DIZERTAČNÁ PRÁCA - potravinarstvo.com · ICAR International Committee for Animal Recording IDF International Dairy Federation – Medzinárodná mliekarenská federácia ISO International

SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA

V NITRE

FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA

DIZERTAČNÁ PRÁCA

Nitra 2006 Ing. Peter Zajác

SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE

FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA

Dekan: prof. Ing. Jozef Bulla, DrSc.

OPTIMALIZÁCIA REFERENČNEJ METÓDY STANOVENIA POČTU

SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM KRAVSKOM MLIEKU

DIZERTAČNÁ PRÁCA

Katedra hygieny a bezpečnosti potravín

Vedúci katedry: doc. Ing. Jozef Golian, Dr.

Školiteľ dizertačnej práce: prof. MVDr. Jozef Sokol, DrSc.

Školiteľ špecialista: doc. Ing. Jozef Golian, Dr.

Dizertačnú prácu predkladá: Ing. Peter Zajác

NITRA 2006

ABSTRAKT

Mastitída patrí medzi najdôležitejšie ochorenia hovädzieho dobytka. Hlavným

indikátorom a diagnostickým štandardom pri zisťovaní mastitídy sú somatické bunky.

V súčasnosti sa na hodnotenie počtu somatických buniek v bežnej praxi používa metóda,

podľa STN EN ISO 13366-3 (2001) Fluorescenčná optická elektronická metóda. Ako

referenčná metóda sa používa metóda podľa STN EN ISO 13366-1 (2001) Mikroskopická

metóda za použitia farbiva metylénovej modrej alebo etídium bromidu.

V experimente 1 sme overili možnosť využitia referenčnej metódy s použitím etídium

bromidu. Metódu sme porovnali s ďalšou mikroskopickou metódou, ktorej farbenie bolo

založené na princípe farbenia používanom u prístrojov typu Fossomatic. Pri farbení sa použil

etídium bromid, farbiaci roztok sa pridával priamo do vzorky mlieka a teplota počas farbenia

bola modifikovaná na 100 °C. Štatisticky zistený rozdiel medzi metódami bol

21 000 SB . ml-1. Z empirických poznatkov vyplýva, že metódy majú viaceré nedostatky,

predovšetkým metodika počítania jadier somatických buniek a výpočet môžu výrazne

ovplyvniť výsledok analýzy.

V nadväznosti na experiment 1 sme vykonali experiment 2, v ktorom sme sa zamerali

na vývoj sekundárneho referenčného materiálu s presným počtom somatických buniek.

Referenčný materiál bol skúšaný v troch laboratóriách. Referenčný materiál s nízkym počtom

somatických buniek (233 500 SB . ml-1) bol stabilný počas celého experimentu. Pri skúšaní

referenčného materiálu s vysokým počtom somatických buniek (454 625 SB . ml-1) bol

zaznamenaný mierny vzostup počtu somatických buniek v laboratóriu č. 1 a v laboratóriu č. 2.

V laboratóriu č. 3 bol zaznamenaný pokles počtu somatických buniek.

V experimente 3 sme navzájom porovnali výsledky piatich mikroskopických metód

stanovenia počtu somatických buniek a inštrumentálnej metódy. Zistili sme, že výsledky

metód sa v priemere významne líšia. Výsledky stanovené modifikovaným pracovným

postupom návrhu normy ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 pri použití etídium bromidu a farbení

pri 100 °C boli o 50 000 SB . ml-1 nižšie v porovnaní s výsledkami stanovenými pri farbení

metylénovou modrou. Výsledky stanovené pracovným postupom návrhu normy ISO/WD

13366-1 IDF 148-1 pri použití etídium bromidu a farbení pri 50 °C boli o 130 000 SB . ml-1

nižšie v porovnaní s výsledkami stanovenými pri farbení metylénovou modrou.

Kľúčové slová: somatické bunky, etídium bromid, mikroskopická metóda, mlieko,

epifluorescencia

ABSTRACT

Mastitis is one of the most important diseases of dairy cattle. Somatic cells are the

main indicator and diagnostic standard for determination of mastitis disease. In the praxes, for

routine determination of somatic cell count an instrumental fluoro-opto-electronic method

according to EN ISO 13366-3 (2001) is used. The reference method is standard ISO 13366-1

(2001) Milk – Enumeration of somatic cells – part 1: Microscopic method, staining with

methylene blue or ethidium bromide.

In the experiment no. 1 we have verified the above mentioned reference method with

ethidium bromide staining. We compared this method with other microscopic method which

principle of staining copied the principle of staining in Fossomatic instruments. Staining was

performed with ethidium bromide, staining solution was directly added to the milk sample

and the temperature during staining was modified to 100 °C. The statistical difference

between methods was 21 000 SC . ml-1. Both methods have several limitations, mostly that

the methodology of somatic cells nuclei counting and calculation can affect the results

markedly.

Consecutively to the experiment no. 1 we performed the experiment no. 2, where we

focused on the development of the secondary reference material with accurate somatic cells

counts. The reference material was analysed at three laboratories. Reference material with low

level of somatic cells (233 500 SC . ml-1) was stable during the whole period of experiment.

Results from the laboratory no. 1 and laboratory no. 2 prove that the reference material with

high level of somatic cells (454 625 SC . ml-1) show an increase of somatic cells, while the

results from laboratory no. 3 indicates a decrease of somatic cells count.

During the experiment no. 3 we compared the results of five different microscopic

methods for somatic cells counting and an instrumental method. We experienced a big

difference between those methods. The results determined by modified working procedure of

the ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 draft with ethidium bromide staining and the temperature

of staining 100 °C were lower by approx. 50 000 SC . ml-1 in comparison with results

determined by methylene blue staining. The results determined by working procedure of

ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 draft with ethidium bromide staining and the temperature of

staining 50 °C, were lower by approximately 130 000 SC . ml-1 while compared to the results

determined by methylene blue staining.

Key words: somatic cells, ethidium bromide, direct microscopic method, milk,

DMSCC, epifluorescence

ČESTNÉ PREHLÁSENIE

Podpísaný Ing. Peter Zajác prehlasujem, že som dizertačnú prácu na tému

„Optimalizácia referenčnej metódy stanovenia počtu somatických buniek v surovom

kravskom mlieku“ vypracoval samostatne s použitím uvedenej literatúry.

Som si vedomý zákonných dôsledkov v prípade, že hore uvedené údaje nie sú

pravdivé.

V Nitre 15. novembra 2006 .........................................................

POĎAKOVANIE

Moja vďaka patrí rodine, priateľom, profesorom, docentom, oponentom a kolegom,

ktorí ma podporovali v mojom úsilí pracovať na realizácii téz tejto práce.

Osobitné poďakovanie patrí Erike Balážovej.

Poďakovanie ďalej patrí: Ing. Renate Novákovej; Ing. Radovanovi Filovi; doc. Ing.

Jozefovi Golianovi Dr.; prof. MVDr. Jozefovi Sokolovi, DrSc; doc. RNDr. Marte Vrábelovej,

CSc.; MVDr. Stanislave Zubrickej; Ing. Zuzane Vácziovej; Dr. Silvii Orlandini a MVDr.

Pavelovi Popelkovi.

Financovanie

Poďakovanie patrí všetkým subjektom, ktoré sa podieľali na financovaní tejto práce.

Práca bola realizovaná z finančných prostriedkov a pomocou technického

a materiálneho vybavenia Štátneho veterinárneho a potravinového ústavu v Nitre na

pracovisku Národného referenčného laboratória pre mlieko a mliečne výrobky v Nitre.

Spolupráca

Poďakovanie patrí všetkým subjektom, ktoré sa podieľali na realizácii tejto práce.

Katedra hygieny a bezpečností potravín, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre

Roľnícke družstvo Rumanová

Milex – Progres a.s.- centrálne skúšobné laboratórium Bratislava

Skúšobné laboratórium EXAMINALA, a.s. Žilina

Sponzorstvo

Poďakovanie patrí všetkým subjektom, ktoré sa podieľali na sponzorovaní tejto práce.

Združenie HACCP Consulting

ZOZNAM POUŽITÝCH SKRATIEK A POJMOV

A.I.A.-L.S.L. Rím A.I.A. Laboratorio Standard Latte, Via dellÌndustria 24, 000 57 Maccarese, Rím, Taliansko

CSL Centrálne skúšobné laboratórium

Cv Variačný koeficient

DICC Diferenciálne počítanie zápalových buniek (diagnostická laboratórna metóda)

EtBr Etídium bromid

GSH-Px Glutatión peroxidáza

ICAR International Committee for Animal Recording

IDF International Dairy Federation – Medzinárodná mliekarenská federácia

ISO International Standard Organisation – Medzinárodná organizácia pre štandardizáciu

IUPUI Indiana University-Purdue University Indianapolis

KTJ Kolóniotvorné jednotky. Počet živých buniek, resp. zhlukov buniek, schopných po prenesení na vhodné živné médium tvoriť kolónie

MAF NZ Ministry of Agriculture and Forestry New Zealand

NMC National Mastitis Council, A global organisation for mastitis control and milk quality

NRLM Nitra Národné referenčné laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky Nitra

NZFSA New Zealand Food Safety Authority

PMN Polymorfonukleárne neutrofilné leukocyty

PSB Počet somatických buniek

SB Somatické bunky

SNAS Slovenský národný akreditačný systém

ŠVPS SR Štátna veterinárna a potravinová správa Slovenskej republiky

ŠVPÚ Nitra Štátny veterinárny a potravinový ústav Nitra

UHT Ultra vysoko tepelný záhrev mlieka

USDA United States Department of Agriculture „interný limit“ (medzná hodnota)

Teoretický interval, v ktorom by sa mali nachádzať výsledky stanovené v NRLM pri skúšaní referenčnej vzorky

„externý limit“ (medzná hodnota)

Teoretický interval v ktorom by sa mali nachádzať výsledky stanovené laboratóriami pri skúšaní referenčnej vzorky

OBSAH

ÚVOD ..................................................................................................................................................... 12 1 PREHĽAD LITERATÚRY ........................................................................................................................ 14 1.1 MASTITÍDA .................................................................................................................................................... 14 1.1.1 VPLYVY VYVOLÁVAJÚCE MASTITÍDU ............................................................................................................. 14 1.1.1.1 MAKROORGANIZMUS DOJNICE ....................................................................................................................... 14 1.1.1.2 VONKAJŠIE PROSTREDIE ................................................................................................................................. 15 1.1.1.3 INFEKČNÝ ČINITEĽ.......................................................................................................................................... 16 1.1.2 MIKROORGANIZMY VYVOLÁVAJÚCE MASTITÍDU............................................................................................ 17 1.1.3 DIAGNOSTIKOVANÉ FORMY MASTITÍD............................................................................................................ 20 1.1.4 ZÁPAL MLIEČNEJ ŽĽAZY ................................................................................................................................. 22 1.1.5 TERAPIA MASTITÍD ......................................................................................................................................... 24 1.1.6 PREVENCIA MASTITÍD..................................................................................................................................... 29 1.1.6.1 DEZINFEKCIA CECKOV A LIEČBA V OBDOBÍ STÁTIA NA SUCHO....................................................................... 29 1.1.6.2 DODRŽIAVANIE HYGIENICKÝCH ZÁSAD V PRIEBEHU DOJENIA ........................................................................ 31 1.1.6.3 VYRADENIE CHRONICKY CHORÝCH DOJNÍC .................................................................................................... 37 1.1.6.4 SEGREGÁCIA DOJNÍC ...................................................................................................................................... 37 1.1.6.5 VAKCINÁCIA DOJNÍC ...................................................................................................................................... 37 1.1.6.6 LIEČBA KLINICKEJ MASTITÍDY POČAS LAKTÁCIE ............................................................................................ 38 1.2 VPLYV MASTITÍDY NA PRODUKCIU, ZLOŽENIE A TECHNOLOGICKÚ KVALITU

MLIEKA A MLIEČNYCH VÝROBKOV ................................................................................................ 39 1.3 NEBEZPEČENSTVO ASOCIOVANÉ S KONZUMÁCIOU MASTITÍDNEHO MLIEKA ................ 43 1.4 ÚLOHA NÁRODNÉHO REFERENČNÉHO LABORATÓRIA PRE MLIEKO A MLIEČNE

VÝROBKY VO VZŤAHU K SOMATICKÝM BUNKÁM, SYSTÉM KONTROLY........................... 46 1.5 PRÁVNE NORMY A POČET SOMATICKÝCH BUNIEK ................................................................... 48 1.6 CHARAKTERISTIKA SOMATICKÝCH BUNIEK ............................................................................... 50 1.6.1 BUNKY POCHÁDZAJÚCE Z KRVI ...................................................................................................................... 50 1.6.1.1 BUNKY BIELEHO KRVNÉHO OBRAZU............................................................................................................... 50 1.6.1.2 BUNKY ČERVENÉHO KRVNÉHO OBRAZU ......................................................................................................... 53 1.6.2 BUNKY POCHÁDZAJÚCE Z MLIEČNEJ ŽĽAZY................................................................................................... 53 1.6.3 NEBUNKOVÉ ÚTVARY Z MLIEKA..................................................................................................................... 54 1.7 VŠEOBECNÝ VÝZNAM SKÚŠANIA SUROVÉHO KRAVSKÉHO MLIEKA ................................... 55 1.8 STANOVENIE SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM KRAVSKOM MLIEKU ......................... 57 1.8.1 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK RÝCHLYMI METÓDAMI (TESTAMI) ............................................. 58 1.8.1.1 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK NK-TESTOM .............................................................................. 58 1.8.1.2 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK CALIFORNIA MASTITIS TESTOM ................................................. 59 1.8.2 LABORATÓRNE METÓDY, PREVÁDZKOVÉ METÓDY ......................................................................................... 60 1.8.2.1 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK CYTOMETRIOU TUHOU FÁZOU ................................................... 60 1.8.2.2 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK NIR SPEKTROSKOPIOU .............................................................. 61

1.8.2.3 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK VIDEO MIKROSKOPIOU............................................................... 61 1.8.2.4 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK PRIETOKOVOU CYTOMETRIOU (PRÍSTROJOM FOSSOMATIC) ....... 62 1.8.2.5 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK DISKOVOU CYTOMETRIOU

(PRÍSTROJOM FOSSOMATIC 90) .................................................................................................................. 64 1.8.2.6 STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK METÓDOU ELEKTRONICKÉHO POČÍTANIA ČASTÍC

(COULTER COUNTER)............................................................................................................................... 64 1.8.3 REFERENČNÁ METÓDA STANOVENIA POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK .............................................................. 64 1.8.4 METÓDY NA DIFERENCIÁCIU SOMATICKÝCH BUNIEK ..................................................................................... 65 1.9 BEZPEČNOSTNÁ SMERNICA PRE PRÁCU S ETÍDIUM BROMIDOM........................................... 68 1.9.1 CHARAKTERISTIKA ETÍDIUM BROMIDU........................................................................................................... 68 1.9.2 ŠKODLIVÉ ÚČINKY NA ĽUDSKÝ ORGANIZMUS................................................................................................. 68 1.9.3 SPÔSOBY PRENIKNUTIA DO ĽUDSKÉHO ORGANIZMU....................................................................................... 69 1.9.4 FYZIKÁLNE NEBEZPEČENSTVO ASOCIOVANÉ S CHEMIKÁLIOU ........................................................................ 69 1.9.5 URČENÉ OBLASTI POUŽÍVANIA ....................................................................................................................... 69 1.9.6 AUTORIZOVANÉ OSOBY.................................................................................................................................. 69 1.9.7 POŽIADAVKY NA TRÉNING PERSONÁLU .......................................................................................................... 70 1.9.8 USKLADNENIE A POŽIADAVKY NA MANIPULÁCIU........................................................................................... 70 1.9.9 TECHNICKÉ POŽIADAVKY ............................................................................................................................... 70 1.9.10 OSOBNÁ OCHRANA ......................................................................................................................................... 70 1.9.11 POKYNY PRE PRÁCU S ETÍDIUM BROMIDOM.................................................................................................... 71 1.9.12 PRVÁ POMOC .................................................................................................................................................. 71 1.9.13 LIKVIDÁCIA ROZLIATEHO ROZTOKU ETÍDIUM BROMIDU ................................................................................. 71 1.9.14 LIKVIDÁCIA NEBEZPEČNÉHO ODPADU (STARÝCH PRACOVNÝCH ROZTOKOV) ................................................. 72 1.9.15 DEAKTIVÁCIA ROZTOKOV ETÍDIUM BROMIDU............................................................................................... 72 1.10 MANAŽMENT KVALITY LABORATÓRNEJ PRÁCE PRE PRIAMU MIKROSKOPICKÚ

METÓDU POČÍTANIA SOMATICKÝCH BUNIEK ............................................................................. 75 1.11 PRÍPRAVA REFERENČNÝCH VZORIEK S PRESNÝM POČTOM SOMATICKÝCH

BUNIEK ..................................................................................................................................................... 79 2 CIEĽ PRÁCE............................................................................................................................................... 85 2.1 CIEĽ EXPERIMENTU 1 - STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM KRAVSKOM MLIEKU

REFERENČNOU METÓDOU. ............................................................................................................................ 85 2.1.1 OČAKÁVANÉ VÝSLEDKY................................................................................................................................. 85 2.2 CIEĽ EXPERIMENTU 2 - PRÍPRAVA SEKUNDÁRNYCH REFERENČNÝCH MATERIÁLOV ................................. 85 2.2.1 OČAKÁVANÉ VÝSLEDKY................................................................................................................................. 86 2.3 CIEĽ EXPERIMENTU 3 - POROVNANIE VÝSLEDKOV MIKROSKOPICKÝCH METÓD ....................................... 86 2.3.1 OČAKÁVANÉ VÝSLEDKY................................................................................................................................. 88 3 MATERIÁL A METODIKA ...................................................................................................................... 89 3.1 EXPERIMENT 1 – STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM KRAVSKOM MLIEKU

REFERENČNOU METÓDOU ............................................................................................................................. 89 3.1.1 MATERIÁL ..................................................................................................................................................... 89

3.1.2 LOKALITA ..................................................................................................................................................... 89 3.1.3 ČASOVÝ HARMONOGRAM A ROZSAH EXPERIMENTU....................................................................................... 89 3.1.4 POUŽITÉ METÓDY ........................................................................................................................................... 90 3.1.4.1 PRÍSTROJE, POMÔCKY, CHEMIKÁLIE A PRÍPRAVA ROZTOKOV PRE METÓDY A A B, PRÍPRAVA PODLOŽNÝCH

SKLÍČOK ..................................................................................................................................................... 90 3.1.4.2 METÓDA A ..................................................................................................................................................... 95 3.1.4.3 METÓDA B ..................................................................................................................................................... 97 3.1.4.4 METÓDA C ................................................................................................................................................... 100 3.1.5 ŠTATISTICKÉ VYHODNOTENIE EXPERIMENTU 1 - STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM

KRAVSKOM MLIEKU REFERENČNOU METÓDOU ............................................................................................. 101 3.1.5.1 VÝPOČET NEISTÔT MERANIA METÓDY A A B ............................................................................................... 101 3.2 EXPERIMENT 2 – PRÍPRAVA SEKUNDÁRNYCH REFERENČNÝCH MATERIÁLOV.......................................... 103 3.2.1 MATERIÁL ................................................................................................................................................... 103 3.2.2 LOKALITA ................................................................................................................................................... 103 3.2.3 ČASOVÝ HARMONOGRAM A ROZSAH EXPERIMENTU..................................................................................... 103 3.2.4 PRÍSTROJE, POMÔCKY A CHEMIKÁLIE ........................................................................................................... 104 3.2.5 PRACOVNÝ POSTUP PRÍPRAVY REFERENČNÝCH VZORIEK ............................................................................. 104 3.2.6 SKÚŠANIE KVALITY PRIPRAVENÝCH REFERENČNÝCH VZORIEK .................................................................... 107 3.2.7 ŠTATISTICKÉ VYHODNOTENIE EXPERIMENTU 2 – PRÍPRAVA SEKUNDÁRNYCH REFERENČNÝCH

MATERIÁLOV ................................................................................................................................................ 107 3.3 EXPERIMENT 3 – POROVNANIE VÝSLEDKOV MIKROSKOPICKÝCH METÓD ............................................... 109 3.3.1 MATERIÁL ................................................................................................................................................... 109 3.3.2 ANALÝZA VZORIEK ...................................................................................................................................... 109 3.3.3 ČASOVÝ HARMONOGRAM A ROZSAH EXPERIMENTU..................................................................................... 110 3.3.4 PRACOVNÝ POSTUP....................................................................................................................................... 110 3.3.5 ŠTATISTICKÉ VYHODNOTENIE EXPERIMENTU 3 - POROVNANIE VÝSLEDKOV MIKROSKOPICKÝCH METÓD ..... 112 4 VÝSLEDKY ............................................................................................................................................... 113 4.1 VYHODNOTENIE EXPERIMENTU 1 - STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM

KRAVSKOM MLIEKU REFERENČNOU METÓDOU ......................................................................................... 113 4.1.1 ZHRNUTIE VÝSLEDKOV EXPERIMENTU 1 - STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM

KRAVSKOM MLIEKU REFERENČNOU METÓDOU ............................................................................................. 122 4.2 VYHODNOTENIE EXPERIMENTU 2 – PRÍPRAVA SEKUNDÁRNYCH REFERENČNÝCH MATERIÁLOV ............ 123 4.2.1 ZHRNUTIE VÝSLEDKOV EXPERIMENTU 2....................................................................................................... 135 4.3 VYHODNOTENIE EXPERIMENTU 3 – POROVNANIE VÝSLEDKOV MIKROSKOPICKÝCH METÓD .................. 139 4.3.1 VÝSLEDKY KOLABORATÍVNEJ ŠTÚDIE .......................................................................................................... 145 4.3.2 ZHRNUTIE VÝSLEDKOV EXPERIMENTU 3....................................................................................................... 149 5 DISKUSIA .................................................................................................................................................. 151 6 NÁVRH NA VYUŽITIE ZISTENÝCH POZNATKOV ........................................................................ 162 7 ZÁVER ................................................................................................................................................... 164 8 ZOZNAM POUŽITEJ LITERATÚRY ................................................................................................... 167

9 PRÍLOHY................................................................................................................................................... 182 PRÍLOHA 1 – PRAVIDLÁ PRE IDENTIFIKÁCIU A POČÍTANIE SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM KRAVSKOM MLIEKU PRÍLOHA 2 – CALIFORNIA MASTITIS TEST PRÍLOHA 3 – MIKROSKOP OLYMPUS BX51 PRÍLOHA 4 – SPEKTRÁLNA CHARAKTERISTIKA POUŽITÉHO SVETELNÉHO ZDROJA – ORTUŤOVEJ LAMPY PRÍLOHA 5 – ZOZNAM FLUOROCHRÓMOV, VÝBER FLUOROCHRÓMOV, CHARAKTERISTIKA VLNOVÝCH DĹŽOK

POUŽITÝCH ZRKADLOVÝCH JEDNOTIEK S EXCITAČNÝM A EMISNÝM FILTROM A DICHROICKÝM

ZRKADLOM, INTERKALÁCIA ETÍDIUM BROMIDU DO MOLEKULY DNA PRÍLOHA 6 – PRÍSTROJ FOSSOMATIC 5000 PRÍLOHA 7 – FOTODOKUMENTÁCIA PRACOVNÉHO POSTUPU PODĽA NORMY STN EN ISO 13366-1 (2001) PRÍLOHA 8 – FOTODOKUMENTÁCIA PRACOVNÉHO POSTUPU PRÍPRAVY PREPARÁTU PODĽA MODIFIKOVANEJ

METÓDY PUBLIKOVANEJ VERMUNTOM ET AL. (1995) PRÍLOHA 9 – FOTODOKUMENTÁCIA, OBRÁZKY MIKROSKOPICKÝCH PREPARÁTOV METÓDY A A METÓDY B PRÍLOHA 10 – FAKTORY MIKROSKOPU PRE OBJEKTÍV 60 X, PRE METÓDU A PRÍLOHA 11 – FAKTORY MIKROSKOPU PRE OBJEKTÍV 60 X, PRE METÓDU B PRÍLOHA 12 – PRÍKLAD VÝPOČTU POMERU RIEDENIA MLIEKA PRI PRÍPRAVE REFERENČNÝCH VZORIEK PRÍLOHA 13 – NAVÁŽKA K2CR2O7 PRE PRÍPRAVU REFERENČNEJ VZORKY PRÍLOHA 14 – PRÍKLAD VALIDAČNÉHO PROTOKOLU PRÍLOHA 15 – BIELE KRVINKY (LEUKOCYTY) PRÍLOHA 16 – KRV HOVÄDZIEHO DOBYTKA PRÍLOHA 17 – VYPOČÍTANÉ KORELAČNÉ KOEFICIENTY PRE MIKROSKOPICKÉ METÓDY STANOVENIA POČTU

SOMATICKÝCH BUNIEK V EXPERIMENTE 1 A EXPERIMENTE 3

12

ÚVOD

Mastitída patrí medzi najdôležitejšie ochorenia hovädzieho dobytka. Ovplyvňuje

ekonomiku výroby mlieka, znižuje jeho kvalitu a technologickú využiteľnosť. S mastitídou

stúpa riziko prítomnosti patogénnych mikroorganizmov a rezíduí antibiotík v mlieku.

Na znižovanie výskytu mastitídy by sa mali využívať komplexné proti mastitídne

programy ako starostlivosť o prostredie, správne postupy dojenia, aplikácia dezinfekčných

prípravkov pred a po dojení, vhodná preventívna liečba v období státia na sucho, liečba

akútnych ochorení, separácia a segregácia chorých dojníc a využívanie laboratórnych metód

v rámci preventívneho zisťovania mastitídy.

Hlavným indikátorom a diagnostickým štandardom pri zisťovaní mastitídy sú

somatické bunky. Somatické bunky pozostávajú z viacerých typov buniek zahŕňajúc

polymorfonukleárne leukocyty, makrofágy, lymfocyty a epitelové bunky.

Počet somatických buniek v mlieku sa prudko zvyšuje v počiatočných fázach zápalu

vemena a znižuje sa až postupným liečením. Somatické bunky, predovšetkým neutrofilné

leukocyty hrajú dôležitú obrannú úlohu voči infekcii vemena. Ich hlavnou úlohou je

fagocytovať a zničiť infekčné agens. Ceckový kanálik tvorí prvú bariéru voči bakteriálnej

infekcii. Baktérie prestupujúce cez túto bariéru sa v ceckovej cisterne stretávajú s druhou

bariérou, ktorú tvoria fagocytujúce leukocyty. Po spustení zápalovej reakcie sa zvyšuje počet

neutrofilných leukocytov v mieste infekcie. Zvýšenie počtu somatických buniek je normálnou

fyziologickou reakciou organizmu voči infekcii. Fyziologicky normálne množstvo

somatických buniek v mlieku nadojenom zo zdravého vemena je približne od 20 000 do

200 000 v 1 ml. Podľa Medzinárodnej mliekarenskej federácie má mlieko zdravej štvrťky

mliečnej žľazy obsahovať menej ako 250 000 somatických buniek v 1 ml.

V súčasnosti sa na hodnotenie počtu somatických buniek v bežnej praxi používa

metóda, podľa STN EN ISO 13366-3 (2001) Mlieko, Stanovenie počtu somatických buniek,

Časť 3: Fluorescenčná optická elektronická metóda. V Slovenskej republike však nikto

nepraktizuje používanie mikroskopickej referenčnej metódy. Presnosť prístrojov typu

Fossomatic pre vyššie spomenutú metódu sa overuje pomocou dovezených referenčných

vzoriek zo zahraničia, pričom presnosť prevádzkovej metódy sa kontroluje

medzilaboratórnymi porovnávaniami.

Na základe autorizácie Štátnou veterinárnou a potravinovou správou SR je Národné

referenčné laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky ŠVPÚ Nitra povinné zavádzať

najpresnejšie a najmodernejšie laboratórne metódy. Laboratórium je poverené viacerými

13

úlohami. Jednou z úloh je zabezpečovanie referenčných vzoriek a organizovanie

medzilaboratórnych porovnávaní pre metódu stanovenia počtu somatických buniek v surovom

kravskom mlieku za účelom kontroly súčasného systému hodnotenia kvality mlieka

v Slovenskej republike.

Z uvedeného vyplýva potreba zaviesť a praktizovať u nás predpísanú referenčnú

metódu STN EN ISO 13366-1 (2001) Mlieko, Stanovenie počtu somatických buniek, Časť 1:

Mikroskopická metóda, alebo navrhnúť a preskúmať možnosti používania inej metódy u nás

zatiaľ nepublikovanej ako referenčnej metódy v tejto oblasti.

14

1 PREHĽAD LITERATÚRY

1.1 Mastitída

Drahošová a Drončovský (2004) uvádzajú, že mastitída je zápalové ochorenie

mliečnej žľazy, ktoré je charakterizované fyzikálnymi, chemickými a mikrobiálnymi

zmenami, ako aj vzostupom počtu somatických buniek a ďalšími zmenami v zložení mlieka.

Patrí medzi ekonomicky najzávažnejšie ochorenia hospodárskych zvierat.

Mastitída je zápalové ochorenie mliečnej žľazy a somatické bunky sú vo všeobecnosti

štandardom pri jej diagnostikovaní (Pyörärlä, 2003).

1.1.1 Vplyvy vyvolávajúce mastitídu

Podľa Drahošoveej a Drončovského (2004) mastitídu môžu vyvolať neinfekčné alebo

infekčné vplyvy. Za neinfekčné vplyvy sa považujú traumatické, mechanické, chemické,

toxické a fyzikálne vplyvy. Infekčné vplyvy sú mikrobiálneho pôvodu a v praxi sa s nimi

stretávame najčastejšie.

Infekčná mastitída patrí k polyfaktoriálnym ochoreniam, na vznik a šírení ktorého sa

zúčastňujú tri biosystémy (Burdová et al., 1999; Drahošová a Drončovský, 2004; Kováč et

al., 2001).

1.1.1.1 Makroorganizmus dojnice

Kováč et al. (2001) uvádzajú, že vnímavosť dojnice je závislá od geneticky

podmienených faktorov, anatomického, morfologického, funkčného a biochemického stavu

dojnice ako aj faktorov laktácie (veku, štádia laktácie, dojnosti). Individuálnu vnímavosť

určuje najmä imunologická a cytologická reaktivita mliečnej žľazy.

Medzi činitele vrodenej nešpecifickej odolnosti dojnice patria: stav kože a slizníc,

anatomická stavba cecka, ceckového kanálika a ústia ceckového kanálika, funkcia ceckového

kanálika, nevyrovnanosť kapacity jednotlivých štvrtiek, bakteriostatická aktivita laktoferínu

v epitelových bunkách a neutrofilných granulocytoch, laktoperoxidázo-thiokyanát-

hydroxidový systém potláčajúci rozmnožovanie mikroorganizmov, komplement sekrétu

mliečnej žľazy s bakteriocídnymi vlastnosťami, lyzozým pôsobiaci proti fagocytovaným

15

hlavne Gram pozitívnym mikroorganizmom, fagocytóza – pôsobenie defenzínov

s antibakteriálnymi cytotoxickými účinkami v polymorfonukleárnych leukocytoch

v zápalovom ložisku a iné.

Medzi činitele špecifickej odolnosti dojnice patria: imunoglobulíny, ktoré sa

v sekrétoch mliečnej žľazy syntetizujú lokálne alebo sú transportované zo séra. Obranu

mliečnej žľazy pred baktériami zabezpečujú IgG1, IgG2, IgA a IgM. Opsonizácia (stav keď

niektoré lymfocyty produkujú IgG a IgM), neutralizácia bakteriálnych toxínov (závisí na

reakcii s protilátkami), imunita sprostredkovaná v mliečnej žľaze bunkami (proti

mikroorganizmom prežívajúcim fagocytózu), lokálna imunita sprostredkovaná sekrečným

IgA, ktorý je transportovaný do sekrétu mliečnej žľazy.

Medzi špecifické a nešpecifické činitele patria cytokíny, ktoré hrajú dôležitú úlohu

v hostiteľskej obrane regulovaním aktivity buniek.

1.1.1.2 Vonkajšie prostredie

Kováč et al. (2001) ďalej uvádzajú, že medzi faktory vonkajšieho prostredia patria

ustajnenie, klimatické podmienky, kŕmenie, hygienické a technologické podmienky spojené

s prvovýrobou mlieka a ľudský činiteľ (dojič, ošetrovateľ). Špecifický význam majú faktory

súvisiace so strojovým dojením. Mnohé z týchto vplyvov sú považované za predispozičné.

Z hľadiska hygieny ustajnenia môže na dojnicu negatívne vplývať úzke a krátke státie,

stav ležoviska a podstielky, klimatické podmienky v maštali ako nadmerné prúdenie

studeného vzduchu, chlad, vlhkosť, vysoké teploty vonkajšieho prostredia, zvýšená

koncentrácia plynov NH3, H2S, CO2, zvýšená prašnosť a hlučnosť.

Neplnohodnotná kŕmna dávka z hľadiska kvalitatívneho a kvantitatívneho, nedostatok

v príjme tekutín, nedostatok mikroprvkov (napr. meď, zinok, selén) a vitamínov ako (napr.

vitamín E, vitamín A, β–karotén) vplývajú na zdravotný stav dojnice, ovplyvňujú

metabolizmus (acidózy, alkalózy), znižujú odolnosť voči infekčným činiteľom a ovplyvňujú

imunitné mechanizmy v mliečnej žľaze. Nedostatočná výživa má za následok zvýšenie počtu

somatických buniek v mlieku.

Nešetrnosť, násilná manipulácia, predojovanie a stres dojníc vedú v potláčanie ejekcie

mlieka a k zadržovaniu mlieka. Dojacie zariadenia môžu počas dojenia spôsobiť mikro

a makro traumatizačné poranenia a prenos patogénnej mikroflóry. Nepriaznivý vplyv majú

poškodené, opotrebované ceckové násadce, vysoký podtlak, vysoká a nízka frekvencia

pulzov.

16

Vplyvom vonkajších faktorov prostredia môže dochádzať k poraneniam mliečnej

žľazy a ceckov a následne k mastitíde (Kováč et al., 2001).

1.1.1.3 Infekčný činiteľ

Infekčný činiteľ ovplyvňuje vznik a priebeh mastitídy svojou prítomnosťou,

početnosťou, patogenitou, virulenciou a antigenicitou. Infekčná mastitída vzniká dôsledkom

infekcie mliečnej žľazy, ktorá je exogénneho pôvodu. Infekcia mliečnej žľazy je podmienená

jej expozíciou patogénmi, penetráciou patogénov ceckovým kanálikom, kolonizáciou

mliečnej žľazy patogénnymi mikroorganizmami, ktoré sa tu množia, dráždia a poškodzujú

tkanivo mliečnej žľazy (Kováč et al., 2001).

Znázornenie vzájomných vzťahov troch systémov (dojnica, mikroorganizmy,

prostredie) pri riziku vzniku intramamárnej infekcie je uvedené na Obrázku 1.

17

Obrázok 1. Znázornenie vzájomných vzťahov troch systémov (dojnica, mikroorganizmy,

prostredie) pri riziku vzniku intramamárnej infekcie. Obrázok je modifikovaná schéma podľa

Kováča (Kováč et al., 2001).

1.1.2 Mikroorganizmy vyvolávajúce mastitídu

Baktérie spôsobujúce mastitídu sa môžu zaradiť do dvoch kategórií: ako majoritné

alebo minoritné (Harmon, 1994).

Medzi majoritné patogénne mikroorganizmy patria Staphylococcus aureus,

Streptococcus agalactiae.

18

Medzi minoritné patogénne mikroorganizmy patria streptokoky (Streptococcus uberis,

Streptococcus dysgalactiae, streptokoky skupiny C, G a L, enterokoky), koliformné baktérie

(Escherichia coli, Bacillus spp., Proteus spp.), koagulázovo-negatívne mikrokoky

(Staphylococcus sp., Micrococcus sp., Corynebacterium bovis), Actinomyces sp. (Actinomyces

pyogenes), menej častý pôvodcovia (Mycoplasma spp., Leptospira spp., Listeria spp.,

Klebsiella sp., Moraxella sp. Acholeplazma sp., Candida sp., kvasinky, Mucor sp.), špecifickí

pôvodcovia (Mycobacterium sp., Brucella sp.) (Burdová, 1998; Drahošová a Drončovský,

2004; Elečko, 1995; Harmon, 1994; Kováč et al., 2001; Murphy a Boor, 1999; Vasiľ,

1998; De Haas, 2003).

Mastitídy vyvolané majoritnými patogénnymi mikroorganizmami sa prejavujú väčšími

zmenami v zložení mlieka, dochádza pri nich k výraznému vzostupu počtu somatických

buniek a spôsobujú výrazné ekonomické straty. Mastitídy vyvolané minoritnými patogénnymi

mikroorganizmami sa prejavujú miernym zápalom a miernym zvýšením počtu somatických

buniek. Počet somatických buniek sa zvýši oproti normálnemu stavu iba dvoj až trojnásobne.

Minoritné patogénne infekcie sú zriedkavo asociované s klinickou mastitídou, výraznými

zmenami v zložení mlieka a dramatickým poklesom produkcie mlieka (Harmon, 1994).

Infekčné mastitídy sú vyvolané vysoko kontagióznymi patogénnymi baktériami,

predovšetkým Staphylococcus aureus a Streptococcus agalactiae. Hlavným rezervoárom

týchto patogénnych mikroorganizmov je infikované vemeno a infekcia sa šíri medzi

jednotlivými dojnicami alebo medzi štvrťkami vemena takmer výhradne v priebehu procesu

dojenia kontaminovaným dojacím zariadením, rukami dojiča, handrami alebo špongiami na

umývanie a osušenie vemena. Infekcia má tendenciu byť chronická, dlhotrvajúca

a subklinická s periodickými klinickými epizódami. Následkom infekčnej mastitídy sú pokles

produkcie mlieka a zvýšenie počtu somatických buniek v bazénovom mlieku (Harmon,

1996).

Aj napriek tomu, že Streptococcus agalactiae nenapadá glandulárnu časť tkaniva

mliečnej žľazy a nevyvoláva fibrózu ani abscesy (ako je to pri infekciách Staphylococcus

aureus) pri kolonizácii povrchu epitelu spôsobuje subklinické mastitídy alebo ich

intermitentné klinické symptómy. Staphylococcus aureus je pravdepodobne najnebezpečnejší

z kontagióznych baktérií. Ním vyvolané chronické mastitídy sa lokalizujú v najhlbších

19

častiach tkaniva mliečnej žľazy. Naviac tieto infekcie sa veľmi ťažko liečia (Kováč et al.,

2001).

Podľa Harmona (1996) Streptococcus dysgalactiae sa vo všeobecnosti považuje za

enviromentálny patogénny mikroorganizmus, ale môže mať charakter kontagiózneho

mikroorganizmu a môže vyvolávať infekčné mastitídy a šíriť sa z dojnice na dojnicu.

Aj napriek tomu, že je tento patogén citlivý na dezinfekciu ceckov a terapiu počas zasušenia,

v stádach sa často objavujú nové infekcie Corynebacterium bovis sa považuje za minoritný

patogénny mikroorganizmus. Hlavným rezervoárom je infikované vemeno alebo ceckový

kanál. Tento mikroorganizmus sa rýchlo šíry z dojnice na dojnicu ak sa neaplikuje

dezinfekcia ceckov pred dojením. Infekcia Corynebacterium bovis spôsobuje iba mierny zápal

vemena a počet somatických buniek v mlieku sa zvyšuje dvoj až trojnásobne. Len zriedkavo

je táto infekcia príčinou zvýšeného počtu somatických buniek v bazénovom mlieku, klinickej

mastitídy, výrazných zmien v zložení mlieka alebo dramatického poklesu produkcie mlieka.

Mycoplasma sp. sú kontagiózne patogénne mikroorganizmy, ktoré sa v niektorých

oblastiach vyskytujú zriedkavo ale v iných pomerne často. Mycoplasma bovis je najčastejšie

sa vyskytujúci druh, ktorý spôsobuje v chovoch vážne problémy, pretože priebeh infekcie je

neočakávaný, infekcia sa rýchlo šíri medzi dojnicami a dochádza k výraznému poklesu

produkcie mlieka.

Výskyt nových infekcií kontagióznymi baktériami môžeme najčastejšie badať u dojníc

na druhej laktácii. Keďže poväčšine vyvolávajú mastitídu so subklinickým priebehom,

spôsobujú nemalé problémy tak chovateľovi, ako aj samotnému veterinárnemu lekárovi, a to

najmä z hľadiska produkcie mlieka (Kováč et al., 2001).

Medzi enviromentálne patogénne baktérie vyvolávajúce mastitídy dojníc zaraďujeme:

mikroorganizmy Escherichia coli, Klebiella sp., (Klebsiella pneumoniae), Enterobacter sp.,

(Enterobacter aerogenes), Citrobacter sp. Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis,

Streptococcus bovis, Enterococcus faecium a Enterococcus faecalis a ďalšie známe

enviromentálne streptokoky a enterokoky, Seratia sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., a iné

Gramnegatívne baktérie, koagulázo-negatívne druhy rodu Staphylococcus, Rickettsia burneti,

kvasinky a mikroskopické vláknité huby, vírusy, druhy rodu Prototheca, Aktinomyces

pyogenes, parazity. Zdrojom enviromentálnych patogénnych baktérií je okolie dojnice,

ležovisko, hnoj, pôda. Po invázii do mliečnej žľazy enviromentálne patogénne baktérie

vyvolávajú mastitídy s perakútnym, resp. akútnym priebehom. Niektoré z nich sa však môžu

20

stabilizovať ako chronické infekcie mliečnej žľazy. Čistota budov a ustajnenia, obmedzenie

vlhkosti prostredia, zamedzenie hromadenia hnoja, ošetrovanie vemena, insekticídna kontrola

a zníženie poškodzovania koncov ceckov a ceckového kanálika sú dôležité opatrenia pre

elimináciu enviromentálnych patogénnych baktérií (Hogan a Smith, 1987, 1997; Hogan et

al., 1990; Kristula et al., 2005; Kováč et al., 2001; Schukken et al., 1991; Smith et al.,

1985; Todhunter et al., 1995; Zadoks et al., 2001; Zdanowicz et al., 2004).

1.1.3 Diagnostikované formy mastitíd

Kováč et al. (2001) uvádzajú, že na základe klinického, cytologického

a bakteriologického vyšetrenia rozoznávame nasledovné formy mastitíd:

1. Klinicky zjavné formy mastitíd:

- subakútne: na mliečnej žľaze nepozorujeme klinické príznaky zápalu, ale v prvých

strekoch mlieka sa nachádzajú biele vločky,

- akútne: výrazné príznaky zápalu ako teplo, bolestivosť, opuch, často je zhoršený

celkový zdravotný stav, mlieko býva už pri makroskopickom posúdení zmenené.

Akútna mastitída sa môže vyskytovať v dvoch formách – katarálnej

a parenchymatóznej.

- chronické: príznaky dlhotrvajúceho zápalu, postihnutá časť vemena často atrofuje.

Pri klinických formách mastitíd sa obyčajne zisťujú v mlieku postihnutých dojníc

zvýšené počty somatických buniek (nad 500 000 . ml-1) a prítomnosť patogénnych

mikroorganizmov.

2. Subklinické mastitídy, pri ktorých sa nezisťujú typické príznaky, pri zvýšenom počte

somatických buniek sú však z mlieka izolované patogénne mikroorganizmy.

3. Latentné mastitídy, neprejavujú sa klinickými príznakmi, v mlieku s normálnym

počtom somatických buniek sú však prítomné patogénne mikroorganizmy.

4. Abakteriálne (nešpecifické alebo aseptické) mastitídy: tvoria 20 – 30 % všetkých

mastitíd. Neizolujú sa pri nich z mlieka patogénne mikroorganizmy, ostatné

symptómy sú buď subklinického alebo klinického charakteru.

21

Z hľadiska rýchlosti šírenia sa mastitídy dojníc rozdeľujú na infekčné a neinfekčné.

V prvom prípade ide o mastitídy vyvolané skupinou vysoko kontagióznych patogénnych

baktérií, ktoré kolonizujú priamo mliečnu žľazu pri kontaminácii dojacieho zariadenia a rúk

dojičov. V druhom prípade sú to mastitídy vyvolané patogénnymi baktériami, ktoré normálne

nieinfikujú mliečnu žľazu a k infekcii dochádza keď je im z okolia umožnený prístup do

cisterny mliečnej žľazy. Možno ich označiť ako enviromentálne patogénne agensy infikujúce

mliečnu žľazu (Kováč et al., 2001).

Burdová et al. (1999) uvádzajú, že pre značnú neprehľadnosť mastitíd odporučila

Svetová zdravotnícka organizácia (WHO), Organizácia pre poľnohospodárstvo a výživu

(FAO) a Medzinárodná mliekarská federácia (IDF) skĺbiť aspekty klinické a hygienické,

a rôzne stavy mliečnej žľazy porovnávať s tzv. normálnym vemenom. Na základe týchto

aspektov IDF definuje:

1. Normálne vemeno – nevykazuje zjavné príznaky patologických zmien, mlieko

neobsahuje patogénne mikroorganizmy, nevyskytuje sa zvýšený počet somatických

buniek, sekrét senzoricky nie je zmenený, rovnako aj obsah tuku, bielkovín a laktózy,

fyzikálne a chemické vlastnosti sú vo fyziologickom rozpätí.

2. Latentná infekcia – vyznačuje sa prítomnosťou patogénnej mikroflóry, obsah

somatických buniek je v norme, sekrét nie je zmyslovo zmenený, fyzikálne

a chemické vlastnosti sú v norme.

3. Subklinická mastitída – chýbajú makroskopické symptómy zápalu, obsah somatických

buniek je zvýšený. Znížená je dojivosť postihnutej štvrťky, sekrét je bez

makroskopických zmien, zmeny sú v chemickom zložení a vlastnostiach mlieka.

Zvýšené je pH, chloridy, elektrická vodivosť, prítomná je patogénna mikroflóra.

4. Klinická mastitída – vyznačuje sa akútnym, subakútnym, perakútnym, resp.

chronickým priebehom, postihuje rôzne časti tkanív mliečnej žľazy, s rôznym

charakterom zápalu, s rôzne výraznými zmenami senzorických, fyzikálno-chemických

vlastností sekrétu, prítomná je patogénna mikroflóra.

5. Akútna mastitída – na vemene sú viditeľné symptómy zápalu. Mlieko je

makroskopicky zmenené. Príznaky zápalu sú zreteľné, vyniká začervenanie až

cyanotické sfarbenie, bolestivý opuch, zväčšenie štvrtiek, tuhšia konzistencia, zmeny

triasu, zvýšená teplota, poruchy celkového zdravotného stavu. Patogénna mikroflóra je

prítomná.

22

6. Subakútna mastitída – na vemene chýbajú zreteľné zmeny. V mlieku, zvlášť v prvých

strekoch sú prítomné vločky. Množstvo mlieka je znížené, fyzikálno-chemické

vlastnosti mlieka sú zmenené. Prítomnosť patogénnej mikroflóry je striedavá.

7. Chronická mastitída – prejavuje sa zmenami na mliečnej žľaze a mlieku rôznej

intenzity. Niektoré symptómy môžu chýbať. Postihnutá štvrťka je zväčšená,

postihnutý parenchým je nahradený spojivovým tkanivom. Palpáciou sú hmatateľné

väzivové uzly a povrazce. Produkcia mlieka je výrazne znížená, sekrét je zmenený od

vločiek v prvých strekoch po serózny až purulentný. Nález patogénnej mikroflóry

môže byť pozitívny aj negatívny.

8. Nešpecifické – aseptické mastitídy – označované aj ako iritačné sú tie, keď nie je

dokázaná infekcia, ale sú zrejmé subklinické alebo klinické symptómy, výnimočne sa

môžu vyskytnúť vločky v prvom nádoji, zmeny sú vo fyzikálnych a chemických

vlastnostiach mlieka, zreteľne zvýšená je elektrická vodivosť.

1.1.4 Zápal mliečnej žľazy

Harmon (1994) popisuje mechanizmus zápalu mliečnej žľazy nasledovne: zápalová

odpoveď sa inicializuje po tom, ako baktérie vstúpia do mliečnej žľazy cez ceckový kanálik

a pomnožia sa. Bakteriálne toxíny, enzýmy a komponenty bunkových stien baktérií môžu

priamo vplývať na funkciu žľazového epitelu a môžu stimulovať produkciu mnohých

zápalových mediátorov pomocou zápalových buniek (neutrofily, monocyty, makrofágy, T-

lymfocyty, prípadne ďalšie zápalové bunky). Zápalové bunky zohrávajú dôležitú úlohu v

patogenéze ochorenia.

Harmon (1994) ďalej uvádza, že medzi mediátory zápalu patria napríklad fragmenty

komplementu, prostaglandíny, leukotriény, histamín, serotonín, interleukíny, tumor

nekrózový faktor, interferón, cytokíny a ďalšie.

Klasické symptómy zápalu zahŕňajú zvýšenú vaskulárnu permeabilitu, vazodilatáciu,

edémy, zvýšenie prietoku krvi, zvýšenie počtu polymorfonukleárnych neutrofilných

leukocytov, zvýšenú migráciu polymorfonukleárnych neutrofilných leukocytov, pokles

v syntetickej aktivite mliečnej žľazy, bolesť a horúčku.

V klinických modeloch mastitídy bolo pozorované zvýšenie sérového kortizolu

a pokles plazmového železa a zinku. Prejavom chronického zápalového ochorenia je značná

infiltrácia mononukleárnymi leukocytmi.

23

Jednou z iniciačných zložiek zápalovej odpovede je príliv polymorfonukleárnych

neutrofilných leukocytov (PMN) do tkaniva mliečnej žľazy. PMN tvoria základ obrany

mliečnej žľazy za normálnych fyziologických podmienok. PMN voľne pretekajú cez kapiláry

a iba veľmi málo sa adherujú na steny ciev. Počas infekcie a zápalu sa adhézia molekúl

zvyšuje a PMN sa držia pri okraji alebo adherujú na endotel menších ciev a prechádzajú

medzi bunkami ktoré tieto cievy obklopujú.

Chemické faktory uvoľnené z leukocytov prítomných v mlieku alebo uvoľnené

z poškodeného tkaniva priťahujú veľké množstvo PMN do mlieka. PMN vo veľkých

množstvách vystieľajú vonkajšiu stranu niektorých alveol. Súčasne môže dochádzať

k zjavnému poškodeniu syntetickej funkcie buniek, v ktorých sa tvorí mlieko a PMN môžu

prechádzať pomedzi bunky epitelu do lumenu alveol.

V konečnom dôsledku tento proces má za následok zvýšenie počtu somatických

buniek v mlieku dôsledkom zvýšenej migrácie PMN na miesto vzniknutej infekcie. PMN sa

taktiež infiltrujú medzi bunky okolo ceckov, ceckových cisterien a ceckových kanálikov.

Tieto časti vemena môžu byť hlavným miestom migrácie PMN počas počiatočnej odpovede

na inváziu zápalových činiteľov.

Funkciou PMN v mlieku je pohltiť a rozložiť invázne baktérie. Keď PMN vstupujú do

mlieka, obvykle pohltia aj iné častice ako tukové guľôčky a kazeín, v dôsledku čoho sa

znižuje efektívnosť týchto buniek v porovnaní s inými krvnými bunkami. Aj napriek tomuto

faktu PMN hrajú kľúčovú úlohu v obrannom mechanizme vemena.

Leukocyty prítomné v mlieku môžu uvoľňovať špecifické látky, ktoré menia

permeabilitu krvných kapilár a priťahujú väčšie množstvo leukocytov do oblasti s infekciou.

S perzistujúcou bakteriálnou infekciou sa množstvo leukocytov mení, ale vo všeobecnosti

zostáva abnormálne vysoké. Abnormálne množstvo somatických buniek pretrváva až do

eliminovania počtu prítomných baktérií. S postupujúcim procesom hojenia mliečnej žľazy sa

postupne znižuje množstvo somatických buniek.

Okrem zvýšenia počtu somatických buniek sa infekcia prejavuje viacerými príznakmi.

Predovšetkým môže dochádzať k zníženiu syntetickej aktivity mliečnej žľazy vplyvom

toxínov, enzýmov, mediátorov zápalovej reakcie a iných látok, ktoré poškodzujú tkanivo

produkujúce mlieko. Zmeny permeability krvných ciev a žľazového epitelu vedú k prestupu

zložiek krvi do mlieka a prestupu niektorých normálnych zložiek mlieka z lumenu alveol do

perivaskulárneho priestoru. Tkanivo vzniknuté agregáciou leukocytov a faktorov krvného

zrážania môže blokovať malé kanáliky a zabraňovať tým celkovému prestupu mlieka.

Poškodenie epitelových buniek a blokovanie malých kanálikov môže viesť v niektorých

24

prípadoch k zjazveniu tkaniva, jeho poškodeniu alebo až k permanentnej strate sekrečnej

funkcie. V lepších prípadoch sa po skončení zápalu tkanivo zotaví a jeho funkcia sa obnoví

ešte v prebiehajúcej alebo v nasledujúcej laktácii.

Hogan et al. (1993) skúmali úlohu vitamínu E a selénu v obrannom protimastitídnom

mechanizme. Autori uvádzajú, že v metabolizme neutrofilov vznikajú voľné kyslíkové

radikály, ktoré sú nevyhnutnou súčasťou obranného mechanizmu voči baktériam. Voľné

kyslíkové radikály, ale aj ďalšie reaktívne molekuly však môžu spôsobovať poškodenie

samotných neutrofilov ako aj okolitého tkaniva mliečnej žľazy. K poškodeniu tkaniva

dochádza prostredníctvom peroxidácie lipidov, ktoré sú súčasťou bunkových membrán,

inaktiváciou alebo denaturáciou bunkových enzýmov, poškodením DNA a poškodením

sacharidov sa môže zmeniť funkcia bunkových receptorov.

Vitamín E a enzým glutatión peroxidáza (GSH-Px) sú celulárne antioxidanty, ktoré

chránia voči cytotoxickému pôsobeniu metabolitov kyslíka.

Vitamín E je súčasťou membrán a GSH-Px je súčasťou cytozolu. GSH-Px konvertuje

peroxid vodíka na vodu a lipidové hydroxiperoxidy na príslušný alkohol.

Vitamín E inhibuje autooxidáciu polynenasýtených mastných kyselín v membránach

neutrofilov, nachádza sa v tesnej blízkosti oxidázozových enzýmov, ktoré iniciujú tvorbu

voľných radikálov.

Suplementácia výživy vitamínom E zvyšuje baktericídnu aktivitu neutrofilov

prítomných v krvi. Suplementácia výživy selénom, ktorý je súčasťou enzýmu GSH-Px vedie

v rýchlejšie vyplavenie neutrofilov do mlieka a zvyšuje intracelulárne zabíjanie pohltených

baktérií neutrofilmi. Selén zvyšuje aktivitu enzýmu GSH-Px.

Deficit selénu a vitamínu E vo výžive vedie k zvýšeniu incidencie mastitídy.

