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Efecto del ácido clorogénico sobre la actividad de enzimas antioxidantes en enterocitos de rata.Diciembre 2009Universidad Autónoma de Ciudad JuárezInstituto de Ciencias BiomédicasPrograma de Ciencias BásicasPrograma de Química
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ
INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS
EFECTO DEL ÁCIDO CLOROGÉNICO SOBRE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS
ANTIOXIDANTES EN ENTEROCITOS DE RATA
POR
JONATHAN ALONSO TREJO VILLALOBOS
TESIS
LICENCIATURA EN QUIMICA
CD. JUÁREZ, CHIHUHUA, MÉXICO DICIEMBRE, 2009
ii
EFECTO DEL ÁCIDO CLOROGÉNICO SOBRE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS
ANTIOXIDANTES EN ENTEROCITOS DE RATA
POR
JONATHAN ALONSO TREJO VILLALOBOS
TESIS
_____________________________________________________ DRA. LAURA ALEJANDRA ARDILLA DE LA ROSA CARRILLO DIRECTOR DE INVESTIGACIÓN _____________________________________________________ DR. EMILIO ALVAREZ PARRILLA DIRECTOR DE INVESTIGACIÓN _____________________________________________________ M. en C. KATYA AIMEE CARRASCO URRUTIA COORDINADOR DEL PROGRAMA _____________________________________________________ DR. ALEJANDRO MARTINEZ MARTINEZ JEFE DEL DEPARTAMENTO _____________________________________________________ M.C. HUGO SALVADOR STAINES OROZCO DIRECTOR DEL INSTITUTO
FECHA:___ DICIEMBRE 2009______
iii
A todos aquellos sin nombre ni pronombre, a la temporalidad inexistente que está entre nosotros y a los seres libres presos de la soledad.
A los muertos que siguen vivos, con la esperanza que un día
hayan vivido sin estar muertos.
A la palabra que trastoca y al silencio que sana…
Por un Universo en equilibrio, por que el humano respete y honre: la naturaleza de su divinidad, la divina naturalidad, la naturaleza divina, la divinidad de su naturaleza, la naturalidad de su divinidad…
A los locos incomprendidos, a los soñadores, a los sonrientes, a los que creen… a los que se atreven a sentir.
A Morfeo, padre de todos los posibles imposibles, guía de sabiduría, almacén de respuestas, consejos, avisos, visiones, periplos, descansos y desvaríos…
A Lucio, Ramona y Socorrito…
iv
v
AGRADECIMIENTOS
Carmen y Saúl (mis padres), ETERNAMENTE agradecido. A los directores de esta tesis por creer en mis capacidades a pesar de todo.
A todos los que con su presencia y ausencia, palabra, obra y omisión, han estado a lo largo de este recorrido.
MIYOTU… gracias!
vi
TABLA DE CONTENIDO
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................................. v
TABLA DE CONTENIDO ....................................................................................................................... vi
ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................................................... viii
INDICE DE TABLAS .............................................................................................................................. ix
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................... 1
CAPÍTULO 1 ......................................................................................................................................... 3
1.1 Antecedentes ............................................................................................................................... 3
1.1.1 Estrés oxidativo ..................................................................................................................... 3
1.1.2 Especies reactivas de oxigeno (ROS) .................................................................................... 3
1.1.3 Antioxidantes ......................................................................................................................... 5
1.1.4 Enzimas antioxidantes ........................................................................................................... 8
1.1.5 Polifenoles ........................................................................................................................... 18
1.2 Hipótesis. ................................................................................................................................... 27
1.3 Objetivo ...................................................................................................................................... 28
CAPITULO 2 ....................................................................................................................................... 29
2.1 Reactivos y materiales ............................................................................................................... 29
2.1.1 Buffer o solución reguladora de Krebs ................................................................................. 29
2.1.2 Buffer o solución reguladora de fosfatos ............................................................................. 29
2.1.3 PBS 1X ................................................................................................................................ 30
2.1.4 Pirogalol .............................................................................................................................. 30
2.1.5 Peróxido de hidrógeno ......................................................................................................... 30
2.1.6 Tioéter glutatión dinitrobenceno ........................................................................................... 30
2.1.7 Ratas ................................................................................................................................... 30
2.2 Obtención del intestino ............................................................................................................... 30
2.3 Diseño del experimento .............................................................................................................. 31
2.4 Extracto proteico ........................................................................................................................ 31
2.5 Cuantificación de proteína total .................................................................................................. 32
2.6 Cuantificación de actividad enzimática ....................................................................................... 34
2.6.1 Catalasa .............................................................................................................................. 34
2.6.2 Superóxido dismutasa (SOD) .............................................................................................. 35
vii
2.6.3 Glutatión tio-tranferasa (GST) .............................................................................................. 36
2.6.4 Análisis estadístico .............................................................................................................. 38
CAPÍTULO 3 ....................................................................................................................................... 39
3.1 Resultados ................................................................................................................................. 39
3.1.1 Proteína total ....................................................................................................................... 39
3.1.2 Actividades enzimáticas ....................................................................................................... 40
3.2 Discusión y Conclusión .............................................................................................................. 42
3.3 Recomendaciones ..................................................................................................................... 44
Referencias bibliográficas. ................................................................................................................... 46
viii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura química de los polifenoles. Los polifenoles se dividen en flavonoides y no
flavonoides (Manach, Sacalbert et al.2004). ............................................................................ 19
Figura 2. Estructura química del ácido caféico. El 3,4 ácido dihidroxicinámico, mejor conocido
como ácido caféico ................................................................................................................... 24
Figura 3. Estructura química del ácido clorogénico. Es el éster del ácido caféico con ácido
quínico ...................................................................................................................................... 25
Figura 4. Cuantificación GST. Reacción en la que se fundamenta la técnica para la
cuantificación de GST .............................................................................................................. 37
Figura 5. Gráfico de calibración. A partir de esta recta se determinó la concentración de
proteína de cada muestra analizada. ....................................................................................... 39
Figura 6. Actividad enzimática relativa. La actividad de cada enzima está representada en
porcentaje ± el coeficiente de variación. Con referencia a las muestras control se observa que
la actividad de GST y SOD aumentó en presencia del ácido clorogénico en contraste con la
catalasa, la cual disminuyó su actividad. .................................................................................. 42
ix
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Sistema de defensa in vivo contra el daño oxidativo (Noguchi y Niki 1999). ................7
Tabla 2. Concentración de proteína total. La columna control muestra las concentraciones de
las muestras que no llevaron el tratamiento con ácido clorogénico; la columna CGA, de las
que fueron tratadas con ácido clorogénico. La concentración se expresa en mg/mL. ............. 40
Tabla 3. Actividades enzimáticas. Las actividades enzimáticas se presentan en Unidades de
enzima por miligramo de proteína ± el error estándar, en tanto que los valores relativos
reportan porcentaje de actividad enzimática ± coeficiente de variabilidad. La columna de ácido
clorogénico indica que son los valores obtenidos de las muestras tratadas con ácido
clorogénico. La columna control representa los valores obtenidos de las muestras en ausencia
de acido clorogénico ................................................................................................................. 41
1
INTRODUCCIÓN
En el presente trabajo se estudiará el efecto de la absorción del ácido clorogénico en el
intestino de rata sobre las enzimas superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y
glutatión tio-transferasa (GST). Por lo tanto se habla de compuestos fenólicos, especies
reactivas de oxígeno, radicales libres y la absorción de polifenoles en el intestino de la
rata.
El ácido clorogénico es uno de los polifenoles más abundantes en la dieta humana, es
por ello la importancia de conocer el efecto que este compuesto pueda ejercer sobre las
enzimas SOD, CAT y GST.
Conocer si la actividad de estas enzimas es modificada o no, es fundamental para abrir
paso porque se puede relacionar el efecto del consumo de café o cualquier alimento
rico en polifenoles, con el desencadenamiento de las reacciones de los antioxidantes
endógenos, evityo así el daño causado por el estrés oxidativo.
El estrés oxidativo inducido por las especies reactivas de oxígeno producidas por
acción metabólica normal, además de varios factores como el hábito de fumar, el
exceso o falta de ejercicio y una mala alimentación, contribuyen de manera importante
al desarrollo de enfermedades crónicas como el cáncer, diabetes, enfermedades
cardiovasculares, así como las crónico degenerativas (Rao y Rao 2007).
El cuerpo humano utiliza varios antioxidantes para defenderse del ataque de los
radicales libres, muchos de los cuales obtiene de la dieta. Una alimentación basada en
el consumo de antioxidantes juega un importante papel en el mantenimiento de la salud
2
porque los antioxidantes endógenos no proveen suficiente protección contra las
especies reactivas de oxígeno (Benzie 2003) .
Los radicales libres son neutralizados por acción enzimática y no enzimática. La acción
enzimática es ejercida por enzimas como superóxido dismutasa, catalasa, GST, entre
otras. En cambio la neutralización no enzimática la realizan numerosos antioxidantes
como las vitaminas A, C y E, glutatión, compuestos fenólicos, etcétera (Urso y Clarkson
2003).
Sin embargo el mecanismo de acción de los antioxidantes no se ha descrito
claramente y el propósito de este trabajo es el de averiguar si el ácido clorogénico
influye en la actividad antioxidante de las enzimas superóxido dismutasa, catalasa y
glutatión tio-transferasa (Manach, Sacalbert et al. 2004).
3
CAPÍTULO 1
1.1 Antecedentes
1.1.1 Estrés oxidativo
El estrés oxidativo se define como el desequilibrio que ocurre entre el sistema de
antioxidantes y los radicales libres y/o las especies oxidantes, favoreciendo a estos
últimos (Bonnefoy, Drai et al. 2002; Mayne 2003; Barbosa, Bressan et al. 2008). La
generación de radicales libres, así como de especies reactivas de oxígeno en grandes
cantidades e incluso una baja velocidad de neutralización de los mismos, propicia la
oxidación de biomoléculas como lípidos, proteínas y ADN, lo cual trae como
consecuencia el daño oxidativo a células y tejidos (Jacob y Burri 1996; Bonnefoy, Drai
et al. 2002; Barbosa, Bressan et al. 2008).
