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J O U R N A L O F B A C T E R I O L O G Y , M a y 1 9 8 3 , p .
6 5 6 - 6 6 20 0 2 1 - 9 1 9 3 / 8 3 / 0 5 0 6 5 6 - 0 7 $ 0 2 . 0
0 / 0C o p y r i g h t 1 9 8 3 , A m e r i c a n S o c i e t y f o
r M i c r o b i o l o g yV o l . 1 5 4 , N o . 2
C e l l C y c l e P a r a m e t e r s o f S l o w l y G r o w i
n g E s c h e r i c h i a c o l i B / rS t u d i e d b y F l o w C
y t o m e t r yKIRSTEN S K A R S T A D , 1 * HARALD B . S T E E N ,
1 AND ERIK BOYE2
D e p a r t m e n t o f B i o p h y s i c s , N o r s k H y d r
o ' s I n s t i t u t e f o r C a n c e r R e s e a r c h , 1 a n d
D e p a r t m e n t o f M e d i c a lP h y s i c s , T h e N o r w
e g i a n R a d i u m H o s p i t a l , 2 M o n t e b e l l o , O s
l o 3 , N o r w a yR e c e i v e d 1 2 N o v e m b e r 1 9 8 2 / A
c c e p t e d 1 9 F e b r u a r y 1 9 8 3
T h e c e l l c y c l e k i n e t i c s o f E s c h e r i c h i
a c o l i B / r A a n d B / r K c e l l s w e r e s t u d i e d b
yf l o w c y t o m e t r y . T h r e e - d i m e n s i o n a l h i
s t o g r a m s o f c e l l c u l t u r e s s h o w t h e n u m b e
ro f c e l l s a s a f u n c t i o n o f c e l l u l a r D NA a n d
p r o t e i n c o n t e n t s a n d g i v e d e t a i l e dp i c t
u r e s o f t h e c e l l c y c l e d i s t r i b u t i o n w i t h
r e g a r d t o t h e s e p a r a m e t e r s . H i s t o g r a m
so f s l o w l y g r o w i n g c h e m o s t a t c u l t u r e s s
h o w e d t h a t c e l l c y c l e p e r i o d s B a n d C + Di n
c r e a s e w i t h a d e c r e a s i n g g r o w t h r a t e a n d
t h a t t h e B p e r i o d o c c u p i e s a ni n c r e a s i n g
f r a c t i o n o f t h e c y c l e . T h e DNA r e p l i c a t i o
n p a t t e r n s o f B / r A a n d Kw e r e f o u n d t o b e q u
i t e s i m i l a r . A t e x t r e m e l y l o w g r o w t h r a t
e s ( d o u b l i n g t i m e [ T ]= 1 7 h ) , B / r A c e l l s h
a d a B p e r i o d o f 0 . 8 T , a C p e r i o d o f 0 . 1 T , a n
d a D p e r i o d o f0 . 1 T , a n d B / r K c e l l s ( T = 1 6 h
) h a d a B p e r i o d o f 0 . 6 T , a C p e r i o d o f 0 . 1 5 T
, a n d aD p e r i o d o f 0 . 2 5 T . M a s s i n c r e a s e , i
. e . , e s s e n t i a l l y p r o t e i n s y n t h e s i s , was
s e e n i na l l t h r e e p e r i o d s o f t h e c e l l c y c l
e . F o r B / r A c e l l s , t h e a v e r a g e r a t e o f m a s
si n c r e a s e w a s 1 1 t i m e s g r e a t e r i n t h e D p e
r i o d t h a n i n t h e B p e r i o d , w h e r e a s f o r B /
rK c e l l s t h e r a t e o f m a s s i n c r e a s e w a s t w i
c e a s g r e a t i n t h e D p e r i o d a s i n t h e Bp e r i o
d . T h e DNA a n d c e l l s i z e d i s t r i b u t i o n s o f b
a t c h c u l t u r e s i n e x p o n e n t i a lg r o w t h w e r
e f o u n d t o v a r y w i t h t i m e , i n d i c a t i n g t h a
t s u c h c u l t u r e s a r e n o t s u i t a b l ef o r s t u d
i e s o f c e l l c y c l e k i n e t i c s .
G e n e r a l a g r e e m e n t e x i s t s a b o u t t h e t i
m i n g o fc h r o m o s o m e r e p l i c a t i o n i n r a p i d
l y g r o w i n g c u l -t u r e s o f E s c h e r i c h i a c o l
i ( 3 , 1 2 ) . F o r s l o w l yg r o w i n g c u l t u r e s , h
o w e v e r , a v a r i e t y o f p a t t e r n so f DNA s y n t h
e s i s h a v e b e e n o b s e r v e d . T h e s ep a t t e r n s
c a n b e d e s c r i b e d b y f o u r p a r a m e t e r s ; B ,t
i m e b e t w e e n c e l l d i v i s i o n a n d t h e i n i t i a
t i o n o f anew r o u n d o f c h r o m o s o m e r e p l i c a t
i o n ; C , t i m eb e t w e e n i n i t i a t i o n a n d t h e t
e r m i n a t i o n o f a r o u n do f c h r o m o s o m e r e p l
i c a t i o n ; D , t i m e b e t w e e n t h et e r m i n a t i o
n o f c h r o m o s o m e r e p l i c a t i o n a n d t h en e x t
c e l l d i v i s i o n ; a n d T , c e l l g e n e r a t i o n t i
m e ,i . e . , t i m e b e t w e e n o n e d i v i s i o n a n d t
h e n e x t( m e a n v a l u e f o r t h e c u l t u r e ) .A t g r
o w t h r a t e s l e s s t h a n 1 d o u b l i n g p e r h , t h
eC p e r i o d i s n o t c o n s t an t ( 2 , 3 , 8 , 1 3 , 1 4 ) b
u ti n c r e a s e s w i t h d e c r e a s i n g g r o w t h r a t
e . E x p e r i -m e n t s w i t h v a r i o u s t e c h n i q u e
s a n d d i f f e r e n t s u b -s t r a i n s o f E . c o l i B /
