中国测试CHINA MEASUREMENT & TEST Vol.41 No.6June，2015第 41 卷第 6 期2015 年 6 月

DNA甲基化定量测量国际比对 CCQM P94.2高运华 1袁 陈鸿飞 2袁 盛灵慧 1袁 武利庆 1袁 王 晶 1

（1.中国计量科学研究院，北京 100029；2.南京市计量监督检测院，江苏 南京 210037）

摘 要院 建立基因组 DNA 基质中 CDKN2A 基因甲基化含量的液相色谱同位素稀释质谱法和 Sanger 序列测定法两种

定量方法，应用于国际物质量咨询委员会（consultative committee for amount of substance，CCQM）开展的 DNA 甲基化

定量测量国际比对（CCQM P94.2）研究。考察 DNA 甲基化效率、酶解条件、色谱分离条件等对测定结果的影响，评定测

量结果的不确定度。液相色谱同位素稀释质谱定量两个比对未知样的结果分别为未知样 1：64.5%依6.1%；未知样 2：46.7%依8.0%。Sanger 序列测定法测定两个比对未知样的结果分别为未知样 1：48.9%依1.0%；未知样 2：48.9%依1.1%。与

主导实验室标准值未知样 1：51%依5.9%，未知样 2：46.9%依4.9%十分符合，为我国 DNA 甲基化定量测量标准物质的研

制奠定坚实的基础。

关键词院DNA 甲基化；同位素稀释质谱；Sanger 测序；国际比对

文献标志码院A 文章编号院1674-5124渊2015冤06-0047-05

International comparison CCQM P94.2：quantitative analysis of DNA methylation

GAO Yunhua1，CHEN Hongfei2，SHENG Linghui1，WU Liqing1，WANG Jing1

（1. National Institute of Metrology，Beijing 100029，China；2. Nanjing Institute of Measurement and Technology，Nanjing 210037，China）

Abstract: Two quantitative methods namely liquid chromatography-isotope dilution mass spectrometry（HPLC-IDMS） and Sanger sequencing method（SS）have been established to analyze and determinethe CDKN2A gene methylation in the matrix of genomic DNA. The two methods，applied to theinternational comparison （CCQM P94.2） on quantitative measurement of DNA methylation carriedout by the Consultative Committee for the Amount of Substance（CCQM），has investigated the influenceof the DNA methylation efficiency，enzymolysis conditions and chromatographic separation conditionsupon the measurement results and evaluated the uncertainty in measurement results. The DNAmethylation of two unknown comparison samples measured were respectively U1：64.5%依6.1% andU2：46.7%依8.0% by HPLC-IDMS and U1：respectively 48.9%依1.0% and U2：48.9%依1.1% by the SSmethod. These figures are very close to the reference values from the leading laboratory，i.e. U1：51%依5.9% and U2：46.9%依4.9%. The established HPLC-IDMS and SS method have laid a solidfoundation for China to quantitatively measure the DNA methylation in reference materials.Keywords: DNA methylation；isotope dilution mass spectrometry；Sanger sequencing；internationalcomparison