Se ha sugerido que el estrés oxidativo, que conlleva a la oxidación a biomoléculas,
contribuye etiológicamente al desarrollo de diversas enfermedades crónicas como lo
son el cáncer, enfermedades cardiovasculares, cataratas, diabetes, obesidad,
aterogénesis, trastornos neurodegenerativos, entre otras enfermedades relacionadas a
la edad (Mayne 2003; Barbosa, Bressan et al. 2008).
1.1.2 Especies reactivas de oxigeno (ROS)
La transferencia de electrones es uno de los procesos fundamentales en la química, el
paso de un electrón o un par de ellos de un donante a un receptor resulta en el cambio
de las propiedades para ambas partes de la reacción (Larson 1997).
4
La oxidación se definió inicialmente como la incorporación de un oxígeno a una
sustancia, sin embargo esta definición es obsoleta, ya que se sabe que una oxidación
es la conversión de una sustancia química a una con menos electrones. Entonces, la
oxidación es la pérdida de uno o más electrones, estos electrones perdidos son
ganados por otra especie química, la cual se reduce (Larson 1997).
Los radicales libres son especies químicas con electrones desapareados y ejemplos de
ello son: el anión superóxido (O2●-), el radical nitrilo (NO●) y el radical hidroxilo (OH●); así
como las especies derivadas del oxigeno como el peróxido de hidrogeno (H2O2) y el
hipoclorito ácido (HClO), las cuales se encuentran en el cuerpo humano por ser
productos del metabolismo común (Jacob y Burri 1996; Noguchi y Niki 1999). En las
moléculas, los electrones generalmente están presentes en pares; bajo ciertas
condiciones, estas moléculas llegan a tener desapareados los electrones,
convirtiéndose en radicales libres (Noguchi y Niki 1999). Los radicales libres están en
constante búsqueda de electrones para aparearse con ellos y así estabilizar la
molécula, no obstante al aparearse estos radicales libres condicionalmente desaparean
a los electrones de la molécula de la cual tomaron el electrón para estabilizarse
(Noguchi y Niki 1999).
Los radicales libres así como las especies reactivas de oxígeno son parte integral de
nuestro metabolismo, de hecho estas moléculas son producidas naturalmente ya que
sirven para importantes funciones biológicas (Noguchi y Niki 1999).
Los fagocitos activados utilizan a las especies reactivas de oxigeno para matar algunas
bacterias y hongos invasores; el superóxido sirve en la regulación del crecimiento
celular y la señalización intracelular (Papas 1999). A pesar de sus beneficios, las
5
especies reactivas de oxígeno y los radicales libres, al ser producidos en exceso o en
momentos que no son requeridos por el organismo, es cuyo el daño celular por
oxidación se hace presente, ya que los radicales libres y las especies reactivas de
oxígeno son moléculas extremadamente reactivas y atacan al instante a las moléculas
que se encuentran más próximas a ellas, provocando así el inicio de una serie de
eventos desfavorables para la célula, mediante una cadena de reacciones como lo es la
peroxidación de lípidos, así también se presenta el daño a ADN y otras biomoléculas
como proteínas y carbohidratos (Papas 1999).
Para prevenir el daño causado por estas especies químicas, el organismo (humano,
entre otros), ha desarrollado un complejo y potente sistema de defensa como lo son los
antioxidantes (Papas 1999).
1.1.3 Antioxidantes
Existen varios tipos de antioxidantes con diferentes funciones que desempeñan un
papel muy importante en la defensa contra la oxidación (Noguchi y Niki 1999). Los
organismos aerobios se protegen del estrés oxidante y de las especies reactivas de
oxigeno (ROS, por sus siglas en ingles) con los antioxidantes (Noguchi y Niki 1999).
En la primera línea de defensa se encuentran los antioxidantes preventivos, los cuales
impiden la formación de radicales libres y especies reactivas de oxigeno (Noguchi y Niki
1999). Los responsables de la siguiente línea defensiva son los antioxidantes de barrido
o rescate, cuya función consiste en inhibir la iniciación de la cadena de propagación o
en su caso frenarla (Noguchi y Niki 1999). La responsabilidad de la tercera y última
línea de defensa se encuentra en las enzimas antioxidantes como las fosfolipasas,
6
proteasas, reparadoras de ADN y transferasas (Noguchi y Niki 1999). Una
especialización de este mecanismo de defensa es la adaptación de poder generar y
transferir los antioxidantes adecuados, al lugar indicado, en la concentración necesaria
y en el momento preciso (Noguchi y Niki 1999). En la Tabla 1 se muestran de manera
más detallada el sistema defensivo celular contra el daño oxidativo.
7
Tabla 1.- Sistema de defensa in vivo contra el daño oxidativo (Noguchi y Niki 1999).
1. Antioxidantes preventivos. Supresión de la formación de radicales libres
a) Descomposición de hidroperóxidos y peróxidos de hidrogeno
Catalasa Descomposición de peróxido de hidrogeno
2H2O2 2H2O + O2
Glutatión peroxidasa (celular)
Descomposición de peróxido de hidrogeno e hidroperóxidos de ácidos grasos libres
H2O2 + 2GSH H2O + GSSG
LOOH + 2GSH LOH + H2O + GSSG
Glutatión peroxidasa (plasma)
Descomposición de peróxido de hidrogeno y fosfolípidos Hidroperoxidados
PLOOH + 2GSH PLOH + H2O + GSSG
Peroxidasa Descomposición del peróxido de hidrogeno y lípidos hidroperoxidados
LOOH + AH2 LOH + H2O + 2
H2O2 + AH2 2H2O + A
Glutatión tio-transferasa Descomposición de lípidos hidroperoxidados
b) Secuestro de metales por quelación Transferrina, lactoferrina Secuestro de hierro (fierro)
Haptoglobina Secuestro de hemoglobina
Hemopexina Estabilización del grupo hemo
Ceruloplasmina, albumina Secuestro de cobre
c) Amortiguamiento de especies reactivas de oxigeno Superóxido dismutasa (SOD)
Desproporción molecular de superóxido
2O2•- + 2H
+ H2O2 + O2
Carotenoides, vitamina E Amortiguamiento de oxigeno singulete
2. Antioxidantes de rescate de radical: radicales que actúan por inhibición del inicio y rompimiento de la cadena de propagación
Hidrofílicos Vitamina C, ácido úrico, bilirrubina, albumina
Lipofílicos Vitamina E, ubiquimol, carotenoides, flavonoides
3. Enzimas de reparación: reparación del daño y reconstitución de membranas
Lipasa, proteasa, enzimas reparadoras de ADN, transferasa
4. Adaptación: generación de las enzimas antioxidantes y las transfieren al sitio adecuado en el momento indicado a la concentración necesaria.
8
1.1.4 Enzimas antioxidantes
Los radicales libres liberados por los seres vivos que emplean el oxígeno para la
obtención de energía no serian compatibles con la vida de no existir los mecanismos
celulares de defensa que trabajen en su neutralización (Zorrilla 2002). Este sistema de
defensa son los antioxidantes, mismos que son clasificados en endógenos y exógenos
(Zorrilla 2002).
Los antioxidantes endógenos son las enzimas encargadas de neutralizar los radicales
libres y las fundamentales son: catalasa, superóxido dismutasa (SOD), glutatión
peroxidasa (GPX) y glutatión reductasa (GR) (Zorrilla 2002; Gałecka, Jacewicz et al.
2008; Ugartondo 2009).
Los antioxidantes enzimáticos o endógenos son la primer línea defensiva antioxidante
que actúa contra el daño oxidativo por medio de la interacción de las ROS; actúan
como catalizadores y para ejercer su desempeño no son necesarias grandes
cantidades, además de ser reciclados con gran eficiencia luego de haber desempeñado
su función (Ugartondo 2009).
1.1.4.1 Superóxido dismutasa (SOD)
La familia de las enzimas superóxido dismutasas son un grupo de metaloenzimas que
con frecuencia se presentan en organismos aerobios, aerotolerantes y algunos
anaerobios obligados (García, Onel et al. 1995). Estas metaloenzimas han sido
clasificadas en cuatro grupos con base al metal que actúa como cofactor, teniendo así:
MnSOD, FeSOD, CuZnSOD y NiSOD (Díaz 2006), esta última, Lynch y Kiramitsu la
describieron recientemente en su trabajo titulado “Expression y role of superoxide
9
dismutases (SOD) in pathogenic bacteria” en el año 2000 (Díaz 2006). Entre los cuatro
grupos no existe homología de secuencias ni de estructuras en lo que a orden superior
se refiere, lo cual denota una evolución independiente en respuesta a la amenaza del
oxígeno con su toxicidad (García, Onel et al. 1995). Estos grupos de enzimas son
esenciales para afrontar el daño causado por la producción de metabolitos parcialmente
reducidos, mismos que son generados por la acción metabólica regular del organismo
al momento de reducir el oxigeno molecular (García, Onel et al. 1995; Díaz 2006).
En organismos eucariontes existen tres tipos de SOD localizados en diferentes regiones
celulares que trabajan conjuntamente para controlar los niveles de concentración del
radical peróxido (O2.-), estos tres tipos de SOD son: Mn-SOD ubicado en la mitocondria;
CuZn-SOD, en el citosol y CuZn-SOD, en la zona extracelular (García, Onel et al.
1995). Estas enzimas se encargan de catalizar la conversión del radical anión
superóxido (O2.-) en peróxido de hidrógeno (H2O2) y oxígeno molecular (O2), siendo
esta una de las reacciones catalizada por enzimas (Ecuación 1) más rápidas de las que
se conocen (García, Onel et al. 1995; Díaz 2006). Cabe mencionar que el peróxido de
hidrógeno producido por la SOD es eliminado por la catalasa y glutatión peroxidasa
(García, Onel et al. 1995). La velocidad de asociación del anión superóxido se ve
favorecida por el campo eléctrico de la SOD favoreciéndola 30 veces (García, Onel et
al. 1995).
O2.- + O2 - 2H+ H2O2 + O2 Ecuación 1.
