DNA-ČIP TEHNOLOGIJA

Usporedo s razvojem DNA molekularnih markera devedesetih godina prošlog stoljeća naučnici

su počeli razvijati novu tehnologiju nazvanu DNA-čip. Naziv potiče od toga što se na maloj

staklenoj površini nalaze lanci poznatog slijeda baza, što podsjeća na elektronički čip. Ostali

nazivi koji se spominju u literaturi su: biochip, DNA microarray, gene array, gene chip i drugi.

Prema namjeni eksperimenata razvijena su tri glavna tipa DNA-čipa:

- sekvencijski čip

- ekspresijski čip

- čip komparativne hibridizacije.

Osnovna podjela DNA-čipova je na oligonukleotidne i c DNA (DNA komplementarne).

Oligonukleotidnim DNA-čipom se vršidentifikacija mutacija i varijacija na cjelokupnom

genomu dok se cDNA-čip najčešće koristi za proučavanje ekspresije, detekciji odproteinskih

komponenti u hrani, detekciji mutiranih gena, te pri određivanju sigurnosti konzumiranja GMO

biljaka.

Kombinacija mikročipova i bioloških materijala omogućila je konstruiranje biosenzora za

mjerenje sadržaja šećera, bjelančevina i hormona u tjelesnim tekućinama te polutanata u vodi i

zraku. Biosenzori rade na način da supstrat, koji se mjeri, prolazi kroz tanku membranu i nailazi

na biološki senzor (koji može biti enzim, antitijelo i cijela ćelija). Kao produkt reakcije između

supstrata i senzora mogu nastati električna struja, toplota, plin ili topiv spoj odgovarajuće

topivosti

Nastali produkt prolazi kroz još jednu tanku membranu i dolazi do detektora, koji mjeri njegovu

količinu stvarajući električni signal koji se direktno očitava. Osnovna jedinica biočipa jest

molekula poluprovodnika uložena u proteinski ram i građena u cjelinu na proteinskoj podlozi.

Električni signali putuju poluvodičem kao što signali prolaze kroz neke dijelove silicijskog

mikročipai

U agronomiji se koriste DNA-čipovi koji su napravleji isključivo za određene vrste kultivisanog

bilja. Jedan od primjera je Affymetrixov GeneChip® Tomato Genome Array napravljen isključivo

za proučavanje genske ekspresije paradajza (Lycopersicum esculentum Mill.). Složeni slijed je

sastavljen od preko 10 000 setova proba izoliranih iz paradajza kako bi se istražilo preko 9 200

njenih transkripata 2

DNA molekula nije jedini materijal koji se koristi na biočipovima. Drugi tipovi biočipova koji su

još u fazi razvoja ili/i istraživanja uključuju proteinske čipove, čipove antitijela i druge lab-on-

chip naprave koje su rezultat minijaturizacije.

DIZAJN I TIPOVI

DNA-čip se sastoji od velikog broja aktivnih polja (koncentriranih na površini mikrometarskog

reda veličine) koja supričvršćena za tvrdu podlogu (npr. staklo, silikon). Svako polje sadrži

određenu poznatu probu (npr. lanac DNA, oligonukleotide ili fragmente gena). Te probe imaju

sposobnost da prepoznaju komplementarne baze s kojima formiraju dvostruki lanac u procesu

hibridizacije. Kad se uroni DNA-čip u otopinu koja sadrži nepoznate mete, hibridizacija će se

pojaviti samo na komplementarnim mjestima. Detekcija ovih polja će omogućiti identifikaciju

mete. Trenutno se detekcija hibridizacije na podlozi provodi korištenjem markera ( najčešće

flurescentne boje) koji su prethodno fiksirani na sve mete. 3

U okviru DNA-čipa razlikujemo makro i mikročipove (macro- i microarray). Razlika između

makro i mikročipova je u broju aktivnih polja i njihovoj veličini. Makročipovi sadrže nekoliko

desetaka poljakoje su široka 500µm u promjeru, a izrađene su ručno ili pomoću robota.