收稿日期院2014-11-03曰收到修改稿日期院2015-01-17基金项目院国家质检行业公益专项项目资助（201310008）

中央级公益性科研院所基本科研业务费项目资助

（AKY1311）作者简介：高运华（1972-），男，山东定陶县人，副研究员，主

要从事核酸计量及相关的法制计量工作。

0 引 言DNA 甲基化能引起染色质结构、DNA 构象、DNA

稳定性及 DNA 与蛋白质相互作用方式的改变，从而

控制基因表达[1-3]。DNA 甲基化定量信息将有利于更

好地解释这些生物现象，并提升 DNA 甲基化相关疾

病诊断的正确性。DNA 甲基化定量分析的方法现已

doi院10.11857/j.issn.1674-5124.2015.06.011

中国测试 2015 年 6 月

有多种，除了传统的免疫、酶催化和化学方法外，高

效毛细管电泳、高效液相色谱、液质联用等现代仪器

分析方法也取得显著进展[4-6]。然而，没有一种测量参

考系统可以评价不同测量方法和不同测量仪器之间

结果的一致性[7-8]。亚硫酸氢盐介导的方法是最方便

而被广泛应用的技术，亚硫酸氢盐将没有甲基化的

胞嘧啶核苷酸转化为尿嘧啶核苷酸，再通过 PCR 反

应转化为胸腺嘧啶核苷酸，而甲基化的胞嘧啶核苷

酸保持不变，PCR 反应转化后仍为胞嘧啶核苷酸，

通过测定胸腺嘧啶核苷酸和胞嘧啶核苷酸的含量

变化实现甲基化的定量分析。但是，现在还没有一

个能够充分评估其转化反应及后续分析过程（包括

PCR 反应）偏差的方法，不能确保 DNA 甲基化分析

结果的可比性、有效性 [9-10]。因此，急需建立DNA 甲

基化测量标准方法，研制 DNA 甲基化方法和仪器

评价相关的标准物质。为了建立一个 DNA 甲基化标

准测量系统，国际物质量咨询委员会生物工作组

（CCQM BAWG）开展了 DNA 甲基化定量测量国际

比对研究，该比对代号为 CCQM P94.2，由韩国标准

科学研究院（KRISS）主导，7 个国家计量院参加，分

别采用序列测定技术、熔点法、液相色谱-同位素稀

释质谱法、限制性内切酶法等对样品进行了定量比

对分析。中国计量科学研究院实验室采用了液相色

谱同位素稀释质谱和序列测定技术两种方法参加了

此次比对活动，取得了较好的结果。

1 实验部分1.1 仪器与试剂

液相色谱（Agilent 1290，Agilent 公司）；质谱仪

（Qtrap 5500，AB Sciex 公司）；PCR扩增仪（PTC0200，Bio-Rad 公司）；琼脂糖凝胶电泳仪（Power Pac 系列，

Bio-Rad 公司）；紫外分光光度计（Beckman DU800，Beckman 公司）；DNA 序列分析仪（ABI 3500）。

DNA 甲基化试剂盒（EZ DNA methylation kitD5002，Zymo），蛇毒磷酸二酯酶 I（PhosphodiesteraseI，Sigma）和 DNA 酶 I（DNase I，Sigma），腺嘌呤脱氧

核苷一磷酸（dAMP）标准物质（GBW09805），胞嘧

啶脱氧核苷一磷酸（dCMP）标准物质（GBW09806），鸟嘌呤脱氧核苷一磷酸（dGMP）标准物质（GBW09807），胸腺嘧啶脱氧核苷一磷酸（TMP）标准物质（GBW09808）标准物质，均来自中国计量科学研究院；dAMP-15N（Silantes 公司），dCMP-13C15N（Silantes 公司），dGMP-13C15N（Isotec 公司），TMP-13C15N（剑桥同位素实验室）。

乙酸铵（色谱纯，阿拉丁公司）；乙腈（色谱纯，Merck公司）；实验室用水来自 Milli-Q 超纯水系统。比对样

品来自韩国标准科学研究院。

1.2 样品亚硫酸盐甲基化修饰

比对样品共两个，其中比对样品 1（U1）由比对

主导实验室利用亚硫酸盐处理并纯化，直接作为模

板进行 PCR 扩增。未知样 2（U2）由参加实验室进

行亚硫酸盐处理。首先取 14滋L DNA样品，加入 5滋LM-Dilution缓冲溶液，再加入 31滋L超纯水，混匀，37益温浴 15min。然后加入 100滋L CT 转化试剂，混匀后，

50益暗处温浴 12耀16h。然后将样品置于冰上 10min。利用试剂盒中的纯化试剂将修饰后的样品进行纯

化，纯化后的样本用于后续的 PCR 扩增。

1.3 比对样品的 PCR扩增和纯化

PCR 反应体系为：模板 DNA 1滋L；引物 F4：GAGGGGAGTTAGGAATAAAATAA 1滋L；R1：ACCACCATCTTCCCACCCTCAA，1 滋L；AmpliTaq Gold PCRmaster mix 25滋L，水 22滋L。热反应条件为：第 1 步，

