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Aus dem Institut für Pathologie
(Direktor Univ.- Prof. Dr. med. F. Dombrowski)
der Medizinischen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Thema:
Tumornekrosefaktor-Alpha, sein Rezeptor und c-Met sowie die
elektronenmikroskopische Morphologie der Nicht-Parenchymzellen während der
östrogeninduzierten Hepatokarzinogenese der Ratte
Inaugural - Dissertation
zur
Erlangung des akademischen
Grades eines
Doktors der Medizin
(Dr. med.)
der
Medizinischen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
2011
vorgelegt von:
Schirakowski, Anne Elisabeth
geb. am: 17.12.1979
in: Oldenburg (Oldb)
Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Heyo K. Kroemer
1. Gutachter: Prof. Dr. F. Dombrowski
2. Gutachter: Frau Prof. Dr. E. Wardelmann
Ort, Raum: Greifswald, Hörsaal im Institut für Pathologie
Tag der Disputation: 04. Oktober 2011
III
Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ..................................................................... 1
1.1 Chemische Hepatokarzinogenese ..................................................................... 1
1.2 Präneoplastische Leberherde ............................................................................ 3
1.3 Das Modell der Pankreasinseltransplantation in Rattenlebern ......................... 4
1.4 Das Modell der Schilddrüsentransplantation in Rattenlebern .......................... 7
1.5 Das Modell der Ovartransplantation in Rattenlebern ....................................... 8
1.6 Das Zytokin Tumornekrosefaktor alpha (TNF α) ........................................... 12
1.6.1 Die Geschichte und Entdeckung von TNF α .............................................. 12
1.6.2 Die Struktur von TNF α .............................................................................. 13
1.6.3 Funktionen und Syntheseorte von TNF α ................................................... 14
1.7 Tumornekrosefaktor alpha-Rezeptor Typ 1 und 2 (TNF-R1/2) ..................... 16
1.7.1 Einteilung und Mitglieder der TNF-Rezeptor-Superfamilie ...................... 16
1.7.2 Die Struktur und Expressionsorte von TNF-R1 und TNF-R2 .................... 17
1.7.3 Die verschiedenen Signaltransduktionswege von TNF-R1 und TNF-R2 .. 18
1.8 Der Wachstumsfaktor hepatocyte growth factor (HGF) ................................. 20
1.8.1 Die Struktur und Expressionsorte von HGF ............................................... 20
1.8.2 Die Funktion von HGF ............................................................................... 21
1.9 c-Met (mesenchymal-epithelial transition factor) ........................................... 22
1.9.1 Die Struktur und Transkription von c-Met ................................................. 22
1.9.2 Die Signaltransduktionswege von c-Met .................................................... 23
1.9.3 Die Rolle von c-Met in der Tumorformation und –progression ................. 24
1.10 Zielsetzung dieser Arbeit ................................................................................ 25
2 Material und Methoden.............................................. 26
2.1 Material ........................................................................................................... 26
2.1.1 Geräte .......................................................................................................... 26
2.1.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien .................................................... 26
2.1.3 Weitere Materialien .................................................................................... 28
2.1.4 Verwendete Antikörper ............................................................................... 29
2.1.5 Sekundäre Antikörper und Reagenzien für die immunhistochemischen Farbreaktionen ........................................................................................................ 32
2.1.6 Versuchstiere .............................................................................................. 32
2.2 Methoden ........................................................................................................ 32
2.2.1 Versuchsaufbau ........................................................................................... 32
IV
2.2.2 Ovartransplantation ..................................................................................... 33
2.2.2.1 Gewinnung und Präparation des Ovars .............................................. 33
2.2.2.2 Transplantation der Ovarien ............................................................... 33
2.2.3 Töten der Tiere und Perfusionsfixation des Gewebes ................................ 34
2.2.4 Elektronenmikroskopie ............................................................................... 36
2.2.4.1 Einbettung des Gewebes in Epon ....................................................... 36
2.2.4.2 Herstellung von Gewebeschnitten für die Elektronenmikroskopie .... 37
2.2.4.3 Auswertung und Statistik der Elektronenmikroskopie ....................... 38
2.2.5 Immunhistochemie ...................................................................................... 44
2.2.5.1 Einbettung in Paraffin ......................................................................... 44
2.2.5.2 Anfertigung von Schnitten .................................................................. 45
2.2.5.3 Immunhistologisches Färben der Schnitte .......................................... 45
2.2.5.4 Auswertung der immunhistochemischen Präparate ............................ 51
3 Ergebnisse ................................................................. 52
3.1 Elektronenmikroskopische Untersuchungen .................................................. 52
3.1.1 Allgemeine Beobachtungen ........................................................................ 52
3.1.2 Volumenanteile der Parenchym- und Nichtparenchymzellen am Lebervolumen ......................................................................................................... 57
3.1.3 Anteil der Fettvakuolen am Zytoplasmavolumen der Sternzellen .............. 59
3.1.4 Mittlere Größe der Fettvakuolen der Sternzellen ....................................... 60
3.2 Immunhistochemische Untersuchungen ......................................................... 62
3.2.1 Beurteilung der Farbreaktion und Lokalisation von TNF α in ovartransplantierten Rattenlebern ........................................................................... 62
3.2.2 Beurteilung der Farbreaktion und Lokalisation von TNF-R1 in ovartransplantierten Rattenlebern ........................................................................... 65
3.2.3 Beurteilung der Farbreaktion und Lokalisation von c-Met in ovartransplantierten Rattenlebern ........................................................................... 67
3.2.4 Beurteilung der Farbreaktion und Lokalisation von HGF in ovartransplantierten Rattenlebern ........................................................................... 70
3.2.5 Tabellarische Übersicht: TNF α, TNF-R1 und c-Met im Verlauf des Karzinogeneseprozesses ......................................................................................... 70
4 Diskussion .................................................................. 71
4.1 Bewertung der unterschiedlichen zellulären Zusammensetzung von veränderten und unveränderten Leberazini ................................................................. 71
4.2 Bewertung der Morphologie der Sternzellen .................................................. 74
4.2.1 Anteil der Fettvakuolen am Zytoplasmavolumen der Sternzellen .............. 74
4.2.2 Mittlere Größe der Fettvakuolen der Sternzellen ....................................... 75
V
4.3 Bewertung der immunhistochemischen Untersuchungen ............................... 76
4.3.1 TNF α .......................................................................................................... 76
4.3.2 TNF-R1 ....................................................................................................... 78
4.3.3 HGF und c-Met ........................................................................................... 79
5 Zusammenfassung .................................................... 82
6 Abkürzungsverzeichnis .................................... LXXXIV
7 Literaturverzeichnis.......................................... LXXXVII 8 Eidesstattliche Erklärung ................................... XCVIII
1 Einleitung 1
1 Einleitung
Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist ein maligner Tumor der Leber mit
hepatozellulärer Differenzierung, der weltweit als einer der häufigsten bösartigen
Tumoren bei Männern mit einer jährlichen Rate von einer Million Neuerkrankungen
und schätzungsweise einer halben Million Todesfällen beider Geschlechter gilt. Es
macht ungefähr 90% aller primären Leberkarzinome aus, von denen im Schnitt zwei-
bis viermal mehr Männer als Frauen betroffen sind. Als endemisch gilt das HCC in
Südost-Asien und in der Sahara-Region Afrikas, was durch eine ausgeprägte
Verbreitung von Hepatitis-B- und –C-Viren aufgrund einer Infektion meist im
Säuglingsalter begründet wird [1, 2]. In Ostasien erkranken bis zu 36,6 auf 100.000
Männer und in Afrika sogar bis zu 48 auf 100.000, wobei die Zahlen in den westlichen
Industrienationen deutlich geringer ausfallen. In Nordeuropa, Australien und
Neuseeland, welche als Regionen mit dem niedrigsten Risiko gelten, leiden von
100.000 Männern weniger als fünf am hepatozellulären Karzinom [3].
In den meisten Fällen tritt die bösartige Neubildung auf dem Boden einer Leberzirrhose
auf. Ein kausalpathologischer Zusammenhang besteht außerdem mit verschiedenen
Noxen (Hepatitis B, C und D, natürliche Gifte wie Aflatoxin, Nikotin, chronischer
Alkoholmissbrauch, Arsen, Anabolika, orale Kontrazeptiva), welche das Risiko an
einem Leberzellkarzinom zu erkranken, erhöhen [1]. Ferner können auch angeborene
Stoffwechseldefekte wie Hämochromatose, Morbus Wilson, Glykogenose Typ I, α1-
Antitrypsinmangel etc. die Entwicklung eines HCC begünstigen [4].
Die frühen Stadien im Karzinogeneseprozess des hepatozellulären Karzinoms stellen
schon länger das Forschungsthema verschiedener Gruppen dar, trotzdem sind nach wie
vor einige Aspekte ungeklärt. Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Tiermodelle
entwickelt, um diese Mechanismen zu analysieren.
1.1 Chemische Hepatokarzinogenese
Am längsten bekannt ist die hepatokarzinogene Wirkung bestimmter chemischer
Karzinogene. Sasaki und Yoshida erzeugten im Jahre 1935 erstmals Tumoren eines
inneren Organs durch orale Gabe von O-Aminoazotoluol und gaben damit den Impuls
1 Einleitung 2
für weitere Forschungsprojekte in der Krebsforschung. Seitdem wird versucht, mit
Substanzen wie Aflatoxinen [5], Amiden, Thioacetamiden [6, 7], N-2-
Fluorenylacetamiden und besonders mit Nitrosaminen [8, 9] die Entstehung von
Tumoren der Leber zu induzieren und zu verfolgen.
Viele experimentelle und epidemiologische Daten, bezogen von Experimenten sowohl
an Tieren als auch an Menschen, zeigen, dass synthetische Androgene, vor allem
anabolische Steroide, ebenfalls tumorinduzierend auf die Leber von Männern sowie von
Frauen wirken können [10-15]. Dabei ist die Ausbildung eines hepatozellulären
Karzinoms häufiger bei männlichen als bei weiblichen Individuen beobachtet worden.
Auch erhöhte Serum-Konzentrationen von endogenem Testosteron sind assoziiert mit
einem erhöhten Risiko, ein hepatozelluläres Karzinom zu entwickeln. Diese Assoziation
bleibt auch signifikant, wenn andere Risikofaktoren eines hepatozellulären Karzinoms,
wie Hepatitis B und C, Nikotin- und Alkoholgenuss, vorausgegangene
Lebererkrankungen und Diätmaßnahmen hinzukommen [16].
Die Einnahme oraler Kontrazeptiva kann ebenfalls zur Entwicklung von
hepatozellulären Adenomen, bei längerer Einnahme sogar zu hepatozellulären
Karzinomen bei Frauen führen [17-21]. Diese Ergebnisse finden sich in Resultaten von
Tierexperimenten wieder, in denen synthetische Östrogene, wie Ethinyl-Östradiol und
Diethylstilbestrol verabreicht und eine Hepatokarzinogenese beobachtet werden konnte
[22-24]. Die simultane Gabe von Tamoxifen, welches als ein kompetitiver
Östrogenrezeptorblocker hinsichtlich morphologischen, proliferativen und
zytochemischen Veränderungen gilt, verhindert dabei einen Teil des karzinogenen
Effekts von Ethinyl-Östradiol, so dass man davon ausgehen kann, dass diese Effekte
überwiegend über den Östrogenrezeptor vermittelt werden, also lediglich in geringem
Maße genotoxisch wirken [25]. Man muss aber bedenken, dass Tamoxifen zusätzlich
ein geringes genotoxisches Potential besitzt und demnach hepatokarzinogene Effekte in
geringem Umfang in Ratten aufweisen kann. Diese Beobachtungen lassen aber trotzdem
darauf schließen, dass Östrogene sowohl in geringem Umfang genotoxisch wirken [26,
27], als auch Einfluss auf zelluläre Signalwege und Zellstoffwechsel und –proliferation
sowie auf zelluläre und mitochondriale Genexpression nehmen [28, 29]. Östrogene
interagieren auch mit anderen hepatozellulären Mitogenen, wie dem epidermal growth
factor (EGF) oder hepatocyte growth factor (HGF) und transforming growth factor
1 Einleitung 3
alpha (TGF α), indem deren Effekte, im speziellen die DNA-Synthese, induziert werden
[30, 31]. Obwohl die Effekte von synthetischen Östrogenen auf die Leber ausführlich
erforscht wurden, ist sehr wenig über die Auswirkungen von endogenen Östrogenen
bekannt. Es ist beschrieben, dass das natürliche Östrogen Östradiol einen
stimulierenden Effekt auf die Proliferation der Hepatozyten ausübt, jedoch war ein
karzinogener Effekt bis dahin noch nicht sicher bekannt [32]. Nur die Entwicklung von
malignen Neoplasien in der Mamma und dem Endometrium aufgrund des Vorliegens
erhöhter Östrogen-Konzentrationen sind schon erläutert [33, 34].
1.2 Präneoplastische Leberherde
In präneoplastischen Foci der Leber kommt es zu charakteristischen metabolischen und
morphologischen Veränderungen, die sowohl bei Zusatz von bekannten
hepatokarzinogenen Agenzien in Rattenlebern als auch beim Menschen beobachtet
werden konnten. Präneoplastische Leberherde können chemisch-toxisch, viral, radiogen
oder transgen induziert werden, sind am besten bei der Ratte untersucht, aber auch bei
zahlreichen anderen Spezies bekannt, einschließlich des Menschens. Unter den
verschiedenen Typen präneoplastischer Leberherde ist der Glykogenspeicherherd am
häufigsten [35, 36].
Als Hauptmerkmal dieser Foci gehört eine gesteigerte Glykogenansammlung in den
Hepatozyten, welche eine Vorstufe zu benignen sowie später zu malignen Neoplasien
darstellt [35]. Eine Präneoplasie ist hier als eine phänotypisch veränderte Zellpopulation
definiert, die noch kein offensichtliches neoplastisches Verhalten zeigt, jedoch eine
erhöhte Wahrscheinlichkeit einer Progression in benigne oder maligne Neoplasien
aufweist [37].
Außerdem kommt es in präneoplastischen Leberfoci zu einer Reduktion der Aktivität
der Glukose-6-Phosphatase und zu Störungen zahlreicher weiterer
Stoffwechselfunktionen, die nach dem derzeitigen Wissensstand vor allem Enzyme des
Kohlenhydratstoffwechsels [38], fremdstoffmetabolisierende Enzyme, den
Eisenstoffwechsel und verschiedene Komponenten intrazellulärer
Signaltransduktionskaskaden betreffen [39].
Sowohl die Erfahrung der experimentellen als auch der humanen Pathologie sprechen
für fundamentale Störungen im zellulären Energiestoffwechsel während der
1 Einleitung 4
Hepatokarzinogenese. In diesem Zusammenhang soll auf das vorbekannte hohe Risiko
der Entwicklung von hepatozellulären Adenomen und Karzinomen bei Patienten
hingewiesen werden, die an einer Glykogenose Typ I leiden, einer angeborenen
Glykogenspeichererkrankung, die auf einem genetischen Defekt der Glukose-6-
Phosphatase beruht. Genau dieses Enzym ist auch in der präneoplastischen
Glykogenspeicherzelle der Leber erniedrigt [4].
Einige dieser Veränderungen ähneln deutlich denen, die nach der Einwirkung
verschiedener Hormone auf Hepatozyten beobachtet wurden. Die metabolischen Muster
der glykogenotischen Herde gleichen insgesamt den Veränderungen, die durch einen
Insulineffekt im Leberparenchym ausgelöst werden [40]. Dabei kommt es nach einem
Überangebot von Schilddrüsenhormonen eher zu glykogenarmen, amphophilzelligen
Herden [40-42].
Eine glykogenminderspeichernde Leberzelle konnte ebenfalls durch lokale Einwirkung
von weiblichen Sexualhormonen erzeugt werden und zwar durch die in den folgenden
Kapiteln dargestellte Transplantation von Ovargewebe in die Leber von Ratten [43].
1.3 Das Modell der Pankreasinseltransplantation in Rattenlebern
Im Modell der Pankreasinseltransplantation in die Leber von Ratten konnten
Veränderungen des ortsständigen Gewebes festgestellt werden. Dabei wurde vor der
Transplantation in den Ratten eine diabetische Stoffwechsellage induziert, indem
mittels Applikation von Streptozotocin selektiv die B-Zellen der Pankreasinseln zerstört
wurden. Bereits im Jahre 1977 konnten Griffith et al. feststellen, dass die den
transplantierten Inseln benachbarten Hepatozyten in den ersten Tagen post
transplantationem eine Akkumulation von Glykogen sowie in geringerem Maße auch
von Fett zeigten. Diese Veränderungen waren jedoch in den Folgetagen wieder
rückläufig [44]. Im Jahre 1994 entwickelten Dombrowski et al. das Modell der
inkompletten Inseltransplantation. Dies beinhaltet die Transplantation von Inseln, die in
ihrer Anzahl deutlich unter dem Wert lagen, welcher für eine Normoglykämie
notwendig wäre, so dass es zu einer persistierenden Hyperglykämie kam. Die
Hyperglykämie führte zu einer Hypertrophie der insulinproduzierenden B-Zellen sowie
zu einer Dauerstimulation und damit einer deutlich erhöhten Menge von Insulin bei
1 Einleitung 5
gleichzeitiger Atrophie von A- und D-Zellen. Somit kam es zu einer lokalen
Hyperinsulinämie bei systemischer Hypoinsulinämie. Die von Griffith et al.
beobachteten Veränderungen der Hepatozyten kamen auch hier zum Vorschein und
blieben längerfristig bestehen. Außerdem kam man zu der wichtigen Erkenntnis, dass
sich die Veränderungen streng auf diejenigen Hepatozyten beschränkten, die sich im
Blutabstromgebiet der Transplantate befanden und damit innerhalb des zugehörigen
Leberazinus lagen. Die veränderten Azini lagen in unmittelbarer Nähe zu den
transplantierten Inseln, waren aber deutlich von den unveränderten Leberarealen
getrennt. Kontrollexperimente mit transplantierten Glomeruli der Niere, nicht zur
Insulinsynthese befähigten Inseln streptozotocin-diabetischer Ratten und isologen
Inseltransplantationen in die Leber von gesunden, nicht diabetischen Tieren sowie die
Transplantation einer für das Erreichen einer Normoglykämie ausreichend hohen
Anzahl an Inseln ergaben keine der oben genannten Veränderungen, so dass die
Vermutung erhärtet werden konnte, dass der lokale Hyperinsulinismus für die
Alterationen der Hepatozyten verantwortlich sein könnte [45].
In der nachfolgenden Langzeitstudie von Dombrowski et al. aus dem Jahre 1995 wurde
beobachtet, dass die Morphologie der veränderten Hepatozyten auch noch nach 77
Tagen existierte. Außerdem zeigten die Epithelzellen des Inseltransplantates eine
gesteigerte mitotische Aktivität, was beweist, dass die transplantierten Inseln durch die
Hyperglykämie in eine gesteigerte Stoffwechsellage versetzt wurden [46].
Im Jahre 1996 wurden die veränderten Azini vor allem hinsichtlich des Kohlenhydrat-
Metabolismus der Hepatozyten immunhistochemisch untersucht. Dabei wurde deutlich,
dass die beobachteten Enzymveränderungen mit den typischen Effekten des Insulins
weitgehend übereinstimmten. Ebenso konnte man nun die beobachteten
morphologischen Veränderungen, wie eine vermehrte Glykogen- und Fettspeicherung
mit den diagnostizierten Aktivitätsänderungen der Schlüsselenzyme erklären. Hier
ergab sich zum Beispiel eine Erhöhung der Aktivität der Glukose-6-Phosphat-
Dehydrogenase als wichtiges Enzym im Pentosephosphatweg beim Abbau von Glukose
und eine Verminderung der Glykogenphosphorylase und der Glukose-6-Phosphatase
(Glykogenolyse) sowie der Schlüsselenzyme der Glukoneogenese (Glukose-6-
Phosphatase) [47]. Die Beobachtungen anderer Autoren hinsichtlich der Bildung
karzinogeninduzierter präneoplastischer Leberherde [45, 48-52] und die oben
1 Einleitung 6
beschriebenen Enzym- und morphologischen Veränderungen ließen nun die Vermutung
aufkommen, dass es sich auch hier um Präneoplasien handelte, die durch die Wirkung
des Insulins induziert worden sein könnten.
Nach weiterer Beobachtung der Versuchstiere im Rahmen dieses Modells konnten nach
bis zu zwei Jahren signifikant vermehrt multifokale hepatozelluläre Adenome und
Karzinome nachgewiesen werden. Diese Neoplasien waren aus den vorher
diagnostizierten präneoplastischen Foci entstanden und fanden sich lediglich in den mit
transplantierten Inseln versehenen rechten Leberhälften der Hauptgruppentiere.
Außerdem konnte gezeigt werden, dass TGF α als Progressionsmarker in der
Hepatokarzinogenese auch in diesem Modell signifikant erhöht war, wobei in
veränderten Azini die Zonen 1 und 2 schwach, die Zone 3 deutlicher sowie die
hepatozellulären Karzinome stark positiv imponierten [53]. Auch die Sternzellen der
Leber wiesen diskrete morphologische Veränderungen auf. Während sich das Volumen
der Zellen nicht signifikant veränderte, zeigte sich eine Elongation ihres Zellkörpers, ein
höherer Gehalt an rauhem endoplasmatischen Retikulum und eine Zunahme des
Volumens sowie der Volumendichte der Mitochondrien. Allerdings blieb das Volumen
der Lipidvakuolen der veränderten Azini im Vergleich zu unveränderten gleich, jedoch
nahm mit länger werdender Zeit post transplantationem die Volumendichte der
Fettvakuolen und das Einzelzellvolumen der Fettvakuolen zu. Die mRNA in situ
Hybridisierung von HGF ergab in diesem Modell keine weiteren Erkenntnisse. Die
Sternzellen in veränderten Foci produzierten nicht signifikant mehr HGF als diejenigen
in unveränderten Arealen, so dass HGF hier keinen Einfluss auf die
Hepatokarzinogenese zu nehmen schien [54]. Damit kann man zusammenfassend sagen,
dass ein durch die Inseltransplantate bedingter lokaler Hyperinsulinismus in der Leber
von Ratten unter bestimmten Bedingungen enzymatische und morphologische
Veränderungen der Hepatozyten, bis hin zu benignen und malignen hepatozellulären
Tumoren induzieren kann.
1 Einleitung 7
1.4 Das Modell der Schilddrüsentransplantation in Rattenlebern
Als ausgeprägtes direktes hepatozelluläres Mitogen in vivo ist ebenfalls das
Thyroidhormon 3,3',5-Triiod-L-thyronin (T3) bekannt [55]. Dabei ähneln sich die
Effekte von T3 und Peroxisomenproliferatoren wie das Nebennierenrindenhormon
Dehydroepiandrosteron und Lipidsenker, welche hepatozelluläre Tumoren in Ratten
erzeugen können [49, 56-58]. Da bis dato noch wenig über die lokalen Langzeiteffekte
von Thyroidhormonen auf das Leberparenchym bekannt war [59], entwickelten
Dombrowski et al. im Jahre 2000 das Versuchsmodell, Thyroidfollikel über die
Portalvene in die Leber von thyroidektomierten Ratten zu transplantieren [60]. Nach
einer Woche, drei Wochen, drei Monaten und 18 Monaten post transplantationem
proliferierten die Transplantate und synthetisierten Thyreoglobulin, Thyroxin (3,3',5,5'-
Tetraiod-L-thyronin, T4) und T3. Bedingt durch diese Hormonsynthese zeigten die
Hepatozyten, die im Blutstrom der Leber abwärts der Transplantate lagen, eine
Zunahme der zytoplasmatischen Basophilie, einen Verlust an Glykogen, Vergrößerung
und Hyperchromasie der Zellkerne und eine starke Zunahme des Zellstoffwechsels
verglichen mit unveränderten Leberazini. In den veränderten Hepatozyten fanden sich
abweichende Enzymaktivitäten wie einen Anstieg der Glukose-6-Phosphat-
Dehydrogenase, Glukose-6-Phosphatase, Malat-Dehydrogenase, mitochondriale
Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase, Cytochrom-c-Oxidase und Säurephosphatase
sowie eine Abnahme der Aktivitäten der Glykogensynthase und
Glykogenphosphorylase. Im Gegensatz zu dem Modell der Pankreasinseltransplantation
kam es hier zu einem Auftreten von amphophilem (basophilen und eosinophilen)
Zytoplasma der Hepatozyten als eine Form der präneoplastischen Läsion, welche
aufgrund der Proliferation von Mitochondrien und rauhem endoplasmatischem
Retikulum sowie ausgeprägter Abnahme von Glykogen zustande kam [59]. Diese
amphophilzelligen Herde sind typisch für das Einwirken sogenannter direkter Mitogene
wie Peroxisomenproliferatoren und T3 auf das Leberparenchym. Jedoch traten in
diesem Modell keine Neoplasien auf. Dies kann daran liegen, dass die Progression von
amphophilzelligen Herden zu Neoplasien eine längere Zeit in Anspruch nimmt als die
Entwicklung von Tumoren aus glykogenotischen Zellfoci.
