escasamen-te cuatro años podíamos encontrarnos laenfermedad en un único foco, a día de hoy sepuede encontrar puntualmente en muy diver-sas zonas de la provincia, debido principal-mente al comercio de material vegetal infec-tado a partir del foco detectado inicialmente yde comarcas fronterizas gallegas y portugue-sas. El total desconocimiento por parte de lapoblación del ciclo infectivo del hongo, estásuponiendo un grave problema a la hora defrenar la creciente difusión de esta patología.

El foco infectivo localizado en la provin-cia de Burgos, uno de los primeros sotos quese vio colonizado por la enfermedad a partir

Cuadro 1. Localidades visitadas, zonas inspeccionadas, muestras recogidas y porcentaje de aislamiento deC. parasitica en castaños de tres provincias de Castilla y Léon.

de las masas cercanas de provincias vascas,resiste parcialmente tras muchos años deconvivir con el hongo. Los buenos creci-mientos de las varas provenientes de montebajo que se vienen reservando para fustes demadera, son el principal condicionante a lahora de verse pronto y gravemente afectadospor el chancro del castaño, ya que formanumerosas grietas en la corteza que suponenuna sencilla vía de entrada para el hongo.

La incidencia de C. parasitica también hasido estudiada en otras zonas del norte deEspaña (VALDEZATE et al, 2001; HOMS et al.,2002) confirmando el alto nivel de presenciade esta enfermedad.

2. Diversidad de los tipos de compatibi-lidad vegetativa de C. parasitica

El análisis morfológico y la caracteriza-ción del ARN de doble cadena para la iden-tificación de los aislados de C. parasitica,permitió clasificar todos los aislados obteni-dos como virulentos. Las características máscomunes fueron un crecimiento rápido en elmedio de cultivo PDA, micelio de color ana-ranjado y abundantes picnidios.

Se establecieron ocho tipos de compatibi-lidad vegetativa en las tres provincias estu-diadas a partir de los 239 aislados virulentosanalizados. Cada aislado fue incluido en unúnico tipo ve. El número de tipos ve detecta-dos en cada provincia varió de 1 a 6 (Cuadro2). Se determinaron cuatro tipos que única-mente estaban constituidos por un único ais-lado (tipos 4,5,6 y 7).

Las confrontaciones incompatibles mos-traban una línea negra de diferente intensi-dad dependiendo de los aislados enfrentadospero que no seguía un criterio específicopara su interpretación (Fig. 6a). En el caso delas confrontaciones compatibles se producíaun crecimiento común de los miceliosenfrentados sin observar ningún obstáculo ala fusión de las hifas (Fig. 6b).

Así, en la provincia de Zamora, a partir delos veinte aislados estudiados, se obtuvieron6 tipos de compatibilidad vegetativa aunquela mayoría de los aislados (75%) se incluye-ron en dos tipos.

En Burgos, los 28 aislados analizados seincluyeron en un solo tipo de compatibili-dad, esta baja variabilidad puede entenderseporque las muestras recogidas pertenecían a2 ubicaciones próximas. Por otro lado enLeón se establecieron 4 tipos para un total de191 cepas pero el denominado tipo ve 1incluía al 82% de los aislados (Cuadro 2).

De esta manera se determinaron 6 gruposen Zamora, 1 en Burgos y 4 en León. Lacompatibilidad entre los grupos de cada pro-vincia indicó la presencia de un mismo tipoen las tres provincias, concretamente ZA1,BU1 y LEÍ, que se correspondía con el tipove 1 (80% de los aislados).

En el estudio de la compatibilidad vegeta-tiva con las cepas de referencia europeas(EU1-EU64) se encontró que el tipo ve 1 eracompatible con la cepa EU1 (genotipo 2212-22). El tipo ve 2, localizado únicamente enZamora y representado por dos aislados, fuecompatible con el tipo europeo EU12 (geno-tipo 1112-11) mientras que el tipo ve 6, ubi-cado también en la provincia de Zamora, fuecompatible con EU28 (genotipo 2212-11).

Los tipos EU1 y EU12 se encuentran den-tro de los más frecuentes en Europa y se hapublicado su presencia en diferentes paíseseuropeos: Macedonia, Grecia, Sicilia, Espa-ña, Francia, Bosnia-Herzegovina, Italia,Suiza, Eslovakia (TRESTIC et al., 2001; COR-TESI et al., 1998; ADAMCIKOVÁ y JUHÁSOVÁ,2003). El tipo EU28 es menos habitual y seha detectado en Bosnia-Herzegovina en bajaproporción (TRESTIC et al., 2001).

En las Figs. 7, 8 y 9 se representa la dis-tribución de los 8 tipos de compatibilidadvegetativa de C. parasitica determinados enlas provincias de Burgos, León y Zamora,respectivamente.

