Dizilim Analizi ile HLA Tiplendirimi

(Sequence Based Typing, SBT)

Dr Klara Dalva

AÜTF Hematoloji BD DTL Laboratuvarı

Yüksek Çözünürlükte HLA Tiplendirimi

Akraba olmayan vericiden Kök Hücre nakillerinde

Hasta

Bankalara kayıtlı vericiler (adaylar/seçilmişlerde doğrulama)

Akrabadan Kök Hücre Nakillerinde

Ebeveynler incelenemediğinde

Aile verileri ile ailedeki 4 haplotip belirlenemediğinde

Düşük çözünürlük çalışmalarda “homozigot” şüphesi varken

Solid organ Nakillerinde

Özellikle antijen uyumsuzluklarının kabul edilebilir/edilemez olduğunun tespitinde (virtual XM)

Yüksek Çözünürlükte HLA tiplendirimiKullanılan Yöntemler-I

SSOP (daha kapsamlı kitler ile)

SSP (Her alel için ayrı bir çalışma kurarak)

Yukarıdaki yöntemlerin yeni bulunan alellere göre güncellenmesi, çok sayıda

prob, primer, kullanılması gerekir

SBT

Yeni Sekenslama Yöntemleri (Next Generation Sequencing )

Yüksek Çözünürlükte HLA tiplendirimiKullanılan Yöntemler-II

SSOP SSP SBT

(generic)

SBT (group

specifique)

Tüm eksonlar

değerlendirilebilir

- - + +

Rezolüsyon Orta/yüksek Orta/yüksek Yüksek Yüksek ve Allel

düzeyinde

Karmaşık sonuçlar Var * Daha az ** Var *** Nadir***

*: Prob sayısı arttırılarak, tek alel amplifikasyonu ile karmaşık sonuçlar azaltılabilir

**: Düşük çözünürlük yanı sıra her alel için ayrı çalışma(SSP) yapılırsa karmaşaaz, ancak otomasyona uygun değil, daha fazla DNA gerektiriyor, daha zahmetli

*** Ek çalışmalarla eklenen yeni verilerle (GSSP/ HARP, ek ekson, intron sekanslaması) karmaşık sonuçlar çözülebilir

Frederick Sanger

Sekanslama

1980 lerden 1990lara

Yavaş Otomatik Sekanslama

Klonlama PCR ürünü dizi analizi

Radyoizotoplar İzotop kullanmayanEnzim/kimya da iyleşme

“Manuel” Yazılımla Değerlendirme

Zor İnsan Genom Projesiile önemli ilerlemeler

Y2K

Market ufak Lokıus Spes. primerler

Alel sayısı artıyor Otomatik analizplatformları

HLA için kabul Heterozigot sekanslanmagörmesi Grup Spes. sekanslama

Maliyette düşme Yazılımda gelişmeler

Yeni NesilSekanslama

Günümüz

Donanım, Yazılım ,Kimya,Enzimler, Deneyim

Hangi Bölgeler İnceleniyor ?

CLASS I CLASS II

Kaynak: A.M Grenoble – France, R Blasczyk, Hannover – Germany 2007 Teaching Session 2

Antigen Recognition Site , ARS

Antigen Recognition Site , ARS

SBT Yöntemi- Basamaklar

ANALİZ

1 DNA İzolasyonu

Rutin çalışmalarda kan ve ağız çalkantı suyu, «buccal smear» ile toplanan hücreler kullanılabilir

(Hematolojik malinitelerde LOH, alel mutasyonları olabilir. Aile verileri, gerekirse farklı materyalle yeniden tiplendirme önem taşıyor ! )

Farklı yöntemler kullanılabilir

Haplotipe Özgün Ekstraksyon yapılması maliyeti arttırsa dakarmaşayı çok azaltır

DNA miktar/ kalitesi önemli

A260/A280:1,8-2,0 <1,5 iken ≈ %50 prot kontaminasyonu?

Homojen olmalı(Fenol ekstraksyonu ile sorun olabilir)

Genellikle 50-100 ng/mL konsantrasyonda kullanılır

Elüsyon tamponu: Kit ile uyumlu mu? (PCR inhibisyonu?)