1 Einleitung 8
1.5 Das Modell der Ovartransplantation in Rattenlebern
Auch in diesem Modell wurde hormonproduzierendes Gewebe über die Portalvene in
die Leber von Ratten transplantiert. Hierbei konnte ebenfalls beobachtet werden, dass
die lokale Produktion von endogenen Hormonen, hier von Östradiol durch aktivierte
ovarielle Fragmente in der Leber zu fokalen Veränderungen stromabwärts der
Transplantate führte.
Eine Woche nach Transplantation zeigten sich bereits Anstiege der Apoptose- und
Mitose-Indizes, jedoch noch keine Änderungen der untersuchten Enzymaktivitäten [43].
Die morphologischen Alterationen der Hepatozyten nach drei Wochen waren schon
beträchtlich: Verlust an Glykogen, Ausbildung eines amphophilen Zytoplasmas,
Vergrößerung der Zellkerne, Bildung von multiplen Nukleoli und dekondensiertem
Chromatin, Anstieg der Peroxisomendichte, der Proliferationsaktivität und der
apoptotischen Eliminierung sowie Veränderungen der Aktivität von bestimmten
Schlüsselenzymen des Energiestoffwechsels. Dabei gelten der Anstieg von
Proliferationsaktivität und Apoptose als typische Eigenschaften präneoplastischer
Leberherde. Einige Hepatozyten zeigten jedoch eine Akkumulation von Glykogen, so
dass diskutiert wurde, ob es sich hierbei eventuell um eine Zwischenstufe zwischen
unveränderten und glykogenarmen Hepatozyten handelte [43]. Diese Veränderungen
fanden sich jedoch lediglich bei transplantierten und ovarektomierten Tiergruppen, so
dass man als Bedingung für eine ausreichende Stimulation der intrahepatischen
ovariellen Fragmente durch Gonadotropine die Tatsache der Kastration sehen musste
[61]. Nur hier ließen sich starke Anstiege der Serum-Hormon-Konzentrationen und
erhöhte intrahepatische Östradiollevel in der Nähe der Transplantate darstellen [43, 62].
Nicht kastrierte, aber transplantierte Tiergruppen waren nicht in der Lage, ausreichend
hohe Gonadotropinkonzentrationen zu bilden, so dass man daraus schließen konnte,
dass die intrahepatischen Ovargewebe nicht ausreichend stimuliert wurden, hohe
Östrogenlevel zu produzieren [62]. Ebenfalls schon drei Wochen nach Transplantation
ließen sich Anstiege des Zellumsatzes beobachten, welcher auch in
glykogenmehrspeichernden Leberherden nach pankreatischer Inseltransplantation
vorhanden war [53]. Die folgenden Änderungen der Enzymaktivitäten leiteten sich aus
Vergleichen mit unveränderten Azini derselben Tiere ab: Anstieg von γ-
Glutamyltransferase (γ-GT) in Zone 1 und 2, nicht aber in Zone 3 und Anstieg von
1 Einleitung 9
mitochondrialer Glycerol-3-Phosphatdehydrogenase (mG3PDH), Verminderung von
Glykogenphosphorylase (PHO), Glykogensynthase (SYN), Glukose-6-Phosphatase
(G6Pase), Glukose-6-Phosphatase-Dehydrogenase (G6PDH), Pyruvatkinase (PK),
unverändert waren Malic-Enzym (ME), Succinatdehydrogenase (SDH), Cytochrom-c-
Oxidase (COX), Acidphosphatase (AP) und negativ waren transforming growth factor α
(TGF α) und plazentare Glutathion S-Transferase (GST-P) [43].
Drei Monate nach der Transplantation waren die oben beschriebenen morphologischen
Modifikationen und veränderten Enzymaktivitäten der Tiere weiterhin präsent. Das
normale Wachstumsmuster der Hepatozyten war nun durch ein trabekuläres Wachstum,
bestehend aus mehr als zwei Zelllagen, ersetzt. Ebenfalls hat sich die
Proliferationsaktivität verändert, die sich nun vermindert darstellte [43].
Sechs Monate post transplantationem erschienen die präneoplastischen Leberfoci
stereomikroskopisch dunkler als das umgebene unveränderte Gewebe. Diese Tatsache
lag darin begründet, dass sich der Glykogengehalt der Hepatozyten verminderte, wie in
der Folge histochemisch herausgefunden wurde. Außerdem persistierten
morphologische Alterationen wie vergrößerte Zellkerne mit dekondensiertem
Chromatin und prominenten Nukleoli, eine Erhöhung der apoptotischen und
mitotischen Aktivitäten, der Mitochondrien- und Peroxisomendichte, eine Persistenz der
zytoplasmatischen Amphophilität und ein trabekuläres Wachstumsmuster der
Hepatozyten. Ähnlich wie bei den 3-Monats-Tieren zeigte sich noch keine Expression
von TGF α in angefertigten immunhistochemischen Färbungen [62].
Nach 12, 18, 24 und 30 Monaten persistierten die meisten präneoplastischen Leberherde
und zeigten ein Fortschreiten der architektonischen Umordnung. Die angefertigten
PAS-Reaktionen zeigten in einigen veränderten Hepatozyten ein mildes Ansteigen des
Glykogengehaltes, ansonsten war der zytologische Aspekt der präneoplastischen Foci
weitgehend konstant, insofern sie sich nicht zu hepatozellulären Neoplasien
entwickelten. Zum ersten Mal nach 12 Monaten konnten erste TGF α - positive
Hepatozyten in präneoplastischen Herden, meistens in unmittelbarer Nähe zu den
Transplantaten beobachtet werden [62]. Präneoplastische und neoplastische Herde
bildeten sich nur in denjenigen Bereichen der Leberazini, die hinsichtlich des
Blutflusses hinter den Transplantaten lagen. Das legte die Vermutung nahe, dass für die
Veränderungen im Leberparenchym die Transplantate bzw. deren Produkte (hohe lokale
1 Einleitung 10
Östradiollevel) verantwortlich sein mussten. Die Bildung von Präneoplasien gilt als
Adaptation an hohe lokale Hormonkonzentrationen, bevor zusätzliche nicht-
genotoxische und genotxische Effekte zu einer Ausbildung von Neoplasien führen [62].
Die Gabe von Toremifen (Östrogen-Rezeptor-Antagonist) verhinderte jegliche
präneoplastische Veränderung in Leberazini, die hohen lokalen
Östrogenkonzentrationen ausgesetzt waren sowie Entzündungen, Fibrose oder eine
Zirrhose der Leber. Daher ist der primäre Trigger für die Bildung präneoplastisch
veränderter Herde der überwiegend nicht-genotoxische Effekt des Östradiols
verantwortlich, indem seine Wirkung über den Östradiolrezeptor vermittelt wird [62].
Auch andere Produkte der Ovar-Fragmente, wie Progesteron oder α-Inhibin scheinen
keinen ausreichenden tumorinduzierenden Effekt auf die Leber zu haben. Toremifen
wirkt genauso wie Tamoxifen, nur hat Toremifen im Gegensatz zu Tamoxifen keinen
tumorinduzierenden Effekt auf die Leber [63-67].
Alle beschriebenen Veränderungen sind nicht in den Kontrollgruppen beobachtet
worden, ebenfalls nicht in der intraindividuellen Kontrolle, welche die linken
Leberhälften der transplantierten Tiere darstellt [62].
Der Phänotyp der beschriebenen veränderten Hepatozyten-Foci ähnelte in vielen
Aspekten den amphophilen präneoplastischen Foci, die sich durch Langzeitgabe von
verschiedenen chemischen Hepatokarzinogenen gebildet haben [49, 68, 69].
Die Veränderungen nach intrahepatischer Transplantation von Ovarfragmenten
unterschieden sich jedoch hinsichtlich der Morphologie und des Enzymmusters
substanziell von glykogenotischen, klarzelligen Herden nach intrahepatischer
Transplantation von Pankreasinseln [45, 47], ebenso wie von amphophilen Herden nach
intrahepatischer Transplantation von Schilddrüsengewebe [60]. Dies illustriert einen
unterschiedlichen Einfluss der verschiedenen Hormone auf den hepatozellulären
Metabolismus.
Erste neoplastische Leberzellfoci zeigten sich in der Kurzzeitstudie 18 Monate nach
Transplantation ovarieller Gewebefragmente in die Leber. Eines der insgesamt sechs
Versuchstiere bildete ein hepatozelluläres Adenom (HCA) aus, während in den Lebern
von drei Versuchstieren ein hepatozelluläres Karzinom (HCC) mit trabekulärem
Wachstum diagnostiziert wurde. Das Zytoplasma der Tumorzellen war amphophil,
1 Einleitung 11
vereinzelt konnten Bereiche mit einer Akkumulation von Glykogen beobachtet werden
[43].
In der nachfolgenden Langzeitstudie der intrahepatischen Transplantation ovarieller
Fragmente in Rattenlebern bildeten 27 Prozent der Hauptgruppentiere nach 18 Monaten
ein hepatozelluläres Adenom (HCA) in der rechten Leberhälfte aus. Dies imponierte
durch ein trabekuläres Wachstumsmuster und Kompression des umgebenden
Parenchyms durch Expansion. Der zytologische Aspekt der HCA´s war den
amphophilen präneoplastischen Foci sehr ähnlich, es bestand aber mehr Variabilität im
Glykogengehalt. Die mitotische Aktivität zeigte sich moderat erhöht [62]. Nach 24
Monaten hatten bereits 42 Prozent der Hauptgruppentiere ein HCA ausgebildet.
Außerdem trat zum ersten Mal ein HCC auf und das zu 74 Prozent innerhalb der
Hauptgruppe. Das HCC zeigte eine trabekuläre Architektur mit pseudoglandulärem
Wachstumsmuster und breiter Infiltration in das umgebende Leberparenchym. Das
Auftreten einiger HCC´s in Knoten-in-Knoten-Form deutet darauf hin, dass es sich aus
HCAs entwickelt hat. Im Vergleich zu HCAs und präneoplastischen Leberzellen zeigten
die Karzinomzellen mehr Mitosen und Pleomorphismen [62]. 30 Monate nach
intrahepatischer Transplantation ovariellen Gewebes war bei allen Tieren eine
Ausbildung eines HCC´s zu beobachten, teilweise sogar mit multiplen pulmonalen
Metastasen [62]. Die meisten HCC´s und HCA´s der Hauptgruppentiere zeigten eine
moderate bis starke Expression von TGF α, welche schon 12 Monate nach der
Transplantation in einzelnen Hepatozyten präneoplastischer Leberherde vorhanden war.
Daraus konnte man schließen, dass TGF α neben anderen Faktoren eine entscheidende
Rolle in der Progression oder neoplastischen Transformation von späten Präneoplasien
spielte [62]. Zudem war der co-mitogene Effekt von TGF α hinsichtlich der Wirkung
von Östradiol schon bekannt [31].
Zusammenfassend kann man sagen, dass Transplantate von unterschiedlichen
endokrinen Geweben unterschiedliche Langzeitverläufe von hepatozellulären
Veränderungen induzieren.
1 Einleitung 12
1.6 Das Zytokin Tumornekrosefaktor alpha (TNF α)
Zytokine sind hormonähnliche Peptide, die von Zellen des Immunsystems sowie einer
Reihe anderer Zelltypen synthetisiert werden und welche meist als parakrine Faktoren
Proliferation bzw. Differenzierung sowie Funktion ihrer Zielzellen und Gewebe
regulieren. Meistens handelt es sich um lösliche oder über Disulfidbrücken verbundene
Glykoproteine, die sich durch eine ausgesprochene Stabilität auszeichnen. Durch die
Glykosylierung bleiben die Moleküle wasserlöslich und sind vor dem Abbau durch
Proteasen geschützt. Zu der Gruppe der Zytokine gehören außer dem
Tumornekrosefaktor alpha (TNF α) eine Reihe sogenannter Wachstumsfaktoren (bFGF,
PDGF, EGF), die große Gruppe der Interleukine, das Erythropoetin sowie der
Transforming growth factor β (TGF β).
Das Zytokin TNF α, auch bezeichnet als Cachexin oder Cachektin, ist ein
unglykolisiertes Protein mit einem Molekulargewicht von 17 kDa, welches in dem
Prozess der systemischen Inflammation involviert ist. Es ist ein Teil einer Gruppe von
multifunktionellen Zytokinen, die die Akute-Phase-Reaktion stimulieren und mit bisher
insgesamt 19 identifizierten Mitgliedern der TNF α-Superfamilie (TNF α-SF)
angehören.
1.6.1 Die Geschichte und Entdeckung von TNF α Im letzten Jahrhundert wurde erstmals die Idee einer in vivo Produktion von anti-
tumoralen Faktoren, sezerniert durch Zellen des Immunsystems, durch William B.
Coley geäußert. Im Jahre 1968 berichteten Kolb et al. von einem zytotoxischen Faktor
von diversen Tumorzellen, welcher durch Lymphozyten in vitro produziert und
Lymphotoxin (LT) genannt wurde [70]. Ruddle et al. berichteten im selben Jahr von
ähnlichen Entdeckungen, ohne der zytotoxischen Substanz, die eine Nekrose von
Fibroblasten herbeiführt, einen Namen geben zu können oder eine Herkunft zuzuweisen
[71]. Sieben Jahre später entdeckten Carswell et al. einen zytotoxischen Faktor, der
durch Makrophagen produziert wird und eine Nekrose von verschiedenen Tumoren
auslöst. Diesen Faktor, dessen Synthese durch Endotoxin stimuliert wird, nannten sie
Tumornekrosefaktor (TNF) [72]. Pennica et al. beschrieben bei der Sequenzierung der
cDNA von Tumornekrosefaktor und Lymphotoxin deutliche Ähnlichkeiten in der
Aminosäuresequenz beider Moleküle [73]. Auch die Bindung beider Moleküle an
denselben Rezeptor konnte ihre funktionale Ähnlichkeit zeigen, weshalb man aufgrund
1 Einleitung 13
der nun bestätigten funktionalen und sequentiellen Homologie die Umbenennung von
TNF in TNF α und LT in TNF β vornahm. Im Jahre 1985 entdeckten Beutler et al. die
Übereinstimmung von dem Kachexie - induzierenden und von Makrophagen
produzierten Hormon Cachektin und TNF, indem sie eine ausgeprägte Homologie in
über 28 % der N-terminalen Sequenzen beider Moleküle beschrieben. Außerdem zeigte
Cachektin starke TNF-Aktivitäten in vitro, welches die Konformität beider Moleküle
endgültig bestätigen ließ [74]. In einer Nachfolgearbeit identifizierten die Autoren TNF
als einen Hauptmediator für die letale Folge eines septischen Schocks bei Infektionen
durch Endotoxine, indem sie Ratten passiv gegen TNF immunisierten, LPS injizierten
und beobachteten, dass diese Tiere eine niedrigere Letalität als eine Kontrollgruppe
aufwiesen [75]. Nedwin et al. sequenzierten im Jahre 1985 die Gene von TNF (TNF α)
und LT (TNF β) auf Chromosom 6 und bestätigten die Ergebnisse von Pennica et al.
hinsichtlich gleicher biochemischer Charakteristika und biologischer Aktivitäten sowie
einer Homologie der Aminosäuresequenz von ca. 30 Prozent. Beide Gene haben eine
ähnliche Länge von 3 kb und die vier Exone werden unterbrochen von drei Introns. Nur
das letzte Exon beider Gene, welches mehr als 80 Prozent des sequenzierten Proteins
kodiert, stimmt signifikant mit 56 Prozent überein [76, 77]. Zusammenfassend wird
TNF α heute nicht mehr lediglich als Nekrose- bzw. Apoptose-auslösendes Zytokin
bezeichnet, sondern vielmehr als ein proinflammatorisches Zytokin mit der zusätzlichen
Funktion der Apoptoseinduktion.
1.6.2 Die Struktur von TNF α Das Zytokin TNF α gehört zu der TNF α-Superfamilie (TNF α-SF), welche insgesamt
aus bisher 19 identifizierten Mitgliedern besteht. Die Zugehörigkeit eines Proteins zu
dieser Familie definiert sich durch den Besitz einer konservierten C-terminalen
Domäne, welche verantwortlich für die Rezeptor-Bindung ist und welche eine 20 bis 30
prozentige Ähnlichkeit ihrer Aminosäuresequenzen innerhalb der Familienmitglieder
besitzt. Diese sogenannte TNF Homologie Domäne (THD) umfasst 150 Aminosäuren
und bildet zwei antiparallele β-Faltblätter aus, die sich zu einer Biskuitrollen-Struktur
(„jelly roll“) zusammenlagern [78].
TNF α wird zunächst als ein 233 Aminosäuren langes Typ II-Transmembran-Protein
synthetisiert, welches in stabile Homotrimere gefaltet ist. Dieses Vorläufer-Protein des
gelösten 17 kDa schweren TNF α (sTNF) wiegt 26 kDa und ist ein hochaktives,
1 Einleitung 14
integrales Transmembranprotein mit einer eindeutigen Orientierung: der
Aminoterminus liegt innerhalb des Zytoplasmas, während der Carboxyterminus
entweder im Mikrosom, außerhalb der Zelle oder in beiden Lokalisationen zu finden ist
und den zytotoxischen Anteil von beiden darstellt. Das Protein kann nun entweder als
Transmembranprotein (mTNF) mithilfe eines Zell-Zell-Kontaktes zytotoxisch wirken
oder nach proteolytischer Spaltung des Proteins als lösliche 17 kDa-Komponente
(sTNF) seine toxische Wirkung entfalten [79]. Die Abspaltung des löslichen Faktors
von seinem membrangebundenen Vorläufer erfolgt durch eine Matrix-Metalloprotease.
Dieses Protein, genannt TNF α converting enzyme (TACE, ADAM17), gehört zu der
Adamalysin- Familie (ADAM) der zinkgebundenen Metalloproteasen und spaltet das
Transmembranprotein proteolytisch, so dass die 17 kDa-Komponente von der
Zelloberfläche abgetrennt und seine pleiotrope Wirkung als lösliches Zytokin ausüben
kann [80].
Die 17 kDa-Monomere des TNF sind als gestreckte antiparallele ß-Faltblatt-
Sekundärstrukturen in Form einer Biskuitrollen-Topologie („jelly roll“) ausgebildet.
Drei dieser Monomere bilden einen Trimer in Form eines Pyramidenstumpfes,
bestehend aus einer breiten Basis und einer sich verschmälernden Spitze, aus. Die
Bindung von TNF α mit seinem Rezeptor erfolgt in Form dieses Trimers, mit der Basis
als Kontaktstelle zum Rezeptor [81]. Diese so gebildete Tertiärstruktur ist
charakteristisch für die Mitglieder der TNF α-Superfamilie, wird aber auch in viralen
Kapsidproteinen gefunden [78, 82].
1.6.3 Funktionen und Syntheseorte von TNF α TNF α zeigt eine außerordentliche Vielzahl an Funktionen, das sowohl homöostatische
als auch pathophysiologische Vorgänge auslösen kann, welche vom Zeitpunkt sowie
Dauer der TNF-Exposition genauso abhängen, wie von der Expression der zugehörigen
Rezeptoren.
Die homöostatische Hauptfunktion von TNF α ist die Regulation der Funktion von
Immunzellen, neben der Induktion des apoptotischen Zelltodes, der
Inflammationsinduktion und der Verhinderung von Tumorgenese und viraler
Replikation. Folgende Effekte vermag TNF α auszulösen:
Entwicklung und Homöostase lymphatischer Organe
1 Einleitung 15
Mediator von Entzündungsreaktionen und der Immunabwehr (Aktivierung von
Makrophagen, Induktion der Expression von Adhäsionsmolekülen (Selektine,
ICAM, VCAM) auf Endothelzellen, Induktion von Chemokinen auf Endothelien
und Makrophagen, Aktivierung von neutrophilen Granulozyten)
Stimulierung der Fibroblastenproliferation
Auslösung von Fieber vermittelt über Prostaglandine sowie Gewichtsverlust bis
zur Kachexie
Synthese der Akute-Phase-Proteine in der Leber und eine gesteigerte
Lipidsynthese
Auslösung eines septischen Schocks mit Multiorganversagen
Erhöhte Insulinresistenz der Leber und anderer Gewebe
Beispiele von pathophysiologischen Vorgängen, bei denen die Synthese von TNF α
erhöht ist, sind der septische Schock [83], Transplantatabstoßungsreaktionen, Kachexie
[84], zerebrale Malaria [85], Multiple Sklerose, Diabetes mellitus, chronische
Herzinsuffizienz, chronisch-entzündliche Darmerkrankungen wie Morbus Crohn sowie
maligne und infektiöse (virale, bakterielle und parasitäre) Erkrankungen, wobei der
größte Stimulus für die Produktion von TNF α das bakterielle Lipopolysachharid (LPS)
darstellt [86].
Produziert wird TNF α von mononukleären Zellen, Makrophagen, Endothel- und
Epithelzellen [87]. In der Leber wird TNF α überwiegend von Kupfferzellen
synthetisiert, des Weiteren in der regenerierenden und chronisch viral infizierten Leber
auch von Gallengangsepithelzellen, den Endothelzellen der Vena porta und den
Zentralvenen [88] sowie in den Hepatozyten [89, 90].
Die Mitglieder der TNF-Superfamilie üben ihre biologischen Funktionen über die
Interaktion mit verwandten Membranrezeptoren aus, welche ebenfalls eine eigene
Familie der TNF-Rezeptor-Superfamilie bilden [91, 92]. Dabei können sowohl der
lösliche Tumornekrosefaktor (sTNF) als auch der membrangebundene (mTNF) sowie
Lymphotoxin α (LTα) ihre Effekte über zwei Rezeptoren vermitteln: den TNF-R1 und
den TNF-R2, wobei der größte Teil der TNF-Aktivität über den TNF-R1 vermittelt wird
[93].
1 Einleitung 16
1.7 Tumornekrosefaktor alpha-Rezeptor Typ 1 und 2 (TNF-R1/2)
Mitglieder der TNF-Rezeptor-Superfamilie initiieren Prozesse, die von der
Zellproliferation bis zum programmierten Zelltod reichen [94]. Sie werden
typischerweise als Typ 1-Transmembranproteine mit einem extrazellulären
Aminoterminus und einem intrazellulären Carboxyterminus exprimiert [91]. Von diesen
Mitgliedern der Rezeptor-Superfamilie sind zwei Rezeptoren für die Funktion von TNF
α relevant: TNF-R1 (TNF-Rezeptor Typ 1, CD120a, 55 kDa) und TNF-R2 (TNF-
Rezeptor Typ 2, CD120b, 75 kDa) [84, 95].
1.7.1 Einteilung und Mitglieder der TNF-Rezeptor-Superfamilie
Die TNF-Rezeptor-Superfamilie umfasst derzeit 29 Mitglieder, deren
Molekulargewichte zwischen 50 und 120 kDa angegeben werden. Die Einteilung der
Rezeptoren erfolgt in drei Gruppen:
Gruppe I: Rezeptoren mit einer konservierten Protein-Protein-
Interaktionsdomäne im intrazellulären, carboxyterminalen Bereich, die
sogenannte Todesdomäne (death domain, DD) (z.B. Fas (CD95), NGFR, TNF-
R1, TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5), TRAIL-R4 (DcR2))
Gruppe II: Rezeptoren mit TNF-Rezeptor-assoziierte Faktor (TRAF)-
interagierenden-Motiven (TIM) in ihrer zytoplasmatischen Domäne, ohne
intrazelluläre Todesdomänen (z.B. TNF-R2, CD40, RANK, CD 27, CD30,
OX40)
Gruppe III: Rezeptoren ohne funktionelle intrazelluläre Domänen (z.B. TRAIL-
R3, DcR3)
Die Gruppe I, zu der auch TNF-R1 gehört, kann über die intrazelluläre Aktivierung von
Caspasen die Apoptose der Zelle einleiten. Apoptose ist eine Form des programmierten
Zelltodes, bei dem Zellen ohne Entzündungsreaktion eliminiert werden können. Die
Integrität der Plasmamembran bleibt erhalten, indem sich apoptotische Vesikel bilden,
die in der Folge von Makrophagen eliminiert werden. Die Gruppe II der TNF-Rezeptor-
Superfamilie ist befähigt über NF-κB und die JNK das Überleben der Zelle zu sichern.