95 益，5 min，1 个循环；第 2 步，先 94 益，30 s，然后

58 益 30 s，最后 72益，30 s，30 个循环；第 3 步，72益，

7min，1 个循环。反应后的样品用 QIA quick PCR 纯

化试剂盒进行纯化，用琼脂糖凝胶电泳进行产物检验。

1.4 DNA甲基化定量分析

1.4.1 DNA甲基化液相色谱同位素稀释质谱（HPLC-IDMS）定量分析

1）HPLC-IDMS 分析条件优化。利用核苷酸标准

物质、消解后的样本对液相色谱和质谱分析条件进

行了系统优化，使 4 种核苷酸dAMP，dGMP，dCMP，TMP 之间及其他杂质成分基线分离，然后利用优化

后的液相色谱同位素稀释质谱定量测量条件，对酶解

后的比对样品进行了定量分析。

2）比对样品的酶消解条件优化及消解。系统优

化了 Phosphodiesterase I 酶用量和酶消解时间，具体

的优化方案见表 1。

反应结束后，置于 65益水浴中反应 20min 灭活，

置于 4益的冰箱中保存待测。校准样品和未知样品

在相同的条件下进行酶解处理。

1.4.2 比对样品甲基化含量的序列测定分析

将纯化后的 PCR 产物，通过 DNA 连接酶插入

DNA 质粒载体中，然后将转化的质粒 DNA 导入大肠

酶解时间/h DNase I 酶/Unit 温度/益 Phosphodiesterase

I 酶/Unit 样品/ng0.5 2 37 5.5伊10-3 4000.75 2 37 1.1伊10-2 4001.0 2 37 1.65伊10-2 4001.5 2 37 2.2伊10-2 4002.0 2 37 2.75伊10-2 400

表 1 酶反应条件优化方案

48

第 41 卷第 6 期

杆菌中，随机挑取 200 个单菌落，进行 DNA 序列分

析，通过统计计算得到其甲基化含量。

2 结果与讨论2.1 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析

比对样品 1、2，100%甲基化样本 M100 和 0%甲

基化样本 M0，通过 PCR 扩增后产物琼脂糖凝胶电

游分析可知，DNA 分子量标准全部分开，条带清晰，

扩增产物处于 200bp 片段长度标准处，表明PCR 扩

增产物约 200 bp。另外上样孔处干净，证明样品中蛋

白质成分含量极低，用琼脂糖凝胶电泳方法不能检

出，图中下部没有明显的亮色，证明扩增产物中 RNA成分去除干净。

2.2 HPLC-IDMS分析条件优化

优化后的液相色谱分析条件为：色谱柱：WatersACQUITY UPLC HSS T3；流动相：（A 相）5%乙腈-（B 相）醋酸铵（pH=3.6）；梯度洗脱程序为：0~6 min，100%B；6~8min，100%B 降为 98%B；8~12min，98%B降为 60%B；12~20min，维持 60%B；20~21min，60%B升为 100%B；21~30min 维持 100%B。柱温：25益，进

样量：10 滋L。优化后的质谱条件为：正离子扫描；多

反应检测模式（MRM）；离子源温度（TEM）650.00益；

离子源喷雾电压 5 500.00 V，雾化器（GS1）50.00 L/h，辅助加热器（GS2）40.00 L/h；气帘气（CUR）30.00 kPa。检测离子对见表 2。