Mikročipovi sadrže hidljade točaka veličine manje od 500 µm u promjeru. Za njihovu je

proizvodnju potrebna specijalna robotizirana oprema. 3

Prema terminologiji razlikujemo dvije tehnike izrade DNA-čipa:

- DNAčip

- mikročip koji se često naizmjenično koriste.

DNA-čip (ili makročip) ima manju gustoću polja po jedinici površine, dok mikročip ima veću

gustoću polja po jedinici površine i može sadržavati i do nekoliko hiljada polja.Prema namjeni

razlikujemo tri glavna tipa DNA-čipa: -

- sekvencijski čip

- ekspresijski čip

- čip komparativne hibridizacije.

Sekvencijski čip je prvi, najstariji i najčešće spominjan u člancima. Na sekvencijskom čipu

nalaze se probe - cDNA segmenti obično dugi 20 nukleotida pričvršćenih za supstrat na stakalcu.

Uzorci (označena DNA) se zatim izlažu probama na čipu i mjesta spajanja meta i proba određuju

rezultate eksperimenta. Ovaj dizajn se naziva sekvenciranje hibridizacijom ili SBH („sequencing

by hybridization“), a namjena mu je određivanje DNA sekvenci uzorka.4

Ekspresijski čip je konstruiran s namjerom utvrđivanja stepena ekspresije određenog gena

mjerenjem količine mRNA koju proizvede taj gen. To se postiže konstrukcijom čipova sa

specifičnim setovima proba koji sadrži sve moguće kombinacije proba. Rezultati se uspoređuju s

kontrolom kako bi se utvrdio stepen promjene u ekspresiji određenog gena. Ovi čipovi su korisni

u dijagnostici i terapiji bolesti povezanih s određenim genetskim ekspresijama, kao što su neke

vrste raka. 4

Čip komparativne hibridizacije je molekularno citogenetska metoda za analizu kopija pojedinih

gena u ukupnoj količini DNA, a dizajniran je za utvrđivanje relativne količine date genetske

sekvence. Variranje kopija pojedinih gena povezano je s povećanim rizikom pacijenata od nekih

onkoloških, neuroloških i psihijatrijskih bolesti, kao i s njihovim dijagnosticiranjem. Ovim tipom

čipa također se otkrivaju i genetske mutacije tipa kromosomskih aberacija. To se obično obavlja

korištenjem zdravog tkiva kao reference u usporedbi s uzorkom bolesnog tkiva 4

TEHNIKA IZRADE DNA-ČIPA

S obzirom na način proizvodnje, primjenu, način očitanja i prezentiranja rezultata, razlikujemo

više različitih podjela DNA-čipa. S obzirom na vrstu probe razlikujemo oligonukleotidni i

cDNA-čip. Na oligonukleotidnom čipu se nalaze probe kratkih nukleotidnih sekvenci. U

principu se naziv čipa odnosi na specifičnu tehniku proizvodnje koja objedinjuje kemijsku

sintezu s tehnologijom fotolitografije. Oligonukleotidne sekvence su sintetizirane direktno na

čip. Sekvence mogu biti duže (60 proba) ili kraće (25 proba), ovisno o namjeni. Prednost manjih

proba je veća specifičnost, uz vrlo malu mogućnost kontaminacije s drugim sekvencama dok je

glavni nedostatak je visoka cijena.). cDNA-čip se odnosi na mikročip, a naziva se i točkasti čip.

Proizvodnja cDNA-čipa zahtijeva određen međukorak koji nije potreban kod proizvodnje

oligonukleotidnog čipa, a to je korištenje enzima obrnute transkriptaze za proizvodnju cDNA i

PCR-a za umnožavanje cDNA komplementarnih odgovarajućoj mRNA. Prema tome, probe

cDNA čipa su oligonukleotidi, cDNA ili mali fragmenti PCR produkata koji se podudaraju s

mRNA. Probe se prvo sintetiziraju, a tek nakon toga postavlaju na površinu čipa . Za

postavljanje proba na supstrat koristi se robot koji na vrhu svoje robotske ruke ima ugrađene igle

koje uranjaju u posude s DNA probama i odlažu ih na predviđene lokacije na površini čipa.