La reacción depende de la difusión del anión superóxido y en la normalidad sus
concentraciones son bajas, empero, el acoplamiento de la enzima con el sustrato no es
10
sólo cuestión de difusión y colisión (García, Onel et al. 1995). Los factores que pueden
afectar la difusión del anión superóxido, así como la asociación con la enzima resultan
ser la estructura submolecular de la enzima, la distribución de carga electrostática,
interacciones de apantallamiento por disolventes inter e intramoleculares, y las
interacciones hidrodinámicas (García, Onel et al. 1995).
La función fundamental de la SOD consiste en eliminar el radical superóxido antes de
que éste pueda reaccionar con moléculas biológicas susceptibles o produzca otros
agentes tóxicos (García, Onel et al. 1995). La actividad de la SOD esta acoplada al
ciclo de oxido reducción al reducir el glutatión, que es una molécula que aporta
radicales sulfhidrilo (-SH), esta acción la hace merecedora del título de agente reductor
más efectivo que el organismo almacena (García, Orts et al. 2003).
La SOD fue descubierta por McCord y Fridovich en 1968 (Díaz, 2006 - difiere en la
fecha del descubrimiento, ella acota que fue en 1972); fue la primera enzima de la que
se tuvo conocimiento que ejercía acción sobre un radical libre, lo cual constituyó una
evidencia de que los radicales están presentes en los organismos vivos. Este
descubrimiento puso sobre la mesa de discusión la paradoja del oxígeno (García, Onel
et al. 1995; Díaz 2006; Gałecka, Jacewicz et al. 2008),
En el cromosoma 21 se encuentra el gen codificante de la SOD citosólica (CuZn-SOD)
y específicamente es en el segmento extra (21q22.11), el mismo cromosoma donde se
presenta el síndrome de Down, de ahí que los niveles de SOD se encuentren elevados
en la generalidad de estos casos (García, Onel et al. 1995; Ferreira 2000).
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Las diferencias estructurales de la CuZn-SOD humana son mínimas al comparar su
secuencia aminoacídica, comportamiento electroforético y espectrofotométrico con
respecto a la SOD bovina. Las dos actúan por igual, lo que hace posible que en
estudios experimentales, puedan emplearse indistintamente (García, Onel et al. 1995).
La forma nativa de la SOD citosólica se constituye por dos subunidades idénticas
unidas por puentes disulfuro, cada subunidad cuenta con un peso aproximado de
16KDa y 152 aminoácidos. El peso molecular que se reporta de la unidad dimérica es
31.2KDa (García, Onel et al. 1995). La característica aminoacídica es que un sexto del
total de aminoácidos de cada subunidad está constituido por veinticinco residuos de
glicina distribuidos uniformemente a lo largo de la secuencia, lo que provoca que la hoja
destaque en la estructura secundaria; así mismo, son característicos los cuantiosos
cambios direccionales del esqueleto peptídico, la presencia de ocho residuos
aromáticos de fenilalanina, solo dos residuos de tirosina y la falta de triptófano (García,
Onel et al. 1995). En la estructura de cada subunidad se encuentra un átomo de cobre
(Cu+2) y uno de zinc (Zn+2), el primero es vital para la acción catalítica y el segundo
desempeña un rol estructural, ambos situados entre dos asas de cadena polipeptídica
al extremo de un largo canal, de manera que el cobre queda expuesto parcialmente
hacia el disolvente (García, Onel et al. 1995). En el sitio activo se localizan cuatro
residuos de histidina, los cuales, mediante los nitrógenos imidazólicos se coordinan con
el ion cúprico y una molécula de agua. Esta coordinación alcanza al Zn+2 ya que uno de
los imidazoles que se encuentra unido al Cu+2 está desprotonado, provocando una
coordinación con el ion zinc; esto permite que sea utilizado como puente entre los iones
mencionados (García, Onel et al. 1995). Además, el Zn+2 se coordina con otros dos
12
imidazoles de residuos de histidina y a un residuo de ácido aspártico mediante el grupo
el carboxílico (García, Onel et al. 1995). La pérdida de todos o algunos de estos
metales, trae como consecuencia la disminución o ausencia de la actividad enzimática,
lo cual es un factor a considerar al momento de purificar la enzima (García, Onel et al.
1995).
1.1.4.2 Catalasa (CAT)
En la naturaleza, el grupo de las catalasas es uno de los más abundantes ya que están
presentes en todas las células eucariotas y procariotas que cuenten con un sistema de
citocromos (Martínez 2005). En el organismo humano, la catalasa se encuentra
distribuida ampliamente (Céspedes, Hernández et al. 1996). La actividad de la catalasa
varía en función del tejido, así tenemos que en hígado y riñones su actividad es más
elevada; más baja, en tejido conectivo y epitelios; nula, prácticamente en tejido nervioso
(Céspedes, Hernández et al. 1996). A nivel celular, la catalasa se halla en las
mitocondrias, peroxisomas y retículo endoplasmático; en el citoplasma, en células del
hígado, riñón, de la sangre y medula ósea (Céspedes, Hernández et al. 1996; Gałecka,
Jacewicz et al. 2008).
La catalasa es una metaloproteína homotetramérica constituida por cuatro
subunidades, cada una con un grupo prostético de proporfirina IX, las cuales se unen
por interacciones no covalentes; el peso molecular de este homotetrámero
metaloprotéico oscila entre los 210 y 350 kD, de los cuales el contenido protohémico
representa 1.1% y el de hierro 0.09% (Céspedes, Hernández et al. 1996; Gałecka,
Jacewicz et al. 2008).
13
Un importante rol que desempeña la catalasa al momento de que el organismo
presenta estrés oxidativo, es ser reservorio de nicotinamín adenín dinucleótido
fosfatado en su forma reducida (NADPH) (Céspedes, Hernández et al. 1996; Gałecka,
Jacewicz et al. 2008). Algunas especies de catalasa tienen ligada 1 molécula de
NADPH en cada subunidad, lo cual da 4 moléculas por homotetrámero metaloprotéico,
las cuales están ligadas estrechamente a la enzima (Céspedes, Hernández et al. 1996;
Gałecka, Jacewicz et al. 2008). Sin embargo, el NADPH no está involucrado en la
actividad catalítica o peroxidativa propia de la enzima, pero si puede intervenir en la
reversión parcial de la inactivación de la catalasa por su propio sustrato tóxico e incluso
prevenirla, además de estabilizar a la enzima por su efecto alostérico (Céspedes,
Hernández et al. 1996).
Una de las características de la catalasa es su gran capacidad de reacción, dentro de la
catalasa se descomponen 6 millones de moléculas de H2O2 en un minuto, y su relativa
baja afinidad por el sustrato (Céspedes, Hernández et al. 1996; Gałecka, Jacewicz et al.
2008). La función de la catalasa como parte del sistema de defensa antioxidante
consiste en catalizar la descomposición del peróxido de hidrógeno, que se genera
durante el metabolismo celular, en oxígeno molecular y agua (Céspedes, Hernández et
al. 1996; Gałecka, Jacewicz et al. 2008). Su actividad tiene dos funciones, una catalítica
y otra peroxidativa, que se representan en la Ecuación 2 (Céspedes, Hernández et al.
1996).
H2O2 + H2R 2H2O + R Ecuación 2
14
En la Ecuación 2 se puede observar la reducción del sustrato por los átomos de
hidrógeno que aporta el donador (H2R) y como resultado de la reacción el sustrato
queda reducido y el donador oxidado (Céspedes, Hernández et al. 1996). El donador
(R) en la función de catálisis es otra molécula de peróxido de hidrógeno Ecuación 3) y
sólo es llevada a cabo por la enzima cuyo se encuentra en su forma tetramérica
(Céspedes, Hernández et al. 1996).
H2O2 + H2O2 2H2O + +O2 Ecuación 3
En cambio, en la función peroxidativa el donador de hidrógeno puede ser: metanol,
etanol, ácido fórmico, fenol y formaldehido; esta reacción la enzima la puede llevar a
cabo con monómeros, dímeros y tetrámeros (Céspedes, Hernández et al. 1996).
Si bien el mecanismo completo de la catalasa no es conocido, se sabe que la reacción
química se produce en dos etapas:
La primera etapa es la reducción del peróxido de hidrógeno en agua, donde participan
los iones de fierro (Fe III) del grupo hemo y como resultado de esta reacción aparece el
compuesto Fe(V)-Ez (Ecuación 4) (Gałecka, Jacewicz et al. 2008). La segunda etapa es
la reacción de oxidación del Fe(V)-Ez por otra molécula de peróxido de hidrógeno
(Ecuación 5) (Gałecka, Jacewicz et al. 2008).
H2O2 + Fe(III)-Ez 2H2O + O=Fe(V)-Ez Ecuación 4
H2O2 + O=Fe(IV)-Ez H2O + Fe(III)-Ez + O2 Ecuación 5
En ambas ecuaciones el Fe(x)-Ez representa al núcleo de fierro del grupo hemo que
está unido a la enzima actuyo como cofactor.
15
La actividad de la catalasa puede ser inhibida por: cianuro, azida, sulfurola
hidroxilamina, paracetamol, bleomicina, adriamicina, benzidina y paraquat (Céspedes,
Hernández et al. 1996).
1.1.4.3 Glutatión S-Transferasa (GST)
Las Glutatión S-transferasa, son una de las principales familias de enzimas
destoxificantes que se ven involucradas en el metabolismo de diversos xenobióticos,
compuestos tóxicos electrofílicos y propios del organismo catalizyo la conjugación del -
glutamil-L-cisteinil-glicina (GSH), mejor conocido como glutatión, en productos no
tóxicos de fácil eliminación (Fritz-Wolf, Becker et al. 2003; Castillo, Contreras et al.
2007; Zapata 2007).
El Glutatión es un tripéptido antioxidante soluble en agua que está compuesto de
glicina, ácido glutámico y moléculas de cisteína; es sintetizado de novo en células de
mamíferos. La particularidad de este péptido es que el enlace peptídico que se
encuentra entre los residuos de glutamato y el residuo de cisteína, es formado con el
grupo G-carboxilato en contraste con la mayoría que se forma con el grupo a-
carboxilato.
