Effect of salinity on the immune response of tiger shrimpPenaeus monodon and its susceptibility toPhotobacterium damselae subsp. Damselae

Pengaruh salinitas terhadap respon kekebalan tubuh udang windu Penaeus monodon dan kerentanan terhadap Photobacterium damselae subsp. damselae

AbstractAddition of NaCl at 2.5% to tryptic soy broth (TSB) significantly increased the growth of Photobacterium damselae subsp. damselae.Tiger shrimp Penaeus monodon held in 25‰ seawater were injected with P. damsela subsp. damselae grown in TSB containingNaCl at 0.5%, 1.5%, 2.5% and 3.5% at a dose of 8.48!104 colony-forming units (cfu) shrimp_1. Over 24e96 h, thecumulative mortality was significantly higher for the shrimp challenged with P. damselae subsp. damselae grown in 2.5% NaClthan those grown in 0.5%, 1.5% and 3.5% NaCl. In another experiment, P. monodon held in 25‰ were injected with TSB-grownP. damselae subsp. damselae (8.48!104 cfu shrimp_1), and then transferred to 5‰, 15‰, 25‰(control) and 35‰. After 96 h, themortality was highest for the P. damselae subsp. damselae-injected shrimp held in 5‰, and the lowest for the P. damselae subsp.damselae-injected shrimp held in 25‰. In a separate experiment, P. monodon held in 25‰and then transferred to 5‰, 15‰, 25‰(control) and 35‰were examined for immune parameters, and phagocytic activity and clearance efficiency of P. damselae subsp.damselae after 12e96 h. The THC, hyaline cell, phenoloxidase activity, respiratory burst, superoxide dismutase (SOD) activity,phagocytic activity and clearance efficiency decreased significantly for the shrimp held in 5‰, 15‰and 35‰after 12 h. It is concludedthat tiger shrimp P. monodon transferred from 25‰ to low salinity levels (5‰ and 15‰) and high salinity (35‰) had reducedimmune ability and decreased resistance against P. damselae subsp. damselae infection._ 2005 Elsevier Ltd. All rights reserved.

AbstrakPenambahan NaCl 2,5% ke larutan kedelai triptik/ tryptic soy broth (TSB) secara signifikan meningkatkan pertumbuhan Photobacterium damselae subsp. damselae. Udang windu Penaeus monodon yang disimpan dalam air laut 25 ‰, disuntik dengan P. damselae subsp. damsela yang tumbuh di TSB yang mengandung NaCl masing-masing sebesar 0,5%, 1,5%, 2,5% dan 3,5% dengan dosis 8,48 x 104 colony-forming unit (cfu) / udang. Selama 24 – 96 jam, nilai mortalitas keseluruhan secara signifikan lebih tinggi pada udang yang diuji dengan P. damselae subsp. damselae yang tumbuh dalam NaCl 2,5% daripada yang tumbuh dalam NaCl 0,5%, 1,5% dan 3,5%. Dalam eksperimen lain, P. monodon yang disimpan dalam air laut 25 ‰ disuntik dengan P. damselae subsp. damselae yang tumbuh pada TSB (8,48 x 104 unit pembentuk koloni atau colony-forming unit (cfu) / udang), kemudian dipindahkan ke yang 5 ‰, 15 ‰, 25 ‰ (kontrol) dan 35 ‰. Setelah 96 jam, mortalitas tertinggi didapatkan pada udang P. damselae subsp. Damselae yang disimpan di salinitas 5‰, dan terendah pada udang P. damselae subsp. Damselae yang disimpan di salinitas 25‰. Dalam percobaan terpisah, dengan metode yang

sama, P. monodon diperiksa untuk mengetahui parameter kekebalan tubuh serta aktivitas fagositik dan efisiensi pemberantasan P. damselae subsp. damselae setelah 12 – 96 jam. THC, sel hialin, aktivitas phenoloxidase, ledakan pernapasan, aktivitas superoxide dismutase (SOD), aktivitas fagositik, dan efisiensi clearance menurun secara nyata untuk udang disimpan di salinitas 5 ‰, 15 ‰, dan 35 ‰ setelah 12 jam. Hal ini disimpulkan bahwa udang windu P. monodon yang dipindahkan dari salinitas 25 ‰ ke tingkat salinitas rendah (5 ‰ dan 15 ‰) dan salinitas tinggi (35 ‰) telah mengurangi kemampuan kekebalan tubuh dan penurunan perlawanan terhadap infeksi P. damselae subsp. damselae.

© 2005 Elsevier Ltd All rights reserved.

1. IntroductionIn the Eastern hemisphere, commercial shrimp farming mainly based on tiger shrimp Penaeus monodon and kurumashrimp Marsupenaeus japonicus has been particularly badly hit by an epidemic of viruses like monodon baculovirus(MBV), white spot syndrome virus (WSSV), yellow head virus (YHV) and infectious hypodermal andhematopoietic necrosis virus (IHHNV) [1]. Several disease outbreaks have also been due to vibriosis caused by Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi and Photobacterium damselae subsp. damselae (formerly Vibrio damsela) [2e4]. Thesediseases have been reported to be associated with increases of Vibrio populations in culture pond waters [5].In decapod crustaceans, three types of circulating haemocytes are recognised: hyaline, semi-granular and largegranular cells [6]. They are involved not only in phagocytosis, an important process of eliminating microorganismsor foreign particles [7], but also in the production of melanin by the prophenoloxidase (proPO) system [8,9]. Phenoloxidaseis the terminal enzyme in the proPO system and is activated by polysaccharides like b-1,3-glucan, lipopolysaccharideor peptidoglycan from microorganisms through pattern recognition proteins [10].It is known that once a pathogen enters the haemolymph, the host’s NADPH oxidase is activated, which in turnreduces oxygen and subsequently produces several reactive oxygen species such as superoxide anion (O2