Suplementácia výživy dojníc selénom a vitamínom E znižuje frekvenciu a skracuje dĺžku

trvania mastitídy.

1.1.5 Terapia mastitíd

Vasiľ (1998) uvádza, že v chovoch hovädzieho dobytka sa bez liečby klinických

foriem mastitíd nezaobídeme, nakoľko v komplexe protimastitídnych opatrení zohráva

antimikrobiálna terapia významné postavenie.

25

Klinické formy mastitíd je potrebné liečiť, pričom platí zásada, že terapeutický zákrok

je potrebné realizovať hneď po zistení prvých symptómov zápalu, aby nedošlo k rozvinutiu

nenapraviteľných zmien v tkanive mliečnej žľazy, resp. aby sa proces nezmenil na chronický.

V priebehu obdobia laktácie sa používajú dva spôsoby terapie: parenterálna

a intramamárna.

Parenterálna terapia sa v súčasnej dobe v liečbe mastitíd používa málo, najčastejšie

však pri perakútnych a ťažkých akútnych stavoch ako doplnok intramamárnej liečby.

Hlavným dôvodom je nedostatočný prestup väčšiny antibiotík cez bariéru krv-mlieko.

Náročné kritériá definované pre túto formu aplikácie nespĺňa žiadne z dostupných antibiotík,

pričom relatívne dobre z krvi do mlieka difundujú penicilíny, spiramycín, linkomycín, tylozín

ale aj erytromycín.

Vývoj intramamárnych prípravkov v 70. a 80. rokoch pokročil tak ďaleko,

že v súčasnosti sa celosvetovo terapeuticky pri mastitídach dojníc používajú hlavne

antibiotické prípravky, ktoré sú určené k intramamárnej aplikácii.

Pri voľbe intramamárneho prípravku je potrebné vychádzať z dlhodobo sledovanej

citlivosti patogénnych mikroorganizmov v danom stáde, resp. teritóriu, pričom z času na čas

je potrebné výskyt rezistencie k antibiotikám retrospektívne prehodnotiť. Komplexný prístup

k prevencii a tlmeniu mastitíd s využitím antibiotickej liečby v priebehu laktácie a zasušenia

vedie k zlepšeniu kvalitatívnych a kvantitatívnych ukazovateľov produkovaného mlieka.

Owens et al. (2001) testovali účinnosť piatich rozdielnych intramamárnych antibiotík

(cefapirín, penicilín/streptomycín, penicilín/novobiocín, tilmicozin, cefalín). Do štúdie bolo

zapojených stotridsaťtri jalovíc. Autori zistili, že všetky antibiotiká boli účinné pri liečbe

experimentálnej mastitídy vyvolanej Staphylococcus aureus. Priebeh liečby bol v prípade

dojníc liečených antibiotikami výrazne kratší v porovnaní so spontánne sa uzdravujúcimi

neliečenými kontrolnými dojnicami.

Wilson et al. (1999) porovnali účinnosť siedmych intramamárnych antibiotík pri

liečbe mastitídy vyvolanej patogénnymi mikroorganizmami. Liečba antibiotikami bola

v porovnaní s neliečenými dojnicami účinnejšia v prípade amoxicilínu, erytromycínu,

kloxacilínu a pirlimycínu. V prípade cefapirínu, hetacilínu a penicilínu bola liečba rovnako

dlhá ako v prípade neliečených dojníc.

26

Bradley a Green (2001) uvádzajú, že výber vhodného intramamárneho prípravku

s výrazným gram negatívnym spektrom účinnosti môže znížiť výskyt klinických mastitíd

vyvolaných koliformnými mikroorganizmami v nasledujúcej laktácii.

Faktormi ovplyvňujúcimi dĺžku liečby a počtom somatických buniek po liečbe

subklinickej mastitídy pirlimycínom sa zaoberali Deluyker et al. (2005).

Borm et al. (2006) zisťovali vplyv intramamárnej antibiotickej liečby aplikovanej

pred otelením sa jalovíc na celkový zdravotný stav vemena, produkciu mlieka a reprodukčné

ukazovatele jalovíc. Autori zistili, že liečba znížila výskyt intramamárnych infekcií po otelení

sa avšak nevplývala na zvýšenie produkcie mlieka, zníženie počtu somatických buniek

a zlepšenie reprodukčných ukazovateľov počas prvých dvesto dní laktácie. Použitie

intramamárnej antibiotickej liečby za účelom zvýšenia produkcie mlieka v prípade dojníc na

prvej laktácii preto nemusí mať pozitívny efekt.

Rozhodnutie či liečiť postihnutú dojnicu je vo väčšine prípadov spájané

s ekonomickou hodnotou dojnice, ktorú určuje vek, konštitúcia, úžitkovosť a stav

reprodukčných ukazovateľov. Pri rozhodovaní sa musia zohľadniť aj náklady

a predpokladaný výsledok liečby, pravdepodobnosť liečebného neúspechu, tendencia recidívy

ochorenia a množstvo vyradeného mlieka. Zanedbať sa nesmú ani ukazovatele ako hodnota

dojnice v prípade vyradenia, možnosť jej znovu nahradenia, ale aj možnosti kontaminácie

mlieka, resp. mäsa v priebehu liečby (Vasiľ, 1998).

Drahošová a Drončovský (2004) uvádzajú, že terapia v období laktácie sa využíva

najmä pri klinicky zjavných formách a pri subklinických mastitídach. Včasná detekcia

klinických mastitíd je základom úspešnosti terapie. Dvadsaťštyri hodín po vzniku zápalu sa

šanca na kompletné uzdravenie znižuje na 50 %. Pri liečbe sa používajú semisyntetické

penicilíny a sulfonamidy. Výsledok terapie sa preveruje bakteriologickým vyšetrením sekrétu.

Táto liečba môže byť diskutabilná, najmä u subklinickej formy a nerentabilná vzhľadom

k nákladnosti liečby a stratám na mlieku v dôsledku ochrannej lehoty. Odporúča sa hlavne

u dojníc cenných pre vysokú úžitkovosť mlieka.

Liečenie v období státia na sucho môže priaznivo ovplyvniť situáciu vo výskyte

infekčných mastitíd len pri neselektívnom použití. Pri takomto druhu terapie je nevyhnutné

ošetriť všetky štvrťky všetkých dojníc v stáde pri zasušení. Cieľom terapie dojníc v období

27

státia na sucho je predovšetkým eliminácia perzistencie infekcie, t.j. liečba subklinických

mastitíd, ochrana vemena pred novou infekciou v najrizikovejšom období, čo sú prvé tri

týždne po zapustení dojnice (po tomto období vnímavosť mliečnej žľazy k zápalom klesá).

Hlavným cieľom antimikrobiálnej terapie v liečbe klinickej mastitídy je: obnovenie

normálnej produkcie mlieka a jeho zloženia, prevencia mortality v prípade perakútnych

stavov, eliminácia infekčných mikroorganizmov a eliminácia praktík vedúcich k prítomnosti

rezíduí liečiv vo finálnych produktoch. Z uvedeného vyplýva, že implementácia proti-

mastitídneho programu, rozvážneho používania antibiotík ako i ďalších liečiv a uplatňovanie

zásad systému HACCP sú nevyhnutné mechanizmy pre úspešné zvládnutie mastitídy v chove

dojníc (Nickerson, 1995).

Príklady aplikácie antibiotík v závislosti od prítomného mikroorganizmu

Tabuľka 1

Mikroorganizmus Liečba antibiotikami na základe vyšetrenia citlivosti

Staphylococcus sp.

Staphylococcus aureus

Kloxacilín, oxacilín, ampicilín, amoxicilín, nafcilín, cefapirín,

cefalexin, cefacetril, linkomycín, neomycín, novobiocín,

streptomycín, rifamycín, erytromycín

Streptococcus agalactiae Penicilín, kloxacilín, oxacilín, ampicilín, cefapirín,

erytromycín, linkomycín, neomycín, tetracyklíny

Streptococcus dysgalactiae Penicilín, kloxacilín, cefalosporín

Mycoplasma sp. Antibiotická liečba je neúčinná, sekundárne infekcie sa liečia

makrolidovými antibiotikami a tetracyklínmi

Actinomyces pyogenes Penicilín

E. coli,

Enterobacter aerogenes,

Klebsiella sp.

Liečba antibiotikami na základe vyšetrenia citlivosti

Pseudomonas sp. Liečba antibiotikami na základe vyšetrenia citlivosti

Kvasinkové mastitídy,

mastitídy vyvolané

mikroskopickými

vláknitými hubami

Antimykotiká, clotrimazol

(Kováč et al., 2001)

28

Citlivosť penicilínových antibiotík voči Gram pozitívnym a Gram negatívnym

mikroorganizmom

Tabuľka 2 Mikroorganizmy Penicilínové deriváty

Gram pozitívne mikroorganizmy

Penicilín/ Ampicilín

Amoxicilín +Kyselina

klavulónová

Oxacilín/Nafcilín

Karbocilín/Ticarcilín

Azlocilín

Staphylococcus sp. (lak neg.)

+ + +

+ + + + + +

Staphylococcus sp. (lak poz.)

- + + + + - -

Streptococcus pyogenes + + + + + + + +

Streptococcus pneumoniae + + + + + + + +

Enterococcus sp. + + + + - + + +

Bacteroides fragilis - + + - + +

Ostatné anaeróby + + + + - + +

Gram negatívne mikroorganizmy

Penicilín/ Ampicilín

Amoxicilín +Kyselina

klavulónová

Oxacilín/Nafcilín

Karbocilín/Ticarcilín

Azlocilín

Escherichia coli + + + + + + +

Klebsiella sp. - + + - - ± Proteus mirabilis + + + + + + + + + +

Proteus sp. - - + + +

Enterobacter sp. - - + + +

Pseudomonas aeruginosa

- - ± + + +

Pseudomonas sp. - - - - +

(Popelka, 2001) lak neg. – laktózo negatívny lak poz. – laktózo pozitívny + + veľmi aktívne pri nízkych koncentráciach + stredne aktívne proti väčšine kmeňov, alebo aktívne len pri vysokých koncentráciach - inaktívne proti väčšine kmeňov

Okrem antibiotík sa pri liečbe mastitídy môžu uplatniť alternatívne liečivá. Vplyv

účinku bakteriálnych proteínov, bakteriocínov na elimináciu pôvodcov mastitídy skúmalo

viacero autorov. Bakteriocíny sú bakteriálne bielkoviny, ktoré sú schopné rozrušiť bunkové

steny mikroorganizmov. Do tejto skupiny látok patrí napríklad nizín, lysostaphin, lacticin.

Úspešnosť liečby pomocou kombinácie bakteriocínov nizínu a lysostaphinu je

29

u Streptococcus uberis 100 %, u Streptococcus agalactiae 95 % a u Staphylococcus aureus

66 % (Miles et al., 1992; Rian et al., 1998; Twomey et al., 2000).

1.1.6 Prevencia mastitíd

Harmon (1996) uvádza, že prevencia je z hľadiska udržania mastitídy v chove

kľúčová. Cieľom prevencie je znížiť počet baktérií, ktorým je vemeno vystavené. Znižuje sa

tým prenos baktérií zo zvieraťa na zviera a tým aj počet mastitídnych zvierat. Liečba

mastitídy by sa mala aplikovať predovšetkým v klinických prípadoch, kedy sa zameriava na

elimináciu infekcie. Liečenie produkčných dojníc antibiotikami v priebehu laktácie je

ekonomicky veľmi náročné a neefektívne.

Medzi preventívne protimastitídne opatrenia patria: dezinfekcia ceckov a liečba dojníc

v období státia na sucho, dodržiavanie hygienických zásad v priebehu dojenia, brakovanie

chronicky mastitídnych dojníc, vakcinácia a izolácia mastitídnych dojníc.

Programy zamerané na prevenciu a tlmenie mastitíd by mali byť široko koncipované.

Tieto programy musia zabezpečiť redukciu výskytu mastitídy v danom chove. Program

prevencie a tlmenia by mal zahrňovať najmä hygienu v najširšom slova zmysle. Rozumie sa

pod ňou hygiena maštaľného prostredia a hygienu dojenia. Z hľadiska hygieny dojenia je

veľmi dôležité použiť funkčnú a dobre nastavenú dojaciu techniku, vykonávať dezinfekciu

dojacieho zariadenia a dezinfekciu ceckov. Prevencia zahŕňa aj ošetrenie mliečnej žľazy

dojníc v zasušení a liečbu klinicky zjavných mastitíd. Liečba by sa mala aplikovať v priebehu

laktácie, ale hlavne v období pred zasušením a po otelení, kedy je výskyt klinických mastitíd

najčastejší. Vyradenie terapii vzdorujúcich dojníc a dojníc chronicky chorých by malo byť

súčasťou proti mastitídneho programu (Vasiľ, 1988).

1.1.6.1 Dezinfekcia ceckov a liečba v období státia na sucho

Dezinfekcia ceckov a liečba v období státia na sucho sú základné preventívne proti

mastitídne opatrenia. Pred ukončením dojenia sa odporúča vydezinfikovať všetky cecky

vemena. Dezinfekciou ceckov sa eliminuje množstvo baktérií usadených na pokožke vemena

počas dojenia. Dezinfekcia je jednoduchá a veľmi efektívna metóda prevencie vzniku nových

infekcií vyvolaných patogénnymi mikroorganizmami. Samotná dezinfekcia redukuje počet

30

novo vzniknutých infekcií na 50 %. Pri dezinfekcii sa odporúča používať dezinfekčné

prípravky s obsahom jódu a chlóru (Harmon, 1996).

Pri prevencii mastitíd je dôležité dodržiavať prísnu hygienu v prvovýrobe mlieka.

Vykonávanie dezinfekcie ceckov pred a po dojení má význam z hľadiska tlmenia

stafylokokových infekcií, infekcií Streptococcus agalactiae a Streptococcus dysgalactiae.

Dezinfekciou ceckov po dojení sa inaktivuje až 90 % baktérií na povrchu vemena a zabráni sa

prieniku týchto baktérií do ceckového kanálika (Drahošová a Drončovský, 2004).

Oliver et al. (1989) na základe výsledkov svojej štúdie uvádzajú, že dezinfekciou

ceckov sa výrazne znížil počet intramamárnych infekcií.

Ak sa vykonala dezinfekcia ceckov ponorením do dezinfekčného prípravku s obsahom

chlóru pred a aj po dojení, úspešnosť prevencie vzniku intramamárnych infekcií bola

preukázateľne vyššia ako keď sa dezinfekcia vykonala len po dojení. Počet nových prípadov

intramamárnej infekcie vyvolanej Streptococcus uberis a Staphylococcus aureus bol výrazne

nižší v tom prípade ak sa u štvrtiek cecky dezinfikovali ponorením do roztoku dezinfekčného

prípravku pred a aj po dojení v porovnaní s dezinfekciou vykonanou len po dojení.

Dezinfekcia ceckov ponorením do dezinfekčného prípravku pred aj po dojení nebola

efektívnejšia v prípade Gramnegatívnych baktérií, koagulázovo-negatívnych druhov

Staphylococcus aureus a Corynebacterium bovis.

Boddie et al. (2002) vo svojej štúdii skúšali účinnosť rôznych dezinfekčných

prípravkov s obsahom chlóru, jódu, peroxidu vodíka a kvartérnych amóniových zlúčenín.

Na základe získaných údajov konštatujú, že testované dezinfekčné prípravky boli úspešné

voči bežným druhom Mycoplasma sp.

Harmon (1996) ďalej uvádza, že do dezinfekčného prostriedku by sa mala ponoriť

taká časť cecku, aká prišla do styku s dojacím zariadením. Namiesto ponárania ceckov do

dezinfekčného roztoku sa môže používať aj ošetrenie sprejovým prípravkom. Pri aplikácii

sprejového prípravku sa však zvyšuje možnosť zlej aplikácie. Z tohto dôvodu sa ponáranie

ceckov do dezinfekčných roztokov považuje za najlepšiu metódu aplikácie. Intramamárnu

liečbu všetkých štvrtiek všetkých dojníc sa odporúča vykonať pomocou antibiotických túb po

poslednom dojení pred ukončením laktácie a samotným zasušením dojníc.

31

Z hľadiska eliminácie existujúcich infekcií je terapia v období státia na sucho

efektívnejšia než terapia v priebehu laktácie. Pri terapii v období státia na sucho sa taktiež

znižuje počet nových infekcií a môžu sa použiť vyššie koncentrácie antibiotík bez obavy

z následkov z prekročenia limitov rezíduí antibiotík v mlieku. Po intramamárnej aplikácii

antibiotík sa odporúča vykonať dezinfekciu ceckov ponorením do dezinfekčného roztoku.

Pravidelná dezinfekcia a intramamárna liečba v období státia na sucho redukujú počet

mastitíd v chove. K preukázateľnému zlepšeniu stavu v chove dochádza po jedno až

trojročnom pravidelnom dodržiavaní preventívnych opatrení. V prípade zastavenia

preventívnych opatrení dochádza veľmi rýchlo k zvýšeniu počtu mastitíd v chove (Harmon,

1996).

Sumár vedeckých prác zameraných na dezinfekciu ceckov pred a po dojení,

realizovaných od roku 1980 je uvedený na web stránke NMC (National Mastitis Council,

A global organisation for mastitis control and milk quality) (www.nmconline.org, 2005).

1.1.6.2 Dodržiavanie hygienických zásad v priebehu dojenia

Striktné dodržiavanie hygienických zásad je veľmi dôležité z hľadiska redukcie šírenia

sa zápalových baktérií z dojnice na dojnicu a z hľadiska bakteriálnej kontaminácie

bazénového mlieka (Neave et al., 1996).

Ingawa et al. (1992) uvádzajú, že existuje veľa metód a postupov prípravy vemena na

dojenie. Medzi bežné postupy patrí ručné umytie ceckov vodou, poutieranie ceckov špongiou,

utierkou alebo jednorazovými utierkami a následné nasadenie dojacieho zariadenia. Tento

postup sa môže doplniť o dezinfekciu ceckov ponorením do dezinfekčného prípravku.

Harmon (1996) uvádza, že pred zapojením dojacieho zariadenia by sa vemeno malo

vyčistiť a poutierať. Odporúča sa používať utierky navlhčené germicídnou látkou.

Premývanie plátenných utierok alebo špongií v germicídnom roztoku neinaktivuje všetky na

nich priľnuté baktérie, pričom by mohlo dochádzať k prenosu baktérií z jednej dojnice na

druhú. Práve preto sa neodporúča použiť tú istú utierku alebo špongiu na očistenie

a vysušenie vemien všetkých dojníc. Odporúča sa radšej používať jednorazové papierové

utierky.

32

Dojič je často tým najdôležitejším faktorom v šírení mastítíd v stáde. Dojenie by mali

vykonávať iba zaškolení pracovníci (Tongeľ a Mihina, 2005).

Ingawa et al. (1992) uvádzajú, že príprava vemena pred dojením ovplyvňuje kvalitu

mlieka a zdravotný stav mliečnej žľazy. Pre zníženie počtu baktérií prítomných na koži

ceckov sa musia aplikovať účinné hygienické postupy, pretože nedostatočne umyté vemeno je

zdrojom baktérií.

Účinnosť hygieny ovplyvňujú najmä nasledovné faktory: suchosť a čistota ceckov,

typ použitej utierky, typ a koncentrácia dezinfekčného prostriedku a čas kontaktu ceckov

s dezinfekčným prostriedkom. Ako najdôležitejšie faktory sa javia suchosť ceckov a doba

počas ktorej sú cecky napojené na dojacie zariadenie. V prípade nedostatočného vysušenia

vemena môže dochádzať k stekaniu vody kontaminovanej baktériami po ceckoch do

dojacieho zariadenia a následne do mlieka, čím sa zhoršuje mikrobiálna kvalita mlieka.

Taktiež môže dochádzať k vzniku nových mastitídnych infekcií šírením sa mikroorganizmov

medzi jednotlivými dojnicami prostredníctvom dojacieho zariadenia. Vo všeobecnosti platí,

že uplatňovaním správnych hygienických postupov sa znižuje výskyt intramamárnych infekcií

v chove. Slabá úroveň hygieny je asociovaná so zvýšením počtu somatických

buniek, znížením kvality a produkcie mlieka. Znehodnotené mlieko, zhoršený zdravotný stav,

poškodenie tkaniva mliečnej žľazy a vyradenie chronicky chorých dojníc sú príčinou

ekonomických strát. Predchádzať ekonomickým stratám je možné uplatňovaním správnych

hygienických postupov pri ošetrovaní vemena pred dojením.

Dojacie zariadenie môže výrazným spôsobom ovplyvniť vznik nových mastitíd.

Funkčnosť a správne nastavenie dojacej techniky sú preto veľmi dôležité. Kolísanie vákua,

nevhodný podtlak, poruchy pulzácie, nevyhovujúci technický stav ceckových gúm ako aj

nesprávne vykonávanie dezinfekcie dojacieho zariadenia môžu mať za následok vznik nových

mastitíd.

Tančin et al. (2001) uvádzajú, že významné postavenie vo fyziológii vemena

zohrávajú aj funkčné parametre dojacej techniky. Obzvlášť úroveň podtlaku výrazne

ovplyvňuje rýchlosť dojenia. Avšak z hľadiska reakcie tkaniva ceckového zvierača nadmerne

vysoký podtlak poškodzuje toto tkanivo. Podľa platných smerníc ISO pre dojacie zariadenia

s dole umiestnenými mliekovodnými potrubiami by sa priemerné hodnoty podtlaku

v rozdeľovači počas maximálneho toku mlieka mali pohybovať v rozsahu od 32 do 40 kPa

a pre zariadenia s hore umiestnenými mliekovodnými potrubiami by mali hodnoty zostať na

33

48 kPa, za určitých špecifických podmienok je možné tolerovať aj 46 kPa. Poškodené

tkanivo na hrotoch ceckov sa javí ako významný faktor zvýšeného výskytu infekčného

ochorenia mliečnej žľazy a tým zhoršenej kvality mlieka.

Rovnako negatívne pôsobí aj nesprávne nastavená charakteristika pulzácie. Z hľadiska

možnosti traumatizovania tkanív cecku je dôležité poznať sily, ktoré pôsobia priamo na hrot

cecku. Dôležitá je nielen výška podtlaku pod ceckom počas taktu satia, ale aj odpovedajúci

rozdiel tlakov medzi komorami ceckovej nástrčky, ktorý by mal zabezpečiť dokonalé

obopnutie cecku ceckovou gumou počas taktu stláčania. Stláčanie zabezpečí, aby

nedochádzalo k nahromadeniu tekutiny v tkanive cecku v dôsledku pôsobenia podtlaku.

Nahromadenie tekutiny v cecku vytvára optimálne podmienky pre zvýšenú citlivosť na

mastitídu. Podtlak spôsobuje zhrubnutie cecku, čo je vlastne prekrvenie ceckového tkaniva.

Zadržaním krvi v krvnom riečisku cecku sa zníži prietok krvi, tým sa zníži prísun obranných

látok a teda má organizmus zníženú schopnosť brániť sa proti prenikajúcim baktériám.

Vzniká zvýšené riziko ochorenia vemena.

Hmotnosť dojacej súpravy ovplyvňuje stav vemena nasledovne. So zvyšovaním

hmotnosti dojacej súpravy dochádza k výraznejším zmenám pozorovaným na ceckovom

tkanive vplyvom väčšej možnosti dojenia na prázdno, taktiež hrozí riziko kontaminácie

súpravy vplyvom pádov na zem. Ľahšie dojacie súpravy významne redukujú padanie súprav

počas dojenia a tým ich kontamináciu.

Parametre pulzácie (frekvencia pulzov za minútu a pomer taktov pulzu vyjadrený

podielom taktu satia z celkového pulzu) môžu ovplyvniť stav ceckového tkaniva. Pri

frekvencii pulzácie väčšej ako 60 min-1 bol preukazne nižší výskyt akútnych mastitíd a nižší

počet somatických buniek v mlieku než pri frekvencii pulzácie menšej ako 53 min-1.

Kvalitu mlieka ovplyvňuje aj dodájanie. Nešetrné a nadmerne dlhé dodájanie zhoršuje

kvalitu mlieka. Okrem zníženia výkonnosti dojacieho zariadenia sa tiež predlžuje čas

pôsobenia podtlaku na relatívne prázdne vemeno. Vplyvom toho sa môže zvýšiť počet

somatických buniek v mlieku, vo väčšom rozsahu sa môžu objaviť edémy ceckovej steny

a môžu sa vyskytnúť poruchy zdravotného stavu vemena. Uplatňovanie automatizácie pri

ukončovaní dojenia je dôležité nielen z hľadiska pracovnej a strojovej náročnosti, ale aj

z hľadiska kvality mlieka.

Pôsobenie funkčných parametrov dojacích zariadení možno pozorovať jednak na

charakteristike priebehu dojenia, ale aj na stave ceckov na konci dojenia po stiahnutí

ceckových nástrčiek. Fyziologické a anatomické zmeny sú odrazom vhodnosti nastavenia

funkčných parametrov dojacieho zariadenia. Stav ceckov je jedným z rozhodujúcich faktorov,

34

ktorý poukazuje na úroveň zdravotného stavu dojníc a tým i na predpoklad technologickej

a hygienickej kvality mlieka. Zdravotný stav vemena je jedným z kritických vzťahov medzi

strojom a dojnicou. Dojacie zariadenie môže mať buď priamy alebo nepriamy vplyv na

zdravotný stav vemena. Prejavuje sa to predovšetkým tým, že: umožňuje kontamináciu

povrchu kože, vyvoláva zmeny stavu ceckov, umožňuje penetrovať baktériám cez ceckový

kanálik, umožňuje prenos baktérií medzi jednotlivými štvrťkami, ovplyvňuje stupeň

vydojenia vemena (Tančin et al., 2001).

Tieto faktory môžu byť znásobené nedostatočnou hygienou vemena. Následne môže

dochádzať k prenosu mikroorganizmov z dojnice na dojnicu prostredníctvom dojacieho

zariadenia (Ingawa et al., 1992).

Tongeľ a Mihina (2005) popisujú vznik mastitídy nasledovne: mastitída môže

vzniknúť iba tak, že baktérie preniknú do vemena. Do vemena sa však baktérie môžu dostať

výlučne (99.9 %) cez ceckový kanálik. Aby baktérie prenikli cez ceckový kanálik, musia byť

najskôr prítomné na povrchu cecku. Baktérie sa na povrch cecku môžu dostať z podstielky,

ale aj z ceckovej nástrčky dojacieho zariadenia. Je zrejmé, že nie je možné úplne zabrániť

tomu, aby sa baktérie na povrch cecku dostali, ale vhodnými opatreniami sa ich množstvo

môže znížiť. Ďalej je potrebné zabrániť prítomným baktériám preniknúť do vemena.

Najväčšiu šancu baktérie dostávajú počas dojenia, keď sa vyskytne takzvané mokré

dojenie v prípade nedostatočne osušených ceckov. V takom prípade sa cecková nástrčka

šmýka po cecku a vytvára turbulencie mlieka v blízkosti ceckového otvoru. Na konci dojenia

potom vznikajú spätné nárazy mlieka do ceckového kanálika, čo napomáha strhávaniu

baktérií z povrchu cecku a ceckovej nástrčky a následnému vtláčaniu mlieka do vemena. Už

päť životaschopných baktérií, ktorým sa podarí preniknúť do vemena dokáže vyvolať

mastitídu.

Druhý spôsob, ako sa môžu baktérie dostať do vemena, je tesne po dojení, keď je

ceckový kanálik čiastočne pootvorený. Pootvorenie ceckového kanálika trvá približne jednu

hodinu od dojenia. Baktérie, ktoré sa dostali do blízkosti ceckového otvoru z ceckovej gumy,

na ktorú sa dostali pri dojení chorej dojnice, majú mimoriadnu možnosť dostať sa do vemena.

Jedna chorá dojnica dokáže infikovať pomocou ceckových gúm až päť ďalších dojníc

dojených bezprostredne po nej. Z tohto dôvodu je potrebné robiť dôslednú dezinfekciu ceckov

po dojení. Nanesením dezinfekčného roztoku na povrch cecku sa baktérie zničia a v ústí

ceckového kanálika sa vytvorí kvapôčka, ktorá ho uzavrie. Často je kvapôčka vtiahnutá do

35

ceckového kanálika, čím sa tento vydezinfikuje. Takto je možné podstatne zabrániť prieniku

infekcie do vemena.

Veľkú pozornosť je treba venovať čistote celého dojacieho systému. Automatizovaný

preplachový systém efektívne sanituje dojacie zariadenie a redukuje šírenie sa patogénnych

mikroorganizmov (Hogan et al., 1984).

Po aplikácii sanitačných a dezinfekčných prostriedkov však vzniká riziko

kontaminácie mlieka ich rezíduami, preto treba vykonávať kontrolu správnosti ich aplikácie.

Výsledkom správnej aplikácie hygienických postupov má byť vysušené vemeno s nízkym

počtom mikroorganizmov a neprítomnými rezíduami čistiacich a dezinfekčných prostriedkov

(Ingawa et al., 1992).

Neave et al. (1996) vo svojej štúdii zisťovali vplyv čiastkovej hygieny a celkovej

hygieny na vzostup bakteriálnych infekcií. Za čiastkovú hygienu považovali používanie

rukavíc, očistenie vemena dezinfekčným roztokom, používanie jednorazových utierok

a ponorenie vemena do dezinfekčného roztoku. Za celkovú hygienu považovali čiastkovú

hygienu a pasterizáciu gumených násadcov dojacieho zariadenia počas 5 sekúnd pri teplote

85 °C. Aplikáciou čiastkovej hygieny sa znížil počet nových infekcií o 44 % v porovnaní so

zvieratami bez hygienického ošetrenia vemena. Aplikáciou celkovej hygieny sa znížil počet

nových infekcií o 58 % v porovnaní so zvieratami bez hygienického ošetrenia vemena.

Tančin et al. (2001) zhrnuli nasledovné požiadavky na proces dojenia.

Pri dojení je potrebné vytvárať optimálne podmienky prostredia a prísne dodržiavať

stereotyp pracovných postupov, minimalizovať vznik stresov a tým čo najviac využívať

ejekčný reflex dojníc.

Pre zmyslové posúdenie mlieka a odstránenie kontaminovaného mlieka sa musia

oddojiť najmenej dva až tri streky z každého cecku do špeciálnej nádoby s dvojitým dnom.

V žiadnom prípade nie je vhodné oddojovať mlieko na zem alebo na ruku, aby sa nevytvárali

podmienky pre prenos infekcie z dojnice na dojnicu.

Prvé streky mlieka sa musia oddojiť na začiatku prípravy vemena, aby sa počas

umývania kontaminované mlieko v ceckovom kanáliku a cisterne cecku nezmiešalo

s ostatným mliekom v ceckovej cisterne. Až potom je možné pristúpiť k čisteniu a masáži

vemena.

36

Pri zistených zmenách na mlieku je potrebné urobiť podrobnú kontrolu zdravotného

stavu vemena a mlieko od podozrivej dojnice vylúčiť z dodávky do mliekarne.

Pomocou dobre riešeného ustajnenia sa musí zabezpečiť, aby boli dojnice čo najmenej

znečistené a tým minimalizovať potrebu čistenia pred dojením.

Umývať by sa mali iba veľmi znečistené vemená. Po umytí je potrebné vemeno

utretím veľmi dôkladne osušiť, aby znečistená voda počas dojenia nebola nasávaná do

ceckových nástrčiek. Dôraz sa musí klásť predovšetkým na hygienu ceckov a ich hrotov.

Na čistenie vemena a ceckov by sa mali používať podľa možností len jednorazové

utierky. Z hľadiska prenosu možnej infekcie nie je vhodné používať jednu utierku pre viacej

dojníc. Pri utieraní sa vemeno musí masírovať a kontrolovať na prípadné poranenia

a vzniknuté zmeny.

V stádach s vyšším podielom mastitídnych dojníc je potrebné riadiť sa pri dojení

špeciálnym hygienickým programom stanoveným príslušným veterinárnym lekárom.

Poradie dojníc pri dojení upraviť tak, aby boli ako prvé dojené dojnice so zdravou

mliečnou žľazou a až potom dojnice infikované alebo liečené.

Po ukončení prípravy vemena pred dojením by sa mala nasadiť dojacia súprava na

vemeno najneskôr do 1 min. Dojič musí dbať o to, aby sa pri nasadzovaní súpravy na vemeno

zbytočne neprisával atmosferický vzduch a aby nedošlo k zbytočnému poraneniu vemena.

Po nasadení súpravy na vemeno sa kontroluje či dojnica spustila mlieko.

Sústavne sa kontroluje priebeh dojenia a vzniknuté nedostatky sa okamžite odstránia.

V žiadnom prípade nesmie dojič opustiť priestor dojenia, ak majú dojnice nasadené dojacie

súpravy.

Ak nie je k dispozícii zariadenie pre automatické ukončovanie dojenia, je potrebné

dojenie ukončiť čím skôr po zastavení toku mlieka. Prípadné dodájanie by sa malo urobiť

okamžite po zastavení toku mlieka, aby sa zabránilo tzv. dojeniu naprázdno.

Ceckové nástrčky sa musia sťahovať z ceckov vemena šetrne po zatvorení prívodu

podtlaku.

Po ukončení dojenia je nutné dezinfikovať hroty ceckov a upraviť systém kŕmenia tak,

aby dojnice v priestoroch ustajnenia v prvých dvoch hodinách zostali stáť.

Použité dezinfekčné prípravky musia byť riadne registrované a schválené.

Sústavne by sa mala sledovať stabilita funkčných parametrov dojacieho zariadenia

stanovených výrobcom. Akúkoľvek poruchu by mal odstrániť kvalifikovaný servis,

s pravidelnou obmenou gumových súčastí v intervaloch udávaných dodávateľom dojacej

techniky.

37

1.1.6.3 Vyradenie chronicky chorých dojníc

Vyradenie chronicky chorých dojníc je nevyhnutnou súčasťou proti mastitídnych

opatrení. Uplatňuje sa pri regulovaní mykoplazmovej mastitídy a mastitídy vyvolanej

Staphylococcus aureus. Vyradením chronicky chorých mastitídnych dojníc, ktoré sú bez

odozvy na aplikovanú liečbu sa eliminuje riziko prenosu infekcie medzi jednotlivými

dojnicami. Toto opatrenie pozitívne ovplyvňuje počet somatických buniek v bazénovej vzorke

(Harmon, 1996).

Brakovaním dojníc s nevyliečiteľnými zápalmi mliečnej žľazy znižujeme dobu trvania

infekcie v stáde a ďalšiu možnosť šírenia infekcie. Brakujeme dojnice s nízkou produkciou

mlieka s viac násobným výskytom mastitíd v priebehu laktácie (Drahošová a Drončovský,

2004).

1.1.6.4 Segregácia dojníc

V prípade chovov s výrazným problémom zamorenia infekciami Staphylococcus

aureus alebo Mycoplasma sp. môže byť osožnou segregácia infikovaných dojníc. Úspech

segregácie závisí od identifikácie infikovaných dojníc. Identifikácia infikovaných dojníc sa

obyčajne vykonáva na základe výsledkov mikrobiologického vyšetrenia alebo vyšetrenia

počtu somatických buniek (Harmon, 1996).

Segregáciou alebo separáciou dojníc pozitívnych na prítomnosť Staphylococcus

aureus sa znížila prevalencia tohto mikroorganizmu v chove a súčasne sa znížil počet

somatických buniek v bazénovom mlieku. Vystríhanie sa spoločného dojenia infikovaných

dojníc s neinfikovanými preukázateľne znižuje prevalenciu intramamárnych infekcií.

Infikované dojnice by sa mali dojiť oddelene alebo až ako posledné (Wilson et al., 1995).

1.1.6.5 Vakcinácia dojníc

Výsledkom vakcinácie je vo všeobecnosti redukcia klinických epizód a zvýšenie

spontánneho vyliečenia sa dojníc. Aj napriek pozitívnym výsledkom sa vakcináciou

nedosahujú rovnako úspešné výsledky ako pri ošetrovaní vemena dezinfekčnými

38

prostriedkami. Imunizácia je preto v súčasnosti považovaná iba za súčasť protimastitídnych

opatrení a postupov (Harmon, 1996).

Vakcíny určené na zvýšenie odolnosti dojníc voči mastitíde vyvolanej Staphylococcus

sp. majú limitovaný účinok. Môže to byť spôsobené zriedením imunitných zložiek vakcíny

(lymfocytov, imunglobulínov a fagocytov) v mlieku ako aj ich interakciami so zložkami

mlieka (Carter a Kerr, 2003).

1.1.6.6 Liečba klinickej mastitídy počas laktácie

Liečba antibiotikami počas laktácie je veľmi úspešná v prípade infekcií vyvolaných

Streptococcus agalactiae. V prípade infekcií vyvolaných Staphylococcus aureus je úspešnosť

liečby pomerne nízka, obyčajne sa vylieči menej než 50 % postihnutých dojníc. Liečenie

pomocou antibiotík v prípade klinických stavov môže zredukovať klinické symptómy, ale

prevalencia infekcie v stáde sa zlepší iba mierne. Veľké množstvo infekcií je subklinických,

pričom tieto infekcie často zostávajú neodhalené. Mykoplazmové infekcie nereagujú na liečbu

antibiotikami (Harmon, 1996).

39

1.2 VPLYV MASTITÍDY NA PRODUKCIU, ZLOŽENIE A TECHNOLOGICKÚ

KVALITU MLIEKA A MLIEČNYCH VÝROBKOV

Pokles produkcie mlieka u mastitídnych dojníc závisí od druhu prítomného

patogénneho mikroorganizmu. K poklesu dojivosti dochádza už niekoľko týždňov pred

diagnostikovaním klinickej mastitídy (Gröhn et al., 2004).

Existuje preukázateľná negatívna korelácia medzi produkciou mlieka a vysokým

počtom somatických buniek. Produkcia mlieka počas mastitídy klesá v dôsledku poškodenia

epitelu mliečnej žľazy (Marcus a Kehrli, 1994).

Odhad poklesu produkcie mlieka v závislosti od percenta infikovaných štvrtiek stáda

a počtu somatických buniek v bazénovom mlieku

Tabuľka 3

Počet somatických buniek v

bazénovom mlieku (.ml-1)

Infikované štvrťky stáda

(%)

Pokles produkcie mlieka

(%)

200 000 6 0

500 000 16 6

1 000 000 32 18

Pokles produkcie mlieka je vypočítaný ako percento z predpokladanej produkcie na úrovni

200 000 somatických buniek . ml-1. Údaje uvádza (Gerald, 2001) podľa (National Mastitis

Council. 1996. Current Concepts of Bovine Mastitis, 4th ed., Madison, WI).

Mastitída výrazne vplýva na zloženie mlieka, a tým na jeho technologickú kvalitu ako

aj kvalitu finálnych mliečnych výrobkov. Vplyvom mastitídy sa zvyšuje počet somatických

buniek v mlieku, menia sa zmyslové vlastnosti mlieka, jeho zloženie a fyzikálno – chemické

znaky kvality. V mastitídnom mlieku dochádza k výraznému zvýšeniu obsahu

imunoglobulínov. Dochádza k poklesu obsahu hlavných bielkovín mlieka, najmä obsahu

kazeínu. Podiel kazeínu v micelárnej forme sa znižuje z 95 % na 46 % a pomer micelárneho

a rozpustného kazeínu sa mení z pôvodnej hodnoty 16,48 až na 0,87. Súčasne sa zmenšuje

veľkosť kazeínových miciel. Pomer kazeínu a srvátkových bielkovín sa mení v prospech

srvátkových bielkovín, čo sa prejavuje v poklese kazeínového čísla pod hodnotu 77. Znižuje

sa obsah laktózy a zvyšuje sa obsah niektorých minerálnych látok, napr. sodíka, chlóru

40

(zmena chlór cukrového čísla mlieka), znižuje sa množstvo draslíka, vápnika, fosforu

a horčíka. Najzávažnejšou z týchto zmien je predovšetkým pokles obsahu vápnika vo vzťahu

k jeho pozitívnemu vplyvu na syriteľnosť mlieka. V mlieku dojníc so zápalmi mliečnej žľazy

dochádza k znižovaniu obsahu tuku a zvyšovaniu obsahu voľných mastných kyselín, a to až

na dvojnásobok. Stúpa tiež koncentrácia enzýmov kataláz a lipáz (Drahošová a Drončovský,

2004).

Zmeny v produkcii a zložení mlieka v dôsledku mastitídy

Tabuľka 4 Pokles Stupeň zmeny Vzostup Stupeň zmeny

Výťažnosť štvrtiek – (– –) Počet somatických buniek +++

Sušina – Srvátkové bielkoviny +++

Laktóza – Bovinný sérový albumín +

Tuk – Imunoglobulíny +++

Mastné kyseliny s dlhým reťazcom

– Mastné kyseliny s krátkym reťazcom

+

Celkový kazeín – – Proteázové peptóny ++

αS1-kazeín – – Voľné mastné kyseliny ++

β-kazeín – – – κ-kazeín +(+)

α-laktalbumín – Sodík ++

β-laktoglobulín – – – Chloridy ++

Vápnik – – – Mliečnany +++

Horčík – – – Enzýmová aktivita

Fosfor – – – Lipáza ++

Zinok – Lyzozým +++

Draslík – NAGáza +++

- β-glukuronidáza +++

- Plazmín +++

(Pyörärlä, 2003)

Drahošová a Drončovský (2004) ďalej uvádzajú, že najvýznamnejším z faktorov,

ktorý sa mení v priebehu mastitídy je počet somatických buniek. Tento ukazovateľ sa v praxi

používa pri zatrieďovaní mlieka do tried kvality. Zvýšený počet somatických buniek

negatívne ovplyvňuje ekonomiku výroby a výrazne vplýva na technologické vlastnosti

41

mlieka. So zvýšeným počtom somatických buniek, zmenami obsahu a štruktúry bielkovín

a vápnika dochádza k zhoršeniu syriteľnosti mlieka. Prejavuje sa to dlhším časom syrenia,

nedostatočnou tuhosťou syreniny, vyššími stratami sušiny, znížením výťažnosti, zvýšenou

spotrebou syridla a inými negatívnymi následkami pri výrobe.

Zhoršená kysacia schopnosť mastitídneho mlieka spôsobuje problémy pri výrobe

fermentovaných mliečnych výrobkov. Pri výrobe masla dochádza okrem zhoršenej ostrosti

odstredenia smotany k zvýšeniu podielu voľných mastných kyselín. Zvýšená činnosť lipáz

spôsobuje hydrolytické štiepenie mliečneho tuku a zvýšenie jeho kyslosti.

Vplyvom mastitídy sa zhoršuje termostabilita mlieka, čo je nevyhovujúce najmä pri

výrobe sušeného a kondenzovaného mlieka, ako aj pre UHT záhrev pri výrobe trvanlivých

mliekarenských výrobkov s vysokým ohrevom mlieka akým je napríklad trvanlivé mlieko.

Klei et al. (1998) zisťovali ako vplýva počet somatických buniek na kvalitu

a výťažnosť pri výrobe syra cottage cheese. Autori uvádzajú, že zvýšenie počtu somatických

buniek z 83 000 . ml-1 na 872 5000 . ml-1 ovplyvnilo zloženie mlieka a následne zloženie

a výťažnosť syru cottage chease. Mlieko s vysokým počtom somatických buniek malo

v porovnaní s mliekom s nízkym počtom somatických buniek zvýšený obsah bielkovín,

kazeínu, zvýšené pH a malo znížený obsah laktózy a kazeínu vyjadreného ako percento

celkových bielkovín. Zvýšený počet somatických buniek neovplyvnil obsah celkovej sušiny.

Odtučnená syrenina vyrobená z mlieka s vysokým počtom somatických buniek mala

vyšší obsah vody, ale nižší obsah celkových bielkovín v porovnaní so syreninou vyrobenou

z mlieka s nízkym počtom somatických buniek. Výťažok bielkovín bol nižší u odtučnenej

syreniny vyrobenej z mlieka s vyšším obsahom somatických buniek, celkový obsah sušiny

bol vyšší. Výťažok vyššieho percenta sušiny u odtučnenej syreniny vyrobenej z mlieka

s vyšším obsahom somatických buniek bol spôsobený nižším obsahom laktózy v mlieku.

Vyhodnocovanie výťažnosti len pomocou celkového obsahu sušiny by bola zavádzajúca.

Výťažnosť bola preukázateľne nižšia ak sa vyhodnocovala na hydrolýzu kazeínu a na obsah

sušiny prítomný vo vodnej fáze syreniny (101,5 % voči 97,16 %).

Vlastnosti mlieka ovplyvňujú jeho schopnosť zrážať sa. Pri výrobe syrov sa vyžaduje

aby mlieko malo dobré koagulačné vlastnosti, aby sa po pridaní zrážacieho enzýmu rýchlo

zrazilo a vytvorila sa tuhá syrenina. Zabezpečí sa tým vyššia výťažnosť finálneho produktu.

Koagulačné vlastnosti mlieka sa dajú ovplyvniť výberom mlieka s nízkym počtom

42

somatických buniek. Existuje možnosť genetického ovplyvnenia koagulačných vlastností

mlieka vhodnou selekciou dojníc (Ikonen et al., 2004).

Ma et al. (2000) zisťovali ako vplývajú somatické bunky na kvalitu a trvanlivosť

pasterizovaného mlieka. Mlieko s nízkym počtom somatických buniek si zachovalo vysokú

kvalitu a nemalo zmenené organoleptické vlastnosti ani po dobe skladovania 21 dní. Mlieko

s vyšším obsahom somatických buniek vykazovalo od štrnásteho dňa skladovania chyby

v organoleptických vlastnostiach. Mlieko bolo potuchnuté, zhorknuté a trpké. Tieto chyby

súviseli s vyšším stupňom lipolýzy a proteolýzy. Počas skladovania pasterizovaného mlieka

pri chladiarenských teplotách výrazne stúpol obsah voľných mastných kyselín a taktiež

hydrolýza celkového kazeínu bola vyššia u mlieka s vyšším počtom somatických buniek.

Z uvedeného vyplýva, že mastitídne mlieko výrazne ovplyvňuje kvalitu pasterizovaného

mlieka a skracuje dobu jeho trvanlivosti.

Santos et al. (2003) zistili, že ak sa na výrobu pasterizovaného mlieka použije mlieko

s nízkym počtom somatických buniek a súčasne sa dodržiava prísna hygiena v prevádzke

mliekarenského podniku, a skladovanie finálneho výrobku sa realizuje pri nízkych teplotách

(< 6 °C), je možné vyrobiť pasterizované mlieko, ktoré si udrží chuťové vlastnosti po dobu 61

dní.

43

1.3 NEBEZPEČENSTVO ASOCIOVANÉ S KONZUMÁCIOU MASTITÍDNEHO

MLIEKA

V súvislosti s mastitídou sa mení zloženie mlieka a dochádza k výraznému vzostupu

počtu somatických buniek (Gerald, 2001)

Zvýšený počet somatických buniek sám o sebe nie je rizikovým faktorom pre ľudské

zdravie, ale je nevyhnutné brať do úvahy tú skutočnosť, že v tomto ukazovateli sa odráža

celkový zdravotný stav dojnice (Smith, 1996).

Väčšina zápalov mliečnej žľazy je spôsobená prítomnosťou mikroorganizmov a teda

infekciou (Harmon, 1994).

Prítomnosť mikroorganizmov v surovom kravskom mlieku je sama o sebe riziková.

Riziko sa však stupňuje s prítomnosťou ich toxínov (Zajác et al., 2005).

Matthews et al. (1994) študovali vplyv bakteriálnych virulenčných faktorov na

štruktúru a funkciu epitelových buniek. Autori uvádzajú, že počas laktácie ako aj v období

mimo laktácie je mliečna žľaza vystavená širokému spektru baktérií, ktoré môžu produkovať

látky škodlivé pre dojnicu. Escherichia coli, Staphylococcus aureus a Streptococcus uberis

produkujú endotoxín, a-toxín a hyaluronidázu. Tieto látky pôsobia na tkanivo mliečnej žľazy

a spôsobujú jeho patologické zmeny, taktiež sa môžu dostávať do mlieka a spôsobovať

ochorenia z potravín.

Vybrané mastitídne mikroorganizmy a ich toxíny sú uvedené v Tabuľke 5 (Golian,

1998; Chamberlain, 2005).

44

Vybrané mastitídne mikroorganizmy a ich toxíny Tabuľka 5

Mikroorganizmus Toxín Príznaky

Staphylococcus aureus Enterotoxíny A, B, C, D, E Zvracanie, hnačka, horúčka

nebýva prítomná

Enterotoxigénne E. coli LT-1 a LT-2 toxín

ST-1 a ST-2 toxín

Hnačka, zvracanie, kŕče,

nevoľnosť, zvýšená teplota

počas 1-3 dní

Enterohemmorhagická E. coli

sérotyp O157:H7

Verotoxín VT-1 a VT-2 Krvavá hnačka a v niektorých

prípadoch hemolytický

uremický syndróm

(Golian, 1998; Chamberlain, 2005)

Pri liečbe mastitídy sa používa široké spektrum veterinárnych liečiv, predovšetkým

antibiotík. Rezíduá týchto látok predstavujú veľké riziko pre zdravie človeka. Pri vyššom

počte somatických buniek sa zvyšuje riziko z prítomnosti antibiotík v surovom kravskom

mlieku (Ruegg a Tabone, 2000).

Ruegg a Tabone (2000) ďalej uvádzajú, že v priebehu obdobia rokov 1995 až 1998

sledovali relatívne riziko z prítomnosti rezíduí antibiotík vo vzťahu k počtu somatických

buniek u 1000 dojníc (Tabuľka 6). Podľa priemerného ročného počtu somatických buniek

dojnice rozdelili do piatich tried a na základe výsledkov experimentu skupinám priradili

relatívne riziko z prítomnosti rezíduí antibiotík.

Relatívne riziko z prítomnosti rezíduí antibiotík

Tabuľka 6 Počet somatických buniek Relatívne riziko z prítomnosti rezíduí

antibiotík

≤ 250 000 1,00

251 000 – 400 000 1,43

401 000 – 550 000 2,38

551 000 – 700 000 2,78

> 700 000 7,10

(Ruegg a Tabone, 2000)

45

Autori záverom konštatujú, že s vyšším počtom somatických buniek sa preukazne

zvyšuje riziko prítomnosti rezíduí antibiotík. V tej istej súvislosti sa zvyšuje aj počet prípadov

subklinickej mastitídy vyvolanej prevažne majoritnými patogénnymi mikroorganizmami.

Podobnou štúdiou sa zaoberali Schaik et al. (2000), ktorí zistili pri priemernom počte

363 000 somatických buniek . ml-1 riziko na úrovni 3,9.

Smith (1996) uvádza, že Saville et al. zistili na troch rôznych hladinách počtu

somatických buniek: < 400 000 . ml-1, 400 000 až 750 000 . ml-1 a > 750 000 . ml-1 nasledovné

úrovne rizika: 1,0; 2,21; a 4,73. Počet somatických buniek bol jednoznačne asociovaný

s rizikom prítomnosti rezíduí antibiotík v surovom kravskom mlieku pričom 60 % prípadov sa

vyskytovalo pri počte somatických buniek > 400 000 . ml-1.

Vyššie uvedení autori analyzovali vzorky surového kravského mlieka na prítomnosť

rezíduí antibiotík, taktiež všetci uvádzajú, že sa zvýšila prítomnosť patogénnych

mikroorganizmov v surovom kravskom mlieku. Závislosť medzi počtom somatických buniek

v bazénovej vzorke a percentom infikovaných štvrtiek naznačuje, že surové kravské mlieko

s vyšším počtom somatických buniek bude obsahovať vyšší počet patogénnych

mikroorganizmov.

Mikroorganizmy, predovšetkým patogénne baktérie a ich toxické produkty ako aj

veterinárne liečivá predstavujú riziko, ktoré existuje v paralele so zvýšeným počtom

somatických buniek. Toto riziko môže nepriaznivo ovplyvniť ľudské zdravie (Zajác et al.,

2005).

46

1.4 ÚLOHA NÁRODNÉHO REFERENČNÉHO LABORATÓRIA PRE MLIEKO

A MLIEČNE VÝROBKY VO VZŤAHU K SOMATICKÝM BUNKÁM, SYSTÉM

KONTROLY

Národné referenčné laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky je na základe

autorizácie zodpovedné za viacero úloh. Medzi tieto úlohy patria: koordinácia činnosti

laboratórií, ktorých úlohou je vykonávanie analýz na kontrolu chemických

a bakteriologických štandardov, pomoc orgánom veterinárnej správy pri organizovaní

systému kontroly mlieka a mliečnych výrobkov, periodické organizovanie porovnávacích

testov a ďalšie úlohy (ŠVPS SR, 2003).

Celoplošná kontrola počtu somatických buniek v surovom kravskom mlieku sa

v Slovenskej republike vykonáva v centrálnych skúšobných laboratóriách v Bratislave

a Žiline.

Vzorky na analýzu v centrálnych skúšobných laboratóriách odoberajú mliekarne

v pravidelných časových intervaloch (najmenej 1 krát za mesiac), jedná sa o vzorky určené na

vyšetrenie základných ukazovateľov mlieka v súvislosti s jeho speňažovaním. Centrálne

skúšobné laboratóriá informujú o výsledkoch skúšok mliekarenské závody. Počet

somatických buniek sa stanovuje výpočtom v mliekarenských závodoch ako kĺzavý

geometrický priemer za posledné 3 mesiace. Ak surové kravské mlieko obsahuje nadlimitný

počet somatických buniek, musí to mliekareň nahlásiť príslušnej regionálnej veterinárnej

a potravinovej správe a musí prijať opatrenia na nápravu tohto stavu.

Pokiaľ prevádzkovateľ mliekarne nevykoná nápravu situácie do troch mesiacov od

prvého oznámenia regionálnej veterinárnej a potravinovej správe o nedodržaní podmienok

s ohľadom na celkový počet mikroorganizmov a počet somatických buniek v mlieku,

dodávky surového mlieka z produkčného chovu sa pozastavia, alebo na základe osobitného

povolenia alebo všeobecných pokynov regionálnej veterinárnej a potravinovej správy –

podliehajú požiadavkám, ktoré sa týkajú jeho ošetrenia a použitia nevyhnutným na ochranu

zdravia ľudí. Toto pozastavenie alebo tieto požiadavky zostanú v platnosti, pokým mliekareň

nepreukáže, že mlieko opäť spĺňa uvedené kritériá (Nariadenie ES č. 1662/2006, Nariadenie

ES č. 853/ 2004; Nariadenie ES č. 854/ 2004).

47

Do 31. 12. 2005 platilo Nariadenie vlády Slovenskej republiky č. 312 (2003) v znení

Nariadenia vlády Slovenskej republiky č. 284 (2004), v ktorom sa uvádzalo, že obnoviť

dodávku surového mlieka na výrobu mlieka a mlieka na výrobu mliečnych výrobkov na

výživu ľudí možno len vtedy, ak aktuálne hodnoty dvoch bazénových vzoriek surového

mlieka, ktoré na základe písomnej žiadosti produkčného hospodárstva odobral úradný

veterinárny lekár a ktoré sa vyšetrili v akreditovanom laboratóriu autorizovanom Štátnou

veterinárnou a potravinovou správou v Bratislave (v Národnom referenčnom laboratóriu pre

mlieko a mliečne výrobky v Nitre), spĺňajú požiadavky celkového počtu mikroorganizmov

a počtu somatických buniek.