r h a v e g i v e n s i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t v a
l u e s f o r t h e r e l a t i v e d u r a t i o n s o f B ,C , a
n d D . E v i d e n c e f o r d i f f e r e n t r e p l i c a t i o
np a t t e r n s i n t h e s u b s t r a i n s w a s p r e s e n t
e d b y H e l m -s t e t t e r a n d P i e r u c c i ( 8 ) , u s i
n g t h e m e m b r a n ee l u t i o n t e c h n i q u e , a n d b
y K o p p e s e t a l . ( 1 0 ) ,u s i n g e l e c t r o n m i c r
o s c o p i c a n d a u t o r a d i o g r a p h i ca n a l y s e s
. B o t h g r o u p s o b s e r v e d o n e r e p l i c a t i o np
a t t e r n w i t h s t r a i n B / r A ( n o B p e r i o d , l o n
g Dp e r i o d ) a n d a n o t h e r p a t t e r n w i t h s t r a
i n s B / r K
a n d B / r F ( b o t h a n i n i t i a l B a n d a t e r m i n
a l Dp e r i o d ) . T h e r e s u l t s o b t a i n e d b y K u b
i t s c h e k a n dNewman ( 1 3 ) , who s t u d i e d c e l l s u r
v i v a l a f t e r t h er a d i o a c t i v e d e c a y o f 1 2 5
I i n c o r p o r a t e d i n t o t h eDNA, d o n o t s h o w s i g
n i f i c a n t l y d i f f e r e n t p a t -t e r n s f o r s t r
a i n s B / r A , K , a n d F .We s t u d i e d t h e g r o w t h o
f E . c o l i B / r A a n d B / rK c e l l s b y d u a l - p a r a
m e t e r f l o w c y t o m e t r y . W i t ht h i s t e c h n i q
u e , m e a s u r e m e n t s o f t h e c e l l u l a rc o n t e n
t s o f DNA a n d p r o t e i n i n s i n g l e c e l l s c a nb e
m a d e w i t h a p r e c i s i o n o f a f e w p e r c e n t a n d
a ta r a t e o f 1 0 4 c e l l s p e r s . F l o w c y t o m e t r
y h a sp r o v e n e x t r e m e l y u s e f u l f o r s t u d i e
s o f c e l l c y c l ek i n e t i c s i n e u c a r y o t i c c e
l l s a n d i t s u s e f u l n e s s i snow a l s o b e i n g e s
t a b l i s h e d f o r p r o c a r y o t i c c e l l s( 1 8 - 2 0
; E . B o y e , H . B . S t e e n , a n d K . S k a r s t a d ,J .
G e n . M i c r o b i o l . , i n p r e s s ) . T h e d u a l - p a
r a m e -t e r m o d e p e r m i t s a s i m u l t a n e o u s v i
e w o f DNAa n d p r o t e i n s y n t h e s i s . By r e c o r d i
n g i n f o r m a t i o no n s i n g l e c e l l s i n l a r g e n
u m b e r s , t h i s m e t h o dm a k e s i t p o s s i b l e t o
d i s t i n g u i s h s u b p o p u l a t i o n so f c e l l s a n
d t h e r e b y r e s o l v e d e t a i l s t h a t may n o tb e d
e t e c t e d b y o t h e r m e t h o d s .I n t h e p r e s e n t
s t u d y , d u a l - p a r a m e t e r h i s t o -g r a m s w e r
e u s e d t o d e t e r m i n e t h e l e n g t h o f t h eB , C ,
a n d D p e r i o d s o f E . c o l i B / r A a n d B / r Ka n d t
o s t u d y t h e k i n e t i c s o f p r o t e i n s y n t h e s i
s i nt h e s e s u b s t r a i n s .
6 5 6
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CELL C Y CLE PARAMETERS OF E . COLI 6 5 7MATERIALS AND
METHODS
B a c t e r i a l s t r a i n s a n d g r o w t h c o n d i t i
o n s . Tw o s t r a i n so f E . c o l i w e r e u s e d : B / r A
a n d B / r K ( f r o m H . E .K u b i t s c h e k ) . B o t h s t
r a i n s h a d b e e n d e s i g n a t e d B / ru n t i l d i f f
e r e n t i a t i o n i n t o s u b s t r a i n s A a n d K ( 8 )
.B a t c h c u l t u r e s w e r e g r o w n s l o w l y a t 3 7 C
w i t hb u b b l i n g a e r a t i o n i n M9 s a l t s ( 1 ) s u p
p l e m e n t e d w i t h 2mg o f L - p r o l i n e o r s o d i u m
s u c c i n a t e p e r m l a n d r a p i d l yi n K p l u s g l u
c o s e m e d i u m ( M 9 s a l t s , 1% C a s a m i n oA c i d s ,
a n d 1 1 mg o f g l u c o s e p e r m l ) . C u l t u r e d o u b
l i n gt i m e s w e r e e s t a b l i s h e d f r o m c e l l c o
u n t s ( v i a b l e t i t e r o na g a r p l a t e s ) .S t e a d
y - s t a t e c h e m o s t a t c u l t u r e s w e r e l i m i t e
d w i t h1 0 0 p . g o f g l u c o s e p e r m l i n M9 s a l t s a
t 3 7 C . T h e c e l ld o u b l i n g t i m e s w e r e d e t e r
m i n e d f r o m t h e v a l u e s o ft h e c u l t u r e v o l u
m e d o u b l i n g t i m e s ( 7 ) .F i x a t i o n a n d s t a i
n i n g . B a c t e r i a l c u l t u r e s a m p l e sw e r e f i
x e d b y 1 0 - f o l d d i l u t i o n i n i c e - c o l d 7 0 % o
a q u e o u s
e t h a n o l a n d s t o r e d a t 4 C o v e r n i g h t . T h