Se sabe que el GSH actúa como agente reductor no específico, con el fin de mantener
la forma reducida del tiol en las proteínas, de tal manera que se impida la oxidación en
los residuos de cisteína y el entrecruzamiento entre sí para formar puentes disulfuro. La
conjugación del glutatión es considerado un mecanismo de protección innato, mismo
que fue desarrollado para proteger al organismo de compuestos dañinos en potencia.
Existen dos tipos de reacción de la conjugación con glutatión:
16
1. Reacción de desplazamiento.- en esta reacción el glutatión desplaza a un grupo
de electrones como halógenos, nitrilos y ácidos carboxílicos.
2. Reacción de adición: el glutatión es adicionado para activar estructuras de doble
enlace o sistemas cíclicos, por ejemplo la adición nucleofílica.
La reacción general de la GST que proporciona protección mediante la conjugación del
glutatión (RX + GSH –GST HX + GSR Ecuación 6) radica en el ataque nucleofílico por
parte del glutatión hacia el sustrato electrofílico mediante el poder de catálisis de la
GST, esto produce un enlace tioéter entre la cisteína del glutatión y el compuesto
electrofílico. El resultado, una molécula con mayor solubilidad en el agua para su
eliminación y así disminuir la reactividad. En algunos casos el resultado es inverso, el
glutatión termina por activar compuestos reactivos como haloalcanos y haloalquenos.
RX + GSH –GST HX + GSR Ecuación 6
De la RX + GSH –GST HX + GSR Ecuación 6 se desprende que R puede ser un
grupo alifático, aromático o heterocíclico, en tanto que X puede ser un grupo sulfato,
nitrato o un halógeno (Zapata 2007). La adición de epóxidos alifáticos y óxidos de
arenos al glutatión esta catalizada por la enzima, así como la reducción del nitrato de
poliol y algunas reacciones de intercambio de enlaces disulfuro e isomerización (Zapata
2007).
En la actualidad, se conoce de la existencia de 13 clases de enzimas en la familia de
las GST, de las cuales, las que más han tenido atención por parte de los investigadores
son las pertenecientes a los mamíferos; estas, las de clase alfa (), mu (µ) y pi (π),
tienen una capacidad de procesar distintas especies de sustratos (Zapata 2007). La
17
GST puede presentarse en su estado nativo como un monómero, dímero e incluso
como trímero; el estado nativo será determinado por la localización de la enzima en la
célula y la familia a la que pertenece (la enzima) (Zapata 2007).
Las GSTs de los mamíferos se diferencian en tres tipos: citosólica, mitocondrial y
microsomal (Zapata 2007). La del tipo citosólica es la GST principal y más abundante,
se han identificado 8 clases de GST citosólica, es soluble, y es altamente polimórfica.
La parte mitocondrial es soluble en tanto que la microsomal es conocida como MAPEG
(proteínas de membrana asociadas en metabolismo de eicosanoides y glutatión). Estas
enzimas son de membrana pequeña y desempeñan un rol clave en el metabolismo
endógeno de leucotrienos y prostaglyinas; ambas fracciones (mitocondrial y
microsomal), dependiendo del tejido, constituyen entre el 10 y 30% de la actividad
catalíca cuyo es expresada en actividad por cantidad de proteína (Zapata 2007).
La inducción de la actividad de la GST tanto a nivel de sitio especifico como genético,
es producida por una amplia variedad de estímulos naturales y sintéticos que han sido
identificados. Estos agentes inductores van desde barbitúricos, hidrocarburos
aromáticos policíclicos, hasta antioxidantes y productos naturales. Donde se ha podido
observar esta inducción ha sido en hígado, esófago, estómago e intestino.
Para el estudio enzimático de GST, tanto para conocer su especificidad como la
cinética enzimática, existe una gran cantidad de sustratos que pueden ser empleados,
sin embargo el 1-cloro 2,4-dinitrobenceno (CDNB) ha sido catalogado como el sustrato
universal para GST en lo que a estudios enzimáticos con fines prácticos se refiere
(Habig y Jakoby 1981; Zapata 2007).
18
1.1.5 Polifenoles
El término polifenol o fenólico, se define como una sustancia que posee un anillo
aromático con uno o más hidroxilos como sustituyentes, además de los cuales se
puede incluir derivados funcionales como ésteres, metil éteres, glucósidos, entre otros
(Figura 1) (Shahidi y Ho 2005).
Los compuestos fenólicos y polifenólicos se encuentran en los alimentos como
metabolitos secundarios, donde se puede encontrar una gran variedad de clases de
compuestos fenólicos con propiedades benéficas para la salud por su poder
antioxidante, mismo que genera un efecto anticarcinogénico, entre otros (Shahidi y Ho
2005).
Los compuestos fenólicos tienen la capacidad de actuar como agentes protectores
contra los radicales libres, causantes de diversas patologías en el hombre (Carbonaro y
Grant 2005).
19
Figura 1. Estructura química de los polifenoles. Los polifenoles se dividen en flavonoides y no
flavonoides (Manach, Sacalbert et al. 2004).
1.1.5.1 Flavonoides
Los flavonoides son polifenoles con un esqueleto C6-C3-C6; con alrededor de 5000
diferentes compuestos identificados, constituyen parte de nuestra dieta no energética
(Carbonaro y Grant 2005). Los datos actualizados acerca de la biodisponibilidad de los
flavonoides son aun contradictorios y los mecanismos de absorción, inciertos
(Carbonaro y Grant 2005). La actividad antioxidante de una dieta rica en flavonoides
últimamente ha llamado mucho la atención por su aparente papel preventivo en las
20
enfermedades crónicas relacionadas al estrés oxidativo como diabetes y enfermedades
del corazón. Los flavonoides están ampliamente distribuidos en el reino de los
vegetales (plantas) y están divididos en categorías como flavonoles, flavanoles,
flavononas, flavonas, antocianinas e isoflavonas (Murota y Terao 2003).
Los flavonoides son encontrados normalmente en su forma glucosilada, es decir, uno o
más grupos de azúcar esta unido al grupo fenólico mediante enlace glucosídico (Murota
y Terao 2003). De manera general los glucósidos de quercetina contienen el grupo
azúcar en la posición 3, como ejemplo esta la isoquercetina (quercetina 3-O-β-
glucósido;Q3G), encontrándose comúnmente distribuidos en una amplia variedad de
vegetales. El estimado total de flavonoides tomados en la ingesta diaria es de varios
cientos de miligramos por día (Murota y Terao 2003).
Puesto que los compuestos (flavonoides) se presentan principalmente como
conjugados glucosídicos, tienen una mayor importancia ya que pueden ser absorbidos
en el intestino delgado sin que el enlace β-glucosídico sea cortado (Carbonaro y Grant
2005).
La quercetina (3,3’,4’,5,7-pentahidroxiflavona) es el flavonoide mas común presente en
frutas y verduras (Murota y Terao 2003). En estudios anteriores se ha observado que
las formas intactas glucosiladas de la quercetina fueron absorbidas en el intestino
delgado, sin embargo los glucósidos de quercetina difieren ampliamente en su
biodisponibilidad, y en conjugación con la glucosa aumenta la absorción en el intestino
delgado, por lo que se cree que la entrada de los flavonoides glucosilados hacia los
enterocitos es por medio del transportador de glucosa dependiente de sodio (Carbonaro
y Grant 2005).
21
Numerosos estudios in vitro dan cuenta de los diversos efectos biológicos de la
quercetina, donde se incluyen la inducción de apoptosis, antimutagénesis, inhibición de
la proteína-quinasa C (PKC), inhibición de la lipoxigenasa, inhibición de la liberación de
histamina, actividad de la superóxido dismutasa (SOD), modulación del ciclo celular,
inhibición de la angiogénesis, y la inhibición de la enzima II convertidora de
angiotensina (Murota y Terao 2003).
Los grupos hidroxilos de la estructura fenólica en los flavonoides, son los que actúan
como donadores de electrones, es por ello que hacen de los flavonoides compuestos
antioxidantes con actividad radical de rescate (Murota y Terao 2003). El poder
antioxidante de los flavonoides puede ser explicado por su acción quelante, porque los
iones de metales de transición como lo es el ión fierro, juegan un papel crucial en la
generación de especies reactivas de oxígeno por la reacción Fenton (Murota y Terao
2003).
La estructura del catecol dentro de los flavonoides tiene una importancia relevante,
porque posee dos grupos hidroxilos en posiciones vecinas, que lo hace notablemente
superior a disposiciones en la capacidad donante de electrones, por lo tanto, quercetina
y otros flavonoides que contienen la estructura catecol pueden ejercer una actividad
más potente como radical rescate (Murota y Terao 2003).
1.1.5.2 No flavonoides
De las estructuras de polifenoles que no hacen referencia a los flavonoides se encontró
que existen tres grupos: los estilbenos, los lignanos y los ácidos fenólicos. Los
estilbenos son estructuras que a pesar de no ser muy numerosas (200
aproximadamente), se encuentran en varias especies de vegetales. En especies
22
arbóreas como el pino y eucalipto se encuentran en la médula troncal. En la dieta
humana se encuentran en bajas cantidades (Manach, Sacalbert et al. 2004). La forma
molecular más extendida de los estilbenos es el resveratrol, característico de las
familias Pinaceae y Vitaceae. El resveratrol es acumulado principalmente en la
epidermis de la uva, vital razón de que las uvas y el vino signifiquen en la dieta una
fuente casi exclusiva de este antioxidante (Palazón, Cusidó et al. 2001).
Los lignanos son estructuras que tienen la función de fitohormonas en las plantas pero
que en el metabolismo del hombre funcionan como antioxidantes (Morris 2007). Se
componen por dos unidades de fenilpropano (Manach, Sacalbert et al. 2004).La gran
mayoría de plantas ricas en fibra son fuente confiable de lignanos (Morris 2007). Sin
embargo, la linaza es la principal fuente de lignanos vegetales, especialmente de
secoisolariciresinol diglicósido (SDG), aunque también presenta otros como el
matairesinol, pinoresinol, lariciresinol, isolariciresinol y secoisolariciresinol (SECO)
(Manach, Sacalbert et al. 2004; Morris 2007). En el colon humano, los lignanos
mencionados, a excepción del isolariciresinol, son transformados por las bacterias
propias de dicho órgano en los lignanos mamíferos enterodiol y enterolactona (Manach,
Sacalbert et al. 2004; Morris 2007).
