Efecto morfológico del gen C-H-ras en la línea celular Molt-4

Alumna:

Betsabé González Zamudio

Matrícula No.: 204245337

Asesores:

Dr. Enrique Miranda Peralta (H.G.M.)

Dr. Rodolfo Velasco Lezama (U.A.M. – I.)

AGRADECIMIENTOS

Primeramente a mi Dios Jehová que me ha dado todo y más de lo necesario, a

mis padres Leticia Zamudio Orozco, Pedro Hugo González Aldana pues me han

brindado su apoyo incondicional en todo aspecto y a mi novio M.C. Rodrigo de

A. Salazar López pues me ha otorgado su apoyo y confianza en todo momento y

compartido su conocimiento. A mis asesores: Dr. Enrique Miranda Peralta, M. C.

Jorge Antonio Zamora Domínguez, Dr. Rodolfo Velasco Lezama, Tec. Marco

Elías Gudiño Zayas y a la QFB. Bertha Ortiz Bonilla, gracias doy a todos y a cada

uno por su cooperación para la terminación de este trabajo.

INDICE

Pág.

Índice de figuras 5

Resumen 6

Introducción 7Justificación 9

Hipótesis 10

Objetivo general 11

Objetivos particulares 11

Material y métodos 12

Diagrama de trabajo 14

Resultados y discusión 15

Conclusión 18

Bibliografía 19

• A.- Técnica de extracción de células 20

• B.- Separación de muestras con Ficoll 21

• C.- Cambio de medio 22

• D.- Descongelamiento de células 23

• E.- Preparación de medio LB (Lunia Bertania) sólido 24

• F.- Preparación de medio LB (Lunia Bertania) líquido 25

• G.- Preparación de medio de cultivo RPMI 1640 26

• H.- Preparación de la solución amortiguadora de Hebs

para 250 ml

27

• I.- Preparación de la solución amortiguadora de PBS 28

• J.- Tinción de Wright 29

• K.- Buffer de Tinción de Wright 30

• L.- Cito spin 31

• M.- Linearización del plásmido 32

• N.- Purificación del plásmido con Kit QIAGEN 33

• Ñ.- Sembrado de bacteria 35

• O.- Electroforesis 36

INDICE DE FIGURAS

Pág.Figura 1.- Células Molt-4 16Figura 2.- Células transfectadas 96 horas PSV3neowt 16Figura 3.- Células transfectadas 96 horas PSV2neow 16

Figura 4.- Gel de plásmidos digeridos

Figura 5.- Gráfica de células transfectadas por triplicado

17

17

RESUMEN

Actualmente invaden al ser humano enfermedades tan agresivas que se cobran

la vida de miles de millones de personas por todo el mundo, una de las más

sobresalientes es el cáncer, que se define como una alteración descontrolada

del ciclo celular, provocada por oncogenes que codifican proteínas capazes de

transformar células e inducir cáncer. Como la Leucemia es un trastorno

hematopoyético donde las células son remplazadas por células no funcionales,

la Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) de linfocitos tipo T, que es un trastorno

neoplásico que resulta de mutaciones somáticas en un progenitor linfoide B o T,

con acumulación de linfoblastos en médula ósea y sangre periférica. En América

latina la LLA ocupa un porcentaje considerable que año con año se cobra la vida

de cientos de personas, a pesar del tratamiento con quimioterapias y

radioterapias, estas son poco exitosas, por lo cual se desea encontrar nuevas

alternativas de tratamiento, utilizando técnicas especificas menos tóxicas y

agresivas que modifiquen a las células desde su genoma y que las conduzca a

la muerte, por eso se ha asociado al gen C-H-ras que está involucrado en el

ciclo celular, provocando proliferación y apoptosis de las células eucariotas.