Dobiveni uzorak na čipu predstavlja profile nukleinskih kiselina pripremljenih proba koje su

spremne hibridizirati s komplementarnim cDNA metama pripremljenima obrnutom

transkripcijom s mRNA iz eksperimentalnih uzoraka5

Organi i tkiva na čipovima

Ovakvi čipovi su, zapravo, mikrouređaji koji repliciraju strukturu ljudskih organa i predstavljaju

inovaciju u ispitivanjima novih lijekova.

Čipovi koji imitiraju ljudske organe se sastoje od dva sistema: mikrofluidalnog sistema i

mikrotehnološkog sistema. Mikrofluidalni sistem omogućava precizno kontroliranje tokova

fluida ili stvaranje koncentracionog gradijenta, te takođe olakšava manipulaciju sa malom

količinom tečnosti. Danas se koriste mikrofluidni sistemi od PDMS-a (polidimetilsiloksana).

PDMS ima nekoliko prednosti koje se najprije ogledaju u bogatoj propusnosti gasa koji

osigurava da ćelije unutar čipa budu opskrbljene kisikom. U ovom slučaju, vanjski dotok kisika

uopšte nije potreban. Takođe, PDMS je veoma fleksibilan i transparentan. Mikrotehnologija

omogućava formiranje mikrostruktura, olakšava kontrolu oblika i funkcije ćelija.(6)

Danas se usavršavaju tehnologije za izradu čipova te za replikaciju mnogih organa na čipove,

čak i cijelog ljudskog tijela. Dosad su uspješno replicirani sljedeći: pluća, jetra i crijeva (slika 1.).

Takođe se radi i na replikaciji tumora, kako bi se ustanovili razlozi nastanka malignih bolesti, ali

i kako bi se proučilo djelovanje antitumorskih lijekova.(6)

Slika 1. Replikacija jetre, bubrega, pluća i ljudskog tijela na čipove(7)

3.2.1. Crijeva na čipovima

Kada je riječ o čipu koji replicira crijeva, važno je pomenuti da je ovakav model ključan u

ispitivanju određenih lijekova, jer se lijekovi koji su uneseni oralnim putem najviše apsorbiraju

putem crijeva. Prilikom izrade ovakvog modela potrebno je uzeti u obzir nekoliko činjenica.

Najprije, potrebno je voditi računa o ćelijskom sastavu budući da se crijevo većinom sastoji od

enterocita i peharastih ćelija. Potom je potrebno voditi računa o strukturnim karakteristikama kao

što su resice i sluzi, ali i o dinamičkim osobinama crijeva, odnosno, pokretima crijeva. Naučnici

su izradili jedan ovakav model koji sadrži dva neovisna kanala odvojena polupropusnom

membranom. U kanalima su ćelije inokulisane i kultivirane. Takođe, nakon razvijanja takvog

modela, naučnici su ga unaprijedili uvođenjem dinamičkih osobina crijeva. Za sada se radi i na

tome da se unutar ovakvih modela razviju bakterijske kulture kako bi što bolje oponašale

humana crijeva.(6)

3.2.2. Jetra na čipovima

Jedan od najvažnijih organa za detoksikaciju lijekova jeste jetra, te su se stoga naučnici jako

puno posvetili izradi čipa koji replicira jetru kao organ. Osim toga, jetra je jedan od najboljih

pokazatelja i akutne i hronične toksičnosti lijekova. Ovakav alternativni model pruža mnoge

pogodnosti kao što su:

proučavanje ponašanja hepatocita, protoka tečnosti kroz sistem, i ko-kulture različitih

tipova ćelija jetre,

proučavanje klirensa lijekova i interakcija između lijekova,

u potpunosti zamjenjuje animalne modele,

olakšava proučavanje toksičnosti i izvođenje kliničkih studija za novootkrivene lijekove. (8)

Naučnici su mnogo vremena utrošili na razvoj čipa koji u potpunosti oponaša prirodne ćelije

jetre. Za konstruiranje jedinstvene trodimenzionalne jetrene ćelijske strukture koriste se čipovi sa

mikrokomorama (slika 2.). Perisinusoidalne ćelije su uzgojene u ravnim komorama. U

odvojenim komorama su uzgojeni hepatociti kako bi se izbjegao kontakt dvaju tipa ćelija.