2 PCR ile Amplifikasyon

“Generic”: Tek bir tüpte tek bir lokusa özgün problar ile Multiplexamplifikasyon yapılır

Class I için en az Exon 2 ve 3 , 1-6 ya da hepsini içeren kitler

Class II için en az Exon 2, exon 3, hepsini içeren kitler

Generic(biallelik) sekanslamayı takiben

Grup spesifik sekanslama (GSSP, HARPs.. ile mono allelik sekanslama) yapılabilir

Grup spesifik Amplifikasyon (Ör: -B için 16 grup, -DRB1 için 16 grup için amp. yapılır)

Amplifikasyon ürününde tespit edilen alele göre her alel ayrı sekanslanır

Alel spesifik amplifikasyon

Mevcut iki basamaklı sonuçlara göre (ör DRB1*04, DRB1*15 için ayrı ayrı) amplifikasyon ve takiben sekanslama yapılır

Çalışma nasıl olsun? Peşin? Taksitli?

2 PCR ile Amplifikasyon Türü

A*02:01/A*03:01

HLA –A lokus PCR “Multiple” Grup Spesifik PCR

A1- A2+ A3+ A24- A68- A80-A*02:01 ve A*03:01 aynı reaksyonda amplifiye olur

A2 ve A3 e özgün 2 farklı Kalıp ile(homozigot)DNA sekanslaması yapılırHLAA*02:01/A*03:01 değil de A*02:01/A*02:05 olsaydı heterozigotbir sekanslama görülür

A*02:01 A*03:01

İki allel birlikte sekanslanırBazan net, bazan karmaşık sonuçlar

A*02:01/A*03:01 A*02:01/A*03:01veyaA*02:24/A*03:17

SSP veya GSSP

Ile çözülür

Peşin

Taksitli

2 Biallelik Amplifikasyonda kullanılanprimerler : Örnek: Üretici A, Class I

Amplifikasyon primeri (tek tüpte)

Sekanslama primeri (her primer farklı tüpte, 6 tüp)

GSSP primeri (karmaşaya göre yazılım öneriyor ,geniş bir alanda

lokalize olabilir

R1 F13

45 7

69

8 10

a,b,c,d,e,f,g…..

h,ı,j,k,l,m………

2 Piyasada bulunan kitlere örnekler (core kit)

2 PCR ürünlerinin kontrol edilmesi

3 PCR Ürünlerinin Temizlenmesi

Daha sonraki sekanslama basamağını etkilememesi içinkullanılmayan PCR primerleri ve dNTP ler uzaklaştırılır

Bu amaçla

Kolonlar kullanarak filtreleme

ExoSAP-IT™ (20 dk 37°takiben 15-20 dk 80° ile inaktivasyon)

Exonuclease I: Kalan primerleri parçalar

Shrimp Alkaline Phosphatase: Kalan dNTP leri parçalar

****Bu işlemden önce jel elektroforezi ile amplifikasyonkontrol edilmelidir . Amplikon oluşmuşsa temizleme işlemi ile devam edilir Oluşmamışsa PCR işlemi tekrarlanır

3 PCR ürününün temizlenme sorunu

Temizlenmiş

Temizlenmiş

Orijinal

Orijinal

3 PCR ürününün temizlenme sorunu

ExoSAPyetersiz

Temiz

Sekanslama primerlerinin kalitesi ile temizlenmeyen ürünlerin

olumsuz etkisi baskılanabilir

4 Sekanslama Reaksiyonu

Kaynak: Dong -Feng Chen, SBT The gold standart for HLA high resolution typing, ABHI-U sunusu

dNTP/ddNTP: ≈100/1, ddNTP ler floresan işaretli

4 dNTP ve ddNTP Farkı

Kaynak: Dong -Feng Chen, SBT The gold standart for HLA high resolution typing, ABHI-U sunusu