Por eso es importante utilizar la transfección, como es la electroporación, una

técnica de choque eléctrico controlada que permite la dilatación de los poros

celulares por un corto tiempo pero suficiente para la incorporación del DNA. En

este trabajo se estandarizaron de acuerdo a una línea celular llamada Molt-4

provocando efectos morfológicos de suma importancia como son células

grandes multinucleadas a las 92 horas después de la transfección con los

plásmidos PSV2neo, PSV2neowt y PSV2neow

INTRODUCCIÓN

Los cambios morfológicos son de suma importancia para la ciencia y se ha

valido de ellos durante años1, ya que se puede ver a simple vista los efectos y

posteriormente postular rutas metabólicas, cambios bioquímicos y fisiológicos.

Actualmente han tenido mucho auge las herramientas de la biología molecular

para aportar más información al respecto, empleando varias metodologías para

la transfección celular tanto químicas como físicas.

Dentro de las metodologías químicas se encuentra la precipitación de calcio, que

protege al DNA de las nucleasas, son endocitados/fagocitados por las células.

También se cuenta con DEAE-dextrano, que es un polímero que se une por

choque osmótico mediante glicerol.

Por otra parte, está la lipofección, que es una reacción entre lípido y DNA por

endocitosis. Así como la microinyección, que consiste en la introducción del DNA

recombinante en las células. La balística funciona con disparos de moléculas.

La electroporación es una técnica que crea o que dota a la membrana de cierta

permeabilidad al DNA durante unos pocos segundos debido a una descarga

eléctrica. Si la célula o grupo de células sometidas a dicho choque eléctrico

están sumergidas en un medio rico en plásmidos, alguno de ellos puede

penetrar en una célula2.

En este trabajo se presentan cambios morfológicos en la línea celular de Molt-4

después de haberse transfectado o insertado de forma estable, por descargas

eléctricas un gen involucrado directamente en el ciclo celular, ya sea en la

proliferación o apoptosis, hablamos del gen C-H-ras3, desde los años ochentas

se ha identificado, estudiado y postulado varias rutas de señalización

involucradas en el ciclo celular (de diferentes linajes celulares).

La alteración de los ciclos celulares ha provocado alteraciones significativas y provocando daños irreversibles en las estirpes celulares y de los cuales el más documentado ha sido el cáncer, que se define como una alteración descontrolada del ciclo celular, provocada por oncogenes que podrían ser cualquier gen que codifica una proteína capaz de transformar células en cultivo o inducir cáncer.

De acuerdo a su localización es su nomenclatura, del cual solamente nos

enfocaremos a la Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) de linfocitos tipo T, que

es un trastorno neoplásico que resulta de mutaciones somáticas en un

progenitor linfoide B o T, con acumulación de linfoblastos en médula ósea y

sangre periférica. En América latina la LLA es un porcentaje considerable que

año a año se cobra la vida de varias personas (Tabla 1).

Tabla 1. Número de defunciones por año de registro y 30 principales causas de

mortalidad según criterios de agrupación (2003-2007) en el Hospital General de

México4.

JUSTIFICACIÓN

Debido a la alta tasa de mortalidad registrada en México a causa de la leucemia

linfoblástica aguda, y a que no existe un tratamiento que asegure una alta

eficacia en la recuperación de los pacientes, y puesto que los tratamientos

actuales resultan tóxicos para la mayoría de los pacientes afectados, surge la

necesidad de diseñar nuevas metodologías específicas que aseguren una alta

tasa de supervivencia, por ello, es vital evaluar el efecto morfológico del gen C-

H-ras en la línea celular de Molt-4 como blanco terapéutico para este

padecimiento, ya que según estudios realizados por María Camats Malet5, en

Barcelona 2008, este gen es el responsable del desarrollo de células alteradas o

mutadas, causantes del cáncer6.

Con lo anterior se pretende obtener una terapia personalizada basada en la

farmacogenómica, es decir, de acuerdo a la genética de cada individuo, lo que

permitirá proporcionar al paciente el mejor tratamiento en base a sus

necesidades particulares sin que éste resulte tóxico para él.