V súvislosti s vyššie uvedeným musí mať Národné referenčné laboratórium pre mlieko

a mliečne výrobky zavedenú čo najpresnejšiu a medzinárodne akceptovanú referenčnú

metódu pre stanovenie počtu somatických buniek. Výsledky stanovené pomocou referenčnej

metódy musia odzrkadľovať skutočný, správny obsah somatických buniek v skúšanej

laboratórnej vzorke mlieka. Všetky úradne odobraté vzorky sa musia skúšať referenčnou

metódou.

Národné referenčné laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky kontroluje

a metodicky usmerňuje činnosť centrálnych skúšobných laboratórií. Kontrolu metódy

stanovenia počtu somatických buniek v centrálnych skúšobných laboratóriách vykonáva

prostredníctvom sekundárnych referenčných materiálov. Výsledky analýz sekundárnych

referenčných materiálov sa sumarizujú a štatisticky vyhodnocujú vo forme mesačných správ.

Národné referenčné laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky zabezpečuje výrobu

a distribúciu sekundárnych referenčných materiálov s presným počtom somatických buniek.

Ďalším spôsobom kontroly je kontrola prostredníctvom medzilaboratórnych skúšok

spôsobilosti, ktoré sa vykonávajú pomocou referenčných vzoriek s rozdielnym počtom

somatických buniek pripravených v Národnom referenčnom laboratóriu pre mlieko a mliečne

výrobky.

Uvedené činnosti vyplývajú z úloh Národného referenčného laboratória a sú súčasťou

kontroly systému preplácania mlieka v Slovenskej republike.

48

1.5 PRÁVNE NORMY A POČET SOMATICKÝCH BUNIEK

Legislatíva Európskej únie upravuje počet somatických buniek prostredníctvom

Nariadenia Komisie (ES) č. 1662/2006 zo 6. novembra 2006, ktorým sa mení a dopĺňa

nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004 z 29. apríla 2004, ktoré

stanovuje špecifické hygienické pravidlá pre potraviny živočíšneho pôvodu (Smernica rady

92/46 EHS, 1992). Kritérium pre počet somatických buniek v surovom kravskom mlieku

v bazénovej vzorke je maximálne 400 000 somatických buniek v 1 ml. Stanovuje sa ako

kĺzavý geometrický priemer výsledkov z troch po sebe idúcich mesiacov. Stanovuje sa

minimálne 1 vzorka za mesiac, ak príslušný orgán neurčí inú metodiku kvôli zohľadneniu

sezónnych odchýlok v množstvách produkcie.

Počet somatických buniek v surovom kravskom mlieku v Slovenskej republike taktiež

upravuje norma STN 57 0529 (1999) Surové kravské mlieko na mliekarenské ošetrenie

a spracovanie (Tabuľka 7). Údaje uvedené v tejto norme môžu slúžiť ako pomôcka pri

uzatváraní zmlúv v rámci dodávateľsko-odberateľských vzťahov. Z legislatívneho hľadiska je

však dôležité riadiť sa požiadavkami vyššie uvedených nariadení Európskej únie. Podľa

normy STN 57 0529 musí surové kravské mlieko spĺňať viaceré požiadavky. Surové kravské

mlieko musí pochádzať od dojníc nevykazujúcich zjavné príznaky porúch celkového

zdravotného stavu a od dojníc bez príznakov zápalov a poranení mliečnej žľazy a kože

mliečnej žľazy. Počet somatických buniek v surovom kravskom mlieku musí byť nasledovný:

Počet somatických buniek podľa normy STN 57 0529 (1999)

Tabuľka 7

Trieda kvality mlieka

Q I

Najviac 300 000 Najviac 400 000

V jednotlivých krajinách sveta sú rozdielne limity pre počet somatických buniek

v surovom kravskom mlieku (Smith a Hogan, 1998).

Krajiny podieľajúce sa výrazným spôsobom na exporte mlieka ako Nový Zéland

(MAF NZ 1990; NZFSA, 1997), Austrália (Smith a Hogan, 1998) a Švajčiarsko (Smith

a Hogan, 1998) prijali ako maximálny limit pre tento ukazovateľ hranicu 400 000

somatických buniek . ml-1. Na Novom Zélande sa dokonca uvažuje o hranici 300 000

49

somatických buniek .ml-1. V Kanade je limitom hranica 500 000 somatických buniek .ml-1

(Milk Quality Regulation, 1986) a uvažuje sa o znížení tejto hranice na úroveň 400 000

somatických buniek .ml-1. V USA je limitom hranica 750 000 somatických buniek . ml-1

(USDA, 2002).

Z pohľadu medzinárodného obchodu krajiny, ktoré sprísnili kritériá v oblasti

somatických buniek vyvážajú väčšie množstvo mlieka (Smith, 1996).

50

1.6 CHARAKTERISTIKA SOMATICKÝCH BUNIEK

Grieger a Holec et al. (1990) uvádzajú, že pri mikroskopickom vyšetrení sa v mlieku

nachádzajú okrem mikroorganizmov taktiež bunkové útvary, ktoré majú význam pre

posúdenie zdravotného stavu mliečnej žľazy a kvality mlieka.

1.6.1 Bunky pochádzajúce z krvi

Sekrečný parenchým mliečnej žľazy je čiastočne priepustný pre bunky krvi. Táto

priepustnosť sa zvyšuje za nenormálnych podmienok sekrécie mlieka (Grieger a Holec et al.,

1990).

1.6.1.1 Bunky bieleho krvného obrazu

Bunky bieleho krvného obrazu popisuje Kováčik et al. (1996). Obrázky bielych

krviniek sú uvedené v Prílohe 15.

Biele krvinky (leukocyty) všetkých živočíšnych skupín stavovcov majú jadro počas

celého svojho života. Ich počet sa mení v závislosti od fyziologického stavu organizmu.

Leukocyty putujú medzi miestom ich tvorby (kostná dreň, týmus, lymfatické uzliny)

a rôznymi tkanivami. Podľa veľkosti, tvaru jadra a schopnosti farbenia sa možno u leukocytov

rozlíšiť monocyty (makrofágy), lymfocyty (lymfocyty T, lymfocyty B, nešpecializované

lymfocyty) a granulocyty (eozinofily, neutrofily, bazofily).

Monocyty

Monocyty nachádzajúce sa v krvi sa tvoria v rozličných častiach

retikulohistiocytárneho systému. Sú to bunky veľké 15 – 20 µm, s obličkovitým alebo

laločnatým jadrom, excentricky uloženým. Cytoplazma je sfarbená dymovo modro. Z krvi

monocyty prenikajú do rozličných tkanív, kde potom ako makrofágy majú relatívne dlhú

životnosť (50 – 70 dní). Majú ameboidný pohyb. Aktivované monocyty, prípadne makrofágy

majú vysokú aktivitu fagocytózy a pinocytózy. Po prijatí väčších cudzích teliesok (baktérie,

zvyšky buniek) sa tvoria resorpčné vakuoly, do ktorých sa uvoľňujú enzýmy z lyzozómov.

Okrem toho obsahujú aktivátor plazminogénu, kolagénu, elastázu a enzým, ktorý odbúrava

fibrín. V krvi zvierat sa ich nachádza 2 – 6 % z celkového obsahu leukocytov.

51

Lymfocyty

Lymfocyty vznikajú hlavne v slezine a v lymfatických uzlinách. Sú veľké 6 – 18 µm,

vyznačujú sa veľkým, guľatým, modro zafarbeným jadrom, vypĺňajúcim takmer celú bielu

krvinku. Cytoplazmy je málo a je svetlo modrá. Ich životnosť je asi 1 deň. U lymfocytov

možno rozlíšiť lymfocyty T, lymfocyty B a nešpecializované lymfocyty.

Lymfocyty T majú dôležitú úlohu pri podpore lymfocytov B (ako pomocné bunky),

pri odbúraní a deštrukcii nádorových buniek a pri tvorbe bunkovej imunity. Jeden z typov

lymfocytov T tlmí ochranné reakcie. Pri zvýšenej aktivite týchto buniek je znížená schopnosť

deštrukcie nádorových buniek.

Lymfocyty B sa špecializujú na rozlišovanie antigénov (bakteriálnych a vírusových

antigénov). Pri kontakte s určitým antigénom sa zvyšuje skupina imunokompetentných

buniek (klon) v priebehu 7 – 8 generácií a potom sa menia na plazmatické bunky s vysokou

schopnosťou syntézy imunoglobulínov. Z celkového obsahu leukocytov v krvi zvierat tvoria

lymfocyty 40 – 60 % podiel.

Granulocyty

Granulocyty sú bunky, ktoré majú v mladom štádiu tyčinkové jadro, na ktorom sa

neskôr objavujú zúženiny. Jadro sa starnutím rozpadá na 2 – 5 častí (segmentované). Veľkosť

granulocytov je 10 – 20 µm. V cytoplazme granulocytov sa nachádzajú granuly, ktoré sú

farbiteľné rôznymi farbivami. Týmto spôsobom možno rozlíšiť eozinofilné, neutrofilné

a bazofilné granulocyty.

Eozinofily s veľkými granulami, ktoré sa eozínom farbia jasne červene. Eozinofily sa

dožívajú 6 – 7 dní a v krvi ich je 3 – 6 % z celkového počtu leukocytov. Ich počty sa zvyšujú

pri alergii, pri napadnutí niektorými parazitmi a pri niektorých kožných chorobách. Záťaže

organizmu vyvolávajú prechodné zníženie ich celkového počtu. Množstvo eozinofilov záleží

tiež na činnosti kôry nadobličiek. Injekcia adenokortikotropného (ACTH) hormónu

z adenohypofýzy vyvoláva vyplavenie kortikoidov z nadobličiek s následným poklesom

eozinofilov v periférii krvi.

Neutrofily majú polymorfné jadro a na fialovo sa farbiace granuly. Veľkosť

neutrofilov je 10 – 15 µm, životnosť 4 – 5 dní. Neutrofilné granulocyty sú ameboidne

pohyblivé a prenikajú v oblasti kapilár v určitom rozsahu do tkaniva. Vzhľadom k tomu,

že majú schopnosť prijímať baktérie a iné partikuly (napr. nadbytočné spermie v pohlavných

cestách samice), neutrofily sa označujú aj ako mikrofágy. Predstavujú „zdravotnú službu“,

v boji proti mikroorganizmom uplatňujú enzýmové systémy (proteolytické, lipolytické,

52

glykolytické), pomocou ktorých rozkladajú cudzorodé látky. Sú priťahované

mikroorganizmami na princípe pozitívnej chemotaxie. Lymfou sa transportujú do

regionálnych lymfatických uzlín a tam sú odbúravané makrofágmi. V krvi je 30 – 35 %

neutrofilných granulocytov z celkového počtu bielych krviniek.

Bazofily sú bunky veľkosti 6 – 18 µm, majú nečlenené jadro, ich granuly sa farbia

zásaditými farbivami na modro. V granulách sa zistil heparín, histamín, kyselina hyalurónová

a serotonín. Tieto látky sa uvoľňujú do zápalovej oblasti. V celkovom počte leukocytov je ich

asi 1 %.

Jadrá niektorých granulocytov, najmä neutrofilných, majú prívesky kyjakovitého tvaru

alebo tvaru púčika. Vyskytujú sa len u žien, preto sa zaraďujú medzi pohlavné chromatíny –

sexchromatíny. Majú význam pri určovaní spornosti pohlavia.

Nakoľko leukocyty predstavujú z funkčného i morfologického hľadiska rôznorodú

skupinu krvných elementov a celkový počet leukocytov nedáva obraz o zastúpení

jednotlivých druhov v periférnej krvi, k hematologickému vyšetreniu sa robí diferenciálny

krvný obraz (leukogram). Leukogram udáva percentuálne zastúpenie jednotlivých druhov

leukocytov.

Počet leukocytov je druhovo špecifický. U cicavcov sa pohybuje v rozmedzí

8 – 14 g / l. Pomer leukocytov k erytrocytom u cicavcov je 1 : 1000. Za istých okolností sa

počet leukocytov v krvi mení. Zvýšenie celkového počtu leukocytov sa nazýva leukocytóza

a pokles pod rozmedzie základných hodnôt leukopénia. Leukocytóza sa objavuje po prijatí

potravy, pri intenzívnej svalovej činnosti, pri emočných stavoch, pri bolesti a gravidite, pri

infekčných zápaloch či septických stavoch. Leukopénia vzniká napríklad pri hladovaní a pri

dlhodobom podchladení organizmu.

Granulocyty sa tvoria v kostnej dreni z vetvených buniek sieťovitého väziva,

uloženého medzi tukovými bunkami. V lymfatickom tkanive (lymfatické uzliny, slezina,

týmus, mandle) sa tvoria lymfocyty. Monocyty sa tvoria v retikulohistiocytárnom systéme.

Centrom nervového riadenia tvorby bielych krviniek (leukopoézy) je hypotalamus.

Krvotvorné orgány sú inervované vegetatívnou nervovou sústavou. Sympatikus stimuluje

tvorbu krvi a parasympatikus ju tlmí. Na humorálnej regulácii sa podieľa humorálny faktor

leukopoetín.

53

Grieger a Holec et al. (1990) uvádzajú, že leukocyty sú významné z diagnostického

hľadiska. Leukocyty sa menia vekom a ich pôvodne oválne jadro nadobúda fazuľový, neskôr

až tyčinkový tvar, je rôzne poprehýbané a pozorovateľná je i segmentácia jadra. Granulocyty

sú v mlieku najviac zastúpené. Podľa farbenia ich rozdeľujeme na neutrofilné, eozinofilné

a bazofilné.

Neutrofilné leukocyty sa zo všetkých typov leukocytov v mlieku vyskytujú

najčastejšie. Stretávame sa s nimi v štádiu segmentovaných jadier, spravidla sú segmentované

na 2 až 3 diely. U týchto buniek je vyvinutá fagocytárna schopnosť. Vo zvýšenom množstve

sa objavujú v období sekrécie mledziva a v starodojnom mlieku pred zasušením. Ich výskyt

v mlieku je vysoký pri ochorení mliečnej žľazy, najmä bakteriálneho pôvodu.

Eozinofilné leukocyty tvoria v mlieku zdravých dojníc iba nepatrnú časť celkového

bunkového obsahu.

Bazofilné leukocyty sú veľmi vzácne a v cytológii mlieka nemajú prakticky žiadny

význam.

Lymfocyty sa v mlieku vyskytujú v podobe malých lymfocytov (6-8 µm) a v podobe

veľkých lymfocytov (do 15 µm). Majú charakteristický okrúhly tvar jadra. V mlieku zdravých

dojníc sú najbohatšie zastúpenou zložkou bieleho krvného obrazu.

Monocyty sú podobné veľkým lymfocytom. Majú fazuľovité až podkovovité jadro

niekedy i laločnatého tvaru. Vyznačujú sa fagocytárnou schopnosťou. Sú charakteristické pre

mledzivo vo forme tzv. malých kolostrálnych teliesok (lipofágov).

1.6.1.2 Bunky červeného krvného obrazu

Môžu byť v mlieku zastúpené iba erytrocytmi. Erytrocyty pri príprave preparátu za

použitia bežných farbív nedajú zistiť. Dajú sa zafarbiť špeciálnymi metódami a zisťujeme ich

pri ťažkých formách zápalu mliečnej žľazy, pri poranení mliečnej žľazy, najmä pri poranení

strukových vývodov. Taktiež ich môžeme nájsť v mledzive (Grieger a Holec et al., 1990).

1.6.2 Bunky pochádzajúce z mliečnej žľazy

Grieger a Holec et al. (1990) ďalej uvádzajú, že dlaždicový vrstevnatý epitel sa

nachádza na koži na povrchu vemena, struku a strukových vývodov. Do mlieka prechádza

vplyvom dráždenia v priebehu dojenia. Pri dojení dochádza k mechanickému odlupovaniu

zrohovatených epitélií. Bunky dlaždicového vrstevnatého epitelu majú tvar oválnych alebo

54

polygonálne zvrásnených útvarov s príležitostne sa vyskytujúcimi fragmentmi jadier. Tieto

bunky nie sú príznakom chorobného stavu mliečnej žľazy. Nešetrný spôsob dojenia (najmä

ručného) môže byť príčinou väčšieho množstva týchto útvarov v mlieku.

Cylindrický epitel pochádza z mliečnych cisterien a väčších mliekovodov.

Je dvojvrstvový a jeho bunky sú oválne až obdĺžnikovité, s excentricky uloženým jadrom.

Bunky sa do mlieka dostávajú jednotlivo alebo v zhlukoch, nachádzajú sa aj v mlieku

zdravých dojníc. Väčší výskyt v podobe zhlukov sa vyskytuje pri mikrobiálnom alebo

mechanickom podráždení strukovej a žľazovej cisterny.

Epitelové bunky pochádzajú z drobných mliekovodov a sekrečných alveol. Majú

guľovitý, až mierne oválny tvar a dobre sa farbiace excentricky uložené jadro. Protoplazma

týchto buniek je pri laktácii vyplnená tukovými kvapôčkami. Bunky nadobúdajú penovitú

štruktúru a často narastajú do značných rozmerov. Takéto bunky sa potom označujú ako

bunky penové alebo veľké kolostrálne telieska. Tieto bunky sú krehké a pri získavaní

sedimentu sa často poškodia, takže v zafarbenom preparáte sa potom dajú pozorovať len ich

fragmenty. Tieto bunky sa nachádzajú v značnom množstve na začiatku laktácie, v zrelom

mlieku sa nachádzajú len zriedka.

Dominujúcim typom buniek v mlieku pri plnej laktácii sú makrofágy, v kolostrálnom

mlieku prevládajú polymorfonukleárne leukocyty.

1.6.3 Nebunkové útvary z mlieka

Mliečna plazma sa pri mikroskopovaní náteru mlieka javí ako homogénny alebo

jemne sieťovaný povlak. Jeho prítomnosť môžeme pravidelne zistiť pri vyšetrení mledziva,

v mlieku starodojných dojníc a niekedy i v mlieku dojníc postihnutých zápalom mliečnej

žľazy.

Kazeín sa pri mikroskopovaní dá pozorovať v podobe jemne vyzrážaných vločiek

a veľmi dobre sa dá pozorovať pri vyšetrovaní nakysnutého mlieka.

Mliečne konkrementy sú okrúhle útvary najrôznejších veľkostí (1-200 µm)

s intenzívne zafarbeným centrom. Niekedy je dobre viditeľné koncentrické vrstvenie. Tvoria

sa v lumene mliečnej žľazy okolo vločky zrazeného kazeínu alebo rozpadnutej bunky.

Konkrementy sa vyskytujú často v kolostrálnom mlieku a v starodojnom mlieku (Grieger

a Holec et al., 1990).

55

1.7 VŠEOBECNÝ VÝZNAM SKÚŠANIA SUROVÉHO KRAVSKÉHO MLIEKA

Hanuš et al. (2004) uvádzajú, že skúšanie surového mlieka je významné pre:

- bezpečnosť mliečneho potravinového reťazca,

- kontrolu a preplácanie kvality mlieka,

- spracovanie mlieka,

- šľachtenie dobytka,

- kontrolu zdravotného stavu dojníc.

Výhody skúšania vzoriek surového kravského mlieka:

- vzorku mlieka je možné odobrať neinvazívnym spôsobom a na rozdiel od ostatných

telových tekutín ako moč alebo krv je vzorkovanie oveľa jednoduchšie a efektívnejšie

pretože nehrozí riziko stresu zvieraťa alebo infekcie,

- pravidelné skúšanie vzoriek bazénového mlieka je výhodné pre kontrolu

kvalitatívnych ale aj hygienických ukazovateľov mlieka,

- pravidelné skúšanie vzoriek mlieka individuálnych dojníc je výhodné pre kontrolu

úžitkovosti a zdravia dojníc,

- analýzy sú často automatizované, rýchle a ekonomicky nenáročné,

- získané výsledky je možné štatisticky spracovať, porovnávať a interpretovať pre účely

hodnotenia kvality a zdravotného stavu dojníc,

- údaje ako dojivosť, zloženie mlieka (tuk, bielkoviny, močovina, počet somatických

buniek), poradie a štádium laktácie sa môžu použiť pre účely šľachtenia, pre kontrolu

výživy a zdravotného stavu dojníc.

Výsledky skúšania bazénových vzoriek mlieka dávajú obraz o úrovni zamorenia

mastitídami v chove. Výsledky vzoriek mlieka individuálnych dojníc alebo štvrťkových

vzoriek dávajú obraz o zdravotnom stave dojnice a môžu slúžiť k presnej identifikácii

bakteriálnych pôvodcov mastitíd a stanoveniu ich citlivosti na antibiotiká.

Získané výsledky umožňujú sofistikované manažovanie mastitídy a aplikáciu účinnej

liečby.

56

Vo vzorkách mlieka sa odporúča analyzovať rutinné parametre ako počet somatických

buniek, zloženie (obsah laktózy, bielkovín, tuku, beztukovej sušiny), teplotu tuhnutia mlieka,

hustotu, celkový počet mikroorganizmov a počet koliforných baktérií.

Špeciálne vyšetrenia vzoriek mlieka sú cielené na prítomnosť patogénnych

mikroorganizmov a overenie ich citlivosti na antibiotiká.

Z ďalších vyšetrení je možné vykonať stanovenie vodivosti (konduktivity), stanovenie

obsahu chloridov, stanovenie močoviny, stanovenie prítomnosti rezíduí inhibičných látok,

viskozimetrické stanovenie mastitídy pomocou rýchlych testov (California mastitis test, NK

test).

57

1.8 STANOVENIE SOMATICKÝCH BUNIEK V SUROVOM KRAVSKOM MLIEKU

Podľa International Committee for Animal Recording, Working Group on Milk

Testing Laboratories (ICAR, 2005), sa pre stanovenie počtu somatických buniek môžu

používať nasledovné metódy:

Analytické laboratórne metódy na stanovenie počtu somatických buniek Tabuľka 8

Medzinárodná – referenčná metóda

Mikroskopické stanovenie počtu somatických buniek

ISO 13366-1 (IDF 148) STN EN ISO 13366-1

Štandardizované rutinné metódy

Metóda elektronického počítania častíc (Coulter Counter)*

*Po ukončení revízie normy ISO 13366 (IDF 148) bude táto metóda zrušená.

ISO 13366-2 (IDF 148), STN EN ISO 13366-2 (bola zrušená)

Fluoro-opto-elektronická metóda (Rotačné disky) ISO 13366-3 (IDF 148), STN EN ISO 13366-3 AOAC 978.26

Fluoro-opto-elektronická metóda (Prietoková cytometria)**

**Po ukončení revízie normy ISO 13366 (IDF 148) bude súčasťou tejto normy.

ISO 13366 (IDF 148) STN EN ISO 13366-3

Rutinné inštrumentálne metódy používané v členských krajinách ICAR

Rátanie častíc Coultronic (UK) Coulter counter Fluoro-opto-elektronická metóda založená na diskovej cytometrii.

Foss Electric (DK) Fossomatic 90, 180, 215, 250, 360, 400

Anadis (F) Somatic Cell Counter 300, 500 Bentley (USA) Somacount 150, 300, 500 Chemunex (D) Partec CA 11 Delta Instruments (NL) Somascope MKII Manual MKII

Auto 200 MKII Auto 400

Fluoro-opto-elektronická metóda založená na prietokovej cytometrii.

Foss Electric (DK) Fossomatic 5000, CombiFoss 5000, CombiFoss 6000 FC

(ICAR 2005)

Podľa Nariadenia Komisie (ES) č. 1664/2006 zo 6. novembra 2006 , ktorým sa mení a

dopĺňa nariadenie (ES) č. 2074/2005, sa na stanovenie počtu somatických buniek musí použiť

referenčná metóda ISO 13366-1. Je prípustné použiť aj iné metódy ak sú validované

referenčnou metódou a ak sú v súlade s normou ISO 8196 a keď sa vykonávajú v súlade

s ISO 13366-2.

58

1.8.1 Stanovenie počtu somatických buniek rýchlymi metódami (testami)

Z rýchlych diagnostických metód sa pri zisťovaní mastitídy v praxi používajú tzv.

rýchle maštaľné testy. Niektoré z nich umožňujú nepriamo stanoviť počet somatických buniek

v mlieku. Medzi najčastejšie používané rýchle maštaľné testy patria: California mastitis test,

Wisconsin mastitis test, u nás NK-test a ďalšie komerčné testy (Foltys a Kirchnerová, 2003;

Rice, 1981).

Suarez et al. (2002) zisťovali závislosť medzi počtom somatických buniek

a výsledkami California mastitis testu v závislosti od infekčného stavu štvrtiek vemena

u oviec. Autori zistili dobrú koreláciu medzi výsledkami California mastitis testu a počtom

somatických buniek.

Rýchle diagnostické testy ako California mastitis test alebo Wisconsin mastitis test sú

veľmi užitočné, avšak získané výsledky sú len orientačné. Presné výsledky počtu somatických

buniek sa môžu získať len prostredníctvom laboratórnych diagnostických metód (Rajah,

1993).

1.8.1.1 Stanovenie počtu somatických buniek NK-testom

Kováč et al. (2001) popisujú použitie u nás najčastejšie používaného rýchleho testu na

stanoveni mastitídy, NK-testu. NK-test je modifikáciou Calirofnia mastitis testu.

Diagnostická reagencia je červený priesvitný roztok (100,0 cm3 povrchovo aktívnych látok –

alkylarylsulfonáty a 0,2 g fenolovej červene ad 1000,0 cm3 destilovanej vody) s upravenou

koncentráciou vodíkových iónov. Skúška sa robí na miskách umiestnených na palete určenej

na posudzovanie. Dva mililitre čerstvo nadojeného mlieka sa zmiešajú s 2 ml diagnostickej

reagencie a pri nakláňaní palety sa posudzuje reakcia, ktorá prebehne spravidla do 30 sekúnd.

Pozitívna reakcia sa prejavuje výraznou tvorbou vločiek a zmenou konzistencie vo forme

gelifikácie až koagulácie. Pôsobenie rozdielneho pH na farebný indikátor zapríčiňuje súčasne

farebnú reakciu.

Posúdenie výslednej reakcie NK-testu:

Zmeny v konzistencii sú dôležitejšie ako zmeny farebné. Mlieko sa posúdi najskôr bez

pridania reagencie. Naklonením palety o 45° sa upraví množstvo mlieka po označenie (t.j.

59

2 ml). Potom sa pridá rovnaké množstvo reagencie pre NK-test. Kruhovým pohybom sa

mlieko s diagnostickou reagenciou zmieša a posúdi sa výsledná reakcia.

a; negatívna reakcia: mlieko nemení konzistenciu ani sfarbenie, približný počet somatických

buniek je od 0 – 200 000 . ml-1.

b; dubiózna reakcia: mierne zahustenie až vytvorenie sa slizu, na dne misky sa po čase vytvorí

jemný zvlnený film, ktorý svojím ružovkastým sfarbením poukazuje na približný obsah

150 000 – 500 000 ( v priemere 360 000) somatických buniek . ml-1 mlieka.

c; pozitívna reakcia, +1: hlienovitá konzistencia najmä v strede misky, pri naklonení sa táto

pohybuje, závojový film na dne misky a červenkasté sfarbenie reakcie poukazuje na mlieko

s obsahom 400 000 – 1 000 000 (v priemere 660 000) somatických buniek . ml-1 mlieka.

d; silne pozitívna reakcia, +2: hustá hlienovitá až rôsolovitá konzistencia, zmes vytvára

zhluky vo forme vločiek a je červenej farby, poukazuje na približný obsah 800 000 –

5 000 000 (v priemere 1 600 000) somatických buniek . ml-1 mlieka.

e; veľmi silne pozitívna reakcia, +3: pri hladine zmesi červenej farby sa vytvára reliéf (súvislá

vrstva zmesi), približný obsah somatických buniek je viac ako 5 000 000 (v priemere

7 500 000) . ml-1 mlieka.

1.8.1.2 Stanovenie počtu somatických buniek California mastitis testom

California mastitis test je rýchly test pre orientačné stanovenie počtu somatických

buniek v mlieku. Test reaguje predovšetkým s neutrofilnými leukocytmi prítomnými

v mlieku. Čím intenzívnejšia je reakcia, tým je v mlieku väčší počet somatických buniek.

Skúška sa robí na miskách umiestnených na palete. Testovacia paleta pozostáva zo štyroch

častí označených písmenami A, B, C, D určených pre každú štvrťku vemena. Pomocou testu

sa môže určovať približný počet somatických buniek v bazénovom mlieku.

Postup skúšky je nasledovný: testovacia paleta sa naplní malým množstvom mlieka

z každej štvrťky. K mlieku sa pridá rovnaké množstvo reagencie California mastitis testu.

Otočným pohybom testovacej palety sa premieša mlieko s reagenciou. Po desiatich sekundách

60

sa odčíta výsledok reakcie, za súčasného miešania pretože reakcia trvá iba 20 sekúnd.

Výsledok sa musí odčítať veľmi rýchlo.

Vyhodnocovanie výsledkov reakcie: reagencia California mastitis testu reaguje

s neutrofilnými leukocytmi a dochádza k zahusťovaniu až gelovateniu zmesi. Intenzita

reakcie závisí od počtu prítomných somatických buniek.

a; negatívna reakcia: mlieko nemení konzistenciu, priemerný počet somatických buniek je

100 000 . ml-1.

b; náznak mastitídy: mierne zhustnutie, reakcia sa stratí po desiatich sekundách, priemerný

počet somatických buniek je 300 000 . ml-1.

c; pozitívna reakcia, stupeň 1: zreteľné zhustnutie, gél sa netvorí, priemerný počet

somatických buniek je 900 000 . ml-1.

d; pozitívna reakcia, stupeň 2: okamžité zhustnutie, tvorba gélu na dne misky, priemerný

počet somatických buniek je 2 700 000 . ml-1.

e; pozitívna reakcia, stupeň 3: z celej zmesi sa vytvoril gél, povrch gélu je vyvýšený, v strede

sa nachádza zreteľný pík, priemerný počet somatických buniek je 8 100 000 . ml-1 (Rice,

1981; www.infovets.com).

1.8.2 Laboratórne metódy, prevádzkové metódy

1.8.2.1 Stanovenie počtu somatických buniek cytometriou tuhou fázou

D'Haese et al. (2001) vo svojej práci skúmali potenciál cytometrie tuhou fázou pri

stanovení počtu somatických buniek. Táto metóda kombinuje aspekty fluoro-opto-

elektronickej metódy a epifluorescenčnej mikroskopie. V prípade cytometrie tuhou fázou

dochádza k zachyteniu somatických buniek na membránovom filtri, označeniu somatických

buniek fluorescenčnou látkou a k následnej detekcii celého membránového filtra pomocou

laserového skenovacieho prístroja ChemScan. Fluoreskujúce body sa môžu vizuálne preveriť

pomocou epifluorescenčného mikroskopu s počítačom riadeným stolom. Táto metóda bola

porovnaná s fluoro-opto-elektronickou metódou (Fossomatic 360). Vypočítaná

61

opakovateľnosť bola horšia než pri stanovení prístrojom Fossomatic 360. Hlavným

problémom tejto metódy je filtrácia mlieka a narušenie fluorescenčných častíc. Kvôli týmto

problémom sa táto metóda v súčasnosti nedá rutinne používať pri zisťovaní počtu


1.8.2.2 Stanovenie počtu somatických buniek NIR spektroskopiou

Tsenkova et al. (2001) skúmali potenciál metódy NIR v oblasti 1,100 až 2,500 nm pri

zisťovaní počtu somatických buniek v kravskom mlieku. Vypočítaná presnosť metódy

naznačila možnosť aplikácie metódy pri skríningu zdravotného stavu dojníc. Stanovenie počtu

somatických buniek metódou NIR sa zakladá na zmenách v zložení mlieka a rozlíšení

zdravého mlieka od mastitídneho. Medzi veľmi významné faktory ovplyvňujúce NIR

spektrum patria zmena obsahu bielkovín a zmena koncentrácie iónov v mastitídnom mlieku.

Autori v závere práce konštatujú, že je ešte nutné vykonať ďalšie pozorovania a pokusy

s mliekom iných druhov hospodársky významných prežúvavcov.

1.8.2.3 Stanovenie počtu somatických buniek video mikroskopiou

Baro et al. (2005) publikovali metódu video mikroskopie pre stanovenie počtu

somatických buniek v kravskom mlieku a porovnali ju s referenčnou mikroskopickou

metódou a prevádzkovou metódou (Fossomatic). Autori uvádzajú, že mikroskopické

preparáty boli pripravené podľa postupu uvedeného v norme IDF 148. Mikroskopovanie sa

uskutočnilo na bežnom mikroskope s CCD kamerou umiestnenou na okulári. Pri snímaní

obrázkov bol použitý objektív so 40 x zväčšením. Mikroskop bol vybavený automatickým

posuvným stolom. Obrazový výstup z mikroskopu bol spracovaný v počítači s nainštalovanou

video kartou. Spracovanie získaných obrázkov sa vykonalo prostredníctvom softvéru. Postup

spracovania obrázkov bol nasledovný: upravila sa intenzita šedej farby (zblednutie pozadia),

boli vylúčené častice ležiace v blízkosti hraníc zorného poľa (zabránenie viacnásobného

počítania buniek), vyfiltrovali sa častice s veľkosťou somatickej bunky, vyfiltrovali sa častice

s nevhodným tvarom, spočítali sa zostávajúce častice. Počet somatických buniek sa vypočítal

vynásobením zisteného počtu častíc s faktorom mikroskopu. Najlepšie výsledky sa dosahovali

pri počte somatických buniek 100 až 1000 buniek v 1 µl. Pri počte nad 1000 µl boli výsledky

stanovené referenčnou mikroskopickou metódou vyššie v porovnaní s výsledkami video

mikroskopie. Relatívny rozdiel medzi oboma metódami je približne 5 % pri hladine 100 až

62

1000 somatických buniek v 1 µl a na vyššej hladine neprekračuje 10 %. Rozdiel nebol

ovplyvnený počtom spracovaných obrázkov v jednej vzorke. Výsledky referenčnej

mikroskopickej metódy a video mikroskopie boli nepatrne nižšie v porovnaní s výsledkami

stanovenými na prístroji Fossomatic.

1.8.2.4 Stanovenie počtu somatických buniek prietokovou cytometriou (prístrojom

Fossomatic)

Operátorský manuál firmy Foss Electric (Foss Electric, 2000) obsahuje technické

údaje o prístroji Fossomatic.

Princíp stanovenia prístrojom je založený na zafarbení somatických buniek, ktoré sú

následne elektronicky počítané.

Prietoková cytometria je založená na princípe priechodu veľmi malého množstva

vzorky pod počítacou jednotkou prístroja. Úzky pramienok vzorky prechádza pod počítaciu

jednotku pomocou kvapaliny, ktorá vytvorí veľmi tenký, ale dobre analyzovateľný pramienok

vzorky. Vytvorenie tenkého pramienku vzorky sa dosahuje zmenšením priemeru prietoku

v kyvete a vysokým tlakom, ktorým je vzorka hnaná cez prietokovú kyvetu. Rozmer

pramienka vzorky dovoľuje v rovnakom čase prejsť iba jednej somatickej bunke.

Potom, čo sa vzorka zafarbí fluorescenčnou látkou (fluorescenčná látka zafarbí

predovšetkým molekuly DNA, čím presne špecifikuje iba somatické bunky) je vystavená

v kyvete modrému svetlu o vlnovej dĺžke 450 nm. Modré svetlo dopadá na zafarbené bunky

a spôsobí odraz červeného svetla z buniek. Červené svetlo sa zosilňuje pomocou

fotozosilňovača a následne sa počíta ako svetelné impulzy.

Popis prietokového systému prístroja Fossomatic:

Prietok cez prístroj Fossomatic 5000 je nasledovný:

1. Prístroj nasaje vzorku mlieka.

2. V rovnakom čase vzorková dávkovacia jednotka nasaje čistiaci roztok.

3. V rovnakom čase farbiaca dávkovacia jednotka nasaje farbivo. Zmiešavacia komôrka

sa plní koncentrovaným farbivom zo zásobníka a riediacim roztokom z vonkajšieho

riediaceho zásobníka v pomere 1 : 9.

4. Mlieko a farbivo sa zmiešavajú a tlačia sa cez vstavaný filter. Prvá časť zmesi prejde

priamo do vysoko koncentrovaného odpadu.

63

5. Meracia dávkovacia jednotka sa naplní čistiacim roztokom.

6. Meracia dávkovacia jednotka vstrekne zmes mlieka s farbivom do prietokovej kyvety,

v ktorej stálou rýchlosťou preteká unášacia kvapalina. V prietokovej kyvete sa vytvorí

tenký pramienok zmesi mlieka s farbivom a unášacej kvapaliny zúžením priemeru

prietoku. Tenký pramienok sa následne analyzuje.

7. Impulzy zo zafarbených somatických buniek sa zosilnia, spočítajú a prepočítajú sa na

počet somatických buniek . ml-1.

8. Pred každou meranou vzorkou sa všetky hadičky prístroja automaticky vyčistia

a vstavaný filter sa spätne prepláchne. Odpad sa rozdelí na vysoko a nízko

koncentrovaný.

Technické údaje k prístroju Fossomatic 5000

Tabuľka 9 Rýchlosť merania: 400 vzoriek za hodinu pri meraní štandardných mliečnych

vzoriek

Rozsah merania: do 10 000 000 somatických buniek

Množstvo vzorky: 2,5 ml (programovateľné 2 – 5 ml)

Teplota vzorky: 30 – 42 °C

Opakovateľnosť metódy

pri štandardnom

nastavení:

Cv < 4 % do 500 000 buniek

Cv < 5 % do 300 000 buniek

Cv < 7 % do 100 000 buniek

Opakovateľnosť metódy

pri zvláštnom

nastavení:

Cv < 2 % do 500 000 buniek

Cv < 2,5 % do 300 000 buniek

Cv < 3,5 % do 100 000 buniek

Správnosť: lepšie než 10 % v rozpätí 100 000 - 1 500 000 buniek.ml-1

Korelácia: 0,96 – 0,99

Pracovný faktor: 300 alebo lepší

Prenosová chyba: Nekompenzovaná: pod 1 %, typicky 0,4 %

S automatickou kompenzáciou: zanedbateľná

Poznámka: Cv – variačný koeficient

(Foss Electric, 2000)

64

1.8.2.5 Stanovenie počtu somatických buniek diskovou cytometriou (prístrojom

FOSSOMATIC 90)

Mlieko určené na skúšanie sa zmieša s tlmivým a farbiacim roztokom. Zmes sa

nanesie vo forme tenkého filmu na rotujúci disk, ktorý slúži ako podložné sklíčko

mikroskopu. Každá zafarbená bunka zaznamenaná mikroskopom dáva elektrický impulz,

ktorý sa zosilňuje a registruje. Počet somatických buniek sa odčíta priamo v tisícoch . ml-1

(STN EN ISO 13366-3).

1.8.2.6 Stanovenie počtu somatických buniek metódou elektronického počítania častíc

(COULTER COUNTER)

Somatické bunky nachádzajúce sa vo vzorke, ktorá sa má skúšať, sa fixujú prídavkom

formaldehydu (formalínu). Vzorka a zriedi emulgačnou elektronickou zmesou a zahreje sa,

čím sa rozrušia tukové guľôčky, ktoré prekrývajú oblasť veľkosti somatických buniek. Počet

somatických buniek sa priamo odčíta v tisícoch . ml-1.

Mlieko prechádza v prístroji na elektronické počítanie častíc nastavenou štrbinou

medzi elektródami. Ak touto štrbinou prechádza častica, vytlačí sa jej vlastným objemom

vysoko vodivá kvapalina a nahradí sa objemom kvapaliny s nižšou vodivosťou. Zosilnený

odpor zvýši napätie, čím sa vytvorí impulz napätia úmerný objemu častice. Počet impulzov

udáva počet častíc, ktoré prešli štrbinou. Počítajú sa iba impulzy nad nastavenou prahovou

hodnotou (STN EN ISO 13366-2, 2001).

Táto metóda sa už v praxi takmer vôbec nepoužíva a bola vyradená z revízie normy

ISO 13366.

1.8.3 Referenčná metóda stanovenia počtu somatických buniek

Referenčnou metódou je mikroskopické stanovenie počtu somatických buniek.

Vzorka mlieka sa nanesie na podložné sklíčko tak, aby vznikol tenký film. Film sa

vysuší, zafarbí a nasleduje mikroskopické počítanie zafarbených buniek. Spočítaný počet

buniek na definovanej ploche sa násobí pracovným faktorom a tak sa získa počet buniek

v 1 ml (STN EN ISO 13366-1, 2001).

65

Pracovný postup:

Z pripravenej analytickej vzorky sa mikrodávkovačom odoberie 0,01 ml. Vzorka sa

nanesie na podložné sklíčko tak aby sa vytvorila plocha 20 mm x 5 mm. Náter sa vysuší pri

laboratórnej teplote niekoľko hodín. Podložné sklíčko so suchým náterom filmu sa na 10

minút ponorí do farbiaceho roztoku. Po zafarbení sa náter filmu vystaví prúdu vody, kým sa

prebytočné farbivo nevymyje. Náter sa znova suší a uchováva sa chránený pred prachom až

do mikroskopovania. Pod mikroskopom sa v nátere spočítajú bunkové jadrá. Bunkové jadrá

musia byť zreteľne rozoznateľné a v mikroskopickom poli musí byť z jadra viditeľná

najmenej polovica. Celkový počet buniek v mililitri sa vypočíta vynásobením počtu

spočítaných somatických buniek pracovným faktorom mikroskopu (STN EN ISO 13366-1,

2001).

Referenčná metóda je podrobne popísaná v experimentálnej časti tejto práce.

1.8.4 Metódy na diferenciáciu somatických buniek

Pillai et al. (2001) skúmali možnosť využitia metódy diferenciácie somatických

buniek. Autori uvádzajú že diferenciácia somatických buniek má svoje opodstatnenie, pretože

zastúpenie jednotlivých typov somatických buniek v mlieku sa mení v závislosti od

zdravotného stavu vemena. V mlieku nadojenom zo zdravého vemena je nasledovné

zastúpenie somatických buniek: 60 % tvoria makrofágy, 28 % lymfocyty a od 2 % do 5 %

PMN. V mastitídnom mlieku je percentuálny podiel PMN podstatne vyšší a dosahuje úroveň

90 %.

Pillai et al. (2001) ďalej popisujú metódu diferenciálneho počítania zápalových

buniek (DICC). DICC je metóda založená na prietokovej cytometrii a farbení somatických

buniek kombináciou dvoch fluorescenčných farbív viažucich sa na DNA. Pomocou tejto

metódy je možné identifikovať jednotlivé typy zápalových buniek prítomných v mlieku. Ako

farbivá sa používajú SYBR green 1 a propidium jodid. Počas farbenia sa farbia iba bunky

obsahujúce jadro. Zafarbené mŕtve bunky po osvietení laserovým lúčom špecifickej vlnovej

dĺžky fluoreskujú na červeno a živé bunky na zeleno.

Jednotlivé typy živých buniek je možné identifikovať na základe rozdielnej vlnovej

dĺžky a intenzity fluorescencie produkovanej po osvietení laserovým lúčom. Bunky

66

prechádzajúce cez meraciu oblasť sú osvietené laserovým lúčom. Bunky zafarbené

fluorescenčnou látkou generujú fluorescenčné svetlo. Rozdielne fluorescenčné látky

produkujú fluorescenčné svetlo rozdielnej vlnovej dĺžky. Fluorescenčné svetlo je následne

zachytávané sériou optických zariadení, deteguje sa jeho vlnová dĺžka a detektor nazývaný

fotozosilňovacia trubica ho transformuje na elektrické impulzy, ktoré sú následne

elektronicky konvertované a zaslané do počítača na spracovanie. Veľkosť a denzita buniek sa

môže zistiť z odklonu laserového lúča. Laserový lúč dopadajúci na bunku sa odkloní smerom

dopredu. Stupeň odklonu sa analyzuje detektorom. Stupeň odklonu je priamo úmerný

priemeru bunky, ktorý reprezentuje veľkosť analyzovanej bunky alebo populácie buniek.

Dopadajúci laserový lúč sa môže odkloniť aj smerom do pravej strany. Odklon do pravej

strany závisí od prítomnosti granúl alebo organel vo vnútri bunky. Čím hustejšia je bunka,

tým je väčší uhol odklonu laserového lúča do pravej strany. Na základe tohto odklonu je

možné stanoviť relatívnu denzitu bunky alebo populácie buniek. Získané dáta je možné

znázorniť na dot-plot diagrame a analyzovať pomocou software. (www.iupui.edu, 2005).

Mononukleotidy (mononukleárne leukocyty) a PMN majú rozdielne optické vlastnosti

na základe ktorých je možná ich jednoznačná identifikácia a rozlíšenie.

Zo získaných výsledkov vyplýva, že existuje výrazná pozitívna korelácia medzi

celkovým počtom somatických buniek stanoveným konvenčným elektronickým spôsobom

počítania a počtami mononukleotidov a PMN stanovenými metódou DICC.

Vo vzorkách mlieka s vysokým počtom somatických buniek je možné pomocou

metódy DICC stanoviť percentuálny podiel PMN a tak exaktne potvrdiť prítomnosť zápalu

v štvrťke vemena. Mlieko pochádzajúce zo štvrtiek so zvýšeným percentuálnym podielom

PMN sa následne môže podrobiť bakteriologickej analýze, ktorou sa získajú podklady pre

indikáciu liečebných postupov (Pillai et al. 2001).

Dosogne et al. (2003) vyvinuli metódu dieferenciácie somatických buniek pomocou

prietokovej cytometrie v mlieku s nízkym počtom somatických buniek. Cieľom ich štúdie

bolo vyvinúť metódu s minimálnym vplyvom na morfológiu bunky.

Pracovný postup pozostával zo zriedenia vzorky mlieka s 30 % fosfátovým tlmivým

roztokom, odstreďovania, farbenia DNA leukocytov pomocou farbiva SYTO 13 a analýzy

prietokovou cytometriou.

Výsledky boli nanesené na „dot-plot“ bodový diagram. Jednotlivé typy somatických

buniek fluoreskovali inou intenzitou. V oblasti zelenej fluorescencie 530 nm boli jasne

67

identifikované štyri hlavné skupiny leukocytov: lymfocyty, monocyty, polymorfonuklerárne

neutrofily, zrelé makrofágy, ďalej boli identifikované bunky s apoptickými znakmi

v dôsledku kondenzácie chromatínu a fragmentácie jadra.

Metódami diferenciácie leukocytov prietokovou cytometriou vo vzorkách kravského

mlieka sa zaoberalo viacero autorov (Hageltorn a Saad, 1986; Östensson et al., 1988;

Redelman et al., 1988; Saad a Östensson et al., 1990, Rivas et al., 2002). Tieto metódy boli

vyvinuté predovšetkým pre vzorky mlieka s vysokým obsahom somatických buniek.

68

1.9 BEZPEČNOSTNÁ SMERNICA PRE PRÁCU S ETÍDIUM BROMIDOM

1.9.1 Charakteristika etídium bromidu

Etídium bromid (EtBr) je silný mutagén, ktorý sa používa na farbenie nukleových

kyselín. Zafarbený materiál fluoreskuje pod ultrafialovým svetlom červeno oranžovým

svetlom. Intenzita fluorescencie sa zvyšuje v prípade dvojitej závitnice DNA. Etídium bromid

sa obvykle distribuuje v práškovej forme alebo ako roztok. Etídium bromid sa rozpúšťa vo

vode. Kryštalická alebo prášková forma je sfarbená na tmavo červeno (Ethidium Bromid

Safety, 1999).

Bežne používané názvy a chemické vzorce etídium bromidu sú uvedené v Tabuľke 10.

Bežne používané názvy a chemické vzorce etídium bromidu

Tabuľka 10

Bežné názvy etídium bromidu:

2,7-Diamino-10-ethyl-9-phenylphenanthridinium Bromide

3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylpehnanthridinium Bromide

2,7-Diamino-9-phenyl-10ethylphenanthridinium Bromide

2,7-Diamino-9-phenylphenanthridine Ethobromide

Dromilac

Homidium Bromide

Vzorec: C21H20BrN3

Štrukturálny vzorec: [(C4H3NH2)2C6H5C5N+CH2CH3]Br –

(Standard Operating Procedure Ethidium Bromide, 1999).

1.9.2 Škodlivé účinky na ľudský organizmus

Prášková forma dráždi horné dýchacie cesty, oči a pokožku. Etídium bromid je silný

mutagén spôsobujúci mutácie živých buniek. Aj napriek tomu, že sa v súčasnosti neeviduje

žiadny prípad karcinogenity a teratogenity u ľudí, etídium bromid sa považuje za potenciálny

karcinogén a teratogén (Ethidium Bromid Safety, 1999).

69

1.9.3 Spôsoby preniknutia do ľudského organizmu

a; inhalácia: pri práci s práškovou formou etídium bromidu, operáciách pri ktorých existuje

možnosť vzniku etídium bromidového prachu alebo aerosólov z etídium bromidového

roztoku,

b; absorbcia: pri kontakte s nechránenou pokožkou sa môže absorbovať cez pokožku.

c; ingescia: požitím,

d; inokulácia: pri vpichnutí použitej ihly mikrostriekačky do pokožky počas roztierania

vzorky na podložné sklíčko (Standard Operating Procedure Ethidium Bromide, 1999).

1.9.4 Fyzikálne nebezpečenstvo asociované s chemikáliou

a; korózne vlastnosti: má leptavé účinky na materiály,

b; horľavosť: etídium bromid nepredstavuje nebezpečenstvo – nie je horľavinou,

c; reaktivita: etídium bromid reaguje s bielidlami, čistiacimi a dezinfekčnými prostriedkami

s obsahom chlóru (Standard Operating Procedure Ethidium Bromide, 1999).

1.9.5 Určené oblasti používania

Miestnosti kde sa pracuje s etídium bromidom musia byť náležite označené.

Laboratórne dvere: „Toxické chemikálie. Neoprávneným vstup zakázaný“.

Digestor: „Etídium bromid. Nebezpečenstvo – silný mutagén“ (Standard Operating

Procedure Ethidium Bromide, 1999).

1.9.6 Autorizované osoby

Laboratórium pracujúce s etídium bromidom musí viesť zoznam autorizovaných osôb

určených na prácu s etídium bromidom. Laboratórium musí viesť evidenciu vykonávania

tréningu a školenia personálu (Standard Operating Procedure Ethidium Bromide, 1999).

70

1.9.7 Požiadavky na tréning personálu

Tréning personálu pozostáva z preskúšania zo smernice určenej na prácu s etídium

bromidom, bezpečnostných predpisov dodávaných spolu s chemikáliou, s oboznámením sa

zamestnancov s pracovným postupom pri práci so zvlášť nebezpečnými chemikáliami

a z vysvetlenia bežnej laboratórnej praxe (Standard Operating Procedure Ethidium

Bromide, 1999).

1.9.8 Uskladnenie a požiadavky na manipuláciu

Etídium bromid sa skladuje na chladnom, suchom mieste mimo dosahu silných

oxidačných zlúčenín. Nádoby v ktorých je uskladnený musia byť tesne uzatvorené.

Pri manipulácii s práškovou formou sa musí zabrániť tvorbe prachu (Standard Operating

Procedure Ethidium Bromide, 1999).

1.9.9 Technické požiadavky

S etídium bromidom sa pracuje v digestore. V blízkosti pracoviska by sa mali

nachádzať bezpečnostné sprchy a k dispozícii by mala byť možnosť umytia očí v prípade

nehody (Standard Operating Procedure Ethidium Bromide, 1999).

1.9.10 Osobná ochrana

Nosenie laboratórneho plášťa, ochranných okuliarov (štítu) a rukavíc sa považuje za

samozrejmosť pri práci s etídium bromidom. Po ukončení práce sa pracovný plášť, rukavice

a ďalšie ochranné pomôcky musia nechať v laboratóriu, zamedzí sa tým kontaminácii ďalších

priestorov a pracovníkov. Pri práci sa preferuje používanie jednorazových ochranných

pracovných pomôcok.

V prípade, že sa pri práci používa ultrafialové svetlo, musia sa dodržiavať ďalšie

ochranné opatrenia. Nechránená pokožka a oči sa musia chrániť pred UV svetlom. Ak UV

svetlo svieti smerom nahor od zdroja, tvár sa musí chrániť UV ochranným štítom. V prípade

dlhšej práce v blízkosti zdroja UV svetla sa musí pracovať v laboratórnom plášti, ktorého

rukávy sú pevne obvinuté okolo zápästia tak aby nebolo vidieť nechránenú pokožku medzi

plášťom a ochrannými rukavicami. Ak sa pri práci používa zdroj UV svetla nízkej intenzity,

71

je možné niektoré odporúčané ochranné opatrenia vynechať. K takémuto kroku sa môže

siahnuť až potom ako sa overí či je intenzita žiarenia pod úrovňou maximálneho expozičného

limitu (Ethidium Bromid Safety, 1999).

1.9.11 Pokyny pre prácu s etídium bromidom

Pri práci s etídium bromidom sa musí minimalizovať jeho rozlievanie. Ak je to možné

namiesto vlastného pripravovania zásobných roztokov je vhodné používať zásobné roztoky

dodávané distribučnými firmami. Príprava vlastných pracovných roztokov sa musí vykonávať

v digestore. Pri práci s práškovou formou etídium bromidu sa pracuje v digestore

a s ochranným rúškom, aby nedošlo k inhalácii prachových častíc. Prenášať sa smú len

menšie objemy roztoku v zásobných fliaš odolných voči rozbitiu alebo v nádobách

umiestnených do druhého obalu (Ethidium Bromid Safety, 1999).

1.9.12 Prvá pomoc

V prípade kontaktu s očami sa oči vypláchnu prúdom vody počas 15 minút. V prípade

kontaktu s pokožkou, sa zasiahnutá pokožka ihneď umyje mydlom a opláchne sa dostatočným

množstvom vody. V prípade inhalácie sa postihnutý vyvedie na čerstvý vzduch.

Bezprostredne sa kontaktuje lekár (Dawson, 1996).

1.9.13 Likvidácia rozliateho roztoku etídium bromidu

Rozliatie roztoku etídium bromidu sa oznámi spolupracovníkom. Miesto rozliatia sa

zabezpečí pred vstupom neoprávnených pracovníkov. Pred likvidáciou rozliateho roztoku sa

vypnú všetky elektrické zariadenia. Vykoná sa čistenie a dekontaminácia zasiahnutého

miesta. Pri likvidácii rozliateho roztoku etídium bromidu sa pracuje v ochrannom pracovnom

odeve. Rozliaty roztok by sa mal poutierať absorbentom (papierové utierky).