De los ocho grupos encontrados en estetrabajo solo tres mostraron compatibilidadcon las cepas de referencia europeas mien-tras que cinco fueron incompatibles contodas. Estos resultados pueden explicarse yaque, en un primer momento se creyó que elsistema de incompatibilidad vegetativa de C.parasitica estaba controlado por 6 loci deincompatibilidad vegetativa (vic), cada uno

a Tamaño de cada provincia (n° de aislados).b N° de ve encontrados en cada provincia.c índice de diversidad de Shannon: H' = -(Spi In pi), donde pi es la frecuencia de cada tipo ve.

Figura 7. Distribución de los tipos de compatibilidadvegetativa (ve) de Cryphonectña parasitica en la

provincia de Burgos.

de ellos con dos alelos. De esa manera conesos 6 loci vie eran posibles 64 genotipos(26=64), lo que daba lugar a los 64 tipos decompatibilidad vegetativa establecidos enEuropa (CORTESI y MILGROOM, 1998), perolos estudios de compatibilidad realizados endistintas localizaciones europeas, similaresal llevado a cabo en el presente trabajo, indi-can que al menos es necesario un gen vic oun alelo adicional para describir de maneracompleta el determinismo genético de lostipos ve (ROBIN et al., 2000), de tal maneraque en la actualidad los tipos de compatibili-dad ya no son 64 sino que se han incluido 10tipos ve más (ROBIN et al., 2000).

En España, y más concretamente en Cata-luña, TRESTIC etal. (2001) encuentran al tipoEU2 como el tipo dominante (71% de losaislados) aunque en menor proporción tam-bién detectaron los tipos EU1, EU12 y EU5.

El índice de diversidad de Shannon varióentre 0 y 1,42 (cuadro 2). En Burgos todos losaislados pertenecían al mismo tipo mientrasque en León se ha observado una diversidaddel 0,596 que coincide con lo determinado enotras zonas (PENNISI et al, 1992). La diversi-dad detectada en este estudio es baja pero

Figura 8. Distribución de los tipos de compatibilidad vegetativa (ve) de Cryphonectria parasitica en la provincia de León.

puede verse incrementada con el tiempo porla introducción de nuevos alelos vic y la con-siguiente recombinación con los tipos ya exis-tentes dando lugar a una mayor variabilidad,por eso es imprescindible llevar a cabo medi-

das preventivas que eviten la importación decastaños afectados procedentes de otras áreas.

Este primer trabajo sobre la distribución ydiversidad de los tipos de compatibilidadvegetativa de las poblaciones de C. parasiti-

Figura 9. Distribución de los tipos de compatibilidad vegetativa (ve) de Cryphonectria parasitica en la provincia de Zamora.

ca en Castilla y Léon facilitará la puesta enmarcha de un programa para el control bioló-gico de esta enfermedad aunque se necesitanmás investigaciones encaminadas a comple-tar el estudio de compatibilidad con los nue-vos tipos europeos incluidos en la colección,a la detección de cepas hipovirulentas com-patibles con los tipos ve más extendidos o ala realización de pruebas de conversión paraobtener la transmisión del hipovirus entrecepas no compatibles (CORTESI et al., 1998).

AGRADECIMIENTOS

Queremos agradecer la aportación a estetrabajo del Dr. P. Cortesi y del Dr. M. Mil-groom por facilitarnos las cepas de referen-cia europeas y micelio hipovirulento para elestudio del dsRNA. A Dña. Paula Zamorapor su labor de muestreo. A Dña. AngelesBarros, por su trabajo en el procesamiento demuestras y a D. Manuel Vilas por el trata-miento informático de los datos.

ABSTRACT

AGUÍN O., M. MATA, J. P. MANSILLA, A. B. MARTÍN, J. M. SIERRA. 2005. Distributionand diversity of types of compatibility vegetative of Cryphonectria parasitica in chesnutstands in Castilla-León. Bol. San. Veg. Plagas, 31: 287-297.

The distribution and diversity of Cryphonectria parasitica, ascomyeete responsible ofchestnut blight, were studied in 2003 and 2004 in Castilla and León. 261 samples werecollected and Cryphonectria parasitica was detected in 91% of the bark samples analy-sed. No hypovirulent fungal strains were identified by morphological characters anddsRNA extraction. Eight vegetative compatibility groups (vc) were detected among 239isolates. Three vc types were compatible with European testers. Most isolates were inclu-ded in type vc 1, which was compatible with the European tester EU1. The type vc 2 wascompatible with EU12 and the type vc 6 with EU28. In León 4 vc types were determi-ned, 6 in Zamora and 1 in Burgos. There was an average of 3.6 types found per provin-ce. The highest Shannon diversity index was detected in Zamora with a 1.42. The lowdiversity of C. parasitica vc types found in Castilla-León will facilitate the establishmentof a biological control program.

Key words: Castanea sativa, Castilla and León, Chesnut blight, genetic diversity

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(Recepción: 15 noviembre 2004)(Aceptación: 15 febrero 2005)