HIPÓTESIS

La presencia de cambios morfológicos en la línea celular Molt-4, al ser

transfectada por electroporación, se debe a la sobre expresión del gen C-H-ras

OBJETIVO GENERAL

Obtener los efectos morfológicos del gen C-H- ras en la línea celular maligna de

Molt-4.

OBJETIVOS PARTICULARES

Evaluar la trasfección por electroporación de los plásmidos PSV2neo,

PSV2neowt y PSV2neow en la línea celular Molt-4.

Determinar el porcentaje de viabilidad en células transfectadas con los

plásmidos PSV2neo, PSV2neowt y PSV2neow en la línea celular Molt-4.

Evaluar el efecto morfológico del gen C-H- ras mediante la tinción de Wright en

la línea celular Molt-4.

MATERIALES Y MÉTODOS

Si las células se extraen de sangre periférica o de médula ósea7 (ver apéndice

A) la separación es diferente (ver apéndice B). Se partió de una línea celular

Molt-4, obtenida del laboratorio de Biología Molecular del hospital general de

México.

La transfección por electroporación se realizó mediante el conteo celular y la

determinación del porcentaje de su viabilidad, de la siguiente manera:

Se centrifugaron las células a 1500RPM durante 5 min a 4°C, para

posteriormente decantar el medio (ver apéndice C).

Después se resuspendió el botón de células con 5ml de buffer Hebs (ver

apéndice H) a 4°C y se centrifugó a 15000RPM, se decantó el sobrenadante y

se repitió el paso anterior.

El sobrenadante se resuspendió a una concentración de 10 – 20X106 células en

250µl de buffer Hebs a 4°C, y se transfirió esta suspensión celular a una celda

sumergida en hielo.

Posteriormente se adicionaron 50µl de la mezcla de DNAs a la suspensión

celular y se agitó por vortex durante 2 seg y se incubó en hielo durante 10min

(ver apéndice D).

Mientras tanto, se conectó el electroporador marca Biorad a la corriente eléctrica

y se conectaron los cables del portaceldas al aparato, se giró la perilla High Cap

hasta su máxima capacitancia y se encendió el aparato, la ventana indicaba

0.0000.

Se oprimió el botón Set High Cap (µF X1000) y se ajustó con el botón raise a

0.950µF. Se presionó el botón Set Volts (kV) y se ajustó con el botón raise a

200V.

Se colocaron las celdas en el portaceldas y se presionaron los dos botones rojos

al mismo tiempo hasta que sonó la alarma del equipo.

Posterior a esto, se dejó incubando la celda en hielo durante 10min, y luego se

adicionó la suspensión celular de la celda en una caja P100 que contenía 4.5ml

de medio RPMI 1640 C.S bobino neonato al 10% (ver apéndice G). Se lavó la

celda con 500µl de medio y se adicionó ese medio a la caja P100.

Se incubaron las células durante 24 horas en la incubadora a 37°C en una

atmósfera al 5% de CO2.

Se centrifugaron las células durante 5min a 100RPM y se decantó el

sobrenadante para resuspender las células en 5ml de medio RPMI1640 con

suero bobino neonato al 10% que contenía antibiótico G418 (ver apéndice F) a

una concentración de 600µg/ml.

Simultáneamente se tomó una alícuota de células para contabilizar en la cámara

de Neubauer e iniciar con el proceso de selección de células resistentes al

antibiótico neomicina, se cambió el medio cada tercer día, se contabilizó y

determinó viabilidad celular tomando una alícuota de 200µl de células en medio

(2ml) y se le agregaron 200µl de azul de tripano®, posteriormente se vertieron

en la cámara de Neubauer y se contaron 2 cuadrantes, el total se multiplicaba

por 2 (factor de dilución) y se multiplica por 10000 que es una constante.

Posteriormente se tomó otra alícuota de 300µl de células en medio para el cito

spin (ver apéndice L). Por otra parte, con la tinción de Wright (ver apéndices J y

K) se determinó su cambio morfológico.

Cabe mencionar que para la trasfeccion es importante la obtención del plásmido,

el cual debe estar en un vector (bacteria) (ver apéndice Ñ) y de forma lineal (ver

apéndice N) y posteriormente purificado (ver apéndice M).