Na dekontamináciu sa použije mydlo, voda a dekontaminačný roztok. Pri umývaní rozliateho

miesta sa musí zabrániť tvorbe nadmerného prachu. Použité čistiace pomôcky sa zabalia do

igelitového vreca. Vrece sa umiestni do kontajnera určeného pre likvidáciu nebezpečného

odpadu. Vyplní sa formulár evidencie zvlášť nebezpečného odpadu (Dawson, 1996).

72

1.9.14 Likvidácia nebezpečného odpadu (starých pracovných roztokov)

Kvapalný odpad obsahujúci etídium bromid sa môže spracovať dvoma spôsobmi:

1; deaktiváciou pomocou špeciálnych komerčne dostupných filtrov

2; chemickou deaktiváciou pomocou dekontaminačných roztokov

Z uvedených spôsobov deaktivácie je vhodnejšie použiť prvý spôsob. Filtrácia roztoku

etídium bromidu je ľahšia a bezpečnejšia než chemická dekontaminácia pomocou roztokov.

Deaktivácia pomocou filtrov je založená na výmene iónov. Aktívne uhlie a živica

odstraňujú ióny etídium bromidu z roztoku. Použité filtre by sa mali umiestniť do kontajnera

určeného na likvidáciu nebezpečného odpadu. Vzniknutý filtrát sa môže vyliať do

kanalizačného odpadu. Vylievanie filtrátu do kanalizácie by sa malo zaznamenávať (Dawson,

1996).

1.9.15 Deaktivácia roztokov Etídium Bromidu

Na deaktiváciu roztokov etídium bromidu sa môže použiť viacero pracovných

postupov. (Lunn a Sansone, 1987) uvádzajú deaktiváciu pomocou kyseliny fosforečnej

a dusitanu sodného a v prípade roztoku s nízkou koncentráciou etídium bromidu pomocou

Amberlitu XAd-1 (Quillardet a Hofnung, 1988) pomocou kyseliny chlorovodíkovej

a manganistanu draselného, (Bensaude, 1988) pomocou práškového aktivovaného uhlia,

(Lunn a Sansone, 1989) uvádzajú dekontaminačný postup v prípade rozliatia roztoku etídium

bromidu.

Pre daktiváciu roztokov etídium bromidu odporúčame kvôli lepšej manipulácii použiť

metódu podľa (Lunn a Sansone, 1987) alebo (Quillardet a Hofnung, 1988), ktoré sú

popísané nižšie.

Metóda 1 (Lunn a Sansone, 1987)

1. Pomocou vody sa zriedi koncentrácia etídium bromidu na 0,5 mg.ml-1 alebo menej.

Pracuje sa v ochrannom pracovnom odeve.

73

2. Na každých 100 ml roztoku etídium bromidu sa pridá 20 ml čerstvo pripravenej 5 %

kyseliny fosforečnej a 12 ml čerstvo pripraveného 0,5 M roztoku dusitanu sodného.

Zmes sa dôkladne premieša.

Dôležité upozornenie: Musí sa overiť či je pH zmesi nižšie ako 3,0.

Kyselina fosforečná sa obyčajne dodáva koncentrovaná 50 %-ná. Koncentrovaná

kyselina fosforečná má leptavé účinky, z tohto dôvodu sa pri práci musia používať ochranné

pomôcky. Na dekontamináciu by sa mal používať čerstvo pripravený roztok. Roztok sa

pripraví nasledovne: prenesie sa 10 ml koncentrovanej kyseliny fosforečnej do 90 ml

destilovanej vody a premieša sa. Roztok sa pripravuje v digestore a v ochrannom pracovnom

odeve. Roztok dusitanu sodného o koncentrácii 0,5 M by sa mal pripraviť až pred použitím

nasledovným postupom: rozpustí sa 3,45 g dusitanu sodného vo vode a doplní sa destilovanou

vodou po objem 100 ml. Roztok sa pripravuje v digestore a v ochrannom pracovnom odeve.

3. Roztoky sa nechajú pôsobiť počas 24 hodín pri izbovej teplote.

4. Pomocou sódy bikarbóny sa upraví pH roztoku na úroveň medzi 5 až 9.

Metóda 2 (Quillardet a Hofnung, 1988)

1. Pomocou destilovanej vody sa zriedi koncentrácia etídium bromidu na 0,5 mg.ml-1

alebo menej. Pracujte v ochrannom pracovnom odeve.

2. Na každých 100 ml roztoku etídium bromidu sa pridá 100 ml 0,5 N roztoku

manganistanu draselného. Následne sa pridá 100 ml 2,5 M kyseliny chlorovodíkovej.

Zmes sa dôkladne premieša a nechá sa stáť počas niekoľkých hodín pri izbovej

teplote.

Príprava 0,5 M roztoku manganistanu draselného: rozpustí sa 7,9 g manganistanu draselného

vo vode a doplní sa vodou na objem 100 ml.

Príprava 2,5 N roztoku kyseliny chlorovodíkovej: pridá sa 20,7 ml koncentrovanej kyseliny

chlorovodíkovej do vody a doplní sa na objem 100 ml.

74

3. Pomocou 2,5 N roztoku hydroxidu sodného sa upraví pH na úroveň medzi 5 a 9, pH sa

upraví orientačne pomocou 100 ml roztoku.

Príprava 2,5 N roztoku hydroxidu sodného: v destilovanej vode sa rozpustí 10 g hydroxidu

sodného a doplní sa na objem 100 ml.

4. Zmes sa dôkladne premieša a vyleje do kanalizácie.

Pri práci s etídium bromidom sa môžu používať viaceré zdraviu škodlivé chemikálie.

Ľadová kyselina octová – vyznačuje sa silnými leptavými účinkami

Tetrachlór etán – je jed a pôsobí toxicky na životné prostredie, predovšetkým vodné živočíchy

HCl – je žieravina

Kyselina fosforečná – má leptavé účinky

KMNO4 – je silná oxidačná zlúčenina

75

1.10 MANAŽMENT KVALITY LABORATÓRNEJ PRÁCE PRE PRIAMU

MIKROSKOPICKÚ METÓDU POČÍTANIA SOMATICKÝCH BUNIEK

Ernst-Heinrich Ubben na Workshope národných referenčných laboratórií pre mlieko

a mliečne výrobky zameranom na počítanie somatických buniek mikroskopickou metódou,

ktorý sa konal v nemeckom meste Kiel 9. až 10. septembra 2004 uviedol referát zameraný na

manažment kvality práce pri stanovení počtu somatických buniek priamou mikroskopickou

metódou (Ubben, 2004).

Kvalitu laboratórnej práce ovplyvňuje: rozmanitosť a zloženie analyzovanej vzorky,

analytické vybavenie, rozdielnosti v prístrojoch a použitých chemikáliách, vplyv prostredia,

pracovné inštrukcie, pracovné postupy, normy, špeciálne pravidlá, odporúčania,

individuálnosť pracovníka vykonávajúceho analýzu, manažment a v rámci neho realizácia

a frekvencia vykonávania kontrol, testovanie kvality laboratórnej práce pomocou

referenčných vzoriek a medzilaboratórnych porovnávaní.

1. Vzorka mlieka

Každá vzorka mlieka je jedinečná a jej charakter môžu vo významnej miere

ovplyvňovať nasledovné ukazovatele:

- typ somatických buniek

- obsah somatických buniek

- degenerácia somatických buniek

- obsah, aktivita a typ prítomných enzýmov

- prítomnosť mikroorganizmov

- rôzne živé alebo neživé zložky

- homogenita vzorky

2. Analytické vybavenie a vplyv prostredia

Pre zabezpečenie kvality práce by sa v laboratóriu mali používať kalibrované prístroje

a vybavenie. Takéto prístroje pracujú veľmi presne a ich používanie znižuje chybu analýzy

a zlepšuje presnosť a správnosť analýzy. Prístroje u ktorých nie je možné vykonať kalibráciu

je preto lepšie vyradiť z ďalšieho použitia. Zmeny v laboratórnych podmienkach môžu

ovplyvniť kvalitu analýzy. Predovšetkým zmena teploty a vlhkosti môže ovplyvniť množstvo

76

pipetovanej vzorky. Odporúča sa preto vykonávať kalibráciu pipiet pri bežných laboratórnych

podmienkach. Optimálne je vykonávať kalibrácie a pracovať pri konštantnej teplote 20 °C.

Pre prípravu roztokov by sa mali používať certifikované chemikálie kvality p.a. (pre analýzu)

alebo supra pur. Pre pipetovanie vzorky sa odporúča používať mikrostriekačku pred

automatickou pipetou. Na nanášanie preparátu sa odporúča používať podložné sklíčka

s predtlačeným rozmerom, potom templát s preddefinovaným rozmerom. V nevyhnutnom

prípade sa môže použiť milimetrový papier, na ktorom sa vyznačí požadovaný rozmer.

3. Pracovné postupy

Pre zabezpečenie jednotnosti laboratórnej práce v referenčných laboratóriách

jednotlivých členských krajinách EÚ, je veľmi dôležité aplikovať rovnaké pracovné postupy.

Vo všeobecnosti sa odporúča pracovať podľa normy ISO 13366. Na základe legislatívnych

požiadaviek sa môžu zaviesť rozličné pravidlá súvisiace s používaním normy ISO 13366.

Pracovné postupy aplikované v jednotlivých laboratóriách by mali byť dostatočne

zdokumentované, aby sa v prípade potreby dali analýzy bez problémov vykonať. Pracovné

postupy by mali podliehať pravidelným kontrolám. V prípade nutnosti ich modifikácie sa

musia v rámci ich validácie vykonať náležité porovnávacie skúšky.

4. Analytik

Pracovník môže vo veľmi veľkej miere ovplyvniť výsledok analýzy. Z tohto dôvodu

sa musí vykonávať pravidelný tréning pracovníkov vykonávajúcich počítanie somatických

buniek mikroskopickou metódou. Praktické zručnosti ako odber vzorky, roztieranie vzorky na

podložné sklíčko a ďalšie praktické úlohy súvisiace s prípravou preparátu sa dajú natrénovať

až do úplnej dokonalosti a spoľahlivosti. Tieto schopnosti sú výsledkom manažmentu,

tréningu a výberu vhodného pracovníka. Detekcia somatických buniek a ich klasifikácia však

vždy závisí od vedomostí, individuálnych skúseností a talentu pracovníka vykonávajúceho

analýzu. Každý pracovník by mal poznať úroveň svojich schopností a mal by vedieť do akej

miery je schopný vykonať individuálne odčítavanie somatických buniek.

77

5. Manažment

Pred začatím práce je nevyhnutné prispôsobiť pracovný postup miestnym

podmienkam. Následne sa musí dozerať nad presným dodržiavaním zavedených pracovných

postupov a pravidiel. Je nevyhnutné vykonávať pravidelné kontroly stanovených výsledkov

s výsledkami získanými na automatických zariadeniach (napr. Fossomatic 5000).

U niektorých špeciálnych vzoriek môžu byť výsledky analýz diametrálne odlišné, pri

rozhodovaní je v takýchto prípadoch nutné využiť vedomosti z dlhodobého pozorovania.

Kvalita práce sa posudzuje na základe viacerých výsledkov a nie na základe jedného

výsledku. Pri kontrolách by sa mali využívať referenčné vzorky a medzilaboratórne skúšky

spôsobilosti. Pracovníci musia byť informovaní o dosiahnutej presnosti a správnosti

výsledkov ich práce.

Medzilaboratórne skúšky spôsobilosti sú dôležitým nástrojom pre zisťovanie kvality

laboratórnej práce. Z hodnôt opakovateľnosti stanovených v posledných medzilaboratórnych

skúškach spôsobilosti vyplýva potreba zlepšenia kvality laboratórnej práce na medzinárodnej

úrovni (Tabuľka 11). Medzilaboratórne skúšky spôsobilosti odhalili systematické chyby

u značného množstva laboratórií (Ubben a Knappstein, 2005).

78

Pokrok v zručnosti laboratórií pri počítaní somatických buniek v medzilaboratórnych

skúškach spôsobilosti

Tabuľka 11 Rok Počet účastníkov

medzilaboratórnej skúšky

spôsobilosti

Sr

[SB.ml-1]

Bias

[SB.ml-1]

1994 42 103 000 300 000

1995 49 48 000 186 000

1996 61 43 000 127 000

1997 67 37 000 118 000

1998 60 38 000 107 000

1999 65 30 000 98 000

2000 65 31 000 76 000

2001 56 35 000 96 000

2002 48 29 000 78 000

2003 45 40 000 122 000

2004 51 29 000 85 000

Sr = opakovateľnosť vyjadrená pomocou štandardnej odchýlky

Bias = systematická chyba (rozdiel od skutočnej hodnoty), u každého z účastníkov bola

vybraná najhoršia hodnota z 9 resp. 10 stanovovaných vzoriek.

Uvedené dáta reprezentujú 85 % hladinu rozdelenia účastníkov.

(Ubben a Knappstein, 2005)

79

1.11 PRÍPRAVA REFERENČNÝCH VZORIEK S PRESNÝM POČTOM

SOMATICKÝCH BUNIEK

Vermunt et al. (1995) uvádzajú, že na stanovenie počtu somatických buniek sa

používajú viaceré metódy. Skutočná, reálna, hodnota počtu somatických buniek sa musí

stanoviť pomocou priamej mikroskopickej metódy.

Schmidt-Madsen (1975) zistil, že počty somatických buniek zistené pomocou

prístrojov Fossomatic vykazujú vysoký stupeň korelácie s priamou mikroskopickou metódou

stanovenia počtu somatických buniek.

V praxi sa však častejšie využíva fluoro-opto-elektronická metóda, ktorú využívajú aj

prístroje typovej rady Fossomatic (Vermunt et al., 1995).

Prístroje na počítanie somatických buniek majú vykazovať nielen dobrú hranicu

opakovateľnosti (r) a reprodukovateľnosti (R) pri medzilaboratórnych skúškach spôsobilosti,

ale majú zaručovať vysokú správnosť strednej hodnoty alebo pokiaľ možno čo najmenšie

vychýlenie (systematickú chybu „bias“). Vzhľadom na to, že vychýlenie je definované ako

rozdiel medzi „skutočnou“ hodnotou a strednou hodnotou z počtov stanovení, musí sa táto

„skutočná“ hodnota stanoviť pokiaľ možno použitím priamej metódy.

Na stanovenie správnosti strednej hodnoty sa nemôže použiť suspenzia častíc

s definovanou veľkosťou. Vzhľadom na to, že postup počítania rôznych prístrojov obsahuje

kroky riedenia, zmiešavania s chemikáliami, farbenie, ohrev, aby sa vzorka pripravila na

finálny proces počítania, vzorky so skutočnými hodnotami musia mať prakticky rovnaké

zloženie ako vzorky mlieka, ktoré sa majú počítať (STN EN ISO 13366-3, 2001).

Vermunt et al. (1995) ďalej uvádzajú, že pre prístrojové metódy stanovenia počtu

somatických buniek sa musia zaviesť postupy kontroly kvality laboratórnej práce, aby

výsledky zistené týmito metódami skutočne odzrkadľovali reálnu hodnotu počtu somatických

buniek vo vzorke. Postupy kontroly kvality vyžadujú vzorky s konštantným a referenčným

množstvom somatických buniek. Referenčné vzorky sa môžu pripravovať viacerými

spôsobmi a ich zloženie môže byť značne odlišné.

80

Príprava referenčných vzoriek

V posledných rokoch boli navrhnuté rôzne spôsoby prípravy referenčných vzoriek

(„štandardov“):

a; prídavok plastových častíc alebo leukocytov do vzoriek mlieka s veľmi malým počtom

somatických buniek,

b; ošetrenie vzoriek mlieka s uvedeným počtom somatických buniek („pravých prirodzených“

vzoriek mlieka) takým spôsobom, že sa vzorky môžu uchovávať najmenej niekoľko

mesiacov.

Jednotlivé prístupy boli úspešné v rôznej miere. Dnes možno konštatovať, že prístup

používajúci prídavok častíc do vzorky mlieka nebol správnym riešením. Prídavok

izolovaných leukocytov (PMN, tymocytov) možno použiť, avšak je potrebné uvedomiť si,

že izolácia týchto buniek vedie často k selekcii určitých typov buniek, takže vzorky

neobsahujú bunky v rovnakom rozsahu alebo s rovnakým rozdelením ako prirodzené mlieko.

V posledných rokoch sa vyvinulo špecifické ošetrenie vzoriek mlieka s malým,

stredným a veľkým počtom buniek takým spôsobom, že pripravené štandardy („referenčné

vzorky“) môžu mať trvanlivosť i niekoľko mesiacov dokonca i pri teplote miestnosti.

Môžu sa prepravovať po celom svete, pretože ošetrenie (kombinácia tepelného

ošetrenia a chemického konzervovania) zaručuje, že sa vo vzorkách nenachádzajú žiadne

patogénne mikroorganizmy ani vírusy (je zaručená absolútna sterilita).

Pri príprave štandardov na báze mlieka sa musí uviesť postup na počítanie

„skutočného“ počtu buniek vo vzorkách mlieka pre kalibráciu a na kontrolu správnosti

elektronického počítania (napríklad fluorescenčná optická elektronická metóda). Na tento účel

je vhodná mikroskopická metóda (STN EN ISO 13366-1). Okrem toho sa musí dokázať,

že referenčné hodnoty nie sú ošetrením zaťažené systematickou odchýlkou.

Podmienky úschovy (čas a teplota) sa riadia návodom výrobcu.

Týmto spôsobom je možné získať štandardy s presne stanoveným definovaným alebo

skutočným počtom buniek. Pre laboratóriá to má výhodu v tom, že vzorky mlieka počítané

mikroskopickou metódou sú k dispozícii bez obmedzenia a môžu sa použiť kedykoľvek je to

potrebné bez toho, aby sa muselo vykonať časovo náročné a prácne mikroskopické počítanie

buniek v danom laboratóriu (STN EN ISO 13366-3, 2001).

81

Odporúčania pre zaradenie bunkových štandardov (mliečnych štandardov) do

programu zabezpečovania kontroly kvality pri počítaní buniek v laboratóriu sú podľa normy

STN EN ISO 13366-3 nasledovné:

a; stanovenie hranice opakovateľnosti (r)

Opakovane sa stanoví počet buniek vo vzorke mlieka (konzervovaného alebo

nekonzervovaného), ktorá obsahuje počet buniek od 400 000 do 500 000 v mililitri.

b; stanovenie hranice reprodukovateľnosti (R)

Účasť v mezilaboratórnych skúškach.

c; stanovenie správnosti (vychýlenia)

Používajú sa štandardy so skutočnými hodnotami stanovenými mikroskopickým

počítaním. Štandardy možno použiť niekoľkokrát za deň, aby sa zistilo, či odčítaná hodnota je

v určitých hraniciach stanovených pre hodnotu štandardu (napríklad od 5 % do 10 % pre

počet buniek od 400 000 do 500 000 . ml-1).

Nie je vždy možné dosiahnuť úzku závislosť medzi príliš veľkými a príliš malými počtami

štandardov a príslušnými odchýlkami počítaných vzoriek mlieka. Je potrebné brať do úvahy,

že štandardné vzorky sú dobre konzervované a že sú z mlieka „najlepšej kvality“.

Odlišné počty (príliš veľké alebo príliš malé) somatických buniek v rutinných vzorkách môžu

byť ovplyvnené príliš veľkými počtami baktérií alebo príliš dlhým časom konzervovania pri

použití niektorých chemických konzervačných látok (napr. azidu sodného) a inými faktormi.

Dosiahnutie počtu somatických buniek udaného pre mliečny štandard môže iba

zabezpečiť, že celkový systém počítania vrátane prípravy vzorky pracuje správne.

Laboratórium, ktoré vykonáva počítanie buniek, musí zabezpečiť, že „kvalita“

počítaných rutinných vzoriek bude taká, aby presne kalibrovaný prístroj mohol počítať

„správne“ počty buniek v týchto vzorkách.

Stabilizácia referenčných vzoriek

Vermunt et al. (1995) uvádzajú, že pri príprave referenčných vzoriek s presným

počtom somatických buniek, by sa malo mlieko preventívne ošetriť za účelom zabránenia

rozkladu somatických buniek. Na konzerváciu sa môžu použiť viaceré konzervačné látky

o rôznych koncentráciách, napr.: kyselina boritá (≤ 0,6 %), dichroman draselný (0,1 %,

82

0,2 %), azid sodný (0,024 %) a bronopol (0,05 %). Pri výrobe referenčných vzoriek sa môže

použiť kombinácia chemickej konzervácie a tepelného ošetrenia.

Autori ďalej uvádzajú, že cieľom ich štúdie bolo vyvinúť dve referenčné vzorky,

vzorku s nízkym a vysokým počtom somatických buniek tak, aby sa pri ich príprave použilo

bazénové mlieko a mlieko od individuálnych dojníc bez potreby odstreďovania, a aby bol

počet somatických buniek stabilný počas 10 týždňov. Pri výrobe referenčných vzoriek

zmiešavali mlieko od individuálnych dojníc s obsahom 100 000 až 1 250 000 somatických

buniek . ml-1 tak, aby vzorky obsahovali rozličný počet somatických buniek. Maximálne

množstvo mlieka použitého od individuálnych dojníc bolo približne 65 %. Mlieko bolo

schladené a uskladnené pri teplote od 0 °C do 2 °C.

Autori preskúmali tri rozdielne spôsoby konzervovania mlieka:

- konzerváciu s 0,1 % w/w bronopolom,

- konzerváciu s 0,1 % w/w dichromanom draselným,

- kombináciu tepelného ošetrenia a konzerváciu s 0,1 % dichromanom draselným, sterilné

zásobné banky obsahujúce 2 až 3 litre mlieka boli umiestnené do vodného kúpeľa pri teplote

70 °C počas 45 min, po tepelnom ošetrení boli chemicky zakonzervované.

Mlieko bolo zakonzervované v priebehu 5 až 10 hodín a v priebehu 24 až 36 hod po

nadojení. V mlieku bol v deň prípravy referenčných vzoriek stanovený celkový počet

mikroorganizmov štandardnou platňovou metódou a počet somatických buniek

mikroskopickou metódou. Vzorky boli zabalené do izotermických boxov s chladiacimi

vložkami a boli zaslané štyrom laboratóriám, ktoré ich uskladnili pri teplote medzi 0 °C až

2 °C. Každá analýza bola vykonaná z novej vzorkovnice.

Z výsledkov experimentu vyplynulo, že tepelné ošetrenie s následným pridaním 0,1 %

dichromanu draselného bolo lepšie než ošetrenie s 0,1 % bronopolom alebo 0,1 %

dichromanom draselným bez tepelného ošetrenia. Štatistická analýza 14 rozdielnych sérií

vzoriek stabilizovaných tepelným ošetrením a konzerváciou 0,1 % dichromanom draselným

ukázala, že tieto vzorky boli stabilné počas celej dĺžky experimentu, desiatich týždňov.

Odhadovaný pokles po 10 týždňoch bol nanajvýš 2 % a nebol významný. V dvoch prípadoch

bol zaznamenaný veľký pokles 13 % a 29 %. Autori uviedli, že v dôsledku neštandardného

pracovného postupu pri tepelnom ošetrení bol pokles v počte somatických buniek očakávaný.

Nedostatočné tepelné ošetrenie viedlo zrejme k zvýšeniu celkového počtu živých

mikrobiálnych buniek. Jedna vzorka vykazovala malý, ale stále veľmi významný pokles 3 %

po uplynutí doby 10 týždňov. Pre tento pokles autori nemali vysvetlenie.

83

Výsledky boli získané pri presne stanovených podmienkach. Mlieko bolo vždy čerstvé

a nekonzervované, vzorky boli konzervované vždy tým istým spôsobom a boli skladované za

rovnakých podmienok. Výsledky indikujú, že týmto spôsobom pripravené vzorky sa môžu

použiť ako referenčné vzorky za účelom kontroly prístrojov typovej rady Fossomatic. Takéto

vzorky môžu slúžiť na kalibrovanie prístrojov Fossomatic a na kontrolu kvality práce

laboratória. Hodnoty opakovateľnosti a reprodukovateľnosti zistené pri analyzovaní

pripravených referenčných vzoriek autori zhrnuli do tabuľky (Tabuľka 12).

Hodnoty opakovateľnosti a reprodukovateľnosti zistené pri analyzovaní šiestich

rozdielnych referenčných vzoriek konzervovaných kombináciou tepelného ošetrenia

a konzervovaním 0,1 % dichromanom draselným

Tabuľka 12 Reprodukovateľnosť

(stredná hodnota, v zátvorke je uvedená najnižšia

a najvyššia dosiahnutá hodnota)

Referenčná

vzorka

Opakovateľnosť

(stredná hodnota,

v zátvorke je uvedená

najnižšia a najvyššia

dosiahnutá hodnota)

Medziprístrojová Medilaboratórna Celková

Vzorka

s vysokým

počtom SB

60 000

(49 000 - 67 000)

89 000

(66 000 -105 000)

112 000

(83 000 -151 000)

123 000

(83 000 -151 000)

Vzorka

s nízkym

počtom SB

25 000

(22 000 - 32 000)

32 000

(26 000 - 37 000)

36 000

(28 000 - 45 000)

36 000

(29 000 - 46 000)

Poznámka: hodnoty sú uvedené v jednotkách (SB . ml-1)

(Vermunt et al., 1995)

V rámci experimentu zisťovali vplyv viacerých faktorov, ktoré by mohli ovplyvniť

množstvo somatických buniek vo vzorke.

Čerstvosť mlieka môže byť veľmi dôležitá pre kvalitu pripravenej referenčnej vzorky.

Čerstvé vzorky vykazovali nižší počet životaschopných mikroorganizmov ako staršie vzorky

pripravené po 24 až 36 hodinách od odberu mlieka. Zvýšený počet mikroorganizmov môže

viesť v nízky ale významný 6 % pokles počtu somatických buniek. Výber vhodnej

konzervačnej metódy je taktiež veľmi dôležitý. Metóda konzervácie ovplyvnila stabilitu

84

referenčných vzoriek. Konzervácia s dichromanom draselným, bola zahrnutá do experimentu

preto, že tento spôsob konzervácie sa v praxi využíva veľmi často. Metóda konzervovania

pomocou bronopolu bola vybraná preto, že bronopol je alternatívou voči dichromanu

draselnému. Konzervácia 0,1 % bronopolom bola testovaná preto, že v predbežných

experimentoch sa koncentrácia 0,03 % javila ako príliš nízka, nedokázala by vzorku

stabilizovať natoľko, aby nedochádzalo k poklesu počtu somatických buniek. Výsledky

naznačili, že konzervácia 0,1 % bronopolom stále vedie k väčšiemu poklesu počtu

somatických buniek než konzervácia 0,1 % roztokom dichromanu draselného.

Tepelné ošetrenie ovplyvňuje kvalitu referenčných vzoriek. Pri tepelnom ošetrení

dochádza k väčšej inaktivácii baktérií a enzýmov. Po 20 dňoch bol celkový počet

životaschopných buniek v piatich vzorkách konzervovaných kombináciou tepelného ošetrenia

a chemického ošetrenia v priemere 340 násobne nižší v porovnaní s neošetrenou vzorkou po

jednom dni, zatiaľ čo pri konzervácii iba s dichromanom draselným bol vykázaný

50 násobný pokles.

Uskladnenie vzoriek pri teplote od 0 °C do 2 °C je veľmi dôležité pre predchádzanie

poklesu počtu somatických buniek vo vzorke.

Autori v závere konštatujú, že bude potrebné vyskúšať ďalšie kombinácie konzervácie

pri príprave referenčných vzoriek.

85

2 CIEĽ PRÁCE

2.1 Cieľ experimentu 1 - stanovenie počtu somatických buniek v surovom kravskom

mlieku referenčnou metódou.

Zaviesť do praxe referenčnú metódu stanovenia počtu somatických buniek.

Porovnať metódu uvedenú v norme STN EN ISO 13366-1 (2001) s modifikovanou

metódou popísanou Vermuntom et al. (1995). Modifikácia tejto metódy vykonaná v NRLM

je popísaná v kapitole metodika.

Vypočítať neistoty merania pre obi dve metódy.

2.1.1 Očakávané výsledky

Očakávame, že výsledky stanovené metódou popísanou Vermuntom et al., (1995)

budú porovnateľné s výsledkami stanovenými podľa STN EN ISO 13366-1 (2001).

Predpokladáme, že aspoň jedna z uvedených metód bude natoľko presná, že ju

budeme môcť považovať za referenčnú a bude sa môcť používať na stanovenie počtu

somatických buniek za účelom prípravy sekundárnych referenčných materiálov. Halaj (2003)

udáva, že sekundárny referenčný materiál je materiál, ktorého hodnota bola určená

porovnaním s primárnym etalónom danej veličiny. V praxi sa používa ako alternatíva

finančne nákladných a nie všetkým dostupných primárnych referenčných materiálov.

2.2 Cieľ experimentu 2 - príprava sekundárnych referenčných materiálov

Preskúmať možnosť výroby sekundárnych referenčných materiálov (referenčných

vzoriek) s nízkym a vysokým počtom somatických buniek podľa postupu uvedeného v práci

Vermunta et al. (1995), určených pre dennú kontrolu automatických prístrojov na stanovenie

počtu somatických buniek vo vzorkách mlieka (prístroje typu Fossomatic).

1. Pripraviť a testovať kvalitu referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek

v NRLM.

2. Pripraviť a testovať kvalitu referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek

v NRLM.

86

3. Pripraviť referenčné vzorky s nízkym a vysokým počtom somatických buniek a testovať

ich kvalitu v reálnych laboratórnych podmienkach, porovnať výsledky stanovené v troch

laboratóriách.


Očakávame, že nami zistené výsledky budú korešpondovať s výsledkami stanovenými

v práci Vermunta et al. (1995) a pripravené referenčné vzorky sa budú môcť používať na

dennú kontrolu automatických prístrojov stanovujúcich počet somatických buniek vo

vzorkách mlieka.

2.3 Cieľ experimentu 3 - porovnanie výsledkov mikroskopických metód

Porovnať výsledky stanovené nasledovnými metódami:

A

STN EN ISO 13366-1 (2001) Mlieko - stanovenie počtu somatických buniek, Časť 1:

Mikroskopická metóda (referenčná metóda) – farbenie etídium bromidom - výsledky

NRLM.

B

ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005) Mlieko – stanovenie počtu somatických buniek – Časť

1: Mikroskopická metóda (referenčná metóda) – (modifikovaná) farbenie etídium

bromidom pri teplote 100 °C – výsledky NRLM.

C

ISO 13366-3 (1997) Mlieko, Stanovenie počtu somatických buniek, Časť 3: Fluorescenčná

optická elektronická metóda – prístroj Fossomatic (prevádzková metóda) – výsledky A.I.A.-

L.S.L. Rím.

D


1: Mikroskopická metóda (referenčná metóda) – farbenie etídium bromidom pri teplote

50 °C – výsledky NRLM.

87

E


1: Mikroskopická metóda (referenčná metóda) – farbenie metylénovou modrou – výsledky

kolaboratívnej štúdie.

F


1: Mikroskopická metóda (referenčná metóda) – farbenie etídium bromidom – výsledky


V norme ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005) je rozpracovaný návrh novej

referenčnej metódy pre stanovenie počtu somatických buniek. Pracovný postup uvedený

v navrhovanej norme je prakticky totožný s pracovným postupom v doteraz platnej norme

STN EN ISO 13366-1 (2001), norma je však doplnená o pracovný postup farbenia etídium

bromidom, o prípravu farbiacich roztokov pre kozie mlieko, norma detailnejšie popisuje

postup počítania somatických buniek, jednotlivé typy somatických buniek a obsahuje nový

spôsob výpočtu.

Metódy A, B a C korešpondujú s metódami z experimentu 1. Výpočet však bol

vykonaný podľa navrhovanej normy ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005). Taktiež bola

vykonaná úprava v bode 9.1 normy ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005), pri farbení sa

použil pracovný farbiaci roztok pripravený podľa bodu 5.1.2.3 ale zriedený v pomere 1 : 9

s deionizovanou destilovanou vodou. Zriedenie pracovného farbiaceho roztoku neovplyvňuje

výsledky analýzy a umožňuje pohodlnejšie mikroskopovanie vzorky pretože vo vzorke nie je

nadbytok fluoreskujúceho farbiva. Tieto empirické skúsenosti boli získané v experimente 1.

Experiment 3 bolo možné uskutočniť vďaka ISO/IDF kolaboratívnej štúdie zameranej

na stanovenie počtu somatických buniek v kravskom mlieku navrhovanou referenčnou

metódou ISO 13366-1 / IDF 148-1 (2005), ktorú organizovala Silvia Orlandini, AIA –

Laboratorio Standard Latte Via dellÌndustria 24, 000 57 Maccarese, Rím, Taliansko.

Experiment sa uskutočnil na vzorkách, ktoré boli súčasťou vyššie uvedenej


Cieľom kolaboratívnej štúdie bolo stanoviť hodnoty opakovateľnosti

a reprodukovateľnosti pre navrhovanú normu ISO 13366-1 / IDF 148 -1 (2005).

88


Očakávame, že výsledky stanovené metódami A, B, C a E budú približne na rovnakej

hladine, výsledky stanovené metódou D a F budú značne nižšie v porovnaní s ostatnými

výsledkami.

89

3 MATERIÁL A METODIKA

3.1 Experiment 1 – stanovenie počtu somatických buniek v surovom kravskom mlieku

referenčnou metódou

3.1.1 Materiál

Na skúšanie sa použili iba vzorky surového kravského mlieka. Odber vzoriek sa

realizoval podľa STN EN ISO 707 (2001). Odber vzoriek vykonával zootechnik a doktorand.

Vzorky mlieka pochádzali od dojníc zdravých, mastitídnych a odobraté boli aj bazénové

vzorky surového kravského mlieka. Výberom vhodných dojníc sme sa snažili zabezpečiť

vzorky s rozdielnymi hladinami somatických buniek (od 50 000 somatických buniek . ml-1 po

1 400 000 somatických buniek . ml-1) tak, aby väčšina vzoriek obsahovala počet somatických

buniek od 200 000 do 500 000 . ml-1, teda v intervale dôležitom z hľadiska trhového

preplácania mlieka. Všetky vzorky boli po odbere okamžite schladené na teplotu pod 6 °C.

Prevoz vzoriek sa realizoval v izotermických nádobách. Vzorky boli v laboratóriu uskladnené

v chladničke pri teplote od 2 °C do 6 °C a boli spracované do 24 hodín od ich odberu.

3.1.2 Lokalita

Vzorky surového kravského mlieka pochádzali prevažne z vybraného chovu RD

Rumanová. Okrem vzoriek z RD Rumanová boli analyzované aj vzorky pochádzajúce

z oficiálnych odberov vykonaných veterinárnymi inšpektormi. V týchto vzorkách sa prvotne

vykonali analýzy požadované veterinárnymi inšpektormi alebo vlastníkmi a následne bola

vykonaná analýza stanovenia počtu somatických buniek.

3.1.3 Časový harmonogram a rozsah experimentu

Experiment prebiehal počas rokov 2004 a 2005. Celkovo bolo vyšetrených 120

vzoriek surového kravského mlieka a mikroskopicky zhodnotených 524 preparátov. V každej

analyzovanej vzorke bol stanovený počet somatických buniek tromi metódami A, B a C.

Tieto metódy sú popísané nižšie.

Pri mikroskopických metódach A a B sa vykonávali paralelné stanovenia. Pri

inštrumentálnej metóde C (automatické stanovenie pomocou prístroja Fossomatic 5000) sa

v každej vzorke stanovil počet somatických buniek minimálne 6-krát. Priemerná hodnota

90

počtu somatických buniek zistená prístrojom Fossomatic 5000 slúžila ako orientačná

a kontrolná hodnota.

3.1.4 Použité metódy

Metóda A

STN EN ISO 13366-1 (2001) Mlieko, Stanovenie počtu somatických buniek časť 1:

Mikroskopická metóda

Metóda B

Metóda publikovaná Vermuntom et al. (1995), modifikovaná na základe našich

pozorovaní a empirických skúseností. Pri pracovnom kroku farbenia somatických buniek bola

zmenená teplota 50 °C teplotou 100 °C, nasledovalo pridanie farbiaceho roztoku, farbenie

počas 1 minúty za stáleho miešania a vychladenie laboratórnej vzorky na teplotu 20 °C.

Metóda C

STN EN ISO 13366-3 (2001) Mlieko, Stanovenie počtu somatických buniek, časť 3:

Fluorescenčná optická elektronická metóda. Stanovenie počtu somatických buniek prístrojom

Fossomatic 5000.

3.1.4.1 Prístroje, pomôcky, chemikálie a príprava roztokov pre metódy A a B, príprava

podložných sklíčok

Upozornenie

Etídium bromid je silný mutagén, pravdepodobný karcinogén a teratogén.

Pri práci sa musí používať laboratórny plášť, okuliare (štít) a ochranné rukavice.

V prípade, že sa pri práci s etídium bromidom používa ultrafialové svetlo, musia sa

dodržiavať ďalšie ochranné opatrenia.

Pri práci s práškovou formou etídium bromidu sa používa ochranné rúško.

Každý pracovník musí byť zaškolený pre prácu s etídium bromidom.

91

Prístroje a pomôcky

Fluorescenčný mikroskop Olympus BX51

Mikropipeta o objeme 10 µl (resp. mikrodávkovač) s max. odchýlkou ± 2 %

Automatická pipeta o objeme 1 ml

Skúmavky o objeme 10 ml

Stojan na skúmavky

Fľaša so zabrúseným hrdlom z tmavého skla

Fľaša so zabrúseným hrdlom

Odmerná banka 100 ml

Vodný kúpeľ s teplotou udržiavanou na 65 °C ± 5 °C



Filter s veľkosťou pórov od 10 µm do 12 µm alebo menšou, odolný proti používaným

rozpúšťadlám

Podložné sklíčka s vyznačeným obrysom s rozmermi 20 mm x 5 mm

Ohrievacia doska s teplotou udržiavanou na 30 °C až 40 °C

Papierová vata

Ochranné pracovné pomôcky

Digestor

Chladnička

Vpichový teplomer s presnosťou (± 0,5 °C)

Kalibrovaný teplomer s teplotným rozsahom do 100 °C s presnosťou (± 0,5 °C)

Roztoky pripravené podľa postupov uvedených v sekcii príprava roztokov.

Chemikálie

Všetky chemikálie musia byť analytickej kvality alebo lepšej.

Etanol 95 %

Tetrachlóretán

Ľadová kyselina octová

Metylénová modrá

92

Etídium bromid (Sigma) tabletová forma

Deionizovaná voda

Hydrogén ftalát draselný

Hydroxid draselný

Triton-X-100

Imerzný olej

Technický benzín

Éter

Príprava roztokov

Metodika A

Farbiaci roztok:

Etanol 95 % 54 ml

Tetrachlóretán 40 ml

Etídium bromid (metylénová modrá) 0,6 g

Ľadová kyselina octová 6,0 ml

Príprava farbiaceho roztoku:

Etanol a tetrachlóretán sa zmiešajú vo fľaši a zahrejú vo vodnom kúpeli na teplotu

65 °C. Potom sa pridá etídium bromid (namiesto etídium bromidu sa môže použiť metylénová

modrá) a dôkladne sa premieša. Ochladí sa v chladničke na 4 °C. Pridá sa ľadová kyselina

octová. Roztok sa prefiltruje a uchováva sa v tesne uzavretej fľaši z tmavého skla, pri teplote

0 až 5 °C po dobu maximálne 3 mesiacov. Ak je to potrebné, pred použitím sa znova

prefiltruje.

Metylénová modrá nie je tak citlivá ako etídium bromid, ale na druhej strane je menej

toxická a nepreniká (nevkladá sa) medzi reťazce nukleových kyselín. (WIKIPEDIA – THE

FREE ENCYCLOPEDIA2, 2006)

93

Metodika B

Farbiaci roztok:

Etídium bromid 2,5 g

Deionizovaná voda 1000 ml

Príprava farbiaceho roztoku:

Etídium bromid sa rozpustí v 1000 ml deionizovanej vody. Dôkladne sa mieša až do

úplného rozpustenia etídium bromidu. Proces sa môže urýchliť zahriatím na teplotu od 40 °C

do 60 °C. Po rozpustení etídium bromidu sa roztok prefiltruje. Takto pripravený roztok sa

môže skladovať v tme počas 6 mesiacov pri teplote 0 až 5 °C.

Tlmivý roztok:

Hydrogén ftalát draselný 5,1 g

KOH 1,4 g


Príprava tlmivého roztoku:

Hydrogén ftalát draselný sa rozpustí v 1000 ml deionizovanej vody. Po rozpustení sa

pridá KOH. Opatrne sa mieša až do úplného rozpustenia KOH. Takto pripravený roztok sa

neskladuje, vždy sa pripravuje čerstvý.

Štandardný roztok:

Farbiaci roztok 200 ml

Tlmivý roztok 800 ml

Triton X-100 10 ml

Príprava štandardného roztoku:

94

Zmieša sa tlmivý roztok s farbiacim. Pridá sa Triton X-100 a mieša sa až do úplného

rozpustenia Tritonu X-100. Takto pripravený roztok sa môže skladovať v tme vo

vzduchotesnej nádobe pri teplote 0 až 5 °C max. 6 mesiacov.

Pracovný roztok:

Štandardný roztok 10 ml


Príprava pracovného roztoku:

Roztok sa pripraví zmiešaním štandardného roztoku s deionizovanou vodou. Takto

pripravený roztok sa môže skladovať v tme pri teplote 0 až 5 °C maximálne 1 týždeň.

Roztok na čistenie mikroskopu

Etanol 7 dielov

Éter 3 diely

Príprava čistiaceho roztoku:

Etanol a éter sa odmerajú pomocou odmerného valca a zmiešajú sa. Pracuje sa

v digestore. Pripravený čistiaci roztok sa uchováva v zásobnej fľaši.

Príprava podložných sklíčok

Podložné sklíčka sa musia pred prípravou preparátu dôkladne vyčistiť pomocou

papierovej vaty a alkoholu.

Odmastenie sklíčok sa vykonáva ponorením sklíčka do alkoholu a vypálením (sklíčko

sa vystaví plameňu iba za účelom splanutia alkoholu - nevystavuje sa plameňu dlhšie ako 1

sekundu z dôvodu jeho poškodenia).

V prípade čistenia použitých podložných sklíčok sa z nich najskôr odstráni pod

prúdom teplej vody a pomocou čistiaceho prostriedku zaschnutá vrstva preparátu a imerzný

95

olej. Následne sa podložné sklíčka osušia papierovou vatou a potom sa odmastia podľa vyššie

popísaného postupu pomocou alkoholu.

3.1.4.2 Metóda A

Podstata metódy

Vzorka mlieka sa nanesie na podložné sklíčko tak, aby vznikol tenký film. Film sa

vysuší, zafarbí a nasleduje mikroskopické počítanie (fluoreskujúcich) jadier somatických

buniek na definovanej ploche.

Výsledný počet somatických buniek v 1 ml vzorky sa získa vynásobením spočítaných

jadier somatických buniek s pracovným faktorom mikroskopu.

Príprava vzoriek

Čerstvá vzorka mlieka sa dôkladne ale jemne premieša prevrátením 25 krát, (vzorky

s vystúpeným tukom by sa mali zahriať na teplotu 40 °C ± 2 °C a premiešať, tak aby došlo

k rovnomernému rozptýleniu tuku. Zo vzorky sa odpipetuje 1 ml do skúmavky tak, že špička

pipety sa ponorí do stredu vzorkovnice a 3 krát sa prepláchne vzorkou. Štvrté nasatie sa

prenesie do skúmavky tak, že vonkajšia časť špičky, ktorá prišla do styku so vzorkou sa

opatrne utrie papierovou vatou a vzorka sa pomaly vypustí na dno skúmavky. Vzorka mlieka

v skúmavke sa zahreje vo vodnom kúpeli na teplotu 40 °C ± 2 °C. Teplota sa kontroluje

vpichovým teplomerom ponoreným do ekvivalentného množstva vzorky v druhej skúmavke.

Potom sa vzorka dôkladne a jemne premieša a ochladí sa prúdom studenej vody alebo

v chladničke na teplotu 20 °C (pri tejto teplote je kalibrovaná mikropipeta resp.

mikrodávkovač). Teplota sa kontroluje vpichovým teplomerom ponoreným

do ekvivalentného množstva vzorky v druhej skúmavke.

Pracovný postup

Z pripravenej vzorky sa zo skúmavky odoberie 0,01 ml pomocou mikropipety

(mikrodávkovača). Špička mikropipety sa ponorí pod hladinu. Pozor sa musí dávať na penu,

špička musí byť ponorená v mlieku. Špička sa tri-krát premyje vzorkou a štvrté nasatie sa

prenesie na podložné sklíčko. Vonkajší okraj špičky mikropipety, ktorý prišiel do styku so

96

vzorkou sa pred vypustením vzorky na podložné sklíčko opatrne očistí papierovou vatou.

Na čistom podložnom sklíčku sa najskôr obtiahne vyznačený obrys (20 mm x 5 mm) malým

množstvom skúšanej vzorky z mikropipety. Potom sa vyznačená plocha čo najrovnomernejšie

vyplní zvyšným množstvom skúšanej vzorky z mikropipety. Náter sa suší do úplného

vysušenia na vzduchu počas 12 hodín. Sušenie sa môže vykonať aj na vodorovnej ohrievacej

doske pri teplote 30 °C až 40 °C, pri tomto spôsobe sušenia však môže dôjsť k poškodeniu

preparátu potrhaním sa naneseného filmu vzorky).

Podložné sklíčko s vysušeným náterom sa na 10 minút ponorí do farbiaceho roztoku.

Pracuje sa v digestore za použitia ochranných pracovných pomôcok. Po zafarbení sa náter

vystaví prúdu vlažnej vody, kým sa nevymyje prebytočné farbivo. Podložné sklíčko sa

opatrne zbaví prebytočnej vody osušením papierovou vatou. Papierová vate nesmie prísť do

styku s nanesenou vzorkou aby nedošlo k poškodeniu preparátu. Náter sa znovu suší až do

úplného vysušenia na vzduchu alebo na vodorovnej ohrievacej doske pri teplote 30 °C až

40 °C a po vysušení sa uchováva chránený pred prachom až do mikroskopovania.

Mikroskopuje sa:

- fluorescenčným svetlom o vlnovej dĺžke 450 nm (modré svetlo) pri použití farbiaceho

roztoku s etídium bromidom, kedy sa počítajú fluoreskujúce bunkové jadrá.

Poznámka: mikroskopovanie bez fluorescenčného svetla sa vykonáva pri použití farbiaceho

roztoku s metylénovou modrou, kedy sa počítajú zreteľne na modro sfarbené bunkové jadrá.

Farbenie metylénovou modrou však nebolo predmetom tohto experimentu.

V oboch prípadoch sa pri pozorovaní použije 500 až 1000-násobné zväčšenie (objektív so

zväčšením 60 x) a imerzný olej.

V preparáte sa musí napočítať najmenej 400 bunkových jadier.

Poznámka: v prípade vzoriek s veľmi nízkym počtom somatických buniek

(do 100 000 . ml-1) nie je možné napočítať 400 somatických buniek. Z tohto dôvodu je

postačujúce ak sa spočítajú somatické bunky v minimálne 12 pruhoch. Pruhy sa musia zrátať

kompletne. V prípade vzoriek s veľmi vysokým počtom somatických buniek (800 000 . ml-1

97

a viac) by počítanie do 400 somatických buniek nemuselo stačiť na stanovenie presnej

hodnoty počtu somatických buniek (400 somatických buniek by sa nachádzalo v 2 až 3

pruhoch). V takomto prípade sa odporúča kompletne zrátať minimálne 7 pruhov.

Bunkové jadrá musia byť zreteľne rozoznateľné a v mikroskopickom poli musí byť

z jadra viditeľná najmenej polovica. Dĺžka každého z pruhov, v ktorom sa má počítať je

5 mm. Šírka zodpovedá priemeru zorného poľa mikroskopu. Šírka zorného poľa mikroskopu

sa určí pomocou objektívového mikrometra. Ak je objem skúšanej vzorky 0,01 ml, tak potom

sa pracovný faktor mikroskopu (wf) určí podľa nasledovnej rovnice:

wf = (20 x 100) / (d x b)

Kde: d – je číselná hodnota priemeru zorného poľa mikroskopu v milimetroch (0,36 mm pri

objektíve 60 x)

b – je počet kompletne zrátaných pruhov použitých na počítanie somatických buniek.

Vypočítané faktory sú uvedené v Prílohe 10, v Tabuľke 1.

Výpočet

Celkový počet somatických buniek v ml sa vypočíta vynásobením počtu spočítaných

somatických buniek pracovným faktorom mikroskopu wf.

Vypočítané pracovné faktory mikroskopu sú uvedené v Prílohe10, v Tabuľke 1.

3.1.4.3 Metóda B

Podstata metódy

Vzorka mlieka sa zmieša s farbiacim roztokom a nanesie sa na podložné sklíčko tak,

aby vznikol tenký film. Film sa vysuší a nasleduje mikroskopické počítanie fluoreskujúcich

jadier somatických buniek na definovanej ploche.

Výsledný počet somatických buniek v 1 ml vzorky sa získa vynásobením spočítaných

jadier somatických buniek s pracovným faktorom mikroskopu.

98

Príprava vzoriek

Čerstvá vzorka mlieka sa dôkladne ale jemne premieša prevrátením 25 krát, (vzorky

s vystúpeným tukom by sa mali zahriať na teplotu 40 °C ± 2 °C a premiešať, tak aby došlo

k rovnomernému rozptýleniu tuku. Zo vzorky sa odpipetuje 1 ml do skúmavky tak, že špička

pipety sa ponorí do stredu vzorkovnice a 3 krát sa prepláchne vzorkou. Štvrté nasatie sa

prenesie do skúmavky. Štvrté nasatie sa prenesie do skúmavky tak, že vonkajšia časť špičky,

ktorá prišla do styku so vzorkou sa opatrne utrie papierovou vatou a vzorka sa pomaly vypustí

na dno skúmavky. Vzorka mlieka v skúmavke sa zahreje vo vodnom kúpeli na teplotu

50 °C ± 2 °C a udržuje sa pri tejto teplote počas 5 minút. Teplota sa kontroluje vpichovým

teplomerom ponoreným do ekvivalentného množstva vzorky v druhej skúmavke. Potom sa

vzorka dôkladne a jemne premieša a ochladí sa prúdom studenej vody alebo v chladničke na

teplotu 20 °C (pri tejto teplote je kalibrovaná mikropipeta resp. mikrodávkovač). Teplota sa

kontroluje vpichovým teplomerom ponoreným do ekvivalentného množstva vzorky v druhej

skúmavke.

Pracovný postup

Skúmavka so vzorkou sa opatrne zohrieva nad plameňom na teplotu 100 °C.

V okamihu varu sa skúmavka ihneď odstaví od plameňa (nesmie dôjsť k vykypeniu vzorky).

Do vzorky sa okamžite napipetuje 1 ml farbiaceho roztoku tak, že vonkajšia časť špičky,

ktorá prišla do styku s farbiacim roztokom sa opatrne utrie papierovou vatou a vzorka sa

vypustí do skúmavky. Vzorka sa mieša počas 1 min. Následne sa vzorka ochladí prúdom

studenej vody alebo v chladničke na teplotu 20 °C (pri tejto teplote je kalibrovaná

mikropipeta resp. mikrodávkovač). Teplota sa kontroluje vpichovým teplomerom ponoreným

do ekvivalentného množstva vzorky v druhej skúmavke.

Z takto pripravenej vzorky sa odoberie 0,01 ml pomocou mikropipety.

Špička mikropipety sa ponorí pod hladinu. Pozor sa musí dávať na penu, špička musí byť

ponorená v mlieku. Špička sa tri-krát premyje vzorkou a štvrté nasatie sa prenesie na

podložné sklíčko. Vonkajšia strana špičky mikropipety, ktorá prišla do styku so vzorkou sa

pred vypustením vzorky na podložné sklíčko opatrne očistí papierovou vatou. Na čistom

podložnom sklíčku sa najskôr obtiahne vyznačený obrys (20 mm x 5 mm) malým množstvom

skúšanej vzorky z mikropipety. Potom sa vyznačená plocha čo najrovnomernejšie vyplní

zvyšným množstvom skúšanej vzorky z mikropipety. Náter sa suší do úplného vysušenia na

99

vzduchu počas 12 hodín. Sušenie sa môže vykonať aj na vodorovnej ohrievacej doske pri

teplote 30 °C až 40 °C, pri tomto spôsobe sušenia však môže dôjsť k poškodeniu preparátu

potrhaním sa naneseného filmu vzorky).

Mikroskopuje sa fluorescenčným mikroskopom s 500 až 1000 násobným zväčšením

pri vlnovej dĺžke fluorescenčného svetla 450 nm (modré svetlo). Pri mikroskopovaní sa

použije objektív (60 x) a imerzný olej. Počítajú sa fluoreskujúce bunkové jadrá.

Musí sa napočítať najmenej 400 bunkových jadier.

Poznámka: v prípade vzoriek s veľmi nízkym počtom somatických buniek

(do 100 000 . ml-1) nie je možné napočítať 400 somatických buniek. Z tohto dôvodu je

postačujúce ak sa spočítajú somatické bunky v minimálne 12 pruhoch. Pruhy sa musia zrátať

kompletne.

Bunkové jadrá musia byť zreteľne rozoznateľné a v mikroskopickom poli musí byť

z jadra viditeľná najmenej polovica. Dĺžka každého z pruhov, v ktorom sa má počítať je

5 mm. Šírka zodpovedá priemeru zorného poľa mikroskopu. Šírka zorného pola mikroskopu

sa určí pomocou objektívového mikrometra. Ak je objem skúšanej vzorky 0,01 ml, tak potom

sa pracovný faktor mikroskopu (wf) určí podľa nasledovnej rovnice:

wf = (20 x 100) / (d x b)

Kde: d – je číselná hodnota priemeru zorného poľa mikroskopu v milimetroch (0,36

mm pri objektíve 60 x)

b – je počet kompletne zrátaných pruhov použitých na počítanie somatických buniek.

Vypočítané faktory sú uvedené v Prílohe 11, v Tabuľke 1.

Výpočet

Celkový počet somatických buniek v mililitri sa vypočíta vynásobením počtu

spočítaných somatických buniek pracovným faktorom mikroskopu wf.

Vypočítané pracovné faktory mikroskopu sú uvedené v Prílohe 11, v Tabuľke 1.

100

3.1.4.4 Metóda C

Podstata metódy

Vzorka sa v prístroji Fossomatic 5000 farbí farbiacim roztokom, ktorý zafarbí DNA

somatických buniek. Somatické bunky sa v prietokovej bunke zoraďujú za sebou. Pri

prechode somatickej bunky cez prietokovú štrbinu, je somatická bunka pod čítacím

zariadením vystavená modrému svetlu, čo spôsobí emitáciu červeného svetla.

Emitované svetelné impulzy sa zachytávajú a rátajú. Zrátaný počet svetelných impulzov sa

vynásobí pracovným faktorom prístroja. Výsledok sa udáva ako počet somatických buniek

v 1 ml.