4 PCR Amplifikasyonu - Sekanslama ReaksyonuFarklar

PCR Amplifikasyonu Sekanslama Reaksiyonu

Primer Her reaksyonda bir çift

primer (forward ve reverse

aynı tüpte )

Her reaksiyon için tek

primer (forward ve reverse

ayrı tüpte)

dNTP Kullanılır Kullanılır

ddNTP Kullanılmaz Kullanılır

“Thermal

Cycling”

Uygulanır Uygulanır

Çalışma Alanı Pre-PCR Post_PCR

Ürün Çift sarmal Çift sarmal (denaturasyon

ile tek sarmal hazırlanıp cihaza

yüklenir )

4 Sekanslanan Bölgeler

4 Sekanslamada kullanılan primerler :Örnek: Üretici A, Class I

Amplifikasyon primeri (tek tüpte)

Sekanslama primeri (her primer farklı tüpte, 6 tüp)

GSSP primeri (karmaşaya göre yazılım öneriyor ,

geniş bir alanda lokalize olabilir

R1 F13

4

5 7

6

9

8 10

a,

b,c,d,e,f,g……

…

h,ı,j,k,l,m………

Sekanslanan Bölgeler- Karmaşık Sonuçlar

Karmaşık Sorun Örneği

5 Sekanslanan Ürünün Temizlenmesi

Bağlanmamış floresan işaretli ddNTP ler ortamdanuzaklaştırılır

Kalırlarsa Elektroforez sırasında DNA fragmanları ile birliktehareket ederek veri kirliliğine sebep olurlar

En sık kullanılan iki yöntem

Jel filtrasyonu (Sephadex)

Etanol ile çöktürme

Bağlanmayan “big dye” etanolde kalır fragmanlar çöker

Küçük fragmanlar için sodyum asetat eklenir

6 Ürünlerin Elektroforez için Cihaza

Yüklenmesi

DNA Fragmanlarının polimerdeki hareketi

Floresan Dedektörü (CD kamera)

Katot

6 Kapiller Elektroforez

Cihazın performansı önemli

“Spatial Calibration”

Her kapiller için Sinyal Pixel pozisyonlarının belirlenmesi

“Spectral Calibration”

Floresan sinyallerin ayırımı (üst üste binmemesi) için gerekli

Verilerin Analizi: Prensip

Elde edilen dizilimler, HLA veri tabanında bulunan sekanslar (Consensus) ile karşılaştırılarak olası aleller tespit edilir

Analiz aşamasında tüm dizilimin gözden geçirilmeli (genellikle hata /tutarsızlık şüphesi olan yerlerde kılavuz işaretler var)

“Concensus” ile farklı olan pozisyonların kontrolü, düzeltilmesi

Heterozigot pozisyonların kontrolü

“forward” ve “reverse” dizilimler arasında tutarsızlık kontrolü, bazların gerekiyorsa güvenilir olan veriye göre düzeltilmesi

International Union of Biochemistry

Nomenclature Committee (IUB) Kodları

R= A ve G (puRine)

Y= C ve T (pYrimidine)

K= G ve T (Keto)

M= A ve C (aMino)

S= G ve C (Strong, 3 Hidrojen bağı)

W= A ve T (Weak, 2 Hidrojen bağı)

N= aNy base (A veya T veya C veya T)

Verilerin Analizi

Kullanılan yazılım Programları farklılıklar taşır

Olası Alel seçenekleri özetleniyor (varsa MM sırasına göre)

Yapılan tüm müdahaleler izlenebiliyor

Bir sonuç raporu oluşturulur

Önerilen ek çalışmalar bildirilebilir ( ek olarak hangi lokus bilgisi gerekli, kullanılması önerilen GSSP)

Sık (CWD) ve sık görülmeyen alellere göre veriler sınıflanabilir !

Sonuçlar NMDP kodları ile verilebilir !

ARS bölgesi ortak olan aleller birlikte sınıflanabilir(G group) !