Para comprobar la linearización se realizó la separación de los plásmidos de

acuerdo a su peso molecular mediante la electroforesis (ver apéndice O).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La trasfección por electroporación de los plásmidos PSV2neo, PSV2neowt y

PSV2neow en la línea celular Molt-4, fue de un 98% de viabilidad al inicio del

experimento.

Al evaluar el efecto morfológico del gen C-H- ras mediante la tinción de Wright

en la línea celular Molt-4, se observaron células sin plásmido como control (Fig.

1) y células transfectadas con el gen silvestre PSV2neowt (Fig.2) y el gen

mutado PSV2neow (Fig.3), para confirmar que se trataban de los plásmidos

deseados se les realizó una electroforesis (Fig. 4) (ver apéndice O) de carril

izquierdo a derecho se cargó el marcador de peso molecular (fago landa) de

23130pb, en los siguientes carriles 1,2,3 fueron PSV2neo, PSV2neowt y

PSV2neow , siendo afirmativos los resultados y complacientes.

Posteriormente de las células fijadas en los portaobjetos y teñidas con Wright se

cuantificaron, en el cual se notó una clara diferencia en el número de células

multinucleadas que contenían al gen C-H- ras mutado, obtuvieron un 70% de

cambios morfológicos (ver Fig. 5), a diferencia de las células transfectadas con el

gen C-H- ras silvestre se observó un 18% de células con cambios notables pero

significativos, y un 12% de cambios en las trasfectadas con el plásmido, la

trasfección con estos tres plásmidos se empezaron a ver las diferencias desde

las 50 horas pero a partir de las 72 horas se observaron diferencias en las

células multinucleadas.

Con ayuda de la microscopía se pudo documentar el efecto morfológico de las

células Molt-4 y dar un panorama visual del efecto del gen C-H-ras a diferentes

horas y discutir si la muerte celular fue provocada por una mitosis o por

apoptosis5.

Figura1.‐CélulasMolt‐4

Figura2.96horasPSV2neowt

Figura3.96horasPSV2neow

Figura4.‐PlásmidosPSV2neo,PSV2neowtyPSV2neow

Figura5.‐Gráficadecélulastransfectadasportriplicado

CONCLUSIONES

El efecto morfológico se vío modificado al transfectar las células con los

Plásmidos PSV2neo, PSV2neowt y PSV2neow, fue notorio su tamaño, número

de nucléolos, el cual provocó la muerte celular.

El gen C-H-ras tiene un efecto importante en el ciclo celular de las Molt-4 ya que

puede provocar muerte mitótica o apoptotica, el cual se afirmaría con

herramienta de biología molecular y química.

Debido a que se obtiene la muerte celular, con este tratamiento se perfila como

buena alternativa de blanco terapéutico para regular la LLA.

BIBLIOGRAFIA

1. Miranda E, Santana C, Rojas E, Hernandez S, Otrosky P, Garcia A.

Induced mitotic death of HeLa cells by abnormal expression of C-H-

ras. 1995, Mutation research.

2. Current protocols in molecular biology, 1996.

3. Los genes Tas, el ciclo celular y el desarrollo de tumores, Carla

Santana y Alejandro García Carranca, Departamento de Biología

Molecular, Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM, 2002.

4. Boletín de mortalidad hospitalaria 2003-2007, Hospital General de

México.

5. Camats Malet María, Mecanismo de señalización intracelular

regulado por la proteína p19 h-ras, Barcelona 2008.

6. Castedo M. y Perfettin J, Roumier T. Andeau K, Medema R y

Kroemer G. Cell death by mitotic catastrophe: a molecular

definition, Nature, 2004.

7. Departamento de hemato-oncologia pediátrica. Hospi ta l

universitario niño Jesús Madrid. A. Lassaletta Atienza, 2004.