1 Einleitung 17
1.7.2 Die Struktur und Expressionsorte von TNF-R1 und TNF-R2
Die extrazellulär gelegene, ligand-bindende Einheit beider Rezeptoren besteht aus vier
gleichen Untereinheiten, welche vier Pseudorepeats aufweisen, die Zystein-reiche
Domänen genannt werden [82]. Diese Pseudorepeats wurden erstmals in der
dreidimensionalen Struktur des TNF-Rezeptors Typ 1 entdeckt und gelten als
Kennzeichen der Mitglieder der TNF-Rezeptor-Superfamilie [78, 94, 96]. Die
Ähnlichkeit der extrazellulären Domäne beträgt bis zu 28 % ihrer Aminosäuresequenz
und wird bei nahezu allen Oberflächenrezeptoren der TNF-Rezeptor-Superfamilie, wie
FAS-Antigen (CD95), CD 40, OX 40, CD 27 und NGF-Rezeptor (nerve growth factor-
receptor) gefunden [97, 98]. Im Gegensatz dazu besteht eine völlige Abwesenheit an
übereinstimmenden Sequenzen der intrazellulären Domäne beider TNF-Rezeptoren, so
dass man davon ausgehen muss, dass beide unterschiedliche Signalwege benutzen und
damit verschiedene Funktionen ausüben [98, 99]. Die zytoplasmatische Domäne
fungiert als Andockstation für verschiedene intrazelluläre Adapterproteine, von denen
es zwei Typen gibt: TRAFs (TNF receptor-associated factors) und Todesdomänen
(death domains, DD) [91]. Diese Todesdomänen werden sowohl in dem intrazellulär
gelegenen Anteil des Rezeptors gefunden als auch in den dazugehörigen
Adapterproteinen wie FADD und TRADD, wodurch die Moleküle in die Lage versetzt
werden, untereinander kommunizieren zu können.
Die Rezeptordichte verschiedener Zellen reicht von 100 bis 10.000 Rezeptoren pro
Zelle. Darüber hinaus scheint keine Korrelation zwischen der Anzahl an Rezeptoren auf
einer Zelle und der Menge sowie Art von TNF-induzierten Antworten zu bestehen
[100]. Im Gegensatz zu den Liganden der TNF-Rezeptoren werden die Rezeptoren
überwiegend konstitutiv auf vielen Zellen und nicht erst nach Induktion synthetisiert.
Die meisten Zelllinien und Gewebe coexprimieren beide Rezeptortypen auf ihrer
Zelloberfläche, wobei die Expression von TNF-R1 und TNF-R2 durch unterschiedliche
Mechanismen kontrolliert wird. TNF-R1 wird kontinuierlich, aber auf einem geringen
Level exprimiert, während die Expression von TNF-R2 abhängig von der
transkriptionellen und posttranskriptionellen Regulation durch externe Stimuli reguliert
wird [84, 101]. TNF-R1 wird im Wesentlichen auf allen Zellen gefunden, während die
Expression von TNF-R2 höher reguliert wird und typischerweise lediglich auf Zellen
des Immunsystems und auf Endothelzellen vorhanden ist. Deshalb scheint in der
1 Einleitung 18
Mehrheit der Zellen TNF-R1 der Schlüsselmediator der TNF-Aktivität zu sein, indem er
Aktivitäten wie Zytotoxizität, Proliferation von Fibroblasten, Resistenz gegenüber
Chlamydien, Synthese von Prostaglandin E2, antivirale Aktivität und Induktion der
manganhaltigen Superoxiddismutase (SOD) induziert [102-105], lediglich in
Immunzellen spielt der TNF-R2 die Hauptrolle [93]. Des Weiteren bestehen deutliche
Unterschiede in den Bindungscharakteristika des löslichen bzw. membrangebundenen
TNF α in Bezug auf seine Rezeptoren. TNF-R2 kann nur durch das membrangebundene
TNF-Protein vollständig aktiviert werden, die lösliche Variante (sTNF) kann lediglich
die Expression diverser Zytokine, wie GM-CSF (granulocyte/macrophage colony-
stimulating factor) in einem T-Zell-Hybridom [106] und die Proliferation von
Thymozyten induzieren [104, 107], während TNF-R1 durch beide Moleküle vollständig
aktiviert werden kann [108].
1.7.3 Die verschiedenen Signaltransduktionswege von TNF-R1 und TNF-R2
TNF-R1 und TNF-R2 üben über verschiedene intrazelluläre Signalwege ihre
Funktionen aus und besitzen, wie alle Mitglieder der TNF-R-Superfamilie, keine
enzymatischen Domänen, welche in das Zytoplasma hineinreichen. Vielmehr stellt eine
Oligomerisation zytoplasmatischer Domänen den Ursprung der intrazellulären
Signalwege dar, um Bestandteile der intrazellulären Signalwege durch Sichtbarmachen
bestimmter Motive an den Rezeptorkomplex zu locken [78]. Der TNF-R1 besitzt eine
intrazelluläre Todesdomäne (death domain, DD), eine Protein-Interaktionsdomäne, die
aus 65 bis 80 Aminosäuren besteht, welche über weitere Schritte in der Apoptose der
Zelle mündet [77], während der TNF-R2 die Gen-Transkription für das Zellüberleben, -
wachstum und –differenzierung induziert [109].
Nach Bindung des Liganden an die extrazelluläre Domäne des monomeren TNF-R1
kommt es zur Trimerisierung des Rezeptors [82, 93, 110], woran sich drei verschiedene
Signalkomplexe anschließen können. Eine Möglichkeit besteht darin, dass der TNF-R1
über seine Todesdomäne am zytoplasmatischen Teil, nach Dissoziierung von SODD
(silencer of death domains), einen Komplex aus dem Protein TRADD (TNF-Receptor
associated death domain), den Adapterproteinen TRAF-1 (TNF-Rezeptor assoziierter
Faktor 1) und TRAF-2 (TNF-Rezeptor assoziierter Faktor 2), des FADD (Fas-
associated death domain) und der Kinase RIP-1 (Rezeptor interagierende Serin-
1 Einleitung 19
/Threonin-Kinase 1) rekrutieren kann [93, 111]. TRAF-2 und RIP-1 können in der
Folge eine antiapoptotische Signalgebung durch Aktivierung der Transkriptionsfaktoren
NF-κB (nukleärer Faktor kappaB) über die Rekrutierung und Phosphorylierung des
Inhibitorproteins IκK (inhibitory of NF-κB (IKB) kinase) in der Zelle einleiten [111,
112]. Im Zellkern kommt es hiermit zu einer Induktion der Transkription
proinflammatorischer und immunmodulatorischer Gene, die ein Überleben der Zelle
sichern [111, 113].
TRAF-2 kann ebenfalls MAP-Kinasen (MAPKKK, mitogen-activated protein kinase
kinase kinase) aktivieren, wie zum Beispiel die Kinasen MEKK1 (MEK Kinase 1) und
ASK1 (apoptosis-stimulated kinase 1). Dabei wird eine Kaskade von Kinasen in
Bewegung gesetzt, woraus eine Aktivierung von JNK (c-Jun NH2-terminal kinase)
resultiert, welche dann wiederum den Transkriptionsfaktor c-Jun phosphoryliert,
wodurch dessen Transkriptionsaktivität erhöht wird. Der JNK-Signalweg ist in der
Zelldifferenzierung und –proliferation involviert und wirkt im Allgemeinen ebenfalls
proapoptotisch [111].
Eine dritte Möglichkeit ist darin gegeben, dass nach Trimerisierung des TNF-R1 durch
Bindung seines Liganden der Rezeptor internalisiert wird [114, 115]. Anschließend
wird ein DISC (death inducing signalling complex) aus den Proteinen TRADD, FADD
und der Caspase 8 (FLICE) gebildet. Caspasen (Cystein Aspartat-spezifische Protease)
gehören zu der Familie der Cystein-Proteasen, die ihre Substrate am Carboxyterminus
spalten können. Durch die Rekrutierung der Pro-Caspase 8 durch FADD in den DISC
kommt es bei hoher Konzentration zu einer autokatalytischen Aktivierung der
Initiatorcaspase 8, die wiederum nachgeschaltete Effektorcaspasen, wie die Caspasen 3,
6 und 7 durch limitierte Proteolyse aktivieren kann. Die freigewordene Caspase 8 kann
so die proapoptotischen Signalwege induzieren und damit den Zelltod auf
verschiedenen Ebenen einleiten [93, 111, 116].
Ein interessanter Aspekt der verschiedenen Signalwege, die von TNF-R1 ausgehen, ist
die gegenseitige Beeinflussung derselben. So ist bei Abwesenheit der NF-κB-Aktivität
die zelluläre Empfindlichkeit der TNF-induzierten Apoptose verstärkt, während eine
verstärkte Aktivierung von NF-κB die Zelle gegen Apoptose schützt, indem cFLIP
(cellular FLICE-like inhibitory protein) die Caspase 8 inhibiert [116]. Ebenso ist die
TNF-induzierte JNK-Aktivierung in Zellen, denen NF-κB fehlt, verstärkt und verlängert
1 Einleitung 20
wirksam. Die Produkte der durch NF-κB aktivierten Gene verhindern die Aktivierung
von JNK durch TNF [111].
Aufgrund dieser verschiedenen Signalwege kann TNF in den verschiedenen Zellen
diverse Effekte auslösen.
Nach Bindung von TNF an seine Rezeptoren werden letztere zu 50 Prozent herunter
reguliert, indem der TNF-R1 in der überwiegenden Anzahl in die Zelle internalisiert
und der TNF-R2 vor allem von der Zellmembran abgeschnitten wird [117]. Hiermit
wird die Antwort auf das Einwirken von TNF dosis- und zeitabhängig abgeschwächt
[118].
1.8 Der Wachstumsfaktor hepatocyte growth factor (HGF)
HGF (hepatocyte growth factor), auch SF (scatter factor) oder Hepatopoetin A genannt,
ist ein multifunktioneller Wachstumsfaktor, der wie Prothrombin, Urokinase und
Gewebs-Plasminogen-Aktivator zu der Plasminogen-Familie gehört und vielfältige
Effekte auf Zellen über seinen Rezeptor, das Protoonkogen c-Met, ausüben kann [119].
SF und HGF wurden unabhängig voneinander als Faktoren, die eine Dissoziation mit
anschließender Bewegung von Epithelzellen auslösen können, entdeckt [120, 121]. In
der Folge wurden beide Faktoren als identische Moleküle identifiziert [122].
1.8.1 Die Struktur und Expressionsorte von HGF Biologisch aktives HGF ist ein Heterodimer, bestehend aus einer α-Untereinheit (65
kDa) und einer β-Untereinheit (34 kDa), die über Disulfidbrücken miteinander
verbunden sind. Es besteht aus einer Haarnadelschleife (hairpin loop) und vier kringle
domains in der α-Kette sowie einer Serinproteasendomäne ohne enzymatische Aktivität
in der β-Kette [123]. Das zugehörige Gen ist auf Chromosom 7 lokalisiert (7q21.1)
[119]. Synthetisiert wird HGF als ein aus einer Einzelkette bestehendes inaktives
Vorläufermolekül (pro-HGF, 92 kDa) in Zellen mesenchymaler Herkunft, wie
Fibroblasten, Endothelzellen und den Nichtparenchymzellen der Leber [119, 124].
Beide Formen können an den zugehörigen Rezeptor c-Met binden, jedoch vermag
lediglich das Heterodimer eine mitogene Aktivität auszulösen [125]. Aktiviert wird das
Vorläufermolekül in der extrazellulären Matrix infolge proteolytischer Spaltung durch
Enzyme wie Urokinase-Typ Plasminogen Aktivator (uPA), den gewebespezifischen
Plasminogen Aktivator (tPA), die Koagulationsfaktoren X, XI, XII, Thrombin oder XII-
1 Einleitung 21
like factor [125-127]. Hieraus kann man schlussfolgern, dass die oben beschriebenen
Enzyme biologische Regulatoren der Aktivität von HGF sind, und somit Einfluss auf
Tumorinvasion und Metastasierung nehmen können.
1.8.2 Die Funktion von HGF Unter physiologischen Bedingungen fördert HGF die Organregeneration, indem es die
Proliferationsfähigkeit der meisten Epithel-und Endothelzellen, wie von Hepatozyten,
Gallengangsepithelien der Leber, Epithelzellen der Lunge sowie der Mamma, der Haut
und anderer Gewebe induziert [128, 129]. Zusätzlich zu diesen mitogenen Effekten
fördert HGF die Zellmotilität und –zerstreuung („scatter factor“), indem es die
Interzellulär-Verbindungen zerstört, die Apoptose hemmt sowie als wichtiges
Morphogen in der Embryonalentwicklung agiert. In der Phase der embryonalen
Entwicklung ist HGF in den Prozess der Gastrulation, der Bildung der Epithelien sowie
der Angiogenese, Muskel- und Knochenentwicklung, der Formation des Nervensystems
sowie der Migration von Myoblasten involviert [119]. HGF fördert die Tubuli- [130]
und Lumenformation [131], die Bildung der Angiogenese [132] und die Konversion des
mesenchymalen in einen epithelialen Phänotyp [133]. In vivo ist HGF beteiligt an der
neuralen Induktion [134], der Nierenentwicklung [135], der Geweberegeneration [136]
und der Wundheilung [137].
Nach partieller Hepatektomie agiert HGF zusammen mit TGF α als Proliferationsfaktor
nach vorangegangenem Priming durch TNF oder IL-6.
In Tumorgeweben ist HGF verantwortlich für Tumorprogression, Metastasierung und
Dissemination der Tumorzellen über die Bildung neuer Blutgefäße (Angiogenese)
[119], was er über die Bindung an seinen Rezeptor, das Protoonkogen c-Met, ausüben
kann.
1 Einleitung 22
1.9 c-Met (mesenchymal-epithelial transition factor)
Met ist ein Protoonkogen, welches das Protein Met kodiert, auch bekannt als c-Met
sowie hepatocyte growth factor receptor (HGFR) [138]. C-Met ist der Rezeptor von
HGF und verfügt über eine Tyrosinkinase-Aktivität [119]. Zu finden ist c-Met
hauptsächlich auf Zellen epithelialer Herkunft [123], zusätzlich auch auf
Endothelzellen, Neuronen, Hepatozyten, hämatopoetischen Zellen und Melanozyten
[139].
In Tumoren sind die Rezeptoren von Wachstumsfaktoren wie HGF überexprimiert,
permanent dimerisiert und aktiviert, ohne dass ein Ligand gebunden hat. So signalisiert
der mutierte Rezeptor der Zelle kontinuierlich mitogene Signale, die in einer
kontinuierlichen Expression von Tumoren und aggressiver Metastasierung resultieren
[140, 141].
1.9.1 Die Struktur und Transkription von c-Met C-Met ist ein durch Disulphidbrücken verbundenes Heterodimer, bestehend aus einer
intrazellulären, transmembranären und extrazellulären β-Untereinheit (145 kDa) sowie
einer lediglich extrazellulär gelegenen α-Untereinheit (50 kDa). Der zytoplasmatische
Bereich der β-Untereinheit wird durch drei verschiedene Abschnitte definiert: die
Juxtamembranregion, die Tyrosin-Kinasedomäne und die carboxyterminale Region,
welche als Andockbereich für Adapterproteine mit Src homology-2 (SH2)-Domänen
gilt [142, 143]. Der extrazelluläre Bereich der β-Kette sowie die α-Untereinheit sind in
die Bindung des Liganden involviert [123, 144]. C-Met wird über eine proteolytische
Spaltung eines Vorläufermoleküls gebildet, welches in Form eines Monomers vorliegt
[119].
Die Transkription von c-Met wird durch die Einwirkung von HGF und diversen anderen
Wachstumsfaktoren aktiviert. Die Promotorregion c-Mets hat vier Bindungsstellen für
Ets, eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die u.a. als wichtige Effektoren des Ras-
MAP-Kinase-Signaltransduktionswegs im Zellkern fungieren [145, 146]. Die Met-
Transkription wird ebenfalls über den hypoxia inducible factor 1 (HIF1) induziert,
welcher in Folge einer verminderten intrazellulären Sauerstoffkonzentration
ausgeschüttet wird und an eine der zahlreichen hypoxia response elements (HREs) im
Met Promotor bindet [124, 147].
1 Einleitung 23
1.9.2 Die Signaltransduktionswege von c-Met c-Met gehört wie die meisten Rezeptoren von Wachstumsfaktoren zu denjenigen
Rezeptoren mit membrangebundener, intrinsischer Tyrosinkinaseaktivität. Rezeptoren
dieser Familie besitzen eine extrazellulär gelegene ligand-bindende Domäne, einen
transmembranen Abschnitt sowie einen zytoplasmatischen Teil, welcher eine
Tyrosinkinaseaktivität besitzt. Tyrosinkinasen sind Proteine und gehören zu der Familie
der Proteinkinasen, deren Aufgabe die reversible Übertragung einer Phosphatgruppe
(Phosphorylierung) auf die Hydroxygruppe von Tyrosin eines anderen Proteins ist.
Tyrosinkinasen sind aus diesem Grund ein wichtiger Teil von Rezeptorsystemen und
dienen damit der Signalübertragung dieser Rezeptoren. Dabei ist die Kinaseaktivität
infolge einer Autophosphorylierung von Tyrosin positiv reguliert, negativ durch die
Aktivierung von Proteinkinase C oder eine Erhöhung der intrazellulären Calcium-
Konzentration [148].
Die Bindung des Liganden HGF induziert eine Dimerisierung des Rezeptors, eine
Phosphorylierung des Tyrosins sowie eine vorübergehende Aktivierung der Rezeptor-
Tyrosin-Kinase. Die aktivierte Kinase phosphoryliert und aktiviert in der Folge
zytoplasmatisch gelegene Effektormoleküle: Zunächst erfolgt die Anlagerung von
sogenannten Adapter- oder Brückenproteinen wie GRB2 (growth factor receptor-bound
protein 2) und dem GTP:GDP-Austauschfaktor SOS (son of sevenless). An diese
Proteine lagert sich inaktives RAS (rat sarcoma), welches durch GAP (GTPase
aktivierendes Protein) aktiviert wird, an. Aktiviertes RAS interagiert und aktiviert RAF
(rapidly growing fibrosarcoma or rat fibrosarcoma), auch bekannt als MAP Kinase
Kinase Kinase, welches zu der sogenannten MAP Kinase Kaskade gehört. Ebenfalls
dazu gehören MEK (MKK, Map Kinase Kinase), welches durch RAF phosphoryliert
wird sowie ERK (MK, MAP Kinase), dessen Phosphorylierung durch MEK erfolgt. Die
aktivierte MAP Kinase phosphoryliert andere zytoplasmatische Proteine und nukleär
gelegene Transkriptionsfaktoren wie FOS und JUN. Diese Transkriptionsfaktoren
stimulieren wiederum die Produktion von Wachstumsfaktoren, deren Rezeptoren und
Proteine, welche das Eintreten von Zellen in den Zellzyklus überwachen [149].
Phosphorylierte Anteile der Rezeptoren können auch als Andockstellen für Adapter-
Moleküle, wie den Schlüsselmediator intrazellulärer Antwort c-Mets Gab1 (growth-
factor-receptor-bound protein 2 (Grb2)-associated binder 1) fungieren. Gab1 wiederum
1 Einleitung 24
rekrutiert Effektormoleküle wie PLCγ (Phospholipase Cγ), Shp2 (SH2-domain-
containing protein tyrosine phosphatase 2) und PI-3 Kinase [150]. PLCγ katalysiert die
Aufteilung membranöser Inositol-Phospholipide in IP3 (Inositol-Triphosphat) und
Diacylglycerol. IP3 erhöht die Konzentration von Calcium, Diacylglycerol aktiviert die
Serin-Threonin-Proteinkinase C (PKC), welche diverse Transkriptionsfaktoren aktiviert
und damit antiapoptotisch wirkt.
Der PI-3 Kinase-Signalweg kann durch zwei Möglichkeiten aktiviert werden: einmal
über Adapterproteine wie Gab1 oder im Verlauf des RAS-Signalweges [148]. Diese
Aktivierung führt zu einer Erhöhung der Zellmobilität über eine Aktin-Reorganisation
und andere Zytoskelettänderungen und einer Triggerung der Überlebenssignale über
eine Aktivierung der Serin-Threoninkinase AKT (v-akt murine thymoma viral oncogene
homolog 1) [123, 150].
STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) ist ein Transkriptionsfaktor,
welcher entweder indirekt über das Adapterprotein Gab1 oder direkt durch Met über
eine SH2-Domäne phosphoryliert und damit aktiviert wird. Nach der nukleären
Translokation von STAT3 wird über die spezifische Bindung an bestimmte DNA-
Promoter-Elemente wie SIE eine HGF-induzierte epitheliale Tubulogenese initiiert
[123, 151].
Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass c-Met mit anderen zellulären
Oberflächenrezeptoren interagiert und sich deren Signale gegenseitig beeinflussen
können. Dazu gehören CD44, Fas, RON, EGFR und ErbB2 [119].
1.9.3 Die Rolle von c-Met in der Tumorformation und –progression In Tumoren sind die Rezeptoren von Wachstumsfaktoren permanent aktiviert, welches
durch drei unterschiedliche Mechanismen erreicht werden kann:
1) Entwicklung eines autokrinen Kreislaufs zwischen Ligand und Rezeptor, ohne
die Anwesenheit eines Wachstumsfaktors (z.B. im Osteosarkom,
Rhabdomyosarkom, Mammakarzinom und Glioblastom) [123]
2) Überexpression des Rezeptors durch permanente Dimerisierung und damit
Aktivierung ohne die Anwesenheit eines Wachstumsfaktors als häufigster
Mechanismus einer onkogenen Aktivierung in humanen Tumoren, wie
Magentumoren, Gallengangskarzinomen und Lungentumoren [119, 123]
1 Einleitung 25
3) Vorhandensein von Punktmutationen in Kodierungssequenzen des Rezeptors
(z.B. im papillären Nierenzellkarzinom, Magentumoren und kindlichem
hepatozellulärem Karzinom) [119, 123]
So signalisiert der aktivierte Rezeptor der Zelle kontinuierlich mitogene Signale, die in
einer Expression von Tumoren, Invasivität und aggressiver Metastasierung resultieren
[140, 141].
Nach der Aktivierung des Rezeptors kommt es zu einem komplexen morphogenetischen
Programm, welches als invasives Wachstum bezeichnet wird und mehrere Schritte
umfasst [123]:
1) Zellteilung
2) Zell-Zell-Dissoziation
3) Umwandlung in einen mobilen Phänotyp
4) Zellmigration
5) Ansiedelung und Vermehrung in einer neuen Umgebung
1.10 Zielsetzung dieser Arbeit
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Effekte natürlicher Ovarhormone,
produziert durch transplantierte Ovarfragmente, auf die Leber hinsichtlich
elektronenmikroskopischer Morphologie und der Mitwirkung von TNF α und HGF
sowie deren Rezeptoren auf den Karzinogeneseprozess. Da in vorangegangenen
Arbeiten bereits die Auswirkungen der Ovarhormone auf die Hepatozyten untersucht
wurden [62], wurde im vorliegenden Projekt der Fokus auf die Nicht-Parenchymzellen
der Leber, wie die Kupfferzellen, Sternzellen und Endothelzellen, gelegt.