e f i x e d c e l l sw e r e w a s h e d t w i c e i n 0 . 1 M T r
i s - 0 . 6 % N a C l ( p H 7 . 4 )a n d t h e n s u s p e n d e d
i n 0 . 1 M T r i s - 0 . 6 % N a C l - 2 5 mMM g C l c o n t a i n
i n g t h e D N A - s p e c i f i c f l u o r e s c e n t d y e sm
i t r a m y c i n ( P f i z e r I n c . , Ne w Y o r k , N . Y . ;
5 0 j g / m l )a n d e t h i d i u m b r o m i d e ( C a l b i o c
h e m , L a J o l l a , C a l i f . ;2 5 j i g / m l ) .F l o w c y
t o m e t r y . F l o w c y t o m e t r i c m e a s u r e m e n t
sw e r e p e r f o r m e d w i t h a l a b o r a t o r y - b u i l
t m i c r o s c o p e -b a s e d f l o w c y t o m e t e r d e s c
r i b e d i n d e t a i l e l s e w h e r e( 1 7 , 2 1 ) . I n t h
i s i n s t r u m e n t , t h e s t a i n e d c e l l s , c a r r i
e db y a l a m i n a r f l o w o f w a t e r , p a s s o n e b y o
n e t h r o u g ht h e f o c u s o f a f l u o r e s c e n c e m i
c r o s c o p e s o t h a t e a c hc e l l g i v e s r i s e t o a
p u l s e o f f l u o r e s c e n c e l i g h t , t h ei n t e n s
i t y o f w h i c h i s p r o p o r t i o n a l t o t h e c e l l u
l a r DNAc o n t e n t . A s e n s i t i v e p h o t o m u l t i p
l i e r t u b e t r a n s f o r m st h e f l u o r e s c e n c e p
u l s e s i n t o e q u i v a l e n t e l e c t r i c a lp u l s e
s , w h i c h a r e s i z e d a n d s t o r e d b y a m u l t i c h
a n n e lp u l s e - h e i g h t a n a l y z e r ( M C A ) . T h e
a m o u n t o f e x c i t a -t i o n l i g h t s c a t t e r e d b
y e a c h b a c t e r i u m i s d e t e c t e dt h r o u g h a s e
c o n d a r y m i c r o s c o p e i n a d a r k - f i e l d c o n f
i g -u r a t i o n . T h e r e s u l t i n g p u l s e s a r e s t
o r e d b y t h e s a m eMCA. T h e 6 3 b y 6 3 - c h a n n e l MCA
t h u s a c c u m u l a t e s at h r e e - d i m e n s i o n a l h
i s t o g r a m o f t h e b a c t e r i a w i t h r e -g a r d t o
s c a t t e r e d l i g h t a n d t h e i r c o n t e n t s o f
DNA-a s s o c i a t e d f l u o r e s c e n t d y e . D N A - a s s
o c i a t e d f l u o r e s -c e n c e i s a t r u e m e a s u r e
o f t h e DNA c o n t e n t p e r c e l l ,a n d t h e a m o u n t
o f s c a t t e r e d l i g h t f r o m a n i n d i v i d u a lb a
c t e r i u m i s p r o p o r t i o n a l t o t h e c e l l u l a r
d r y m a s s , i . e . ,e s s e n t i a l l y p r o t e i n c o n
t e n t . ( E . B o y e e t a l . , i n p r e s s ) .F l u o r e s
c e n t l a t e x p a r t i c l e s ( d i a m e t e r , 0 . 5 7 , u
m ; P o l y -s c i e n c e s I n c . ) w e r e a d d e d t o t h e
s a m p l e s t o m o n i t o rt h e s e n s i t i v i t y a n d s
t a b i l i t y o f t h e i n s t r u m e n t d u r i n gs a m p l
e m e a s u r e m e n t s .
RESULTS.C a l i b r a t i o n o f t h e f l u o r e s c e n c e
a x i s . To c a l i -b r a t e t h e f l u o r e s c e n c e a x i
s w i t h r e g a r d t o c e l l u -l a r DNA c o n t e n t , w e
m e a s u r e d t h e f l u o r e s c e n c e
f r o m b a c t e r i a g r o w n i n t h e p r e s e n c e o f
c h l o r a m -
p h e n i c o l . C h l o r a m p h e n i c o l i s a n i n h i
b i t o r o fp r o t e i n s y n t h e s i s e n a b l i n g t h e
r e p l i c a t i o n f o r k st o f i n i s h r o u n d s o f r e
p l i c a t i o n w h i l e b l o c k i n g t h ei n i t i a t i o
n o f new r o u n d s o f r e p l i c a t i o n a n d c e l ld i v
i s i o n . C e l l s g r o w n i n t h e p r e s e n c e o f c h l
o r -a m p h e n i c o l t h e r e f o r e e n d u p w i t h a n i
n t e g e rn u m b e r o f f u l l y r e p l i c a t e d c h r o m
o s o m e s ( 1 8 ,1 9 ) . A s a m p l e o f c h l o r a m p h e n
i c o l - t r e a t e d c e l l sw a s u s e d a s a f l u o r e s
c e n c e s t a n d a r d i n a l le x p e r i m e n t s , g i v i
n g a g o o d m e a s u r e o f t h e f l u o r -e s c e n c e p e
r c h r o m o s o m e . T h e DNA s t a i n i n gd e p e n d e d t
o s o m e d e g r e e o n t h e g r o w t h c o n d i -t i o n s ,
c o n c e i v a b l y r e f l e c t i n g d i f f e r e n c e s i n
c h r o -mosome c o n f i g u a t i o n .S t e a d y - s t a t e c
h e m o s t a t c u l t u r e s . I n a s l o w l yg r o w i n g c
h e m o s t a t c u l t u r e ( T = 1 7 h ) o f s t r a i nB / r A
, m o s t o f t h e c e l l s h a d a DNA c o n t e n te q u i v a