_), hydroxylradical (cOH), hydrogen peroxide (H2O2) and singlet oxygen (1O2). The release of superoxide anion is known as therespiratory burst, and it plays an important role in microbicidal activity [11]. It is also known that superoxide dismutase(SOD) catalyses the rapid two-step dismutation of the toxic superoxide anion to molecular oxygen and hydrogenperoxide through the alternate reduction and oxidation of the active-site metal ion [12,13].Tiger shrimp P. monodon is the most important species of penaeid currently being cultured commercially in manycountries. This species is euryhaline, and has a tolerance of a wide range of salinity from 1‰to 57‰[14]. P. monodonexhibits hyper-osmotic regulation in low salinity levels, and exhibits hypo-osmotic regulation in high salinity levelswith an iso-osmotic point of 750 mOsm kg_1 (equivalent to 25‰) [15]. The level of salinity suitable for growth of this

species is in the range of 10‰e35‰ [16]. Farmers are likely to add freshwater to adjust salinity levels lower thanthese levels, because they believe that the growth of shrimp in brackish water is better than in seawater.We assume that change in salinity may affect the immune resistance of P. monodon, and lead to its susceptibility tovibriosis and mortality. Accordingly, this study was aimed at measuring: (1) the effects of NaCl on the growth ofP. damselae subsp. damselae in tryptic soy broth, (2) the virulence of P. damselae subsp. damselae incubated at differentconcentrations of NaCl to P. monodon, (3) the effect of salinity on the susceptibility of P. monodon to P. damselaesubsp. damselae, and (4) the effect of salinity on the immune parameters of P. monodon. For the latter purpose,total haemocyte count (THC), differential haemocyte count (DHC), phenoloxidase activity, respiratory burst (releaseof superoxide anion), superoxide dismutase (SOD) activity, phagocytic activity and clearance efficiency of shrimp toP. damselae subsp. damselae were examined.2. Materials and methods2.1. P. monodonP. monodon were obtained from a commercial farm in Iilan, Taiwan, and acclimatized in the laboratory for 2 weeksbefore experimentation. Only shrimp in the intermolt stage were used for the study. The molt stage was identified bythe examination of uropoda in which partial retraction of the epidermis could be distinguished [17]. For the virulenceand susceptibility experiments, test and control groups of 10 shrimp in triplicate were used. For the experiments ofimmune parameter assays, tests were carried out in eight replicate test groups consisting of one shrimp each in20 l PVC tanks. In all tests, the shrimp were fed twice daily with a formulated shrimp diet (Tairoun Feed Company,Taipei, Taiwan). The shrimp ranged from 15.7 to 23.2 g, averaging 18.75G3.60 g (meanGSD) with no significantsize difference among the treatments. During experiments, water temperature was maintained at 28G1 _C, pH 7.9e8.2 while salinity was maintained at 25‰, and transferred to 5‰, 15‰, 25‰ and 35‰for the susceptibility test andimmune parameter assays.2.2. P. damselae subsp. damselaeP. damselae subsp. damselae (no. 12906) obtained from Bioresources Collection and Research Center, Food Industryand Development Institute (Hsinchu, Taiwan) was used for the study. This species was demonstrated tohave high pathogenicity in P. monodon [18]. Stocks were cultured on tryptic soy agar (TSA supplemented with2.5% NaCl, Difco) for 24 h at 28 _C and transferred into 10 ml tryptic soy broth (TSB supplemented with 2.5%NaCl, Difco) for 24 h at 28 _C for use as a stock bacterial broth for growth tests. For challenge experiments, stockcultures were centrifuged at 7155!g for 20 min at 4 _C. The supernatant fluid was removed and the bacterial pellet

was re-suspended in saline solution (0.85% NaCl) at 4.24!106 cfu ml_1 for the virulence and susceptibility tests,and 4.70!106 cfu ml_1 for the phagocytic activity and clearance efficiency tests. The concentration of the bacterialsuspension was measured by its absorbance at 601 nm optical density, and was calculated from a standard curve basedon a series of different concentrations of bacterial suspension.2.3. Effect of NaCl on the growth of P. damselae subsp. damselaeInoculum for the growth tests consisted of 0.5 ml of stock broth culture. Bacteria were cultured in 10 ml tryptic soybroth supplemented with different concentrations of NaCl (0.5%, 1.5%, 2.5% and 3.5%) in 50 ml flasks at 28G1 _C.Each test was conducted in triplicate and bacterial growth was monitored at 12, 24, 48, 72, 96, 120 and 144 h of incubationby measuring the optical density (OD) at 601 nm using a Model U-2000 spectrophotometer (Hitachi, Tokyo,Japan).2.4. Effect of NaCl on the virulence of P. damselae subsp. damselaeAfter 24 h of cultivation in TSB containing different concentrations of NaCl, P. damselae subsp. damselae in eachmedium was harvested by centrifugation at 7155!g for 15 min at 4 _C. The pellet was re-suspended in saline solution(0.85% NaCl) at 4.24!106 cfu ml_1 as the stock bacterial suspension for injection.Each shrimp was injected with 20 ml of bacterial suspension (4.24!106 cfu ml_1) into the ventral sinus of thecephalothorax resulting in 8.48!104 cfu shrimp_1. Challenge tests were conducted in triplicate with 10 shrimpper replicate following the methods described by Liu and Chen [19]. After injection, shrimp were kept in a separate60 l glass aquarium (10 shrimp each) containing 40 l of aerated water at 25‰salinity. They were fed with a formulatedshrimp diet, and observed for 96 h. During the experiment, water temperature was maintained at 28G1 _C. Controlshrimp were injected with an equal volume of sterile saline solution (Table 1).2.5. Effect of salinity change on the susceptibility of P. monodon to P. damselae subsp. damselaeChallenge tests were conducted in triplicate with 10 shrimp per replicate following the methods described before[19]. Into the ventral sinus of the cephalothorax of each shrimp, 20 ml of bacterial suspension (4.24!106 cfu ml_1)was injected resulting in 8.48!104 cfu shrimp_1. After injection, shrimp were kept in a separate 60 l glass aquarium(10 shrimp each) containing 40 l of aerated water at 5‰, 15‰, 25‰(control) and 35‰. The experiment lasted 96 h at28G1 _C. Shrimp injected with an equal volume of sterile saline solution and kept in 5‰, 15‰, 25‰and 35‰seawaterserved as the unchallenged controls (Table 2).Table 1Susceptibility of P. monodon to P. damselae subsp. damselae which was incubated in tryptic soy broth supplemented with different NaCl concentrationsat 28G1 _C

1. Pendahuluan

Di belahan bumi Timur, pertambakan udang komersial yang terutama berbasis udang windu Penaeus monodon dan udang kuruma Marsupenaeus japonicus telah mengalami epidemi virus-virus seperti baculovirus (MBV), white spot syndrome virus (WSSV), yellow head virus (YHV) dan infectious hypodermal and hematopoetic necrosis virus (IHHNV) yang sangat parah [1]. Beberapa wabah penyakit Vibriosis yang disebabkan oleh Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, dan Photobacterium damselae subsp. damselae (dulu disebut Vibrio damsela) juga mulai muncul [2-4]. Penyakit – penyakit ini telah dilaporkan untuk dihubungkan dengan peningkatan populasi Vibrio di budidaya perairan tambak – culture pond waters.