2 Material und Methoden 26
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Geräte
Material Firma
Feinwaage Firma Owa Labor, Oschatze
Feuchte Kammern Firma Quartett, Berlin
Gewebeeinbettungssystem, Typ Hypercenter® XP Firma Thermo Shandon GmbH, Frankfurt (M)
Histocenter, Typ Hypercenter® XP Firma Thermo Shandon GmbH, Frankfurt (M)
Kurzzeitmesser Firma Dako Cytomation, Hamburg
Laborschüttelmaschine Firma GFL, Burgwedel
Lichtmikroskop, Typ DME Firma Leica, Wetzlar
Magnetrührer Firma Heidolph, Kelheim
Mikrotom für Fein- und Ultrafeinschnitte, Typ Ultracut UCT
Firma Leica, Wetzlar
Mikrowelle, Typ M611S Firma Miele, Gütersloh
pH-Messgerät Firma Knick, Berlin
Rotationsmikrotom für Paraffinschnitte, Typ HM 325 Firma Microm GmbH, Walldorf
Schalen zum Kochen in der Mikrowelle Firma Dako Cytomation, Hamburg
Transmissionselektronenmikroskop, Typ EM 900 Firma Zeiss, Oberkochen
Trim-Gerät für Eponblöcke, Typ EM TRIM Firma Leica, Wetzlar
Vortex Firma Heidolph, Kelheim
Waage Firma Kern, Albstadt
Wärmeinkubator Firma Binder, Tuttlingen
2.1.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
Material Firma
1,2-Dichloräthan Firma Merck, Darmstadt
Alkohol Kliniksapotheke
Aluminiumkaliumsulfat Firma Merck, Darmstadt
Ampuwa Kliniksapotheke
Aqua destillatum eigene Herstellung
Azur II Firma VEB Laborchemie, Apolda
Bleiacetat Firma Fluka, Steinheim
Bleicitrat Firma Serva, Heidelberg
Bleicitrat Firma Serva, Heidelberg
Bleinitrat Firma Sigma-Aldrich, Seelze
2 Material und Methoden 27
Chloralhydrat Firma Merck, Darmstadt
Citronensäure Firma Merck, Darmstadt
DDSA Firma Serva, Heidelberg
Dextran Firma Serva, Heidelberg
Di-Natriumhydrogencarbonat Firma Merck, Darmstadt
Di-Natriumtetraborat Firma Merck, Darmstadt
DMP 30 Firma Serva, Heidelberg
Eindeckmedium (Corbit Balsam) Firma Hecht, Kiel
Epon 812 Firma Serva, Heidelberg
Formaldehydlösung Firma Merck, Darmstadt
Glutaraldehyd Firma Serva, Heidelberg
Hämatoxylin Firma Merck, Darmstadt
Hanks´ Salt Solution Firma Sigma-Aldrich, Seelze
HCl Firma Merck, Darmstadt
Isopentan (2-Methylbutan) Firma Fluka, Steinheim
Kaninchennormalserum Firma DAKO-Diagnostika GmbH, Hamburg
Magermilchpulver Firma Roth, Karlsruhe
Methylenblau Firma Merck, Darmstadt
MNA Firma Serva, Heidelberg
Mowital Firma Hoechst, Frankfurt (M)
Na2HPO4 (wasserfrei) Firma Merck, Darmstadt
NaCl Firma Merck, Darmstadt
NaH2PO4 x H2O Firma Merck, Darmstadt
Na-Jodat Firma Merck, Darmstadt
NaOH (4%) Firma Chemapol, Prag
Natrium-Acetat-Trihydrat Firma Merck, Darmstadt
Natrium-Acid Firma Roth, Karlsruhe
Natriumcitrat Firma Fluka, Steinheim
Natriumcitrat Firma Merck, Darmstadt
Osmiumtetroxyd Firma Fluka, Steinheim
Papainlösung Firma Merck, Darmstadt
Paraffineinbettungsmedium (Paraplast Plus) Firma Tyco Healthcare Deutschland GmbH, Neustadt (Donau)
Paraformaldehyd Firma Merck, Darmstadt
Procain Firma Fluka, Steinheim
Propylenoxyd Firma Serva, Heidelberg
Rinderserum-Albumin Firma Invitrogen, Karlsruhe
Ringerlösung E156 Firma Serumwerk, Bernburg
2 Material und Methoden 28
RPMI Firma Bio-WHITTACKER, Verviers, Belgien
Saccharose Firma Roth, Karlsruhe
Tris Firma Sigma, München
Tris-HCl Firma Merck, Darmstadt
Triton X-100 Firma Ferak, Berlin
Uranylacetat Firma Serva, Heidelberg
Veronal-Natrium Firma Merck, Darmstadt
Wasserstoffperoxid (H2O2) Kliniksapotheke
Xylol Kliniksapotheke
2.1.3 Weitere Materialien
Material Firma
CSA-Kit Firma DAKO-Diagnostika GmbH, Hamburg
Deckgläser Firma Roth GmbH & Co.KG, Karlsruhe
Diamantmesser (für Epon) Firma Diatome, Schweiz
Einbettkassetten (Universalkassetten) Firma Süsse GbmH, Gudensberg
Glas-Objektträger (SuperFrost Plus®) Firma Menzel, Braunschweig
Ketavet® (Ketaminhydrochlorid) Firma Bayer, Leverkusen
Kupfer-Grids für Elektronenmikroskopie Firma PLANO, Wetzlar
Mikrotomklingen (für Paraffin) Firma Zeiss, Oberkochen
Mikrotomklingen (für Paraffin), S35 Firma Feather, Köln
Negativfilme für Elektronenmikroskopie (Kodak) Firma PLANO, Wetzlar
Pipetten und deren Einmalaufsätze Firma Eppendorf, Hamburg
Rasierklingen Firma Wilkinson Sword GmbH, Solingen
Rompun® (Xylazinhydrochlorid) Firma Pfizer, Karlsruhe
2 Material und Methoden 29
2.1.4 Verwendete Antikörper
Antikörper Verwendete Abkürzung Herkunft Verwendungszweck
TNF α (M-18): polyklonaler Ziege-anti-Maus-Antikörper gegen C-Untereinheit von TNF α
sc-1348 Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg
Immunhistochemie
TNF-R1 (E-20): polyklonaler Ziege-anti-Maus-Antikörper gegen C-Untereinheit von TNF-R1
sc-1070 Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg
Immunhistochemie
Met (C-28): polyklonaler Kaninchen-anti-Mensch-Antikörper gegen C-Untereinheit von Met
sc-161 Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg
Immunhistochemie
HGF: Kaninchen-anti-Ratte-Antikörper gegen N-Untereinheit von HGF
905-089 ACRIS Antibodies GmbH, Hiddenhausen
Immunhistochemie
Antikörper gehören zu einer Gruppe von Proteinen, die als Immunglobuline bezeichnet
werden. Diese Immunglobuline (Ig) umfassen fünf Hauptklassen (IgG, IgA, IgM, IgE
und IgD), wobei die in der Immunhistochemie am häufigsten verwendeten Antikörper
den Klassen IgG und IgM angehören. In dieser Arbeit wurden ausschließlich
polyklonale Antikörper verwendet, welche natürliche Gemische der Antikörper sind, die
im Zuge der Immunreaktion gegen die verschiedenen Determinanten eines Antigens
von den jeweiligen B-Lymphozyten bzw. Plasmazellen gebildet werden. Der Nachteil
polyklonaler Antikörper liegt in dem breiten Reaktionspektrum, welches zu
Kreuzreaktionen führen kann. TNF α und TNF-R1 wurden durch Immunisierung von
Ziegen hergestellt, Met und HGF durch Immunisierung von Kaninchen. Es folgen
einige genauere Angaben über das jeweilige Immunisierungspeptid sowie über
bisherige Nachweise der Spezifität des Antiserums:
TNF α, auch bekannt als Cachektin, ist ein kleineres Zytokin als TNF β mit einem
Molekulargewicht von 17 kDa. Es wird von vielen verschiedenen Zelltypen produziert,
u.a. Lymphozyten, Neutrophilen und Makrophagen, es moduliert einige Immun- und
Entzündungsreaktionen und kann Tumorwachstum verhindern. Diese Tumorzellen
müssen aber den TNF-Rezeptor 1 (55 kDa) und 2 (75 kDa) exprimieren, um in ihrem
Wachstum gestört werden zu können.
2 Material und Methoden 30
Der TNF α-Antikörper ist ein affinitätsgereinigter polyklonaler Ziegen-Antikörper, der
gegen den C-Terminus von TNF α der Maus gerichtet ist. Der Antikörper soll laut
Hersteller TNF α von Maus, Ratte und Mensch erkennen, wobei er für die Methoden
Western Blot, Immunpräzipitation und Immunfluoreszenz geeignet sein soll.
TNF-R1 ist zusammen mit TNF-R2 der Rezeptor für TNF, wobei die Hauptwirkung des
TNF über den TNF-R1 vermittelt wird. Beide Rezeptoren sind auf den meisten
Zelltypen exprimiert, TNF-R2 aber ist überwiegend auf Zellen des Immunsystems
vorhanden und sein Zellsignal schwächer ausgeprägt als das von TNF-R1. TNF-R1 und
TNF-R2 gehören zu der Wachstums-TNF- und nerve growth factor- (NGF) Rezeptor-
Superfamilie, wozu auch FAS, CD30, CD27 und CD40 zuzuzählen sind. Die Mitglieder
dieser Superfamilie sind Typ I- Membranproteine, die ähnliche extrazelluläre
Peptidsequenzen besitzen. TNF-R1 besitzt intrazellulär ein Molekül, welches „death
domain“ genannt wird und über FAS und drei weitere, mit dem Rezeptor unverbundene
Proteine (TRADD, FADD, RIP) den Zelltod vermittelt.
TNF-R1 ist ein affinitätsgereinigter polyklonaler Ziegen-Antikörper, der in der
Immunfluoreszenz und im Western Blot gegen den C-Terminus von TNF-R1 der Maus
und der Ratte gerichtet ist.
Der von mir verwendete c-Met-Antikörper ist ein Protoonkogen, welches als ein
Rezeptorprotein mit Tyrosinkinase-Aktivität gekennzeichnet ist und in vielen Geweben
exprimiert wird. Es besitzt Transformations-Aktivität und wurde identifiziert als
Zelloberflächenrezeptor für Hepatocyte Growth factor (HGF), einen humoralen
Mediator der Leberregeneration.
c-Met ist ein affinitätsgereinigter polyklonaler Kaninchen-Antikörper, der gegen den
zytoplasmatisch gelegenen C-Terminus von c-Met des Menschen gerichtet ist. Der
Antikörper soll die 145 kDa schwere β-Kette von c-Met bei Menschen und etwas
schwächer bei Mäusen und Ratten erkennen. Er ist für Western Blot,
Immunpräzipitation, Immunfluoreszenz und Immunhistochemie geeignet.
Hepatocyte Growth factor (HGF) wurde erstmals als Mitogen von Hepatozyten bekannt.
Er fördert Bewegung und Wachstum von Epithelzellen, induziert Vaskularisierung und
ist involviert in Wachstum und Metastasierung von Malignomzellen. HGF wirkt über
die Bindung an c-Met, den oben beschriebenen Rezeptor mit Tyrosinkinaseaktivität,
wodurch seine Wirkung zustande kommt. Synthetisiert wird HGF als eine Kette,
2 Material und Methoden 31
bestehend aus 728 Aminosäuren, welche anschließend zu 69 kDa α- und 34 kDa β-
Ketten prozessiert werden, die wiederum durch Disulfid-Brücken verbunden werden.
Der HGF-Antikörper ist ein affinitätsgereinigter polyklonaler Kaninchen-Antikörper,
der gegen den N-Terminus von HGF der Ratte gerichtet ist. Geeignet ist er für Western
Blot und Immunhistochemie, was sowohl an Kryostatschnitten als auch an
Paraffinschnitten durchgeführt werden kann. Der Antikörper von ACRIS Antibodies
GmbH ergab kein zufriedenstellendes Ergebnis, so dass auf HGF im weiteren Verlauf
der Arbeit nicht weiter eingegangen wird. Durchgeführt wurden die Versuche mit HGF
sowohl an Paraffinschnitten und an Kryostatschnitten als auch an Präparaten von
Rattenlebern, die nach Zugabe von Tetrachlorkohlenstoff eine Fibrose der Leber
entwickelten. Die Kryostatschnitte wurden in Formalin und Aceton sowie
ausschließlich in Aceton fixiert. Zur Demaskierung der Antigene wurde die
Vorbehandlung in der Mikrowelle mit EDTA und Citratpuffer sowie die
Papainvorbehandlung probiert. Durch Zugabe von Magermilchpulver und
Schweinenormalserum wurde versucht, unspezifische Anlagerungen der Antikörper zu
verhindern, welche in den Konzentrationen von 1:20 bis 1:400 zugegeben wurden. Zur
Blockierung des endogenen Biotins, welches sich z.B. in Lebergewebe, Mamma,
Gehirn, Nierentubuli, Pankreas, Schilddrüsenepithel und Leydigschen Zwischenzellen
befindet, wurde ein Avidin-Biotin-Blockierungskit hinzugegeben, um unspezifische
Farbereaktionen zu umgehen. Da die Färbung der Schnitte in allen Variationen zu
schwach erschien, wurde nach Zugabe des Peroxidase-markierten ABC-Komplexes
zusätzlich in einem weiteren Inkubationsschritt biotinyliertes Tyramin hinzugefügt.
Durch die Reaktion mit biotinyliertem Tyramin und Wasserstoffperoxid entstehen neue
Bindungsstellen, an die sich in dem darauffolgenden Inkubationsschritt mit dem
gleichen Peroxidase-markierten ABC-Komplex weitere Komplexanlagerungen
anschließen. Es kommt dadurch zu einer wesentlichen Vermehrung von gebundener
Peroxidase und damit zu einer erheblichen Signalverstärkung. Als Sekundärantikörper
wurden sowohl derjenige im LSAB®-Kit, als auch ein Fluoreszenz-markierter
Sekundärantikörper (1:50, 1:100) ausgetestet.
2 Material und Methoden 32
2.1.5 Sekundäre Antikörper und Reagenzien für die immunhistochemischen Farbreaktionen
Antikörper bzw. Reagenz Herkunft Verwendungszweck
VECTASTAIN Elite ABC Kit - Peroxidase (goat-IgG/human IgG)
Vector Laboratories Inc., Axxora, Grünberg
Immunhistochemie für TNF α und TNF-R1
LSAB®+Kit, Peroxidase (Code K0690)
DAKO Deutschland GmbH, Hamburg
Immunhistochemie für c-Met und HGF
Liquid DAB+Substrate Chromogen System (Code K3468)
DAKO Deutschland GmbH, Hamburg
Immunhistochemie für TNF α und TNF-R1
2.1.6 Versuchstiere Als Versuchstiere dienten weibliche Lewis-Ratten mit einem Gewicht zwischen 200 g
und 250 g, die von Harlan Winckelmann in Borchen bezogen wurden. Es handelte sich
hierbei um einen Inzuchtstamm, so dass bei den isologen Transplantationen nicht mit
einer Abstoßungsreaktion zu rechnen war. Die Tiere wurden zu zweit in Typ 3-
Makrolonkäfigen in einem 21°C temperierten Raum gehalten, wobei ihnen
Leitungswasser und Futter (Altromin R; Firma Lage, Westfalen) zur freien Verfügung
standen. Durch eine Zeitschaltuhr wurde ein konstanter Tag-Nacht-Rhythmus
eingehalten, wobei zwölf Stunden belichtet und zwölf Stunden verdunkelt wurde.
Die dieser Arbeit vorangegangenen tierexperimentellen Untersuchungen wurden bei der
zuständigen Behörde (Bezirksregierung Köln) beantragt und genehmigt.
2.2 Methoden
2.2.1 Versuchsaufbau Zur Untersuchung der Fragestellung dieser Arbeit wurden jeweils 5-7 Tiere aus
folgenden Gruppen und Untergruppen ausgewählt und untersucht:
1) Hauptgruppe: Ovarektomie und Transplantation von Ovargewebe über die
Portalvene in die rechte Leberhälfte
3 Wochen nach Transplantation
3 Monate nach Transplantation
9 bis 27 Monate nach Transplantation (Entwicklung von
hepatozellulären Karzinomen)
2) Kontrollgruppe
6 Monate (Kontrolltiere zu 3 Monatstieren der Hauptgruppe)
24 Monate
2 Material und Methoden 33
3) Ovarektomie, keine Transplantation
6 Monate
24 Monate
2.2.2 Ovartransplantation
2.2.2.1 Gewinnung und Präparation des Ovars Reagenzien Menge Zusammensetzung
Gemisch aus Ketavet® (Ketaminhydrochlorid) und Rompun® (Xylazinhydrochlorid)
10 ml
2 ml
Ketavet®
Rompun®
-> 0,1 ml Mischung pro 100 g Körpergewicht
Gemisch aus Hanks´ Salt Solution und Ampuwa (1:10, pH 7,2)
10 ml
90 ml
Hanks´ Salt Solution
Ampuwa
Gesunde Tiere desselben Inzuchtstammes, deren Ovarien als Spenderorgane benötigt
wurden, narkotisierte man intraperitoneal mit einem Gemisch aus Ketavet® und
Rompun®. Das Abdomen wurde durch eine mediane Laparotomie eröffnet. Schließlich
wurden die Ovarien explantiert und in eine Petrischale mit Hanks-Lösung (pH 7,2)
gebracht. Mit einer scharfen entfetteten Rasierklinge wurde das Gewebe nun in 400 μm
große Teile zerkleinert und die Gewebestücke mit einer Glaspipette aufgesammelt. Bis
zur Transplantation wurde das Gewebe wiederum in eiskalter Hanks-Lösung
aufbewahrt.
2.2.2.2 Transplantation der Ovarien Reagenzien Menge Zusammensetzung
Gemisch aus Ketavet® (Ketaminhydrochlorid) und Rompun® (Xylazinhydrochlorid)
10 ml
2 ml
Ketavet®
Rompun®
-> 0,1 ml Mischung pro 100 g Körpergewicht
Gemisch aus Hanks´ Salt Solution
und Ampuwa (1:10, pH 7,2)
10 ml
90 ml
Hanks´ Salt Solution
Ampuwa
Alkohol, 70% ig Gebrauchsfertig
Unmittelbar vor der Transplantation erfolgte bei den Tieren eine Gewichtsmessung. Die
Narkose wurde mit einem Gemisch aus Ketavet® und Rompun® eingeleitet, die
narkotisierten Tiere anschließend am Bauch rasiert, mit 70%igem Alkohol desinfiziert
und auf einem Rattenoperationstisch in Rückenlage fixiert. Das Abdomen wurde durch
2 Material und Methoden 34
eine mediane Laparotomie von ca. drei Zentimetern eröffnet und das Operationsfeld mit
einem Lochtuch abgedeckt. Um die Pfortader gut darzustellen, wurde das
Darmkonvolut nach extraabdominal verlagert und mit feuchten Kompressen abgedeckt.
Das Ovargewebe, das zuvor gewonnen wurde, zog man nun mit etwa 0,6 ml Hanks-
Lösung in eine 1 ml Tuberkulinspritze auf. Um eine intraindividuelle Kontrolle zu
haben, wurde mittels einer Gefäßklemme der extrahepatisch gelegene linke Pfortaderast
abgeklemmt. Bei der nachfolgenden langsamen Injektion des Ovargewebes in die
Pfortader wurde das Gewebe nur in die rechte Leberhälfte, d.h. in den rechten
Leberlappen, in die rechte Hälfte des Mittellappens, in den Processus caudatus und die
Processus papillares, geschwemmt. Die linke Leberhälfte, also der linke Leberlappen
und die Hälfte des Mittellappens, blieben frei von Transplantaten. Nach der Injektion
wurde die Gefäßklemme sofort wieder entfernt, so dass der Blutfluss in die linke
Leberhälfte maximal für eine Minute unterbrochen wurde. Die Injektionsstelle wurde
danach für zwei bis drei Minuten manuell komprimiert, um die Blutung zu stillen.
Anschließend wurden die feuchten Kompressen entfernt, der Darm wieder reponiert und
die Bauchdecke mittels fortlaufender Naht verschlossen. Die Haut wurde geklammert
und die Tiere bis zum Aufwachen beobachtet. Die Narkose dauerte in der Regel
ungefähr 30 Minuten.
2.2.3 Töten der Tiere und Perfusionsfixation des Gewebes
Reagenzien Menge Zusammensetzung
Gemisch aus Ketavet® (Ketaminhydrochlorid) und Rompun® (Xylazinhydrochlorid)
10 ml
2 ml
Ketavet®
Rompun®
-> 0,1 ml Mischung auf 100 g Körpergewicht
Spüllösung 20 g
2,5 g
Auffüllen auf 500 ml
Dextran (4%)
Procain (0,5%)
Ringerlösung
Fixationslösung mit Dextran
(pH 7,4)
20 g
15 g
Auffüllen auf 500 ml
Dextran (4%)
Paraformaldehyd (3%)
Phosphatpuffer nach Sörensen (PBS) (pH 7,4; 0,1 M)
10 ml Glutaraldehyd (25%)
Fixationslösung ohne Dextran
(pH 7,4)
15 g
Auffüllen auf 500 ml
Paraformaldehyd (3%)
Phosphatpuffer nach Sörensen (PBS) (pH 7,4; 0,1 M)
10 ml Glutaraldehyd (25%)
2 Material und Methoden 35
Fixationslösung ohne Dextran mit 0,5%igem Glutaraldehyd
15 g
Auffüllen auf 500 ml
Paraformaldehyd (3%)
Phosphatpuffer nach Sörensen (PBS)
(pH 7,4; 0,1 M)
10 ml Glutaraldehyd (0,5%)
4%ig gepufferte Formalinlösung 4 g
6,5 g
892 ml
108 ml
NaH2PO4 x H2O
Na2HPO4 (wasserfrei)
Aqua destillatum
Formaldehydlösung (37%)
Isopentan (2-Methylbutan) Gebrauchsfertig
Kurz vor dem Töten wurde letztmalig das Gewicht der Tiere bestimmt. Zur
Vorbereitung der Perfusionsfixation wurden die Ratten intraperitoneal mit einem
Gemisch aus Ketavet® und Rompun® narkotisiert. Das Abdomen wurde mittels
medianer Laparotomie und vier Entlastungsschnitten eröffnet und die Aorta
abdominalis dargestellt. Mit einer 1,5 mm durchmessenden Braunüle wurde die Aorta
punktiert, um mit einer 5 ml Spritze 5 ml Blut zu entnehmen. Zur Gewinnung des
Serums zentrifugierte man das Blut 10 Minuten bei 4000 rpm und pipettierte darauf das
Serum von den restlichen Blutbestandteilen ab. Dieses verbrachte man dann in flüssigen
Stickstoff, um es bei -80°C einzufrieren. Die Braunüle wurde dann mit Klemmen in der
Aorta abdominalis fixiert und eine Spüllösung, bestehend aus Ringerlösung, die mit 4%
Dextran und 0,5% Procain versetzt war, angeschlossen, um das Blutgefäßsystem von
Blut zu reinigen. Um hierbei einen offenen Kreislauf zu schaffen, wurden die Vena cava
inferior und superior mit einer Schere eröffnet. Bei jedem Tier wurden etwa 200 ml des
Gemisches zum Spülen benötigt. Nach Abklemmen der zuführenden Gefäße wurden der
Mittellappen der Leber und die linke Niere abgesetzt, mit einer Rasierklinge in ca. 3
mm breite Scheiben geschnitten, in -120°C kaltem Isopentan (2-Methylbutan)
eingefroren und bei -80°C gelagert, um anschließend als Kryostatschnitte zu dienen.
Danach wurde die Spüllösung durch die Fixationslösung mit Dextran ersetzt. Nach etwa
sieben Minuten war eine gleichmäßige Perfusionsfixation aller Organe erreicht. Die
Organe wurden nach der Fixation entnommen und in folgender Weise konserviert:
Lunge, Geschlechtsorgane, Pankreas mit Milz und Dünndarm wurden in einer 4%ig
gepufferten Formalinlösung gelagert, während das Gehirn mit Hypophyse, Schilddrüse,
Leber und die rechte Niere in eine Fixationslösung ohne Dextran gegeben wurden.
2 Material und Methoden 36
Das perfusionsfixierte Lebergewebe für die elektronenmikroskopische Untersuchung
wurde mithilfe einer entfetteten Rasierklinge in pyramidenstumpfförmige Stücke mit
einer Kantenlänge von ca. 2 mm geschnitten, in Rollrandgläser gegeben und für
mindestens 2 Stunden immersionsfixiert. Als Fixierlösung diente die Fixierlösung ohne
Dextran plus 0,5%igem Glutaraldehyd. Anschließend erfolgte die Einbettung in Epon.
Die restlichen Organe wurden in Paraffin eingebettet.