Príprava vzoriek

Vzorka mlieka sa umiestni do vodného kúpeľa o teplote 40 °C ± 2 °C a temperuje sa

po dobu 10 min. Dôkladne a jemne sa premieša prevrátením (25 krát).

Pracovný postup

Vzorkovnica sa so vzorkou umiestni pod nasávaciu pipetu prístroja Fossomatic 5000.

Po vykonaní nastavení v software prístroja sa pristúpi k analýze vzorky. Po spustení programu

prístroj automaticky zmeria počet somatických buniek vo vzorke. Výstupné dáta sa zobrazia

na monitore prístroja. Celý proces merania na prístroji Fossomatic 5000 sa uskutočňuje podľa

interného pracovného postupu č. PP4 Národného referenčného laboratória ŠVPÚ Nitra, ktorý

bol zostavený na základe normy STN EN ISO 13366-3 (2001).

Výpočet

Prístroj automaticky počíta svetelné impulzy zafarbených somatických buniek

a prevádza ich na počet somatických buniek v 1 ml vzorky.

Počet SB v 1 ml vzorky prístroj Fossomatic 5000 vypočíta automaticky podľa

zadefinovaného vzorca x = a . kx

101

kde: a - je počet impulzov indikovaných prístrojom

kx - konštantný pracovný koeficient prístroja

3.1.5 Štatistické vyhodnotenie experimentu 1 - stanovenie počtu somatických buniek

v surovom kravskom mlieku referenčnou metódou

Na vyhodnotenie získaných výsledkov (Tabuľka 17) sa použila dvojfaktorová analýza

rozptylu (ANOVA) bez interakcií. Na mnohonásobné porovnanie metód sa použil Tukeyov

test a Sheffeho test. Pre vzájomné porovnanie metód boli vypočítané korelačné koeficienty

(Príloha 17, Tabuľka 1). Výpočet sa uskutočnil v profesionálnom štatistickom programe

STATISTICA CZ.

3.1.5.1 Výpočet neistôt merania metódy A a B

Výpočet neistôt meraní metód sa uskutočnil podľa odbornej literatúry (Kazda, 2006;

Ľalík, 2006; Rimarčík, 2006; Urban 2006; Koller, 2002; Halaj, 2004; Eurachem, 2000;

SNAS, 1997). Zo zistených údajov sa vypočítala štandardná odchýlka, variačný koeficient,

neistota typu A, neistota typu B, kombinovaná štandardná neistota typu C a rozšírená neistota

merania. Pracovný postup výpočtu neistôt merania je uvedený v Tabuľke 13.

Výpočet neistoty typu A pre metódu A je uvedený v Tabuľke 22 a Tabuľke 23. Výpočet

neistoty typu A pre metódu B je uvedený v Tabuľke 24 a Tabuľke 25.

102

Postup pre výpočet neistôt merania Tabuľka 13

p.č Operácia Rovnica Číslo rovnice

Citácia

1. stanovenie počtu meraní i = 1 až n 2. stanovenie aritmetických priemerov xi = 1, 2, ... n 3. stanovenie výberového priemeru

nxxxxx n321

s+++

= (II.1)

Urban (2006), SNAS (1997)

4. stanovenie odchýlok aritmetických priemerov jednotlivých meraní od výberového priemeru

∆ xi = xi - xs (II. 2)

5. stanovenie druhej mocniny odchýlok ∆ xi2 = (xi - xs)2 (II. 3)

6. stanovenie súčtu druhých mocnín odchýlok ∑∑

=

−=n

1i

2si

2)x(xi∆x

(II. 4)

7. Výpočet štandardnej odchýlky rovnicu (II. 4) podeliť výrazom (n-1) a vypočítať druhú odmocninu celého výrazu

∑=

−−

=n

1i

2sid )x(x

1)(n1S

(II. 5)

Urban (2006), SNAS (1997), Koller (2002)

Výpočet štandardnej neistoty typu A vynásobiť korelačným koeficientom kA v závislosti od počtu meraní Hodnoty korelačného koeficientu

uA = kA.Sd Urban (2006)

n 2 3 4 5 6 7 8 9 10

8.

kA 7 2,3 1,7 1,4 1,3 1,3 1,2 1,2 1

Ľalík (2006)

9. Výpočet variačného koeficientu Cv (%) Cv = .100

(II.1)Sd

Rimarčík (2006)

10 Výpočet čiastkových neistôt typu B Predpokladáme rovnomerné rozdelenie pravdepodobnosti, t.j. κ = √3, ∆i = variačný koeficient zistený pri kalibrácii pipety a pod.

3∆iu Bi =

Eurachem (2000), Kazda (2006), Halaj (2004)

11. Výpočet štandardnej neistoty typu B Štandardná neistota typu B má zložkový charakter. uBi sú štandardné neistoty typu B pochádzajúce od jednotlivých zdrojov.

∑=

=n

1i

2BiB uu

Kazda (2006)

12. Výpočet kombinovanej štandardnej neistoty typu C

2B

2AC uuu += Koller

(2002) 13. Výpočet rozšírenej neistoty U

kde k je faktor pokrytia, pričom k = 2 čo zodpovedá konfidenčnej pravdepodobnosti približne 95 %.

U = k . uC Koller (2002), Halaj (2004)

103

3.2 Experiment 2 – príprava sekundárnych referenčných materiálov

3.2.1 Materiál

Na výrobu referenčných vzoriek sa použilo iba surové kravské mlieko. Odber mlieka

sa realizoval podľa STN EN ISO 707 (2001). Odber mlieka vykonával zootechnik

a doktorand. Mlieko pochádzalo z bazénu a od mastitídnych dojníc. Mlieko bolo okamžite po

odbere schladené na teplotu 6 °C. Prevoz mlieka sa realizoval v izotermických nádobách.

Mlieko bolo v laboratóriu uskladnené v chladničke pri teplote od 2 °C do 6 °C a bolo

spracované do 12 hodín od odberu.

3.2.2 Lokalita

Mlieko použité na výrobu referenčných materiálov pochádzalo z vybraného chovu RD

Rumanová.


Experiment prebiehal počas obdobia rokov 2004 a 2005. Pripravené boli 4 referenčné

vzorky. V prvej fáze experimentu boli pripravené dve referenčné vzorky, boli skúšané

v Národnom referenčnom laboratóriu pre mlieko a mliečne výrobky v Nitre. V druhej fáze

experimentu boli pripravené dve referenčné vzorky, ktoré boli skúšané v Národnom

referenčnom laboratóriu pre mlieko a mliečne výrobky v Nitre a v dvoch ďalších

akreditovaných skúšobných laboratóriách.

Experiment bol rozdelený nasledovne:

1. Príprava a skúšanie kvality referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických

buniek.

2. Príprava a skúšanie kvality referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických

buniek.

3. Príprava referenčných vzoriek s nízkym a vysokým počtom somatických

buniek, skúšanie kvality pripravených referenčných vzoriek v reálnych laboratórnych

podmienkach, porovnanie výsledkov stanovených v troch laboratóriách.

104

3.2.4 Prístroje, pomôcky a chemikálie

Prenosná chladiaca taška

Elektrická sušiareň

Uzatvárateľné zásobné fľaše o objeme 1 liter

Vzorkovnice o objeme 300 ml

Erlenmayerova banka o objeme 1 liter

Vodný kúpeľ 70 ± 2 °C

Kalibrovaný teplomer s teplotným rozsahom do 100 °C s presnosťou ± 0,5 °C

Prístroj Fossomatic 5000

Mikroskop Olympus BX51

Pracovné pomôcky a chemikálie pre mikroskopické stanovenie počtu somatických

buniek

Odmerný valec

Papierová vata

Alobal

Ochranné pracovné pomôcky

Dichroman draselný K2Cr2O7

Analytické váhy s presnosťou 0,001 g

3.2.5 Pracovný postup prípravy referenčných vzoriek

Na prípravu referenčných vzoriek sa použije čerstvé surové kravské mlieko,

maximálne 12 hodín od pôdoja, prepravované a uchovávané pri teplote od 2 °C do 6 °C.

V mlieku sa stanoví orientačný počet somatických buniek pomocou prístroja

Fossomatic 5000.

Vypočíta sa pomer riedenia mlieka na dosiahnutie požadovaného počtu somatických

buniek v referenčnej vzorke podľa rovnice materiálovej bilancie, ktorá je uvedená spolu

s príkladom v Prílohe 12.

Podľa vypočítaného pomeru sa nariedi požadované množstvo referenčnej vzorky.

Mlieko s nariedeným obsahom somatických buniek sa naleje do vysterilizovanej

erlenmayerovej banky a dôkladne sa premieša.

Z premiešaného mlieka sa odleje potrebné množstvo do 2 sterilných vzorkovníc za

účelom mikroskopického stanovenia počtu somatických buniek.

105

Erlenmayerová banka s mliekom sa umiestni do vodného kúpeľa o teplote

70 °C ± 2 °C. Mlieko sa pasterizuje vo vodnom kúpeli pri teplote 70 °C ± 2 °C po dobu

45 minút za občasného premiešania tyčinkou tak, aby sa na povrchu nevytvorila vrstva

(kožka) zrazených albumínových bielkovín. Čas sa začína merať až po dosiahnutí teploty

70 °C v mlieku. Teplota sa kontroluje pomocou kalibrovaného teplomera ponoreného priamo

do mlieka.

Po tepelnom ošetrení sa mlieko chemicky konzervuje pomocou dichromanu

draselného. Do mlieka sa pridáva dichroman draselný vo forme prášku v takom množstve aby

sa získal 0,1 % roztok. Navážky dichromanu draselného na určitý objem mlieka sú uvedené

v Prílohe 13, v Tabuľke 1. Dichroman draselný sa naváži do sterilnej vzorkovnice

a kvantitatívne sa pomocou malého množstva ošetreného mlieka prenesie do celkového

objemu ošetreného mlieka. Obsah erlenmayerovej banky sa dôkladne premieša.

Zakonzervované mlieko sa nadávkuje rozlievaním do vopred pripravených

vysterilizovaných vzorkovníc. Vzorkovnice sa uzatvoria.

Po vychladnutí na laboratórnu teplotu sa pripravené vzorky umiestnia do chladničky

a skladujú sa pri teplote od 2 °C do 6 °C maximálne po dobu 1 mesiaca.

Stanovenie počtu somatických buniek.

Mikroskopickou metódou sa stanoví počet somatických buniek v nezakonzervovanom

nariedenom mlieku. Vypočíta sa štandardná odchýlka a variačný koeficient.

Pomocou prístroja Fossomatic 5000 sa stanoví počet somatických buniek

v pripravených zakonzervovaných vzorkách. Priemerný počet somatických buniek sa stanoví

z výsledkov meraní minimálne 3 vzorkovníc (minimálne 18 výsledkov). Prístroj vypočíta

nasledovné hodnoty: priemernú hodnotu počtu somatických buniek, variačný koeficient

a štandardnú odchýlku.

Priemerná hodnota počtu somatických buniek stanovená prístrojom Fossomatic 5000

sa porovná s priemernou hodnotou počtu somatických buniek stanovenou mikroskopickou

metódou.

Priemerná hodnota stanovená referenčnou mikroskopickou metódou sa musí

pohybovať v intervale variačného koeficientu vypočítaného prístrojom Fossomatic 5000 pri

meraní vyššie uvedených 3 vzorkovníc.

V prípade nezhody priemerných výsledkov oboch metodík sa vykoná opätovná

analýza alebo sa pripravená vzorka vyleje.

106

Po stanovení presného počtu somatických buniek sa vystaví validačný protokol.

Validačný protokol musí obsahovať:

- názov laboratória, ktoré pripravilo referenčnú vzorku spolu s adresou a kontaktom,

- názov laboratória ktorému bude vzorka zaslaná,

- číslo referenčnej vzorky,

- dátum prípravy referenčnej vzorky,

- dátum odoslania referenčnej vzorky,

- dátum expirácie referenčnej vzorky,

- podpis zodpovedného pracovníka,

- priemerný počet somatických buniek v ml-1, stanovené rozpätie,

- stanovené počty somatických buniek v referenčnej vzorke v ml-1,

- štandardnú odchýlku v ml-1,

- variačný koeficient v %,

- spôsob manipulácie s referenčnou vzorkou,

- návod na použitie referenčnej vzorky,

- údaje o kontrole pripravenej referenčnej vzorky.

Príklad validačného protokolu je uvedený v Prílohe 14 v Tabuľke 1. Po vystavení

validačného protokolu sa vzorka môže deklarovať ako referenčná.

Referenčné vzorky sa označia etiketou, ktorá musí obsahovať: číslo šarže, dátum

expirácie, priemernú hodnotu počtu somatických buniek a interval počtu somatických buniek

stanovený na základe výpočtu štandardnej odchýlky.

Referenčné vzorky sa uchovávajú pri teplote od 2 °C do 6 °C. Referenčné vzorky sa

distribuujú v izotermických chladiacich boxoch pri teplote od 2 °C do 6 °C. Vzorky by mali

byť stabilné počas jedného mesiaca od ich výroby.

Kontrola kvality referenčných vzoriek

Kvalitu referenčných vzoriek je nutné kontrolovať minimálne 3 x do týždňa počas

celej dĺžky ich expirácie. Kontrola sa vykoná stanovením počtu somatických buniek na

prístroji Fossomatic 5000 a porovnaním výsledku s hodnotami uvedenými na validačnom

protokole.

107

V prípade zistenia nezhody výsledkov sa najskôr skontroluje prístroj Fossomatic 5000,

následne sa zmerajú ďalšie dve referenčné vzorky. V prípadne potvrdenia sa nezhody

výsledkov sa ihneď upovedomia laboratóriá do ktorých bola referenčná vzorka zaslaná

a oznámi sa im poškodenie kvality referenčných vzoriek.

Pred prípravou referenčnej vzorky sa vykoná kontrola mikrobiálnej kvality mlieka.

Stanoví sa celkový počet mikroorganizmov platňovou metódou za použitia noriem STN EN

ISO 4833 (2003), STN ISO 7218 (2000), STN EN ISO 8261 (2001), STN ISO 6887-1

(1999) vo vzorke mlieka s namiešaným počtom somatických buniek ešte pred vykonaním

tepelného ošetrenia. Celkový počet mikroorganizmov sa stanoví aj v zakonzervovanej vzorke.

Na základe výsledkov mikrobiologického skúšania sa zistí účinnosť pasterizácie

a chemického ošetrenia.

3.2.6 Skúšanie kvality pripravených referenčných vzoriek

Prvé dve referenčné vzorky, vzorka s nízkym a vzorka s vysokým počtom

somatických buniek sa pripravia a odskúšajú len v Národnom referenčnom laboratóriu pre

mlieko a mliečne výrobky v Nitre. Po vyhodnotení ich kvality sa pripravia ďalšie referenčné

vzorky, ktoré sa budú skúšať v reálnych laboratórnych podmienkach v troch akreditovaných

laboratóriách (Národné referenčné laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky v Nitre,

laboratórium 2, laboratórium 3). Laboratóriá sa uvedú kvôli anonymite pod kódom.

Vo všetkých vzorkách sa bude počas celej doby trvania experimentu stanovovať počet

somatických buniek pomocou automatických prístrojov (Fossomatic 5000 resp. Combi Foss

6000).

3.2.7 Štatistické vyhodnotenie experimentu 2 – príprava sekundárnych referenčných

materiálov

Pre vyhodnotenie výsledkov experimentu 2 (Tabuľka 26, Obrázok 3, Tabuľka 27,

Obrázok 4, Tabuľka 28, Tabuľka 29, Tabuľka 30 a Tabuľka 31) sme vypočítali aritmetický

priemer meraní počtu somatických buniek, štandardnú odchýlku a variačný koeficient.

Priemerné výsledky sa porovnali voči referenčnej hodnote, ktorá sa určila na začiatku

experimentu.

108

Priemerné výsledky sa ďalej porovnali voči internému limitu, ktorý bol daný

štandardnou odchýlkou, ktorá sa stanovila na začiatku experimentu pri určovaní referenčnej

hodnoty počtu somatických buniek v pripravovanej referenčnej vzorke.

Priemerné výsledky sa taktiež porovnali voči externému limitu, ktorý sa určil

odborným odhadom a predstavoval približne dvojnásobok štandardnej odchýlky vypočítanej

z hodnôt nameraných prístrojom Fossomatic 5000 pri určovaní počtu somatických buniek

(18 výsledkov) v pripravovanej referenčnej vzorke.

Priemerné výsledky jednotlivých meraní sa zoradili za sebou na časovú os v podobe

grafu a určil sa trend za obdobie experimentu (stabilita referenčného materiálu).

Výsledky druhej fázy experimentu 2 sa okrem vyššie uvedeného postupu porovnali

navzájom.

Výsledky sa porovnali s výsledkami zistenými Vermuntom et al. (1995).

109

3.3 Experiment 3 – porovnanie výsledkov mikroskopických metód

3.3.1 Materiál

Na skúšanie sa použili vzorky mlieka konzervované 0,02 % w/w bronopolom. Vzorky

mlieka boli doručené v izotermických nádobách. Celkovo bolo doručených 16 vzoriek mlieka

v sklenených fľaštičkách o objeme 3 ml. Počet somatických buniek vo vzorkách sa pohyboval

v rozmedzí od 200 000 do 800 000 . ml-1. Vzorky sa do prípravy preparátov uchovávali pri

teplote 4 °C. Po príprave preparátov sa vzorky mlieka ihneď analyzovali.

3.3.2 Analýza vzoriek

Na skúšanie sa použili vzorky pripravené v A.I.A. Laboratorio Standard Latte, Via

dell` Industria 24, 000 57 Maccarese, Rím, Taliansko. Do kolaboratívnej štúdie boli zapojené

nasledovné laboratóriá (Tabuľka 14):

Účastníci kolaboratívnej štúdie stanovenia počtu somatických buniek metódou

ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005)

Tabuľka 14

AIA LABORATORIO STANDARD LATTE Taliansko BFEL KIEL Nemecko CECALAIT Francúzsko CENTRO NATIONAL DE ALIMENTACION A.E.S.A. Španielsko CLO-DVK Belgicko COKZ Holandsko IST.SUPERIORE DI SANITA' / IST.ZOOPROFILATTICO (RM) Taliansko ISTITUTO SPERIMENTALE PER LA ZOOTECNIA Taliansko LABORATORIO AGROALIMENTARIO DE SANTANDER Španielsko MILK CONTROL STATION NEDERLAND Holandsko NAT.REF.LABORATORY FOR MILK AND MILK PRODUCTS Slovensko NATIONAL VETERINARY AND FOOD RESEARCH INSTITUTE, EELA

Fínsko

NATIONAL VETERINARY LABORATORY Litva NATIONAL VETERINARY RESEARCH INSTITUTE Poľsko RIKILT INSTITUTE OF FOOD SAFETY Holandsko S.VET.MED.DIAGNOSTIC C.OF FOOD AND VET.SER.FOOD CONT. LAB

Lotyšsko

VETERINARY AND FOOD LABORATORY Estónsko (Orlandini, 2005)

110


- august 2005: rozosielanie prihlášok do kolaboratívnej štúdie,

- september 2005: zaslanie dokumentov, návrhu normy ISO/WD 13366-1 IDF 148-1,

inštrukcií a elektronického formuláru pre zaznamenávanie výsledkov,

- október 2005: distribúcia laboratórnych vzoriek,

- 10 až 14. október 2005: príprava preparátov,

- 21. október 2005: zasielanie stanovených výsledkov,

- 31. december 2005: vyhotovenie záverečnej správy.

3.3.4 Pracovný postup

1. Pripraviť 2 preparáty z každej vzorky pre metódy A, B a D (spolu 96 preparátov).

2. Mikroskopicky stanoviť počet somatických buniek v pripravených preparátoch.

3. Porovnať a štatisticky vyhodnotiť výsledky stanovené metódami A, B, C, D, E, F.

Výsledky metód A, B a D sa stanovia v NRLM.

Výsledky metódy C sa stanovia v AIA – Laboratorio Standard Latte v Ríme pomocou

prístroja Fossomatic.

Výsledky metódy E a F sa stanovia laboratóriami zúčastnenými v kolaboratívnej štúdii.

Poznámka:

Všetky vzorky sa musia analyzovať len jedným laborantom.

Pri výpočte sa musí použiť ten istý prepočítavací faktor pre každú vzorku.

Mikroskopické počítanie somatických buniek v preparáte sa musí vykonať bez prerušenia.

Výpočet koncentrácie somatických buniek v 1 ml vzorky sa vykonal podľa vzorca

uvedeného v Tabuľke 15.

111

Vzorec pre výpočet koncentrácie somatických buniek v 1 ml vzorky podľa návrhu

normy ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005)

Tabuľka 15

c = VmBf

NHrWr

..2

Df.

..2

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛π

c = koncentrácia somatických buniek v 1 ml vzorky Vypočíta sa

Wr = šírka náteru 20 mm

Hr = dĺžka náteru 5 mm

N = celkový počet zrátaných buniek Zistí sa mikroskopovaním

Df = priemer zorného poľa v mm 0,36 mm

bf = počet kompletne zrátaných zorných polí Kvôli splneniu podmienky

kolaboratívnej štúdie sa bude počítať v

168 zorných poliach u každého

analyzovaného preparátu.

0,01 ml

IDF 148A (1995)

Vm = množstvo naneseného mlieka

0,005 ml

ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005) Návrh normy ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005) udáva, že vo všeobecnosti sú bunky

v mlieku rozptýlené podľa Poisonovho rozdelenia. Poisonovo rozdelenie predpokladá že:

M = V = sd

Kde: M – je stredná hodnota

V – je rozptyl

Sd – je štandardná odchýlka

Variačný koeficient Cv = % 100.Msd alebo Cv =

ds% 100 alebo Cv =

M% 100

Kde: M – je stredná hodnota, v prípade počítania počtu somatických buniek je to počet

zrátaných častíc (buniek).

112

Z uvedeného vyplýva, že minimálny počet buniek (N), ktorý je nevyhnutné napočítať

pri mikroskopovaní v závislosti od množstva buniek vo vzorke a za účelom splnenia

podmienky variačného koeficientu (Cv) je nasledovný (Tabuľka 16):

Minimálny počet buniek, ktorý je nevyhnutné napočítať pri mikroskopovaní v závislosti

od počtu somatických buniek vo vzorke a splnenia podmienky variačného koeficientu

Tabuľka 16

Koncentrácia buniek . ml-1 Cv (%) N (bunky)

< 150 000 10 100

150 000 – 250 000 7 200

250 000 – 400 000 6 300

≥ 400 000 5 400

3.3.5 Štatistické vyhodnotenie experimentu 3 - porovnanie výsledkov mikroskopických

metód


rozptylu (ANOVA) bez interakcií. Na mnohonásobné porovnanie metód sa použil Tukeyov

test a Sheffeho test. Pre vzájomné porovnanie metód boli vypočítané korelačné koeficienty

(Príloha 17, Tabuľka 2). Výpočet sa uskutočnil v profesionálnom štatistickom programe

STATISTICA CZ.

113

4 VÝSLEDKY

4.1 Vvyhodnotenie experimentu 1 - stanovenie počtu somatických buniek v surovom

kravskom mlieku referenčnou metódou


rozptylu (ANOVA) bez interakcií.

Dvojfaktorová ANOVA bez interakcií sa riadi modelom

Yijp = µ + αi + βj + eijp,

kde µ, αi, βj (i =1,2, ..., I; k = 1,2, ... ,J; p = 1,2, ...,nij) sú neznáme parametre a eijp sú nezávislé

veličiny s rozdelením N (0, σ2). Parametre αi, βj vyjadrujú po rade riadkové a stĺpcové efekty,

µ je absolútny člen. Budeme sa zaoberať iba vyváženými modelmi, teda nij = n pre i =1,2, ...,

I; k = 1,2, ...,J.

Faktor A pôsobí na I úrovniach a faktor B na J úrovniach. Predpokladajme, že efekty

faktorov A, B sa nasčítajú do stredných hodnôt premenných a pôsobia aditívne.

V našom prípade Faktor A je Sample (vzorka) a pôsobí na deväťdesiatich úrovniach,

faktor B je Method (metóda) a pôsobí na troch úrovniach.

Zaujíma nás len testovanie hypotézy H0: β1 = β2 = β3 proti H1: existujú také i,j (i ≠ j),

pre ktoré platí βi ≠ βj, kde βi je príspevkom k strednej hodnote počtu somatických buniek pre

i-tu metódu.

Výpočet sa uskutočnil v profesionálnom štatistickom programe STATISTICA CZ.

Použila sa štandardná ANOVA hlavných efektov. Na mnohonásobné porovnávanie metód bol použitý Tukeyov test a Sheffeho test.

114

Zdrojové údaje počtu somatických buniek pre analýzu rozptylu – výsledky stanovenia

počtu somatických buniek v surovom kravskom mlieku metódami A, B, C

Tabuľka 17

Metóda Metóda Interné číslo

vzorky

Poradové číslo

A B C Interné číslo

vzorky

Poradové číslo

A B C

F25 1 747 100 895 555 881 750 F71 46 147 157 164 001 161 500F26 2 202 525 199 335 185 250 F72 47 247 530 256 001 246 500F27 3 186 342 197 667 191 250 F73 48 171 154 171 556 168 750F28 4 555 556 567 259 532 500 F74 49 212 122 212 001 211 500F29 5 278 818 317 778 270 250 F75 50 185 416 187 556 188 500F31 6 89 723 100 000 100 500 F76 51 118 241 132 889 130 000F32 7 223 891 243 212 233 500 F77 52 373 649 381 905 365 750F33 8 248 764 260 635 241 750 F78 53 282 290 291 112 290 000F34 9 762 037 762 857 743 000 F79 54 269 753 282 074 276 786F35 10 651 672 668 335 653 750 F81 55 370 372 385 999 388 500F36 11 353 150 398 938 391 750 F82 56 319 444 332 000 336 750F37 12 274 073 289 220 267 167 F83 57 135 556 162 667 155 000F38 13 278 123 282 043 278 250 F84 58 318 254 320 000 324 000F39 14 318 651 324 337 320 500 F89 59 562 963 585 777 562 056F40 15 223 058 252 000 233 000 F90 60 146 946 158 667 137 500F41 16 308 889 323 528 316 000 F91 61 191 946 218 000 201 000F42 17 53 889 50 000 50 500 F92 62 656 945 719 332 715 500F43 18 168 890 175 333 172 000 F93 63 370 372 393 333 374 500F44 19 105 926 114 667 108 500 F94 64 262 344 268 666 274 500F45 20 247 036 261 111 251 250 F95 65 120 926 129 334 138 500F46 21 202 627 229 001 210 000 F96 66 124 815 135 112 125 250F47 22 194 823 225 778 205 250 F97 67 132 949 156 889 150 250F48 23 116 112 140 000 138 250 F98 68 247 221 277 333 258 500F49 24 247 530 249 111 241 250 F99 69 774 818 803 764 870 000F50 25 179 451 199 334 197 000 F100 70 279 512 323 333 291 000F51 26 135 989 149 334 149 750 F101 71 568 056 557 779 558 821F52 27 178 525 190 223 176 750 F102 72 372 687 372 741 379 125F53 28 148 333 168 001 166 750 F103 73 319 576 344 593 336 063F54 29 232 963 249 778 238 000 F105 74 445 185 476 333 453 500F55 30 130 926 155 556 141 500 F106 75 278 933 295 062 291 000F56 31 200 725 218 667 209 500 F108 76 216 887 241 481 230 333F57 32 318 651 323 945 317 500 F109 77 446 296 458 888 448 679F58 33 113 426 132 889 123 750 F110 78 224 796 247 407 233 438F59 34 204 293 217 778 214 000 F111 79 203 535 234 074 201 167F60 35 179 131 198 223 174 500 F112 80 505 290 539 554 516 208F61 36 153 625 168 445 167 250 F113 81 448 888 507 676 516 208F62 37 267 938 285 556 275 750 F114 82 221 634 234 074 230 458F63 38 159 923 175 556 167 750 F115 83 457 222 536 888 510 828F64 39 212 122 234 238 215 500 F116 84 279 859 316 296 300 103F65 40 193 602 213 778 200 250 F117 85 560 186 594 567 547 292F66 41 234 568 270 223 234 667 F118 86 645 767 674 445 670 333F67 42 223 335 234 223 221 000 F119 87 318 518 328 518 327 667F68 43 653 336 700 445 677 750 F121 88 622 994 670 002 647 343F69 44 464 449 505 334 500 500 F122 89 248 647 293 703 271 367F70 45 166 072 186 223 176 000 F123 90 567 659 600 493 571 481

115

ANOVA tabuľka

Tabuľka 18

Súčet štvorcov Stupne voľnosti

Priemerný súčet štvorcov

F P

Absolútny člen 2,563255E+13 1 2,563255E+13 143265,5 0,00000

Sample 8,303247E+12 89 9,329491E+10 521,4 0,00000 Method 2,034400E+10 2 1,017200E+10 56,9 0,00000 Chyba 3,184712E+10 178 1,789164E+08 - -

Podľa ANOVA tabuľky (Tabuľka 18) hypotézu o rovnosti stredných hodnôt H0: β1 =

β2 = β3 zamietame, lebo P-hodnota pre faktor Method je menšia ako 0,01.

95 % intervaly spoľahlivosti pre rôzne typy metód sú uvedené na Obrázku 2. Výsledky

použitých metód A, B, C sa v priemere významne líšia.

Obrázok 2. Porovnanie metód A, B, C. Na obrázku sú uvedené stredné hodnoty počtu

somatických buniek pre metódy A,B,C a ich 95 % intervaly spoľahlivosti.

116

Opisné charakteristiky

Opisné štatistiky a intervaly spoľahlivosti pre metódy A, B, C sú uvedené v Tabuľke 19.

Opisné štatistiky a intervaly spoľahlivosti pre strednú hodnotu počtu somatických

buniek

Tabuľka 19

Metóda Priemer priemerných výsledkov

Štandardná chyba

Dolná hranica 95 %

Horná hranica 95 %

Počet priemerných výsledkov

(n) A 297398,7 1409,950 294616,3 300181,1 90 B 318659,0 1409,950 315876,6 321441,3 90 C 308289,9 1409,950 305507,5 311072,2 90

Mnohonásobné porovnávanie metód

Tukeyov test (Tabuľka 20) aj Sheffeho test (Tabuľka 21) dávajú rovnaké výsledky.

Z Tukeyovho HSD testu vyplýva, že významné rozdiely sú medzi priemernými výsledkami

každých dvoch metód. Významné rozdiely medzi priemermi sú u metód, ktorých P-hodnota je

vyznačená červenou farbou (P-hodnota < 0,05), teda medzi metódami A-B, B-C a A-C.

Približné pravdepodobnosti (P-hodnoty) pre Tukeyov HSD test

Tabuľka 20

A

Priemer (297398,7) B

Priemer (318659,0) C

Priemer (308289,9) A - 0,000022 0,000022 B 0,000022 - 0,000022 C 0,000022 0,000022 -

Približné pravdepodobnosti (P-hodnoty) pre Scheffeho test

Tabuľka 21

A

Priemer (297398,7) B

Priemer (318659,0) C

Priemer (308289,9) A - 0,000000 0,000001 B 0,000000 - 0,000003 C 0,000001 0,000003 -

117

Výpočet neistôt pre metódu A

Výpočet neistoty typu A (pri spôsobe počítania do 400 buniek)

Tabuľka 22

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. xi xs ∆ xi ∆ xi

2 Sd uA Cv i

[SB.ml-1] [SB.ml-1] [SB.ml-1] [SB.ml-1] 1)(n∆x 2

i

−∑

[SB.ml-1] [SB.ml-1] % 1 444 444 -3111,20 9679565,44 2 446 666 -889,20 790676,64 3 444 444 -3111,20 9679565,44 4 450 000 2444,80 5977047,04 5 446 666 -889,20 790676,64 6 451 111 3555,80 12643713,647 450 000 2444,80 5977047,04 8 447 777 221,80 49195,24 9 444 444 -3111,20 9679565,44 10 450 000

2444,80 5977047,04 priemer suma

447555,2 61244099,6 6804899,95 2608,62 2608,62 0,5829

Výpočet neistoty typu A (pri kompletnom zrátaní pruhov)

Tabuľka 23

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. xi xs ∆ xi ∆ xi

2 Sd uA Cv i


i

−∑

[SB.ml-1] [SB.ml-1] % 1 417 590 -4166,60 17360555,562 399 997 -21759,60 473480192,163 424 071 2314,40 5356447,36 4 431 479 9722,40 94525061,765 410 646 -11110,60 123445432,366 405 553 -16203,60 262556652,967 430 090 8333,40 69445555,568 440 275 18518,40 342931138,569 416 201 -5555,60 30864691,3610 441 664

19907,40 396304574,76 priemer suma

421756,6 1816270302,4 201807811,3 14205,9 14205,9 3,3683

118

10.

Výpočet čiastkových neistôt typu B

V metóde A boli na základe analýzy pracovného postupu stanovené dve čiastkové

neistoty typu B.

uB1 - na pipetovanie mlieka bola použitá kalibrovaná pipeta s hodnotou objemu 1000 µl, ktorej

chyba stanovená na základe kalibrácie je 0,103591602 %. Predpokladá sa rovnomerné

rozdelenie pravdepodobnosti, t.j. κ = √3

% 90,05980863 3

20,10359160u B1 ==

uB2 - na pipetovanie mlieka bola použitá kalibrovaná pipeta s hodnotou objemu 10 µl pipeta,

ktorej chyba stanovená na základe kalibrácie je 1,226818956 %. Predpokladáme

rovnomerné rozdelenie pravdepodobnosti, t.j. κ = √3

361,22681895u B2 = = 0,708304254 %

11.

Výpočet štandardnej neistoty typu B.

2B2

2B1B uu u +=

% 60,7108248640,70830425 90,05980863 u 22B =+=

12.

Výpočet kombinovanej štandardnej neistoty typu C.

2B

2AC uu u +=

22C 60,71082486 0,5829 u += = 0,919237614 % pri spôsobe počítania do 400 buniek

22C 60,71082486 3,3683 u += = 3,4424870 % pri kompletnom počítaní pruhov

119

13.

Výpočet rozšírenej neistoty U

U = k.uC

U = 2 . 0,919237614 = 1,838475227 % = 2 % pri spôsobe počítania do 400 buniek

U = 2 . 3,4424870 = 6,884974039 % = 7 % pri kompletnom počítaní pruhov

U = 2 % (platí pri stanovení počtu somatických buniek počítaním do 400 buniek).

U = 7 % (platí pri stanovení počtu somatických buniek v siedmych kompletne zrátaných

pruhoch v prípade vzorky s veľmi vysokým obsahom somatických buniek ako aj v prípade

vzorky s veľmi nízkym obsahom somatických buniek kedy sa kompletne zráta minimálne

12 pruhov).

Výpočet neistôt pre metódu B

Výpočet neistoty typu A (pri spôsobe počítania do 400 buniek)

Tabuľka 24

1 2 3 4 5 6 7 8 9 xi xs ∆ xi ∆ xi

2 Sd uA CV i


i

−∑

[SB.ml-1] [SB.ml-1] % 1 487 272 10939,20 119666096,642 484 848 8515,20 72508631,04 3 484 848 8515,20 72508631,04 4 487 272 10939,20 119666096,645 447 777 -28555,80 815433713,646 492 121 15788,20 249267259,247 457 777 -18555,80 344317713,648 444 444 -31888,80 1016895565,449 487 272 10939,20 119666096,6410 489 697

13364,20 178601841,64 priemer suma

476332,8 3108531645,6 345392405,06 18584,735 18584,735 3,9016

120

Výpočet neistoty typu A (pri kompletnom zrátaní pruhov)

Tabuľka 25

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. xi xs ∆ xi ∆ xi

2 Sd uA CV i


i

−∑

[SB.ml-1] [SB.ml-1] % 1 491 111 20667,10 427129022,412 481 111 10667,10 113787022,413 476 666 6222,10 38714528,41 4 468 888 -1555,90 2420824,81 5 427777 -42666,90 1820464355,616 495 555 25111,10 630567343,217 457 777 -12666,90 160450355,618 431 111 -39332,90 1547077022,419 485 555 15111,10 228345343,2110 488 888

18444,10 340184824,81 priemer suma

470443,9 5309140642,9 589904515,8 24287,95 24287,95 5,1628

10.

Výpočet čiastkových neistôt typu B

V metóde B boli na základe analýzy pracovného postupu stanovené tri čiastkové

neistoty typu B.

uB1 - na pipetovanie mlieka bola použitá kalibrovaná pipeta s hodnotou objemu 1000 µl, ktorej

chyba je 0,103591602 %. Predpokladáme rovnomerné rozdelenie pravdepodobnosti, t.j.

κ = √3

% 90,05980863 3

20,10359160u B1 ==

uB2 - na pipetovanie mlieka bola použitá kalibrovaná pipeta s hodnotou objemu 1000 µl,

ktorej chyba je 0,103591602 %. Predpokladáme rovnomerné rozdelenie

pravdepodobnosti, t.j. κ = √3

121

% 90,05980863 3

20,10359160u B2 ==

uB3 - na pipetovanie mlieka bola použitá kalibrovaná pipeta s hodnotou objemu 10 µl pipeta,

ktorej dovolená chyba je 1,226818956 %. Predpokladáme rovnomerné rozdelenie

pravdepodobnosti, t.j. κ = √3

% 40,70830425 3

61,22681895u B3 ==

11.

Výpočet štandardnej neistoty typu B.

3B3

2B2

2B1B uuu u ++=

% 10,7133365740,70830425 90,05980863 90,05980863 u 222B =++=

12.

Výpočet kombinovanej štandardnej neistoty typu C.

2B

2AC uu u +=

22C 10,71333657 3,9016 u += = 3,966302213 % pri spôsobe počítania do 400 buniek.

22C 10,71333657 5,1628 u += = 5,21184735 % pri kompletnom spočítaní pruhov

13.

Výpočet rozšírenej neistoty U.

U = k.uC

U = 2 . 3,966302213 = 7,932604426 % = 8 % pri spôsobe počítania do 400 buniek

U = 10,42369471992 pri kompletnom spočítaní pruhov

U = 8 % (platí pri stanovení počtu somatických buniek počítaním do 400 buniek)

U = 10 % (platí pri stanovení počtu somatických buniek v minimálne dvanástich kompletne

zrátaných pruhoch – pri vzorke s nízkym počtom somatických buniek)

122

4.1.1 Zhrnutie výsledkov experimentu 1 - stanovenie počtu somatických buniek

v surovom kravskom mlieku referenčnou metódou

Výsledky metód A, B, C, sa významne líšia. Z porovnania priemerných výsledkov

vyplýva, že najnižšie výsledky počtu somatických buniek boli stanovené metódou A, následne

metódou C, a najvyššie výsledky počtu somatických buniek boli stanovené metódou B.

Výsledky stanovené metódou A boli o 21 000 somatických buniek . ml-1 nižšie

v porovnaní s výsledkami metódy B a o 11 000 somatických buniek . ml-1 nižšie v porovnaní

s výsledkami metódy C. Výsledky metódy B boli o 10 000 somatických buniek . ml-1 vyššie

v porovnaní s výsledkami metódy C.

Štatisticky zistený rozdiel medzi metódami A a C a rovnako B a C neprekračuje

hodnotu 5 %, ktorá predstavuje variačný koeficient pri meraní na prístroji Fossomatic (metóda

C) na hladine 300 000 somatických buniek . ml-1. Z uvedeného vyplýva, že metódy A a B sa

môžu zaviesť do praxe.

Rozšírená neistota merania vypočítaná pre metódu A je 2 %, resp. 7 % v závislosti od

použitého spôsobu počítania jadier somatických buniek.

Rozšírená neistota merania vypočítaná pre metódu B je 8 %, resp. 10 % v závislosti

od použitého spôsobu počítania jadier somatických buniek.

123

4.2 Vyhodnotenie experimentu 2 – príprava sekundárnych referenčných materiálov

Vyhodnotenie bodu 1 experimentu 2 (Príprava a skúšanie kvality referenčnej vzorky

s nízkym počtom somatických buniek):

Referenčná vzorka bola pripravená z bazénovej vzorky mlieka odobratej dňa 1.3.2004,

do ktorej nebolo primiešané ďalšie mlieko (Tabuľka 26). Celkový počet mikroorganizmov

v mlieku pred konzerváciou vzorky bol 12 . 103 KTJ (4,08 log). Po konzervácii neboli

vo vzorke vykultivované žiadne mikroorganizmy, referenčná vzorka bola sterilná.

Výsledky skúšania referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek sú uvedené na

Obrázku 3.

Príprava referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek

Tabuľka 26 Výsledky stanovené referenčnou metódou

[SB.ml-1]

Výsledky stanovené inštrumentálnou metódou [SB.ml-1]

Metóda A Experiment 1

Metóda B Experiment 1

Metóda C Experiment 1

222 224 248 889 229 000 250 000 239 000 247 000 255 000 231 000248 147 258 667 239 000 223 000 239 000 237 000 240 000 242 000Výsledky

stanovení 228 518 241 778 246 000 260 000 235 000 240 000 250 000 242 000232 963 249 778 Aritmetický

priemer 241 371 241 333

Sd 13 521,05769 8 479,52 9 120,114 Cv % 5,803950708 3,39482 3,779053

Splnená Splnená Podmienka:* Splnená

Interval: 241 333 ± 9 120 [SB.ml-1] <232 213 – 250 453>

*Priemerná hodnota stanovená referenčnou mikroskopickou metódou sa musí pohybovať

v intervale variačného koeficientu vypočítaného prístrojom Fossomatic 5000 pri meraní

referenčnej vzorky. Interný limit: ± 9 120 [SB.ml-1]. Externý limit ± 20 000 [SB.ml-1].

124

Výsledky skúšania referenčnej vzorky s nízkym počtom somaticých buniek

211 000213 000215 000217 000219 000221 000223 000225 000227 000229 000231 000233 000235 000237 000239 000241 000243 000245 000247 000249 000251 000253 000255 000257 000259 000261 000263 000265 000267 000269 000271 000

4.3.04

6.3.04

8.3.04

10.3.04

12.3.04

14.3.0416.3.04

18.3.04

20.3.04

22.3.04

24.3.04

26.3.04

28.3.04

30.3.04

1.4.04

3.4.045.4.04

7.4.04

9.4.04

11.4.04

13.4.04

15.4.04

17.4.04

19.4.04

21.4.04

23.4.04

25.4.0427.4.04

29.4.04

1.5.04

3.5.04

5.5.04

7.5.04

9.5.04

11.5.04

13.5.04

15.5.04

17.5.0419.5.04

21.5.04

23.5.04

25.5.04

27.5.04

29.5.04

31.5.04

2.6.04

4.6.04

6.6.048.6.04

10.6.04

12.6.04

14.6.04

16.6.04

18.6.04

dátum skúšania

hlad

ina

som

atic

kých

bun

iek

NRLM

Dátum 4.3. 04 5.3. 04 16.3. 04 23.3. 04 24.3. 04 1.4. 04 8.4. 04 16.4. 04 19.4. 04 29.4. 04 4.5. 04 6.5. 04 7.5. 04 11.5. 04 17.5. 04 28.5. 04 4.6. 04 9.6. 04 17.6. 04 18.6. 04 Priemer SB.ml-1 235 900 233 750 234 750 239 500 238 250 237 250 233 250 236 750 230 000 237 750 231 500 234 000 237 250 233 750 236 375 239 667 239 000 239 500 241 250 241 100 Sd SB.ml-1 13 552 7 667 1 500 5 802 8 421 3 304 7 365 8 342 11 972 5 737 9 713 8 315 15 500 6 752 6 718 6 683 6 512 7 681 6 702 11 396 Cv % 5,74 3,28 0,64 2,42 3,53 1,39 3,16 3,52 5,21 2,41 4,20 3,55 6,53 2,89 2,84 2,79 2,72 3,21 2,78 4,73 Legenda: Priemerný počet somatických buniek v referenčnej vzorke Interval kvality udávaný na komerčne dostupných vzorkách Interval kvality vyplývajúci zo štandardnej odchýlky Sd Trendová čiara

Obrázok 3. Výsledky skúšania referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek

125

Vyhodnotenie bodu 2 experimentu 2 (Príprava a skúšanie kvality referenčnej vzorky

s vysokým počtom somatických buniek):

Referenčná vzorka bola pripravená z mlieka pochádzajúceho od individuálnej dojnice

dňa 11. 5. 2004 (Tabuľka 27). K mlieku nebolo primiešané ďalšie mlieko. Celkový počet

mikroorganizmov v mlieku pred konzerváciou bol 45.103 KTJ (4,65 log). Po konzervácii

neboli vo vzorke vykultivované žiadne mikroorganizmy, referenčná vzorka bola sterilná.

Výsledky skúšania referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek sú uvedené

na Obrázku 4.

Príprava referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek


[SB.ml-1]





570 834 582 222 553 000 601000 606 000 565 000 561 000 586 000555 556 589 332 585 000 572 000 560 000 560 000 563 000 544 000

Výsledky stanovení 562 500 546 665 569 000 563 000 565 000 583 000 564 000 559 000

562 963 572 740 Aritmetický priemer 567 852

569 944

Sd 7 649,5313 22 859,4446 16202,65854 Cv % 1,3587974 3,991245221 2,842848755

Splnená Splnená Podmienka:* Splnená

Interval: 569 944 ± 16 203 [SB.ml-1] <553 741 – 586 147>



referenčnej vzorky.

Interný limit: ± 16 203 [SB.ml-1]. Externý limit ± 30 000 [SB.ml-1].

126

Výsledky skúšania referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek

539 000542 000545 000548 000551 000554 000557 000560 000563 000566 000569 000572 000575 000578 000581 000584 000587 000590 000593 000596 000599 000602 000605 000608 000611 000614 000617 000620 000623 000626 000629 000632 000635 000638 000

11.5.0412.5.0413.5.0414.5.0415.5.0416.5.0417.5.0418.5.0419.5.0420.5.0421.5.0422.5.0423.5.0424.5.0425.5.0426.5.0427.5.0428.5.0429.5.0430.5.0431.5.041.6.042.6.043.6.044.6.045.6.046.6.047.6.048.6.049.6.0410.6.0411.6.0412.6.0413.6.0414.6.0415.6.0416.6.0417.6.0418.6.0419.6.0420.6.0421.6.0422.6.0423.6.0424.6.0425.6.0426.6.0427.6.0428.6.0429.6.0430.6.041.7.042.7.043.7.044.7.045.7.046.7.047.7.048.7.049.7.0410.7.0411.7.0412.7.0413.7.0414.7.0415.7.0416.7.0417.7.0418.7.0419.7.0420.7.0421.7.0422.7.0423.7.0424.7.0425.7.0426.7.0427.7.0428.7.0429.7.0430.7.0431.7.041.8.042.8.043.8.044.8.04

dátum skúšania

hlad

ina

som

atic

kých

bun

iek

NRLM

Dátum 11.5. 04 13.5. 04 14.5. 04 18.5. 04 21.5. 04 24.5. 04 26.5. 04 28.5. 04 1.6. 04 4.6. 04 9.6. 04 17.6. 04 18.6. 04 25.6. 04 1.7. 04 2.7. 04 6.7. 04 9.7. 04 15.7. 04 22.7. 04 27.7. 04 3.8. 04 4.8. 04 Priemer SB.ml-1 558 375 568 375 575 250 576 000 586 000 587 500 594 500 582 333 591 000 598 667 573 500 605 500 598 000 607 125 595 500 635 667 585 167 592 500 572 625 596 375 586 250 595 333 588 833

Sd SB.ml-1 29 115 10 141 21 125 16 912 11 576 12 276 18 469 15 807 9 823 21 584 10 909 9 678 10 755 8 560 2 121 11 003 8 909 16 750 9 709 19 071 6 882 8 406 26 026 Cv % 5,21 1,78 3,67 2,94 1,98 2,09 3,11 2,71 1,66 3,61 1,90 1,60 1,80 1,41 0,36 1,73 1,52 2,83 1,70 3,20 1,17 1,41 4,42

Legenda: Priemerný počet somatických buniek v referenčnej vzorke Interval kvality udávaný na komerčne dostupných vzorkách Interval kvality vyplývajúci zo štandardnej odchýlky Sd Trendová čiara

Obrázok 4. Výsledky skúšania referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek

127

Vyhodnotenie bodu 3 experimentu 2 (Príprava referenčných vzoriek s nízkym

a vysokým počtom somatických buniek, skúšanie kvality pripravených referenčných

vzoriek v reálnych laboratórnych podmienkach, porovnanie výsledkov stanovených

v troch laboratóriách):

Referenčná vzorka s nízkym počtom somatických buniek bola pripravená z bazénovej

vzorky mlieka s obsahom somatických buniek 170 000 . ml-1 dňa 8. 2. 2005. K mlieku bolo

primiešané mlieko od individuálnej dojnice s obsahom somatických buniek 1 200 000 . ml-1

(Tabuľka 28). Celkový počet mikroorganizmov v mlieku pred konzerváciou bol 14.103 KTJ

(4,15 log). Po konzervácii neboli vo vzorke vykultivované žiadne mikroorganizmy,

referenčná vzorka bola sterilná. Výsledky skúšania referenčnej vzorky s nízkym počtom

somatických buniek sú uvedené v Tabuľke 30 a na Obrázku 5.

Príprava referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek


[SB.ml-1]





204 545 225 555 214 000 239 000 210 000 236 000 229 000 243 000223 335 258 889 232 000 230 000 246 000 240 000 248 000 228 000

Výsledky stanovení 222 780 240 000 221 000 232 000 245 000 240 000 231 000 239 000

216 887 241 481 Aritmetický priemer 229 184

233 500

Sd 10 691,799 16 716,29894 10 578,8357 Cv % 4,9296708 6,922397981 4,530550620

Nesplnená Splnená Podmienka:*

Splnená

Interval: 233 500 ± 10 580 [SB.ml-1] <222 921 – 244 079>





128

Komentár: V prípade metódy A, nebola splnená podmienka, avšak po vylúčení odľahlého

výsledku jeden výsledok podmienku spĺňal a druhý sa nachádzal v tesnej blízkosti hraničnej

hodnoty, preto sme sa rozhodli postupovať ďalej v príprave referenčnej vzorky.

Referenčná vzorka s vysokým počtom somatických buniek bola pripravená

z bazénového mlieka s obsahom somatických buniek 170 000 . ml-1 dňa 8. 2. 2005. K mlieku

bolo primiešané mlieko od individuálnej dojnice s obsahom somatických buniek 1 200 000 .

ml-1 (Tabuľka 29). Celkový počet mikroorganizmov v mlieku pred konzerváciou bol 55 .103

KTJ (4,74 log). Po konzervácii neboli vo vzorke vykultivované žiadne mikroorganizmy,

referenčná vzorka bola sterilná. Výsledky skúšania referenčnej vzorky s vysokým počtom

somatických buniek sú uvedené v Tabuľke 31 a na Obrázku 6.