Los ácidos fenólicos tienen mención en la siguiente sección.
1.1.5.2.1 Ácidos fenólicos
El anillo fenólico único es la característica que distingue a los ácidos fenólicos de los
flavonoides, además de contar en su estructura química con el anillo aromático y el
grupo hidroxílico, posee una función carboxílica (Farmacéuticos 2009 ; Martínez 2002).
23
Los ácidos fenólicos están divididos en dos tipos básicamente: los ácidos
hidroxibenzoicos y los ácidos hidroxicinámicos (Farmacéuticos 2009 ; Vila 2002). Los
ácidos hidroxibenzoicos están compuestos por un fenol unido a un grupo carboxílico
que le da función ácida (Vila 2002). De los ácidos benzoicos se desprende que su
unidad básica estructural es el ácido gálico, son abundantes en la naturaleza tanto en
su forma libre, acidificada o aldehídica como en formas heterosídicas; perteneciendo a
esta ultima los taninos hidrolizables (Farmacéuticos 2009).
1.1.5.2.2 Ácidos hidroxicinámicos
Los ácidos hidroxicinámicos se componen de un fenol portador de una cadena lateral
insaturada (Vila 2002). Son encontrados en la naturaleza generalmente en su forma
esterificada, ya sea con azúcares, alcoholes alifáticos, ácido quínico (ácido
clorogénico), flavonoides e incluso amidas (Farmacéuticos 2009). Los principales
ácidos hidroxicinámicos son los esteres de los ácidos caféico, cumárico y ferúlico (Vila
2002).
1.1.5.2.3 Ácido caféico
El 3,4 ácido dihidroxicinámico, mejor conocido como ácido caféico (CA por sus siglas en
inglés), es un compuesto fenólico que se encuentra en plantas, frutas y vegetales
(Figura 2). Su fórmula molecular es C9-H8-O4 con un peso molecular de 180.16
gramos.(Medicine 2003). Actúa como antioxidante e inhibe la síntesis de leucotrienos
implicados en la inmunorregulación, inflamación y alergia; a pesar de sus posibles
beneficios como agente antioxidante, varios artículos clasifican a este compuesto como
cancerígeno (Medicine 2003). El ácido caféico es un producto de la hidrólisis del éster
24
del ácido tartárico (Leighton, Urquiaga et al. 1997), sin embargo, la forma en que el
ácido cafeico es encontrado naturalmente es a manera de éster con el ácido quínico, el
cual lleva por nombre ácido clorogénico (Marques y Farah 2009).
Figura 2. Estructura química del ácido caféico. El 3,4 ácido dihidroxicinámico, mejor conocido como
ácido caféico.
1.1.5.2.4 Ácido clorogénico
Es uno de los polifenoles más cuantiosos dentro de la dieta humana, ya que se
encuentra en el café, frutas y vegetales. El ácido 5-O-cafeoilquínico (5-CQA), mejor
conocido como ácido clorogénico (CGA), es el éster del ácido caféico con ácido quínico
(Figura 3) (Olthof, Hollman et al. 2001). Su peso molecular es de 354.3087 gramos/mol,
en tanto que su fórmula molecular es C16H8O9 (Pubchem 2007). La nomenclatura del
ácido clorogénico, con base en la IUPAC es (1R, 3S, 4S, 5S)–3–[(E)–3–(3, 4-
dihidroxifenil) prop-2-enoil] oxi–1, 4, 5–trihidroxiciclohexano–1–ácido carboxílico
(Pubchem 2007). Su punto de fusión 205 a 209 grados Celsius (ChemBlink 2005).
25
Figura 3. Estructura química del ácido clorogénico. Es el éster del ácido caféico con ácido quínico.
1.1.5.2.4.1 Actividad biológica del ácido clorogénico
El café es la mayor fuente de ácido clorogénico en la dieta humana, aporta de 0.5 a 1
gramos a los bebedores de café (Olthof, Hollman et al. 2001). Los polifenoles son
metabolizados principalmente en el hígado, sin embargo los riñones y la mucosa
intestinal también se ven implicados en este proceso ya que contienen enzimas
esenciales para metabolizar a estos compuestos (Martínez-Valverde, Periago et al.
2000). Por otro lado, Claudine Manach y colaboradores dicen que los fluidos biológicos
como plasma, jugo gástrico y fluido duodenal, así como el hígado y la mucosa intestinal,
no poseen esterasas capaces de hidrolizar el ácido clorogénico, esto ha sido observado
también en ratas, únicamente la microflora del colon sería capaz de llevar a cabo la
hidrólisis (Manach, Sacalbert et al. 2004).
A pesar de los efectos potencialmente benéficos para los seres humanos, los datos
sobre su contenido y su distribución en plantas, alimentos y bebidas son escasos.
Además, la mayoría de los datos existentes si no miden el total del contenido de
compuestos fenólicos (incluido CGA), simplemente miden el contenido de 5-CQA, que
es el CGA más abundante en la naturaleza (Marques y Farah 2009).
Los fenoles presentes en la dieta, a través de diversos y muy variados estudios, han
26
demostrado ser excelentes antioxidantes in vitro, empero su capacidad antioxidante in
vivo es incierta (Olthof, Hollman et al. 2003). Por otro lado Viviane Marques (Marques y
Farah 2009) indica que las propiedades potencialmente benéficas para los seres
humanos derivados de ácidos hidroxicinámicos, como actividades antioxidantes,
hipoglucemiantes, antivirales y hepatoprotectoras son imputadas al ácido clorogénico,
basyo su expresión en estudios epidemiológicos, in vitro e in vivo. Las lactonas
clorogénicas que se forman durante la deshidratación de la molécula de ácido quínico y
la formación de un enlace éster intramolecular también han demostrado tener efectos
biológicos como la inhibición del transporte de adenosina, afinidad por el receptor µ-
opioide y actividad hipoglucemiante (Marques y Farah 2009).
En un estudio realizado con humanos, se observó que la concentración máxima en
plasma de ácido caféico se alcanzó una hora después de la ingesta de café, cabe
mencionar que en el café el ácido cafeico no aparece en su forma libre sino esterificada
con ácido quínico (ácido clorogénico) (Manach, Sacalbert et al. 2004). En la
investigación se demostró que el ácido clorogénico representa solamente el 30% del
ácido caféico la hidrólisis alcalina del café, lo cual brinda la posible explicación de que
otras formas del acido cafeico fueron hidrolizadas en la parte alta del intestino (Manach,
Sacalbert et al. 2004). Aun y con esta evidencia se siguen planteyo dudas sobre la
incapacidad de los tejidos para hidrolizar los ácidos fenólicos esterificados (Manach,
Sacalbert et al. 2004).
En insectos se ha demostrado que el ácido clorogénico actúa como pro-oxidante creyo
especies reactivas de oxígeno, lo que provoca un aumento de la peroxidación lipídica,
oxidación de las proteínas y la disminución del nivel de ácido ascórbico (Lukasik 2007).
27
1.2 Hipótesis.
El ácido clorogénico modifica la actividad enzimática de SOD, GST y catalasa en los
enterocitos de rata.
28
1.3 Objetivo
Determinar el efecto del ácido clorogénico sobre la actividad de las enzimas Superóxido
dismutasa (SOD), Glutation tio-transferasa (GST) y catalasa (CAT) en enterocitos de
rata.
29
CAPITULO 2
2.1 Reactivos y materiales
Para la preparación de soluciones reguladoras como el buffer de Krebs y los buffer de
fosfatos se utilizaron los siguientes reactivos:
Cloruro de sodio (NaCl) 100%, J.T. Baker; cloruro de potasio (KCl) 99%, Jalmek; fosfato
de potasio dibásico (K2HPO4) ≥98%, Sigma – Aldrich; fosfato de potasio monobásico
(KH2PO4), J.T. Baker; fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4●7H2O), Mallinckrodt; fosfato
de sodio monobásico anhidro (NaH2PO4) 99.0%, Sigma; cloruro de calcio (CaCl2)
aproximadamente 95%, Spectrum; cloruro manganoso (MgCl2●H2O), Analytyka;
bicarbonato de sodio (NaHCO3) 100.2%, J.T. Baker; dextrosa (C6H12O6), Difco; agua
inyectable Pisa, Irrigadual; pirogalol (C6H6O3) 99%, Sigma – Aldrich; peróxido de
hidrógeno (H2O2) 30%, Fluka; glutatión en su forma reducida (C10H17N3O6S) 98%,
Sigma; ácido clorogénico (C16H18O9), Sigma.
2.1.1 Buffer o solución reguladora de Krebs
NaCl 115mM, KCl 5.9mM, MgCl2 1.2mM, NaH2PO4 1.2mM, CaCl2 2.5mM, NaHCO3
25mM, C6H12O6 10mM. Se ajustó el pH a 7.4 con ácido clorhídrico. ¿con qué?
2.1.2 Buffer o solución reguladora de fosfatos
Se tomaron 80.2mL de K2HPO4 1M y 19.8mL de KH2PO4 1M; se diluyó la mezcla a una
proporción 1:10 para luego volver a diluir 1:2 y de esta manera obtener una
concentración final de 0.05M. El pH debe quedar ajustado a 7.
30
2.1.3 PBS 1X
NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 10mM, KH2PO4 2mM. Se ajusta el pH a 7.4.
2.1.4 Pirogalol
C6H6O3 3.6mM en agua inyectable
2.1.5 Peróxido de hidrógeno
Se tomaron 15µL de H2O2 y se afora a 10mL con PBS 1X. Con este procedimiento el
peróxido de hidrógeno alcanza una concentración de 15mM.
2.1.6 Tioéter glutatión dinitrobenceno
Se tomó 1mLde cloro-dinitro-benceno (CDNB) 0.1M en etanol y se le agrego 43.3mL de
solución reguladora de fosfatos 0.1M pH 6.5, así se logra una concentración 2.25mM
del CDNB. Así mismo se prepara glutatión reducido 2.25mM (C10H17N3O6S) con buffer
de fosfatos 0.1M pH 6.5.
2.1.7 Ratas
Las ratas sacrificadas fueron de la cepa Sprague-dawley, con una edad de 50 días de
nacidas y un peso aproximado de 115gr.