2.2.4 Elektronenmikroskopie
2.2.4.1 Einbettung des Gewebes in Epon Reagenzien Menge Zusammensetzung
Phosphat-Waschpuffer nach Sörensen (PBS) (pH 7,4; 0,1 M)
17,1 g
0,01 g
202 ml
Sachharose
Natrium-Acid
Stammlösung B (Na2HPO4 x 2H2O + Aqua
destillatum)
48 ml Stammlösung A (NaH2PO4 x H2O + Aqua
destillatum)
Osmiumtetroxyd-Gebrauchslösung (pH 7,2; 2%)
5 ml
450 mg
2 ml
2 ml
Auffüllen auf 10 ml
Osmiumtetroxyd (4%)
Sachharose
Veronalacetatstammlösung
HCl (0,1 M)
Aqua destillatum
Veronal-Acetat-Waschpuffer (pH 7,2)
4,5 g
0,004 g
20 ml
Sachharose
Natrium-Acid
Pufferstammlösung (0,39 g Natrium-Acetat-
Trihydrat + 0,59 g Veronal-Natrium)
20 ml
Auffüllen auf 100 ml
HCl (0,1 M)
Aqua destillatum
Propylenoxyd Gebrauchsfertig
Epon 20 ml
20 ml
0,6 ml (1,5 %)
Epon A (31 ml Epon 812 + 50 ml
DDSA)
Epon B (50 ml Epon 812 + 44,5 ml MNA)
DMP 30
Das in der Fixierlösung ohne Dextran fixierte Material wurde für 3 x 30 Minuten im
Phosphatpuffer nach Sörensen gespült, um das Fixiermittel herauszulösen.
Anschließend wurde das Gewebe für 2,5 bis 3 Stunden bei + 4°C in
Osmiumtetroxydlösung auf einem Schüttler gelagert, um dann in Veronal-Acetat-
Waschpuffer 3 x 5 Minuten gewaschen zu werden. In einer aufsteigenden Alkoholreihe
2 Material und Methoden 37
(20%, 30%, 50%) wurde das Material jeweils für 10 Minuten entwässert, danach über
Nacht bei + 4°C in 70%igem Alkohol mit 0,5%igem Uranylacetat inkubiert. Am
nächsten Tag wurde die Dehydrierung in aufsteigender Alkoholreihe fortgeführt (70 %:
1 x 10 Minuten, 90%: 1 x 10 Minuten, 96%: 2 x 10 Minuten, 100%: 3 x 10 Minuten)
und dann für 2 x 15 Minuten in Propylenoxyd belassen. Es folgte wiederum eine
Inkubation über Nacht, diesmal im Propylenoxyd-Epon-Gemisch (1:1) bei + 20°C,
anschließend die Fixation in Epon für 24 Stunden ebenfalls bei Zimmertemperatur. Die
Probe wurde dann in die vorbereiteten Gelatinekapseln mit frischer Epon-
Gebrauchslösung gebracht, sinken gelassen und bei + 60°C für mindestens 48 Stunden
polymerisiert.
2.2.4.2 Herstellung von Gewebeschnitten für die Elektronenmikroskopie Reagenzien Menge Zusammensetzung
Übersichtsfärbung nach Richardson Stammlösung A
1 g Di-Natriumtetraborat + 1 g
Methylenblau -> Auffüllen auf 100
ml mit Aqua destillatum
Stammlösung B 1 g Azur II -> Auffüllen auf 100 ml mit Aqua destillatum
-> A + B 1:1 mischen
Uranylacetatlösung (3%) 1,5 g
Auffüllen auf 50 ml
Uranylacetat
Aqua destillatum
Bleilösung nach Sato 1 g
1g
1g
2g
82 ml
18 ml
Bleinitrat
Bleiacetat
Bleicitrat
Natriumcitrat
Aqua destillatum
NaOH (4%)
Filme für Grids 200 mg
50 ml
Mowital
1,2-Dichloräthan
Die in Epon polymerisierten Gewebeblöcke wurden in Objekthalter eingespannt und
mit einem Trim-Gerät der Firma Leica zu gleichschenkligen Trapezen getrimmt. Das
Herstellen 500 nm dicker Semidünnschnitte und Ultradünnschnitte (55-70 nm) erfolgte
mithilfe eines Mikrotoms der Firma Leica, welche dann auf Objektträger aufgezogen
wurden. Anschließend wurde eine Übersichtsfärbung nach Richardson für die
Lichtmikroskopie durchgeführt, bei der die Färbelösung für 1,5 bis 2 Minuten einwirken
musste und mit Aqua destillatum abgespült wurde. Die Entwässerung erfolgte ebenfalls
2 Material und Methoden 38
in einer aufsteigenden Alkoholreihe und Xylol. Eingedeckt wurden die Objektträger mit
Kanada-Balsam.
Für die Elektronenmikroskopie wurden die Ultradünnschnitte auf film-beschichtete
Kupfer-Grids (200 Maschen, hexagonal) aufgezogen und für 30 Minuten mit 3%
wässriger Uranylacetatlösung, dann für 4 Minuten mit Bleilösung nach Sato
kontrastiert.
2.2.4.3 Auswertung und Statistik der Elektronenmikroskopie
Grundlage zur Beurteilung der Gewebe waren die zuvor angefertigten Hämatoxylin und
Eosin-Färbungen (HE-Färbungen), die Perjodsäure-Schiff-Reaktion (PAS-Reaktion)
und die Übersichtsfärbung nach Richardson.
Licht- und elektronenmikroskopisch konnte man veränderte Azini (VA) und nicht
veränderte Azini (NA) anhand ihrer morphologischen Unterschiede (Größenzunahme
sowie Glykogen- und Fettakkumulation) leicht unterscheiden. Außerdem schienen die
Zell-Zell-Abstände zwischen den Nichtparenchymzellen, vor allem den Sternzellen,
verbreitert. Ein hepatozelluläres Karzinom charakterisiert ein Gewebe, welches
stärkergradige Zellatypien, ein pseudoglanduläres Wachstum oder eine Trabekelbreite
von mehr als drei Tumorzellen an mindestens zwei verschiedenen Stellen aufweist. In
einigen Lebern traten auch gutartige Gallengangstumoren (Cholangiome) auf, welche
aber nicht Gegenstand dieser Arbeit waren.
2 Material und Methoden 39
Abbildung 4.1-Lichtmikroskopische Aufnahmen von präneoplastischen Arealen der verschiedenen Hauptgruppen
(A) Hauptgruppe (3 Monate; transplantierte rechte Leberhälfte; HE) Das Foto zeigt ein Transplantat mit zwei Follikeln und einem Gelbkörper. Das angrenzende Lebergewebe ist bereits präneoplastisch verändert. (B) Hauptgruppe (3 Wochen; transplantierte rechte Leberhälfte; PAS) Man erkennt ein kleines Transplantat am linken oberen Bildrand. In der PAS-Färbung sieht man deutlich den Glykogenverlust im veränderten, transplantatnah gelegenem Areal. (C) Hauptgruppe (3 Wochen; transplantierte rechte Leberhälfte; HE) Die Abbildung zeigt im linken oberen Bereich ein Transplantat mit einer im Zentrum gelegenen Eizelle. Das direkt dem Transplantat anliegende Lebergewebe ist präneoplastisch verändert, erkennbar an Mitosen und vergrößerten Zellkernen. Das Gewebe am rechten unteren Bildrand stellt Normalgewebe dar. (D) Hauptgruppe (3 Monate; transplantierte rechte Leberhälfte; HE) Man sieht ein präneoplastisch verändertes Areal mit verbreiterten Trabekeln und in Zahl und Größe abnormen Nukleoli.
Vergrößerung: Länge der unteren Bildkante (A) 1630μm; (B) 812μm; (C) 507μm; (D) 253μm
Die Bestimmung der Volumenanteile der einzelnen Leberzellen erfolgte mithilfe eines
Punkterasters, welches aus 108 Punkten bestand und auf die vom Elektronenmikroskop
(Firma Zeiss, Typ EM 900, Oberkochen) gezeigten Präparatausschnitte aufgelegt
wurde. Dabei wurden drei hexagonale Maschen pro Versuchtier bei einer Vergrößerung
von x1100 vollständig ausgezählt, indem eine Masche durch vier Gesichtsfelder
(viermal 108 Punkte) erfasst wurde. Die Auswahl der Maschen erfolgte streng zufällig.
Zusätzlich sollte erwähnt werden, dass die Portalfelder und Zentralvenen nicht mit
ausgezählt wurden, so dass die Volumendichte der verschiedenen Zelltypen nicht mit
A B
C D
2 Material und Methoden 40
dem Lebervolumen, wohl aber mit dem intraazinären Volumen in Verbindung zu setzen
ist.
Unter dem Elektronenmikroskop wurden weiterhin pro Versuchstier jeweils fünf
Fotografien von Endothel-, Stern- und Kupfferzellen bei einer Vergrößerung von x7000
angefertigt, um Vergleiche zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen feststellen zu
können. Die Auswahl der Zellen und der Fotografien erfolgte dabei ebenfalls völlig
zufällig.
Abbildung 4.2-Elektronenmikroskopische Übersichtsaufnahme (Kontrollgruppe; 24 Monate)
Auf der Fotografie sind Hepatozyten (H), Stern- (S), Endothel- (E) und Kupfferzellen (K) zu sehen.
Vergrößerung: x1100
Da beim Auswerten der Fotos keine Unterschiede beim Vergleich der Endothel- und
Kupfferzellen der verschiedenen Gruppen zu sehen waren, wurden lediglich die
Sternzellen morphometrisch untersucht.
Die Morphometrie wird definiert als Methode zur Messung von Geweben und deren
Bestandteilen, Oberflächen und Volumina. Sie ist eine elementare Komponente der in
H
E
K S
2 Material und Methoden 41
der Medizin vielfach unverzichtbaren histologischen Diagnostik. Dies erfolgte mit der
l03-Methode nach Gundersen [152]. Das Prinzip dieser Methode lässt sich am Beispiel
von sphärischen Strukturen erklären. Zweidimensionale Parameter wie die
Volumendichte einer Struktur lassen sich leicht ermitteln. Probleme ergeben sich aber
dann, wenn man bei einem absoluten Zahlenwert vom Zwei- auf das Dreidimensionale
schließen möchte. Bei der Bestimmung der Volumina von Sphären ist es nicht zulässig,
vom gemessenen Radius des Fotos auf das Volumen zu schließen, da der Radius auf
dem Foto nur dem tatsächlichen entspricht, wenn der abgebildete Anschnitt der Struktur
exakt durch den Äquator erfolgt. In der Regel geht der Schnitt hingegen durch die
Kugelperipherie, so dass die ermittelten Resultate unter den tatsächlichen liegen. Bei
der l03-Methode nach Gundersen werden nur Strukturen ausgewertet, die von Punkten
bzw. Linien eines aufgelegten Punkterasters getroffen werden, womit dem oben
erläuterten Problem Rechnung getragen wird. Da die Wahrscheinlichkeit, dass eine
Struktur von einem Punkt des Rasters getroffen wird, dem Volumen der Struktur direkt
proportional ist, werden diejenigen Anschnitte der Struktur, die klein sind, z.B.
periphere Anschnitte, anteilsmäßig weniger erfasst als äquatornahe Anschnitte. Man
erhält mit dieser Methode also ein durchschnittliches Volumen einer Struktur.
Voraussetzung dafür ist, dass die Zellen zufällig und ohne vorherige Auswahl
fotografiert wurden und die Positionierung des Test-Systems ebenfalls zufällig erfolgte
[153].
In dieser Arbeit wurden die Volumina der Fettvakuolen der Sternzellen mithilfe der l03-
Methode nach Gundersen und das Verhältnis von Fettvakuolen und Zytoplasma mittels
Auszählung eines aufgelegten Punkterasters bestimmt. Das genaue Vorgehen der
Volumenbestimmung nach Gundersen verdeutlicht Abbildung 4.3. Dabei wurde das
abgebildete Punkteraster auf ein Foto gelegt, um mithilfe des ebenfalls dargestellten
Rulers den Durchmesser der Fettvakuolen zu ermitteln, die entlang der Linien des
Rasters liegen. Die gemessene (Länge)3, 30l multipliziert mit
3
ist eine
unvoreingenommene Abschätzung des Volumens der Fettvakuolen: 303
l . Der
Abstand der Klassen 1 bis 10 des Rulers ist auf einer Skala in (Länge)3 jeweils gleich,
11 bis 15 doppelt so weit und 16 bis 20 viermal so weit wie der Abstand der Klassen 1
bis 10.
2 Material und Methoden 42
Abbildung 4.3-Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Sternzelle (Hauptgruppe mit Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms, 9 Monate)
Man erkennt den weitgehenden Verlust der intrazytoplasmatisch gelegenen Fetttropfen. Zusätzlich finden sich eine Vermehrung von Golgi-Apparat und endoplasmatischem Retikulum.
Das abgebildete Punkteraster verdeutlicht das Vorgehen bei der Volumenbestimmung nach Gundersen (siehe Text).
Vergrößerung: x7000
Anhand des dargestellten Beispiels der Tabelle 4.1 soll die Volumenbestimmung
erläutert werden. In Spalte A sind die Klassen dargestellt, in Spalte B die Messwerte der
Klassenmittelpunkte, in Spalte C die Anzahl der Beobachtungen und in der letzten
Spalte das Produkt der Werte aus Spalte B und C. Aus der Länge der ersten zehn
Klassen des Rulers (L10 = 35 mm) und der absoluten Vergrößerung (M = 17010),
welche sich aus der Vergrößerung von x7000 multipliziert mit dem
Nachvergrößerungsfaktor von 2,43 zusammensetzt, bestimmt man den Faktor F,
2 Material und Methoden 43
welcher die Klassen in die Einheit μm3 umwandelt: 3
310
10
1m
M
LF
. Dies ergibt im
dargestellten Beispiel: 33
871,017010
100035
10
1mF
.
Die durchschnittliche (Länge)3, 30l
ergibt sich aus den mittels der Tabelle bestimmten
Summen aus Spalte C und der letzten Spalte:
39,657
36430
C
CBl .
Abschließend wird das durchschnittliche Volumen der gemessenen Strukturen
folgendermaßen bestimmt: 828,5871,039,6
333
0 Fl
.
Tabelle 4.1-Beispiel für die Volumenbestimmung nach der l03-Methode nach Gundersen
A (Klassen) B (Messwert der Klassen-Mittelpunkte, l0
3) C (Anzahl der Beobachtungen)
B x C
1 0,5 19 9,5
2 1,5 12 18
3 2,5 6 15
4 3,5 4 14
5 4,5 3 13,5
6 5,5 0 0
7 6,5 2 13
8 7,5 1 7,5
9 8,5 1 8,5
10 9,5 0 0
11 11 0 0
12 13 0 0
13 15 1 15
14 17 0 0
15 19 2 38
16 22 0 0
17 26 0 0
18 30 2 60
19 34 0 0
20 38 4 152
∑ 57 364
2 Material und Methoden 44
Die Bestimmung des Verhältnisses von Fettvakuolen und Zytoplasma mithilfe des
Punktegitters erfolgte durch streng zufälliges Auflegen des Gitters auf das Foto und
Auszählen derjenigen Punkte, die auf Fettvakuolen und Zytoplasma fielen.
Bei beiden Verfahren wurden mithilfe des T-Testes folgende Gruppen gegeneinander
getestet:
HCC nach Ovartransplantation vs. Kontrollgruppe 24 Monate
Hauptgruppe 3 Monate transplantierte rechte Leberhälfte vs. linke Leberhälfte
(Kontrollseite)
Hauptgruppe 3 Monate Kontrollseite vs. Kontrollgruppe 24 Monate
Kontrollgruppe 6 Monate vs. Kontrollgruppe 24 Monate
Kontrollgruppe 6 Monate vs. Ovarektomie 6 Monate
Zur Prüfung von Unterschieden der verschiedenen Gruppen wurden der Wilcoxon-
Paardifferenzen-Test zum Vergleich zweier abhängiger Stichproben (linke Leberhälfte
(Kontrollseite) vs. transplantierte rechte Leberhälfte) und der Nichtmetrische Mann-
Whitney-Test (U-Test) zum Vergleich zweier unabhängiger Stichproben angewandt.
Unterschiede wurden als statistisch signifikant akzeptiert, wenn die
Irrtumswahrscheinlichkeit p < 0,05 war.
2.2.5 Immunhistochemie
2.2.5.1 Einbettung in Paraffin
Nachdem die Präparate einige Tage in einer Formalinlösung aufbewahrt wurden,
wurden sie zunächst durch gründliches Spülen mit Aqua destillatum vom Fixiermittel
befreit. Über Nacht wurden die Präparate in das geschlossene
Gewebeeinbettungssystem (Hypercenter XP) von Shandon verbracht, um das Material
in einer aufsteigenden Alkoholreihe zu entwässern (jeweils 1 Stunde bei 50%, 75%,
80%, 2 x 96%, 3 x 100% und 2 x Xylol) und abschließend bei 60°C für 2 x 2 Stunden in
ein Bad aus flüssigem Paraffin (Paraplast Plus) zu geben. Danach war das Programm
beendet und das Material wurde im Histocenter von Shandon in die Universalkassetten
überführt und mit Paraffin aufgegossen. Durch den Plastikpolymerenanteil im Paraplast
Plus ist das Paraffin härter und dadurch besser zu schneiden. Nach dem Erkalten der
Formen wurden sie am Rotationsmikrotom der Firma Microm geschnitten.
2 Material und Methoden 45
2.2.5.2 Anfertigung von Schnitten
Mithilfe eines Rotationsmikrotoms wurden von den Paraffinblöcken 1-2 µm dicke
Schnitte angefertigt, sofort in ein 35°C warmes Wasserbad verbracht und auf Glas-
Objektträger (SuperFrost Plus®) der Firma Menzel, Braunschweig aufgezogen. Damit
die Schnitte während des Nachweisverfahrens nicht abschwemmen konnten, wiesen die
Objektträger an der Oberfläche eine elektrische Ladung auf, die mit der Ladung der
Präparate interagierte und so eine gute Haftung der Schnitte gewährleistete. Diese
wurden danach zum Aushärten der Schnitte für einen Tag im Brutschrank bei 37°C
aufbewahrt.
2.2.5.3 Immunhistologisches Färben der Schnitte Reagenzien Menge Zusammensetzung
Alkoholreihe 100%, 96%, 75% Verdünnung in Aqua destillatum
DAB 1 Tropfen (20 µl)
1 ml
DAB+Chromogen
DAB+Substratpuffer
Eindeckmedium
Hämalaun nach MAYER 1 g
0,2 g
800 ml
50 g
Hämatoxylin
Natriumjodat
Aqua destillatum
Aluminiumkaliumsulfat
-> einige Tage Ruhe
50 g
1 g
Chloralhydrat
Citronensäure
Kaninchennormalserum 1:50 Verdünnung in Tris-Puffer ohne Triton
Liquid DAB+Substrate Chromogen System
LSAB®+Kit-Peroxidase
Magermilchpulver 5 g auf 100 ml Verdünnung in Tris-Puffer ohne Triton
Natriumcitratpuffer (0,01 M, pH 6,0) 75 ml (0,1 M)
25 ml (0,1 M)
Na-Citrat
Citronensäure
Primärantikörper c-Met (sc-161) 1:50/1:20 Verdünnung in RPMI
Primärantikörper HGF (90589) 1:20-1:400 Verdünnung in RPMI
Primärantikörper TNF-R1 (sc-1070) 1:1000/1:600 Verdünnung in RPMI
Primärantikörper TNF α (sc-1348) 1:400 Verdünnung in RPMI
RPMI (pH 7,4-7,6) 5 ml
50 ml
500 mg
0,05 g
RPMI
Aqua destillatum
Rinderserum Albumin
Natrium-Acid
2 Material und Methoden 46
Tris-Spülpuffer 9 g
68,5 g
87,8 g
1 l
1 Tropfen
Tris
Tris-HCl
NaCl
Aqua destillatum
1 :10 verdünnen
Triton X-100 (senkt die Oberflächenspannung)
VECTASTAIN Elite ABC Kit-Peroxidase
Wasserstoffperoxid (H2O2) 3 % Verdünnung in Aqua destillatum
Xylol
Immunhistochemische Färbemethoden erlauben an Schnittpräparaten die Darstellung
von bestimmten Gewebs- bzw. Zellantigenen mit Hilfe spezifischer Antikörper. Dabei
werden in der Regel mehrere Antikörper nacheinander verwendet: der primäre
Antikörper ist gegen das darzustellende Antigen (z.B. TNF α) gerichtet, der
Sekundärantikörper richtet sich gegen das Fc-Fragment von Immunglobulinen der
Tierspezies, in welcher der Primärantikörper hergestellt wurde. Da die Signalmoleküle
und Rezeptoren in relativ geringer Menge (verglichen mit dem Gesamtproteingehalt der
Leberzellen) vorkommen, wurde für die Detektion dieser Proteine das VECTASTAIN®
Elite ABC Kit-Peroxidase für TNF α und TNF-R1 und die mit biotinyliertem Tyramin
verstärkte Streptavidin-Biotin-Komplex-Methode für c-Met und HGF gewählt. Die
Reagenzien zur Durchführung der Reaktionen wurden mit Ausnahme der
Primärantikörper und des VECTASTAIN® Elite ABC Kits (Vector, USA) von der
Firma DAKO GmbH, Hamburg bezogen, die dieses Nachweissystem als LSAB®+Kit,
Peroxidase vertreibt.
Um eine bessere Demaskierung von Antigenen zu erreichen, wurden die für c-Met
bestimmten Objektträger in 0,01 M Na-Citratpuffer (pH 6,0) für 3 x 10 Minuten bei 600
W in der Mikrowelle erhitzt. Die Pufferverluste durch die Mikrowellenbehandlung
wurden alle 10 Minuten ausgeglichen, so dass die Objektträger stets vollständig von
Citratpuffer bedeckt waren. Das Enzym Peroxidase für die Konjugation eines
Komplexes wird aus der Wurzel des Meerrettichs gewonnen und hat ein
Molekulargewicht von 40 kDa. Endogene Peroxidase findet sich in Hämoproteinen wie
Hämoglobin, Myoglobin, Zytochrom und Katalase, demnach hauptsächlich in
Granulozyten, Mastzellen, und Erythrozyten, weshalb die Erythrozyten im Präparat eine
2 Material und Methoden 47
gute Kontrolle der erfolgreichen Blockade durch Wasserstoffperoxid darstellen. Zu
einer Farbreaktion kommt es, indem das Enzym Peroxidase mit dem Substratpuffer,
H2O2 als Katalysator und dem jeweiligen Chromogen (hier DAB) ein farbiges
Endprodukt bildet, welches sowohl löslich als auch unlöslich in organischen
Lösungsmitteln vorhanden sein kann. Die Substrat–Chromogen-Reaktion kann nicht
unterscheiden, ob die Peroxidase endogen vorhanden ist oder nachträglich zugegeben
wurde (ABC-System mit Peroxidase). Da das Enzym Peroxidase im System benutzt
wird, muss aus dem oben genannten Grund vor Beginn der eigentlichen Reaktion die
endogene Peroxidase oder Pseudoperoxidase durch Zugabe von Wasserstoffperoxid
inaktiviert werden. Dies wird durch 15minütige Inkubation mit 3%igem
Wasserstoffperoxid direkt nach dem Entparaffineren und Dehydrieren bzw. im Fall von
c-Met nach der Mikrowellenvorbehandlung bewirkt.
Eine unspezifische Anlagerung der Antikörper wird durch Vorinkubation mit einem
Normalserum erreicht. Das Normalserum wird auch als Non- oder Nicht-Immunserum
bezeichnet. Es handelt sich dabei um das Serum einer Tierspezies (TNF α, TNF-R1:
Kaninchen; HGF: Schwein), welche nicht mit den nachzuweisenden Antigenen
immunisiert wurde und diese Tiere also keine spezifischen Antikörper gegen die
gesuchten Antigene besitzen. Man geht davon aus, dass nicht immunisierte Tiere keine
Antikörper gegen eigene Serumproteine bilden können. Das Normalserum dient in der
Immunhistochemie der Absättigung von elektrostatischen Ladungen der Proteine im
Untersuchungsgut und damit der Verhinderung von unspezifischen Anfärbungen.
Immunglobuline können ebenfalls unspezifisch durch die hydrophobe Bindung an
Membranen oder Fettgewebe gebunden werden. Die Proteine des Normalserums binden
an die unterschiedlichen Ladungen des Gewebes, so dass der nachfolgende
Primärantikörper nur noch spezifische Bindungen mit dem Untersuchungsmaterial
eingehen kann. Die Konzentration des Normalserums sollte nicht mehr als 1-5%
betragen, da es bei höherer Konzentration zu einer unspezifischen Bindung der
Immunglobuline an das eingesetzte Detektionssystem kommt und damit eine störende
Hintergrundfärbung vorhanden ist. Die Auswahl der richtigen Tierspezies des
Normalserums richtet sich nach der Tierspezies des verwendeten Sekundär- oder
Brückenantikörpers. Stammen diese wie bei TNF α und TNF-R1 aus dem Kaninchen,
so blockiert man mit Kaninchennormalserum. Die Schnitte werden vor Zugabe des
2 Material und Methoden 48
Primärantikörpers und nach der Blockade mit Wasserstoffperoxid mit dem
Normalserum für 20 Minuten inkubiert. Das Normalserum darf nach abgelaufener Zeit
nur abgetropft und nicht abgespült werden, da sonst der Ausgangszustand des
Präparates wieder hergestellt wäre, d.h. die unterschiedlichen Ladungen wären für
unspezifische Reaktionen wieder frei.