l e n t t o o n e s i n g l e c h r o m o s o m e ( F i g . 1 A )
.T h e s e c e l l s w e r e i n t h e B p e r i o d o f g r o w t
h . C e l l sc o n t a i n i n g t w o f u l l c h r o m o s o m e
s w e r e i n t h e Dp e r i o d a n d h a d , o n t h e a v e r a
g e , t w i c e t h e m a s sa n d p r o t e i n c o n t e n t s o
f t h e c e l l s w i t h o n e c h r o -m o s o m e . T h e r i d
g e o f c e l l s c o n n e c t i n g t h e o n e -a n d t w o - c
h r o m o s o m e p e a k s r e p r e s e n t s c e l l s i nt h e
C p e r i o d , i . e . , t h e p e r i o d o f DNA s y n t h e s i
s .To d e t e r m i n e t h e d u r a t i o n o f t h e B , C , a n
d Dp e r i o d s , w e i n t e g r a t e d t h e d u a l - p a r a
m e t e r h i s t o -g r a m o f F i g . 1A w i t h r e g a r d t o
l i g h t s c a t t e r ,y i e l d i n g a s i n g l e - p a r a m
e t e r DNA h i s t o g r a m( F i g . 1 B ) . From t h i s h i s t
o g r a m , t h e f r a c t i o n s o ft h e c e l l c u l t u r e
o c c u p y i n g B , C , a n d D p e r i o d sw e r e f o u n d ,
a n d b y t a k i n g i n t o c o n s i d e r a t i o n t h ee x p
o n e n t i a l m u l t i p l i c a t i o n o f c e l l s g r o w i
n g i ns t e a d y - s t a t e c u l t u r e s ( 2 2 ) , w e m a d
e e s t i m a t e s o ft h e c e l l c y c l e p a r a m e t e r s
( T a b l e 1 ) . B o c c u p i e da p p r o x i m a t e l y 8 0 %
o f t h e c e l l c y c l e , a n d C a n dD o c c u p i e d a p p
r o x i m at e l y 1 0 % e a c h .F l o w c y t o m e t r i c m e a
s u r e m e n t s o f B / r K c e l l sg r o w i n g s l o w l y i
n a c h e m o s t a t c u l t u r e ( T = 1 6 h )g a v e a h i s t
o g r a m s i m i l a r t o t h e o n e s h o w n i n F i g .1 A f
o r B / r A c e l l s ( F i g . 2 ) . T h e c e l l c y c l ep a r
a m e t e r s r e v e a l e d a s i m i l a r DNA r e p l i c a t i
o np a t t e r n ( T a b l e 1 ) , w i t h B , C , a n d D o c c u
p y i n g6 0 , 1 5 , a n d 2 5 % , r e s p e c t i v e l y , o f t
h e c e l l c y c l e .To g e t a b e t t e r v i e w o f t h e s i
z e d i s t r i b u t i o n o ft h e c e l l s , w e r o t a t e d
a n d t i l t e d t h e t h r e e - d i m e n -s i o n a l h i s t
o g r a m o f F i g . 1A ( F i g . 1 C ) . I t c a n b es e e n t h
a t t h e r i d g e o f D N A - s y n t h e s i z i n g c e l l s i
sa t a n a n g l e t o t h e DNA a x i s i n d i c a t i n g t h a
t t h ec e l l m a s s i n c r e a s e d d u r i n g t h e C p e r
i o d . Thec e l l s o c c u p y i n g a n a r r o w s e c t i o n
o f t h i s r i d g e ,f o r e x a m p l e , DNA c h a n n e l n o
. 3 0 a n d l i g h ts c a t t e r c h a n n e l s n o . 1 t o 6 3
, w e r e a t t h e sames t a g e o f r e p l i c a t i n g a n e w
c h r o m o s o m e . T h u s
F I G . 1 . T h r e e - d i m e n s i o n a l D N A / l i g h t
s c a t t e r h i s t o g r a m s o f a s l o w l y g r o w i n g E
. c o l i B / r A c h e m o s t a t c u l t u r ew i t h a d o u b
l i n g t i m e o f 1 7 h v i e w e d f r o m t w o d i f f e r e n
t a n g l e s ( A a n d C ) . E a c h h i s t o g r a m r e p r e s
e n t s 2 x 1 0 ' c e l l s ,r e c o r d e d a t a r a t e o f a b
o u t 3 x 1 0 3 c e l l s p e r s w i t h a n i n s t r u m e n t a
l r e s o l u t i o n o f < 5 % . T h e t h r e e - d i m e n s
i o n a lh i s t o g r a m w a s i n t e g r a t e d w i t h r e g
a r d t o l i g h t s c a t t e r , y i e l d i n g a s i n g l e -
p a r a m e t e r DNA h i s t o g r a m o f t h e s l o w l yg r o
w i n g B / r A c e l l s ( B ) .
VOL. 1 5 4 , 1 9 8 3
-
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3/7
6 5 8 S K A R S T A D , S T E E N , AND BOYE J . B A C T E R I O
L .I Y o . o f AC e l t s
DNA
W : I t : , ~ ~ ~
N o . o f c e l l sA t 1
-
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4/7
CELL CYCLE PARAMETERS OF E . COLI 6 5 9
B
In I0dz
l 2 0 $ 2DNAF I G . 2 . T h r e e - d i m e n s i o n a l D N A
/ l i g h t s c a t t e r h i s t o g r a m o f a s l o w l y g r o
w i n g E . c o l i B / r K c h e m o s t a t c u l t u r ew i t h
a d o u b l i n g t i m e o f 1 6 h ( A ) a n d t h e i n t e g r a
t e d , s i n g l e - p a r a m e t e r DNA h i s t o g r a m o f t
h i s c u l t u r e ( B ) . I n t h i sr e c o r d i n g , t h e l
i g h t s c a t t e r a m p l i f i e r g a i n w a s h a l f o f t
h e v a l u e u s e d f o r t h e h i s t o g r a m o f F i g . 1
.