Različiti tipovi ćelija su povezani preko spojnih cijevi. Osmotske pumpe omogućavaju

kontinuiranu opskrbu hranjivim tvarima i uklanjanje otpada. Takođe, pumpa služi i za kontrolu

brzine protoka hranjivih tvari.(9)

Na ovaj način je razvijen model koji je dovoljno kompaktan za dugoročan rad bez ikakvih

perifernih uređaja.

Slika 2. Razvoj čipa koji replicira jetru(9)

3.2.3. Pluća na čipovima

Ovakav model nudi sasvim novi in vitro pristup ispitivanjima toksičnosti lijekova. Razvijeni

trodimenzionalni model u potpunosti oponaša i strukturu i funkciju pluća.(10)

Ovakva tehnologija je uveliko korištena za ispitivanje toksičnosti udahnutih spojeva jer, kao što

je poznato, pojedini lijekovi se jako dobro apsorbiraju i preko disajnog trakta.

Razvijen je mikročip koji se sastoji od polimera i čija je dužina 2 cm. Ovakav čip u potpunosti

oponaša i strukturu i funkciju ljudskih pluća. Mikrofluidacijski sistem je ugrađen u alveolarno –

kapilarni dvosloj (slika 3.). Alveolarno – kapilarni dvosloj sadrži dva kanala. Kanali su izgrađeni

od alveolarnih epitelnih ćelija, mikrovaskularnih endotelnih ćelija pluća, sloja zraka i medija za

kulturu. Kanali su odvojeni poroznom membranom debljine 10 µm. Porozna membrana je

obložena ekstracelularnim matriksom. Mikrovaskularne endotelne ćelije i alveolarne ćelije su,

takođe, odvojene tankim zidom. Primjena vakuuma na komorama deformiše tanke zidove i

uzrokuje gibanje fleksibilne membrane polimera. Upravo na taj način se oponaša mehanika

disanja.(11)

Slika 3. Izrada čipa koji replicira pluća(11)

LITERATURA

(1)Hwang, S. Y. (1997): Whole genome analysis using DNA chips. Korean Soc. Med. Biochem.

Mol. Biol. News 4: 28-34.(2)Anonymous (2008): http://www.affymetrix.com(3) McGall, G. H., Christians, F. C. (2006): High-density genechip oligonucleotoide probe arrays.

Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology: Chip technology 77, 21-43, Springer,

Germany(4)Henke, C. (1999): Big business from tiny molecules. IVD Technology, Nov 9, 31.(5) Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. (1995): Quantitative monitoring of gene

expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270: 467-470.

(6) A review about organ on a chip. URL: www.elveflow.com/a-review-about-organs-on-chip;

(datum pristupa: 01. 12. 2014.; 08:00h)

(7)Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J. & Ingber, D. E. Microengineered

physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab Chip 12, 2156–2164 (2012).

(8) Liver chip. URL: www.liverchip.com; (datum pristupa: 01.12. 2014.; 09:00h)

(9)3D microfluidic liver on a chip. URL: http://www.rsc.org/chemistryworld/2013/04/liver-chip-

model-paracrine-signalling-osmotic-pump-drug-testing; (datum pristupa: 01.12.2014.; 10:00h)

(11) Lung-on-a-chip. URL: wyss.harvard.edu/viewpage/240/; (datum pristupa: 01.12.2014.;

12:00h)

(12)M.J. Hass et al. "Breathing Life into Lung Models " SciBX3(28); doi:10.1038/scibx.2010.847;

(datum pristupa: 01. 12. 2014.; 15:00h)

i