2.2 Obtención del intestino
Se obtuvo el intestino de 7 ratas, a las cuales se les sacrificó por decapitación de
acuerdo a lo especificado en la Norma Oficial Mexicana -NOM-062-ZOO-1999,
Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de
laboratorio, en su apartado 9 Eutanasia.
31
Se extrajo el intestino delgado, más específicamente la sección del yeyuno, el cual fue
cortado desde aproximadamente 5 centímetros después del ligamento que une el
intestino con el estómago (ligamento de Treitz), hasta antes de llegar al intestino
grueso. De esta sección se cortaron cuatro pedazos de 2 centímetros cada uno. A
continuación , procedió a limpiarlos de toda materia fecal y posteriormente fueron
volteados para exponer el lumen a las soluciones en las que se estuvieron sumergidos,
y colocados en vasos de precipitados, de la siguiente manera:
2.3 Diseño del experimento
2 segmentos de intestino fueron dispuestos en un vaso de precipitado con 25mL de
ácido clorogénico 50µM en buffer de Krebs.
2 segmentos de intestino se dispusieron en un vaso de precipitados con 25mL de buffer
de Krebs pH 7.4, la cual sirvió como muestra control
. Ya con el lumen expuesto, y limpios de toda materia fecal (los pedazos de intestino),
se incubaron durante 15 minutos a 37oC en los mismos contenedores donde fueron
colocados los segmentos de intestino.
2.4 Extracto proteico
Después de la incubación, cada porción de intestino se raspó con un hisopo, al que se
le retiró todo rastro de algodón, con la intención de obtener el mayor número de
enterocitos. El producto que se obtuvo de este raspado fue depositado en tubos
Eppendorf que contenían 600µL de buffer de fosfatos 10mM a pH 7. Todos los tubos
Eppendorf, con sus respectivos raspados se mantuvieron en contacto con hielo para
mantener una temperatura de 4oC.
32
El siguiente paso que se llevó a cabo fue la obtención del extracto proteico crudo
mediante la técnica de sonicación, la cual consiste en someter a los enterocitos a altas
frecuencias de sonido para que las membranas colapsen y las proteínas sean liberadas
al medio. Se utilizaron dos pulsos de 2 segundos cada uno para cada tubo. Ya
sonicadas las muestras, se procedió a centrifugar a 14,000 rpm durante 10 minutos a
4oC, con la finalidad de quitar impurezas del extracto proteico que puedan contaminar e
interferir en las mediciones. Se trasladó el sobrenadante a un tubo Eppendorf nuevo,
previamente etiquetado, y de cada muestra se realiza una dilución relación 1:10.
Realizadas las diluciones, ambas muestras con sus respectivas diluciones son llevadas
a -80oC para la posterior medida de las actividades enzimáticas y la cuantificación de
proteína total.
La medición de las actividades enzimáticas se realizó en un mismo día, así como la
cuantificación de proteína. Todo ensayo, cuantificación y/o experimento llevado a cabo
se realizó por triplicado.
2.5 Cuantificación de proteína total
El método de Bradford fue utilizado en la determinación de proteína total (Bradford
1976). Para ello fue necesario realizar una curva de calibración, la cual se hace con
soluciones estándar de albúmina bovina sérica (BSA) de concentraciones 0, 100, 200,
300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 y 1000 µg/mL a partir de una solución stock de BSA
10 mg/mL. Una vez hechas las diluciones pertinentes para obtener las soluciones
estándar, se vertieron 20µL de cada estándar y 20µL de agua destilada, misma que fue
usada como blanco, en los pozos de la microplaca. Además, se adicionó en cada pozo
33
200µL del reactivo de Bradford. Se dejó reaccionar la mezcla por 5 minutos a
temperatura ambiente, pasado este tiempo se introdujo la microplaca en el
espectrofotómetro para leer la absorbancia a 595nm. Con los datos de absorbancia y
concentración se hizo el gráfico de calibración con su respectiva regresión lineal.
Para realizar la cuantificación total de proteína de las muestras, se tomaron 20µL de
muestra diluida en una proporción de 1:10 con buffer de fosfatos 10mM pH 7.4 se
depositaron en los pozos de la microplaca y se les agregaron 200µL de reactivo de
Bradford. Se dejó incubar la reacción por espacio de 5 minutos a temperatura ambiente
y se midió su absorbancia a 595nm. La concentración de proteína total se obtuvo a
partir de la ecuación de la recta de calibración.
La fórmula empleada para el cálculo de la concentración de proteína total en mg/mL fue
la siguiente:
x = {[(y – b) ÷ m] x 10} ÷ 1000 Ecuación 7
donde:
x es la concentración de proteína;
y es la absorbancia de la mu
b es la ordenada al origen de la recta de calibración
m es la pendiente de la recta de calibración;
10 el factor de dilución
34
1000 para obtener las unidades en mg/mL
2.6 Cuantificación de actividad enzimática
2.6.1 Catalasa
Para medir la actividad enzimática de catalasa, se empleó el espectrofotómetro con la
lámpara UV. El blanco utilizado para el instrumento fue PBS 1X a un pH de 7, una vez
establecido el blanco, se midió el blanco experimental, el cual es la desaparición
espontánea del peróxido de hidrógeno, luego se midieron las muestras llevyo a cabo el
siguiente procedimiento: en la celdilla de cuarzo se depositaron 600µL de peróxido de
hidrógeno y se añadieron 60µL de muestra, inmediatamente se agitó una vez y se midió
en el espectrofotómetro lo antes posible. Todas las lecturas se hicieron a una longitud
de onda de 240nm, ya que a dicha longitud de onda se puede observar la desaparición
del peróxido de hidrógeno; cada lectura se efectuó por 3 minutos.
Siendo que la técnica está basada la desaparición del peróxido de hidrógeno y que esta
desaparición se puede medir a 240nm, la acción de la catalasa se pudo observar al
graficar los resultados que arrojados de las lecturas contra el tiempo, es decir, se
graficó la absorbancia leída a 240nm contra tiempo, a partir de aquí se calculó la
diferencia de absorbancia por minuto (ΔAbs240) como la pendiente de la regresión lineal
de la gráfica. Una vez calculada la pendiente se emplea la siguiente fórmula para
calcular las unidades de catalasa por mililitro:
UCAT/ml = (ΔAbs240/0.0394) x 100 Ecuación 8
Sin embargo, como es preciso obtener los resultados en unidades de catalasa por
miligramo de proteína total, el resultado obtenido de la fórmula anterior, se dividió entre
35
la concentración de proteína total en mg/ml; la concentración de proteína se determinó
por el método de Bradford.
Entonces, una unidad de catalasa equivale a la cantidad de enzima necesaria para
reducir un µmol de H2O2 por minuto (Aebi 1984).
2.6.2 Superóxido dismutasa (SOD)
En la medición de la actividad de la enzima superóxido dismutasa se utilizó el mismo
espectrofotómetro empleado para medir la actividad enzimática de la catalasa, con la
única diferencia que para este ensayo se ocupó la lámpara de tungsteno (luz visible).
En una celdilla de cuarzo se depositaron 40µL de muestra diluida relación 1:10 o agua
destilada (en el caso del blanco), 60µL de pirogalol y 1000µL de TRIS 50mM y dietilen-
triamino-penta acetato (DTPA) 1mM pH 8.2; se leyó a una longitud de onda de 420nm
por tres minutos en intervalos de 0.5 segundos. Realizado el proceso de las lecturas se
determinó el cambio de absorbancia a 420nm en los tres minutos obteniendo así
ΔAbs420.
El porcentaje de inhibición se calculó de la siguiente manera:
% de inhibición = [(100)(ΔAbsblanco – Δabsmuestra)] ÷ ΔAbsblanco Ecuación 9
La diferencia entre el cambio de absorbancia del blanco con el de la muestra es el
porcentaje de auto-oxidación del pirogalol.
Ya obtenido el porcentaje de inhibición se determinaron las unidades de SOD/ml
empleyo la siguiente fórmula:
USOD/mL= (% de inhibición ÷ 50) x 10 Ecuación 10
36
Para establecer las unidades especificas, el valor obtenido con la fórmula anterior se
dividió entre la concentración de proteína total en mg/mL obtenida por el método de
Bradford.
Una unidad de SOD es la cantidad de enzima necesaria para inhibir la reacción en un
50% con base a lo publicado por Paoletti y sus colaboradores en 1986 (Paoletti,
Aldinucci et al. 1986).
2.6.3 Glutatión tio-tranferasa (GST)
Para medir la actividad de la enzima GST se recurrió al método establecido por Habig
en 1974, por lo cual fue necesario preparar una solución de 1-cloro 2,4-dinitrobenceno
(CDNB) 2.25mM y otra de glutatión reducido (GSH) 2.25mM, de las cuales se tomaron
volúmenes iguales para mezclarlas (procurar no generar burbujas) y así obtener una
solución equimolar de 1.125mM de cada sustrato (Habig y Jakoby 1981). La
preparación de esta mezcla es imprescindible realizarla antes de iniciar el experimento
ya que sólo permanece estable por 20 minutos a 37oC.
La preparación de la solución de CDNB 2.25mM se llevó a cabo de la siguiente manera:
se preparó un extracto con 0.1M de CDNB en etanol, de esta solución se tomó 1mL
para diluirlo en 43.3mL de solución reguladora de fosfatos (KH2PO4/K2HPO4) 0.1M pH
6.5 y así obtener la solución de CDNB 2.25mM.
Para la preparación de la solución de GSH 2.25mM, se pesaron 0.0076gr de GSH y se
depositaron en un matraz aforado de 10mL, se lleno hasta el aforo con la misma
solución reguladora de fosfatos utilizada para la solución de CDNB.
37
Se tomaron 25µL de solución reguladora de fosfatos (blanco) o de muestra y se
depositaron en los pozos correspondientes de la microplaca, así mismo se añadieron
200µL de mezcla CDNB-GSH 1.125mM; la concentración final de los sustratos resultó
de 1mM. El lector de microplaca se configuró de la siguiente manera: se establecieron
90 lecturas a una longitud de onda de 340nm en intervalos de 15 segundos con un
mezclado de 5 segundos previo a cada lectura; y se mantuvo una temperatura de 37oC
a lo largo de todas las lecturas.