Pada krustasea berkaki sepuluh, ada tiga tipe sirkulasi hematosit yang ditemukan : sel hialin, semi-granular, dan granular besar. Ketiganya bukan hanya terlibat dalam fagositosis, suatu proses eliminasi mikroorganisme atau partikel asing, tapi juga dalam produksi melanin oleh sistem prophenoloxidase (proPO). Phenoloxidase adalah enzim terminal pada sistem proPO dan diaktifkan oleh polisakarida seperti β -1,3-glucan, lipopolisakarida, atau peptidoglikan dari mikroorganisme melalui pola pengenalan protein.

Telah diketahui bahwa sekali suatu patogen memasuki hemolimf, NADPH oksidase host teraktivasi, yang nantinya akan mengurangi oksigen dan kemudian menghasilkan menghasilkan beberapa jenis oksigen reaktif seperti anion superoksida (O2

-), Hidroksil radikal (COH), hidrogen peroksida (H2O2), dan oksigen tunggal (1O2). Pelepasan anion superoksida dikenal sebagai ledakan pernapasan (respiratory burst) dan memainkan peran penting dalam aktivitas mematikan bakteri [11]. Telah diketahui pula bahwa superoksida dismutasi (SOD) mengkatalisis dua langkah cepat reaksi dismutasi dari anion superoksida beracun untuk molekul oksigen dan hidrogen peroksida melalui alternatif reduksi dan oksidasi sisi aktif ion logam [12,13].

Udang windu P. monodon adalah spesies paling penting dari penaeid yang saat ini sedang dibudidayakan secara komersial di banyak negara. Spesies ini euryhaline dan memiliki toleransi pada berbagai salinitas dari 1 ‰ hingga 57 ‰ [14]. P. Monodon menunjukkan hiper-regulasi osmotik dalam tingkat salinitas rendah, dan regulasi hipo-osmotik dalam tingkat salinitas tinggi dengan jalur iso-osmotik 750 mOsm/ kg (setara dengan 25 ‰) [15]. Tingkat salinitas yang cocok untuk pertumbuhan spesies ini yaitu pada kisaran 10 ‰ – 35 ‰ [16]. Penambak cenderung menambahkan air tawar untuk menyesuaikan tingkat salinitas yang lebih rendah daritingkat ini, karena mereka percaya bahwa pertumbuhan udang di air payau lebih baik daripada di air laut.

Kami berasumsi bahwa perubahan salinitas dapat mempengaruhi resintensi imun P. monodon yang mengarah pada kerentanan terhadap vibriosis dan kematian. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan mengukur: (1) pengaruh NaCl terhadap pertumbuhan P. damselae subsp. damselae dalam larutan kedelai tryptic, (2) virulensi dari P. damselae subsp. damselae yang diinkubasi pada konsentrasi NaCl yang berbeda terhadap P. monodon, (3) pengaruh salinitas terhadap kerentanan P. monodon terhadap P. damselae subsp. damselae, dan (4) pengaruh salinitas pada parameter kekebalan P. monodon. Untuk tujuan yang terakhir, total count haemocyte (THC), diferential haemocyte (DHC), aktivitas phenoloxidase, ledakan pernafasan (rilis anion superoksida), aktivitas superoksida dismutase (SOD), aktivitas fagositik, dan efisiensi pemberantasan udang terhadap P. damselae subsp. damselae diperiksa.

2. Bahan dan metode

2.1. P. Monodon

P. monodon diperoleh dari sebuah pertambakan komersial di Iilan, Taiwan, dan diaklimatisasi di laboratorium selama 2 minggu sebelum percobaan. Hanya udang dalam tahap intermolt (sedang berganti kulit) yang digunakan untuk penelitian. Tahap intermolt diidentifikasi oleh pemeriksaan uropoda di mana dapat dibedakan adanya pencabutan sebagian epidermis [17]. Untuk percobaan virulensi dan kerentanan, digunakan kelompok uji dan kontrol dengan 10 udang rangkap tiga. Untuk percobaan tes parameter kekebalan tubuh, tes dilakukan dengan delapan kelompok uji serupa yang masing-masing terdiri dari satu udang dalam tangki 20 l PVC. Dalam semua tes, udang diberi makan dua kali sehari dengan diet udang dirumuskan (Tairoun Feed Company, Taipei, Taiwan). Berat udang mulai dari 15,7 sampai 23,2 g, dengan rata-rata 18.75±3.60 g (mean±SD) tanpa perbedaan ukuran signifikan antar perlakuan. Selama percobaan, suhu air dijaga pada 28° C, pH 7.9-8.2 sedangkan salinitas dipertahankan di 25 ‰, dan dipindahkan ke 5 ‰, 15 ‰ 25 ‰ dan 35 ‰ untuk tes kerentanan dan parameter kekebalan.

2.2. P. damselae subsp. DamselaeP. damselae subsp. damselae (no. 12906) yang diperoleh dari Pusat Pengumpulan dan Penelitian Sumber Daya Alam (Bioresources Collection and Research Center), Industri Makanan (Food Industry), dan Institut Pengembangan (Development Institute) (Hsinchu, Taiwan) digunakan untuk penelitian. Spesies ini telah ditunjukkan memiliki patogenisitas tinggi terhadap P. monodon [18]. Sediaan dikultur pada agar kedelai tryptic (TSA dilengkapi denganNaCl 2,5%, Difco) selama 24 jam pada suhu 28° C dan dipindahkan ke 10 ml larutan kedelai tryptic – tryptic soy both (TSB dilengkapi dengan 2,5% NaCl, Difco) selama 24 jam pada 28° C untuk digunakan sebagai persediaan larutan bakteri untuk tes pertumbuhan. Untuk percobaan tantangan, sediaan kultur disentrifugasi pada 7155 X g selama 20 menit pada suhu 4°C. Cairan supernatan dibuang dan butir bakteri itu disuspensi kembali dalam larutan garam (NaCl0,85%) pada 4,24 X 106 cfu / ml untuk uji virulensi dan kerentanan, dan 4.70 X 106 cfu/ml untuk aktivitas fagositosis dan tes efisiensi clearance. Konsentrasi suspensi bakteri diukur pada absorban 601 nm densitas optik, dan dihitung dari kurva standar berdasarkan pada serangkaian konsentrasi yang berbeda dari suspensi bakteri.