FARK GÖSTERENLER

TÜMÜNDE ORTAK

Karşılaşılan Problemlerin Kaynakları

Bir alelin tercihli amplifikasyonu

Kullanılan Sekanslama primerlerinin bağlanmasını etkileyen yeni bir polimorfizm

farklı bir kit ile farklı verim alınabilir

HLA genlerindeki somatik mutasyonlar LOH ( tüm bir haplotip ya da tek bir lokusta olabilir, farklı

yöntemlerle farklı sonuçlar alınabilir SBT daha duyarlı)

HLA Allel polimorfizmi ( ör: indel mutasyonları, ortaya çıkan Null bir alel)

Karmaşık Sonuçlar (ambiguity)

Tercihli amplifikasyon örneği: C*7 ve 17 olan bir bireyde C*17 de amp. avantajı var

Karmaşık Sonuçların Sebepleri

Dizilim analizi yapılan bölgede gen sekanslarının ortak olması (Ör: C*04:01-C*04:01N DRB1*14:01-14:54

Bu durum “ ifade edilen iki alel” ya da “ifade edilen bir alel ile null bir alel” olarak karşımıza çıkabilir

Bu sorun genellikle diğer eksonları/intronları sekanslayarak çözülür

Serolojik tipleme, SSP ile ek testler yardımcı olur

Belli motiflerin yer değiştirmiş olabilmesi olasılığı (cis-trans) nedeniylegörülen karmaşalar

Mono allelik sekanslama (haplotip spesifik ekstraksyon)

Allelerden birine özel primerlerin kullanılması (monoalleliksekanslama)

grup spesifik amplifikasyona ek olarak HARP; GSSP kullanımı

En başından seçilmiş bir alelle özgün sekanslama reaksiyonu

Ortak Gen Sekansları

Agnés Moine, Grenoble - France 2007 Teaching Session 2

ARS de Ortak Gen Sekansı -Örnekler

Alel 1 Null Alel Polimorfizmyerleşimi

A*0101 A*01010102N Intron 2

A*0301 A*01010102N İntron 4

A*2901 A*29010102N İntron 4

A*6801 A*6811N Exon 1

B*1501 B*15010102N Intron 1

B*1801 B*1817N Exon

B*4402 B*4419N Exon 1

C*0301 C*0303N Exon 1

C*0401

C*0409N Exon 7

Agnés Moine, Grenoble - France 2007 Teaching Session 2

Alel 1 İfade edilenAlel 2

Polimorfizmyerleşimi

A*7401 A*7402 Exon 1

B*0705 B*0706 Exon 5

B*2705 B*2713 Exon 1

B*8101 B*8102 Exon 1

C*0501 C*0503 Exon 4

C*0701 C*0706, 0718 Exon5,6

C*0704 C*0711 Exon7

DRB1*1201 DRB1*1206, 1210

Exon 1 ve3

DRB1*1401 DRB1*1454 Exon 3

Motif Pozisyonlarının Önemi

Motiflerin yer değiştirme olasılığı

“Generic” Karmaşa Allelik Karmaşa

A B C DRB1

01/3604 07/4808 05/0802 03/1327

03/3204 35/53 05/0709 11/13

25/6601 38/39 07/0802 13/14

25/2603 4418/4501/5002

25/2601 4901/5001

32/7406 51/78

51/5301

52/7805

5602/5610

%9,7 %5,77 %4,34 %2,7 AM, Grenoble – France 2007 EFI Teaching Session 2

A B C DRB1

%79,7 %80,46 %54,6 %96,7

Özet

SBT, halen Yüksek çözünürlükte HLA tiplendirimi için kabuledilen Referans Yöntemdir

Seçilecek olan yöntem ve kullanılacak donanım, amaca/kaynaklara göre farklılıklar gösterebilir

Seri çalışmalar için Otomasyon mümkündür

SBT ile çözülmesi zaman alan soruların çok yakın gelecekte NGS ile çözümlenmesi mümkün olabilecektir

Diğer HLA tiplendirme yöntemlerinde olduğu gibi Çalışma-Analiz ve Sonuçların Onaylanmasında başarılı olmak,deneyim- konu ve incelenen toplumlar hakkında bilgisahibi olmayı gerektirir