Príprava referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek


[SB.ml-1]





444 444 458 888 449 000 456 000 440 000 457 000 461 000 471 000450 000 452 222 464 000 460 000 448 000 460 000 432 000 427 000Výsledky

stanovení 444 444 465 555 449 000 423 000 474 000 443 000 483 000 457 000446 296 458 888 Aritmetický

priemer 452 592 454 625

Sd 3 207,7581 6 666,500006 14 997,2200

Cv % 0,7187513 1,452749944 3,298811540 Splnená Splnená Podmienka:*

Splnená Interval: 454 625 ± 14 997 [SB.ml-1]

<439 628 – 469 622> *Priemerná hodnota stanovená referenčnou mikroskopickou metódou sa musí pohybovať




129

Porovnanie výsledkov skúšania referenčnej vzorky 0405N RV - N3

204 000206 000208 000210 000212 000214 000216 000218 000220 000222 000224 000226 000228 000230 000232 000234 000236 000238 000240 000242 000244 000246 000248 000250 000252 000254 000256 000258 000260 000262 000264 000

9.2.05

10.2.05

11.2.05

12.2.05

13.2.05

14.2.05

15.2.05

16.2.05

17.2.05

18.2.05

19.2.05

20.2.05

21.2.05

22.2.05

23.2.05

24.2.05

25.2.05

26.2.05

27.2.05

28.2.05

1.3.05

2.3.05

3.3.05

4.3.05

5.3.05

6.3.05

7.3.05

8.3.05

9.3.05

10.3.05

11.3.05

dátum skúšania

hlad

ina

som

atic

kých

bun

iek

LAB 1

LAB 2

LAB 3

LAB 1

LAB 3

LAB 2

Legenda:

Priemerný počet somatických buniek v referenčnej vzorke Interval kvality udávaný na komerčne dostupných vzorkách Interval kvality vyplývajúci zo štandardnej odchýlky Sd Trendová čiara LAB 1 Trendová čiara LAB 2 Trendová čiara LAB 3

Obrázok 5. Porovnanie výsledkov skúšania referenčnej vzorky 0405N RV-N3

130

Zdrojové údaje počtu somatických buniek k Obrázku 5 - Porovnanie výsledkov skúšania referenčnej vzorky 0405N RV-N3

Tabuľka 30

Laboratórium 1 Dátum 9.2. 05 10.2. 05 11.2. 05 14.2. 05 16.2. 05 18.2. 05 21.2. 05 23.2. 05 25.2. 05 1.3. 05 2.3. 05 4.3. 05 8.3. 05 9.3. 05 11.3. 05 - -

245 000 222 000 233 000 222 000 228 000 211 000 219 000 221 000 231 000 236 000 228 000 218 000 232 000 217 000 216 000 - - 236 000 239 000 236 000 240 000 247 000 216 000 228 000 234 000 232 000 242 000 221 000 218 000 243 000 221 000 235 000 - - 240 000 230 000 218 000 228 000 232 000 242 000 246 000 226 000 247 000 224 000 214 000 222 000 233 000 228 000 234 000 - - 240 000 225 000 234 000 243 000 240 000 236 000 225 000 238 000 238 000 232 000 236 000 227 000 216 000 234 000 244 000 - - 229 000 221 000 214 000 227 000 219 000 238 000 243 000 242 000 227 000 215 000 233 000 239 000 247 000 229 000 255 000 - - 248 000 231 000 235 000 233 000 225 000 246 000 234 000 229 000 242 000 246 000 241 000 229 000 245 000 233 000 239 000 - - 231 000 213 000 - 227 000 - - 226 000 236 000 234 000 241 000 241 000 241 000 222 000 255 000 232 000 - -

Namerané výsledky

243 000 222 000 - 234 000 - - 242 000 221 000 238 000 234 000 250 000 220 000 226 000 237 000 245 000 - - Priemer SB.ml-1 239 000 225 375 228 333 231 750 231 833 231 500 232 875 230 875 236 125 233 750 233 000 226 750 233 000 231 750 237 500 - -

Sd SB.ml-1 6 633 7 873 9 688 7 126 10 226 14 446 9 891 7 864 6 446 10 181 11 686 9 099 11 339 11 523 11 452 - - Cv % 2,78 3,49 4,24 3,08 4,41 6,24 4,25 3,41 2,73 4,36 5,02 4,01 4,87 4,97 4,82 - -

Laboratórium 2 Dátum 10.2. 05 11.2. 05 15.2. 05 16.2. 05 17.2. 05 18.2. 05 22.2. 05 23.2. 05 25.2. 05 2.3. 05 3.3. 05 4.3. 05 8.3. 05 - - - -

235 000 239 000 231 000 228 000 232 000 232 000 239 000 234 000 220 000 220 000 240 000 237 000 238 000 - - - - 233 000 240 000 234 000 257 000 241 000 241 000 227 000 233 000 222 000 238 000 223 000 253 000 229 000 - - - - 234 000 232 000 224 000 246 000 249 000 249 000 224 000 248 000 224 000 225 000 256 000 229 000 243 000 - - - - 240 000 226 000 255 000 235 000 239 000 239 000 251 000 222 000 226 000 238 000 234 000 247 000 234 000 - - - - 235 000 240 000 239 000 239 000 236 000 236 000 247 000 226 000 239 000 220 000 254 000 234 000 226 000 - - - - 226 000 244 000 245 000 231 000 233 000 233 000 229 000 227 000 239 000 231 000 243 000 226 000 234 000 - - - - 238 000 211 000 255 000 244 000 239 000 239 000 229 000 230 000 240 000 233 000 229 000 245 000 226 000 - - - -

Namerané výsledky

239 000 233 000 240 000 227 000 223 000 223 000 229 000 254 000 208 000 223 000 237 000 237 000 243 000 - - - - Priemer SB.ml-1 235 000 233 125 240 375 238 375 236 500 236 500 234 375 234 250 227 250 228 500 239 500 238 500 234 125 - - - -

Sd SB.ml-1 4 408 10 616 11 006 10 281 7 597 7 597 10 042 11 145 11 348 7 502 11 427 9 227 6 875 - - - - Cv % 1,88 4,55 4,58 4,31 3,21 3,21 4,28 4,76 4,99 3,28 4,77 3,87 2,94 - - - -

131

Pokračovanie Tabuľky 30

Laboratórium 3 Dátum 10.2. 05 11.2. 05 15.2. 05 16.2. 05 17.2. 05 17.2. 05 18.2. 05 18.2. 05 22.2. 05 22.2. 05 23.2. 05 23.2. 05 24.2. 05 24.2. 05 25.2. 05 25.2. 05 1.3. 05

211 000 246 000 241 000 215 000 229 000 209 000 202 000 225 000 209 000 234 000 219 000 216 000 215 000 222 000 216 000 239 000 248 000 244 000 246 000 225 000 239 000 241 000 218 000 224 000 231 000 227 000 228 000 232 000 217 000 223 000 224 000 209 000 217 000 234 000 263 000 238 000 238 000 231 000 233 000 230 000 230 000 229 000 244 000 234 000 234 000 228 000 223 000 219 000 222 000 231 000 221 000 237 000 229 000 235 000 224 000 227 000 229 000 231 000 230 000 215 000 229 000 233 000 228 000 219 000 222 000 240 000 232 000 236 000 242 000 243 000 239 000 225 000 221 000 215 000 232 000 220 000 235 000 222 000 230 000 218 000 225 000 223 000 227 000 221 000 236 000 246 000 233 000 249 000 231 000 266 000 231 000 230 000 219 000 228 000 219 000 231 000 227 000 225 000 235 000 238 000 222 000 232 000

- - - - - - - - - - - - - - - - -

Namerané výsledky

- - - - - - - - - - - - - - - - - Priemer SB.ml-1 240 500 239 167 237 833 227 500 236 167 222 000 224 833 225 667 226 333 227 667 229 833 222 333 221 667 224 167 225 333 227 000 234 500

Sd SB.ml-1 16 932 7 083 7 859 8 142 16 055 9 252 11 531 5 203 12 801 6 154 5 492 5 888 3 933 5 565 12 193 8 319 8 666 Cv % 7,04 2,96 3,30 3,58 6,80 4,17 5,13 2,31 5,66 2,70 2,39 2,65 1,77 2,48 5,41 3,66 3,70

Sumár za všetky tri laboratóriá Priemer SB.ml-1

232 156

Sd SB.ml-1

10 337

Cv % 4,45

132

Porovnanie výsledkov skúšania referenčnej vzorky 0405V RV - V3

415 000417 000419 000421 000423 000425 000427 000429 000431 000433 000435 000437 000439 000441 000443 000445 000447 000449 000451 000453 000455 000457 000459 000461 000463 000465 000467 000469 000471 000473 000475 000477 000479 000481 000483 000

9.2.05

10.2.05

11.2.05

12.2.05

13.2.05

14.2.05

15.2.05

16.2.05

17.2.05

18.2.05

19.2.05

20.2.05

21.2.05

22.2.05

23.2.05

24.2.05

25.2.05

26.2.05

27.2.05

28.2.05

1.3.05

2.3.05

3.3.05

4.3.05

5.3.05

6.3.05

7.3.05

8.3.05

9.3.05

10.3.05

11.3.05

dátum skúšania

hlad

ina

som

atic

kých

bun

iek

LAB 1

LAB 2

LAB 3

LAB 1

LAB 3

LAB 2

Legenda: Priemerný počet somatických buniek v referenčnej vzorke Interval kvality udávaný na komerčne dostupných vzorkách Interval kvality vyplývajúci zo štandardnej odchýlky Sd Trendová čiara LAB 1 Trendová čiara LAB 2 Trendová čiara LAB 3

Obrázok 6. Porovnanie výsledkov skúšania referenčnej vzorky 0405V RV-V3

133

Zdrojové údaje počtu somatických buniek k Obrázku 6 - Porovnanie výsledkov skúšania referenčnej vzorky 0405V RV-V3

Tabuľka 31

Laboratórium 1 Dátum 9.2. 05 10.2. 05 11.2. 05 14.2. 05 16.2. 05 18.2. 05 21.2. 05 23.2. 05 25.2. 05 1.3. 05 2.3. 05 4.3. 05 8.3. 05 9.3. 05 11.3. 05 - -

449 000 474 000 427 000 510 000 447 000 477 000 465 000 451 000 474 000 434 000 433 000 442 000 477 000 - 453 000 - - 464 000 - 457 000 446 000 467 000 474 000 464 000 456 000 459 000 441 000 486 000 480 000 454 000 465 000 462 000 - - 449 000 460 000 443 000 414 000 447 000 481 000 435 000 437 000 483 000 440 000 465 000 486 000 458 000 493 000 459 000 - - 456 000 486 000 457 000 431 000 437 000 - 445 000 445 000 467 000 446 000 482 000 457 000 469 000 449 000 487 000 - - 460 000 461 000 472 000 457 000 470 000 458 000 446 000 421 000 415 000 454 000 467 000 474 000 467 000 445 000 457 000 - - 423 000 - 464 000 467 000 448 000 - 499 000 466 000 460 000 448 000 443 000 446 000 454 000 469 000 461 000 - - 440 000 483 000 - 476 000 - - 432 000 475 000 450 000 447 000 468 000 473 000 481 000 478 000 454 000 - -

Namerané výsledky

448 000 471 000 - 459 000 - - 459 000 444 000 481 000 449 000 469 000 460 000 463 000 490 000 457 000 - - Priemer SB.ml-1 448 625 472 500 453 333 457 500 452 667 472 500 455 625 449 375 461 125 444 875 464 125 464 750 465 375 469 857 461 250 - -

Sd SB.ml-1 12 828 10 821 16 058 29 076 12 941 10 083 21 514 16 843 21 814 6 244 17 972 15 989 10 099 18 641 10 859 - - Cv % 2,86 2,29 3,54 6,36 2,86 2,13 4,72 3,75 4,73 1,40 3,87 3,44 2,17 3,97 2,35 - -

Laboratórium 2 Dátum 10.2. 05 11.2. 05 15.2. 05 16.2. 05 17.2. 05 18.2. 05 22.2. 05 23.2. 05 25.2. 05 2.3. 05 3.3. 05 4.3. 05 8.3. 05 - - - -

465 000 476 000 458 000 467 000 470 000 434 000 449 000 440 000 441 000 454 000 440 000 - 468 000 - - - - 448 000 458 000 462 000 461 000 449 000 472 000 472 000 475 000 457 000 472 000 470 000 437 000 455 000 - - - - 500 000 445 000 430 000 468 000 453 000 471 000 474 000 494 000 461 000 455 000 439 000 475 000 442 000 - - - - 480 000 482 000 466 000 451 000 456 000 453 000 448 000 456 000 465 000 437 000 465 000 466 000 456 000 - - - - 499 000 472 000 467 000 467 000 471 000 456 000 412 000 489 000 462 000 471 000 476 000 450 000 455 000 - - - - 485 000 470 000 496 000 435 000 435 000 449 000 452 000 466 000 476 000 448 000 457 000 481 000 471 000 - - - - 473 000 466 000 454 000 473 000 472 000 470 000 444 000 432 000 462 000 468 000 464 000 452 000 479 000 - - - -

Namerané výsledky

452 000 471 000 468 000 478 000 434 000 435 000 449 000 484 000 479 000 446 000 468 000 447 000 522 000 - - - - Priemer SB.ml-1 475 250 467 500 462 625 462 500 455 000 455 000 450 000 467 000 462 875 456 375 459 875 458 286 468 500 - - - -

Sd SB.ml-1 19 594 11 464 18 260 13 690 15 362 15 362 19 086 22 810 11 679 12 839 13 685 16 039 24 501 - - - - Cv % 4,12 2,45 3,95 2,96 3,38 3,38 4,24 4,88 2,52 2,81 2,98 3,50 5,23 - - - -

134

Pokračovanie Tabuľky 31

Laboratórium 3 Dátum 10.2. 05 11.2. 05 15.2. 05 16.2. 05 17.2. 05 17.2. 05 18.2. 05 18.2. 05 22.2. 05 22.2. 05 23.2. 05 23.2. 05 24.2. 05 24.2. 05 25.2. 05 25.2. 05 1.3. 05

462 000 441 000 443 000 405 000 415 000 425 000 419 000 443 000 419 000 409 000 409 000 433 000 411 000 424 000 441 000 421 000 431 000 437 000 437 000 444 000 418 000 463 000 415 000 422 000 445 000 428 000 425 000 427 000 433 000 425 000 430 000 419 000 454 000 461 000 444 000 452 000 470 000 435 000 461 000 444 000 423 000 418 000 427 000 419 000 425 000 404 000 410 000 427 000 411 000 417 000 426 000 440 000 447 000 441 000 429 000 425 000 420 000 411 000 469 000 421 000 452 000 421 000 433 000 431 000 423 000 440 000 444 000 436 000 439 000 433 000 439 000 456 000 435 000 420 000 412 000 442 000 408 000 435 000 426 000 399 000 426 000 397 000 429 000 435 000 463 000 447 000 428 000 435 000 430 000 437 000 419 000 430 000 437 000 420 000 460 000 420 000 - 400 000 440 000 427 000 465 000 430 000

- - - - - - - - - - - - - - - - -

Namerané výsledky

- - - - - - - - - - - - - - - - - Priemer SB.ml-1 444 833 439 667 445 333 428 833 439 333 423 833 419 500 442 333 420 500 433 333 421 333 420 400 417 167 423 500 427 833 439 333 441 167

Sd SB.ml-1 9 152 8 892 12 501 17 105 19 242 10 381 7 176 16 367 7 176 19 643 6 653 17 344 11 957 14 349 117 03 18 705 16 461 Cv % 2,06 2,02 2,81 3,99 4,38 2,45 1,71 3,70 1,71 4,53 1,58 4,13 2,87 3,39 2,74 4,26 3,73

Sumár za všetky tri laboratóriá Priemer SB.ml-1

450 888

Sd SB.ml-1

21 802

Cv % 4,84

135

4.2.1 Zhrnutie výsledkov experimentu 2

Bod 1 experimentu 2 (Príprava a skúšanie kvality referenčnej vzorky s nízkym počtom

somatických buniek)

Referenčná vzorka s nízkym počtom somatických buniek bola skúšaná počas obdobia

4. 3. 2004 až 16. 6. 2004. Referenčná vzorka si udržala kvalitatívne vlastnosti počas celej

dĺžky experimentu. Bol zaznamenaný iba mierny vzostup počtu somatických buniek.

Vypočítaná hodnota opakovateľnosti merania na prístroji Fossomatic 5000, bola

± 9 120 somatických buniek . ml-1, táto hodnota predstavovala interný limit pre posudzovanie

kvality referenčnej vzorky. Interný limit bol nepatrne prekročený iba pri dvoch meraniach.

Externý limit bola hodnota ± 20 000 somatických buniek . ml-1. Externý limit bol odhadnutý

zo štandardnej odchýlky vypočítanej z výsledkov nameraných na prístroji Fossomatic 5000

pri určovaní počtu somatických buniek v pripravovanej referenčnej vzorke a predstavoval

dvojnásobok hodnoty štandardnej odchýlky. Externý limit nebol prekročený počas celej dĺžky

experimentu.

Pracovný postup prípravy referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek je

vhodný pre prípravu sekundárnych referenčných materiálov s presným počtom somatických

buniek.

Bod 2 experimentu 2 (Príprava a skúšanie kvality referenčnej vzorky s vysokým počtom

somatických buniek)

Referenčná vzorka s vysokým počtom somatických buniek bola skúšaná počas

obdobia 11. 5. 2004 až 4. 8. 2004. Referenčná vzorka si neudržala kvalitatívne vlastnosti

počas celej dĺžky experimentu. Bol zaznamenaný vzostup počtu somatických buniek.

Vypočítaná hodnota opakovateľnosti merania na prístroji Fossomatic 5000 bola

± 16203 somatických buniek . ml-1, táto hodnota predstavovala interný limit pre posudzovanie

kvality referenčnej vzorky. Interný limit bol nepatrne prekročený už 14 dní od začatia

experimentu. Bolo pozorované zvýšenie počtu somatických buniek. Externý limit bola

hodnota ± 30 000 somatických buniek . ml-1. Externý limit bol odhadnutý zo štandardnej

odchýlky vypočítanej z výsledkov nameraných na prístroji Fossomatic 5000 pri určovaní

počtu somatických buniek v pripravovanej referenčnej vzorke a predstavoval dvojnásobok

hodnoty štandardnej odchýlky. Externý limit bol prekročený 37 dní od začatia experimentu.

136

Referenčné vzorky pripravené týmto pracovným postupom sa budú môcť použiť

v praxi iba za toho predpokladu, že sa zvýši hodnota externého limitu za súčasného skrátenia

doby úschovy referenčných vzoriek. Z výsledkov vyplýva, že doba úschovy referenčných

vzoriek by mala byť maximálne jeden mesiac od ich prípravy.

Bod 3 experimentu 2 (Príprava referenčných vzoriek s nízkym a vysokým počtom

somatických buniek, skúšanie kvality pripravených referenčných vzoriek v reálnych

laboratórnych podmienkach, porovnanie výsledkov stanovených v troch laboratóriách)

Referenčná vzorka s nízkym počtom somatických buniek bola skúšaná počas obdobia

9. 2. 2005 až 11. 3. 2005 v troch akreditovaných skúšobných laboratóriách. Referenčná

vzorka si udržala kvalitatívne vlastnosti počas celej dĺžky experimentu. Bol zaznamenaný

veľmi mierny vzostup počtu somatických buniek v prípade laboratória č. 1. V laboratóriu č. 2

bol zaznamenaný nepatrný pokles počtu somatických buniek. V laboratóriu č. 3 bol

zaznamenaný pokles počtu somatických buniek.


± 10 579 somatických buniek . ml-1, táto hodnota predstavovala interný limit pre

posudzovanie kvality referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek. Interný limit

bol nepatrne prekročený iba pri jednom meraní v laboratóriu č. 3.

Hodnota reprodukovateľnosti stanovená z výsledkov meraní troch zúčastnených

laboratórií bola v prípade referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek ± 10 337

somatických buniek . ml-1. Externý limit bola hodnota ± 20 000 somatických buniek . ml-1.

Externý limit bol odhadnutý zo štandardnej odchýlky vypočítanej z výsledkov nameraných na

prístroji Fossomatic 5000 pri určovaní počtu somatických buniek v pripravovanej referenčnej

vzorke a predstavoval približne dvojnásobok hodnoty štandardnej odchýlky. Externý limit

nebol prekročený počas celého experimentu.

Z výsledkov experimentu vyplýva, že všetky tri zúčastnené laboratóriá stanovili počet

somatických buniek približne na tej istej hladine.

Kvalita referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek bola overená priamo

v reálnych laboratórnych podmienkach. Kvalita referenčnej vzorky s nízkym počtom

somatických buniek sa počas celej dĺžky experimentu v prípade výsledkov laboratória č. 1

a laboratória č. 2 nemenila. V laboratóriu č. 3 bolo zaznamenané zhoršenie kvality referenčnej

vzorky, namerané výsledky mali klesajúcu tendenciu, ale až na jeden výsledok sa všetky

nachádzali v tolerancii interného limitu.

137

Nami použitý pracovný postup prípravy referenčnej vzorky s nízkym počtom

somatických buniek je vhodný pre prípravu sekundárnych referenčných materiálov s presným

počtom somatických buniek.

Referenčná vzorka s vysokým počtom somatických buniek bola skúšaná počas

obdobia 9. 2. 2005 až 11. 3. 2005. Z výsledkov meraní laboratória č. 1 a laboratória č. 2

vyplýva, že referenčná vzorka si zachovala kvalitatívne vlastnosti počas celej dĺžky

experimentu.

Bol zaznamenaný mierny vzostup počtu somatických buniek v laboratóriu č. 1

a laboratóriu č. 2. V laboratóriu č. 3 bol zaznamenaný pokles počtu somatických buniek.


± 14 997 somatických buniek . ml-1, táto hodnota predstavovala interný limit pre

posudzovanie kvality referenčnej vzorky.

V laboratóriu č. 1 tri výsledky prekročili interný limit, ostatné výsledky boli

v tolerancii stanoveného interného limitu. Žiadny výsledok laboratória 1 neprekročil externý

limit. V laboratóriu č. 2 jeden výsledok prekročil stanovený interný limit, ostatné výsledky

boli v tolerancii stanoveného interného limitu. Laboratórium č. 1 a laboratórium č. 2 stanovili

počet somatických buniek na tej istej hladine. Značná časť výsledkov meraní laboratória č. 3

sa nachádzala pod hranicou interného limitu a výsledky piatich meraní boli pod hranicou

externého limitu. Laboratórium č. 3 v porovnaní s laboratóriami č. 1 a č. 2 stanovilo počet

somatických buniek na hladine približne o 30 000 somatických buniek . ml-1 nižšej.

Hodnota reprodukovateľnosti stanovená z výsledkov meraní všetkých troch laboratórií

bola ± 21 802 somatických buniek . ml-1.

Externý limit bola hodnota ± 30 000 somatických buniek . ml-1. Externý limit bol

odhadnutý zo štandardnej odchýlky vypočítanej z výsledkov nameraných na prístroji

Fossomatic 5000 pri určovaní počtu somatických buniek v pripravovanej referenčnej vzorke

a predstavoval približne dvojnásobok hodnoty štandardnej odchýlky. Externý limit nebol

prekročený v prípade výsledkov laboratória č. 1 a laboratória č. 2. Päť výsledkov meraní

laboratória č. 3 sa nachádzalo pod hranicou externého limitu.

Kvalita referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek bola overená

priamo v reálnych laboratórnych podmienkach. Z výsledkov stanovených v laboratóriu č. 1

a laboratóriu č. 2 sa dá usúdiť, že kvalita referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických

buniek je postačujúca. Výsledky stanovené v laboratóriu č. 3 naznačujú určitý pokles kvality


138

Z výsledkov vyplýva, že bude nutné zvýšiť hranicu externého limitu alebo použiť

vhodnejší spôsob konzervácie referenčnej vzorky.

139

4.3 Vyhodnotenie experimentu 3 – porovnanie výsledkov mikroskopických metód

Na vyhodnotenie získaných výsledkov (Tabuľka 33, Obrázok 7) sa opäť použila

dvojfaktorová analýza rozptylu bez interakcií. Model je popísaný v časti 4.1.

Riadkovým faktorom je Sample (vzorka) a pôsobí na šestnástich úrovniach,

stĺpcovým faktorom je Method (metóda) a pôsobí na šiestich úrovniach.

Zaujíma nás len testovanie problému H0: β1 = β2 = β3 = β4 = β5 = β6 proti H1: existujú

také i,j (i ≠ j), pre ktoré platí βi ≠ βj, kde βi je príspevkom k strednej hodnote počtu

somatických buniek pre i-tu metódu.


Použila sa štandardná analýza ANOVA hlavných efektov. Na mnohonásobné porovnávanie metód sa použili Tukeyov test a Sheffeho test.

140

Súhrn výsledkov meraní metód A, B, C, D, E, F experimentu 3. Tabuľka 32

Použitá laboratórna metóda

A B C D E F STN EN ISO 13366-1 (2001)

EtBr

ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005) návrh

EtBr 100 °C

Fossomatic ISO 13366-3

(1997)

ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005) návrh

EtBr 50 °C

ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005)

návrh (kolaboratívna

štúdia – metylénová

modrá)

ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005)

návrh (kolaboratívna štúdia – EtBr)

Výsledky NRLM

Výsledky NRLM Výsledky A.I.A.-L.S.L

Rím

Výsledky NRLM Výsledky kolaboratívnej

štúdie

Výsledky kolaboratívnej

štúdie

Čís

lo v

zork

y

Iden

tifik

ačný

kód

z k

olab

. štú

d.

Meranie 1

Meranie 2

Priemer Meranie 1

Meranie 2

Priemer Priemer Meranie 1

Meranie 2

Priemer Priemer 14-tich

laboratórií

Priemer 4-roch

laboratórií 1 G 758 850 779 913 769 000 761 776 758 265 760 000 817 000 624 867 615 505 620 000 819 000 668 000 2 H 766 456 782 253 774 000 772 307 779 328 776 000 775 000 640 079 627 207 634 000 802 000 610 000 3 A 201 853 205 363 204 000 217 650 225 841 222 000 228 000 154 461 157 972 156 000 228 000 193 000 4 B 216 480 233 447 225 000 219 990 227 011 224 000 249 000 163 823 160 312 162 000 253 000 207 000 5 C 379 133 396 100 388 000 395 515 411 897 404 000 434 000 354 559 345 198 350 000 428 000 368 000 6 D 432 375 439 396 436 000 429 450 416 578 423 000 475 000 344 028 360 410 352 000 469 000 410 000 7 E 563 433 555 242 559 000 554 657 596 783 576 000 614 000 509 021 511 361 510 000 611 000 535 000 8 F 718 480 682 205 700 000 714 969 720 820 718 000 723 000 551 146 555 827 553 000 716 000 599 000 9 G 813 263 817 358 815 000 786 349 802 731 795 000 817 000 697 417 705 608 702 000 819 000 668 000

10 H 403 121 393 174 398 000 392 004 388 494 390 000 775 000 346 368 339 347 343 000 802 000 610 000 11 A 201 268 198 928 200 000 218 820 228 182 224 000 228 000 179 035 179 035 179 000 228 000 193 000 12 B 245 149 238 713 242 000 223 501 229 352 226 000 249 000 174 354 184 886 180 000 253 000 207 000 13 C 380 303 394 930 388 000 380 303 392 004 386 000 434 000 327 645 331 156 329 000 428 000 368 000 14 D 424 769 392 589 409 000 407 216 429 450 418 000 475 000 360 410 353 389 357 000 469 000 410 000 15 E 597 953 610 825 604 000 609 654 597 953 604 000 614 000 530 083 538 275 534 000 611 000 535 000 16 F 713 799 705 023 709 000 672 843 697 417 685 000 723 000 606 144 610 825 608 000 716 000 599 000

141

020 00040 00060 00080 000

100 000120 000140 000160 000180 000200 000220 000240 000260 000280 000300 000320 000340 000360 000380 000400 000420 000440 000460 000480 000500 000520 000540 000560 000580 000600 000620 000640 000660 000680 000700 000720 000740 000760 000780 000800 000820 000840 000860 000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

číslo vzorky

poče

t som

atic

kých

bun

iek

/ ml

A: STN EN ISO 13366-1 (2001) EtBr - Výsledky NRLM B: ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005) návrh EtBr 100°C - Výsledky NRLMC: FOSSOMATIC ISO 13366-3 (1997) - Výsledky A.I.A.-L.S.L Rím D: ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005) návrh EtBr 50°C - Výsledky NRLME: ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005) návrh (kolaboratívna štúdia – metylénová modrá) F: ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005) návrh (kolaboratívna štúdia – EtBr)

Obrázok 7. Grafické znázornenie priemerných výsledkov meraní metód A, B, C, D, E, F experimentu 3.

142

Zdrojové údaje počtu somatických buniek pre analýzu rozptylu – zaokrúhlené

priemerné výsledky stanovenia počtu somatických buniek z Tabuľky 32

Tabuľka 33 Metóda

Vzorka A B C D E F 1 769 000 760 000 817 000 620 000 819 000 668 000 2 774 000 776 000 775 000 634 000 802 000 610 000 3 204 000 222 000 228 000 156 000 228 000 193 000 4 225 000 224 000 249 000 162 000 253 000 207 000 5 388 000 404 000 434 000 350 000 428 000 368 000 6 436 000 423 000 475 000 352 000 469 000 410 000 7 559 000 576 000 614 000 510 000 611 000 535 000 8 700 000 718 000 723 000 553 000 716 000 599 000 9 815 000 795 000 817 000 702 000 819 000 668 000

10 398 000 390 000 775 000 343 000 802 000 610 000 11 200 000 224 000 228 000 179 000 228 000 193 000 12 242 000 226 000 249 000 180 000 253 000 207 000 13 388 000 386 000 434 000 329 000 428 000 368 000 14 409 000 418 000 475 000 357 000 469 000 410 000 15 604 000 604 000 614 000 534 000 611 000 535 000 16 709 000 685 000 723 000 608 000 716 000 599 000

ANOVA tabuľka

Tabuľka 34

Súčet štvorcov Stupne voľnosti

Priemerný súčet štvorcov F p

Absolútny člen 2,270010E+13 1 2,270010E+13 8565,341 0,000000

Vzorka 3,676538E+12 15 2,451025E+11 92,484 0,000000 Metóda 2,071003E+11 5 4,142007E+10 15,629 0,000000 Chyba 1,987670E+11 75 2,650227E+09

Podľa ANOVA tabuľky (Tabuľka 34) hypotézu o rovnosti stredných hodnôt H0: β1 =

β2 = β3 = β4 = β5 = β6 zamietame, lebo P-hodnota pre faktor Method je menšia ako 0,01.

95 % intervaly spoľahlivosti pre rôzne typy metód sú uvedené na Obrázku 8. Výsledky

použitých metód A,B,C,D,E,F sa v priemere významne líšia.

143

Obrázok 8. Porovnanie metód A, B, C, D, E, F. Na obrázku sú uvedené stredné hodnoty

počtu somatických pre metódy A,B,C,D,E,F a ich 95 % intervaly spoľahlivosti.

Opisné charakteristiky

Opisné štatistiky a intervaly spoľahlivosti pre metódy A, B, C, D, E, F sú uvedené

v Tabuľke 35.

144

Opisné štatistiky a intervaly spoľahlivosti pre strednú hodnotu počtu somatických

buniek

Tabuľka 35

Metóda Priemer

priemerných výsledkov

Štandardná chyba

Dolná hranica 95 %

Horná hranica 95 %

Počet priemerných výsledkov

A 488 750,0 12 870,09 463 111,5 514 388,5 16 B 489 437,5 12 870,09 463 799,0 515 076,0 16 C 539 375,0 12 870,09 513 736,5 565 013,5 16 D 410 562,5 12 870,09 384 924,0 436 201,0 16 E 540 750,0 12 870,09 515 111,5 566 388,5 16 F 448 750,0 12 870,09 423 111,5 474 388,5 16

Mnohonásobné porovnávanie metód.

Tukeyov test (Tabuľka 36) aj Sheffeho test (Tabuľka 37) dávajú rovnaké výsledky.

Z Tukeyovho HSD testu vyplýva, že významné rozdiely medzi priemermi sú u metód,

ktorých P-hodnota je vyznačená červenou farbou (P-hodnota < 0,05), teda medzi metódami

A-D, B-D, C-D, C-F, D-E, E-F.

Približné pravdepodobnosti (P-hodnoty) pre Tukeyov HSD test

Tabuľka 36

metóda A B C D E F A - 1,000000 0,071778 0,000820 0,059524 0,251223 B 1,000000 - 0,078662 0,000733 0,065408 0,234286 C 0,071778 0,078662 - 0,000126 1,000000 0,000175 D 0,000820 0,000733 0,000126 - 0,000126 0,299585 E 0,059524 0,065408 1,000000 0,000126 - 0,000162 F 0,251223 0,234286 0,000175 0,299585 0,000162 -

Približné pravdepodobnosti (P-hodnoty) pre Scheffeho test

Tabuľka 37

metóda A B C D E F A - 1,000000 0,185532 0,004855 0,161810 0,444201 B 1,000000 - 0,198272 0,004340 0,173380 0,424076 C 0,185532 0,198272 - 0,000000 1,000000 0,000563 D 0,004855 0,004340 0,000000 - 0,000000 0,498537 E 0,161810 0,173380 1,000000 0,000000 - 0,000437 F 0,444201 0,424076 0,000563 0,498537 0,000437 -

145

4.3.1 Výsledky kolaboratívnej štúdie

Výsledky kolaboratívnej štúdie stanovenia počtu somatických buniek metódou ISO/WD

13366-1 / IDF sú uvedené v Tabuľke 38 a Tabuľke 39, grafické znázornenie opakovateľnosti

výsledkov zúčastnených laboratórií je na Obrázku 9, grafické znázornenie opakovateľnosti

vyjadrenej na vzorku je na Obrázku 10, grafické znázornenie celkovej správnosti výsledkov

laboratórií je na Obrázku 11.

Súhrn výsledkov kolaboratívnej štúdie stanovenia počtu somatických buniek

metódou ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005)

Tabuľka 38

(Orlandini, 2005)

146

Súhrn priemerných výsledkov kolaboratívnej štúdie stanovenia počtu somatických

buniek metódou ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005)

Tabuľka 39

(Orlandini, 2005)

147

Obrázok 9. Grafické znázornenie opakovateľnosti výsledkov laboratórií zúčastnených

v kolaboratívnej štúdii stanovenia počtu somatických buniek metódou ISO/WD 13366-1 /

IDF 148-1 (2005), (NRLM figuruje pod označením LAB 12) (Orlandini, 2005).

148

Obrázok 10. Grafické znázornenie opakovateľnosti vyjadrenej na vzorku v kolaboratívnej

štúdii stanovenia počtu somatických buniek metódou ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005),

(Orlandini, 2005).

149

Obrázok 11. Grafické znázornenie celkovej správnosti výsledkov laboratórií zúčastnených

v kolaboratívnej štúdii stanovenia počtu somatických buniek metódou

ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1 (2005), (NRLM figuruje pod označením LAB 12)

(Orlandini, 2005).

4.3.2 Zhrnutie výsledkov experimentu 3

Výsledky metód A, B, C, D, E, F sa v priemere významne líšia. Významné rozdiely

existujú medzi metódami A-D, B-D, C-D, C-F, D-E, E-F. Z porovnania priemerných

výsledkov vyplýva, že najnižšie hodnoty počtu somatických buniek boli stanovené metódou

D, následne metódou F, potom na rovnakej úrovni metódami A a B a najvyššie hodnoty počtu

somatických buniek boli stanovené na rovnakej úrovni metódami C a E. Z uvedeného

vyplýva, že sa čiastočne potvrdil náš predpoklad. Výsledky stanovené metódou D a F boli

150

podľa predpokladu najnižšie. Nepotvrdil sa však predpoklad, že výsledky stanovené

metódami A a B budú na rovnakej hladine ako výsledky stanovené metódami C a E.

Výsledky stanovené metódou A a B boli o 50 000 somatických buniek . ml-1 nižšie

v porovnaní s výsledkami metód C a E. Výsledky stanovené metódou D boli v porovnaní

s výsledkami stanovenými metódami C a E o 130 000 somatických buniek . ml-1 nižšie

a v porovnaní s metódami A a B o 80 000 somatických buniek . ml-1 nižšie. Výsledky

stanovené metódou F boli v porovnaní s výsledkami stanovenými metódami C a E o 90 000

somatických buniek . ml-1 nižšie a v porovnaní s metódami A a B o 40 000 somatických

buniek . ml-1 nižšie.

Z výsledkov experimentu 3 vyplýva, že pri použití rôznych mikroskopických metód

sa dosahujú rozdielne výsledky. Výber mikroskopickej metódy potom môže ovplyvniť

správnosť nastavenia rutinných laboratórnych prístrojov typu Fossomatic a následne

správnosť laboratórnych výsledkov u reálnych laboratórnych vzoriek.

151

5 DISKUSIA

5.1 Experiment 1 - stanovenie počtu somatických buniek v surovom kravskom mlieku

referenčnou metódou

Pri realizácii experimentu 1 sme získali mnoho empirických skúseností. Zistili sme,

že pracovný postup prípravy mikroskopického preparátu metódou A je v porovnaní s metódou

B podstatne náročnejší a vyžaduje veľmi precíznu prácu. Keďže sa na podložné sklíčko

nanáša veľmi malý objem mlieka (10 µl), je nevyhnutné pracovať s veľmi presnými pipetami.

Pri práci sa nám osvedčilo používanie mikropipety aj napriek tomu, že sa vo všeobecnosti

odporúča pracovať s mikrostriekačkou ako uvádza Ubben (2004). Pri používaní mikropipety

sme na rozdiel od mikrostriekačky pracovali s menšou prenosovou chybou (prenosová chyba

bola zistená kalibráciou). Pri práci sa musia používať výlučne kalibrované pipety s overenou

chybou prenosu pipetovaného objemu. Z hľadiska presnosti laboratórnej práce je dôležité

používať podložné sklíčka s predtlačeným rozmerom 5 mm x 20 mm. V porovnaní so

sklíčkami bez predtlačeného rozmeru sa dosahujú presnejšie výsledky a najmä rovnomerné

rozvrstvenie mlieka na definovanej ploche podložného sklíčka. Použitie podložných sklíčok

s preddefinovaným rozmerom odporúča používať Ubben (2004). Predtlačený rozmer sa pred

použitím podložného sklíčka musí preveriť pomocou mikrometra. Podložné sklíčka musia byť

dokonale odmastené, pretože inak dochádza v prípade metódy A k oddeľovaniu a zmývaniu

zafixovaného filmu mlieka počas pracovnej operácie vymývania farbiva pod prúdom vody.

Po rozvrstvení mlieka na podložnom sklíčku odporúčame uprednostniť fixáciu voľným

sušením na vzduchu pred fixáciou sušením na výhrevnej doske. Pri sušení na výhrevnej doske

často dochádza k potrhaniu naneseného filmu. Neskôr pri farbení preparátu metódou A môže

farbivo preniknúť do vzniknutých trhliniek a pri následnom vymývaní sa už nedá dostatočne

odstrániť. Pri dlhšom vymývaní môže dôjsť k potrhaniu filmu, jeho oddeleniu sa od

podložného sklíčka a úplnej deštrukcii preparátu. V prípade nedostatočného vymytia farbiva

je preparát prakticky nepozorovateľný kvôli veľmi intenzívnej fluorescencii. Pri veľmi dlhom

vymývaní farbiva môže dochádzať k nadmernému vymytiu farbiva, čím sa znemožní

identifikácia jadier somatických buniek. Metóda A má v porovnaní s metódou B aj ďalšie

nevýhody. Na prípravu farbiacich roztokov sa používajú agresívnejšie a toxickejšie

chemikálie ako tetrachlóretán a ľadová kyselina octová. Pracovné úkony sa musia vykonávať

v digestore, čo sťažuje samotnú prácu. Fixácia preparátu trvá pri metóde A 24 hodín. Pri

metóde B sa pri fixácii môže použiť výhrevná platňa a preparát sa môže mikroskopovať

152

prakticky ihneď po vysušení naneseného filmu. Výhodou metódy A v porovnaní s metódou B

je príjemnejšie mikroskopovanie. Na preparáte sa nenachádza nadbytočné fluorescenčné

farbivo, fluoreskujú len zafarbené jadrá somatických buniek jasne zlato žltou až mierne

oranžovou farbou a pozadie preparátu má príjemnú olivovo zelenú farbu. Uvedené platí ak sa

mikroskopuje s fluorescenčným svetlom o vlnovej dĺžke 450 nm.

Správnosť výsledku závisí od kvality pripraveného mikroskopického preparátu. Pri

príprave preparátu metódou A existuje viac pracovných operácií a tým sa zvyšuje riziko

možných chýb a riziko poškodenia zafixovaného filmu. Farbenie preparátu sa vykonáva za

„sucha“, vysušený preparát sa ponorí do farbiaceho roztoku. Po zafarbení preparátu nasledujú

pracovné operácie vymývania farbiva a opätovné sušenie preparátu. Znásobuje sa tým riziko

poškodenia naneseného filmu. Pri vymývaní by sa mal použiť mierny prúd vlažnej vody, aby

nedošlo k poškodeniu naneseného filmu. Pri metóde B sa farbiaci roztok pridáva priamo do

mlieka zahriateho na teplotu 100 °C. Farbivo zostáva prítomné v mlieku. Mlieko sa pri

farbení zriedi s farbiacim roztokom v pomere 1 : 1. Na podložné sklíčko sa nanáša mlieko

zriedené s farbiacim roztokom. Zafarbené jadrá somatických buniek fluoreskujú zlato žltou až

oranžovou farbu. Pozadie preparátu mierne fluoreskuje z dôvodu prítomnosti farbiva v celom

objeme vzorky a má oranžovú farbu. Uvedené platí ak sa mikroskopuje s fluorescenčným

svetlom o vlnovej dĺžke 450 nm. Metóda B obsahuje pri príprave preparátu menej pracovných

operácií, čím sa znižuje riziko poškodenia naneseného filmu. Nevýhodou metódy B je,

že obsahuje o jedno pipetovanie viac v porovnaní s metódou A. Každá chyba spôsobená

pipetovaním môže ovplyvniť výsledok analýzy. Domnievame sa, že v prípade metódy B sa

jedná o najzávažnejšiu chybu, keďže prípadné poškodenie filmu pri sušení a vzniknuté

trhlinky nemôžu ovplyvniť výsledok, pretože operácia farbenia sa vykonáva skôr.

Častým problémom metódy A je vytvorenie sa veľmi intenzívne fluoreskujúceho pásu

pozdĺž celej dĺžky okraja preparátu. V dôsledku intenzívnej fluorescencie je znemožnené

počítanie somatických buniek v okrajových oblastiach preparátu. Príčinou uvedeného

problému je pravdepodobne zaschnutie väčšieho objemu mlieka a vytvorenie hrubšej vrstvy

filmu pozdĺž okrajov preparátu. Ostatné časti preparátu sú obyčajne dobre pozorovateľné.

Zistili sme, že na prípravu preparátov by sa malo používať iba nezakonzervované

surové kravské mlieko alebo mlieko zakonzervované bronopolom. Gonzalo et al. (2003)

taktiež použili nezakonzervované mlieko pri mikroskopickom skúšaní somatických buniek

v ovčom mlieku. Neodporúčame pripravovať preparát z mlieka zakonzervovaného

dichromanom draselným z dôvodu zníženia priľnavosti filmu mlieka na podložnom sklíčku

ako aj z dôvodu nedostatočného farbenia sa jadier somatických buniek farbivom EtBr.

153

V porovnaní s našim pracovným postupom, Gonzalo et al. (2003) použili pri príprave

podložných sklíčok poly-L-lyzín za účelom zvýšenia priľnavosti filmu mlieka.

Ubben (2004) odporúča preparáty pozorovať ihneď po ich príprave. Z uvedeným

názorom súhlasíme, avšak zistili sme, že preparáty je možné pozorovať aj niekoľko týždňov

až mesiacov po ich príprave bez ovplyvnenia výsledku. Preparáty však musia byť počas

skladovania chránené pred prachom a svetlom. Samotné počítanie somatických buniek pod

mikroskopom odporúčame vykonávať pri zväčšení 600 x za použitia imerzného oleja.

Pri menších zväčšeniach by mohol nastať problém s identifikáciou jadier somatických buniek

prítomných v zhlukoch. Väčšie zväčšenia nie je nutné použiť, navyše by sa predĺžila doba

analýzy. Vo všeobecnosti doba za ktorú je skúsený laborant schopný spočítať jadrá somatický

buniek v preparáte je približne 20 minút.

Výhodou oboch metód je, že farbivo EtBr farbí výlučne jadrá somatických buniek

pretože obsahujú DNA, umožňuje sa tým exaktné stanovenie počtu somatických buniek vo

vzorke a eliminuje sa chyba počítania útvarov, ktoré nie sú somatickými bunkami. K tejto

chybe môže dôjsť pri počítaní somatických buniek v preparáte zafarbenom farbivom

metylénovou modrou. Identifikácia fluoreskujúcich jadier somatických buniek je jednoduchá

a laborant sa môže pri počítaní sústrediť iba na fluoreskujúce jadrá somatických buniek.

Pri príprave preparátu farbivo EtBr farbí aj DNA prítomných mikroorganizmov. V prípade

metódy A, je identifikácia prítomných mikroorganizmov jednoznačná. Mikroorganizmy majú

v porovnaní s jadrami somatických buniek menšiu veľkosť a charakteristické tvary. V prípade

metódy B sú prítomné baktérie prakticky nepozorovateľné, pretože ich identifikácia je kvôli

prítomnosti nerozrušených tukových guľôčok nemožná. Tukové guľôčky v prípade metódy B

do určitej miery sťažujú mikroskopovanie, pretože môžu prekrývať prítomné somatické

bunky. Uvedený problém je možné riešiť preostrením zorného poľa. V prípade metódy A sa

tento problém nevyskytuje, pretože tukové guľôčky sú rozrušené.

Najväčším problémom oboch metód je spôsob výpočtu výsledku. Pri výpočte sa

používa vzorec, do ktorého sa dosadzuje faktor, ktorý závisí od počtu kompletne spočítaných

pruhov, resp. počtu pruhov, v ktorých sa pri počítaní dosiahol počet 400 jadier somatických

buniek. Výsledok závisí predovšetkým od použitého faktora, čím sa vlastne stráca zmysel

samotného počítania somatických buniek. Číselné hodnoty faktorov sa veľmi líšia u metódy

A. V prípade metódy B sú kvôli zriedeniu vzorky pri jej farbení rozdiely medzi číselnými

hodnotami faktorov menšie. Pri vzorkách u ktorých sa počet 400 bunkových jadier dosiahne

na rozhraní dvoch pruhov môže nastať situácia, že vplyvom požitia zlého faktora dôjde

k výraznému ovplyvneniu výsledku. Existuje možnosť napočítať aj viac ako 400 bunkových

154

jadier a počítanie zastaviť na konci niektorého z pruhov. Výsledky vypočítané týmto

spôsobom rátania („rátanie úplných pruhov“) sa s výsledkami vypočítanými spôsobom

„rátania do 400 bunkových jadier“ a použitia faktora pre posledný kompletne zrátaný pruh

podstatne líšia. „Výhodou“ uvedených skutočností je, že ak sa pri viacerých paralelných

preparátoch použije rovnaký faktor, výsledky budú v podstate rovnaké a budú sa líšiť len

v dôsledku rozdielnych počtov bunkových jadier napočítaných v poslednom zornom poli.

Vo väčšine prípadov nie je možné v poslednom zornom poli skončiť počítanie presne počtom

400 bunkových jadier pretože sa v zornom poli nachádza viac somatických buniek. Do vzorca

sa potom dosadzuje hodnota nad 400 bunkových jadier (napr. 403) a dochádza k určitému

zvýšeniu výsledku. Kvôli rozdielnemu počtu jadier somatických buniek napočítaných

v poslednom zornom poli sa výsledky paralelných skúšaní odlišujú, avšak za použitia

rovnakého prepočítavacieho faktora sú si veľmi podobné. Myslíme si že pri uvedenom

spôsobe výpočtu dochádza ku skresleniu výsledkov a preto ďalej neodporúčame používať

spôsob počítania jadier somatických buniek v pruhoch. Ako vhodnú alternatívu odporúčame

použiť nový spôsob výpočtu, ktorý sa uvádza v návrhu normy ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1

(2005). Pri novom spôsobe výpočtu sa do vzorca dosádza počet odmikroskopovaných

zorných polí a počet spočítaných jadier somatických buniek. Medzi výsledkami paralelných

skúšaní vypočítaných týmto spôsobom existuje väčšia variabilita a podľa nášho názoru tieto

výsledky predstavujú reálne hodnoty počtu somatických buniek vo vzorke. Počet jadier

somatických buniek, ktoré je nevyhnutné napočítať sa riadi Poisonovým rozdelením.

V experimente 1 sme overili možnosť využitia referenčnej metódy EN ISO 13366-1

(2001) s použitím farbiva EtBr a metódu sme porovnali s metódou publikovanou

Vermuntom et al. (1995), v ktorej sa pri farbení taktiež používa farbivo EtBr, avšak pri

farbení sme použili teplotu 100 °C namiesto uvádzaných 50 °C.

Štatisticky zistený rozdiel medzi metódami bol 21 000 somatických buniek . ml-1.

Tento rozdiel bol podľa nášho názoru okrem samotného postupu prípravy preparátu

ovplyvnený aj metodikou výpočtu. Výsledky oboch metód sa v porovnaní s výsledkami

stanovenými na prístroji Fossomatic nelíšili na hladine 300 000 somatických buniek . ml-1

o viac než 5 %. Gonzalo et al. (2003) pri stanovení počtu somatických buniek v ovčom

mlieku porovnali tri rozdielne mikroskopické metódy (farbenie metylénovou modrou - MB,

farbenie podľa May-Grünvald-Giemsa - MGG a farbenie pyronin Y-metylénovou zelenou -

PMG) a vypočítali korelačné koeficienty medzi jednotlivými metódami. Autori uvádzajú,

že korelačný koeficient medzi metódami MB a MGG bol 0,981, medzi metódami MB a PMG

bol 0,982 a medzi metódami MGG a PMG bol 0,990. Korelačný koeficient medzi metódami

155

MB a Fossomaticom bol 0,957 a medzi metódami MGG a Fossomaticom bol 0,996). Autori

ďalej uvádzajú, že všetky tri použité mikroskopické metódy sa môžu považovať za referenčné

vo vzťahu k prístrojovej metóde Fossomatic.

Uvedené výsledky súhlasia s výsledkami, ktoré sme zistili v experimente 1

a v experimente 3. V experimente 1 sme zistili nasledovné korelačné koeficienty (Príloha 17,

Tabuľka 1): 0,995 medzi metódami A a B, 0,994 medzi metódami A a C a 0,997 medzi

metódami B a C. Tieto výsledky súhlasia aj s výsledkami ďalších autorov (Grappin

a Jeunet, 1974; Heeschen, 1975; Schmidt-Madsen, 1975, 1979; Heald et al., 1977), ktorí

uvádzajú vysoké korelačné koeficienty, blízke 1,00.

Rozšírená neistota merania vypočítaná pre metódu EN ISO 13366-1 (2001) je 2 %

a resp. 7 % v závislosti od použitého spôsobu počítania jadier somatických buniek.

Rozšírená neistota merania vypočítaná pre nami modifikovanú metódu popísanú

Vermuntom et al. (1995) je 8 %, resp. 10 % v závislosti od použitého spôsobu počítania

jadier somatických buniek.

Počas realizácie experimentu 1 sme chceli overiť, či farbivo etídium bromid farbí

erytrocyty. Kulíšek et al. (1996) uvádzajú, že erytrocyty sú bezjadrové bunky, ktoré v čase

vývoja stratili jadro a ostatné typické organely buniek. Podľa Martínez et al. (2003)

a Ethidium Bromid Safety (1999) sa etídium bromid používa na farbenie nukleových

kyselín. Keďže erytrocyty neobsahujú jadro, namali by sa farbiacim roztokom etídium

bromidu zafarbiť. Pre overenie tejto hypotézy sme získali z krvi hovädzieho dobytka čistú

suspenziu červených krviniek podľa postupu, ktorý uvádza Mikula et al. (1985). Suspenziu

červených krviniek sme následne zafarbili farbiacim roztokom etídium bromidu

a experimentálne sme dokázali, že etídium bromid erytrocyty nefarbí pretože neobsahujú

jadrovú DNA.

Táto skutočnosť znamená, že u mastitídneho mlieka obsahujúceho krv, sa pri farbení

buniek etídium bromidom erytrocyty nezafarbia a môže preto dochádzať k podhodnoteniu

výsledku laboratórnej skúšky.

5.2 Experiment 2 – príprava sekundárnych referenčných materiálov

V prvej fáze experimentu 2 (bod 1 - Príprava a skúšanie kvality referenčnej vzorky

s nízkym počtom somatických buniek; a bod 2 - Príprava a skúšanie kvality referenčnej

vzorky s vysokým počtom somatických buniek) sme skúšali kvalitu referenčných vzoriek

v podmienkach NRLM.

156

Zo zistených výsledkov vyplýva, že referenčná vzorka s nízkym počtom somatických

buniek si zachovala kvalitatívne vlastnosti, predovšetkým stabilný počet somatických buniek

počas celého experimentu. Bol zaznamenaný iba mierny vzostup počtu somatických buniek.

Toto zistenie nekorešponduje s údajmi zistenými Vermuntom et al. (1995), ktorí zistili

mierny pokles počtu somatických buniek.

V referenčnej vzorke s vysokým počtom somatických buniek sme zistili porušenie

kvality referenčnej vzorky v podobe zvýšenia počtu somatických buniek. Toto zistenie

nekorešponduje s údajmi zistenými Vermuntom et al. (1995), ktorí zistili pokles počtu

somatických buniek. Predpokladáme, že k zvýšeniu počtu somatických buniek mohlo dôjsť

v dôsledku pretrvávajúcej enzymatickej aktivity mikrobiálnych enzýmov a enzýmov

somatických buniek, ktoré nemuseli byť inaktivované počas tepelného ošetrenia vzorky

a následnej chemickej konzervácie. Enzýmy mohli rozrušiť zhluky somatických buniek, ktoré

sú často prítomné v mastitídnom mlieku, čím sa zvýšil počet somatických buniek. Saeman et

al. (1988) zistili, že aktivita plazmínu sa na celkovej proteolýze vo vzorkách mlieka podieľala

päťdesiatimi štyrmi percentami. Verdi a Barbano (1991) zistili, že relatívna proteázová

aktivita buniek pochádzajúcich z mlieka s vysokým počtom somatických buniek bola pri pH

6,6 výrazne vyššia v porovnaní s aktivitou buniek izolovaných priamo z krvi. Vyššia

proteázová aktivita mohla byť spôsobená väčšou koncentráciou aktivovaných makrofágov.

Výsledky Saemana et al. potvrdili Le Roux et al. (1995), ktorí uvádzajú, že zvýšenie počtu

somatických buniek viedlo k zhoršeniu kvality proteínov prítomných v mlieku. Autori ďalej

konštatujú, že na degradácii proteínov sa podieľa plazmín a proteázy zo somatických buniek.

Santos et al. (2003) uvádzajú, že počas mastítídy dochádza k zvýšeniu prestupu zložiek krvi

(leukocytov) do mlieka. Leukocyty obsahujú veľké množstvo enzýmov, ktoré následne

ovplyvňujú zloženie mlieka, predovšetkým rozkladajú kazeín a mliečny tuk. Najdôležitejšie

z týchto enzýmov sú plazmín a mliečne proteázy, ktoré rozkladajú kazeín. Taktiež bolo

dokázané, že vplyvom lipolýzy a proteolýzy dochádza k zmenám chuťových vlastností mlieka

a k jeho zhorknutiu (Ma et al., 2000). Proteolýza v mlieku má dva pôvody, mikrobiálny

a mastitídny. Fairbairn a Law (1986) uvádzajú, že mikroorganizmy môžu počas skladovania

mlieka v chladiacich tankoch produkovať tepelne rezistentné exogénne proteázy. Narušenie

zdravotného stavu mliečnej žľazy vedie k zvýšeniu množstva endogénnych proteáz,

predovšetkým tých, ktoré pochádzajú z plazmín-plazminogénneho systému (Politis a Ng-

Kwai-Hang, 1988). Grieger a Holec et al. (1990) uvázajú, že mikrobiálne lipázy sú na

rozdiel od mliečnych lipáz termorezistentné, zachovávajú si aktivitu aj po sterilizácii.

Termorezistencia lipáz sa líši podľa druhu lipolytických mikroorganizmov. Pri zahriatí mlieka

157

na 63 °C po 30 min aktivita lipáz klesá od 14,5 % do 56 %. Pri zahriatí mlieka na 72 °C

aktivita lipáz klesá po 17 sekundách od 1,5 % do 41,3 %. V našom pracovnom postupe sme

použili teplotu 70 °C ± 2 °C počas 45 minút.

Uvažujeme, že príčinou zvýšenia počtu somatických buniek v referenčnej vzorke

s vysokým počtom somatických buniek by mohla byť aj použitá pasterizačná teplota,

vplyvom ktorej mohlo dôjsť k denaturácii povrchových častí somatických buniek a následne

k oddeľovaniu somatických buniek zo zhlukov, čo mohlo mať za následok zvýšenie

celkového počtu somatických buniek vo vzorke.

Pri príprave referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek sa za účelom

zvýšenia počtu somatických buniek použilo mlieko pochádzajúce od dojnice s mastitídou.

Toto mlieko malo v porovnaní s bazénovou vzorkou mlieka zvýšený celkový počet

mikroorganizmov (55 . 103 KTJ = 4,74 log v porovnaní so 14 . 103 KTJ = 4,15 log). Po

tepelnom a chemickom ošetrení mlieka sme však nezistili prítomnosť živých

mikroorganizmov v zakonzervovanom mlieku. Zakonzervovaná referenčná vzorka bola

sterilná. Nepredpokladáme, že príčinou zvýšenia počtu somatických buniek bola mikrobiálna

aktivita, pretože mikrobiologickým vyšetrením zakonzervovaných referenčných vzoriek na

začiatku experimentu a na konci experimentu neboli vykultivované žiadne mikroorganizmy,

referenčná vzorka bola sterilná. Súhlasíme však s Griegerom a Holecom et al. (1990)

a Fairbairnom a Lawom (1986), ktorí uvádzajú že termorezistentné enzýmy môžu ovplyvniť

kvalitatívne vlastnosti mlieka.

Z uvedeného vyplýva, že bude treba vykonať ďalšie experimenty zamerané na

stabilizáciu počtu somatických buniek v referenčnej vzorke s vysokým počtom somatických

buniek alebo zvýšiť „externý limit“ (teoretický interval v ktorom by sa mali nachádzať

výsledky stanovené laboratóriami pri skúšaní referenčnej vzorky). Pracovný postup prípravy

referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek sa bude môcť aplikovať na

prípravu referenčných vzoriek iba vtedy, ak sa dodržia vyššie uvedené odporúčania.