2.3. Pengaruh NaCl terhadap pertumbuhan P. damselae subsp. damselaeInokulum untuk tes pertumbuhan terdiri dari 0,5 ml sediaan kultur larutan. Bakteri dikultur dalam 10 ml medium TSB dilengkapi dengan konsentrasi NaCl yang berbeda (0,5%, 1,5%, 2,5% dan 3,5%) dalam labu 50 ml pada 28±1 °C. Setiap pengujian dilakukan rangkap tiga dan bakteri pertumbuhan dimonitor pada 12, 24, 48, 72, 96, 120 dan 144 jam inkubasi dengan mengukur optical density (OD) – densitas optik pada 601 nm menggunakan spektrofotometer U-2000 (Hitachi, Tokyo, Jepang).

2.4. Pengaruh NaCl pada virulensi subsp damselae P.. damselaeSetelah 24 jam kultur di medium TSB yang mengandung konsentrasi NaCl yang berbeda, P. damselae subsp. damselae di masing-masing medium dipanen dengan sentrifugasi pada 7155 g selama 15 menit pada suhu 4 °C. Butiran itu kembali disuspensikan dalam larutan garam(0,85% NaCl) pada 4,24 x 106 cfu/ml sebagai persediaan suspensi bakteri untuk injeksi.Setiap udang disuntik dengan 20 ml suspensi bakteri (4,24 x 106 ml/cfu) ke dalam sinus ventral cephalothorax menghasilkan 8,48 udang 104/cfu. Tes challenge dilakukan rangkap dengan 10 ekor udang tiap kalinya mengikuti metode yang dijelaskan oleh Liu dan Chen [19]. Setelah penyuntikan, udang disimpan dalam akuarium kaca 60 l secara terpisah (10 udang masing-

masing) yang berisi 40 l air diaerasi dengan salinitas 25 ‰. Mereka diberi makan dengan rumusan diet udang, dan diamati selama 96 jam. Selama percobaan berlangsung, suhu air dipertahankan pada suhu 28±1°C. Udang kontrol disuntikkan larutan saline steril dengan volume yang sama (Tabel 1).

2.5. Pengaruh perubahan salinitas terhadap kerentanan P. monodon untuk P. damselae subsp. damselae Tes challenge dilakukan rangkap tiga dengan 10 udang tiap kalinya dengan metode yang sama seperti dijelaskan sebelumnya [19]. Ke dalam sinus ventral cephalothorax udang masing-masing, disuntikkan 20 ml suspensi bakteri (4,24x106 cfu/ml) menghasilkan udang 8,48x104 cfu/udang. Setelah penyuntikan, udang udang disimpan dalam akuarium kaca 60 l secara terpisah (10 udang masing-masing) yang berisi 40 l air diaerasi dengan salinitas 5‰, 15‰, 25‰ (kontrol), dan 35‰. Percobaan berlangsung selama 96 jam pada suhu 28±1°C. Udang yang disuntik larutan saline steril dengan volume yang sama dan disimpan dalam air laut dengan salinitas 5‰, 15‰, 25‰ (kontrol), dan 35‰ menjadi kontrol (Tabel 2).

Tabel 1Kerentanan P. monodon untuk P. damselae subsp. damselae yang diinkubasi dalam medium TSB dilengkapi dengan konsentrasi NaCl yang berbeda di 28±1°C

2.6. Effect of salinity change on the immune parameters of P. monodonFor haemocyte count and enzyme activity assays, P. monodon (16e23 g) reared in 25‰ seawater were placed ineight replicates of 20 l PVC tanks (one shrimp per tank) with 5‰, 15‰, 25‰ and 35‰ seawater that was reneweddaily for 96 h. Haemolymph was sampled individually at the beginning of the test, and at 12, 24, 48 and 96 h. Haemolymph(100 ml) was withdrawn from the ventral sinus of each shrimp into a 1 ml sterile syringe (25 gauge) containing0.9 ml anticoagulant solution (30 mM trisodium citrate, 0.34 M sodium chloride, 10 mM EDTA, 0.115 Mglucose, pH 7.55, osmolality 780 mOsm kg_1). A drop of the anticoagulantehaemolymph mixture was placed ona haemocytometer to count THC and DHC using an inverted phase-contrast microscope (Leica DMIL, Leica Microsystems,Wetzlar GmbH, Germany), while the remainder was used for subsequent tests.Phenoloxidase activity was measured spectrophotometrically by recording the formation of dopachrome producedfrom L-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) based on the method of Herna˜ndez-Lo´pez et al. [20]. The detail of the measurementwas described previously [19]. The optical density of the shrimp’s phenoloxidase activity for all test conditionswas expressed as dopachrome formation in 50 ml of haemolymph.Respiratory burst activity of haemocytes was quantified using the reduction of nitroblue tetrazolium (NBT) toformazan as a measure of superoxide anion, as described previously [19]. The optical density at 630 nm was measuredusing a microplate reader (Model VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Respiratory burst wasexpressed as NBT-reduction in 10 ml of haemolymph.