t h e s e c e l l s w e r e s y n c h r o n o u s : t h e i r s
i z e d i s t r i b u -t i o n g a v e t h e v a r i a b i l i t y
i n c e l l s i z e o f t h e c u l t u r ea t t h i s p o i n t i
n t h e c e l l c y c l e . When t h e c e l l s i z ed i s t r i b
u t i o n s o f t h e DNA c h a n n e l s w e r e c o n s i d -e r
e d o n e b y o n e f r o m t h e b e g i n n i n g t o t h e e n d
o ft h e C p e r i o d , t h e s i z e d i s t r i b u t i o n s h
a d a b o u t t h esame w i d t h ( f i v e c h a n n e l s o f t h
e l i g h t s c a t t e ra x i s ) , b u t moved t o w a r d l a r
g e r l i g h t s c a t t e rv a l u e s . T h i s s i z e s h i f
t ( t o t a l o f f o u r c h a n n e l st h r o u g h t h e C p e
r i o d ) i n d i c a t e s t h e mass i n -c re ase o f t h e c e
l l s i n t h e C p e r i o d . By t a k i n g t h ed u r a t i o n
o f t h e p e r i o d i n t o c o n s i d e r a t i o n , weo b t a
i n e d a m e a s u r e o f t h e average r a t e o f massi n c r e
a s e i n t h e C p e r i o d ( T a b l e 2 ) . Th e o n e - a n dt
w o - c h r o m o s o m e p e a k s w e r e c o n s i d e r e d i n
t h e
s a m e w a y , i . e . , a s r e s u l t i n g f r o m ( i ) a
s i z ev a r i a t i o n i n c e l l s o f t h e s a m e a g e ( t
a k e n t o h a v et h e s a m e r e l a t i v e w i d t h a s t h
e s i z e d i s t r i b u t i o n o fs y n c h r o n o u s c e l l
s i n t h e C p e r i o d ) a n d ( i i ) a ni n c r e a s e i n s
i z e r e f l e c t i n g a c o r r e s p o n d i n g m a s si n c
r e a s e . T h e a v e r a g e r a t e o f m a s s i n c r e a s e
i nt h e D p e r i o d w as a b o u t 1 1 t i m e s g r e a t e r t
h a nt h a t i n t h e B p e r i o d a n d 4 t i m e s g r e a t e
r t h a n t h a ti n t h e C p e r i o d ( T a b l e 2 ) . T h e s
i z e d i s t r i b u t i o n o fB / r K c e l l s ( F i g . 2 A )
was s o m e w h a t d i f f e r e n tf r o m t h a t o f B / r A c
e l l s . E s t i m a t e s o f t h e r a t e o fm a s s i n c r e
a s e i n t h e t h r e e p e r i o d s g a v e s i m i l a rv a l
u e s f o r t h e B a n d C p e r i o d s a n d a t w o f o l d -h
i g h e r v a l u e f o r t h e D p e r i o d ( T a b l e 2 ) .I n
F i g . 1 C , c e l l s w i t h v e r y l a r g e l i g h t s c a t
t e r
V O L . 1 5 4 , 1 9 8 3
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6 6 0 SKARSTAD, STEEN, AND B O Y ETABLE 1 . D u r a t i o n o f
c e l l c yc l e p e r i o d s f o r E . c o l i B / r A a n d B /
r K c e l l s
S t r a i n T B C + D B ( m i n ) C + D C ( m i n ) ' D ( m i n
) '( m i n )B / r A 7 3 m i n 0 . 1 5 T 0 . 8 5 T 1 1 6 27 4 m i n
0 . 1 5 T 0 . 8 5 T 1 1 6 39 5 m i n 0 . 2 5 T 0 . 7 5 T 2 4 7 11 1
3 m i n 0 . 3 T 0 . 7 T 3 4 7 92 3 6 m i n 0 . 5 T 0 . 5 T 1 1 8 1
1 82 9 3 m i n 0 . 5 T 0 . 5 T 1 4 7 1 4 71 7 h 0 . 8 T 0 . 2 T 8 1
6 2 0 4 1 0 2 1 0 2B / r K 2 3 1 m i n 0 . 4 T 0 . 6 T 9 2 1 3 94 0
0 m i n 0 . 5 5 T 0 . 4 5 T 2 2 0 1 8 0 6 0 1 2 01 6 h 0 . 6 T 0 .
4 T 5 7 6 3 8 4 1 4 4 2 4 0a S e p a r a t e e s t i m a t e s o f
C a n d D a r e n o t g i v e n when T < 5 h ; i n t h e s e h i
s t o g r a m s , t h e t w o - c h r o m o s o m e p e a kw a s n
o t d i s c e r n i b l e .
s i g n a l s c a n b e s e e n a s r i d g e s i n f r o n t o
f t h e o n e -a n d t w o - c h r o m o s o m e p e a k s . Th e c
e l l c y c l e d i s -t r i b u t i o n o f t h e s e c e l l s
was t h e same a s i n t h em a i n p o p u l a t i o n o f t h e c
u l t u r e . T h i s f r a c t i o n o fl a r g e r c e l l s ( a
b o u t 1 0 % ) was n o t t a k e n i n t oc o n s i d e r a t i o
n i n c a l c u l a t i n g t h e r a t e s o f massi n c r e a s e
. T h e n a t u r e o f t h e s e l a r g e r c e l l s i s n o tk
n o w n .S e v e r a l o t h e r c u l t u r e s o f B / r A a n d
K w i t hd o u b l i n g t i m e s r a n g i n g f r o m 7 3 t o 4
0 0 m i n w e r ei n v e s t i g a t e d w i t h d u a l - p a r a
m e t e r f l o w c y t o -m e t r y . The h i s t o g r a m s w e
r e r e d u c e d t o s i n g l e -p a r a m e t e r h i s t o g r
a m s a s e x p l a i n e d a b o v e t oe s t i m a t e t h e c e
l l c y c l e p a r a m e t e r s ( T a b l e 1 ) . Th eB a n d C +
D p e r i o d s i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n gd o u
b l i n g t i m e , a n d t h e B p e r i o d o c c u p i e d a ni
n c r e a s i n g f r a c t i o n o f t h e c e l l c y c l e . B /
r A h a d as l i g h t l y l o n g e r B p e r i o d t h a n d i d
B / r K .B a t c h c u l t u r e s . T h e DNA a n d p r o t e i n
c o n t e n t so f b a t c h c u l t u r e s w e r e f o u n d t o
vary, e v e nd u r i n g s t r i c t e x p o n e n t i a l g r o w
t h . I n o n e b a t c hc u l t u r e o f s t r a i n B / r A ( F
i g . 3 ) , e x p o n e n t i a lg r o w t h was m a i n t a i n e
d f o r 3 . 5 h w i t h a d o u b l i n gt i m e o f 7 8 m i n ( F
i g . 3 F ) . C e l l u l a r DNA c o n t e n t sc a n b e s e e n
t o d e c r e a s e d u r i n g t h e s a m p l i n gp e r i o d .