La Figura 4 muestra esquemáticamente el fundamento en el que está basada la técnica
para la cuantificación de la actividad enzimática de GST, es decir, está basada en la
formación del complejo tioéter glutatión dinitrobenceno, el cual es posible medir su
aparición en el espectrofotómetro ya que absorbe a 340nm.
Figura 4.- Cuantificación GST. Reacción en la que se fundamenta la técnica para la cuantificación de GST
El reporte de los resultados se expresó en unidades de GST por miligramo de proteína
total, mismas que serán determinadas como a continuación se menciona: al graficar
absorbancia contra tiempo, se calculó el valor de la pendiente de la regresión lineal del
38
blanco (ΔAbsB) y de cada muestra (ΔAbsM) para emplear los datos obtenidos en la
fórmula siguiente:
UGST/mL = (ΔAbsB - ΔAbsM) ÷ [(225/25)(0.82549)] Ecuación 11
De la fórmula anterior se desprende que 225/25 es el factor de dilución, lo cual quiere
decir que 225µL es el volumen total de la reacción y 25µL el volumen de muestra
empleada en la reacción. El número 0.82549 es el coeficiente de extinción molar del
complejo tioéter glutatión dinitrobenceno (mmol-1cm-1). Se mencionó que los resultados
se expresarían en unidades de GST por miligramo de proteína total y para lograrlo fue
necesario dividir el resultado de la fórmula anterior entre la concentración de proteína
total en mg/ml obtenida mediante el método de Bradford.
Una unidad de GST se entiende como el equivalente a la cantidad de enzima que
cataliza 1µmol de CDNB con 1µmol de GSH por minuto a 37oC.
2.6.4 Análisis estadístico
Los resultados obtenidos fueron sometidos a un análisis de varianza (ANOVA) y la
comparación de medias por la prueba de Tukey a un α 0.05. Además se llevó a cabo
una prueba T de Student de datos apareados. El análisis estadístico se realizó
mediante el programa computacional SPSS (Statical Packege for the Social Sciences,
SPSS Inc. Chicago, III) versión 15.0, proporcionado por la Universidad Autónoma de
Ciudad Juárez (UACJ) a través del Centro de Cómputo del Instituto de Ciencias
Biomédicas (ICB).
39
CAPÍTULO 3
3.1 Resultados
La actividad enzimática, así como la concentración de proteína total se obtuvieron de
siete ratas a los 50 días de edad de la cepa Sprague-Dawley. Solamente para la
actividad de la enzima catalasa se realizaron siete repeticiones, en tanto que para
superóxido dismutasa y glutatión S-transferasa sólo se hicieron seis repeticiones.
3.1.1 Proteína total
La proteína total se cuantifico de acuerdo al método de Bradford. La curva de
calibración empleada para calcular la concentración de proteína total de cada muestra
se muestra en la Figura 5.
Figura 5.- Gráfico de calibración. A partir de esta recta se determinó la concentración de proteína de
cada muestra analizada.
40
La Tabla 2 muestra los valores obtenidos de proteína de total de cada muestra para
cada tratamiento más/menos (±) la desviación estándar.
Tabla 2.- Concentración de proteína total. La columna control muestra las concentraciones de las
muestras que no llevaron el tratamiento con ácido clorogénico; la columna CGA, de las que fueron
tratadas con ácido clorogénico. La concentración se expresa en mg/mL.
Concentración mg/mL
Muestra Control CGA
R1 1.903 ± 0.1080 1.298 ± 0.0150
R2 1.316 ± 0.0220 1.728 ± 0.0156
R3 3.835 ± 0.0561 1.858 ± 0.0156
R4 2.160 ± 0.0115 1.069 ± 0.0231
R5 1.728 ± 0.0090 2.632 ± 0.0697
R6 2.288 ± 0.1107 1.920 ± 0.0582
R7 1.289 ± 0.0156 1.319 ± 0.0811
3.1.2 Actividades enzimáticas
Las actividades enzimáticas que presentó cada enzima en ambos tratamientos (con y
sin ácido clorogénico) son mostradas en la Tabla 3 con sus respectivos errores
estándar, así mismo aparece el valor relativo de las actividades. Se tomó el valor de la
actividad enzimática control como el 100% ya que es la actividad de la enzima que no
se encuentra afectada por la acción del ácido clorogénico. A partir de esta premisa se
calculó el valor relativo de las actividades enzimáticas y los coeficientes de variación,
mismos que son presentados en la Tabla 3.
41
Tabla 3. Actividades enzimáticas. Las actividades enzimáticas se presentan en Unidades de enzima
por miligramo de proteína ± el error estándar, en tanto que los valores relativos reportan porcentaje de
actividad enzimática ± coeficiente de variabilidad. La columna de ácido clorogénico indica que son los
valores obtenidos de las muestras tratadas con ácido clorogénico. La columna control representa los
valores obtenidos de las muestras en ausencia de acido clorogénico
Control Ácido clorogénico
Enzima Actividad enzimática Valor relativo Actividad enzimática Valor relativo
SOD
a 38.8978 ± 21.0691
U SOD/mg proteína 100% ± 54.2%
b 85.3315 ± 29.3748
U SOD/mg proteína 219.37% ± 34.4%
Catalasa
c 85.0553 ± 19.2431
U catalasa/mg proteína 100% ± 22.6%
d 62.6893 ± 13.2348
U catalasa/mg proteína 73.70% ± 21.1%
GST
e 3.0098E-05 ± 0.6751E-05
U GST/mg proteína 100% ± 22.4%
f 4.8009E-05 ± 0.8087E-05
U GST/mg proteína 159.51% ± 16.8%
a-b; c-d; e-f Indica que existe diferencia significativa (p<0.05)
Dentro de la Tabla 3 se indica que los dos tratamientos tienen una diferencia
significativa para las tres enzimas. La Figura 6 representa esquemáticamente los
valores relativos de la actividad de las tres enzimas. En esta figura se aprecia
claramente el cambio en la actividad de cada enzima. Así, se observa que para GST la
actividad aumentó en más de un 55% con la presencia del ácido clorogénico y SOD
aumentó en más de un 115% con el mismo tratamiento. En cambio, el ácido
clorogénico tuvo un efecto contrario en la actividad de la catalasa ya que la disminuyó
en casi un 30% con respecto a la actividad de la enzima sin tratamiento con el ácido
clorogénico.
42
Figura 6. Actividad enzimática relativa. La actividad de cada enzima está representada en porcentaje ±
el coeficiente de variación. Con referencia a las muestras control, se observa que la actividad de GST y
SOD aumentó en presencia del ácido clorogénico en contraste con la catalasa, la cual disminuyó su
actividad.
3.2 Discusión y Conclusión
El efecto que el acido clorogénico produjo en la enzima catalasa se cree que fue debido
a que el ácido clorogénico disminuyó el efecto oxidante del peróxido de hidrógeno. La
catalasa disminuye su actividad cuyo la concentración de peróxido de hidrógeno es
menor, es ahí que entra en acción la enzima glutatión peroxidasa, ya que esta enzima
posee mayor afinidad por el sustrato en bajas concentraciones (Carreras 2004).
El aumento de la actividad de GST en un 59.51% se relaciona con lo publicado por
Rentian Feng et al en 2005, donde el ácido clorogénico con una concentración de 40µM
aumentó la actividad de GST un 46.8%. Ellos mismos atribuyen este cambio a que el
ácido clorogénico activa GST a través de elementos antioxidantes de respuesta (AREs),
43
es decir, que el ácido clorogénico puede estimular la expresión de los genes GST
marcyo el promotor GSTA1 en los AREs (Feng, Lu et al. 2005)
En cuanto a la actividad reportada para SOD, se propone que el aumento en un
119.37% se debe a la actividad antioxidante del ácido clorogénico que coadyuva a
neutralizar el peróxido de hidrógeno, permitiendo así a la enzima aumentar su actividad
al no dejar que se retroalimente negativamente con el producto de la reacción propia de
la enzima, el peróxido de hidrógeno. Siendo de este modo que al encontrarse una
elevada generación de ion superóxido, la actividad enzimática de SOD aumenta, sin
embargo esto no puede prolongarse por mucho tiempo debido a que el producto de la
reacción inhibe la actividad de la enzima, (Bravo, Araujo et al. 2007).
La catalasa se vio afectada de manera decreciente en su actividad enzimática, en
contraste con la actividad de las enzimas SOD y GST que se vieron favorecidas por
acción del ácido clorogénico a una concentración de 50µM, lo que lleva a concluir que
el efecto antioxidante del ácido clorogénico se manifiesta al aumentar la actividad de
estas dos enzimas. Sin embargo no se puede asegurar que sea el único mecanismo de
acción del ácido clorogénico ya que en su ingesta, la hidrólisis del ácido clorogénico
genera otros antioxidantes que podrían ser los que lleven a cabo ese mecanismo de
defensa.
A partir de los resultados obtenidos y después del análisis de los mismos, se puede
concluir que el acido clorogénico tiende a modificar la actividad de las tres enzimas que
fueron evaluadas, dos de ellas (SOD y CAT) por inhibición del efecto oxidante del
peróxido de hidrógeno y la otra (GST) a través de la activación del los AREs. Por lo
44
anterior, la hipótesis planteada al inicio de la investigación no es rechazada, toda vez
que los resultados arrojaron evidencia suficiente a un nivel de confianza del 95%.
3.3 Recomendaciones
Dado que en esta investigación el ácido clorogénico se dispuso de manera directa a los
intestinos, es recomendable evaluar el desempeño del mismo a través del metabolismo
de la rata, es decir, a través de una dieta rica en acido clorogénico con el fin de evaluar
cual es el porcentaje de ácido clorogénico que realmente llega al intestino y observar el
efecto de las estructuras hidrolizadas de este antioxidante.
La actividad de la enzima glutatión peroxidasa no fue evaluada en esta investigación,
por lo que se recomienda su valoración para comparar los resultados con el efecto
causado por el ácido clorogénico en la catalasa.