Z výsledku experimentu vyplynulo viacero otázok, ktoré by mali byť predmetom

ďalšieho výskumu. Predovšetkým sa bude musieť porovnať ako pôsobia rôzne koncentrácie

a kombinácie konzervačných látok za aplikácie alebo bez aplikácie tepelného ošetrenia. Pri

ďalšom výskume budeme môcť vychádzať z výsledkov prác viacerých autorov. Vplyvmi

rozdielnych faktorov na zmeny v počte somatických buniek vo vzorkách mlieka sa zaoberali

Gonzalo et al. (2003). Najdôležitejšie faktory ovplyvňujúce počet somatických buniek vo

vzorke sú: konzervačná látka, analytická teplota, vek vzoriek, spôsob uskladnenia a interakcie

týchto faktorov. Autori uvádzajú, že v zakonzervovaných vzorkách sa logPSB (logaritmus

158

počtu somatických buniek) pohyboval od 5,67 (bronopol), 5,63 (dichroman draselný) a 5,62

(azidiol). Najvyššia hodnota logPSB bola u nezakonzervovaného mlieka (5,72) a k jej

zvýšeniu došlo v dôsledku pomnoženia sa baktérií vo vzorke. Hodnota logPSB bola vyššia pri

použití teploty 60 °C (5,68) než pri teplote 40 °C (5,65). Hodnota logPSB bola pri skladovaní

vzoriek mlieka pri chladničkovej teplote (5,67) a pri laboratórnej teplote (5,65). Zvýšenie

počtu somatických buniek pri konzervovaní mlieka bronopolom zistil v minulosti aj

Bertrand (1996). Sánchez et al. (2005) zistili, že použitie bronopolu pri konzervácii vzoriek

poskytuje najlepšie výsledky vo vzťahu k rozdielnym skúmaným modelovým podmienkam.

Barkema et al. (1997) a Martínez (2003) skúmali vplyv zmrazenia na počet somatických

buniek vo vzorke mlieka. Autori uvádzajú, že tento postup sa môže použiť v protimastitídych

kontrolných programoch.


v prípade referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek ± 9 120 somatických

buniek . ml-1 a v prípade referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek ± 16 203

somatických buniek.ml-1. Vermunt et al. (1995) uvádzajú hodnotu opakovateľnosti až

± 60 000 somatických buniek . ml-1. Nami zistené výsledky boli v tolerancii tejto hodnoty.

Podľa návrhu normy ISO/FDIS 13366-2 / IDF 148-2 (2006) by hodnoty opakovateľnosti (r)

mali byť nasledovné: na hladine 150 000 SB . ml-1 (r) 25 000 SB . ml-1, na hladine 300 000

SB . ml-1 (r) 42 000 SB . ml-1, na hladine 450 000 SB . ml-1 (r) 50 000 SB . ml-1, na hladine

750 000 SB . ml-1 (r) 63 000 SB . ml-1, na hladine 1 500 000 SB . ml-1 (r) 126 000 SB . ml-1.

Nami zistené hodnoty opakovateľnosti boli v toleranciách uvádzaných v návrhu vyššie

uvedenej normy.

V druhej fáze experimentu 2 (bod 3 experimentu 2) sme skúšali kvalitu referenčných

vzoriek s nízkym a vysokým počtom somatických buniek v reálnych laboratórnych

podmienkach v troch akreditovaných skúšobných laboratóriách.

V prípade referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek mierny vzostup

počtu somatických buniek v laboratóriu č. 1 nekorešponduje a nepatrný pokles počtu

somatických buniek v laboratóriu č. 2 a pokles počtu somatických buniek v laboratóriu č. 3

korešpondujú s údajmi zistenými Vermuntom et al. (1995), ktorí zistili mierny pokles počtu


V prípade referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek mierny vzostup

počtu somatických buniek v laboratóriu č. 1 a laboratória č. 2 nekorešpondujú a mierny

159

pokles počtu somatických buniek v laboratóriu č.3 korešponduje s údajmi zistenými

Vermuntom et al. (1995), ktorí zistili mierny pokles počtu somatických buniek.

Pokles počtu somatických buniek súhlasí s výsledkami Gonzala et al. (2003), ktorí

v prípade konzervácie vzoriek mlieka s dichromanom draselným zistili pokles počtu


Laboratórium č. 3 v porovnaní s laboratóriami č. 1 a č. 2 stanovilo počet somatických

buniek na hladine približne o 30 000 somatických buniek . ml-1 nižšej. Päť výsledkov meraní

laboratória č. 3 sa nachádzalo pod hranicou externého limitu. Predpokladáme, že meranie na

nižšej hladine súviselo s nastavením prístroja a nesúviselo s porušením kvality referenčnej

vzorky.

Z výsledkov vyplýva, že bude nutné zvýšiť hranicu externého limitu alebo použiť

vhodnejší spôsob konzervácie referenčnej vzorky.

Vypočítané hodnoty opakovateľnosti a reprodukovateľnosti boli v porovnaní

s hodnotami uvádzanými Vermuntom et al. (1995) podstatne nižšie.

Vypočítané hodnoty opakovateľnosti boli ± 10 579 somatických buniek . ml-1

v prípade referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek a ± 14 997 somatických

buniek . ml-1 v prípade referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek. Merania

boli uskutočnené na prístroji Fossomatic 5000. Hodnoty opakovateľnosti podľa návrhu normy

ISO/FDIS 13366-2 / IDF 148-2 (2006) boli uvedené vyššie. Nami vypočítané hodnoty

opakovateľnosti boli v toleranciách uvádzaných v návrhu tejto normy.

Vypočítané hodnoty reprodukovateľnosti boli ± 10 337 somatických buniek . ml-1

v prípade referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek a ± 21 802 somatických

buniek . ml-1 v prípade referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek. Merania

boli uskutočnené na prístroji Fossomatic 5000 a dvoch prístrojoch Combi Foss 6000). Podľa

návrhu normy ISO/FDIS 13366-2 / IDF 148-2 (2006) by hodnoty reprodukovateľnosti (R)

mali byť nasledovné: na hladine 150 000 SB . ml-1 (R) 38 000 SB . ml-1, na hladine 300 000

SB . ml-1 (R) 67 000 SB . ml-1, na hladine 450 000 SB . ml-1 (R) 88 000 SB . ml-1, na hladine

750 000 SB . ml-1 (R) 126 000 SB . ml-1, na hladine 1 500 000 SB . ml-1 (R) 252 000 SB.ml-1.

Nami zistené hodnoty reprodukovateľnosti boli v toleranciách uvádzaných v návrhu tejto

normy.

160

Vermunt et al. (1995) uvádzajú priemerné hodnoty opakovateľnosti ± 25 000

somatických buniek . ml-1 v prípade referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek

a ± 60 000 somatických buniek . ml-1 v prípade referenčnej vzorky s vysokým počtom

somatických buniek. Autori uvádzajú nasledovné priemerné hodnoty reprodukovateľnosti:

± 36 000 somatických buniek . ml-1 v prípade referenčnej vzorky s nízkym počtom

somatických buniek a ± 112 000 somatických buniek . ml-1 v prípade referenčnej vzorky

s vysokým počtom somatických buniek.

Z vypočítaných hodnôt reprodukovateľnosti a rozšírenej neistoty merania, ktoré sme

vypočítali z nameraných výsledkov všetkých troch zúčastnených laboratórií je možné

vypočítať externý limit.

Externý limit pre referenčnú vzorku s nízkym počtom somatických buniek by potom

mal byť ± 27 701 somatických buniek . ml-1 a pre referenčnú vzorku s vysokým počtom

somatických buniek ± 44 685 somatických buniek . ml-1.

Vypočítané externé limity odporúčame používať v praxi pri výrobe sekundárnych

referenčných materiálov s presným počtom somatických buniek.

Pri výpočte externého limitu sme zohľadnili nasledovné čiastkové neistoty typu B:

rozlišovacia schopnosť prístroja 1 000 SB . ml-1, opakovateľnosť prístroja na hladine do

300 000 SB . ml-1 (5 % = 15 000 SB . ml-1), opakovateľnosť prístroja na hladine do 500 000

SB . ml-1 (4 % = 20 000 SB . ml-1).

5.3 Experiment 3 – porovnanie výsledkov mikroskopických metód

V experimente 3 sme zistili, že výsledky metód A a B boli v porovnaní s výsledkami

metód C a E o 50 000 somatických buniek . ml-1 nižšie. Rozdiel medzi metódami bol do

určitej miery ovplyvnený nízkymi výsledkami stanovenými v NRLM u vzorky č. 10.

Nemáme však vysvetlenie prečo boli výsledky v prípade vzorky č. 10 nižšie v porovnaní

s výsledkami ostatných metód. Domnievame sa, že výsledky mohli byť ovplyvnené zlou

homogenizáciou vzorky počas prípravy vzorky, chybou pri pipetovaní počas prípravy

mikroskopického preparátu alebo kvalitou laboratórnej vzorky. Taktiež sa domnievame,

že rozdiel medzi metódami mohol byť ovplyvnený aj odľahlými výsledkami stanovenými

niektorými laboratóriami v kolaboratívnej štúdii. Ak sme do štatistického vyhodnotenia

nezahrnuli výsledky vzorky č.10, rozdiel medzi metódami A a B v porovnaní s metódami

C a E predstavoval 29 000 somatických buniek . ml-1. Pri porovnaní korelačných

koeficientov (Príloha 17, Tabuľka 2) sme zistili, že najvyšší korelačný koeficient je medzi

161

metódami C a E (0,999) a ďalej medzi metódami A a B (0,998). Tieto údaje súhlasia s údajmi

autorov, (Grappin a Jeunet, 1974; Heeschen, 1975; Schmidt-Madsen, 1975, 1979; Heald

et al., 1977, Gonzalo et al., 2003), ktorí zistili vysoké hodnoty korelačného koeficientu,

blízke hodnote 1,00.

162

6 NÁVRH NA VYUŽITIE ZISTENÝCH POZNATKOV

Poznatky zistené v experimente 1 boli využité pri optimalizácii a zavádzaní

referenčnej metódy stanovenia počtu somatických buniek v surovom kravskom mlieku, jej

validácii a následnej akreditácii v Národnom referenčnom laboratóriu pre mlieko a mliečne

výrobky v Nitre v decembri 2004, tieto poznatky sme odporučili zohľadniť pri tvorbe

medzinárodnej normy ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1.

Zavedenie referenčnej metódy stanovenia počtu somatických buniek bolo prvým

predpokladom pre realizáciu experimentu 2, v ktorom sme sa zamerali na prípravu

sekundárnych referenčných materiálov s presným počtom somatických buniek. Nami

pripravené sekundárne referenčné materiály sa v súčasnosti používajú v laboratóriách

vykonávajúcich stanovenie počtu somatických buniek v surovom mlieku. Predovšetkým

slúžia na kontrolu prístrojov typovej rady Fossomatic v Národnom referenčnom laboratóriu

pre mlieko a mliečne výrobky v Nitre a v centrálnych skúšobných laboratóriách v Bratislave

a v Žiline, ktoré vykonávajú skúšanie surového kravského mlieka pre trhové účely. Použitím

rovnakých referenčných materiálov vo vyššie uvedených laboratóriách sa zjednotilo

nastavenie laboratórnych prístrojov typu Fossomatic, odstránili sa rozdiely v laboratórnych

výsledkoch, zlepšila sa presnosť a správnosť laboratórnych výsledkov. Presné a správne

laboratórne výsledky sú dôležité pre prvovýrobcov mlieka ako aj spracovateľov mlieka,

pretože slúžia ako podkladové informácie pre účely preplácania. Z pohľadu hygieny

a technológie výroby mliečnych výrobkov je dôležité aby sa nespracovalo hygienicky

nevyhovujúce mlieko s vysokým počtom somatických buniek. Správne nastavené laboratórne

prístroje musia spoľahlivo detegovať počet somatických buniek v mlieku v oblasti

hygienického limitu (400 000 SB.ml-1) daného Nariadením Komisie (ES) č. 1662/2006,

ktorým sa mení a dopĺňa nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004.

Referenčné materiály pripravené v Národnom referenčnom laboratóriu pre mlieko

a mliečne výrobky umožňujú nastaviť laboratórne prístroje tak, aby merali presne a správne

v oblasti legislatívneho limitu. Sekundárne referenčné materiály s presným počtom

somatických buniek by mali mať uplatnenie aj v prevádzkových laboratóriách jednotlivých

mliekarenských podnikov, kde budú slúžiť na zvyšovanie kvality laboratórnej

práce, zvyšovanie presnosti a správnosti laboratórnych výsledkov pri skúšaní vstupnej

suroviny.

163

Z pohľadu vedy a laboratórnej diagnostiky, poznatky zistené v experimente 3 budú

slúžiť pre optimalizáciu mikroskopickej referenčnej metódy stanovenia počtu somatických

buniek v surovom kravskom mlieku. Na základe výsledkov experimentu sme porovnali

viaceré mikroskopické metódy stanovenia počtu somatických buniek. Doteraz nebola

publikovaná práca, ktorá by detailne porovnávala rozdielne mikroskopické metódy určené na

stanovenie počtu somatických buniek v surovom kravskom mlieku, predovšetkým postup

farbenia somatických buniek metylénovou modrou a postup farbenia etídium bromidom.

Poznatky zistené v experimente 3 sme navrhli zohľadniť pri tvorbe medzinárodnej normy

ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1. Veľké množstvo vedeckých prác zameraných na mastitídu

v chovoch dojníc, zvyšovanie účinnosti veterinárnych liečiv, genetiku a šľachtenie

hovädzieho dobytka, hygienu prvovýroby mlieka, technológiu výroby mliečnych výrobkov

využíva výsledky stanovenia počtu somatických buniek zistené pomocou prístrojov typu

Fossomatic. Vedecký výskum preto často závisí od správneho nastavenia laboratórnych

prístrojov. Optimalizácia referenčnej metódy stanovenia počtu somatických buniek a výroba

kvalitných sekundárnych referenčných materiálov môžu prispieť k získavaniu presných

údajov dôležitých pre vedecký výskum.

164

7 ZÁVER

Mastitída patrí medzi najdôležitejšie ochorenia hovädzieho dobytka. Ovplyvňuje

ekonomiku výroby mlieka, znižuje kvalitu mlieka a jeho technologickú využiteľnosť.

Hlavným indikátorom a diagnostickým štandardom pri zisťovaní mastitídy sú somatické

bunky. V bežnej praxi sa na stanovenie počtu somatických buniek používajú inštrumentálne

laboratórne metódy, ktorých presnosť sa musí overovať referenčnou metódou. V súčasnosti je

referenčnou metódou metóda EN ISO 13366-1 (2001) Mlieko, Stanovenie počtu somatických

buniek, Časť 1: Mikroskopická metóda.

V experimente 1 sme overili možnosť využitia vyššie uvedenej referenčnej metódy

s použitím farbiva EtBr a metódu sme porovnali s metódou publikovanou Vermuntom et al.

(1995), v ktorej sa pri farbení taktiež používa farbivo EtBr.

Medzi porovnávanými metódami sme zistili štatistický rozdiel 21 000 somatických

buniek . ml-1. Tento rozdiel bol podľa nášho názoru ovplyvnený metodikou výpočtu.

Výsledky oboch metód sa v porovnaní s výsledkami stanovenými na prístroji Fossomatic

nelíšili na hladine 300 000 somatických buniek . ml-1 o viac než 5 %.

Rozšírená neistota merania vypočítaná pre metódu EN ISO 13366-1 (2001) je 2 %,

resp. 7 % v závislosti od použitého spôsobu počítania jadier somatických buniek.

Rozšírená neistota merania vypočítaná pre metódu popísanú Vermuntom et al. (1995)

je 8 %, resp. 10 % v závislosti od použitého spôsobu počítania jadier somatických buniek.

Z empirických poznatkov zistených počas experimentu 1 vyplýva, že uvedené metódy

majú viaceré nedostatky, predovšetkým metodika počítania jadier somatických buniek

a výpočet môžu výrazne ovplyvniť výsledok analýzy. Pri výpočte odporúčame použiť vzorec

uvedený v návrhu normy ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 (2005). Správnosť výsledku je vo

veľmi veľkej miere ovplyvnená zručnosťou, talentom a skúsenosťami laboranta.

Uvedené metódy sme validovali a akreditovali v decembri 2004.

V nadväznosti na experiment 1 sme vykonali experiment 2, v ktorom sme sa zamerali

na vývoj sekundárneho referenčného materiálu s presným počtom somatických buniek.

Pracovný postup prípravy referenčnej vzorky s nízkym počtom somatických buniek je

vhodný pre prípravu sekundárnych referenčných materiálov. Pripravené referenčné vzorky

boli stabilné počas celého experimentu. Hodnota reprodukovateľnosti stanovená z výsledkov

meraní troch zúčastnených akreditovaných skúšobných laboratórií pri skúšaní referenčnej

vzorky s nízkym počtom somatických buniek bola ± 10 337 somatických buniek . ml-1.

165

Pracovný postup prípravy referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek

sa bude môcť použiť na výrobu referenčných vzoriek iba vtedy ak sa zvýši „externý limit“

(interval, v ktorom sa musia nachádzať výsledky stanovené laboratóriami pri skúšaní

referenčnej vzorky), alebo sa zmení spôsob konzervácie referenčnej vzorky. Hodnota

reprodukovateľnosti stanovená z výsledkov meraní troch zúčastnených akreditovaných

skúšobných laboratórií pri skúšaní referenčnej vzorky s vysokým počtom somatických buniek

bola ± 21 802 somatických buniek . ml-1.

Zistené hodnoty reprodukovateľnosti sú v porovnaní s hodnotami udávanými

Vermuntom et al. (1995) podstatne nižšie a naznačujú zlepšenie presnosti inštrumentálnej

laboratórnej metódy vplyvom jej technického vývoja za uplynulých desať rokov.

Pomocou referenčných vzoriek bude môcť Národné referenčné laboratórium pre

mlieko a mliečne výrobky vykonávať kontrolu súčasného systému hodnotenia kvality

surového kravského mlieka na Slovensku v oblasti somatických buniek.

Z výsledkov experimentu 2 vyplynulo viacero otázok, ktoré by mali byť predmetom

ďalšieho výskumu. Predovšetkým sa bude musieť porovnať ako pôsobia rôzne koncentrácie

a kombinácie konzervačných látok za aplikácie alebo bez aplikácie tepelného ošetrenia na

kvalitu referenčných vzoriek.

V experimente 3 sme navzájom porovnali výsledky piatich mikroskopických metód

stanovenia počtu somatických buniek a inštrumentálnej metódy. Zistili sme, že výsledky

metód sa v priemere významne líšia. Výsledky stanovené v NRLM modifikovaným

pracovným postupom návrhu normy ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 za použitia farbiva EtBr

a farbení pri 100 °C boli o 50 000 somatických buniek . ml-1 nižšie v porovnaní s výsledkami

stanovenými pri farbení metylénovou modrou podľa normy ISO/WD 13366-1 IDF 148-1.

Rozdiel medzi metódami bol však ovplyvnený výsledkami vzorky č. 10 stanovenými

v NRLM a odľahlými výsledkami stanovenými v kolaboratívnej štúdii pri farbení

metylénovou modrou. Výsledky stanovené pracovným postupom návrhu normy ISO/WD

13366-1 IDF 148-1 za použitia farbiva EtBr a farbení pri 50 °C boli o 130 000 somatických

buniek . ml-1 nižšie v porovnaní s výsledkami stanovenými pri farbení metylénovou modrou

podľa normy ISO/WD 13366-1 IDF 148-1.

Odporúčame vykonať zmenu v návrhu normy ISO/WD 13366-1 IDF 148-1 a pri

metóde farbenia pomocou EtBr navrhujeme použiť teplotu 100 °C. Neodporúčame ďalej

používať spôsob výpočtu podľa STN EN ISO 13366-1 (2001) s použitím faktora závislého od

počtu kompletne zrátaných pruhov, pretože môže dochádzať k skresleniu výsledkov.

166

Ako vhodnú alternatívu odporúčame použiť nový spôsob výpočtu, ktorý sa uvádza v návrhu

normy ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1.

Správnosť laboratórnych výsledkov stanovenia počtu somatických buniek má význam

z pohľadu laboratórnej diagnostiky, hygieny prvovýroby mlieka, technológie výroby

mliečnych výrobkov a bezpečnosti potravín. Veríme, že prostredníctvom zistených výsledkov

a poznatkov sme prispeli k optimalizácii referenčnej mikroskopickej metódy stanovenia počtu

somatických buniek v surovom kravskom mlieku.

167

8 ZOZNAM POUŽITEJ LITERATÚRY

1. BARO, J. A. – ROLDÁN, P. – CARLEOS, C. E. – GRILLO, G. J. – PÉREZ, M. A.

Video-microscopy as an Alternative Method for Evaluation of Somatic Cell Count. In

Journal Dairy Research, roč. 72, February 2005, č. 1, s. 93 -100.

2. BARKEMA, H. W. – VAN DER SCHANS, J. – SCHUKKEN, Y. H. – DE GEE, A. L.

W. – LAM, T. J. G. M. – BENEDICTUS, G. Effest of Freezing on Somatic Cell Count

of Quarter Milk Samples as Determined by a Fossomatic Electronic Cell Counter. In

Journal Dairy Science, roč. 80, 1997, s. 422 – 426.

3. BENSAUDE, O. Ethidium Bromide and Safety-Readers Suggest Alternative Solutions. In

Trends Gent. roč. 4, 1988, s. 89.

4. BERTRAND, J. A. Influence of shipping container, preservative, and breed on analysis

of milk components of shipped samplies. In Journal Dairy Science, roč. 79, 1996, s. 145 -

148.

5. BODDIE, R. L. – OWENS, W. E. – RAY, C. H. – NICKERSON, S. C. – BODDIE, N.

T. Germicidal Activities of Representatives of Five Different Teat Dip Classes Against

Three Bovine Mycoplasma Species Using a Modified Excised Teat Model. In Journal

Dairy Science, roč. 85, 2002, s. 1909 -1912.

6. BORM, A. A. – FOX, K. L. – LESLIE, K. E. – HOGAN, J. S. – ANDREW, S. M. –

MOYES, K. M. – OLIVER, S. P. – SCHUKKEN, Y. H. – HANOCK, D. D. –

GASKINS, C. T. – OWENS, W. E. – NORMAN, C. Effects of Prepartum

Intramammary Antibiotic Therapy on Udder Health, Milk Production, and Reproductive

Performance in Dairy Heifers. In Journal Dairy Science, roč. 89, 2006, s. 2090 - 2098.

7. BRADLEY, A. J. – GREEN, M. J. An Investigation of the Impact of Intramammary

Antibiotic Dry Cow Therapy on Clinical Coliform Mastitis. In Journal Dairy Science, roč.

2001, s. 1632 -1639.

8. BYRON, F. BREHM-STECHER. – JOHNSON, E. A. Sensitization of Staphylococcus

aureus and Escherichia coli to Antibiotics by the Sesquiterpenoids Nerolidol, Farnesol,

Bisabolol, and Apritone. In Antimicrob Agents Cemother, roč. 47, October 2003, č. 10, s.

3357 - 3360.

9. BURDOVÁ, O. Kvalita potravín z pohľadu výrobnej a kontrolnej činnosti na konferencii

Hygiena Alimentorum XIX. In Mliekarstvo, roč. 29, 1998, č. 4, s. 46.

10. BURDOVÁ, O. – BARANOVÁ, M. – MAĽA, P. – PAŽÁKOVÁ, J. Mastitídy I.

Aktuálny problém prvovýroby mlieka. In Infovet, roč. 6, 1999, s. 27 - 28.

168

11. CARTER. E. W. – KERR, D. E. Optimization of DNA-based Vaccination in Cows

Using Green Fluorescent Protein and Protein A as a Prelude to Immunization Against

Staphylococcal Mastitis. In Journal Dairy Science, roč. 86, 2003, s.1177 - 1186.

12. DAWSON, S. Ethidium bromide Decontamination. [online]. February 1996 [cit. 2005-01-

25] Department of Biochemistry, University of Nottingham. Dostupné na internete:

<http://www.nottingham.ac.uk/~mbzspd/methods/Ethidium_ Bromide_Dec.html>.

13. DE HAAS, Y. 2003. Somatic cell count patterns: Improvement of udder health by

genetics and management: PhD Thesis. Wageningen : Wageningen Universiteit, 2003.

177 s. ISBN 90-5808-873-1.

14. DELUYKER, H. A. – VAN OYEE, S. N. – BOUCHER, J. F. Factors Affecting Cure

and Somatic Cells Count After Pirlimycin Treatment of Subclinical Mastitis in Lactating

Cows. In Journal Dairy Science, roč. 88, s. 604 - 614.

15. D'HAESE, E. - NELIS, H. J. - REYBROECK, W. Determination of somatic cells in

milk by solid phase cytometry. In J. Dairy Research, roč. 68, February 2001, č. 1, s. 9 -14.

16. DOSOGNE, H. – VANGROENWEGHE, F. – MEHRZAD, J. – MASSART-LEËB,

A. M. – BURVENICH, C. Differential Leukocyte Count Method for Bovine Low

Somatic Cell Count Milk. In Journal Dairy Science, roč. 86, 2003, s. 828 - 834.

17. DRAHOŠOVÁ, K. – DRONČOVSKÝ, M. Mastitída – najčastejšia príčina zníženej

akosti mlieka. In Mliekarstvo, roč. 35, december 2004, č. 4, s. 7.

18. ELEČKO, J. Trendy v problematike výskumu ÚEVM V Košiciach. Mastitídy a sekrečné

poruchy mliečnej žľazy. In Slovenský veterinársky časopis, roč. XX, 1995, č. 5, s. 218 -

226.

19. Ethidium Bromid Safety: [online]. May 1999 [cit. 2005-01-25]. University of

Washington, Enviromental Health and Safety. Dostupné na internete: <http://www.ehs.

washington.edu/updates/TipsEthidium.htm>.

20. Eurachem: Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement – Guide. 8. Step 4.

Calculating the Combined Uncertainty. [online]. 2000 [cit. 2006-02-19]. Dostupné na

internete: <www.measurementuncertainty.org/mu/guide/index.html>.

21. FAIRBAIM, D. J. – LAW, B. A. Proteinases of psychrotrophic bacteria: their

production, properties, effects and control. In J. Dairy Res., roč. 53, 1986, s. 139 – 177.

22. FITTS, J. E. – MURPHY, S. Direct Microscopic Somatic Cell Count Guideline – Rules

and Examples for Counting Somatic Cell in Milk. [online]. July 2004 [cit. 2006-01-08].

Department of Food Science Cornell University, Ithaca, New York, Dostupné na

internete: <http://www.foodscience.cornell.edu/mqip/BACT-DMCmum-SCC.doc>.

169

23. FOLTYS, V. – KIRCHNEROVÁ, K. Uplatnenie kontrolného mastitídneho programu

v praxi. [online]. 2003 [cit. 2005-12-30]. Ústav vedecko-technických informácií pre

pôdohospodárstvo, Nitra. Dostupné na internete: <http://www.agroporadenstvo.sk/zv/hd/

drobnosti/mastitpr.htm>.

24. FOSS ELECTRIC: Integrated Milk TestingTM Type 29500 Reference manual. GB FOSS

Issue 5GB October 2000 P/N 491647.

25. GERALD, M. J. J. How Does Somatic Cell Count Affect Milk Quality & Safety?

[online]. 2001 [cit. 2005-12-29]. College of Agriculture and Life Sciences, Department of

Dairy Science. Dostupné na internete: <www.dasc.vt.edu/faculty/jones/ MilkSafe.htm>.

26. GOLIAN, J. 1998. Ochorenia z potravín. 1. vyd. SPU v Nitre : Tlačové a edičné

stredisko SPU v Nitre, 1998. 128 s. ISBN 80-7137-519-5.

27. GONZALO, C. - MARTIŃEZ, J. R. – CARRIEDO, J. A. – SAN PRIMITIVO, F.

Fossomatic Cell-Cunting on Ewe Milk: Comparison with Direct Microscopy and Study of

Variation Factors. In Journal Dairy Science, roč. 86, 2003, s. 138 - 145.

28. GRAPPIN, R. – JEUNET, R. Premiers essais de l’appareil Fossomatic pour la

de´termination automatique du nombre de cellules du lait. In Le lait, roč. 54, 1974 s. 627 -

644.

29. GRIEGER, C. – HOLEC, J. et al. 1990. Hygiena mlieka a mliečnych výrobkov. 1. vyd.

Bratislava : Príroda, 1990. 397 s. ISBN 80-07-00253-7.

30. GRÖHN, Y. T. – WILSON, D. J. – GONZÁLEZ, R. N. – HERTL, J. A. –

SCHULTE, H. – BENNETT, G. – SCHUKKEN, Y. H. Effect of Pathogen-Specific

Clinical Mastitis on Milk Yield in Dairy Cows. In Journal Dairy Science, roč. 87, 2004, s.

3358 - 3374.

31. HAGELTORN, M. – SAAD, M. A. Flow cytofluorometric characterization of bovine

blood and milk leukocytes. In Am. J. Vet. Res., roč. 47, 1986, s. 2012 - 2016.

32. HALAJ, M. Meradlá – Prednáška 2 - Všeobecná metrológia: Prednáška. Strojnícka

fakulta STU v Bratislave, 2003, zimný semester 2003/2004. s.31. [online]. 2003 [cit.

2006-06-18]. Strojnícka fakulta STU v Bratislave. Dostupné na internete:

<http://www.kam.sjf.stuba.sk/katedra/vyuka/pt4/ VM-prednaska2-meradla.pdf>.

33. HALAJ, M. Chyby a neistoty merania – neistoty merania - Všeobecná metrológia:

Prednáška. Strojnícka fakulta STU v Bratislave, november 2004. s. 3, s.17, s.19 a s. 20.

[online]. 2004 [cit. 2006-06-18]. Strojnícka fakulta STU v Bratislave. Dostupné na

internete: <http://www.kam.sjf.stuba.sk/ katedra/vyuka/pt4/VM-prednaska6-neistota.pdf>.

170

34. HANUŠ, O. et al.. Význam laboratórního testování syrového kravského mléka pro

chavatele dojnic. In Mliekarstvo, roč. 35, 2004, č. 2, s. 31 - 38.

35. HARMON, R. J. Controlling Contagious Mastitis, [online]. 2006 [cit. 2005-01-25]. A

Global Organization for Mastitis Control and Milk Quality, Verona, WI, USA. Dostupné

na internete: <http://www.nmconline.org/articles/contagious.htm>.

36. HARMON, R. J. Physiology of Mastitis and Factors Affecting Somatic Cell Counts. In

Journal Dairy Science, roč. 77, 1994, č. 7, s. 2103 – 2112.

37. HEALD, C.W. – JONES, G. M. – NICKERSON, S. C. – PATTERSON, W. N. –

VINSON, W. E. Preliminary evaluation of the Fossomatic somatic cell counter for

analysis of individual cow samples in a central testing laboratory. In J. Food Prot., roč.

40, 1977, s. 523 – 526.

38. HEESCHEN, W. Determination of somatic cells in milk (technical aspect of counting).

Bull. Int. Dairy Fed. roč. 85, s. 79 - 92.

39. HOGAN, J. S. – HARMON, R. J. - LANGLOIS, B. E. - HEMKEN, R. W. – CRIST,

L. W. Efficacy of an iodine backflush for preventing new intramammary infections. In

Journal Dairy Science, roč. 67, 1984, s.1850 - 1859.

40. HOGAN, J. S. – SMITH, K. L. A practical look at enviromental mastitis. Cornp.

Continuing Educ. Bacterial. In Pract. Vet., roč. 9, 1987, č. 10, s. F341.

41. HOGAN, J. S. – SMITH, K. L. – TOOHUNTER, D. A. – SCHIENBERGER, P.S.

Bacterial Counts Associated with Recycled Newspaper Bedding. In Journal Dairy

Science, roč. 73, 1990, s.1756 – 1761.

42. HOGAN, J. S. – WEISS, W. P. – SMITH, K. L. Role of Vitamin E and Selenium in

Host Defense Against Mastitis. In Journal Dairy Science, roč. 76, 1993, s.2795 – 2803.

43. HOGAN, J. S. – SMITH, K. L. Bacteria Counts in Sawdust Bedding. In Journal Dairy

Science, roč. 80, 1997, s.1600 – 1605.

44. HRAZDÍRA, I. 1990. Biofyzika. Učebnice pro lékařské fakulty. 2. vyd. Praha :

Avicenum, 1990. 318 s. ISBN 80-201-0046-6.

45. CHAMBERLAIN, N. Gastrointestinal tract infection. [online]. 2005 [cit. 2005-03-23].

Kirksville College of Osteopathic Medicine. Dostupné na internete: <http://www.kcom

.edu/faculty/chamberlain/gastro.htm#staph>.

46. CHORVÁT, D. Biofyzika. Bratislava: Univerzita Komenského Bratislava, 1998. s. 42-43.

ISBN 80-223-1083-2. [online – elektronický učebný text]. 2006 [cit. 2006-06-22].

Univerzita Komenského Bratislava. Dostupné na internete: <http://www.fmph.uniba.sk/

mffuk/studium/stud_materialy/stud_ materialy/biofyz/biof03.pdf>.

171

47. ICAR: Analytical methods for milk recording analysis. [online]. Version n°1 –

13/10/2005 [cit. 2005-12-30]. International Committee for Animal Recording. Dostupné

na internete: <http://www.icar.org/DOCS/milk_laboratories_leray/List_analytical_ metho

ds_in_milk_recording.pdf>.

48. IKONEN, T. – MORRI, S. – TYRISEVÄ, A. M. – RUOTTINEN, O. – OJALA, M.

Genetic and Phenotypic Correlations Between Milk Coagulation Properties, Milk

Production Traits, Somatic Cell Count, Casein Content, and pH of Milk. In Journal Dairy

Science, roč. 87, 2004, s.458 - 467.

49. INGAWA, K. H. – ADKINSON, R. W. – GOUGH, R. H. Evaluation of Gel Teat

Cleaning and Sanitizing Compounds for Premilking Hygiene. In Journal Dairy Science,

roč. 75, 1992, s.1224 – 1232.

50. ISO/WD 13366-1 / IDF 148-1: 2005, Milk - Enumaration of somatic cells - Part 1:

Microscopic method (Reference method).

51. ISO/WD 13366-2 / IDF 148-2: 2006, Milk – Enumeration of somatic cells – Part 2:

Guidance on the operation of fluoro-opto-electronic counters.

52. ISO 13366-3: 1997, Milk - Enumeration of somatic cells - Part 3: Fluoro-opto-electronic

method.

53. KAZDA, J. Úvod do nejistot měření. In Zborník prednášok zo seminára Stanovovanie

neistôt merania, kalibrácie a výkonu skúšok. Spišská Nová Ves, Kalibračné združenie SR

a Q-Test plus s.r.o. Bratislava, február 2006, s. 70 a s. 73.

54. KLEI, L. – YUN, J. – SAPRU, A. – LYNCH, J. – BARBANO, D. – SEARS, P. –

GALTON, D. Effects of Milk Somatic Cell Count on Cottage Cheese Yield and Quality.

In Journal Dairy Science, roč. 81, 1998, s. 1205 - 1213.

55. KOLLER, L. Analytická chémia. Princípy analytických metód pre anorganickú prvkovú

analýzu: Študijný materiál pre študentov HF a FBERG TU. Košice: Technická univerzita

v Košiciach, 2002 s. 16. [online]. 2002 [cit. 2006-01-19]. Technická univerzita Košice.

Dostupné na internete: <http://sk ripta.lib.tuke.sk/16000/pdf/AnalytickaChemiaLadislav

Koller_ALL.pdf>.

56. KOVÁČ, G. - et al. Choroby hovädzieho dobytka. 1. vyd. Prešov : M&M vydavateľstvo

Prešov, október 2001. s. 673.- 676. ISBN 80-88950-14-7.

57. KOVÁČIK, J. – VALENT, M. – KOLLÁROVÁ, E. Fyziológia zvierat. 2. upravené

vyd. Nitra : Vydavateľské a edičné stredisko Vysokej školy poľnohospodárskej v Nitre,

1996. 284 s. ISBN 80-7137-322-2.

172

58. KRISTULA, M. A. – ROGERS, W. – HOGAN, J. S. – SABO, M. Comparison of

Bacteria Populations in Clean and Recycled Sand used for Bedding in Dairy Facilities. In

Journal Dairy Science, roč. 88, 2005, s. 4317 - 4325.

59. KULÍŠEK, V. – HLUCHÝ, S. – MASSANYI, L. – MARENČÁK, L. – UHRÍN, V.

Funkčná anatómia hospodárskych zvierat. 3. upravené vyd. Nitra : Vysoká škola

poľnohospodárska v Nitre, 1996. s. 6., s. 40. ISBN 80-7137-323-0.

60. LE ROUX, Y. – COLIN, O. LAURENT, F. Proteolysis in Samples of Quarter Milk with

Varying Somatic Cell Counts. 1. Comparison of Some Indicators of Endogenous

Proteolysis in Milk. In Journal Dairy Science, roč. 78, 1995, s. 1289 – 1297.

61. LONGUET, M. – SERDUC, R. – RIVA, C. Implication of bax in apoptosis depends on

microtubule network mobility. In International Journal Oncology, roč. 25, 2004, s. 309-

317. [online]. 2004 [cit. 2006-06-22]. University of Crete, Faculty of Medicine. Dostupné

na internete: <http://147.52.72.117/IJO/ 2004/volume25/number2/309.pdf>.

62. LUNN, G. - SANSONE, E. B. Ethidium Bromide. Destruction and Decontamination of

Solutions. In Anal. Biochem. roč. 162, 1987, s. 453 - 458.

63. LUNN, D. - SANSONE, E. B. Decontamination of Ethidium Bromide Spills. In Appl.

Ind. Hyg. roč. 4, 1989, s. 234-237.

64. ĽALÍK, V. Neistoty merania pri kalibrácii posuvných meradiel. In Zborník prednášok zo

seminára Stanovovanie neistôt merania, kalibrácie a výkonu skúšok. Spišská Nová Ves :

Kalibračné združenie SR a Q-Test plus s.r.o. Bratislava, február 2006, s. 103.

65. MA, Y. – RYAN, C. – BARBANO, D. M. – GALTON, D. M. – RUDAN, M. A.

BOOR, K. J.: Effects of Somatic Cell Count on Quality and Shelf-Life of Pasteurized

Fluid Milk. In Journal Dairy Science, roč. 83, 2000, s. 264 - 274.

66. MAF NZ: Ministry of Agriculture and Forestry New Zealand: MAF Food: Dairy

Plants, Circular number 69, Dairy Industry Regulations 1990, D115.1 Raw Milk

Acceptance, 1990. ISBN 0-478-07639-8. [online]. 1990 [cit. 2006-01-13]. Dostupné na

internete: <http://www.nzfsa.govt.nz/dairy/publications/standards/d115-1.pdf>.

67. MARCUS, E. – KEHRLI, JR. Factors Affecting Milk Somatic Cells and Their Role in

Health of the Bovine Mammary Gland. In Journal Dairy Science, roč. 77, 1994, s. 619 -

627.

68. MARTÍNEZ, J. R. – GONZALO, C. – CARRIEDO, J. A. – SAN PRIMITIVO, F.

Effect of Freezing on Fossomatic Cell Counting in Ewe Milk. In Journal Dairy Science,

roč. 86, 2003, s. 2583 – 2587.

173

69. MATTHEWS, K. R. – REJMAN J. J. – TURNER, J.D. – OLIVER, S.P. Proliferation

of a Bovine Mammary Epithelial Cell Line in the Presence of Bacterial Virulence Factors.


70. MIDOUX, P. – MAYER, R. – MONSIGNY, M. Membrane permeabilization by α-

helical peptides: a flow cytometry study. In Biochim. Biophys. Acta. roč.1239(2), 1995, s.

249-256. [online]. November 1, 1995 [cit. 2006-06-01]. National Center for

Biotechnology Information, U. S. National Library for Medicine. Dostupné na internete:

<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abs

tract &list_uids =7488630>.

71. MIKULA, I. – PILIPČINEC, E. – TKÁČIK, J. – PISTIL, J. – HOLODA, E.:

Veterinárna mikrobiológia a imunológia. Praktické cvičenia. 1. vyd. Bratislava : Príroda

pre Vysokú školu veterinársku v Košiciach, 1985. 205 s.

72. MILES, H. – LESSER, W – SEARS, P. Our Industry Today. The Economic

Implications of Bioengineered Mastitis Control. In Journal Dairy Science, roč. 75, 1992,

s. 596 – 605.

73. MILK QUALITY REGULATION: Dairy Products Act, N.B. Reg. 86-118. [online].

1986 [cit. 2005-02-25]. Canadian Legal Information Institute. Dostupné na internete:

<http://www.canlii.org/nb/laws/regu/1986 r.118/20050114/whole.html>.

74. MURPHY, S. C. – BOOR, K. J. Sources and Causes of High Bacteria Counts in Raw

Milk: An Abbreviated Review. [online]. 1999 [cit. 2005-01-25]. Department of Food

Science Cornell University, Ithaca, New York, Dostupné na internete:

<http://www.foodscience.cornell.edu/mqip/BACTRawRev.doc>.

75. Nariadenie (ES) č. 853/2004 Európskeho parlamentu a Rady z 29. apríla 2004, ktorým sa

ustanovujú osobitné hygienické predpisy pre potraviny živočíšneho pôvodu. [online]. 2004

[cit. 2006-02-07]. Štátna veterinárna a potravinová správa SR. Dostupné na internete:

<http://www.svps.sk/sk/pdf/legislativa/nk_0853 _2004.pdf>.

76. Nariadenie (ES) č. 854/2004 Európskeho parlamentu a Rady z 29. apríla 2004, ktorým sa

ustanovujú osobitné predpisy na organizáciu úradných kontrol produktov živočíšneho

pôvodu určených na ľudskú spotrebu. [online]. 2004 [cit. 2006-02-07]. Štátna veterinárna

a potravinová správa SR. Dostupné na internete: <http://www.svps.sk/sk/pdf/legisl

ativa/nk_0854_2004.pdf>.

77. Nariadenie Komisie (ES) č. 1662/2006 zo 6. novembra 2006 , ktorým sa mení a dopĺňa

nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004, ktorým sa ustanovujú

osobitné hygienické predpisy pre potraviny živočíšneho pôvodu. [online]. 2006 [cit. 2006-

174

10-07]. Eurlex. Dostupné na internete: <http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/

LexUriServ.do?uri=OJ:L:2006:320:0001:0010:SK:PDF>.

78. Nariadenie Komisie (ES) č. 1664/2006 zo 6. novembra 2006, ktorým sa mení a dopĺňa

nariadenie (ES) č. 2074/2005, pokiaľ ide o vykonávacie opatrenia pre určité produkty

živočíšneho pôvodu určené na ľudskú spotrebu, a zrušujú určité vykonávacie opatrenia.

[online]. 2006 [cit. 2006-10-07]. Eurlex. Dostupné na internete: <http://eur-

lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2006:320:0013:0045:SK:PDF>.

79. Nariadenie vlády Slovenskej republiky č. 312/2003 Z.z. o zdravotných požiadavkách na

výrobu a uvádzanie na trh surového mlieka, tepelne ošetreného mlieka a mliečnych

výrobkov. [online]. 2003 [cit. 2006-02-07]. Štátna veterinárna a potravinová správa SR.

Dostupné na internete: <http://www.svps.sk/sk /pdf/legislativa/nv_312_2003.pdf>.

80. Nariadenie vlády Slovenskej republiky č. 284/2004 Z.z., ktorým sa mení a dopĺňa

nariadenie vlády Slovenskej republiky č. 312/2003 Z. z. o zdravotných požiadavkách na

výrobu a uvádzanie na trh surového mlieka, tepelne ošetreného mlieka a mliečnych

výrobkov. [online]. 2004 [cit. 2006-02-07]. Štátna veterinárna a potravinová správa SR.

Dostupné na internete: <http://www.svps.sk /sk/pdf/legislativa/nv_0284_2004.pdf>.

81. NEAVE, F. K. - DODD, D. H. - KINGWILL, R.G. – WESTGARTH, D.R. Control of

mastitis in the dairy herd by hygiene and management. In Journal Dairy Science, roč. 79,

1996, s. 52:696.

82. NICKERSON, S.C. Clinical Mastitis: to Treat Or Not to Treat, [online]. 1995 [cit. 2005-

12-18]. Department of Agricultural, Food and Nutritional Science. University of Alberta,

Edmonton. Dostupné na internete: <http://www.wcds.afns.ualberta.ca/Proceedings/1996/

wcd96355.htm>.

83. NZFSA: New Zealand food safety authority. Dairy Circular. [online]. 1997 [cit. 2005-

03-23]. Dostupné na internete: <http://www.nzfsa.govt.nz/dairy/publications/circulars

/no31.htm>.

84. OLIVER, S. P. – KING, S. H. – TORRE, P. M. – SHULL, E. P. - DOWLEN, H. H. –

LEWIS, M. J. – SORDILLO, L. M. Prevention of bovine mastitis by a postmilking teat

disinfectant containing chlorous acid and chlorine dioxide in a soluble polymer gel. In


85. ORLANDINI, S. Collaborative Study – Reference Method For Somatic Cell Counting

ISO 13366-1 FIL/IDF 148-1, Cow Milk, October 2005 : kolaboratívna štúdia. Roma :

Joint Action Team on Automated Method-Working group “Somatic Cell Count”,

175

Associazione Italiana Allevatori Laboratorio Standard Latte V.dell’ Industria, 24

Maccarese, Roma – Italy, 2005. 11 s.

86. ÖSTENSSON, K. – HAGELTORN, M. – ASTROM, G. Differential cell counting in

fraction-collected milk from dairy cows. In Acta Vet. Scand. roč. 29, 1988, s. 493 – 500.

87. OWENS, W. E. – NICKERSON, S. C. – BODDIE, L. R. – TOMITA, G. M. – RAY,

C. H. Prevalence of Mastitis in Dairy Heifers and Effectiveness of Antibiotic Therapy. In

Journal Dairy Science. roč. 84, 2001, s. 814 - 817.

88. PILLAI, S. R. – KUNZE, E. – SORDILLO, L. M. – JAYARAO, B. M. Application of

Differential Inflammatory Cell Count as a Tool to Monitor Udder Health. In Journal

Dairy Science, roč. 84, 2001, s. 1413 - 1420.

89. POLITIS, I. – NG-KWAI-HANG, K. F. Effects of somatic cells count and milk

composition on the coagulating properties of milk. In Journal Dairy Science, roč. 71,

1988, s. 1740 – 1746.

90. POPELKA, P. Rezíduá penicilínov v potravinách a surovinách živočíšneho pôvodu :

dizertačná práca. Košice : Univerzita veterináskeho lekárstva, Katedra hygieny

a technológie potravín, 2001. 66 s.

91. PYÖRÄRLÄ, S. Indicators of inflammation in the diagnosis of mastitis. In Vet. Res. roč.

34, 2003, 565 - 578.

92. QUILLARDET, P.- HOFNUNG, M. Ethidium Bromide and Safety-Readers Suggest

Alternative Solutions. In Trends Genet., roč. 4, 1988, s. 89 - 90.

93. RAJAH, R. Mastitis. In Small-Scale Dairy Farming Manual, roč. 5, 1993, Husbandry

Unit 10.5, s. 119. [online]. 1993 [cit. 2005-12-30]. Food and Agriculture Organization of

the United Nations. Dostupné na internete: <http://www.fao.org/ag/againfo/subjects/

documents/Dairyman/Dairy/V5U10_5.htm>.

94. REDELMAN, D. – BUTLER, S. – ROBISON, J. – GARNER, D. Identification of

inflammatory cells in bovine milk by flow cytometry. In Cytometry, roč. 9, 1988, s. 463 –

468.

95. RIAN, M. P. – MEANEY, W. J. – ROSS, P. E. – HILL, C. Evaluation of Lacticin 3147

and Teat Seal Containing This Bacteriocin for Inhibition of Mastitis Pathogens. In Appl.

Environ. Microbiol., roč. 64, 1998, č. 6, s. 2287 - 2290.

96. RICE, D. N. Using the California Mastitis Test (CMT) to Detect Subclinical Mastitis.

File G556 under DAIRY C-3, Herd Management. [online]. 1987, electronic version

issued: January1997 [cit. 2005-12-30]. University of Nebraska-Lincoln. Dostupné na

internete: <http://ianrpubs.unl. edu/dairy/g556.htm#top>.

176

97. RIMARČÍK, M. Opisné charakteristiky. [online]. [cit. 2006-02-19]. Marián Rimarčík,

osobná web stránka. Dostupné na internete: <http://rimarcik.com/sk/navigator/och.htm>.

98. RIVAS, A. L. – TADEVOSYAN, R. – QUIMBY, F. W. – COAKSAYGAN, T. –

LEIN, D. H. Identification of subpopulations of bovine mammary-gland phagocytes and

evaluation of sensitivity and specificity of morphologic and functional indicators of

bovine mastitis. In Canadian J. Vet. Res., roč. 66, 2002, s. 165 - 172.

99. RUEGG, P. L. – TABONE, T. J. The Relationship Between Antibiotic Residue

Violations and Somatic Cell Counts in Wisconsin Dairy Herds. In Journal Dairy Science,

roč. 83, 2000, s. 2805 – 2809.

100. SAAD, A. M. – ÖSTENSSON, K. Flow cytofluorometric studies on the alteration of

leukocyte populations in blood and milk during endotoxin-induced mastitis in cows. In

Am. J. Vet. Res. roč. 51, 1990, s. 1603 – 1607.

101. SAEMAN, A. I. – VERDI, R. J. – GALTON, D. M. – BARBANO, D. M. Effect of

mastitis on proteolytic activity in bovine milk. In Journal Dairy Science, roč. 71, 1988 s.

505 - 512.

102. SANTOS, M. V. – MA, Y. – BARBANO, D. M. Effect of Somatic Cell Count on

Proteolysis and Lipolysis in Pasteurized Fluid Milk During Shelf-Life Storage. In


103. SCHAIK, V.G. – LOTEM, M. – SCHUKKEN, Y.H. Trends in Somatic Cell Counts,

Bacterial Counts, and Antibiotic Residue Violations in New York State During 1999–

2000. In Journal Dairy Science. roč. 85, 2002, s. 782 – 789.

104. SCHMIDT-MADSEN, P. Fluoro-opto-electronic cell-counting on milk. In Journal

Dairy Research, roč. 42, 1975, s. 227 - 239.

105. SCHMIDT-MADSEN, P. Influence of storage and preservation of milk samples on

microscopic and Fossomatic somatic cell counts. In Nord. Vet. Med. roč. 31, 1979, s.

449 – 454.

106. SCHUKKEN, F. J. – GROMMERS, D. VAN DE GEER. – ERE, H. N. – BRAND,

A. Risk Factors for Clinical Mastitis in Herds with a Low Bulk Milk Somatic Cell

Count. Risk Factors for Escherichia coli and Staphylococcus aureus. In Journal Dairy

Science, roč. 74, 1991, s. 826 - 832.

107. Sigma-Aldrich Co.: 2006-2007 Biochemicals, Reagents & Kits for Life Science

Research – catalogue. Sigma-Aldrich Co., 2006, s. 964.

108. SLANINA, Ľ. – BARTKO, P. – ČANECKÝ, P. – FRIED, K. – HOJOVCOVÁ, M.

– RADEMACHER, R. – VRZGULA, L. Klinická propedeutika a diagnostika

177

vnútorných chorôb hospodárskych zvierat. 1. vydanie. Bratislava : Slovenské

vydavateľstvo pôdohospodárskej literatúry Bratislava, 1965. 574 s.

109. Smernica rady 92/46/EHS zo 16. júna 1992, ktorou sa stanovujú hygienické predpisy

pre výrobu surového mlieka, tepelne ošetreného mlieka a mliečnych výrobkov a ich

uvádzanie na trh. Official Journal of the European Communities No. L 268, 14-9-1992.

110. SMITH, K. L. – TODHUNTER. L. D. A., - SCHOENBERGER, S. Enviromental

mastitis: cause, prevalence, prevention. In Journal Dairy Science, roč. 68, 1985, s. 1531.

111. SMITH, K. L. Standards for somatic cells in milk: Physiological and regulatory.

Mastitis Newsletter, Newsletters of the IDF No.144, 1996. s 7.

112. SMITH, K. L. – HOGAN, J.S. Milk Quality a Worldwide Perspective. [online]. 1998

[cit. 2005-01-25]. A Global Organization for Mastitis Control and Milk Quality, Verona,

WI, USA. Dostupné na internete: <http://www.nmconline.org/articles/keynote98.htm>.

113. SNAS: Slovenský národný akreditačný systém: Metodické smernice na akreditáciu.

Vyjadrovanie neistôt merania pri kalibrácii, MSA 0104-97 EAL R2. [online]. 1997 [cit.

2006-01-19]. ÚNMS SR. Dostupné na internete: <http://www.snas.sk/files/msa/MSA

_0104_december1997.pdf>.

114. Standard Operating Procedure Ethidium Bromide: Dickinson College Health &

Safety. [online]. January 1999 [cit. 2005-01-25]. Dickinson College, Carlisle, Pa.

Dostupné na internete: <http://www.dickinson.edu/departments/hazard/SOPs/ethidium_

bromide.html>.

115. STN EN ISO 707: 2001, Mlieko a mliečne výrobky. Návod na odber vzoriek.

116. STN EN ISO 4833: 2003, Mikrobiológia potravín a krmív. Horizontálna metóda na

stanovenie počtu mikroorganizmov. Metóda počítania kolónií kultivovaných pri 30 °C.

117. STN EN ISO 6887-1: 1999, Mikrobiológia potravín a krmív. Úprava analytických

vzoriek, príprava základnej suspenzie a desaťnásobných riedení na mikrobiologické

skúšanie. Časť 1: Všeobecné pokyny na prípravu základnej suspenzie a desaťnásobných

riedení.

118. STN EN ISO 8261: 2001, Mlieko a mliečne výrobky. Všeobecné pravidlá úpravy

analytických vzoriek, prípravy základných suspenzií a desaťnásobných riedení na

mikrobiologické skúšanie.

119. STN EN ISO 13366-1: 2001, Mlieko, Stanovenie počtu somatických buniek, Časť 1:

Mikroskopická metóda.


Metóda elektronického počítania častíc.

178


Fluorescenčná optická elektronická metóda.

122. STN 570529: 1999, Surové kravské mlieko na mliekarenské ošetrenie a spracovanie.

123. STN ISO 7218: 2000, Mikrobiológia potravín a krmív. Všeobecné pravidlá

mikrobiologického skúšania.

124. SUAREZ, V. H. – BUSETTI, M. R. – MIRANDA, A. O. – CALVINHO, L. F. –

BEDOTTI, D. O. – CANAVESIO, V. R. Effect of Infectious Status and Parity on

Somatic Cell Count and California Mastitis Test in Pampinta Dairy Ewes. In J. Vet.

Med., Series B, roč. 49, June 2002, č. 5, s. 230.