Superoxide dismutase (SOD) activity was measured by its ability to inhibit superoxide radical dependent reactionsusing the Ransod kit (Randox, Crumlin, UK). The detail of the measurement was described previously [19]. The opticaldensity was measured at 505 nm, 37 _C, and the rate of reaction was estimated from the absorbance readings 30 sand 3 min after adding xanthine oxidase. A reference standard SOD was supplied with the Ransod kit. One unit ofSOD was defined as the amount required to inhibit the rate of xanthine reduction by 50%. Specific activity was expressedas SOD units ml_1.For the phagocytic activity and bacterial clearance tests, experimental parameters were as described above. Shrimpwere transferred individually to 5‰, 15‰, 25‰ and 35‰. After 0, 12, 24, 48 and 96 h of transfer, shrimp were injectedwith 20 ml bacterial suspension (4.70!106 cfu ml_1 in 0.85% NaCl) into the ventral sinus resulting in9.40!104 cfu shrimp_1. After injection, the shrimp were held in their respective test solutions for 1.5 h at28G1 _C. Then, 100 ml of haemolymph from the ventral sinus was collected, and mixed with 100 ml and 900 mlof anticoagulant for the measurement of phagocytic activity and clearance efficiency, respectively.Phagocytic activity was measured following the method described by Weeks-Perkins et al. [21]. Briefly, 200 ml ofthe diluted haemolymph sample was fixed with 200 ml 0.1% paraformaldehyde for 30 min at 4 _C to fix the haemocytes,and then centrifuged at 800!g (centrifuge Model 5403, Eppendorf, Hamburg, Germany) at 4 _C. The detail of

2.6. Pengaruh perubahan salinitas pada parameter kekebalan P. MonodonUntuk uji haemocyte count dan aktivitas enzim, P. monodon (16-23 g) yang tersimpan

dalam air laut dengan salinitas 25 ‰ ditempatkan di delapan tangki 20 l PVC serupa (satu udang per tangki) dengan air laut yang salinitasnya diperbaharui 5 ‰, 15 ‰, 25 ‰ dan 35 ‰ setiap hari selama 96 jam. Hemolimf disampelkan tersendiri pada awal pengujian, dan pada 12, 24, 48 dan 96 jam berikutnya. Hemolimf (100 µl) ditarik dari sinus ventral udang masing-masing ke dalam syringe steril 1 ml (25 gauge) yang mengandung 0,9 ml larutan antikoagulan (30 mM trisodium sitrat, natrium klorida 0,34 M, 10 mM EDTA, 0,115 M glukosa, pH 7,55, osmolalitas 780 mOsm/kg). Setetes campuran antikoagulan-hemolimf ditempatkan pada suatu hemositometer untuk menghitung THC dan DHC menggunakan mikroskop kontras fase-terbalik (Leica DMIL, Leica Microsystems, Wetzlar GmbH, Jerman), sementara sisanya digunakan untuk tes berikutnya.

Aktivitas Phenoloxidase diukur secara spektrofotometri dengan mencatat pembentukan dopachrome yang diproduksi dari L-dihydroxyphenylalanine (L-dopa) berdasarkan metode Herna~ndez-Lo'pez et al. [20]. Detail dari pengukuran telah dijelaskan sebelumnya [19]. Kepadatan optik dari aktivitas phenoloxidase udang untuk semua kondisi pengujian dinyatakan sebagai pembentukan dopachrome dalam 50 ml hemolimf.

Aktivitas ledakan pernafasan (Respiratory burst) hemosit diukur dengan menggunakan reduksi tetrazolium nitroblue (NBT) menjadi formazan sebagai pengukuran anion superoksida, seperti yang dijelaskan sebelumnya [19]. Kepadatan optik pada absorban 630 nm diukur

menggunakan pembaca lempeng (Model VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Respiratory burst adalah tampak pada reduksi NBT dalam 10 ml hemolimf.

Aktivitas superoxyda dismutase (SOD) diukur dari kemampuannya untuk menghambat reaksi radikal superoksida terkait menggunakan kit Ransod (Randox, Crumlin, Inggris). Detail dari pengukuran tersebut telah diuraikan sebelumnya [19]. Kepadatan optik diukur pada 505 nm, suhu 37°C, dan laju reaksi diperkirakan dari pembacaan absorbansi pada 30 detik dan 3 menit setelah menambahkan xanthine oxidase. Sebuah SOD referensi standar disertakan dengan kit Ransod. Satu unit SOD didefinisikan sebagai jumlah yang diperlukan untuk menghambat laju penurunan xanthine sebesar 50%. Aktivitas spesifik itu diungkapkan sebagai unit SOD/ml.

Untuk kegiatan fagositosis dan tes clearance (pemberantasan) bakteri, parameter eksperimental adalah sebagaimana dijelaskan di atas. Udang dipindahkan satu per satu ke salinitas 5 ‰, 15‰, 25 ‰ dan 35 ‰. Setelah 0, 12, 24, 48 dan 96 jam transfer, ke dalam sinus ventral udang disuntikkan 20 ml suspensi bakteri (4,70x106 ml/cfu dalam NaCl 0,85%) menghasilkan 9,40x104 cfu/udang. Setelah penyuntikan, udang disimpan di masing-masing larutan uji selama 1,5 jam pada suhu 28±1°C. Kemudian, 100 ml hemolimf dari sinus ventral dikumpulkan, dan dicampur dengan antikoagulan masing-masing 100 ml serta 900 ml untuk pengukuran aktivitas fagositik serta efisiensi clearance.Aktivitas Fagositosis diukur mengikuti metode yang dijelaskan olehWeeks-Perkins et al. [21]. Secara singkat, 200 ml sampel hemolimf diencerkan, tetap dengan 200 ml paraformaldehyde 0,1% selama 30 menit pada suhu 4°C untuk memperbaiki hemosit,dan kemudian disentrifugasi pada 800 g (Centrifuge Model 5403, Eppendorf, Hamburg, Jerman) pada suhu 4°C. Rincian pengukuran telah dijelaskan sebelumnya [19]. Dua ratus hemosit dihitung. Aktivitas fagositosis, yang dinyatakan dalam persentase fagositosis dinyatakan sebagai:

Persentase fagositosis = {(hemosit fagositik) / (total hemosit)} x 100

measurement was described previously [19]. Two hundred haemocytes were counted. Phagocytic activity, defined aspercentage phagocytosis was expressed as:Percentage phagocytosisZfðphagocytic haemocytesÞ=ðtotal haemocytesÞg!100Clearance efficiency was measured following the method of Adams [22]. One millilitre diluted haemolymph wasfurther diluted to 100 ml with saline solution (0.85% NaCl). Three 50 ml portions of this diluted haemolymph samplewere spread on separate TSA plates and incubated at 28 _C for 24 h before colonies were counted using a colonycounter. The number of colonies for shrimp kept in 25‰salinity was expressed as the control group, and the numberof colonies for shrimp transferred to 5‰, 15‰, and 35‰ after 12, 24, 48 and 96 h was expressed as the test group.Clearance efficiency to P. damselae subsp. damselae, defined as percentage inhibition (PI) was calculated as:PIZ100_fðcfu in test groupÞ=ðcfu in control groupÞg!1002.7. Statistical analysisA multiple comparison (Tukey) test was conducted to compare the significant differences among treatments usingthe SAS computer software (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Percent data (virulence test and susceptibility test)were normalised using an arcsin transformation before analysis. For statistically significant differences, it was requiredthat p!0.05.3. Results

3.1. Effect of NaCl on the growth of P. damselae subsp. damselaeP. damselae subsp. damselae grew better in the TSB medium containing NaCl at 2.5% than in the medium containing0.5%, 1.5% and 3.5% NaCl after 12e144 h (Fig. 1).3.2. Effect of NaCl on the virulence of P. damselae subsp. damselaeAll the unchallenged control shrimp survived. By contrast, death began to occur in the challenged shrimp 12 h postinjection.Cumulative mortality of shrimp after 24e96 h was significantly higher with bacteria incubated in TSB containing2.5% NaCl than with bacteria incubated in TSB containing NaCl at 0.5%, 1.5% and 3.5% (Table 1).