Hintergrundreaktionen kann man auch durch den Einsatz von entfettetem
Magermilchpulver etwas reduzieren, welches man entweder wie bei c-Met dem
Gebrauchspuffer (Tris-Spülpuffer) oder dem Verdünnungsmedium zusetzt. Die
Konzentration des Milchpulvers beträgt zwischen 2 und 4%. Eine Blockade mit
Magermilchpulver kam bei dem Antikörper c-Met zum Einsatz, wobei das
Kaninchenserum bei TNF α und TNF-R1 benutzt wurde. Bei HGF wurde sowohl
Schweinenormalserum als auch Magermilchpulver probiert (s. oben).
Die ABC-Methode (Avidin-Biotin-Komplex-Methode) macht sich die Affinität von
Avidin zu Biotin zunutze, die außerordentlich hoch (mehrere Zehnerpotenzen stärker als
die zwischen Antikörper und Antigen) und zusätzlich irreversibel ist. Dies verringert die
Gefahr von Auswaschungen während der verschiedenen Färbeschritte, wie sie noch bei
PAP (Peroxidase-Anti-Peroxidase)- oder APAAP (Alkalische-Phosphatase-Anti-
Alkalische-Phosphatase-Komplex)-Methoden gegeben waren. Die Bildung eines
optimierten Komplexes zwischen Avidin und Enzym schließt eine außerordentlich hohe
Signalverstärkung ein, so dass auch Antigene in sehr kleinen Mengen oder
Konzentrationen nachgewiesen werden können (pg- und fg-Bereich). Avidin ist ein aus
Hühnereiweiß gewonnenes Glykoprotein (Tetramer) mit vier Bindungsstellen für
Biotin. Das Molekulargewicht beträgt 68 kDa. Da es teilweise zu unspezifischen
Reaktionen bei der Verwendung von Avidin gekommen ist, wurde es im weiteren
Verlauf zweckmäßig, ein reineres Produkt auf technischem Wege zu gewinnen. Dieses
neuere Produkt heißt Streptavidin und wird aus dem Bakterium Streptomyces avidinii
isoliert. Für die ABC-Methode verwendet man einen Brückenantikörper, welcher mit
Biotin markiert (biotinyliert) ist. Bei Biotin handelt es sich um ein wasserlösliches
Vitamin, welches sich gut an den Brückenantikörper koppeln lässt und somit die
Verbindung zum ABC-Komplex herstellt. An den biotinylierten Brückenantikörper
bindet nun der im weiteren Verlauf zugegebene ABC-Komplex. Der Komplex wird so
produziert, dass an drei von vier möglichen Bindungsstellen des Avidins ein Molekül
2 Material und Methoden 49
Biotin gebunden wird und mit der vierten noch freien Bindungsstelle die Verbindung
zum Biotin des Brückenantikörpers hergestellt werden kann. An den Komplex ist ein
Enzym gekoppelt, wobei es sich im vorliegenden Fall um Peroxidase handelt. Als
Variante des Enzyms ist ebenfalls alkalische Phosphatase möglich. Die Struktur des
Avidin-biotinylierten-Enzym-Komplexes ist noch nicht völlig verstanden, man geht
aber davon aus, dass es aus vielen biotinylierten Enzymmolekülen besteht, die durch
Avidin zu einer dreidimensionalen Struktur verbunden sind. Das hier verwendete
VECTASTAIN Elite ABC Kit ist noch um 5- bis 10-mal sensitiver als das Original
(VECTASTAIN ABC Kit) und kann auch für Western, Southern und Northern Blots,
Enzym-Immunoassays, in-situ-Hybridisierungen und in der Elektronenmikroskopie
benutzt werden.
Bei der ebenfalls verwendeten LSAB-Methode wird an den bereits gebundenen,
Peroxidase-markierten ABC-Komplex zusätzlich in einem weiteren Inkubationsschritt
eine biotinylierte Phenolverbindung (Tyramin) gebunden. Durch die Reaktion mit
biotinyliertem Tyramin und Wasserstoffperoxid entstehen neue Bindungsstellen, an die
sich in dem darauf folgenden Inkubationsschritt mit dem gleichen Peroxidase-
markierten ABC-Komplex weitere Komplexanlagerungen anschließen. Es kommt
dadurch zu einer wesentlichen Vermehrung von gebundener Peroxidase und damit zu
einer erheblichen, bis zu 8-mal stärkeren Signalverstärkung, weshalb die
Primärantikörper in einer viel höheren Verdünnung angesetzt werden können. Das Kit
ist für den qualitativen Nachweis von Antigenen in paraffineingebetteten Geweben,
Kryostatgeweben und Zellpräparaten vorgesehen.
Die Detektion der Reaktion erfolgt im letzten Schritt durch enzymatische Umwandlung
(Oxidation) des Chromogens 3,3`-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB) in
Anwesenheit von Wasserstoffperoxid in ein braunes Farbprodukt an Stelle des
Zielantigens. Dieses Substrat-Chromogen-System ist ein hoch sensibles DAB-System,
das für die Verwendung bei immunhistochemischen, auf Peroxidase-Basis, und in situ-
Hybridisierungs- Färbungsmethoden geeignet ist.
Die Spezifität der Reaktion wurde geprüft, indem Negativkontrollen mitgeführt wurden.
Hierbei wurde in Parallelschnitten der Primärantikörper durch RPMI ersetzt.
2 Material und Methoden 50
Es wurde im Einzelnen wie folgt vorgegangen:
Herstellung von Schnittpräparaten am Mikrotom mit einer Dicke von 1-2 µm
Trocknen der Präparate im Brutschrank bei 37°C über Nacht
Entparaffinieren 3 x in Xylol für jeweils 5 Minuten
Dehydrierung in absteigender Ethanolreihe (2 x 100%, 96%, 75%)
Spülen in Aqua destillatum
als Vorbehandlung zur Demaskierung wurden die Präparate für 3 x 10 Minuten
bei 600 W in 0,01 M Na-Citratpuffer, pH 6 in der Mikrowelle gekocht (nur c-
Met)
Präparate für 10 Minuten abkühlen lassen
Spülen mit Leitungswasser
Spülen mit Aqua destillatum
Blockierung der endogenen Peroxidase für 15 Minuten in 3%igem
Wasserstoffperoxid
Spülen mit Leitungswasser
Spülen mit Aqua destillatum
5 x Spülen in Tris-Puffer
Schnitte einzeln aus Küvetten herausnehmen und Überschuss mit Zellstoff
absaugen
Blockade der elektrostatischen Ladungen der Proteine mit
Kaninchennormalserum (Verdünnung 1:50 in Tris-Puffer ohne Triton, 20
Minuten bei Raumtemperatur in feuchter Kammer auf Schüttelmaschine, bei
TNF α und TNF-R1) bzw. Magermilchpulver (5 g auf 100 ml Tris-Puffer ohne
Triton, 1 Stunde bei 37 °C in feuchter Kammer, bei c-Met)
Inkubieren der Schnitte mit Primärantikörper (100 µl pro Schnitt) für 1 Stunde
bei 37°C in der feuchten Kammer (Verdünnung des Primärantikörpers in RPMI)
5 x Spülen in Tris-Puffer
Inkubieren mit biotinyliertem Sekundärantikörper von der Ziege (100 µl pro
Schnitt) für 30 Minuten bei Raumtemperatur in feuchter Kammer auf
Schüttelmaschine
5 x Spülen in Tris-Puffer
2 Material und Methoden 51
Inkubieren mit Streptavidin-markiertem Tertiärantikörper für 30 Minuten bei
Raumtemperatur in feuchter Kammer auf Schüttelmaschine
5 x Spülen in Tris-Puffer
Färbung mit DAB (Diaminobenzidin) für 5 Minuten bei Raumtemperatur in
feuchter Kammer auf Schüttelmaschine
Spülen mit Aqua destillatum
Gegenfärben mit Hämalaun nach MAYER für 2 Minuten
Spülen mit Leitungswasser
Bläuen mit warmem Leitungswasser
Rehydrierung in aufsteigender Ethanolreihe (75%, 96%, 100%) und 3x in Xylol
Eindecken in Kanada-Balsam
2.2.5.4 Auswertung der immunhistochemischen Präparate
Alle immunhistochemisch angefärbten Schnitte wurden bei 400facher Vergrößerung
unter dem Lichtmikroskop (Typ DME, Firma Leica, Wetzlar) beurteilt und ausgewertet.
Untersucht wurden dabei die Intensität der Reaktion und die Lokalisation der
Antikörper innerhalb eines Präparates sowie im Vergleich innerhalb einer Tiergruppe,
als auch zwischen den verschiedenen Gruppen. Des Weiteren wurde durch Mitführen
der Negativkontrollen eine unspezifische Färbung ausgeschlossen.
3 Ergebnisse 52
3 Ergebnisse
3.1 Elektronenmikroskopische Untersuchungen
3.1.1 Allgemeine Beobachtungen Anfangs verglich ich qualitativ die fotografierten Kupffer-, Stern-, und Endothelzellen
innerhalb der einzelnen Gruppen und die verschiedenen Gruppen miteinander, um
Unterschiede bzw. Gemeinsamkeiten feststellen zu können.
Dabei ergaben sich bei der drei Wochen alt gewordenen Hauptgruppe keine
Besonderheiten. Es waren normale Kupffer- und Sternzellen zu sehen und ein noch
fenestriertes Endothel.
Die drei Monate-Versuchstiere der Hauptgruppe zeigten weiterhin unveränderte
Kupffer- und Endothelzellen, jedoch erschienen die Sternzellen im Vergleich zu der
Kontrollseite derselben Tiere hinsichtlich der Größe und Dichte ihrer Fettvakuolen
leicht verändert.
In derjenigen Tiergruppe mit Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms wirkten
die Fettvakuolen der Sternzellen nun auffällig vermindert und verkleinert, das Endothel
ergab keine Auffälligkeiten und die Kupfferzellen wiesen vereinzelt eine Vermehrung
ihrer Mitochondrien auf.
In der Kontrollgruppe ergab sich, wie auch in der Hauptgruppe, das Bild von
geringgradig sekretorisch aktivierten Kupfferzellen, welche an der Vermehrung des
Golgi-Apparates und diverser Granula zu erkennen waren.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass keine wesentlichen Unterschiede
hinsichtlich der Granulierung, der Phagozytosevakuolen und des sekretorischen
Aktivierungszustands der Kupfferzellen, der extrazellulären Matrix (z.B. der
Kollagenfasern) sowie der Endothelzellen (Größe und Dichte von Pinozytosevesikeln,
Zytoplasmabreite, kein Verlust der Fenestrierung) zu beobachten waren.
3 Ergebnisse 53
Abbildung 5.1-Elektronemikroskopische Aufnahme von Endothelzellen (Kontrollgruppe; 6 Monate (oberes Foto) vs. Hauptgruppe mit Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms; 6 Monate (unteres Foto))
Man sieht morphologisch keine Unterschiede beim Vergleich einer Kontrollgruppe mit einer gleichaltrigen transplantierten Tiergruppe mit Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms. In beiden Fällen findet man ein fenestriertes Endothel sowie eine ähnliche Morphologie von Zellkernen und Zytoplasma.
Vergrößerung: x7000
3 Ergebnisse 54
Abbildung 5.2-Elektronenmikroskopische Aufnahme von Endothelzellen (Hauptgruppe; 3 Monate; transplantierte Leberhälfte)
Man erkennt unveränderte Endothelzellen, ebenfalls im Vergleich zu Abbildung 5.1.
Vergrößerung: x7000
3 Ergebnisse 55
Abbildung 5.3-Elektronenmikroskopische Aufnahme von Kupfferzellen (Hauptgruppe; 3 Monate; transplantierte Leberhälfte (oberes Foto) vs. Kontrollseite (unteres Foto))
Beim Vergleich von transplantierten und untransplantierten Leberhälften von Versuchstieren desselben Alters sieht man keine Unterschiede hinsichtlich der Granulierung, der Phagozytosevakuolen und des sekretorischen Aktivierungszustands der Kupfferzellen.
Vergrößerung: x7000
3 Ergebnisse 56
Abbildung 5.4-Elektronenmikroskopische Aufnahme von Kupfferzellen (Kontrollgruppe; 6 Monate; (oberes Foto) vs. Hauptgruppe mit Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms; 6 Monate (unteres Foto))
Gleichaltrige Versuchstiere der Kontrollgruppe im Vergleich zu der HCC-Gruppe zeigen ebenfalls keine Unterschiede in der Morphologie von Zellkern und Zytoplasma der Kupfferzellen.
Vergrößerung: x7000
3 Ergebnisse 57
Die einzigen Auffälligkeiten ergaben sich hinsichtlich der Dichte und Größe der
Fettvakuolen der Sternzellen, deren Ergebnisse der morphologischen Diagnostik in den
folgenden Kapiteln beschrieben werden.
3.1.2 Volumenanteile der Parenchym- und Nichtparenchymzellen am Lebervolumen
Die einzigen Gewebeanteile, die ihren volumetrischen Anteil am Lebergewebe
signifikant verändert haben, sind Endothel- und Sternzellen, der Dissé-Raum sowie der
Zellzwischenraum.
Die Endothelzellen der Kontrollgruppe (6 Monate) nehmen mit einem Mittelwert von
4,15 Prozent deutlich mehr Volumen ein als die Endothelzellen der 24 Monate alten
Kontrollgruppe (2,80 Prozent). Ebenso verhält es sich mit den Endothelzellvolumina
der Hauptgruppe (3 Wochen, Transplantation) gegenüber der intraindividuellen
Kontrollgruppe mit einem Prozentverhältnis von 4,66 zu 3,84, der Kontrollgruppe (6
Monate) gegenüber der 6 Monate alt gewordenen ovarektomierten Tiergruppe (4,15 zu
2,52 Prozent) und der 6 Monate alten Kontrollgruppe gegenüber der Hauptgruppe (3
Monate, Kontrollseite) mit 4,15 zu 2,66 Prozent.
Im Vergleich zu der gleichaltrigen Kontrollgruppe ist das Volumen der Sternzellen der
Gruppe mit Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms deutlich vermindert (24
Monate nach Ovartransplantation) (0,55 zu 1,87 Prozent). Ebenso verhält es sich bei der
6 Monate alten Kontrollgruppe und der ovarektomierten Tiergruppe (6 Monate) mit
einem Prozentverhältnis von 0,87 zu 1,74.
Bei der statistischen Bewertung des Dissé-Raums ergibt sich lediglich eine einzige
Signifikanz, welche beim Vergleich der 6 und 24 Monate alt gewordenen
ovarektomierten Tiergruppen zu sehen ist. Hier beträgt das Prozentverhältnis 6,39 zu
4,63 und zeigt, dass der Dissé-Raum im 6 Monate alten Tier mehr Volumen einnimmt
als im 24 Monate alten Tier.
Der Zellzwischenraum der Tiere mit Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms
nimmt mit einem Prozentverhältnis von 0,08 zu 0,29 statistisch signifikant weniger
Volumen ein als das der Hauptgruppe 3 Wochen nach Transplantation.
3 Ergebnisse 58
Tabelle 5.1-Mittelwerte (MW) in Volumenprozent und Standardabweichungen (STD) des Mittelwertes der einzelnen
Zellen
a = p< 0,05 gegenüber Hauptgruppe (3 Wochen, Kontrollseite)
b = p< 0,05 gegenüber HCC nach Ovartransplantation
c = p< 0,05 gegenüber Kontrollgruppe (6 Monate)
d = p< 0,05 gegenüber Kontrollgruppe (24 Monate)
e = p< 0,05 gegenüber Ovarektomie (6 Monate)
Tier Dissé-Raum
Endothelzelle Sternzelle Kupfferzelle Sinusoid Zellzwischenraum unverwertbar Hepatozyt
MW±STD MW±STD MW±STD MW±STD MW±STD MW±STD MW±STD MW±STD
Hauptgruppe (3 Wochen)
Transplantation 5,71±1,54 4,66a±1,27 1,34±0,68 2,82±1,76 16,62±7,53 0,29b±0,13 0,22±0,48 68,33±9,14
Kontrollseite 6,45±2,27 3,84±0,97 1,93±0,52 1,64±1,06 15,29±6,30 0,29±0,31 0,06±0,10 70,49±8,28
Hauptgruppe (3 Monate)
Transplantation 5,45±1,09 3,28±1,06 1,18±0,45 2,85±1,16 10,24±2,93 0,10±0,18 0,03±0,06 76,86±4,72
Kontrollseite 5,29±0,73 2,66c±0,78 1,32±0,54 2,25±1,01 11,29±4,50 0,27±0,15 0,13±0,18 76,79±6,77
HCC nach Ovartransplantation 3,42±2,30 3,41±1,34 0,55d±1,14 3,14±2,52 9,66±4,22 0,08±0,07 0,05±0,13 79,69±6,30
Kontrollgruppe (6 Monate) 5,27±1,90 4,15de±0,70 0,87e±0,72 1,99±1,24 9,98±3,29 0,28±0,21 0,09±0,12 77,35±6,11
Kontrollgruppe (24 Monate) 5,17±0,75 2,80±1,22 1,87±0,94 1,65±0,98 11,28±4,05 0,40±0,52 0,00±0,00 76,83±6,61
Ovarektomie (6 Monate) 6,39±0,96 2,52±0,66 1,74±0,55 2,46±1,99 7,46±2,26 0,68±0,89 0,01±0,03 78,74±2,13
Ovarektomie (24 Monate) 4,63e±1,45 3,34±1,18 2,01±1,30 1,94±1,40 10,07±3,07 0,21±0,26 0,00±0,00 77,80±4,32
3 Ergebnisse 59
3.1.3 Anteil der Fettvakuolen am Zytoplasmavolumen der Sternzellen Das Verhältnis von Fettvakuolen und Zytoplasma in den Sternzellen wurde bestimmt,
indem durch streng zufälliges Auflegen eines Punkterasters diejenigen Punkte gezählt
wurden, die auf die beiden zu bestimmenden Parameter fielen. Dabei ergab sich das in
der Tabelle 5.2 dargestellte Ergebnis.
Bei der 24 Monate alt gewordenen Kontrollgruppe konnten signifikant größere
Fettvakuolen als bei der gleichaltrigen Hauptgruppe (9 bis 27 Monate), welche die Tiere
mit ausgebildetem hepatozellulärem Karzinom beinhaltet, festgestellt werden
(Verhältnis von 0,64 bzw. 0,29). Ebenso verhielt es sich bei der oben genannten
Kontrollgruppe im Vergleich zu der Kontrollseite der 3 Monate alten Hauptgruppe
(0,64 bzw. 0,53).
Vergrößerte Fettvakuolen ergaben sich ebenfalls bei der Gegenüberstellung der linken
Leberhälfte (Kontrollseite) und der transplantierten rechten Leberhälfte bei der 3
Monats-Hauptgruppe im Verhältnis von 0,53 bzw. 0,36, genauso wie beim Vergleich
der 24 Monats-Kontrolltiere und der 6 Monats-Kontrolltiere (0,64 bzw. 0,45).
Tabelle 5.2-Mittelwerte und Standardabweichungen des Verhältnisses von
Fettvakuolen und Zytoplasma in den Sternzellen
a = p<0,05 gegenüber Hauptgruppe (3 Monate, Kontrollseite)
b = p<0,05 gegenüber Kontrollgruppe (24 Monate)
Tier Mittelwert und Standardabweichung des Verhältnisses
Hauptgruppe (3 Monate) Transplantation 0,36±0,11 a
Kontrollseite 0,53±0,04 b
HCC nach Ovartransplantation 0,29±0,22 b
Kontrollgruppe (6 Monate) 0,45±0,08 b
Kontrollgruppe (24 Monate) 0,64±0,08
Ovarektomie (6 Monate) 0,54±0,06
3 Ergebnisse 60
3.1.4 Mittlere Größe der Fettvakuolen der Sternzellen Mit der bereits im Methodenteil beschriebenen l0
3-Methode nach Gundersen wurden die
durchschnittlichen Volumina der Fettvakuolen der Sternzellen abgeschätzt und
relevante Versuchstiergruppen miteinander verglichen.
Bei dem Verfahren wurde mithilfe des T-Testes das durchschnittliche Volumen
folgender Gruppen gegeneinander getestet:
HCC nach Ovartransplantation vs. Kontrollgruppe 24 Monate
Hauptgruppe 3 Monate transplantierte rechte Leberhälfte vs. linke Leberhälfte (Kontrollseite)
Hauptgruppe 3 Monate Kontrollseite vs. Kontrollgruppe 24 Monate
Kontrollgruppe 6 Monate vs. Kontrollgruppe 24 Monate
Kontrollgruppe 6 Monate vs. Ovarektomie 6 Monate
Die Ergebnisse der Bestimmungen sind in Tabelle 5.3. dargestellt.
Der T-Test ergab in keinem Fall einen statistisch signifikanten Unterschied, da die
Irrtumswahrscheinlichkeiten nicht p< 0,05 waren. Der subjektive Eindruck über die
unterschiedlich großen Fettvakuolen in den verschiedenen Gruppen konnte demnach
nicht objektiviert werden.
Tabelle 5.3-Ergebnisse der l03-Methode nach Gundersen
Tier Mittelwert und Standardabweichung der Fettvakuolenvolumina der Sternzellen
Hauptgruppe (3 Monate) Transplantation 1,87±0,99
Kontrollseite 3,14±0,93
HCC nach Ovartransplantation 1,98±1,21
Kontrollgruppe (6 Monate) 1,98±0,50
Kontrollgruppe (24 Monate) 2,38±0,56
Ovarektomie (6 Monate) 2,04±0,31
3 Ergebnisse 61
Abbildung 5.5-Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Sternzelle (Hauptgruppe mit Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms; 19 Monate)
Man erkennt eine Sternzelle, die unter einem noch fenestrierten Endothel liegt. Sichtbar sind der Verlust der Fetttropfen sowie eine Vermehrung von Golgi-Apparat und endoplasmatischem Retikulum. Die Hepatozyten zeigen eine Verplumpung ihrer Mikrovilli.
Vergrößerung: x7000
3 Ergebnisse 62
3.2 Immunhistochemische Untersuchungen
An H.E.- und PAS-gefärbten Schnittpräparaten konnten die verschiedenen Herdtypen
und hepatozellulären Adenome und Karzinome klassifiziert und für die
immunhistochemischen Färbungen ausgewählt werden. Die immunhistochemischen
Darstellungen der Rezeptoren und Antigene erfolgte mithilfe der im Methodenteil
beschriebenen polyklonalen Antikörper. Die Spezifität der erzielten Farbreaktion konnte
belegt werden, indem der Primärantikörper in Parallelschnitten durch RPMI ersetzt
wurde und in diesen Fällen keine Färbungen auftraten.
3.2.1 Beurteilung der Farbreaktion und Lokalisation von TNF α in ovartransplantierten Rattenlebern
Die immunhistochemischen Versuche mit dem Antikörper TNF α (M-18) resultierten in
einer membranständigen und intrazytoplasmatisch gelegenen Reaktion, wobei mit der
Bezeichnung „membranständig“, auch im Folgenden, eine Farbreaktion der
Plasmamembran gemeint ist. Lichtmikroskopisch war es nicht möglich, den Begriff
„intrazytoplasmatisch“ genauer zu definieren, die Färbung erstreckt sich zum Teil
körnig über die ganze Zellfläche mit Ausnahme des Zellkerns.
Eine intrazytoplasmatische Farbreaktion wurde in den Nichtparenchymzellen
(Kupfferzellen, Makrophagen, Sternzellen, Endothelzellen) und den Hepatozyten
beobachtet, membranständig ergab sich nur ein positives Ergebnis bei den
Kupfferzellen, Sternzellen und Makrophagen. In Hepatozyten der präneoplastischen
Areale und hepatozellulären Tumoren ergab sich zum Teil auch eine Reaktion in den
Zellkernen.
Beim Vergleich von veränderten und nicht veränderten Hepatozyten ergaben sich keine
Unterschiede in der Farbreaktion, so dass man davon ausgehen kann, dass sich die
Produktion von TNF α in Tumor- und Normalgewebe nicht unterscheidet.