Otra recomendación a evaluar es ver la diferencia en las actividades enzimáticas con el
mismo tratamiento, con la diferencia de que se añada un grupo de ratas previamente
estresadas.
La edad de las ratas también es una variable que resultaría interesante trabajar con ella
para la valoración del desempeño de antioxidantes sobre las enzimas estudiadas en
esta investigación.
Si bien, ya se hicieron las observaciones para modificar las variables de la dieta, edad y
estrés pre-mortem, la variedad en la cepa de ratas es un factor que no debe pasar
desapercibido.
A la par de estas modificaciones para futuras investigaciones, se debe investigar de
cada familia enzimática la especificación de cual clase de enzima tiene mayor
45
participación, esto ayudaría bastante a la compresión del sistema de defensa
antioxidante por enzimas.
Por último, evaluar cuál es la concentración de ácido clorogénico más eficiente para
aumentar la actividad enzimática de las enzimas evaluadas.
46
Referencias bibliográficas.
Aebi, H. (1984). "Catalase in vitro." Methods in ezymology 105(Oxygen radicals in
biological systems): 121 - 126.
Barbosa, K. B. F., J. Bressan, et al. (2008). "Influencia de la dieta sobre marcadores
plasmáticos de estrés oxidativo en humanos." 31: 259 - 280.
Benzie, I. (2003). "Evolution of dietary antioxidants." Comparative Biochemistry y
Physiology Part A 136: 113 -126.
Bonnefoy, M., J. Drai, et al. (2002). "Antioxidants to slow aging, facts y perspectives."
1174 - 84.
Bradford, M. (1976). "A Rapid y Sensitive Method for the Quantitation of Microgram
Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding." Analytical
Biochemistry 72: 248 - 254.
Bravo, A., S. Araujo, et al. (2007). "Actividad de la enzima antioxidante superóxido
dismutasa y niveles de cobre y zinc en pacientes con diabetes Mellitus tipo 2."
Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica 26: 1 - 8.
Carbonaro, M. y G. Grant (2005). "Absorption of quercetin y rutin in rat small intestine."
Annals of Nutrition & Metabolism 49: 178-182.
Carreras, I. (2004). Influencia de la suplementación de antioxidantes y la administracion
de enrofloxacina en la calidad y seguridad de la carne de ave. Química. Girona,
Universitat de Girona. Master: 316.
Castillo, J., S. Contreras, et al. (2007). "Actividad de la enzima Gluation S-transferasa
T1 en floricultores expuestos a plaguicidas." Bioquímia 32: 138.
Céspedes, E., I. Hernández, et al. (1996). Enzimas que participan como barreras
fisiológicas para eliminar los radicales libres: II. Catalasa. Revista Cubana de
Investigaciones Biomédicas. La Habana, Cuba, Rev Cubana Invest Bioméd. 15.
ChemBlink (2005). Chlorogenic acid, Online Database of Chemicals from Around the
World.
Díaz, P. (2006). Papel de las actividades superóxido dismutasa y catalasa en la
virulencia de Photobacterium damselae subsp. piscicida. Estrategias para la
47
estimulación del estallido respiratorio en fagocitos de lenguados cultivados.
Microbiología. Málaga, Universidad de Málaga. Doctoral: 276.
Farmacéuticos., C. G. d. C. O. d. "Compuestos fenólicos." Retrieved 7/11/2009, 2009,
from
http://www.portalfarma.com/pfarma/taxonomia/general/gp000011.nsf/0/4DE2A20
30B26B6F0C1256A790048D68C/$File/web_fenolicos.htm.
Feng, R., Y. Lu, et al. (2005). "Inhibition of Activator Protein-1, NF-B, y MAPKs y
Induction of Phase 2 Detoxifying Enzyme Activity by Chlorogenic Acid
" THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 280(July 29): 27888 - 27895.
Ferreira, R. (2000). "Enzimas antioxidantes y prooxidantes: características principales y
su ubicación en el genoma humano." Antioxidantes, vitaminas y nutrientes.
Fritz-Wolf, K., A. Becker, et al. (2003). "X-ray structure of glutathione S-transferase from
the malarial parasite Plasmodium falciparum." PNAS 100(Biochemistry): 13821-
13826.
Gałecka, E., R. Jacewicz, et al. (2008). "Enzymy antyoksydacyjne – budowa,
właściwości, funkcje." Pol. Merk. Lek. 147.
García, B., G. Onel, et al. (1995). Enzimas que participan como barreras fisiológicas
para eliminar los radicales libres: I. Superóxido dismutasas. Revista Cubana de
Investigaciones Biomédicas. Ciudad de la Habana, Rev Cubana Invest Bioméd.
14.
García, F., M. Orts, et al. (2003). "Variaciones de la superóxido dismutasa salivar en la
infección amigdalar." Acta Otorinolaringológica Española 54: 78 -80.
Habig, W. y H. Jakoby (1981). "Glutathione S-Transferases (Rat y Human)." Methods in
ezymology 77.
Jacob, R. y B. Burri (1996). "Oxidative damage y defense." American Journal of Clinical
Nutrition 63: 985S - 90S.
Larson, R. (1997). Naturally occurring antioxidants. Boca Raton, Florida, USA, Lewis
Publishers.
Leighton, F., I. Urquiaga, et al. (1997). Propiedades antioxidantes del vino y sus
componentes. XXII Congreso Mundial de la Vid y del Vino, Buenos Aires,
Argentina.
48
Lukasik, I. (2007). "Changes in activity of superoxide dismutase y catalase within cereal
aphids in response to plant o-dihydroxyphenols." Journal of Applied Entomology
131(Entomology): 209-214.
Manach, C., A. Sacalbert, et al. (2004). "Polyphenols: food sources y bioavailability."
The American Journal of Clinical Nutrition 79: 727-747.
Marques, V. y A. Farah (2009). "Chlorogenic acids y related compounds in medicinal
plants y infusions." Food Chemestry 113: 1370 - 1376.
Martínez-Valverde, I., M. J. Periago, et al. (2000). "Significado nutricional de los
compuestos fenólicos de la dieta." Archivos Latinoamericanos de Nutrición
50(Nutricion): 14.
Martínez, F. (2002). Viticultura de calidad: factores que afectan al contenido de
compuestos fenólicos ACE Revista de enología. Barcelona, ACE. 21.
Martínez, S. (2005). Influencia de la catalasa y de la β-toxina en la patogénesis de
Stapfhylococcus aureus. Departamento de Sanidad Animal. Madrid, Universidad
Complutense de Madrid. Doctoral: 127.
Mayne, S. (2003). "Antioxidant Nutrients y Chronic Disease: Use of Biomarkers of
Exposure y Oxidative Stress Status in Epidemiologic Research." The Journal of
Nutrition: 933S - 940S.
Medicine, N. L. o. (2003). Caffeic Acid, CASRN: 331-39-5, Hazardous Substances
DataBank.
Morris, D. (2007). Linaza - Una Recopilación sobre sus Efectos en la Salud y Nutrición
Canada, Flax Council of Canada.
Murota, K. y J. Terao (2003). "Antioxidative flavonoid quercetine: implication of its
intestinal absorption y metabolism." Archives of Biochemistry y Biophysics 417:
12-17.
Noguchi, N. y E. Niki (1999). Chemistry of active oxygen species y antioxidants.
Antioxidant status, diet, nutrition, y health. A. Papas. Boca Raton, Florida, USA,
CRC Press: 3-20.
Olthof, M., P. Hollman, et al. (2001). "Chlorogenic Acid y Caffeic Acid Are Absorbed in
Humans." The Journal of Nutrition 131: 66 - 71.
49
Olthof, M. R., P. Hollman, et al. (2003). "Chlorogenic Acid, Quercetin-3-Rutinoside y
Black Tea Phenols Are Extensively Metabolized in Humans." The Journal of
Nutrition 133(Nutrition): 1806–1814.
Palazón, J., R. Cusidó, et al. (2001). Metabolismo y significación biológica de los
polifenoles del vino. ACE Revista de Enología. Barcelona, RUBES. 9.
Paoletti, F., D. Aldinucci, et al. (1986). "A sensitive spectrophotometric method for the
determination of superoxide dismutase in tissue extracts." Analytical Biochemistry
154: 536-541.
Papas, A. (1999). Determinants of antioxidant status in humans. Antioxidant status, diet,
nutrition, y health. A. Papas. Boca raton, Florida, USA, CRC Press: 21-36.
Pubchem, C. (2007). Chlorogenic Acid - Compound Summary (CID 12310830), National
Center for Biotechnology Information.
Rao, A. V. y L. G. Rao (2007). "Carotenoids y human health." Pharmacological
research: 207-216.
Shahidi, F. y C.-T. Ho (2005). Phenolics in Food y Natural Health Products: An
Overview. Phenolic Compounds in Foods y Natural Health Products. F. Shahidi y
C.-T. Ho. Washington, DC, American Chemical Society: 1 - 8.
Ugartondo, V. (2009). Caracterización de derivados polifenólicos obtenidos de fuentes
naturales. Citotoxicidad y capacidad antioxidante frente a estrés oxidativo en
modelos celulares. Fisiologia. Fac. Farmàcia. Barcelona, Universitat de
Barcelona. Doctor: 217.
Urso, M. L. y P. M. Clarkson (2003). "Oxidative stress, exercise, y antioxidant
supplementation." Toxicology 189: 41-54.
Vila, H. (2002). Efecto del tiempo de maceración sobre el color, la composición tánica y
la astrigencia de vinos Cabernet Sauvignon y Malbec Viticultura y enología,
Universidad Nacional de Cuyo;Ecole Nationale Supériure Agronomique de
Montpellier; Estación Experimental Agropecuaria Mendoza del Instituto Nacional
de Tecnología Agropecuaria. Master Scientiae: 67.
Zapata, R. (2007). Evaluación de glutation s-transferasa (GST) en zona tonsilar, en
población expuesta a emisiones de los hornos ladrilleros en Juárez. Ciencias
50
Basicas. Ciudad Juárez, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Licenciatura:
45.
Zorrilla, A. (2002). El envejecimiento y el estrés oxidativo. Revista Cubana de
Investigación Biomédica. La Habana, Cuba, Rev Cubana Invest Biomed. 21: 178-
85.