125. ŠVPS SR, Štátna veterinárna a potravionová správa Slovenskej republiky. Rozhodnutie

č. 11448/2003-480 o autorizácii ŠVPÚ Nitra na výkon odborných činností Národného

referenčného laboratória pre mlieko a mliečne výrobky (2003).

126. TANČIN, V. – HLUCHÝ, S. – MIHINA, Š. – UHRINČAŤ, M. – HETÉNYI, L.

2001. Fyziológia získavania mlieka a anatómia vemena. 1. vyd. Nitra : Výskumný ústav

živočíšnej výroby Nitra vo vydavateľstve Slovenský chov, 2001. 122 s.

ISBN 80-88872-13-8.

127. TODHUNTER, A. – SMITH, K. L. – HOGAN, J. S. Physiology and Management,

Environmental Streptococcal Intramammary Infections of the Bovine Mammary Gland.


128. TONGEĽ, P. – MIHINA, Š. Mastítída – zlodej mlieka. [online]. 2005 [cit. 2006-01-

08]. Ústav vedecko-technických informácií pre pôdohospodárstvo, Nitra. Dostupné na

internete: <http://www.agroporadenstvo.sk/zv/hd/mlieko/mastitida.htm>.

129. TSENKOVA, R. – ATANASSOVA, S. – KAWANO, S. – TOYODA, K. Somatic cell

count determination in cow’s milk by near-infrared spectroscopy: A new diagnostic

tool. In J. Anim. Sci., roč. 79, 2001, s. 2550 - 2557.

130. TWOMEY, D. P. – WHEELOCK, A. I. – FLYNN, J. – MEANEY, W. J. – HILL,

C. – ROSS, R. P. Protection Against Staphylococcus aureus Mastitis in Dairy Cows

Using a Bismuth-Based Teat Seal Containing the Bacteriocin, Lacticin 3147. In Journal

Dairy Science, roč. 83, 2000, s. 1981 - 1988.

131. UBBEN, E. H. Quality management for DMSCC from milk sample to ring trial. Lecture

In: Workshop of the European National Reference Laboratories “Milk and Milk

Products” at the Federal Research Centre for Nutrition and Food, Kiel, Germany

September 9 - 10, 2004. In LOMBARD, B.: Report of the Workshop of the National

Reference Laboratories „Milk and Milk Products“ on the microscopic counting of

179

somatic cells in milk. 9 - 10 September 2004, BFEL, Kiel, Germany, (EU Community

Reference Laboratory for Milk and Milk Products, AFSSA, 23 Avenue du General De

Gaulle, Maisons-Alfort, Paris, France).

132. UBBEN, E. H. – KNAPPSTEIN, K. 10 years of inter-comparisons on counting of

somatic cells. In IDF Mastitis Newsletter, roč. 26, 2005. s. 26 - 27. [online]. 2005 [cit.

2006-01-06]. International Dairy Federation. Dostupné na internete: <http://www.fil-

idf.org/WebsiteDocuments/Mastitis%20Newsletter%2026-2005.pdf>.

133. URBAN, P. Zdroje neistôt pri kalibrácii strmeňových mikrometrov. In Zborník

prednášok zo seminára Stanovovanie neistôt merania, kalibrácie a výkonu skúšok.

Spišská Nová Ves : Kalibračné združenie SR a Q-Test plus s.r.o. Bratislava, február

2006, s. 111.

134. USDA: United States Department of Agriculture: General Specifications for Dairy

Plants Approved for USDA Inspection and Grading Service. [online]. 2002 [cit. 2005-

03-23]. United States Department of Agriculture. Dostupné na internete:

<http://www.ams. usda.gov/ dairy/genpecs.pdf>.

135. VASIĽ, M. Mastitídy dojníc – liečiť alebo neliečiť? In Infovet, roč. 5, 1998, č. 2, s. 7.

136. VERDI, R. J. – BARBANO, D. M. Properties of Proteases from Milk Somatic Cells

and Blood Leukocytes. In Journal Dairy Science, roč. 74, 1991, s. 2077 - 2081.

137. VERMUNT, A.E.M. – LOEFFEN, G.J.M – VAN DER VOET, H. – NABER,

M.A.A.M.: Development of reference samples for the calibration and quality control of

somatic cell count using a Fossomatic instrument. In Netherlands Milk & Dairy Journal.

roč. 49, 1995, s. 000 - 000.

138. WATSON, J. D. – TOOZE, J. – KURTZ, D. T. 1998. Rekombinantní DNA. Krátký

kurs. 1. vyd. Praha : Academia, 1988. s. 40 – 41, ISBN 21-028-88. Americký originál:

Recombinant DNA (A Short Course). 1st published in the United States by W.H.

Freeman and Company, New York, New York and Oxford.

139. WIKIPEDIA – THE FREE ENCYCLOPEDIA: White blood cell. [online]. [s.a.].

[cit. 2006-06-18]. Wikipedia. Dostupné na internete: <http://en.wikipedia.org/wiki/

Leucocytes>.

140. WIKIPEDIA – THE FREE ENCYCLOPEDIA2: Methylene blue. [online]. 4th June

2006 [cit. 2006-06-18]. Wikipedia. Dostupné na internete: <http://en.wikipedia.org/

wiki/Methylene_blue>.

180

141. WIKIPEDIA – THE FREE ENCYCLOPEDIA3: Intercalation (chemistry). [online].

3rd January 2006 [cit. 2006-06-18]. Wikipedia. Dostupné na internete: <http://en.wikipe

dia.org/wiki/Intercalation_(chemistry)>.

142. WILSON, D. J. – GONZALES, R. N. – CASE, K. L. – GARRISON, L. L. –

GROÖHN, T. Comparison of Seven Antibiotic Treatmens with No Treatment for

Bacteriological Efficacy Against Bovine Mastitis Pathogens. In Journal Dairy Science,

roč. 82, 1999, s. 1664 - 1670.

143. WILSON, D. J. – GONZALEZ, R. N. – SEARS, P. M. Segregation or Use of

Separate Milking Units for Cows Infected with Staphylococcus aureus: Effects on

Prevalence of Infection and Bulk Tank Somatic Cell Count. In Journal Dairy Science,

roč. 78, 1995, s. 2083 - 2085.

144. www.infovets.com: D100 California Mastitis Test (CMT). [online]. [s.a.]. [cit. 2005-

12-31]. Infovets.com. Dostupné na internete: <http://www.infovets.com/demo/demo/

smrm/ D100.HTM>.

145. www.iupui.com: Indiana University-Purdue University Indianapolis. Molecular

medicine in action. Flow cytometry. [online]. 2005 [cit. 2006-01-12]. Indiana

University-Purdue University Indianapolis. Dostupné na internete: < http://www.iup

ui.edu/~wellsctr/MMIA/htm/flowcytometry.htm>.

146. www.nmconline.org: National Mastitis Council, Inc.: Summary of Peer-Reviewed

Publications of Efficacy of Premilking and Postmilking Teat Disinfectants Published

Since 1980. [online]. Updated january, 2005 [cit. 2005-12-20]. National Mastitis

Council, Inc.Dostupné na internete: <http://www.nmconline.org/docs/Teatbibl.pdf>.

147. www.olympus.com – LONG, J. C. – DAVIDSON, M. W. Olympus BX51 Microscope

Light Pathways, Interactive Java Tutorial. [online]. [s.a.]. [cit. 2006-01-08]. Olympus

America, Inc. Dostupné na internete: <http://www.olympusmicro.com/primer/java/

lightpaths/bx51fluorescence/index.html>.

148. www.olympus.com (2): UIS Fluorescence Mirror Units Technical Specifications.

Printed in Japan M1501E-0303B. [online]. [s.a.]. [cit. 2006-01-08]. Olympus Europa.

Dostupné na internete: <http://resources.olympus-europa.com/micro/catalogs/C125

67B6003775C790216DDC27B5B6DAC1256D5500341E72_UISMirrorUnit.pdf#search

=%22UIS%20Fluorescence%20Mirror%20Units%20Technical%20Specifications%22>.

149. ZADOKS, R. N. – ALLORE, H. G. – BARKEMA, H. W. – SAMPIMON, O. C. –

GRÖHN, Y. T. – SCHUKKEN, Y. H. Analysis of an Outbreak of Streptococcus

uberis Mastitis. In. Journal Dairy Science. roč. 84, 2001, s. 590 - 599.

181

150. ZAJÁC, P. – GOLIAN, J. – NOVÁKOVÁ, R. Vplyv Zvýšeného počtu somatických

buniek na zdravotnú neškodnosť surového kravského mlieka. In Zborník

z medzinárodnej vedeckej konferencie „Bezpečnosť a kontrola potravín“. Nitra 6. – 7.

apríl 2005 : Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, s. 151 –155. ISBN 80-

8069-503-2.

151. ZDANOWICZ, M. – SHELFORD, J. A. – TUCKER, C. B. – WEARY, D. M. –

KEYSERLINGK, M. A. G. Bacterial Populations on Teat Ends of Dairy Cows Housed

in Free Stalls and Bedded with Either Sand or Sawdust. In Journal Dairy Science, roč.

87, 2004, s. 1694 - 1701.

9 PRÍLOHY

Príloha 1 – Pravidlá pre identifikáciu a počítanie somatických buniek v surovom

kravskom mlieku

Pravidlá zostavili James E. Fitts z NYS Department of Agriculture & Markets Control

v spolupráci so S. Murphy z Department of Food Science, Cornell University

(Fitts a Murphy, 2004).

Použitá metóda: priame mikroskopické počítanie somatických buniek, metóda (STN

EN ISO 13366-1) s metylénovou modrou (Príloha 1, Obrázok 1 až 24).

1. Charakteristika buniek zafarbených metylénovou modrou.

Jadrá somatických buniek zložené z jednej alebo viacerých jadrových jednotiek sa

dobre farbia metylénovou modrou. Intenzita modrého zafarbenia závisí od techniky farbenia

a vlastností somatických buniek. Jadrová hmota buniek má vo všeobecnosti nerozoznateľnú

formu. Po zafarbení sa môže javiť ako jednoliaty modrý útvar, v niektorých bunkách môže

mať granulovaný vzhľad alebo sa môžu vyskytovať deštrukcie v jej celistvosti. Pri počítaní sa

preto rátajú iba somatické bunky s charakteristickým jadrom. Jadrá leukocytov sú laločnatého

tvaru pričom laloky sú premostené jadrovou hmotou. Multilaločnaté jadrá s premosteniami sa

počítajú ako jedna bunka. Cytoplazma, ktorá za normálnych podmienok obklopuje jadro

somatickej bunky sa môže farbiť rozdielne. Po zafarbení môže mať svetlo modrú farbu alebo

nemusí byť zafarbená vôbec, čo sa javí ako číra zóna. V prípade, že je rozpadnutá nemusí byť

prítomná.

2. Veľkosť somatických buniek

Jadrá počítateľných somatických buniek majú vo všeobecnosti veľkosť 8 µm alebo

o niečo väčšiu. Bunky alebo ich fragmenty (bunky ktoré boli zničené alebo sú rozpadnuté) sa

môžu javiť ako menšie. Pri rátaní sa nepočítajú bunky s jadrom menším ako 4 µm.

Rozpadnuté bunky sa počítajú iba vtedy ak je vidieť viac než 50 % jadra (najmenej 4 µm).

Bunky bez jadra sa nepočítajú.

3. Zhluky somatických buniek

Zhluky somatických buniek sa počítajú ako jedna somatická bunka s tou výnimkou,

že ak sú v zhluku prítomné zreteľne separované jadrá, tieto sa počítajú zvlášť. V prípade,

že sú prítomné zhluky somatických buniek, pri mikroskopovaní sa zvolí nasledovný postup.

Veľmi jemným zaostrovaním sa pozorujú jednotlivé časti zhluku. V prípade, že je jadro

somatickej bunky oddelené od ostatných jadier viditeľnou čírou zónou, počíta sa ako jedna

bunka. Ak sa jadro nedá zreteľne odlíšiť a sú prítomné evidentné premostenia medzi jadrami,

takéto spojenie sa počíta ako jedna somatická bunka.

4. Systém počítania somatických buniek v zornom poli mikroskopu

Pri mikroskopovaní sa vždy zvolí vyhovujúci systém počítania somatických buniek.

Jadrá somatických buniek, ktoré sa dotýkajú okrajov alebo zachádzajú za okraje zorného poľa

sa počítajú tak, aby nedochádzalo k duplicitnému počítaniu somatických buniek,

resp. počítaniu vo väčšej oblasti. Na základe zvoleného systému sa počítajú iba tie bunky,

ktoré sa dotýkajú alebo presahujú zvolený okraj zorného poľa. Pri počítaní v horizontálnych

pruhoch sa vyberie vrchný alebo spodný okraj. Pri počítaní vo vertikálnych pruhoch sa

vyberie ľavý alebo pravý okraj. Nepočítajú sa tie bunky, ktoré sa dotýkajú iného než

zvoleného okraja.

5. Ako počítať v prípade pochybností s určením somatickej bunky

V prípade akýchkoľvek pochybností o tom či daný útvar je alebo nie je somatická

bunka, sa takýto útvar nepočíta.

Obrázok 1. A, B a C sú počítateľné somatické

bunky (3 bunky).

Obrázok 2. A a B sú počítateľné somatické bunky (2 bunky).

Obrázok 3. A je počítateľná somatická bunka

(1 bunka). Obrázok 4. A a B sú počítateľné somatické bunky,

obe sú obklopené dezintegrovanou cytoplazmou (2 bunky).

Obrázok 5. A až D sú typické počítateľné

somatické bunky, E je rozložená somatická bunka, ktorá sa nepočíta (4 bunky).

Obrázok 6. A je jedna somatická bunka s lalokmi spojenými s jadrovým premostením. Počíta sa ako

jedna bunka (1 bunka).

A

A

B

A

B

C

D

E A

A

B

C A

B

Obrázok 7. A a C sú typické fragmenty

cytoplazmy, ktoré sa nepočítajú. B a D sú typické somatické bunky (2 bunky).

Obrázok 8. A je útvar pripomínajúci somatickú bunku (nie je to časť z jadra bunky), ktorý sa

nepočíta, B je somatická bunka (1 bunka).

Obrázok 9. A je jedna počítateľná somatická bunka s dezitegrovaným jadrom (1 bunka).

Obrázok 10. A až E sú typické somatické bunky s viacerými lalokmi (5 buniek).

Obrázok 11. A je typická somatická bunka. B je

typický monocyt. Obe bunky sú počítateľné (2 bunky).

Obrázok 12. A je jedna somatická bunka s veľkou cytoplazmou (1 bunka).

B A

D

C A

B

A C

A

B E

D

A

B

A

Obrázok 13. Všetko sú počítateľné somatické

bunky. B a E majú dvojlaločnaté jadro s premostením a počítajú sa ako jedna bunka

(6 buniek).

Obrázok 14. A nie je počítateľná somatická bunka pretože jej veľkosť je menšia ako 4 µm. B je

dezinegrovaná počítateľná somatická bunka. C je typická somatická bunka (2 bunky).

Obrázok 15. A, C a D sú počítateľné somatické

bunky. B je fragment cytoplazmy, ktorý sa nepočíta.

Obrázok 16. A až G sú všetko počítateľné somatické bunky (7 buniek).

Obrázok 17. A, B, C a E sú typické somatické

bunky. D je počítateľná somatická bunka s veľkou oblasťou dezintegrovanej cytoplazmy. F je útvar,

ktorý sa nepočíta. Na obrázku je 5 buniek.

Obrázok 18. A, C a D sú typické somatické bunky. B je buď veľmi zle viditeľná somatická bunka

alebo útvar, ktorý sa nepočíta (3 bunky).

B

A D C

F A

E

B

C

B

D

A

C D

F

E

B

A

G C

A

C D

B

C

A

D

F

E B

Obrázok 19. A až G sú typické somatické bunky (7

buniek). Obrázok 20. A a B nie sú somatické bunky

(0 buniek).

Obrázok 21. A je typická počítateľná somatická

bunka. B a C sú fragmenty po cytoplazme, ktoré sa nepočítajú (1 bunka).

Obrázok 22. A a D sú typické somatické bunky. B je fragment väčší ako 50 %, ktorý sa počíta. C má dezintegrovaný jadrový materiál a považuje sa za

počítateľnú somatickú bunku (4 bunky).

Obrázok 23. A a B sú typické somatické bunky. C

a D sú počítateľné somatické bunky vykazujúce začiatok degenerácie (4 bunky).

Obrázok 24. A je dezintegrovaná somatická bunka, ktorá sa aj napriek dezintegrácii počíta

(1 bunka).

B

A D C

F A

E B

G

B

A

C

D B

A

C

A

B

C

A

D

Príloha 2 - California mastitis test

Obrázok 1. California mastitis test – testovacia sada (www.infovets.com).

Obrázok 2. California mastitis test – dojenie mlieka na testovaciu paletu (www.infovets.com).

Obrázok 3. California mastitis test – zmiešavanie mlieka s reagenciou (www.infovets.com).

Obrázok 4. California mastitis test – odčítavanie výsledku (www.infovets.com).

Príloha 3 – Mikroskop Olympus BX51

Obrázok 1. Mikroskop Olympus BX51 – prierez a svetelné cesty, pôvodná anglická verzia (www.olympus.com).

Príloha 4 - Spektrálna charakteristika použitého svetelného zdroja – ortuťovej lampy

404.7

100

300 500 600 700 800Wavelength (nm)

50

0Ultraviolet excitation

luminescent lineViolet excitation

luminescent lineBlue excitation luminescent line

Green excitation luminescent line

Green excitation luminescent line

Blue excitation luminescent range

400

312.6/313.2

334.2

577.0/579.1

280.4

546.1

435

Ligh

t int

ensi

ty (%

)

Mercury lamp

LIGHT SOURCE SPECTRAL CHARACTERISTICS

Obrázok 1. Spektrálna charakteristika použitého svetelného zdroja – ortuťovej lampy, pôvodná anglická verzia (www.olympus.com 2)

Príloha 5 - Zoznam fluorochrómov, výber fluorochrómov, charakteristika vlnových

dĺžok použitých zrkadlových jednotiek s excitačným a emisným filtrom a dichroickým

zrkadlom, interkalácia etídium bromidu do molekuly DNA

Zoznam fluorochrómov

Tabuľka 1 Fluorochrome Excitation Emission Applicable mirror unit Comment

maximum maximum (nm) (nm)

Nuclei, nucleic acid stainingNuclei, nucleic acid

Acridine Orange 490 530, 640 U-MWB2, U-MNB2, U-MNIB2 Single/double-stranded nucleic acid

Acridine Yellow 470 550 U-MWB2, U-MNB2, U-MNIB2 Nucleic acid

Acriflavine-Feulgen 430 515 U-MWBV2, U-MNBV2 DNA

Auramine O-Feulgen 460 550 U-MWB2, U-MNB2, U-MNIB2 DNA

7-Amino Actinomycin D 555 655 U-MWIY2, U-MWIG2 Probe for G-C rich regions

bis-Aminophenyl-oxadizole (BAO) -Feulgen 380 470 U-MWU2, U-MNU2, U-MNUA2 DNA

BOBO 1 462 481 U-MWBV2, U-MNBV2, U-MWB2 DNA

BO PRO 1 462 481 U-MWBV2, U-MNBV2, U-MWB2

Chromomycin A3 450 570 U-MWB2, U-MNB2, Probe for G-C rich regionsU-MWIB2, U-MNIB2

4, 6-diamidino-2-phenyl-indole HCI (DAPI) 372 456 U-MWU2, U-MNU2, U-MNUA2 Probe for A-T rich regions

Ethidium Bromide 545 605 U-MWG2, U-MNG2, U-MWIG2 DNA/RNA

Hoechst 33258 365 465 U-MWU2, U-MNU2, U-MNUA2 Probe for A-T rich regions

Hoechst 33342 355 465 U-MWU2, U-MNU2, U-MNUA2 Probe for A-T rich regions

Mithramycin 395 570 U-MWBV2, U-MNBV2 Probe for G-C rich regions

Olivomycin 430 545 U-MWBV2, U-MNBV2 Probe for G-C rich regions

Pararosaniline-Feulgen 560 625 U-MWG2, U-MNG2, U-MWIG2 DNA

POPO 1 434 456 U-MWBV2, U-MNBV2

Propidium Iodide (PI) 530 615 U-MWG2, U-MNG2, U-MWIG2 DNA/RNA

Pyronin Y 540 570 U-MWIG2 DNA/RNA

Quinacrine Mustard 385 525 U-MWBV2, U-MNBV2 Probe for A-T rich regions, Q band

SYTOX Green nucleic acid stain 504 523 U-MWIB2, U-MWIBA2, U-MNIBA2

Thiazole Orange 509 533 *1

TOTO 1 514 533 *1 DNA

TOTO 3 642 661 *1

TO PRO 3 642 661 *1

YO PRO 1 491 509 U-MWIB2, U-MWIBA2, U-MNIBA2

YOYO 1 490 510 U-MWIB2, U-MWIBA2, U-MNIBA2 DNA

Cell viability judgementLiving cell staining

Acridine Orange 490 590 U-MWB2, U-MNB2, Acid organelleU-MSWB2, U-MNIB2

BCECF/AM 500 530 U-MWIB2, U-MWIBA2, U-MNIBA2 Esterase substrates

Calcein/AM 495 520 U-MWIB2, U-MWIBA2, U-MNIBA2 Esterase substrates

Carboxyfluorescein-diacetate (CFDA) 495 520 U-MWIB2, U-MWIBA2, U-MNIBA2 Esterase substrates

Fluoresceindiacetate (FDA) 495 520 U-MWIB2, U-MWIBA2, U-MNIBA2 Esterase substrates

Dead cell staining

Ethidium Bromide 545 605 U-MWG2, U-MNG2, U-MWIG2 Cell membrane impermeability

Ethidium homodimer-1 528 617 U-MWG2, U-MNG2, U-MWIG2 Cell membrane impermeability

Propidium Iodide (PI) 530 615 U-MWG2, U-MNG2, U-MWIG2 Cell membrane impermeability

(www.olypmus.com 2)

Výber fluorochrómov podľa typu použitej fluorescenčnej zrkadlovej jednotky

Tabuľka 2

Mirror unit Excitation Emission Dichromatic Applicable fluorochromefilter filter mirror

U-MNB2 470-490 520IF 500 Acridine Orange, Acridine Yellow, Auramine O, Auramine O-Feulgen,Calcein, Chromomycin A3, Coriphosphine ODiO, Nile Red

U-MNG2 530-550 590 570 Acidic Fuchsin (Pararosaniline), Alexa Fluor 568, Dil, Ethidium Bromide, Ethidium homodimer-1, Evans Blue, Merocyanine 540, Pararosaniline-Feulgen, Phycoerythrin B (PE-B), Phycoerythrin R (PE-R), Propidium Iodide (PI), Resorufin, Rhodamine B-isothiocyanate (RITC), Rhodamine-Phalloidin, Spectrum Orange, Xylenol Orange

(www.olypmus.com 2)

Green excitation (narrow band) U-MNG2

3000

102030405060708090

100

350 400 450 500 550Wavelength (nm)

Tran

smis

sion

ratio

(%)

3000

102030405060708090

100

350 400 450 500 550Wavelength (nm)

Tran

smis

sion

ratio

(%)

Blue excitation (narrow band) U-MNB2

BP: Excitation filter BA: Barrier filter DM: Dichromatic mirror

BP: Excitation filter BA: Barrier filter DM: Dichromatic mirror

CHARACTERISTICS OF MIRROR UNIT'S WAVELENGTH

600 650 700 750 800

600 650 700 750 800

Obrázok 1. Charakteristika vlnových dĺžok použitých fluorescenčných zrkadlových jednotiek s excitačným a emisným filtrom a dichroickým zrkadlom. Pri experimente bola použitá jednotka U-MNB2, pôvodná anglická verzia (www.olympus.com 2)

Poznámka1

Firma Olympus odporúča použiť pri farbení DNA pomocou etídium bromidu

fluorescenčné zrkadlové jednotky U-MWG2, U-MNG2 a UMWIG2. V laboratóriu sme

disponovali jednotkami U-MNG2 a U-MNB2. Na základe empirických skúseností sme aj

napriek odporúčaniu firmy Olympus použili jednotku U-MNB2 z dôvodu príjemnejšieho

pozorovania mikroskopického preparátu (Príloha 9, obrázky 1 až 11). Pri pozorovaní

mikroskopického preparátu pomocou jednotky U-MNG2 sa preparát javil intenzívne červený,

čo značne znepríjemňovalo jeho pozorovanie (Príloha 9, Obrázok 12). Identifikácia

somatických buniek a zrátané počty somatických buniek boli pri použití jednotiek U-MNB2

a U-MNG2 rovnaké.

Poznámka 2

Firma Olympus uvádza, že na farbenie mŕtvych buniek sa môže použiť farbivo

etídium bromid (www.olympus.com 2).

Longuet et al. (2004) uvádzajú, že pri morfologickom stanovení apoptických buniek

sa používa akridínová oranžová a etídium bromid. Akridínová oranžová preniká cez

plazmatické membrány živých buniek a buniek v počiatočnom štádiu apoptózy. Etídium

bromid môže farbiť DNA iba vtedy, ak je narušená integrita bunkovej membrány. Etídium

bromid farbí iba mŕtve alebo nekrotické bunky.

Etídium bromid je nefluoreskujúca molekula, ktorá zle prechádza cez bunkovú

membránu. Etídium bromid ľahko prestupuje do buniek s poškodenou alebo upravenou

bunkovou membránou. Etídium bromid po prestupe cez bunkovú membránu vstupuje do

dvojitej závitnice DNA a stáva sa intenzívne fluoreskujúcim. Pre túto vlastnosť sa etídium

bromid používa ako farbivo pri zisťovaní integrity bunkových membrán (Midoux et al.,

1995).

Etídium bromid je veľmi často používané farbivo určené na farbenie nukleových

kyselín pri elektroforéze. Etídium bromid môže vstupovať do dvojzávitnicovej DNA

(deoxiribonukleová kyselina) a do RNA (ribonukleová kyselina). Fluorescenicia etídium

bromidu stúpa 21 násobne až po interkalácii do dvojzávitnicovej RNA a 25 násobne po

interkalácii do dvojzávitnicovej DNA, takže v prípade nízkych koncentrácií (10 µg . ml-1) nie

je potrebné odfarbenie pozadia (Sigma-Aldrich Co., 2006).

Cytoplazmatická membrána je selektívne permeabilná blana, ktorá okrem stavebnej

a opornej funkcie separuje rôzne fázy prostredia, riadi selektívny prestup látok z okolitého

prostredia do bunky a naopak a tým udržiava osmotickú rovnováhu buniek (Kulíšek et al.,

1996).

Podľa Chorváta (1998) všetky biologické membrány (vrátane plazmatickej

membrány a membrán subbunkových štruktúr eukaryotických buniek) majú všeobecné

štruktúrne osobitosti: predstavujú súbor lipidických a bielkovinových molekúl, udržiavaných

spolu pomocou nekovalentných väzieb. Vďaka tomu sa udržuje štruktúrna celistvosť

membrán.

Lipidická dvojvrstva o hrúbke približne 5 nm je základnou štruktúrou membrány,

ktorá vytvára relatívne nepriepustnú bariéru pre väčšinu vo vode rozpustných molekúl.

Bielkoviny sú akoby „rozpustené“ v lipidickej dvojvrstve. Sú to základné štruktúry pre

vykonávanie rôznych funkcií membrán. Jedny zabezpečujú transport molekúl do vnútra alebo

von z bunky, iné sú enzýmami a katalyzujú reakcie viazané s membránou.

Jednotlivé funkcie membrán sa sprostredkúvajú špecifickými bielkovinami.

Bielkoviny uskutočňujú úlohu púmp, kanálov, receptorov, enzýmov a transformačných

energetických prvkov. Bielkoviny membrán sú zabudované do lipidickej dvojvrstvy,

čo vytvára výhodné prostredie pre prejavy ich aktivity.

Eukaryotické bunky obsahujú vnútrobunkové membrány, ktoré uzavierajú skoro

polovicu celkového objemu bunky do jednotlivých vnútrobunkových špecializovaných

priestorov – kompartmentov. Základné typy membránových organel vo všetkých

eukaryotických bunkách sú: endoplazmatické retikulum, Golgiho aparát, jadro, mitochondrie,

lyzozómy, endozómy a peroxizómy. Každá organela obsahuje vo svojej výbave rôzne

bielkoviny, určujúce jej unikátne funkcie. Centrálnu úlohu v kompartmentalizácii

eukaryotickej bunky hrajú bielkoviny.

Jadro bunky je uzavreté do obálky, zloženej z dvoch koncentrických membrán.

Vonkajšia jadrová membrána prechádza do membrány endoplazmatického retikula

(endoplazmatické retikulum je továreň na výrobu bielkovinových a lipidických zložiek

mnohých organel. Jeho obrovská membrána obsahuje veľa enzýmov biosyntézy) a priestor

medzi vonkajšou a vnútornou jadrovou membránou prechádza do dutiny endoplazmatického

retikula.

Výmena materiálu medzi jadrom a cytoplazmou prebieha cez póry jadra, ktoré sa

nachádzajú v dvojitej jadrovej membráne, a ktoré zabezpečujú priame spojenie cez vnútornú

a vonkajšiu jadrovú membránu. Póry sú vytvárané špeciálnymi pórovými komplexmi,

predstavujúcimi súbor veľkých bielkovinových granúl, zoskupených do oktagonálnej

štruktúry. V strede komplexu je kanál o priemere 9 nm a dĺžke 15 nm. Cez tento pór

prechádzajú do jadra voľne malé molekuly (5 kDa (kilo Daltona) a menšie). Ukázalo sa však,

že na oboch koncoch týchto pórov sú uložené receptory, ktoré po rozpoznaní veľkých, v jadre

potrebných a signálom označených častíc, (typu DNA, RNA a polymeráz o molekulárnych

hmotnostiach až 1 200 kDa), zrejme rozširujú tieto póry takým spôsobom, aby aj tak veľké

častice prenikli celé do jadra. spätne póry po rozpoznaní špecifických signálových sekvencií

prepúšťajú do cytoplazmy napr. mRNA (teda opäť častice väčšie, ako rozmer pórov).

Za účelom vstupu molekuly etídium bromidu medzi spárované bázy musí dôjsť

k oddialeniu báz na viac ako 0,3 nanometra (WIKIPEDIA – THE FREE

ENCYCLOPEDIA3, 2006).

Z uvedeného vyplýva, že molekula etídium bromidu je malá a môže preto prechádzať

cez póry jadrovej membrány.

Pôsobením silných kyselín, varom alebo vplyvom ťažkých kovov strácajú bielkoviny

svoje natívne schopnosti a dochádza k ich denaturácii. Denaturácia bielkovín je vo väčšine

prípadov nevratný proces, ktorý sa prejavuje rozpadom trojrozmernej štruktúry bielkoviny

pričom ostáva zachovaná len primárna štruktúra, t.j. poradie aminokyselín v reťazci.

Denaturovaná bielkovina nie je schopná ďalej plniť svoju funkciu v organizme (Hrazdíra,

1990).

Za fyziologických podmienok sa vlákna dvojitej závitnice DNA takmer nikdy od seba

spontánne neoddeľujú, avšak, ak je dvojitá závitnica DNA vystavená pôsobeniu teplôt

blízkym bodu varu vody alebo extrémnemu pH (pH < 3 alebo pH > 10), rýchlo sa rozdeľuje

(je denaturovaná) na jednotlivé vlákna. DNA je tvorená pármi báz (guanín-cytozín, adenín-

tymín), ktoré sú spojené vodíkovými mostíkmi. Guanín sa viaže s cytozínom tromi silnými

vodíkovými mostíkmi a adenín s tymínom dvomi silnými vodíkovými mostíkmi. DNA

obsahujúca prevažne páry guanín-cytozín je preto oveľa stabilnejšia, denaturuje pri vyšších

teplotách než DNA, v ktorej prevládajú páry adenín-tymín (Watson et al., 1988).

Byron et al. (2003) sa vo svojej práci zameranej na zvýšenie citlivosti

mikroorganizmov voči antibiotikám zaoberali prestupom etídium bromidu do buniek

mikroorganizmov (Staphylococcus aureus, Escherichia coli). Autori uvádzajú, že bunky

zahriate vo vodnom kúpeli počas 6 minút na teplotu 55 °C za stáleho miešania slúžili ako

pozitívna kontrola pre pozorovanie zvýšenia prestupu etídium bromidu do buniek

mikroorganizmov. Autori použili viacero chemických látok a pozorovali ako sa menila

intenzita fluorescencie a homogénnosť zafarbenia buniek etídium bromidom. Autori ďalej

uvádzajú, že sesqiterpénom sprostredkované zvýšenie prestupu etídium bromidu bolo možné

pozorovať bezprostredne po prídavku 0,5 mM nerolidolu. Z uvedeného vyplýva, že chemické

látky môžu ovplyvniť vlastnosti bunkovej membrány a tým prestup etídium bromidu do

bunky.

Gonzalo et al. (2003) uvádzajú, že hodnota logPSB bola vyššia pri 60 °C

(5,68 ± 0.001) než pri 40 °C (5,65 ± 0.001) pravdepodobne preto, že vplyvom pôsobenia

vyššej teploty dochádza k lepšiemu prenikaniu etídium bromidu do buniek alebo preto, že sa

lepšie disperguje v tuku ovčieho mlieka.

Výsledky experimentu 3 naznačili, že tepelné ošetrenie vzoriek mlieka je jednou

z možností, ktorou sa dá zvýšiť prestup farbiva etídium bromidu cez bunkovú membránu do

buniek. Pri zahriatí vzorky mlieka na teplotu 100 °C počas 1 min boli v porovnaní so

zahriatím vzorky mlieka na teplotu 50 °C počas 5 minút napočítané vyššie počty somatických

buniek (Experiment 3, Obrázok 8).

Interkalácia

Interkalácia je termín používaný v chémii pre reverzibilnú inklúziu molekuly alebo

skupiny molekúl medzi dve ďalšie molekuly alebo skupinu molekúl. Hostiteľská molekula

alebo skupina molekúl obyčajne tvorí v pravidelných sekvenciách opakujúcu sa reťaz alebo

sieť. Schopnosť vstupovať do priestoru medzi dvoma susediacimi spárovanými bázami

reťazca DNA má veľké množstvo molekúl. Molekuly farbiace nukleové kyseliny sú

predovšetkým polycyklické, aromatické alebo planárne. Medzi intenzívne skúmané farbivo

patrí napríklad etídium. Za účelom vstupu molekuly farbiva medzi spárované bázy musí dôjsť

k oddialeniu báz na viac ako 0,3 nanometra, pričom dochádza k lokálnym zmenám v reťazci

DNA. Zmeny v reťazci DNA môžu potom viesť k funkčným zmenám a často aj k inhibícii

transkripcie a procesu replikácie. Z uvedeného vyplýva, že farbivá vstupujúce do DNA môžu

byť potenciálne mutagény a karcinogény (WIKIPEDIA – THE FREE ENCYCLOPEDIA3,

2006).

Obrázok 2. Farbivo etídium vstupujúce medzi dva adenín-uracylové bázové páry.

(WIKIPEDIA – THE FREE ENCYCLOPEDIA3, 2006)

Obrázok 3. Interkalácia. V ľavej časti obrázku je nezmenená DNA. V pravej časti obrázku je

zmenený reťazec DNA obsahujúci cudziu molekulu v troch červeno vyznačených oblastiach.

(WIKIPEDIA – THE FREE ENCYCLOPEDIA3, 2006)

Chorvát (1998) uvádza, že DNA interaguje s farbivami, ktorých charakteristickou

zvláštnosťou je prítomnosť pretiahnutých heterocyklických aromatických chromofórov. Ako

dôsledok takýchto interakcií sa objavuje veľmi silné ovplyvnenie procesov metabolizmu

a spomalenie alebo zastavenie rastu buniek. Pri interkalácii sa interagujúca molekula zasúva

medzi dva susedné páry báz bez porušenia wac párovania. Pri zasúvaní aromatických molekúl

s „hrúbkou“ 3,4 nanometra sa dokonca ani celkový súbor vertikálnych (stacking) interakcií

nemusí narušiť. Na to, aby interkalácia prebehla, sa však páry musia oddialiť, a to vedie

k zmene geometrie sacharidovo-fosfátovej kostry a k porušeniu regulárnej závitnicovej

štruktúry. V dôsledku toho sa molekula DNA musí predĺžiť a musí sa súčasne zväčšiť aj

tuhosť dvojitej závitnice. O tom svedčí aj pozorované zvýšenie viskozity a zmenšenie

koeficientu sedimentácie. Väzba látok na DNA pomocou interkalácie prebieha v dvoch

štádiách. Počas prvého štádia sa látky pripájajú na periférii špirály. V druhom štádiu prebieha

podstata interkalačného javu – zasunutie do závitnice. Molekuly interkalovaných látok

zapĺňajú iba polovicu miest, v ktorých by sa mohli zasunúť, pretože pri zasunutí do každej

polohy by vyvolali stérické obmedzenia. Posúvanie báz pri interkalácii je sprevádzané

zmenami konformácie sacharidu a príslušných torzných uhlov. V niektorých z takýchto

komplexov boli nájdené poruchy ďalekého dosahu.

Príloha 6 - Prístroj Fossomatic 5000

Obrázok 1. Prístroj Fossomatic 5000, Štátny veterinárny a potravinový ústav Nitra, Národné referenčné laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky.

Príloha 7 – Fotodokumentácia pracovného postupu podľa normy STN EN ISO 13366-1 (2001)

Obrázok 1. 1000 µl a 10 µl pipeta, 10 µl

mikrostriekačka Obrázok 2. Podložné sklíčko s preddefinovaným

obrysom 5 mm x 20 mm

Obrázok 3. Pracovné a zásobné roztoky etídium

bromidu Obrázok 4. Dôkladné premiešanie čerstvej vzorky.

V prípade vystúpenia tuku sa vzorka musí vytemperovať na 40 °C ± 2 °C a zhomogenizovať.

Obrázok 5. Pipetovanie 1 ml čerstvej vzorky do

skúmavky. Obrázok 6. Jemné osušenie vonkajších okrajov

špičky od prebytočného mlieka.

Obrázok 7. Skúmavky so vzorkou č.1, č.2 a

skúmavka pre kontrolu teploty.

Obrázok 8. Temperovanie vzorky na teplotu 40 °C ± 2 °C vo vodnom kúpeli, kontrola teploty.

Obrázok 9. Homogenizácia vytemperovanej

vzorky pretrepaním. Obrázok 10. Chladenie vzorky na teplotu

20 °C ± 2 °C. Chladenie je možné vykonať aj v chladničke!

Obrázok 11. Pipetovanie 10 µl vychladenej

vzorky. Obrázok 12. Jemné osušenie vonkajších okrajov

špičky od prebytočného mlieka.

Obrázok 13. Nanášanie 10 µl vzorky na podložné

sklíčko. Obrázok 14. Nanášanie 10 µl vzorky na podložné

sklíčko.


sklíčko, rozotieranie vzorky po obrysoch. Obrázok 16. Nanesená, rozotrená vzorka.

Obrázok 17. Sušenie (fixácia) vzorky 24 hodín

v uzatvorenej nádobe. Obrázok 18. Farbiaca komôrka naplnená farbiacim

roztokom.

Obrázok 19. Farbenie vzorky 10 min.

Obrázok 20. Vymývanie prebytočného farbiva pod

prúdom vlažnej vody.


prúdom vlažnej vody. Obrázok 22. Vymývanie prebytočného farbiva pod

prúdom vlažnej vody.


prúdom vlažnej vody. Obrázok 24. Hrubé odstránenie vody z podložného sklíčka. Treba dávať pozor na poškodenie povrchu

preparátu. Povrch preparátu sa neutiera!

Obrázok 25. Rýchle sušenie vzorky na vyhrievanej platni. Pri voľnom sušení na vzduchu sa dosahujú lepšie výsledky ako pri sušení na výhrevnej platni.

Obrázok 26. Uskladnenie vzorky, chránenie vzorky pred prachom až do mikroskopovania.

Obrázok 27. Nanášanie kvapky imerzného oleja.

Obrázok 28. Nanesená kvapka imerzného oleja.

Obrázok 29. Mikroskopovanie.

Obrázok 30. Mikroskopovanie.

Príloha 8 – Fotodokumentácia pracovného postupu prípravy preparátu podľa

modifikovanej metódy publikovanej Vermuntom et al. (1995)

Obrázok 1. Dôkladné premiešanie čerstvej vzorky.

V prípade vystúpenia tuku sa vzorka musí vytemperovať na 40 °C ± 2 °C a zhomogenizovať.

Obrázok 2. Pipetovanie 1 ml čerstvej vzorky do skúmavky.

Obrázok 3. Jemné osušenie vonkajších okrajov

špičky od prebytočného mlieka. Obrázok 4. Temperovanie vzorky 5 minút pri

teplote 50 °C ± 2 °C vo vodnom kúpeli, kontrola teploty.

Obrázok 5. Chladenie vzorky na teplotu

20 °C ± 2 °C. Chladenie je možné vykonať aj v chladničke!

Obrázok 6. Zahriatie vzorky nad kahanom na 100 °C.

Obrázok 7. Pipetovanie 1 ml farbiaceho roztoku

etídium bromidu. Obrázok 8. Jemné osušenie vonkajších okrajov

špičky od prebytočného roztoku etídium bromidu.

Obrázok 9. Vstreknutie farbiaceho roztokom

etídium bromidu. Obrázok 10. Miešanie skúmavky počas 1 minúty.

Obrázok 11. Chladenie zafarbenej vzorky na

teplotu 20 °C ± 2 °C. Lepšou a rýchlejšou alternatívou je chladenie vzorky v chladničke!

Obrázok 12. Pipetovanie 10 µl vychladenej zafarbenej vzorky.

Obrázok 13. Jemné osušenie vonkajších okrajov

špičky od prebytočnej zafarbenej vzorky. Obrázok 14. Nanášanie 10 µl vzorky na podložné

sklíčko.



sklíčko.



sklíčko.

Obrázok 19. Rozotieranie nanesenej vzorky. Obrázok 20. Rozotieranie nanesenej vzorky.

Obrázok 21. Nanesená, rozotrená vzorka. Obrázok 22. Sušenie vzorky a jej uchovávanie

v uzatvorenej nádobe až do mikroskopovania.

Obrázok 23. Mikroskopovanie. Obrázok 24. Mikroskopovanie.

Obrázok 25. Mikroskopovanie. Obrázok 26. Mikroskopovanie.

Príloha 9 – Fotodokumentácia, obrázky mikroskopických preparátov metódy

A a metódy B

Obrázok 1. Experiment 1, metóda B, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na oranžovom pozadí, preparát pripravený zo surového kravského mlieka s obsahom 9 000 000 SB . ml-1, okulár 10x, objektív 4x.

Obrázok 2. Experiment 1, metóda B, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na oranžovom pozadí, preparát pripravený zo surového kravského mlieka s obsahom 9 000 000 SB . ml-1, okulár 10x, objektív 20x.

Obrázok 3. Experiment 1, metóda B, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na oranžovom pozadí, preparát pripravený zo surového kravského mlieka s obsahom 9 000 000 SB . ml-1, okulár 10x, objektív 60x, (17 somatických buniek).

Obrázok 4. Experiment 1, metóda B, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na oranžovom pozadí, okulár 10x, objektív 60x (3 somatické bunky).

Obrázok 5. Experiment 1, metóda B, zlatožlto fluoreskujúca somatická bunka na oranžovom pozadí, typický PMN, tmavé útvary sú tukové guľôčky, okulár 10x, objektív 60x.

Obrázok 6. Experiment 1, metóda A, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na olivovo zelenom pozadí, preparát pripravený zo surového kravského mlieka s obsahom 600 000 SB . ml-1, okulár 10x, objektív 4x.

Obrázok 7. Experiment 1, metóda A, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na olivovo zelenom pozadí , preparát pripravený zo surového kravského mlieka s obsahom 600 000 SB . ml-1, okulár 10x, objektív 20x.

Obrázok 8. Experiment 1, metóda A, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na olivovo zelenom pozadí, preparát pripravený zo surového kravského mlieka s obsahom 600 000 SB . ml-1, okulár 10x, objektív 60x (3 somatické bunky).

Obrázok 9. Experiment 1, metóda A, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na olivovo zelenom pozadí, preparát pripravený zo surového kravského mlieka s obsahom 1 500 000 SB . ml-1, okulár 10x, objektív 60x, na obrázku je nepočítateľný zhluk buniek.

Obrázok 10. Experiment 1, metóda A, zlatožlto fluoreskujúca somatická bunka na olivovo zelenom pozadí, v ľavom hornom rohu je vidieť fluoreskujúce baktérie tyčinkového tvaru, okulár 10x, objektív 60x (1 somatická bunka).

Obrázok 11. Experiment 1, metóda A, zlatožlto fluoreskujúce somatické bunky na olivovo zelenom pozadí, preparát pripravený zo surového kravského mlieka s obsahom 600 000 SB . ml-1, okulár 10x, objektív 4x, na obrázku je vidieť okraj náteru a veľmi intenzívne fluoreskujúci pás vedúci pozdĺž celého okraja náteru. Intenzívne fluoreskujúci pás znemožňuje počítanie somatických buniek, tento problém sa vyskytuje pri príprave preparátu metódou A pomerne často.

Obrázok 12. Mikroskopický preparát pozorovaný so zrkadlovou jednotkou U-MNG2. okulár 10x, objektív 60x (2 somatické bunky). Pozadie a somatické bunky sú intenzívne červené.

Obrázok 13. Kvasinky - Candida albicans, metóda B, okulár 10x, objektív 60x. Kvasinky sa farbia etídium bromidom, niektoré sa podobajú somatickým bunkám, môžu preto ovplyvniť výsledok laboratórnej skúšky. Zistili sme, že v prípade kvasiniek klesá intenzita fluorescencie po osvietení veľmi rýchlo, v prípade somatických buniek sme nepozorovali jej pokles.

Obrázok 14. Kalibrácia mierky pomocou mikrometra. Okulár 10x, objektív 60x, rozlíšenie obrázku 72 dpi, veľkosť obrázku 640 pixelov x 480 pixelov (obrázok bol po vložení do textového editora zmenšený na 60 % pôvodnej veľkosti. Rovnako boli zmenšené aj Obrázky 1 až 13 Prílohy 9).

Príloha 10 – Faktory mikroskopu pre objektív 60 x, pre metódu A

Tabuľka 1

Počet zrátaných

pruhov

Faktor

mikroskopu

Počet zrátaných

pruhov

Faktor

mikroskopu

1 5555,56 15 370,37

2 2777,78 16 347,22

3 1851,85 17 326,80

4 1388,89 18 308,64

5 1111,11 19 292,40

6 925,93 20 277,78

7 793,65 21 264,55

8 694,44 22 252,53

9 617,28 23 241,55

10 555,56 24 231,48

11 505,05 25 222,22

12 462,96 - -

13 427,35 - -

14 396,83 - -

Príloha 11 – Faktory mikroskopu pre objektív 60 x, pre metódu B

Tabuľka 1

Počet

zrátaných pruhov

Faktor

mikroskopu

Počet zrátaných

pruhov

Faktor

mikroskopu

1 13333,33 15 888,89

2 6666,67 16 833,33

3 4444,44 17 784,31

4 3333,33 18 740,74

5 2666,67 19 701,75

6 2222,22 20 666,67

7 1904,76 21 634,92

8 1666,67 22 606,06

9 1481,48 23 579,71

10 1333,33 24 555,56

11 1212,12 25 533,33

12 1111,11 - -

13 1025,64 - -

14 952,38 - -

Príloha 12 – Príklad výpočtu pomeru riedenia mlieka pri príprave referenčných vzoriek

Vypočítajte aký pomer mlieka treba zmiešať ak treba pripraviť 2,5 litra referenčnej vzorky

s obsahom 350 000 somatických buniek . ml-1 a k dispozícii je:

- mlieko A s obsahom 1 500 000 somatických buniek . ml-1

- mlieko B s obsahom 200 000 somatických buniek . ml-1

Rovnica: požadovaný objem mlieka . požadovaná koncentrácia PSB = x . PSB mlieka A + (požadovaný objem mlieka – x) . PSB mlieka B Výpočet: 2,5 l . 350 000 = x . 1 500 000 + (2,5 l – x) . 200 000 875 000 = 1 500 000 x + 500 000 – 200 000 x 875 000 – 500 000 = 1 308 000 x 375 000 = 1 300 000 x x = 375 000 / 1 300 000 x = 0,28 l mlieka A 2,5 l – 0,28 l = 2,22 l mlieka B Na prípravu 2,5 litra referenčnej vzorky treba zmiešať 0,28 l mlieka A s 2,22 l mlieka B.

Príloha 13 – Navážka K2Cr2O7 pre prípravu referenčnej vzorky

Tabuľka 1 Objem pripravovanej

referenčnej vzorky Navážka K2Cr2O7 na

prípravu 0,1 % roztoku Objem pripravovanej

referenčnej vzorky Navážka K2Cr2O4 na

prípravu 0,1 % roztoku

500 ml 0,5000 g 2800 ml 2,8000 g

600 ml 0,6000 g 2900 ml 2,9000 g

700 ml 0,7000 g 3000 ml 3,0000 g

800 ml 0,8000 g 3100 ml 3,1000 g

900 ml 0,9000 g 3200 ml 3,2000 g

1000 ml 1,0000 g 3300 ml 3,3000 g

1100 ml 1,1000 g 3400 ml 3,4000 g

1200 ml 1,2000 g 3500 ml 3,5000 g

1300 ml 1,3000 g 3600 ml 3,6000 g

1400 ml 1,4000 g 3700 ml 3,7000 g

1500 ml 1,5000 g 3800 ml 3,8000 g

1600 ml 1,6000 g 3900 ml 3,9000 g

1700 ml 1,7000 g 4000 ml 4,0000 g

1800 ml 1,8000 g 4100 ml 4,1000 g

1900 ml 1,9000 g 4200 ml 4,2000 g

2000 ml 2,0000 g 4300 ml 4,3000 g

2100 ml 2,1000 g 4400 ml 4,4000 g

2200 ml 2,2000 g 4500 ml 4,5000 g

2300 ml 2,3000 g 4600 ml 4,6000 g

2400 ml 2,4000 g 4700 ml 4,7000 g

2500 ml 2,5000 g 4800 ml 4,8000 g

2600 ml 2,6000 g 4900 ml 4,9000 g

2700 ml 2,7000 g 5000 ml 5,0000 g

Príloha 14 – Príklad validačného protokolu

Tabuľka 1

VALIDAČNÝ PROTOKOL Výrobca referenčnej vzorky

Národné referenčné laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky, Akademická 3, 949 01

Nitra Tel.: + 421 37 653 65 20 – 22, Fax.: + 421 37 653 65 23, e-mail: [email protected]

www.svpunitra.sk Zákazník

Číslo referenčnej vzorky 0905V (RV - V 7)

Dátum prípravy 14. september 2005

Dátum odoslania 21. september 2005

Dátum expirácie 14. október 2005

Podpis zodpovedného pracovníka

Ing. Peter Zajác

Priemerný počet somatických buniek, ml-1

571 000

Stanovené rozpätie počtu somatických buniek, ml-1

interval od 541 000 do 601 000

Stanovené počty somatických buniek v referenčnej vzorke, ml-1

588 000 560 000 580 000 570 000 568 000 594 000 – 600 000 541 000 547 000 554 000 575 000 572 000 – 550 000 560 000 555 000 600 000 563 000 – – 565 000 587 000 535 000 607 000 585 000 – – 577 000 597 000 531 000 588 000 581 000 – –

Štandardná odchýlka, ml-1 20 709

Variačný koeficient (%) 3,62

Manipulácia s referenčnou vzorkou

Referenčné vzorky skladujte v tme pri teplote od 0 °C do + 6 °C. V referenčných vzorkách garantujeme deklarovaný počet somatických buniek maximálne do dátumu expirácie.

Návod na použitie referenčných vzoriek

Pred použitím referenčné vzorky zahrejte vo vodnom kúpeli na teplotu 40 °C ± 0,5 °C. Počas zahrievania vzorky dôkladne ale opatrne premiešajte prevrátením vzorkovnice 15 až 20 - krát, úkon zopakujte 3 - krát. Pred meraním premiešajte ešte 1 - krát. Vzorku zmerajte 6 až 8 – krát. Stanovte aritmetický priemer meraní. Meranie je vyhovujúce, ak je Vami stanovený aritmetický priemer meraní v rozpätí, ktoré je uvedené vo validačnom protokole.

Hodnota počtu somatických buniek v referenčnej vzorke bola overená stanovením pomocou akreditovanej mikroskopickej metódy podľa normy STN EN ISO 13366 - 1 – Mlieko. Stanovenie počtu somatických buniek. Časť 1: Mikroskopická

metóda (referenčná metóda). Národné referenčné laboratórium prehlasuje, že vykonáva pravidelnú kontrolu kvality referenčných vzoriek od dátumu ich výroby až po dátum ich expirácie. V prípade zistenia odchýlky od deklarovaných hodnôt

referenčnej vzorky, ihneď upozorní všetkých zákazníkov. Zákazníkom budú následne dodané náhradné referenčné vzorky.

Príloha 15 – Biele krvinky (leukocyty)

Obrázok 1. Neutrofilný granulocyt

Obrázok 2. Eozinofilný granulocyt

Obrázok 3. Bazofilný granulocyt

Obrázok 4. Lymfocyt

Obrázok 5. Monocyt

Obrázok 6. Makrofág

(WIKIPEDIA – THE FREE ENCYCLOPEDIA, 2006)

Príloha 16 – Krv hovädzieho dobytka

Obrázok 1. Krv hovädzieho dobytka. 1 – segmentovojadrový bazofil, 2 – tyčinkovojadrový

eozinofil, 3 – segmentovojadrový eozinofil, 4 – mladý neutrofil, 5,6,7 – segmentovojadrové

neutrofily, 8 – monocyt so značne rozčleneným jadrom, 9 – veľký, 10 – stredný s azúrofilnou

granuláciou v cytoplazme, 11 – mladý lymfocyt, 12 – trombocyty, 13 – erytrocyty.

(Autor obrázku Nikitin, zdroj: Slanina et al., 1965)

Príloha 17 – Vypočítané korelačné koeficienty pre mikroskopické metódy stanovenia

počtu somatických buniek v experimente 1 a experimente 3

Vypočítané korelačné koeficienty pre porovnanie metód A, B, C stanovenia počtu

somatických buniek v experimente 1

Tabuľka 1 A B C

A - - -

B 0,995 - -

C 0,994 0,997 -

Vypočítané korelačné koeficienty pre porovnanie metód A, B, C, D, E, F stanovenia

počtu somatických buniek v experimente 3

Tabuľka 2 A B C D E F

A - - - - - -

B 0,998 - - - - -

C 0,918 0,912 - - - -

D 0,993 0,992 0,919 - - -

E 0,908 0,902 0,999 0,908 - -

F 0,927 0,923 0,996 0,933 0,992 -


© 2006 Ing. Peter Zajác ([email protected])

© 2006 Štátny veterinárny a potravinový ústav Nitra – Národné referenčné

laboratórium pre mlieko a mliečne výrobky ([email protected])