Efisiensi clearance diukur mengikuti metode Adams [22]. Satu mililiter hemolimf terdilusi diencerkan lagi menjadi 100 ml dengan larutan saline (NaCl0,85%). Tiga bagian masing –masing 50 µl dari sampel hemolimf ini diencerkan tersebar di plate TSA terpisah dan diinkubasi pada suhu 28°C selama 24 jam sebelum koloni dihitung menggunakan koloni counter. Jumlah koloni untuk udang disimpan di salinitas 25 ‰ dinyatakan sebagai kelompok kontrol, dan jumlahkoloni untuk udang dipindahkan ke 5 ‰, 15 ‰, dan 35 ‰ setelah 12, 24, 48 dan 96 jam dinyatakan sebagai kelompok uji. Efisiensi clearance untuk P. damselae subsp. damselae, yang dinyatakan sebagai persentase inhibisi (PI) dihitung sebagai:

PI = 100 – {(cfu dalam kelompok uji) / (cfu dalam kelompok kontrol)} X 100

2.7. Analisis statistikTes multipel perbandingan (Tukey) dilakukan untuk membandingkan perbedaan nyata antar perlakuan menggunakan komputer SAS software (SAS Institut Inc, Cary, NC, USA). Persen data (virulensi dan uji kerentanan) dinormalisasi menggunakan transformasi arcsin sebelum analisis. Untuk perbedaan yang signifikan secara statistik, harus memenuhi syarat p<0,05.

3. Hasil

3.1. Pengaruh NaCl terhadap pertumbuhan P. Damselae subsp. damselaeP. damselae subsp. damselae tumbuh lebih baik pada medium TSB yang mengandung NaCl sebesar 2,5% dibandingkan dengan medium yang mengandung NaCl 0,5%, 1,5% dan 3,5% setelah 12-144 h (Gbr. 1).

3.2. Pengaruh NaCl pada virulensi P. damselae subsp. damselaeSemua udang kontrol mutlak selamat. Sebaliknya, kematian mulai terjadi di kurun waktu12 jam post-injeksi pada kelompok uji. Mortalitas kumulatif udang setelah 24 – 96 jam secara signifikan lebih tinggi dengan bakteri yang diinkubasi dalam TSB mengandung NaCl 2,5% dibandingkan dengan bakteri yang diinkubasi dalam TSB mengandung NaCl sebesar 0,5%, 1,5% dan 3,5% (Tabel 1).

Fig. 1. Effect of NaCl concentration in TSB medium on P. damselae subsp. damselae grown at 28 _C. Bacterial numbers were determined byabsorbance of bacterial suspension at 601 nm at 12, 24, 48, 72, 96, 120 and 144 h. Each bar represents the mean (GSE) of three determinations.Bars for the same time with different letters are significantly different (p!0.05).

Gambar. 1. Pengaruh konsentrasi NaCl pada medium TSB pada P. damselae subsp. damselae ditumbuhkan pada suhu 28° C. Nomor bakteri ditentukan oleh absorbansi suspensi bakteri pada panjang gelombang 601 nm pada 12, 24, 48, 72, 96, 120 dan 144 jam. Setiap bar mewakili rata-

rata (GSE) dari tiga penentuan. Bar untuk waktu yang sama dengan huruf yang berbeda berbeda nyata (p<0,05).

3.3. Effect of salinity change on the susceptibility of P. monodon to P. damselae subsp. damselaeAll the unchallenged control shrimp survived. By contrast, the onset of mortality occurred at 12 h in the challengedshrimp. Over 24e96 h, the cumulative mortality for the shrimp held in 5‰ was significantly higher than that for theshrimp held in 15‰, 25‰ and 35‰. The cumulative mortality of challenged shrimp held in 25‰ was the lowest,whereas the cumulative mortality of challenged shrimp held in 5‰ was the highest among four treatments after 24and 96 h (Table 2).3.4. Effect of salinity change on the immune parameters of P. monodonFor the shrimp held in 25‰, the mean (GSE) hyaline cell (HC) count varied from 185G2!105

to193G2!105 cells ml_1. The HC decreased significantly by 58%, 50% and 17% for the shrimp transferred to5‰, 15‰and 35‰, respectively, after 12 h, and decreased significantly by 44%, 31% and 14% for the shrimp transferredto 5‰, 15‰ and 35‰, respectively, after 96 h as compared to the shrimp in 25‰ (Fig. 2A). The HC made up78.7% of the THC for the shrimp held in 25‰, whereas the contribution of HC in the THC decreased to 71.5% and72.0% for the shrimp transferred to 5‰ and 15‰, respectively, after 12 h.For the shrimp held in 25‰, the mean counts (GSE) of semi-granular cells (SGC) varied from 32G2!105 to35G1!105 cells ml_1. The SGC decreased significantly by 42% and 39% for the shrimp transferred to 5‰ and15‰, respectively, after 12 h, and decreased significantly by 30% and 18% for the shrimp transferred to 5‰ and15‰, respectively, after 96 h as compared to the shrimp in 25‰ (Fig. 2B). The SGC made up 13.7% of the THCfor the shrimp held in 25‰, whereas the contribution of SGC in the THC increased to 16.7% and 15.4% for the shrimptransferred to 5‰ and 15‰, respectively, after 12 h.For the shrimp held in 25‰, the mean (GSE) granular cell (GC) count varied from 19G1!105

to20G2!105 cells ml_1. The GC decreased significantly by 30% and 21% for the shrimp transferred to 5‰and 15‰, respectively, after 12 h. However, no significant difference in GC was observed for the shrimp amongfour treatments after 96 h (Fig. 2C). The GC made up 8.0% of the THC for the shrimp held in 25‰, whereas thecontribution of GC in the THC increased to 12.0% and 11.7% for the shrimp transferred to 5‰ and 15‰, respectively,after 12 h.For the shrimp held in 25‰, the mean (GSE) THC varied from 236G7!105 to 247G9!105 cells ml_1. TheTHC decreased significantly by 54%, 46% and 15% for the shrimp transferred to 5‰, 15‰ and 35‰, respectively,after 12 h, and decreased significantly by 39% and 28% for the shrimp transferred to 5‰and 15‰, respectively, after96 h as compared to the shrimp in 25‰ (Fig. 3A).