H e n c e , t h e r e p l i c a t i o n k i n e t i c s musth a v e
b e e n c h a n g i n g w i t h t i m e . M o d e l s f o r s l o w
-l y g r o w i n g c e l l s ( T > 1 h ) p r e d i c t a maximum
o ftw o r e p l i c a t i o n f o r k s , i . e . , o n e t o tw o
c h r o m o -s o m e ( s ) per c e l l ( 3 ) , b u t t h e c e l l
s o f F i g . 3A a n dB h a v e DNA c o n t e n t s a s i f t h e y
were g r o w i n gw i t h a T < 1 h . A l s o , c e l l u l a r
p r o t e i n c o n t e n t sd e c r e a s e d d u r i n g t h e s
a m p l i n g p e r i o d . T h e ave r-a ge p r o t e i n c o n t
e n t o f t h e c e l l s i n F i g . 3A wast w i c e t h a t o f t
h e c e l l s i n F i g . 3 E . T h i s c o u l d b ee x p e c t e
d when t h e c e l l s a p p r o a c h s t a t i o n a r yp h a s e
, b u t t h e r e i s no i n d i c a t i o n o f t h i s i n t h eg
r o w t h curve. O t h e r s l o w l y g r o w i n g b a t c h c u
l -t u r e s o f B / r A a n d B / r K c e l l s s h o w e d a s i
m i l a rv a r i a t i o n i n c e l l u l a r DNA a n d p r o t e
i n c o n t e n t sd u r i n g t h e e x p o n e n t i a l g r o w
t h p h a s e . B e c a u s e o ft h i s v a r i a b i l i t y o f
g r o w t h , b a t c h c u l t u r e s w e r en o t u s e d f o r
t h e d e t e r m i n a t i o n o f c e l l c y c l ep a r a m e t
e r s B , C , a n d D .
DISCUSSIONT h e d a t a s h o w e d t h a t f o r B / r A c e l
l s , t h e Bp e r i o d i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i
n g d o u b l i n g t i m e .C + D a l s o i n c r e a s e d , b u
t t h e f r a c t i o n o f t h e c e l lc y c l e t h a t t h i s
p e r i o d o c c u p i e d d e c r e a s e d a s t h ed o u b l i
n g t i m e i n c r e a s e d . T h e B / r K c e l l s s h o w e
da s i m i l a r p a t t e r n o f r e p l i c a t i o n b u t h a
d a s o m e -w h a t s h o r t e r B p e r i o d . O u r r e s u l
t s f o r s l o w l yg r o w i n g B / r K c e l l s a r e i n a g
r e e m e n t w i t h e a r l i e rs t u d i e s s h o w i n g a l
o n g B p e r i o d a n d a s h o r t Dp e r i o d ( 8 , 1 0 , 1 3
) . M o s t s t u d i e s o f s l o w l y g r o w -i n g B / r A c
e l l s h a v e g i v e n c e l l c y c l e s l a c k i n g o r
h a v i n g a v e r y s h o r t B p e r i o d ( 8 , 1 0 ) . T h
i s i s n o ti n a c c o r d a n c e w i t h o u r r e s u l t s o
r w i t h t h e f i n d -i n g s o f K u b i t s c h e k a n d Ne
wm a n ( 1 3 ) . T h e yf o u n d t h a t t h e C p e r i o d a p p
r o a c h e d a l i m i t i n gv a l u e o f 0 . 3 6 T a t v e r y
l o n g g e n e r a t i o n t i m e s ,w h e r e a s o u r m e a s
u r e m e n t g a v e 0 . 1 a n d 0 . 1 5 Tf o r t h e C p e r i o
d o f s l o w l y g r o w i n g B / r A a n d Kc e l l s , r e s p
e c t i v e l y . T h e E . c o l i B / r A u s e d i n t h ep r e
s e n t e x p e r i m e n t s w a s o b t a i n e d f r o m H . E
.K u b i t s c h e k . S i n c e o u r d a t a a g r e e w i t h t
h o s e o fK u b i t s c h e k a n d Newman, t h e s a m e f l o w
c y t o -m e t r i c e x p e r i m e n t w a s r e p e a t e d w i
t h a B / r As u b s t r a i n o b t a i n e d f r o m N . N a n n
i n g a . T h e r e -s u l t i n g h i s t o g r a m w a s q u i t
e s i m i l a r t o t h a t o f F i g .2 A , g i v i n g a B p e r
i o d o c c u p y i n g a m a j o r p a r t o ft h e c e l l c y c
l e .When g r o w i n g a t a p a r t i c u l a r r a t e , r o d -
s h a p e db a c t e r i a l i k e E . c o l i i n c r e a s e t h
e i r m a s s e s s e n -TABLE 2 . A v e r a g e r a t e o f m a s
s i n c r e a s e i n t h e c e l lc y c l e p e r i o d s o f B /
r A ( T = 1 7 h ) a n d B / r K( T = 1 6 h ) c e l l s
Avg r a t e o f m a s sS t r a i n P e r i o d i n c r e a s e(
c h a n n e l s / h )B 0 . 8 8B / r A C 2 . 4D 9 . 4B 3 . 1B / r K
C 3 . 8
D 6 . 3
J . B A C T E R I O L .