利用优化后的色谱质谱分析条件对酶解后的比

对样品进行定量分析，分析结果见图 1。4 种脱氧核

苷酸在优化的色谱质谱分析条件下达到基线分离，

互不干扰，样品浓度合适，峰高和峰面积满足定量分

析的要求。

2.3 酶反应条件的优化

酶反应条件主要从 Phosphodiesterase I 用量和

水解时间两方面进行优化。利用液相色谱-同位素稀

释质谱定量分析各反应条件下的核苷酸含量，统计

分析结果见图 2。

分析图 2 可知，随着 Phosphodiesterase I 量的增

加，各核苷酸的量初期增加，达到 1.1伊10-2 Unit 时含量达到了最高，随后产物的量趋于平衡并稍微

减少，表明酶量在 1.1伊10-2 Unit 时较为合适，超过

1.1伊10-2Unit 时产物趋于平衡或下降，原因可能是酶

中含有杂质，促使产物进一步降解所致。

酶水解时间的优化结果见图 3，酶反应时间在

60min 时产物量基本达到了平衡，最后确定了酶的优

化时间为 60min。

因此，优化后的酶解条件为：酶解时间为 1 h，DNase I 为 2Unit，反应温度 37益，Phosphodiesterase I为 1.1伊10-2Unit，样品量为 400 ng。2.4 酶消解产物的HPLC-IDMS分析及不确定度评定

利用优化后的液相色谱同位素稀释质谱分离分

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120130时间/min

65 00065 50066 00066 50067 00067 50068 00068 50069 000

图 3 比对样品酶水解条件优化

参数HPLC-IDMS 克隆测序

未知样 1 未知样 2 未知样 1 未知样 2DNA 甲基化含量 64.5 46.7 48.9 48.9

扩展不确定度渊k=2冤 6.1 8.0 1.0 1.1

表 3 CCQM P94.2 比对样品 HPLC-IDMS 定量结果

2.2

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18时间/min

0.05.01.01.52.0 3.09

图 1 脱氧核苷酸液相色谱同位素稀释质谱分析

核甘酸 Q1 m/z Q3 m/zLdCMP 320 119LdGMP 363 162LdAMP 337 141LTMP 335 86dCMP 308.2 112dGMP 348.1 152dAMP 332.1 136.2TMP 323.2 81