Phenoloxidase activity decreased significantly by 48%, 44% and 24% for the shrimp transferred to 5‰, 15‰ and35‰, respectively, after 12 h. Phenoloxidase activity decreased significantly by 40% and 27% for the shrimp transferredto 5‰ and 15‰, respectively, after 96 h (Fig. 3B).No significant difference in respiratory burst was observed among the shrimp held in 25‰at the different samplingtimes. After 12 h, respiratory burst decreased significantly by 21%, 20% and 16% for the shrimp transferred to 5‰,15‰and 35‰, respectively. After 24, 48 and 96 h, respiratory burst decreased significantly by 28%, 22% and 21% forthe shrimp transferred to 5‰, respectively (Fig. 4A).No significant difference in SOD activity was observed among the shrimp held in 25‰ at the different samplingtimes. After 12 h, the SOD activity decreased significantly by 45%, 32% and 27% for the shrimp transferred to 5‰,15‰ and 35‰, respectively. After 96 h, the SOD activity decreased significantly by 52%, 27% and 24% for theshrimp transferred to 5‰, 15‰ and 35‰, respectively (Fig. 4B).At time 0 h, phagocytic activity was 35%. After 12 h, phagocytic activity decreased significantly to 10%, 18% and20% for the shrimp transferred to 5‰, 15‰ and 35‰, respectively, as compared to the shrimp held in 25‰. After96 h, phagocytic activity decreased significantly to 17%, 25% and 23% for the shrimp transferred to 5‰, 15‰and 35‰, respectively (Fig. 5A).A similar trend was observed for the clearance efficiency against P. damselae subsp. damselae. After 12 h, clearanceefficiency decreased by 100%, 85% and 73% for the shrimp transferred to 5‰, 15‰, and 35‰, respectively.After 96 h, clearance efficiency decreased by 212%, 94% and 91% for the shrimp transferred to 5‰, 15‰, and35‰, respectively, as compared to the shrimp held in 25‰ (Fig. 5B).

3.3. Pengaruh perubahan salinitas terhadap kerentanan P. monodon untuk P. damselae subsp. damselaeSemua udang kontrol mutlak selamat. Sebaliknya, kematian mulai terjadi di 12 jam pertama dalam udang uji. Setelah 24-96 jam, angka kematian kumulatif untuk udang yang disimpan di salinitas 5 ‰ secara signifikan lebih tinggi dari udang yang disimapan di 15 ‰, 25 ‰, dan 35 ‰. Mortalitas kumulatif udang uji yang disimpan di salinitas 25‰ adalah yang terendah,sedangkan mortalitas kumulatif udang uji yang disimpan di salinitas 5 ‰ adalah yang tertinggi di antara empat perlakuan setelah 24 dan 96 jam (Tabel 2).

3.4. Pengaruh perubahan salinitas pada parameter kekebalan P. MonodonUntuk udang yang disimapn di salinitas 25 ‰, rata-rata (±SE) hitung sel hialin (HC)

bervariasi dari 185±2x105 hingga 193±2 105 sel/ml. HC berkurang secara signifikan masing-masing sebesar 58%, 50%, dan 17% setelah 12 jam untuk udang yang dipindahkan ke salinitas 5 ‰, 15 ‰, dan 35 ‰, dan masing-masing sebesar 44%, 31% dan 14% setelah 96 jam, dibandingkan dengan udang di 25 ‰ (Gbr. 2A). HC dibuat 78,7% dari THC untuk udang yang disimpan di salinitas 25 ‰, sedangkan kontribusi HC di THC turun menjadi 71,5% dan 72,0% untuk udang yang dipindahkan ke saliniyas 5 ‰ dan 15 ‰, masing-masing, setelah 12 jam.

Untuk udang yang disimpan di salinitas 25 ‰, jumlah rata-rata (±SE) sel semi-granular (SGC) bervariasi dari 32±2x105 hingga 35±1x105 sel/ml. SGC berkurang secara signifikan masing-masing sebesar 42% dan 39% untuk udang dipindahkan ke salinitas 5 ‰ dan 15 ‰, setelah 12 jam, dan masing-masing sebesar 30% dan 18% setelah 96 jam, dibandingkan dengan udang di 25 ‰ (Gbr. 2B). SGC terdiri dari 13,7% THC untuk udang yang disimpan di salinitas 25 ‰, sedangkan kontribusi SGC di THC meningkat masing-masing menjadi 16,7% dan 15,4% untuk udang yang dipindahkan ke salinitas 5 ‰ dan 15 ‰, setelah 12 jam.

Untuk udang yang diadakan di 25 ‰, hitung sel granular (GC) bervariasi dari 19±1x105

hingga 20±2x105 sel/ml. GC menurun secara signifikan masing-masing sebesar 30% dan 21% untuk udang yang dipindahkan ke salinitas 5 ‰ dan 15 ‰, setelah 12 jam. Namun, tidak ada perbedaan yang signifikan dalam GC udang yang diamati antaraempat perlakuan setelah 96 jam (Gambar 2C). GC terdiri dari 8,0% THC udang untuk yang disimpan di salinitas 25 ‰, sedangkan kontribusi GC di THC meningkat masing-masing menjadi 12,0% dan 11,7% untuk udang dipindahkan ke salinitas 5 ‰ dan 15 ‰, setelah 12 jam.