-
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V O L . 1 5 4 , 1 9 8 3 CELL CYCLE PARAMETERS OF E . COLI 6 6
1
IHTSATE L I G H T S C A T T E R
o z
- o I I ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~H CTEP - x
(-C~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~C> C oz
C C C
0
C - -w 0W0WZ~~II'! I I I I0 0 0*-~~~~~~~~~
-
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7/7
6 6 2 SKARSTAD, STEEN, AND BOYEt i a l l y b y e l o n g a t i o
n : t h e d i a m e t e r r e m a i n s r e l a -t i v e l y c o n
s t a n t ( 5 , 1 5 , 1 6 ) . Tw o m o d e l s o f e l o n -g a t i
o n h a v e b e e n p r e s e n t e d : e x p o n e n t i a l ( 9 ,
1 0 )a n d l i n e a r ( 4 - 6 , 1 1 , 1 6 , 2 3 ) , w i t h a d o
u b l i n g i ng r o w t h r a t e s o m e w h e r e d u r i n g t
h e c e l l c y c l e .O u r d a t a o n B / r K ( T = 1 6 h ) s h
o w e d a d o u b l i n gi n t h e a v e r a g e r a t e o f m a s
s i n c r e a s e i n t h e Dp e r i o d c o m p a r e d w i t h t
h e B a n d C p e r i o d s . T h i sa g r e e s w e l l w i t h t
h e m o d e l o f l i n e a r e l o n g a t i o n ,w i t h a d o u
b l i n g i n g r o w t h r a t e n e a r t h e b e g i n n i n go
f t h e D p e r i o d . T h e p a t t e r n o f m a s s i n c r e a
s e f o rB / r A ( T = 1 7 h ) , h o w e v e r , w a s q u i t e d
i f f e r e n t ,w i t h a m u c h l a r g e r ( 1 1 t i m e s g r
e a t e r ) a v e r a g er a t e o f m a s s i n c r e a s e a t t
h e e n d o f t h e c e l l c y c l ec o m p a r e d w i t h t h e
b e g i n n i n g . T h i s d o e s n o ts e e m t o b e i n a c c
o r d a n c e w i t h e i t h e r e l o n g a t i o nm o d e l . T
h u s , t h e t w o s u b s t r a i n s s e e m t o h a v es o m e
w h a t d i f f e r e n t m o d e s o f m a s s i n c r e a s e .F
o r b a t c h c u l t u r e s , t h e d i s t r i b u t i o n o f
DNAa n d c e l l s i z e may c h a n g e s i g n i f i c a n t l y
e v e n w h e nt h e c e l l c u l t u r e i s g r o w i n g w i t
h a c o n s t a n t d o u -b l i n g t i m e ( F i g . 3 ) . T h i
s may b e o n e o f t h er e a s o n s w h y s o m a n y d i f f e
r e n t r e s u l t s o f t h e c e l lc y c l e p a r a m e t e r
s o f s l o w l y g r o w i n g c u l t u r e sh a v e b e e n r e
p o r t e d .O u r r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h e e f f
i c i e n c y o f f l o wc y t o m e t r y f o r o b t a i n i n g
i n f o r m a t i o n o n b a c t e r i a lg r o w t h . S u b p o
p u l a t i o n s a n d i r r e g u l a r i t i e s i n c e l lc u
l t u r e s a r e e a s i l y a n d r a p i d l y d e t e c t e d .
T h u s ,t h e m e t h o d may a l s o f i n d c l i n i c a l a p
p l i c a t i o n s ,e . g . , i n t h e r a p i d d e t e c t i o
n o f b a c t e r i a l s e n s i t i v -i t y t o d r u g s .
ACKNOWLEDGMENTST h i s w o r k was s u p p o r t e d b y t h e N
o r w e g i a n C a n c e r S o c i e t y( L a n d s f o r e n i n
g e n mo t K r e f t ) .
LITERATURE CITED1 . B o y e , E . , a n d R . E . K r i s c h .
1 9 8 0 . I n d u c t i o n a n d r e p a i r o fDNA d o u b l e -
s t r a n d b r e a k s i n b a c t e r i o p h a g e l a m b d a s
u -p e r i n f e c t i n g E . c o l i . I n t . J . R a d i a t .
B i o l . 3 7 : 1 1 9 - 1 3 3 .2 . C h u r c h w a r d , G . , a n
d H . B r e m e r . 1 9 7 7 . D e t e r m i n a t i o n o f
d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d r e p l i c a t i o n t
i m e i n e x p o n e n t i a l l yg r o w i n g E s c h e r i c h
i a c o l i B / r . J . B a c t e r i o l . 1 3 0 - . 1 2 0 6 - 1 2
1 3 .3 . C o o p e r , S . , a n d C . E . H d m s t e t t e r . 1
9 6 8 . C h r o m o s o m er e p l i c a t i o n a n d d i v i s i
o n c y c l e i n E s c h e r i c h i a c o l i B / r . J .M o l .
B i o l . 3 1 : 5 1 9 - 5 4 0 .4 . C u l l u m , J . , a n d M. V i
e n t e . 1 9 7 7 . C e l l g r o w t h a n d l e n g t hd i s t r
i b u t i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c t e r i
o l . 1 3 4 : 3 3 0 - 3 3 7 .
J . B A C T E R I O L .5 . D o n a h l e , W. D . , a n d K . J
. B e g g . 1 9 7 0 . G r o w t h o f t h eb a c t e r i a l c e l
l . N a t u r e ( L o n d o n ) 2 2 7 : 1 2 2 0 - 1 2 2 5 .6 . D o
n a c h l e , W. D . , K . J . B e g g , a n d M. V i c e n t e . 1
9 7 6 . C e l ll e n g t h , c e l l g r o w t h a n d c e l l d i
v i s i o n . N a t u r e ( L o n d o n )2 6 4 : 3 2 8 - 3 3 3 .7 .
G e r h a r d t , P . , R . G . E . M u r r a y , R . N . C o s d l
m w , E . W.
N e s t e r , W. A . W o o d , N . R . K r l e g , a n d G . B .