表 2 检测离子对

高运华等：DNA 甲基化定量测量国际比对 CCQM P94.2

0 0.55 1.10 1.65 2.20 2.75 3.30酶量/渊10-2Unit冤

200400600800

1 0001 2001 400

TMPdAMPdGMPdCMP

图 2 Phosphodiesterase I 酶用量优化

49

中国测试 2015 年 6 月

0.20.30.40.50.60.70.8

渊a冤未知样 1

0.20.30.40.50.60.70.8

渊b冤未知样 2图 4 CCQM P94.2 国际比对结果

析条件，对经过酶解并定容后的比对样品进行了定

量分析，结果见表 3。测量结果的不确定度评定主要

从方法的精度、样品和标准溶液的配制称量、酶消解

程度、DNA 甲基化效率等方面进行了系统考察，结

果见表 4。2.5 DNA甲基化克隆测序结果及不确定度分析

亚硫酸盐处理，然后克隆测序测定 DNA 甲基化

含量是 DNA 甲基化定量测定的金标准；但这种方法

操作较为复杂，且定量结果的准确度受选取的单克

隆数量的限制。为尽量提高克隆测序的准确度，比

对过程中每个样品随机选取了 200 个克隆进行测

序，克隆的分辨率提升到 0.5%。通过统计计算得到

其甲基化含量，评定了其测量结果的不确定度，结果

见表 4。2.6 比对结果等效图

CCQM P94.2 国际比对结果见图 4，图中实红线

为主导实验室设定参考值，两侧的红虚线为设定

参考值的不确定度。C-seq 为中国计量科学研究院

克隆测序结果，C-dNMP 为中国计量科学研究院

HPLC-IDMS 测量结果。可以看出，中国计量科学研

究院克隆测序的两个比对样品的结果均与标准值十

分吻合。HPLC-IDMS 测量结果均取得了等效度，未

知样 2 测量结果与标准值十分吻合。综合分析表 4和图 4 可知，克隆测序和 HPLC-IDMS 测量 dNMP 含

量两种方法均可较好地完成 DNA 甲基化定量分析。

HPLC-IDMS 测量结果可以通过 dNMP 标准物质实

现到国际基本单位的溯源，溯源途径清晰。而克隆测

序结果的溯源途径还不十分清晰，相对应的计量标

准物质缺乏，急需加强这方面的科技研究。

3 结束语通过 HPLC-IDMS 和序列测定两种方法对比对

样品进行了 DNA 甲基化含量定量测量，优化了酶消

解条件、液相色谱同位素稀释质谱分析条件，选取了

足够量的克隆进行序列测定分析，充分考虑各可能影

参数 参数量值 标准不确定度

数据来源未知样 1 未知样 2 未知样 1 未知样 2

方法准确度 方法 3.89% 3.69% 3.02% 3.95% 仪器测量重复性

LdAMP 校准贮存溶液的称量 天平线性 0.006mg 0.006mg 0.004598% 0.004 598% 天平校准证书

LdCMP 校准贮存溶液的称量 天平线性 0.006mg 0.006mg 0.003273% 0.003 273% 天平校准证书

LdGMP校准贮存溶液的称量 天平线性 0.006mg 0.006mg 0.003896% 0.003 896% 天平校准证书

TMP 校准溶液的称量 天平线性 0.006mg 0.006mg 0.004267% 0.004 267% 天平校准证书

H2O的称量 天平线性 0.006mg 0.006mg 5.61E-06% 5.61E-06% 天平校准证书

M0 的称量 天平线性 0.006mg 0.006mg 0.000568% 0.000 568% 天平校准证书

M100 的称量 天平线性 0.006mg 0.006mg 0.000587% 0.000 587% 天平校准证书

U1 的称量 天平线性 0.006mg 0.006mg 0.000 587% 0.000 585% 天平校准证书

dNMP mix 的称量 天平线性 0.006mg 0.006mg 0.000598% 0.000 585% 天平校准证书

LdNMP mix 的称量 天平线性 0.006mg 0.006mg 0.000597% 0.000 598% 天平校准证书

酶消解混合物称量 天平线性 0.006mg 0.006mg 0.000219% 0.000 598% 天平校准证书

酶消解 酶消解效率 1.07% 1.07% 参考文献

DNA甲基化 DNA 甲基化效率 0.2% 0.2% 克隆测序

合成不确定度 3.05% 4.0%扩展不确定度渊k=2冤 6.1% 8.0%

表 4 DNA甲基化 HPLC-IDMS定量结果各项相对标准不确定度及合成标准不确定度

50

第 41 卷第 6 期

同程度的检出。3 个采样点中，2~3 环

的含量均相对较低，可能因为低环 PAHs 易挥发，在

大气中主要以气相的形式存在，而高环的 PAHs 则

主要以吸附于颗粒物的形式存在，因此在 撞PAHs 中百分比更高。在这 16 种 PAHs 中，苯并[a]芘是目前

研究最多的多环芳烃，是一种公认的强致癌和致突

变的有机物，在我国 2012 年颁布的空气质量标准

中仅对苯并 [a]芘给定限值为 2.5 ng/m3 [1]，而其他

优控 PAHs 均无标准限值。在本次检测中，苯并[a]芘检测浓度为 3.03~10.9 ng/m3，均超出限值范围。由

此可见，成都大气在一定程度上已受到多环芳烃的

污染。

3 结束语本文建立了加速溶剂萃取-高效液相色谱-紫外

荧光串联检测法同时测定大气颗粒物 PM2.5 中的

16 种优控多环芳烃（PAHs）。该法简便、快速、准确、

灵敏，与传统的索氏提取法和超声提取法相比，加速

溶剂萃取避免了大量有机溶剂的使用，更加智能、

省时，能够满足大批量样品的准确分析。将其应用于

冬季成都市 3 个区域 PM2.5 中这 16 种 PAHs 的含

量测定，可为成都市 PM2.5 中多环芳烃的污染特征

及来源解析提供一定的数据支持。

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渊上接第 46 页冤

响测定准确度的因素，评定了测量结果的不确定度，

取得了较好的比对结果。比对结果证明了文中建立

的方法准确可靠，可为后续的 DNA 甲基化计量标准

物质的研制及临床诊断中 DNA 甲基化的定量分析

提供借鉴和参考。

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