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EFEITO DA RADIAÇÃO IONIZANTE EM CÉLULAS
PARTE II
CONSIDERAÇÕES GERAIS
DNA
REPAROAgentes ou produtos ambientais(radiação ionizante)
DANO DANO NÃOREPARADO
Letalidade celularEnvelhecimento precoceMalformação Câncer
TÉCNICAS (EM NÍVEL CELULAR)
Aberrações cromossômicasCitogenéticas Micronúcleos
Troca entre cromátides irmãs
Bioquímicas Cometa
Moleculares Hibridização in situ
Dosimetria biológica
Genética toxicológica
Biomonitoramento
Instabilidade genômica
IDENTIFICAÇÃO DE MANIFESTAÇÕES CELULARES OU MUTAÇÕES
INDICADORES BIOLÓGICOS- aberrações cromossômicas
Métodos - micronúcleos- Cometa (“single cell gel assay”)
MÉTODO DE ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS
Formação: quebras nos cromossomos quebras na fita dupla do DNA
reparo não reparo reparo errôneo(deleção) (rearranjo)
cromossomo aberrações cromossômicas normal estruturais
Aberração cromossômica qualquer fase do ciclo celular
metáfase
G1- tipo cromossômicoS - cromossômico + cromatídicoG2 - tipo cromatídico
necessitam de quebrasnos cromossomos
ABERRAÇÃO TIPO CROMOSSÔMICO
ABERRAÇÃO TIPO CROMATÍDICO
ABERRAÇÕES CROMOSÔMICAS RADIOINDUZIDAS
REPLICAÇÃO
METÁFASEREJUNÇÃOQUEBRA EM G1
FRAGMENTOACÊNTRICO
ANEL COMFRAGMENTOACÊNTRICO
DICÊNTRICO COMFRAGMENTOACÊNTRICO
TRICÊNTRICO COMFRAGMENTOACÊNTRICO
DOSIMETRIA BIOLÓGICA
ESTIMATIVA DE DOSE ABSORVIDA
frequência de aberraçõesencontadas em linfócitosde indivíduos expostos
frequência observada em lifócitos irradiados in vitro
com doses conhecidas
Curvas dose - resposta
LINFÓCITOS “dosímetros biológicos”
- altamente radiossensíveis- população naturalmente sincrônica de células- ampla distribuição corpórea (G0 G1)- facilmente coletadas- in vitro = in vivo
Moorhead et al. (1960) - desenvolvimento de técnicas de cultivo de linfócitos humanos in vitro, utilizando um mitogênico.
Linfócitos células blásticas MITOSE
(G0 G1)
PHA
(Phaseolus vulgaris)
Bender e Gooch (1962) - propuseram a análise de aberrações cromossômicas para a avaliação quantitativa de dose absorvida de radiação.
CULTURA DE LINFÓCITOS (48 h)(Construção de Curva de Calibração)
- Coleta do sangue (5 mL)- Fracionamento de amostras sanguíneas e irradiação com várias doses (10-500 cGy)- Cultivo a 37oC
sangue total + meio de + soro fetal + mitogênico + antibiótico (0,5 mL) cultura bovino PHA
- Adição de colchicina (2h antes da fixação)- Adição de solução hipotônica (KCl 0,075 M)- Fixação com metanol + ácido acético (3:1)- Preparação de l6aminas: fixação a 65oC- Coloração com Giemsa a 2%
1a divisão em cultura: 40 54 h -BrdU 2a divisão: 72 h -critérios
48h padronização da técnica
Cada laboratório obtenção de curva - padrão
- Sensibilidade da técnica: estimativa de dose, da ordem de 5 cGy de radiação de baixa LET- para cada dose de radiação: pelo menos 100 metáfases analisadas
CROMOSSOMOS ARLEQUIM
Trocas entre cromátides – irmãs em cromossomos mitóticos.Corados com Hoechst – 33238 e acridine orange, observados ao microscópio de fluorescência
CURVA DOSE-RESPOSTA
Todos os tipos de radiação ionizante – mesmo tipo de aberrações cromossômicas em células expostas
Frequência de aberrações induzidas – depende da dose, depende do tipo de radiação
LET = quantidade de E depositada na matéria por unidade de comprimento do trajeto (keV/m)
x x x x x x x x
x x x x x x x x
alto LETbaixo LET
Ilustração diagramática da densidade de ionização relativa por alvo de uma trajetória simples para radiação de alta e baixa LET
Energia média do neutron (MeV)
Dic
êntr
icos
por
cél
ula
Dose (Gy)
baixa LET y = 0 + D2
(R-X, R-y = 0 + D+ D2
alta LET y = 0 + D(n, p, )
0 FA = 1 em 300 células0 D = 1 em 2000 células
1 2 3 4 5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,7 7,6 14,7Raios X 250 kVpa 1,0 Gy/min
Radiação de 60Coa 0,5 Gy/min