APENDICE A

Técnica de extracción de células

Diluir la muestra (M.O o S.P) en 5 ml de PBS (ver apéndice I) a temperatura

ambiente.

Mezclar suavemente y centrifugar a 2500rpm por 10min.

Eliminar las tres cuartas partes del plasma de la muestra.

Separar la capa de las células blancas y pasar a un tubo limpio.

Adicionar de 2 a 3ml de solución lítica a 4°C a las células.

Mezclar vigorosamente.

Incubar a 4°C en el refrigerador durante 4-10min.

Adicionar 2ml de PBS a 4°C en el refrigerador y centrifugar a 2500rpm por 8 min.

Decantar y resuspender el pellet en 5ml de PBS.

Centrifugar a 2500rpm 5 min.

Decantar (extraer y resuspender) y pasar a las células en un tubo eppendorf de

1.5ml estéril.

Centrifugar 5min a 2000rpm a 4°C.

Eliminar el PBS y guardar la muestra a -80°C.

APENDICE B

Separación de muestras con Ficoll

Mezclar bien la muestra de la jeringa o tubo.

Agregar la muestra a un tubo que contenga 5ml de PBS a temperatura ambiente

o 37°C.

En un tubo limpio adicionar 2ml de ficoll a 4°C.

Adicionar muy lentamente la muestra en el tubo con ficoll por las paredes del

tubo.

Centrifugar durante 30min a 1500rpm a 4°C.

Separar el anillo de mononucleares y pasarlo a otro tubo limpio.

Adicionar 5ml de PBS y mezclar bien.

Centrifugar durante 10min a 2500rpm.

Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1ml de PBS y pasarlo a un

eppendorf.

Centrifugar 5min a 2000rpm a 4°C.

Etiquetar correctamente el tubo.

Guardar a -80°C en el banco de muestras nivel 1 caja 1.

NOTA:

Tomar las muestras de novo – ficoll

Tomar las muestras de subsecuente – solución lítica

APENDICE C

Cambio de medio

1.- Verter las células en un tubo Falcon estéril de 15ml.

2.- Centrifugar las células a 1500RPM durante 5min.

3.- Decantar el sobrenadante.

4.- Resuspender el botón celular en 5ml de medio RPMI 1640 completo a 37°C.

5.- Depositar las células en la botella con rosca y meterlas en la incubadora de

CO2.

6.- Cambiar el medio de cultivo cada tercer día.

NOTA

• Cuidar que no se sobrepase la densidad celular.

• Sembrar 0.5X106 células/ml

• No sobrepasar mas de 1.5X106 células/ml

APENDICE D

Descongelamiento de células

1.- Sacar el criovial de células del nitrógeno líquido.

2.- Envolver el criovial con una gasa e incubarlo con la mano hasta que las

células casi se descongelan por completo.

3.- Verter el medio con células en una caja petri con 5ml de medio RPMI 1640,

con suero neonato y antibióticos.

4.- Dejar en incubadora a 37°C, 5% de CO2 por 15min.

5.- Pasar las células a un tubo Falcon estéril de 15ml.

6.- Centrifugar durante 5min a 1500RPM.

7.- Decantar el sobrenadante y resuspender el botón de células con 5ml de

medio RPMI 1640 completo.

8.- Sembrar las células en una botella con rosca e incubar a x°C.

9.- Cambiar el medio de cultivo cada tercer día.

NOTA

• No permitir el incremento de la densidad celular.

APENDICE E

Preparación de medio LB (Lunia Bertania) sólido

Pesar los siguientes reactivos: 500ml 200ml 150ml

• Bactotriptona (select peptone 140) 5g 2g 1.5g

• Extracto de levadura 2.5g 1g 0.75g

• NaCl 5g 2g 1.5g

• Bacto agar 7.5g 3g 2.25g

Se agita hasta disolver.

Ajustar el pH = 7 con NaOH o HCl.

Aforar a 250ml con agua desionizada estéril.

Esterilizar en autoclave durante 30min a 121°C.

Dejar enfriar y agregar 75µl de ampicilina para alcanzar una concentración final

de 100µg/ml.