Versuchstiere mit Ausbildung einer ausgeprägten Steatosis hepatis (24 Monate alt
gewordene Tiere) zeigten eine deutliche Braunfärbung in der unmittelbaren Umgebung
der Fetttropfen. Diese Reaktion wurde als klar spezifisch bewiesen, indem das Fett
durch 20minütige Vorbehandlung mit 50°C warmem Xylol bzw. Äther herausgelöst
wurde und die Färbung trotzdem persistierte. Daraus kann man schließen, dass der
Antikörper spezifisch an das Zytoplasma der Umgebung der Lipidtropfen und nicht an
das Fett selbst bindet.
3 Ergebnisse 63
In hepatozellulären Karzinomen wird TNF α hauptsächlich in den Tumorzellen und den
nekrotischen Zellen nachgewiesen, während in cholestatischen Teilen der Leber eine
erhöhte Konzentration von TNF α vor allem in kleinen Gallengängen und Kupfferzellen
beobachtet werden konnte.
Abbildung 5.6-Lichtmikroskopische Aufnahmen von Farbreaktionen von TNF α in ovartransplantierten Rattenlebern
(A) Kontrollgruppe (6 Monate) Man sieht die ausgeprägte Expression von TNF α in den Makrophagen und Kupfferzellen (Pfeil), ansonsten eine eher schwache Reaktion der Hepatozyten und übrigen Nichtparenchymzellen. (B) Kontrollgruppe (6 Monate; ohne Primärantikörper) Hierbei handelt es sich um die Negativkontrolle zum Versuchstier des Fotos (A). (C) Kontrollgruppe (24 Monate) Die Aufnahme zeigt eine positive Farbreaktion der Fettvakuolenumgebung (Pfeil), welche sich als durchgehender Befund in allen Versuchstieren mit Entwicklung einer Steatosis hepatis darstellt. (D) Ovarektomie (24 Monate) Hier ist eine nukleäre Expression von TNF α zu sehen sowie eine ausgeprägt positive Farbreaktion der Fettvakuolenumgebung. Ansonsten zeigt sich kein Unterschied im Reaktionsmuster im Vergleich zu den gleichaltrigen Kontrolltieren.
Vergrößerung: Länge der unteren Bildkante (A) (B) (C) (D) 203μm
A B
C D
3 Ergebnisse 64
Abbildung 5.7-Lichtmikroskopische Aufnahmen von Farbreaktionen von TNF α in ovartransplantierten Rattenlebern
(A) Kontrollgruppe (6 Monate) Das Foto zeigt eine intrazytoplasmatisch gelegene Farbreaktion der Nichtparenchymzellen (Kupfferzellen, Makrophagen, Sternzellen, Endothelzellen) sowie der Hepatozyten. Membranständig sieht man lediglich ein positives Ergebnis an Kupfferzellen, Sternzellen und Makrophagen. (B) Hauptgruppe (3 Monate; transplantierte rechte Leberhälfte) Zu sehen ist ein Ovartransplantat in der linken Bildhälfte, eingebettet in die Leber. Das angrenzende Lebergewebe erscheint geringgradig präneoplastisch verändert. (C) Hauptgruppe (3 Wochen; transplantierte rechte Leberhälfte) Man erkennt eine deutliche Reaktion der Kupfferzellen in dem an das Transplantat grenzenden Lebergewebe. (D) Hauptgruppe (3 Monate; transplantierte rechte Leberhälfte) In der Aufnahme ist der Übergang zum hepatozellulären Karzinom zu sehen. Die Hepatozyten sind in breiten Trabekeln angeordnet und ausgeprägt verändert, erkennbar an atypischen Zellkernformen, in Zahl und Größe abnormen Nukleoli und zugunsten des Zellkerns verschobenen Kern-Plasma-Relationen. (E) HCC nach Ovartransplantation (24 Monate) Man sieht TNF α sowohl zytoplasmatisch und membranös, als auch nukleär in den Hepatozyten angefärbt. Es handelt sich bei dieser Abbildung um ein Versuchstier mit ausgebildetem, hoch differenzierten hepatozellulären Karzinom. (F) HCC nach Ovartransplantation (24 Monate) Die Abbildung zeigt ein hoch differenziertes hepatozelluläres Karzinom mit deutlich angefärbten Mesenchymzellen (zerfallene Makrophagen, Fibroblasten) (Pfeil) und extrazellulärer Matrix.
Vergrößerung: Länge der unteren Bildkante (A) 203μm; (B) (D) (E) (F) 406μm; (C) 812μm
A B
C D
E F
3 Ergebnisse 65
3.2.2 Beurteilung der Farbreaktion und Lokalisation von TNF-R1 in ovartransplantierten Rattenlebern
Die immunhistochemischen Farbreaktionen des Antikörpers TNF-R1 (E-20) ergaben
sowohl granulär im Zytoplasma von Kupffer-, Stern- und Endothelzellen sowie
Hepatozyten ein positives Ergebnis, als auch membranös an der basalen Seite der
Hepatozyten. In Gallengangsepithelien war nur eine schwache bis keine Farbreaktion
vorhanden, die Entzündungszellen imponierten völlig negativ. In verfetteten
Hepatozyten ergab sich im Vergleich zu nicht verfetteten Zellen eine deutlich stärkere
Reaktion, welche auch hier, wie in Kapitel 5.2.1. beschrieben, als spezifische Färbung
bewiesen wurde. In einigen Präparaten wurde eine deutliche Zonierung der
Farbverteilung beobachtet, wobei die Reaktion in Zone 1 schwächer ausgeprägt war als
in Zone 2 und 3. Dies ist wiederum ein Beweis für die Spezifität der durchgeführten
immunhistochemischen Farbreaktionen.
Bei Tieren mit Entwicklung von hepatozellulären Karzinomen zeigten einige Zellkerne
eine deutlich positive Reaktion sowie diejenigen Hepatozyten, die sich in der Aufnahme
von extrazellulärem Material befanden. Zusammenfassend kann man sagen, dass die
Farbreaktionen in den präneoplastischen Arealen bzw. den hepatozellulären Tumoren
gegenüber den nicht veränderten Azini überwiegen.
Im Transplantat wurde an der Gefäßoberfläche keine Farbreaktion beobachtet.
3 Ergebnisse 66
Abbildung 5.8-Lichtmikroskopische Aufnahmen von Farbreaktionen von TNF-R1 in ovartransplantierten Rattenlebern
(A) Kontrollgruppe (6 Monate) Man sieht die basalseitige Farbreaktion der Hepatozytenmembranen. Stark gefärbt sind außerdem die Kupffer- und Mesenchymzellen (Pfeil). (B) Kontrollgruppe (24 Monate) Auffällig ist hier die deutliche Reaktion der Fettvakuolenumgebung in den verfetteten Arealen (Pfeil). (C) Hauptgruppe (3 Monate; transplantierte rechte Leberhälfte) In der linken Bildhälfte ist ein Transplantat zu erkennen, in dem die Thekazellen auffällig braun imponieren. Das Lebergewebe der rechten Bildhälfte zeigt präneoplastisch veränderte Hepatozyten mit verstärkter intrazytoplasmatischer und membranöser Farbreaktion. (D) Hauptgruppe (3 Wochen; transplantierte rechte Leberhälfte) Man erkennt verändertes Lebergewebe mit zentral gelegenem Portalfeld. Die präkanzerösen Veränderungen zeigen sich anhand von vergrößerten und atypisch imponierenden Zellkernen, vergrößerten und vermehrten Nukleoli sowie Mitosen. (E) HCC nach Ovartransplantation (24 Monate) Auf dem Foto ist ein hochdifferenziertes hepatozelluläres Karzinom mit trabekulärem Wachstum dargestellt. Die Braunfärbung zeigt eine auffällige Heterologie innerhalb des dargestellten Gewebes sowie eine Verstärkung in verfetteten Arealen. (F) Hauptgruppe (3 Monate; transplantierte rechte Leberhälfte; ohne Primärantikörper) Man erkennt das an das Transplantat grenzende veränderte Lebergewebe mit vereinzelten Mitosen. Der Primärantikörper wurde hier durch RPMI ersetzt.
Vergrößerung: Länge der unteren Bildkante (A) (B) 203μm; (C) (D) (F) 406μm; (E) 812μm
A B
C D
E F
3 Ergebnisse 67
3.2.3 Beurteilung der Farbreaktion und Lokalisation von c-Met in ovartransplantierten Rattenlebern
Die immunhistochemische Farbreaktion des Antikörpers c-Met (C-28) zeigt sich
intrazytoplasmatisch und membranös in den Hepatozyten sowie in Versuchstieren mit
Ausbildung eines hepatozellulären Karzinoms auch in den Zellkernen der Leberzellen.
Die nukleäre Reaktion des Antikörpers warf nicht zu beantwortende Fragen auf, da die
Färbung zum Teil sehr deutlich auftrat, aber in direkt benachbarten morphologisch
ähnlichen Tumorgebieten völlig negativ war.
Bei Versuchstieren mit präneoplastischen Foci waren die veränderten Hepatozyten um
das Transplantat herum schwächer angefärbt als die unveränderten extrafokal gelegenen
Hepatozyten.
Bei Versuchstieren in fortgeschrittenem Lebensalter ergaben sich nachfolgende
Besonderheiten: die Farbreaktion der Zellmembranen stellte sich hier abgeschwächt dar.
Außerdem fand sich wiederum eine ausgeprägte Steatosis hepatis, welche jedoch in der
Färbung der Umgebung der Fettvakuolen nicht so deutlich imponierte wie nach Zugabe
der Antikörper TNF α oder TNF-R1.
3 Ergebnisse 68
Abbildung 5.9-Lichtmikroskopische Aufnahmen von Farbreaktionen von c-Met in ovartransplantierten Rattenlebern
(A) Kontrollgruppe (6 Monate) Die Braunfärbung befindet sich zytoplasmatisch und membranös in den Hepatozyten sowie in den Kupfferzellen (Pfeil). Die membranständige Granulierung der Hepatozyten spiegelt die Internalisierung des Rezeptors wider. (B) (48 Stunden nach der Gabe von Tetrachlorkohlenstoff) Man erkennt ausgeprägt positive Stern- und Mesenchymzellen sowie angefärbte Zellkerne in den Stern- und den vitalen Zellen. Die Farbreaktion in den nekrotischen Arealen (links oben) ist deutlich schwächer als in den vitalen Bereichen (rechts unten). (C) Hauptgruppe (3 Wochen; transplantierte rechte Leberhälfte) Auf dem Foto sieht man veränderte Hepatozyten mit intrazytoplasmatischer und membranöser Reaktion. Vereinzelt erkennt man deutlich angefärbte Zellkerne der Leberzellen (Pfeil). (D) Hauptgruppe (3 Monate; transplantierte rechte Leberhälfte) Die Abbildung zeigt oben rechts ein Transplantat und angrenzendes präneoplastisch verändertes Lebergewebe.
Vergrößerung: Länge der unteren Bildkante (A) 203μm; (B) (C) 406μm; (D) 812μm
A B
C D
3 Ergebnisse 69
Abbildung 5.10-Lichtmikroskopische Aufnahmen von Farbreaktionen von c-Met in ovartransplantierten Rattenlebern
(A) Ovarektomie (24 Monate) Man erkennt die intrazytoplasmatisch und membranös gelegene Reaktion der Hepatozyten, wobei letztere abgeschwächt im Vergleich zu den hier nicht abgebildeten 6 Monate alten Versuchstieren ist. (B) Ovarektomie (24 Monate; ohne Primärantikörper) Das Foto zeigt die Negativkontrolle zum Versuchstier des Fotos (A). (C) Hauptgruppe (3 Wochen; transplantierte rechte Leberhälfte) Oben links befindet sich ein Transplantat und angrenzend präneoplastisch verändertes Lebergewebe. Im Transplantat sind einige Zellkerne angefärbt, die Braunfärbung des veränderten Lebergewebes unterscheidet sich nicht zu den hier nicht abgebildeten extrafokalen Bereichen. (D) Hauptgruppe (3 Monate; transplantierte rechte Leberhälfte) Das Foto zeigt einen Bereich des präneoplastisch veränderten Gewebes mit Mitosen (Blockpfeil) und einigen deutlich angefärbten Zellkernen (Pfeil). Außerdem befindet sich die Expression membranös und intrazytoplasmatisch in den Hepatozyten. (E) Kontrollgruppe (24 Monate) Diese Abbildung ist ein Beispiel für eine schwächere Reaktion älterer Versuchstiere. (F) HCC nach Ovartransplantation (24 Monate) Die Hepatozyten des hepatozellulären Karzinoms sind in breiten Trabekeln angeordnet. Man sieht die deutliche Farbreaktion der Zellkerne (Pfeil).
Vergrößerung: Länge der unteren Bildkante (A) (B) (D) 203μm; (C) (E) (F) 406μm
A B
C D
E F
3 Ergebnisse 70
3.2.4 Beurteilung der Farbreaktion und Lokalisation von HGF in ovartransplantierten Rattenlebern
Da die angefertigten immunhistochemischen Farbreaktionen trotz Verwendung
mehrerer Primär- als auch Sekundärantikörper in verschiedensten Konzentrationen und
Vorbehandlungen an Paraffin- und Kryostatgeweben (siehe Kapitel 4.1.4) keine
zufriedenstellenden Ergebnisse erbrachten, wurden weitere Experimente mit diesem
Antikörper am vorliegenden Material eingestellt.
3.2.5 Tabellarische Übersicht: TNF α, TNF-R1 und c-Met im Verlauf des Karzinogeneseprozesses
Eigenschaften TNF α TNF-R1 c-Met
membranständige Reaktion
Kupfferzellen
Sternzellen
Makrophagen
Hepatozyten (basalseitig) Hepatozyten
intrazytoplasmatische Reaktion
Kupfferzellen
Sternzellen
Endothelzellen
Makrophagen
Hepatozyten
Kupfferzellen
Sternzellen
Endothelzellen
Hepatozyten
Hepatozyten
Farbreaktion in Zellkernen
Hepatozyten der präneoplastisch veränderten Arealen
Hepatozyten der Versuchstiere mit Ausbildung eines HCC´s
Hepatozyten der Versuchstiere mit Ausbildung eines HCC´s
Farbreaktion im Normalgewebe
keine Unterschiede Farbreaktion in veränderten Arealen ausgeprägter als im Normalgewebe
Hepatozyten deutlicher angefärbt
Farbreaktion im präneoplastisch veränderten Geweben
Hepatozyten schwächer angefärbt
Farbreaktion im Karzinomgewebe
keine Unterschiede
Besonderheiten bei Versuchstieren mit fortgeschrittenem Lebensalter
ausgeprägte Farbreaktion der zytoplasmatischen Umgebung der Fettvakuolen
ausgeprägte Farbreaktion der zytoplasmatischen Umgebung der Fettvakuolen
membranständige Farbreaktion schwächer als bei jüngeren Versuchstieren
4 Diskussion 71
4 Diskussion
Das Ziel dieser Arbeit war eine Untersuchung der Effekte natürlicher Ovarhormone,
produziert durch transplantierte Ovarfragmente auf die Leber hinsichtlich
elektronenmikroskopischer Morphologie und der Mitwirkung von TNF α und HGF
sowie deren Rezeptoren auf den Karzinogeneseprozess. Da in vorangegangenen
Arbeiten bereits die Auswirkungen auf die Hepatozyten untersucht wurden [62], wurde
im vorliegenden Projekt der Fokus auf die Nicht-Parenchymzellen der Leber wie die
Kupffer-, Stern- und Endothelzellen gelegt.
4.1 Bewertung der unterschiedlichen zellulären Zusammensetzung von veränderten und unveränderten Leberazini
Gemäß einer Studie von Blouin et.al. aus dem Jahre 1977 beträgt die Volumendichte
der Nichtparenchymzellen von Rattenlebern 6,3 %, während die Hepatozyten 77,8 %
einnehmen und der Rest auf die Sinusoide (10,6 %), den Dissé-Raum (4,9 %) und die
Gallekanalikuli (0,43 %) entfällt. Die Volumenanteile der Nichtparenchymzellen teilen
sich wiederum auf die Endothelzellen mit 2,8 %, die Kupfferzellen (2,1 %) und mit 1,4
% auf die Sternzellen auf [154]. Die Werte, die in dieser Studie für unveränderte
Leberazini von Rattenlebern ermittelt werden konnten, bestätigen die gewonnenen
Ergebnisse der Kontrollgruppen (6 und 24 Monate) sowie der Kontrollseiten der
Hauptgruppentiere (3 Wochen und 3 Monate) ausnahmslos (siehe Tabelle 5.1).
Demnach kann bezüglich der volumetrischen Zusammensetzung der unveränderten
Azini eine typische Verteilung festgestellt werden.
Da die Endothelzellen der Kontrollgruppe (6 Monate) im Vergleich zu der
Kontrollgruppe (24 Monate) deutlich mehr Volumen einnehmen, kann man vermuten,
dass das Alter der Tiere Einfluss auf das Zellwachstum nehmen könnte. Auch Le
Couteur et al. sowie Ito et al. haben diesen Sachverhalt im Jahre 2001 bzw. 2007
beschrieben, indem sie in elektronenmikroskopischen Auswertungen von Rattenlebern
eine Dickenzunahme der Endothelzellen mit zunehmendem Alter der Tiere feststellen
konnten [155-157]. Allerdings haben die Arbeitsgruppen lediglich die Zellen
hinsichtlich ihrer zweidimensionalen Morphologie bestimmt, während ich das Volumen
und damit die Dreidimensionalität gemessen habe. Die Hauptgruppe (3 Wochen,
4 Diskussion 72
transplantierte Leberhälfte) zeigt gegenüber der Hauptgruppe (3 Wochen, Kontrollseite)
erhöhte Endothelzellvolumina, ebenso wie die Kontrollgruppe (6 Monate) gegenüber
der ovarektomierten Tiergruppe (6 Monate). Daraus könnte man ableiten, dass die Höhe
der Ovarhormonkonzentration die Größe der Endothelzellen beeinflusst, da das
Volumen der Endothelzellen mit zunehmender Konzentration der Ovarhormone
zuzunehmen scheint. Dieser Sachverhalt wurde bereits im Jahre 1976 von Widmann
et.al. beschrieben, indem in Östrogen-getriggerten weiblichen Rattenlebern eine starke
Proliferation der Endothelzellen beobachtet werden konnte [158]. Eine signifikante
Zunahme der Endothelzellvolumina der transplantierten Hauptgruppe (3 Wochen) im
Vergleich zu der intraindividuellen Kontrollseite konnte ebenfalls in dem im
Einleitungsteil beschriebenen Modell der Pankreasinselzelltransplantation in
Rattenlebern zwischen den veränderten und unveränderten Azini ermittelt werden [54].
Das Volumen der Sternzellen zeigt sich in den Azini des hepatozellulären Karzinoms
signifikant gegenüber der 24 Monate alten Kontrollgruppe vermindert. Im Vergleich
hierzu fanden sich im Modell der Pankreasinselzelltransplantation keine signifikanten
Veränderungen der Sternzellvolumina in der Gegenüberstellung von veränderten und
unveränderten Azini [54]. Ebenfalls kommen die Sternzellen in der 6 Monate alten
Kontrollgruppe im Vergleich zu der gleichaltrigen ovarektomierten Tiergruppe mit
signifikant vermindertem Volumen zur Darstellung. Anhand dessen könnte man
vermuten, dass die Sternzellen umso weniger Volumen einnehmen, je höher die
einwirkende Konzentration von Ovarhormonen ist. Die Sternzellen verhalten sich unter
Einfluss von Ovarhormonen scheinbar genau umgekehrt wie die Endothelzellen.
Yasuda et.al. beobachteten im Jahr 1999 an mit Estradiol versetzten, in Kultur
befindlichen Sternzellen der Ratte eine dosisabhängige Abnahme der Anzahl der
Sternzellen. Somit konnte dem Hormon Estradiol ein inhibitorischer Effekt auf die
Proliferation und Transformation von Sternzellen in den Myofibroblasten-ähnlichen
Zelltyp und damit eine Verminderung von Fibrose und Zirrhose der Leber
nachgewiesen werden [159]. Dies passt sehr gut zu den eigenen Ergebnissen.
Leberfibrosen oder gar Zirrhosen haben sich nach der Ovartransplantation nicht
entwickelt.
Aufgrund der volumetrischen Verkleinerung des Dissé-Raums beim Vergleich der
ovarektomierten Tiergruppen im Alter von 6 Monaten und 24 Monaten ist zu
4 Diskussion 73
diskutieren, ob ein zunehmendes Alter des Organs zulasten der Größe des Dissé-Raums
gehen könnte. Dagegen sprechen jedoch Beobachtungen der Arbeitsgruppe Cogger et
al., die Rattenlebern mit Hydrogenperoxid versetzten und in der Folge deren
Ultrastruktur diagnostizierten. Hierbei zeigte sich unter anderem eine Zunahme des
Volumens des Dissé-Raums, welche hier als Folge des oxidativen Stresses gewertet
wurde, ebenso aber auch mit zunehmendem Alter auftreten kann [160].
Da der Zellzwischenraum der HCC-Tiere statistisch weniger Volumen als das der
Hauptgruppe 3 Wochen nach Transplantation einnimmt, könnte man vermuten, dass ein
Tumorwachstum zulasten des Volumens des Zellzwischenraums gehen könnte. Auch
im Modell der Pankreasinselzelltransplantation in Rattenlebern konnte eine signifikante
volumetrische Abnahme des Extrazellularraums in den veränderten Azini beobachtet
werden. In diesem Modell beinhaltet der Begriff „Extrazellularraum“ jedoch neben den
Zellzwischenräumen zusätzlich Sinusoide und Disseräume [54].
Bei Betrachtung der Kupfferzellvolumina fanden sich im vorliegenden Modell keine
statistisch signifikanten Unterschiede. In der Literatur ist eine Abnahme der
Kupfferzellen in hepatozellulären Karzinomen beschrieben [161]. Warum zumindest in
der Hauptgruppe mit Auftreten eines HCC´s keine Veränderungen der Kupfferzellen
aufgetreten sind, bleibt unklar. Auch im bereits beschriebenen Modell der
Pankreasinselzelltransplantation konnte eine Abnahme der Kupfferzellvolumina
beobachtet werden [54].
Das Volumen der Hepatozyten hat sich in keiner Tiergruppe signifikant verändert, auch
nicht in derjenigen Hauptgruppe nach Ovartransplantation mit Entwicklung von
hepatozellulären Karzinomen. Warum in dieser Gruppe und in präneoplastisch
veränderten Azini transplantierter Tiere keine Volumenzunahme der Hepatozyten
beobachtet werden konnte, bleibt offen. Im Gegensatz dazu konnte im Modell der
Pankreasinselzelltransplantation in Lebern diabetischer Ratten eine signifikante
Zunahme der Hepatozytenvolumina in den veränderten Azini im Vergleich zu
unveränderten vermerkt werden [54].
4 Diskussion 74
4.2 Bewertung der Morphologie der Sternzellen
4.2.1 Anteil der Fettvakuolen am Zytoplasmavolumen der Sternzellen Bei der 24 Monate alt gewordenen Kontrollgruppe konnten signifikant größere
Fettvakuolen als bei der gleichaltrigen transplantierten Gruppe (9 bis 27 Monate) mit
Ausbildung eines hepatozellulären Karzinoms beobachtet werden. Ebenso verhielt es
sich bei der oben genannten Kontrollgruppe im Vergleich zu der Kontrollseite der 3
Monate alten Hauptgruppe. Vergrößerte Fettvakuolen ergaben sich auch bei der
Gegenüberstellung der linken Leberhälfte (Kontrollseite) und der transplantierten
rechten Leberhälfte bei der 3 Monats-Hauptgruppe, genauso wie beim Vergleich von 24
Monats-Kontrolltieren zu 6 Monats-Kontrolltieren.
Aufgrund dieser Ergebnisse bleibt zu diskutieren, ob die untransplantierten Tiergruppen
bzw. Leberhälften größere Fettvakuolen in den Sternzellen als transplantierte besitzen
und damit die erhöht einwirkende Konzentration an Ovarhormonen die
Fettvakuolenvolumina vermindern könnte. Hinlänglich bekannt ist der antifibrogene
Effekt einer natürlichen Konzentration von Estradiol auf die Leber und damit einer
Verhinderung der Transdifferenzierung der Sternzellen in den Myofibroblasten-
ähnlichen Zelltyp [159, 162]. Damit einher geht die Tatsache, dass die Fettvakuolen der
Sternzellen bei Östrogeneinwirkung eher zu- als abnehmen müssten, da die
Transdifferenzierung und damit die Fettvakuolenabnahme verhindert würde. Diese von
Yasuda et al. beschriebene Tatsache würde die Ergebnisse des Experimentes nicht
erklären, es bleibt aber zu diskutieren, ob die hier erhöhte und lokal einwirkende
Konzentration von Ovarhormonen zusätzliche oder gänzlich andere Effekte auf die
Sternzellen ausüben kann. Bekannt ist ebenfalls der gegensätzliche Effekt von
Progesteron auf die Sternzellen der Leber, indem letzteres Hormon die Sternzellen zu
aktivieren vermag und damit die Umwandlung in den Myofibroblasten-ähnlichen
Zelltyp beschleunigt werden würde [162]. Man könnte also vermuten, dass hier die
Progesteron- der Östrogenkonzentration überwiegt und damit die Fettvakuolenvolumina
vermindert werden. Eine Einflussnahme von Insulin im Modell der
Pankreasinselzelltransplantation in Rattenlebern zeigen keine statistisch signifikanten
Änderungen der Fettvakuolenvolumina im Vergleich zwischen präneoplastischen
Arealen bzw. hepatozellulären Tumoren und unveränderten Azini [54].