Curva dose – resposta para dicêntricos induzidos em linfócitos sanguíneoshumano, expostos in vitro ao 37Cs com taxa de dose de 5 cGy.min.-1
Curva dose – resposta para dicêntricos induzidos em linfócitos sanguíneos humano, expostos in vitro ao 60 Co com taxa de dose de 5 cGy.min.-1
CURVA DOSE – RESPOSTARADIAÇÃO DE BAIXA LET
Aberração cromossômica resultante de 2 quebras (anéis, dicêntricos)
y = 0 + D+ D2
termo lineardicêntrico única trajetória ionizante
(1 ou 2 quebras)independe da taxa de dosedoses mais baixas da curva
termo quadráticodicêntrico interação de 2 trajetórias
ionizantes independentedepende da taxa de dose: zona de rejunção < 0,1 mdoses mais altas da curva
D
D2
MÉTODO DO MICRONÚCLEO
Origem - fragmentos acêntricos
- cromossomos inteiros
Tamanho- 1 a 1 de do núcleo principal
Indicadores - agentes clastogênicos
- agentes aneugêncios
Schmidt (1975) – células da medula óssea de camundongos
Countryman e Heddle (1976) – relação quantitativa entre a dose e a frequência de MN em linfócitos humanos
20 5
Ilustração esquemática do mecanismo de formação de micronúcleos em células mononucleadas
METÁFASE
EFEITOGENOTÓXICO
ANÁFASE
CÉLULANORMAL
CÉLULAANORMAL
CÉLULAS -FILHAS NORMAISCÉLULAFILHA
NORMAL
CÉLULAMICRONUCLEADA
Fenech & Morley (1985) – “cytokinesis block method”
Citocalasina B – Helminthosporum dematoideuminibe a citocinese, mas não a carciocinesecélula binucleada (1 divisão nuclear)
Cultivo: adição de cito B, 44 horas após tratamento isotônico – preservação do citoplasma
para cada dose – 500 células binucleadas
Desvantagem - não oferece toda a informação- 10 a 12 MN / 1000 binucleadas
Vantagens - relativamente simples e sensível- análise mais rápida- bom indicador de dano genético- magnitude do dano ocorrido
Ilustração esquemática do mecanismo de formação de micronúcleos em células binucleadas
METÁFASE
EFEITOGENOTÓXICO
ANÁFASECÉLULANORMAL
CÉLULAANORMAL
CÉLULAMICRONUCLEADA
CÉLULANORMAL
ADIÇÃO DECITOCALASINA B
Parâmetros:
-frequência de células com MN (incidência de células afetadas)
-distribuição de MN (extensão do dano ocorrido)0, 1, 2, 3, 4, 5 MN por célula>5 MN - desprezado
TESTE DO COMETA(“SINGLE CELL GEL ASSAY”)
Ostling & Johanson (1984) – técnica eletroforética de microgel
condição neutra quebra na dupla fita
direta visualização do dano em nível de célula individual
Singh et al. (1988) – condição alcalina
quebra na fita sítios
simples álcali-lábeis
Número e tipo de lesões radio – induzidas no DNA (Resnick (67), Warters e Childers (74) e Wlodek e Hittelman (75))
Tipo de lesão Número por gray
Quebra fita dupla (dsb) 40
Quebra simples fita (ssb) 500 – 1000
Dano na base 1000 – 2000
Dano no acúcar 800 – 1600
ligações cruzadas (crosslinks) DNA – DNA 30
ligações cruzadas DNA – proteínas 150
Sítos álcali – lábeis 200 - 300
1 Gy de radiação 1 quebra na 25 quebras na fita de baixa LET fita dupla na fita simples / cromossomo
PRINCÍPIO DO MÉTODO
-DNA nuclear altamente organizado-Molécula de DNA de células de eucarioto-(50 – 100 cm de comprimento)
105 x núcleo(5-10 m )
Interpretação esquemática do padrão de migração do DNA, formando estrutura semelhante ao do cometa
TÉCNICA DE ELETROFORESE DE MICROGEL
PARÂMETROS
- Comprimento da imagem ou do Cometa
( cabeça + cauda)
DNA do nucleóide DNA que migrou
- Comprimento da Cauda
(distância de migração de DNA)
magnitude de dano ocorrido
- Área do Cometa
- “Tail moment” = quantidade DNA X comprimento
na cauda da cauda
intensidade de fluorescência
VANTAGENS
- Análise direta do dano no DNA em nível de célula individual
- Quantidade pequena de células ( da ordem de L)
- Relativa facilidade na obtenção de dados
- Análise de 50 células / dose
- Sensibilidade: 5 cGy de radiação de baixa LET
- Estudo de danos no DNA e reparo: danos oxidativos, dosimetria biológica,
biomonitoramento e estudos de apoptose
Radiação de 60Co
Radiação de 60Co
Radiação de 90Sr