P h i l l p s . 1 9 8 1 .M a n u a l o f m e t h o d s f o r g e n
e r a l b a c t e r i o l o g y , p 1 5 9 - 1 6 5 .A m e r i c a n
S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y , W a s h i n g t o n ,
D . C .8 . Heser, C . E . , a n d 0 . P l e r u c d . 1 9 7 6 . DNA
s y n t h e s i sd u r i n g t h e d i v i s i o n c y c l e o f t
h r e e s u b s t r a i n s o f E s c h e r i c h -i a c o l i B /
r . J . M o l . B i o l . 1 0 2 : 4 7 7 - 4 8 6 .9 . K o c h , A .
L . 1 9 7 7 . D o e s t h e i n i t i a t i o n o f c h r o m o s o
m er e p l i c a t i o n r e g u l a t e c e l l d i v i s i o n ?
A d v . M i c r o b . P h y s i o l .1 6 : 4 9 - 9 8 .1 0 . K o p p
e s , L . J . H . , C . L . W o d r i n g h , a n d N . N a n n l n
a .1 9 7 8 . S i z e v a r i a t i o n s a n d c o r r e l a t i o
n o f d i f f e r e n t c e l l c y c l ee v e n t s i n s l o w g
r o w i n g E s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c t e r i o l
.1 3 4 : 4 2 3 - 4 3 3 .1 1 . K u b i t s c b e k , H . E . 1 9 8 1
. B i l i n e a r c e l l g r o w t h o f E s c h e r i c h -i a c
o l i . J . B a c t e r i o l . 1 4 8 : 7 3 0 - 7 3 3 .1 2 . K u b
i t s c h e k , H . E . , a n d M. L . F r e e d m a n . 1 9 7 1 .
C h r o m o -s o m e r e p l i c a t i o n a n d t h e d i v i s i
o n c y c l e o f E s c h e r i c h i a c o l iB / r . J . B a c t
e r i o l . 1 0 7 : 9 5 - 9 9 .1 3 . K u b i t a c h e k , H . E .
, a n d C . N . N e w m a n . 1 9 7 8 . C h r o m o -s o m e r e p
l i c a t i o n d u r i n g t h e d i v i s i o n c y c l e i n s l
o w l y g r o w -i n g , s t e a d y - s t a t e c u l t u r e s o
f t h r e e E s c h e r i c h i a c o l i B / rs t r a i n s . J .
B a c t e r i o l . 1 3 6 : 1 7 9 - 1 9 0 .1 4 . L a r k , C . 1 9
6 6 . R e g u l a t i o n o f d e o x y r i b o n u c l e i c a c i
d s y n -t h e s i s i n E s c h e r i c h i a c o l i : d e p e n
d e n c e o n g r o w t h r a t e s .B i o c h i m . B i o p h y s
. A c t a 1 1 9 : 5 1 7 - 5 2 5 .1 5 . M e y e r , M ., M. A . d e
J o n g , R . D e n e t , a n d N . N a n n n g a .1 9 7 9 . L e n
g t h g r o w t h o f t w o E s c h e r i c h i a c o l i B / r s u
b -s t r a i n s . J . B a c t e r i o l . 1 3 8 : 1 7 - 2 3 .1 6 .
P l e r u c c l , 0 . 1 9 7 8 . D i m e n s i o n s o f E s c h e r
i c h i a c o l i a tv a r i o u s g r o w t h r a t e s : m o d e
l f o r e n v e l o p e g r o w t h . J .
B a c t e r i o l . 1 3 5 : 5 5 9 - 5 7 4 .1 7 . S t e e n , H .
B . 1 9 8 0 . F u r t h e r d e v e l o p m e n t s o f a m i c r o
s c o p e -b a s e d f l o w c y t o m e t e r : l i g h t s c a t
t e r d e t e c t i o n a n d e x c i t a -t i o n i n t e n s i t
y c o m p e n s a t i o n . C y t o m e t r y 1 : 2 6 - 3 1 .1 8 .
S t e e n , H . B . , a n d E . B o y e . 1 9 8 0 . E s c h e r i c
h i a c o l i g r o w t hs t u d i e d b y d u a l - p a r a m e t
e r f l o w c y t o p h o t o m e t r y . J . B a c -t e r i o l .
1 4 5 : 1 0 9 1 - 1 0 9 4 .1 9 . S t e e n , H . B . , a n d E . B
o y e . 1 9 8 0 . B a c t e r i a l g r o w t h s t u d i e db y f
l o w c y t o m e t r y . C y t o m e t r y 1 : 3 2 - 3 6 .2 0 . S
t e e n , H . B . , E . B o y e , K . S k a r s t a d , B . B l o o
m , T . G o d a l ,a n d S . M u s t a f a . 1 9 8 2 . A p p l i c
a t i o n s o f f l o w c y t o m e t r y o nb a c t e r i a : c e
l l c y c l e k i n e t i c s , d r u g e f f e c t s a n d q u a n
t i t a t i o no f a n t i b o d y b i n d i n g . C y t o m e t r
y 2 : 2 4 9 - 2 5 7 .2 1 . S t e e n , H . B . , a n d T . L i n d
m o . 1 9 7 9 . F l o w c y t o m e t r y : a h i g hr e s o l u t
i o n i n s t r u m e n t f o r e v e r y o n e . S c i e n c e 2 0
4 : 4 0 3 - 4 0 4 .2 2 . S u e o k a , N . , a n d H . Y o s h i k
a w a . 1 9 6 5 . T h e c h r o m o s o m e o fB a c i l l u s s u
b t i l i s . I . T h e o r y o f m a r k e r f r e q u e n c y a n
a l y s i s .G e n e t i c s 5 2 : 7 4 7 - 7 5 7 .2 3 . Z a r l t s
k y , A . , a n d R . H . P r i t c h a r d . 1 9 7 3 . C h a n g e
s i n c e l ls i z e a n d s h a p e a s s o c i a t e d w i t h c
h a n g e s i n t h e r e p l i c a t i o nt i m e o f t h e c h r
o m o s o m e o f E s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c t e r i
o l .1 1 4 : 8 2 4 - 8 3 7 .