Llenar las cajas petri y dejar enfriar hasta que se evapore el agua de la tapa.

Se almacenan a 4°C las cajas con medio y se deja a 37°C por 24 horas una

prueba de esterilidad.

APENDICE F

Preparación de medio LB (Lunia Bertania) líquido

Pesar los siguientes reactivos: 500mL 200mL 150mL

• Bactotriptona (select peptone 140) 5g 2g 1.5g

• Extracto de levadura 2.5g 1g 0.75g

• NaCl 5g 2g 1.5g

Adicionando 400ml de agua estéril desionizada.

Agitar hasta disolver.

Ajustar el pH a 7 con NaOH o HCl.

Aforar a 500ml con agua estéril desionizada.

Esterilizar en el autoclave por 30min a 121°C.

Glucosa 20% MgSO 2M

20 µl 1 µl MLB 16 µl 1 ml MLB

X=400 µl 20 µl MLB X=320 µl 20 µl MLB

Ampicilina V1=V2C2 (15ml)(100µl/mL) = 0.0045ml ó 45µL

C1 333300µg/mL

APENDICE G

Preparación de medio de cultivo RPMI 1640

Adicionar el sobre del medio en un matraz de un litro con 900ml de agua

bidestilada.

Agregar 1.2g de bicarbonato de sodio.

Agitar hasta disolver.

Ajustar el pH a 7 (color durazno) con burbujas de CO2.

Aforar a 1 litro en una probeta limpia o matraz aforado.

Filtrar a 0.22µm, es preferible ejercer presión para reducir la pérdida de CO2.

Almacenar a 4°C en obscuridad.

Poner 5ml en una caja petri como prueba de esterilidad a 37°C en 5% de CO2.

NOTA

• Para descomplementar el medio RPMI 1640 es a 56°C por 30min.

• Esterilizar todo el material antes de utilizarse con 30min a 121°C y bien

envuelto.

• Medio RPMI + Antibiótico

V1=V2C2 (500ml)(100µl/mL) = 0.150ml

C1 333300µg/mL

APENDICE H

Preparación de la solución amortiguadora de Hebs para 250 ml

Se pesa lo siguiente:

• NaCl 137mM 2g

• KCl 5mM 0.092g

• Na2HPO4 0.7mM (12moléculas de H2O) 0.0625g

• Glucosa (dextrosa) 6mM 2.053g

• Hepes 20 mM 1.191g

Ajustar el pH a 7.05 con NaOH o HCl.

Filtrar con 0.22µm en la campana y guardar a -20°C.

V1=V2C2 (100ml)(0.1µl/mL) = 20ml

C1 0.5µg/mL

APENDICE I

Preparación de la solución amortiguadora de PBS

Se pesa lo siguiente:

• NaCl 8g

• KCl 0.223g

• Na2HPO4 2.144g

• KH2PO4 0.272g

Se agrega 800ml de agua destilada a los reactivos en un matraz.

Ajustar el pH a 7.2

Aforar a 1000ml.

Filtrar con 0.22µm y guardar a 4°C ó esterilizar.

APENDICE J

Tinción de Wright

Pesar:

3.3 g de tinción de Wright

Disolver en 1L de etanol QP

Dejar madura 2-3 meses

• Agitando

• En un frasco ambar

Filtrar en enbudo con papel filtro

• Evitar que se presipite

Antes de su uso en las muestras hacer una grafica de estandarizacion

Ya estandarizado el tiempo de tincion de Wright y tiempo de buffer, lavar con

agua corriente y dejar secar

Observar al microscopio e interpretar los datos

APENDICE K

Buffer de Tinción de Wright

Pesar:

KH2PO4 13.26

Na2HPO4

Aforar a 2L de H2O des ionizada

Ajustar el pH a 7.6

APENDICE L

Cito spin

Centrifugar en el cito spin de 500-800RPM durante 5 min

Teñir con Wright durante 7 min

Añadir el buffer y dejar 13 min

Lavar a chorro de agua (suave)