4 Diskussion 75
Außerdem zeigen die hier vorliegenden Ergebnisse, dass bei den älteren Tieren
signifikant größere Fettvakuolenanteile als bei jüngeren Tieren beobachtet werden
können. Dieser Sachverhalt wurde ebenfalls durch andere Arbeitsgruppen bestätigt
[155, 163]. Auch im Modell der Pankreasinselzelltransplantation fand sich eine
Zunahme der relativen Volumendichte der Lipidtropfen mit Fortschreiten des
Experiments sowohl in den veränderten, als auch den unveränderten Azini. Diese
Zunahme in der Volumendichte wurde von einem korrespondierenden Anstieg des
durchschnittlichen Volumens des einzelnen Fetttropfens begleitet [54]. Zusätzlich
wurden von Vollmar et al. eine erhöhte Vitamin A-Autofluoreszenz in den Sternzellen
älterer Versuchstiere im Vergleich zu jüngeren beobachtet [164]. Da Vitamin A in den
Lipidvakuolen gespeichert wird, bedeutet dieser Sachverhalt lichtmikroskopisch
vergrößerte bzw. vermehrte Fettvakuolen. Diese Veränderungen können nicht mit einer
erhöhten Aktivierung der Zellen begründet werden, da die sogenannte
Transdifferenzierung und damit Aktivierung mit einer Abnahme der Fettvakuolen
einhergehen würde [155].
4.2.2 Mittlere Größe der Fettvakuolen der Sternzellen Beim Vergleich der mittleren Größe der Fettvakuolen mittels der l0
3-Methode nach
Gundersen zwischen den verschiedenen Tiergruppen ergaben sich in keinem Fall
statistisch signifikante Unterschiede. Der zuvor geäußerte subjektive Eindruck über die
unterschiedlich großen Fettvakuolen in den verschiedenen Gruppen konnte demnach
nicht objektiviert werden. Im Modell der Pankreasinselzelltransplantation in Lebern
diabetischer Ratten zeigte sich eine Zunahme der Volumendichte der Fetttropfen,
welche von einem korrespondierenden Anstieg des durchschnittlichen Volumens des
einzelnen Fetttropfens sowohl in veränderten wie unveränderten Azini begleitet wurde
[54]. Ob die unterschiedlichen Hormone für die verschiedenen Zellveränderungen
verantwortlich sind, bleibt zu diskutieren.
4 Diskussion 76
4.3 Bewertung der immunhistochemischen Untersuchungen
Die Immunhistochemie ist eine präzise Methode, um eine antigene Substanz im
Gewebe nachzuweisen und zu lokalisieren. Die Menge oder der Gehalt eines
bestimmten Antigens kann damit zwar nicht genau bestimmt werden, deutliche
Unterschiede in der Expressionsintensität und im Verteilungsmuster zwischen
verschiedenen Präparaten können aber durchaus semiquantitativ erfasst werden.
Aus technischen Gründen ist es nicht möglich, alle miteinander zu vergleichenden
Präparate in einem Durchgang zu färben. Tissue-Mikro-Arrays, bei denen kleine
Gewebestanzen aus Tumorproben in einen neuen Paraffinblock gegossen werden,
waren in diesem Experiment nicht sinnvoll, da die präneoplastischen Leberherde sehr
klein waren und der topographische Zusammenhang zum Transplantat in einem Mikro-
Array nicht sichtbar gewesen wäre. Um auswertbare und reproduzierbare Resultate zu
erhalten, braucht es deshalb eine exakte Arbeitsweise und nahezu konstante äußere
Bedingungen.
Trotzdem kommt es vor, dass sich Präparate im selben Arbeitsgang unterschiedlich
stark bzw. unregelmäßig anfärben und Hintergrundreaktionen auftreten. Dies ist ein
bekanntes Problem in der Immunhistochemie (siehe Bönisch T., 2003, Handbuch
immunhistochemische Färbemethoden). Die am häufigsten vorkommenden Ursachen
für Hintergrundreaktionen und Unregelmäßigkeiten sind hydrophobe, ionische und
elektrostatische Wechselwirkungen sowie endogene Enzymaktivitäten.
4.3.1 TNF α Im Allgemeinen ist beim immunhistochemischen Nachweis von TNF α eine
intrazytoplasmatisch gelegene Reaktion zu erwarten. Die ebenfalls beobachtete
membranständige Farbreaktion lässt sich mit einer gerade in Verbindung mit seinem
Rezeptor befindlichen Molekül erklären.
Eine intrazytoplasmatische Reaktion wurde in den Kupfferzellen, Makrophagen,
Sternzellen, Endothelzellen und Hepatozyten beobachtet. Dies stimmt, mit Ausnahme
der Sternzellen, mit den Angaben in der Literatur überein [87-90]. Lediglich
Thirunavukkarasu et al. beschreiben, dass Sternzellen TNF α sowohl im ruhenden als
auch aktivierten Zustand produzieren können [165], in den meisten Literaturangaben
werden die Sternzellen jedoch nicht als TNF α-Produzent beschrieben.
4 Diskussion 77
Beim Vergleich präneoplastisch veränderter und unveränderter Azini ergaben sich keine
Unterschiede in der Farbreaktion, so dass man davon ausgehen kann, dass sich die
Produktion von TNF α hier nicht unterscheidet. Hinlänglich ist in der Literatur die
Schlüsselrolle von TNF α in der Leberregeneration und Förderung der Proliferation
bekannt. Auch in Hepatitis B- und C-infizierten Lebern zeigt sich eine Erhöhung der
TNF α-Levels [166, 167]. Zusätzlich fanden Shiraki et al. in zirrhotischen
Patientenlebern eine signifikante Erhöhung von TNF α-Leveln im Vergleich zu einer
Kontrollgruppe [168]. Im Gegensatz hierzu beschrieben Cheng et al. beim Vergleich
von gesunden Patienten, Patienten mit Leberzirrhose und Patienten mit einem
hepatozellulären Karzinom die höchsten TNF α-Werte in der Kontrollgruppe, mittlere
Werte in den Lebern mit Ausbildung eines HCC´s und die niedrigsten Levels in der
Zirrhose-Gruppe [169]. Demnach scheinen die Ergebnisse in der Literatur äußert
unterschiedlich zu sein.
24 Monate alt gewordene Versuchstiere mit ausgeprägter Steatosis hepatis zeigten eine
deutliche Farbreaktion in der unmittelbaren Umgebung der Lipidtropfen, welche als klar
spezifisch nachgewiesen werden konnte. Feingold et al. berichteten schon im Jahre
1987 von einer signifikant stimulierten hepatischen Lipidsynthese in Ratten nach Gabe
von rekombinantem humanen TNF [170]. Daher scheinen eine Hyperlipidämie und eine
vermehrte Produktion von Triglyceriden in der Leber mit erhöhten TNF-Werten
einherzugehen und erklären die beobachteten Färbeeigenschaften der beschriebenen
Schnitte. Zusätzlich ist eine höhere TNF-Produktion in älteren Ratten im Vergleich zu
jungen Tieren beschrieben [171]. Da es sich in diesem Fall um 24 Monate alt
gewordene Versuchstiere handelt, könnte auch der Aspekt des fortgeschrittenen Alters
in dem beschriebenen Färbeverhalten eine Rolle gespielt haben.
In Versuchstieren mit Ausbildung eines hepatozellulären Karzinoms wird TNF α
hauptsächlich in den Tumorzellen und den nekrotischen Zellen nachgewiesen.
Hepatozelluläre Karzinome entstehen in den meisten Fällen in chronisch entzündeten
Lebern, induziert durch chronisch virale Hepatitiden, Autoimmunerkrankungen oder
andere ätiologische Faktoren. In diesen Fällen ist die Zytokinproduktion durch die
Entzündungszellen schon allein aufgrund der vorliegenden Entzündung erhöht.
Zusätzlich produzieren Tumorzellen reichlich Zytokine und Chemokine, welche weitere
Entzündungszellen, wie neutrophile und eosinophile Granulozyten sowie Makrophagen
4 Diskussion 78
anlocken, welche wiederum die Produktion von weiteren Zytokinen und Chemokinen,
wie TNF α, ermöglichen [172, 173]. So ist es zu erklären, dass TNF α sowohl aufgrund
des vorliegenden Tumorzellwachstums als auch in seiner Funktion als Apoptose- und
Nekrose-induzierender Faktor erhöht ist.
In cholestatischen Bereichen der Leber konnte eine erhöhte TNF α-Konzentration vor
allem in kleinen Gallengängen und Kupfferzellen nachgewiesen werden. Diese
Cholestase könnte durch die Östrogene, welche durch das transplantierte Ovargewebe
produzierten wurden, bedingt sein. Eine kanalikuläre, intrahepatische Cholestase,
ausgelöst durch die orale Einnahme von Kontrazeptiva ist bekannt und wird auf die
Wirkung des Östrogens zurückgeführt, während der genaue Mechanismus hierfür noch
unklar ist [174]. In der Literatur ebenfalls beschrieben ist eine durch erhöhtes
Vorkommen proinflammatorischer Zytokine wie TNF, IL-6 und IL-2 bedingte
Cholestase in der Leber. Im Gegensatz dazu resultiert auch eine operativ induzierte
biliäre Obstruktion in Mäusen und damit eine nachfolgende Cholestase mit Ikterus in
einer signifikanten Erhöhung proinflammatorischer Zytokine und einer Aktivierung von
Makrophagen. Damit sind sie als Schlüsselmediatoren einer Cholestase zu bezeichnen,
und das hier beschriebene erhöhte Vorkommen von TNF α in immunhistochemischen
Farbreaktionen erscheint plausibel [172, 175].
4.3.2 TNF-R1 Die immunhistochemischen Farbreaktionen des Antikörpers TNF-R1 ergaben sowohl
granulär im Zytoplasma von Kupfferzellen, Sternzellen, Endothelzellen und
Hepatozyten ein positives Ergebnis, als auch membranös an der basalen Seite der
Hepatozyten. Wie schon in der Einführung detailliert beschrieben, wird TNF-R1 auf
nahezu allen Zelloberflächen exprimiert, was mit den hier gemachten Beobachtungen
übereinstimmt. Die ebenfalls festgestellte zytoplasmatische Reaktion hängt mit der
Internalisierung des Rezeptors zusammen. Ebenfalls in der Einführung aufgeführt
werden die überwiegenden Expressionsorte des TNF-Rezeptors Typ 2, der mit dem hier
verwendeten Antikörper nicht erfasst wurde, in den Zellen des Immunsystems und den
Endothelzellen angegeben. Da in Gallengangsepithelien lediglich eine schwache bis
keine Farbreaktion vorhanden ist und die Entzündungszellen völlig negativ imponierten,
kann hier passend zu den Literaturangaben eine Expression des Rezeptors Typ 2
vermutet werden.
4 Diskussion 79
In Hepatozyten mit Vorliegen einer Steatosis ergab sich im Vergleich zu den nicht
verfetteten Zellen eine deutlich ausgeprägtere Reaktion. In der Literatur bekannt ist,
dass TNF α eine Schlüsselrolle im Verfettungsmechanismus der Alkohol-induzierten
Steatosis hepatis spielt. Dabei werden die Effekte überwiegend über den TNF-R1 und
nicht über den TNF-R2 vermittelt, welche das hier beobachtete Vorkommen in
verfetteten Hepatozyten erklären könnte [176, 177].
Eine fokal beobachtete positive Expression des Antikörpers in den Zellkernen der
Hepatozyten ist in der Literatur bislang nicht beschrieben, ebenso finden sich keine
Angaben über das Vorkommen des Rezeptors in hepatozellulären Präneoplasien und
Neoplasien.
4.3.3 HGF und c-Met Die immunhistochemische Farbreaktion des Antikörpers c-Met zeigt sich
intrazytoplasmatisch und membranös in den Hepatozyten sowie bei Versuchstieren mit
Ausbildung eines hepatozellulären Karzinoms auch in den Zellkernen der Leberzellen.
Das intrazytoplasmatisch und membranös gelegene Vorkommen in den Hepatozyten
deckt sich mit den Angaben in der Literatur [139, 178]. Die oben erwähnte nukleäre
Reaktion des Antikörpers warf nicht zu beantwortende Fragen auf, da die Farbreaktion
in einigen Bereichen sehr deutlich auftrat, aber in direkt benachbarten morphologisch
ähnlichen Tumorgebieten völlig negativ war. Die Untersuchung mit einer zweiten
Methode (z.B. Western-Blots nach Gewinnung einer Zellkernfraktion) wäre aus meiner
Sicht noch notwendig, um dem weiter nachzugehen.
Bei Versuchstieren mit Ausbildung präneoplastischer Foci waren die veränderten
Hepatozyten um das Transplantat herum schwächer angefärbt als die unveränderten
extrafokal gelegenen Hepatozyten. In der Literatur wird das Vorkommen von HGF bei
verschiedenen Lebererkrankungen sehr unterschiedlich diskutiert, während sich die
Expression von c-Met in HCC´s in den meisten Arbeitsgruppen als erhöht gegenüber
dem Normalgewebe bzw. benignen Läsionen der Leber darstellt. Luo et al. untersuchten
die Genexpression von HGF und c-Met in Geweben mit Ausbildung eines
hepatozellulären Karzinoms im Vergleich zu Normalgeweben. Hier zeigte sich, dass
HGF sowohl im Tumor- als auch im Normalgewebe gleichermaßen auf geringem Level
exprimiert war. Die Expression von c-Met fand sich signifikant ausgeprägter als
4 Diskussion 80
diejenige von HGF in Tumoren im Vergleich zu dem Normalgewebe [179]. Eine
Arbeitsgruppe um Grigioni untersuchte im Jahre 1995 c-Met mittels
immunhistochemischen Methoden in hepatozellulären Karzinomen im Vergleich zu
fokalen nodulären Hyperplasien, fulminanten Hepatitiden und in in Regeneration
befindlichen Lebern. Hierbei war das Signal in den HCC´s deutlich stärker als das in
den benignen Läsionen [180]. Okano et al. untersuchten die immunhistochemische
Expression von HGF und c-Met in Lebergeweben mit akuter und chronischer Hepatitis,
Leberzirrhose sowie Ausbildung von hepatozellulären Karzinomen. Eine ausgeprägte
Farbreaktion ergab sich für HGF in den benignen Läsionen, während die
Gewebsschnitte mit einem HCC negativ imponierten. Die Expression von c-Met war
signifikant ausgeprägter im HCC und in Lebern mit akuter als in Lebern mit chronischer
Hepatitis. Eine Korrelation zwischen HGF und c-Met konnte mit Ausnahme der
Patienten mit einer Leberzirrhose nicht beobachtet werden [181]. Ke et al. wiesen im
Jahre 2009 das Protoonkogen c-Met immunhistochemisch in HCC´s und Normalgewebe
nach. Hierbei zeigte es sich signifikant überexprimiert in HCC´s im Vergleich zum
Normalgewebe, wobei die Reaktion sowohl membranös als auch intrazytoplasmatisch
auftrat [182]. Ebenfalls konnten weitere Arbeitsgruppen mit unterschiedlichen
Methoden eine Überexpression von c-Met in hepatozellulären Karzinomen im
Vergleich zu benignen Läsionen oder Normalgewebe nachweisen [178, 183]. Lediglich
Boix et al. fanden in Nothern-blot-hybridization-Analysen heraus, dass nur die Hälfte
der untersuchten HCC´s eine Überexpression von c-Met im Vergleich zu dem
umgebenden Normalgewebe aufwiesen, jedoch konnten sie keine Korrelation zwischen
der Überexpression von c-Met und klinischem sowie pathologischem Verhalten des
Tumors ausmachen [184]. Di Renzo et al. untersuchten im Jahre 1991 die
Proteinexpression von c-Met mittels Western-Blot-Analysen und fanden heraus, dass
die c-Met-Protein-Level vergleichbar mit denjenigen normaler Leber waren [185].
Bei Versuchstieren in fortgeschrittenem Lebensalter ergaben sich einige
Besonderheiten. Die Farbreaktion der Zellmembranen stellte sich als abgeschwächt dar,
welches die Vermutung zulässt, dass ältere Tiere nicht mehr fähig sein könnten, den
Rezeptor zu produzieren und auf der Oberfläche zu exprimieren. Außerdem fand sich
wiederum eine ausgeprägte Steatosis hepatis, die aber nicht so deutlich angefärbt war
wie nach Zugabe der Antikörper TNF α oder TNF-R1. Die Ursache der Verfettung liegt
4 Diskussion 81
in der vermehrten Ausbildung von Hypophysenadenomen bei älteren Versuchstieren,
welche aber nicht immer symptomatisch waren. Aufgrund des Adenoms verminderte
sich die Nahrungsaufnahme der Tiere und die Hepatozyten begannen, vermehrt Lipide
zu speichern.
Insgesamt bleiben die Rolle von HGF und c-Met in diesem Modell des
Karzinogeneseprozesses unklar.
5 Zusammenfassung 82
5 Zusammenfassung
Das Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, ob die im Rahmen eines Models, einer
intraportalen Transplantation von Ovargewebe in Rattenlebern beobachteten,
morphologischen Veränderungen der Hepatozyten des Rezipientengewebes, die sich mit
zunehmender Versuchsdauer als präneoplastische Herde bis zu Entwicklung von
hepatozellulären Neoplasien erwiesen, von Alterationen der Nicht-Parenchymzellen
begleitet werden. Die Untersuchung der Nicht-Parenchymzellen der Leber wurde
mittels morphometrischer Methoden betrieben, indem die Volumenanteile der einzelnen
Zellfraktionen und Zellzwischenräume der Versuchsgruppen untereinander verglichen
wurden. Signifikanzen ergaben sich hierbei bei Betrachtung der Endothel- und
Sternzellen, dem Dissé-Raum und dem Zellzwischenraum. Die Endothelzellen jüngerer
Versuchstiere zeigten mehr Volumenanteile als diejenigen älterer Tiere. Ebenso fanden
sich Endothelzellen in Kontroll- und ovarektomierten Gruppen mit weniger Volumen
als diejenigen der transplantierten Tiergruppen bzw. Leberseiten. Das Volumen der
Sternzellen zeigte sich vermindert in der HCC-Gruppe im Vergleich zu der
gleichaltrigen Kontrollgruppe. Ebenso verhielt es sich bei der 6 Monate alten
Kontrollgruppe und der ovarektomierten Tiergruppe. In der Beurteilung des Dissé-
Raums fand sich lediglich eine Signifikanz, bei der in den ovarektomierten Tiergruppen
das 6 Monate alte Versuchstier mehr Dissé-Raum-Volumen besitzt als das 24 Monate
alt gewordene. Der Zellzwischenraum der HCC-Tiere nahm statistisch weniger
Volumen ein als das der Hauptgruppe 3 Wochen post transplantationem. Zusätzlich
wurden die Sternzellen hinsichtlich ihres Anteils der Fettvakuolen am
Zytoplasmavolumen und der mittleren Größe der Fettvakuolen bestimmt. Letztere
zeigten sich in keiner Gruppe statistisch signifikant verändert, während sich der Anteil
der Fettvakuolen am Zytoplasmavolumen vor allem beim Vergleich älterer mit jüngeren
Tieren vergrößert fand sowie sich transplantierte Tiergruppen mit kleineren
Fettvakuolen als Kontrolltiere zeigten. Die immunhistochemische Diagnostik von TNF
α zeigte sich korrespondierend zu den Literaturangaben in den Nichtparenchymzellen
und den Hepatozyten. Hierbei ergaben sich keine Unterschiede beim Vergleich von
unverändertem und verändertem Lebergewebe, während sich bei der Auswertung seines
Rezeptors (TNF-R1) eine stärkere Farbreaktion in den präneoplastischen Hepatozyten
ergab. Die Beobachtungen legen eine Bedeutung der Nicht-Parenchymzellen und der
5 Zusammenfassung 83
von ihnen während der östrogenvermittelten Hepatokarzinogenese gebildeten
parakrinen Faktoren nahe.
LXXXIV
6 Abkürzungsverzeichnis
AKT V-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1
AP Acidphosphatase
APAAP Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase-Komplex
ASK1 Apoptosis-stimulated kinase
Caspase Cystein Aspartat-spezifische Protease
CD Clusters of differentiation
cFLIP cellular FLICE-like inhibitory protein
COX Cytochrom-c-Oxidase
DAB 3,3`-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid
DD Todesdomäne, Death domain
DDSA Dodecenylbernsteinsäureanhydrid
DISC Death inducing signalling complex
DMP 30 2,4,6-Tri-Dimethylaminomethyl-phenol
EGF Epidermal growth factor
ERK MK, MAP Kinase
FADD Fas-associated death domain
G6Pase Glukose-6-Phosphatase
G6PDH Glukose-6-Phosphatase-Dehydrogenase
Gab1 Growth-factor-receptor-bound protein 2 (Grb2)-associated binder
GAP GTPase aktivierendes Protein
GM-CSF Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor
GRB2 Growth factor receptor-bound protein 2
GST-P Plazentare Glutathion S-Transferase
GVHD Graft versus host disease
H2O2 Wasserstoffperoxid
HCA Hepatozelluläres Adenom
HCC Hepatozelluläres Karzinom
HCl Salzsäure
HGF Hepatocyte growth factor
LXXXV
HGFR Hepatocyte growth factor receptor
HIF1 Hypoxia inducible factor 1
HREs Hypoxia response elements
IL Interleukin
IP3 Inositol-Triphosphat
IκK Inhibitory of NF-κB (IKB) kinase
JNK c-Jun NH2-terminal kinase
LPS Lipopolysachharid
LT Lymphotoxin
MAPK((K)K) Mitogen-activated protein kinase ((kinase) kinase)
ME Malic-Enzym
MEK MKK, Map Kinase Kinase
MEKK1 MEK Kinase 1
Met Mesenchymal-epithelial transition factor
mG3PDH Mitochondrialer Glycerol-3-Phosphatdehydrogenase
MNA Methylnadicananhydrid
mTNF Membrangebundenes TNF
Na2HPO
4 x 2H
2O Di-Natriumhydrogenphosphat
NaH2PO4 x H2O Natriumhydrogenphosphat
NaOH Natriumhydroxid
NF-κB Nukleärer Faktor kappaB
NGF Nerve growth factor
PAP Peroxidase-Anti-Peroxidase
PAS Periodic acid Schiff
PHO Glykogenphosphorylase
PK Pyruvatkinase
PKC Proteinkinase C
PLCγ Phospholipase Cγ
RAF Rapidly growing fibrosarcoma or rat fibrosarcoma
RAS Rat sarcoma
RIP-1 Rezeptor interagierende Serin-/Threonin-Kinase 1
RPMI Rosewell Park Memorial Institute medium
SDH Succinatdehydrogenase
LXXXVI
Shp2 SH2-domain-containing protein tyrosine phosphatase 2
SOD Superoxiddismutase
SODD Silencer of death domains
SOS Son of sevenless
STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3
sTNF Lösliches (soluble) TNF
SYN Glykogensynthase
T3 3,3',5-Triiod-L-thyronin
T4 3,3',5,5'-Tetraiod-L-thyronin
TACE TNF α converting enzyme
TGF α/β Transforming growth factor α/β
THD TNF Homologie Domäne
TNF Tumornekrosefaktor
TNF α-SF TNF α-Superfamilie
tPA Gewebespezifischer Plasminogen Aktivator
TRADD TNF-Receptor associated death domain
TRAF-1/2 TNF-Rezeptor assoziierter Faktor ½
uPA Urokinase-Typ Plasminogen Aktivator
γ-GT γ-Glutamyltransferase
LXXXVII
7 Literaturverzeichnis
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XCVIII
8 Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine
anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät vorgelegt worden.
Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass
eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.
15.01.2011
Datum Unterschrift