Limpiar con una corunda la parte de debajo del portaobjetos

Observar al microscopio y fotografiar

APENDICE M

Linearización del plásmido

Se cuantifica el plásmido extraído de la bacteria (E.coli)

Se le adiciona lo siguiente:

• H2O

• Buffer 2µl

• BSA 0.5µl

• DNA-P

• Eco R1 3µl

Deacuerdo a los ng/ml de plasmido se le adicionara H2O

• Lo mas recomendable es tener un volumen final de 20µl

Se mezclan suavemente

Incubar 2 Horas a 37°C

Purificar con el Kit QUIAGEN QUIT PURIF

Listo para trasfectar

APENDICE N

Purificación del plásmido con Kit QIAGEN

Resuspender la bateria en 4ml de buffer P1, mezclar perfectamente antes de

usar

Agregar 4ml de buffer P2, por invercion mezclar e incubar a temperatura

ambiente (15-25°C)

• No incubar mas tiempo

• Tapae inmediatamente el buffer P2

• Cambio de color a azul

Durante la incubacion preparar el cartucho QUIAFILTER, colocarlo en un tubo

apropiado

Agregar 4ml de buffer P3 frio al lizado y mix inmediatamente por inversion

vigorosa mezclar (4-6 seg)

Centrifugar 15 min a 2000RPM

Verter el lizado en el cartucho QUIAFILTER e incubar a temperatura ambiente 10

min

Hidratar las QUIAGEN TIPS con 4ml de buffer QBT (dos veces)

Remover el tapon del QUIAFILTER y gentilmente adicionar el embolo en el

QUIAFILTER MIDI y filtrar el lizado en las QUIAGEN_TIPS previamente

equilibradas

Permitir que el lizado entre en la recina por fluido de gravedad

Adicionar el buffer QC (10ml) dos veces

Eluir DNA con 5ml de buffer QF

Agregar 0.7 ml de isopropanol gentilmente, centrifugar 30-45 min

Incubar 24 horas a -20°C

Lavar el pellet con 2 ml de etanol al 70% y centrifugar 10 min a 11000RPM a 4°C

Dejar secar el pellet (5-10 min)

Resuspender con10mM Tris-Cl a pH 8.5

Cuantificar el plasmido

Trasfectar

APENDICE Ñ

Sembrado de bacteria

Preparar medio solido de LB(ver apendice E), bajo mechero tomar bacteria

E.Coli

Dejar crecer durante 48 horas a 37°C

Tomar una colonia aislada y pequeña y pasarla a medio LB liquido (ver

apendiceF)

Dejar crecer durante 12 horas con agitacion continua a 37°C

Posteriormente expandir en medio LB liquido con mayor volumen(ver

apendiceF) a 37°C por 12 horas

Vaciar el medio en contenedores de centrifuga y colocarlos en la centrifuga con

su respectivo contrapeso

Centrifugar a 3500-4000RPM durante 30 min

Decantar el sobrenadante y juntar el pellet en un solo tubo

Congelar a -80°C

APENDICE O

Electroforesis

Pesar:

1% RNA 0.6% DNA

Agarosa 0.3g 0.2g

TAE 1X 30ml 30ml

Bromuro de etidio

Vertirlo sobre el matraz los reactivos y calentar en parrilla hasta que este en

ebuyición

Dejar enfriar hasta 37°C y checar que no tenga residuos

Agragar 1 gota de bromuro de etidio y mezclar

Dejar sobre la camara de corrida con el peine y nivelar la camara, evitar las

burbujas

Dejar que gelifique

Colocar buffer TAE 1X en la camara

Quitar el peine de forma horizontal y firme

Sumergir el gel en el buffer

Cargar los pozos TAE 1X Buffer Loding Plasmido/Fʎ

• Marcador de peso molecular 2µl 2µl 2µl

• Plásmidos 2µl 2µl 0.5µl

Se tapa la cámara y deja correr a 60 Volts durante 30 min.