Untuk udang yang disimpan di salinitas 25 ‰, didapati rata-rata (±SE) THC bervariasi dari 236±7 x 105 hingga 247±9x105 sel/ml. THC berkurang secara signifikan masing-masing sebesar 54%, 46% dan 15% untuk udang yang dipindahkan ke salinitas 5 ‰, 15 ‰ dan 35 ‰, setelah 12 jam, dan penurunan signifikan masing-masing, sebesar 39% dan 28% untuk udang yang dipindahkan ke 5 ‰ dan 15 ‰, setelah 96 jam dibandingkan dengan udang di 25 ‰ (Gambar 3A).

Aktivitas phenoloxidase berkurang secara signifikan masing-masing sebesar 48%, 44% dan 24% untuk udang yang dipindahkan ke salinitas 5 ‰, 15 ‰, dan 35 ‰, setelah 12 jam. Aktivitas phenoloxidase menurun secara signifikan masing-masing sebesar 40% dan 27% untuk udang ditransfer untuk 5 ‰ dan 15 ‰, setelah 96 jam (Gambar 3B).

Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam ledakan pernapasan (respiratory burst) yang diamati antara udang disimpan di salinitas 25 ‰ pada waktu sampling yang berbeda. Setelah 12 jam, ledakan pernafasan (respiratory burst) menurun secara signifikan masing-masing sebesar 21%, 20% dan 16% untuk udang yang dipindahkan ke salinitas 5 ‰, 15 ‰, dan 35 ‰. Setelah 24, 48 dan 96 jam, ledakan pernafasan (respiratory burst) menurun secara signifikan masing-masing sebesar 28%, 22% dan 21% untuk udang dipindahkan ke salinitas 5 ‰ (Gambar 4A).

Tidak ada perbedaan signifikan yang teramati dalam aktivitas SOD antara udang yang disimpan di salinitas 25 ‰ pada waktu sampling yang berbeda. Setelah 12 jam, aktivitas SOD menurun secara signifikan masing-masing sebesar 45%, 32%, dan 27% untuk udang dipindahkan ke salinitas 5 ‰, 15 ‰, dan 35 ‰,. Setelah 96 jam, aktivitas SOD menurun secara signifikan masing-masing sebesar 52%, 27% dan 24% untuk udang dipindahkan ke 5 ‰, 15 ‰ dan 35 ‰ (Gambar 4B).

Pada awal jam, aktivitas fagositosis adalah 35%. Setelah 12 jam, aktivitas fagositosis masing-masing menurun hingga 10%, 18%, dan 20% untuk udang yang dipindahkan ke salinitas 5 ‰, 15 ‰, dan 35 ‰, dibandingkan dengan udang disimpan di salinitas 25 ‰. Setelah96 jam, aktivitas fagositosis masing-masing menurun hingga 17%, 25% dan 23% (Gambar 5A).

Pola yang sama ditemukan untuk efisiensi clearance terhadap P. damselae subsp. damselae. Setelah 12 jam, efisiensi clearance masing-masing menurun sebesar 100%, 85% dan 73% untuk udang yang dipindahkan ke salinitas 5 ‰, 15 ‰, dan 35 ‰. Sedangkan setelah 96 jam, efisiensi clearance masing-masing menurun sebesar 212%, 94% dan 91% bila dibandingkan dengan udang yang disimpan di salinitas 25 ‰ (Gambar 5B).Fig. 2. The hyaline cell (A), semi-granular cell (B) and granular cell (C) of P. monodon kept at a salinity of 25‰at the beginning, and after 12, 24,

48 and 96 h transfer to 5‰, 15‰, 25‰and 35‰. Each bar represents the mean value from eight shrimp with standard error. Data (meanGSE) inthe same exposure time with different letters are significantly different (p!0.05) among different salinity levels.

Gambar. 2. Sel hialin (A), semi-sel granular (B) dan sel granular (C) P. monodon disimpan pada salinitas 25 ‰ di awal, dan setelah 12, 24,48 dan 96 transfer jam sampai 5 ‰, 15 ‰, 25 ‰ dan 35 ‰. Setiap bar merupakan nilai rata-rata dari delapan udang dengan kesalahan standar. Data (meanGSE) diwaktu bukaan yang sama dengan huruf yang berbeda berbeda nyata (0,05 p!) antara tingkat salinitas yang berbeda.

4. DiscussionEnvironmental parameters affect the growth of pathogens and their production of toxins [23,24]. Vibrio parahaemolyticusgrows well in TSB containing NaCl from 0.5% to 4.5% with optimum at 2.5% and 3.5% in the periods of 48and 72 h [25]. The present study indicated that P. damselae subsp. damselae grew well in TSB containing NaCl from0.5% to 3.5% with optimum at 2.5% in the periods of 12e144 h.It is known that fluctuations in normal environmental conditions such as temperature, salinity and oxygen havea significant effect on the virulence of V. harveyi, and higher salinity increases virulence to shrimp more than highertemperatures [25]. Exposure of V. harveyi to low salinity levels (10‰ and 15‰) for 12 h before use in immersionchallenge tests with larvae of the tiger shrimp P. monodon resulted in higher rate of mortalities [26]. The present

4. DiskusiParameter lingkungan yang mempengaruhi pertumbuhan patogen dan produksi racun

mereka [23,24]. Vibrio parahaemolyticus tumbuh dengan baik di medium TSB yang mengandung NaCl sebesar 0,5% hingga 4,5% dengan konsentrasi optimum pada 2,5% dan 3,5% pada periode 48 dan 72 jam [25]. Penelitian ini menunjukkan bahwa P. damselae subsp. damselae tumbuh dengan baik di medium TSB yang mengandung NaCl sebesar 0,5% hingga 3,5% dengan konsentrasi optimal sebesar 2,5% pada periode 12 – 144 jam.

Telah diketahui bahwa fluktuasi dalam kondisi lingkungan normal seperti suhu, salinitas, dan oksigen memiliki dampak yang signifikan pada virulensi V. harveyi, serta salinitas yang tinggi meningkatkan virulensi udang lebih dari pada suhu tinggi [25]. Paparan V. harveyi ke tingkat salinitas rendah (10 ‰ dan 15 ‰) selama 12 jam sebelum digunakan di tes ujicoba imersi dengan larva dari udang windu P. monodon menghasilkan tingkat kematian lebih tinggi [26]. Hasil studi ini juga menunjukkan bahwa P. damselae subsp. damselae yang diinkubasi dalam medium TSB yang mengandung NaCl 2,5% menampakkan virulensi lebih terhadap P. monodon.

Fig. 3. Total haemocyte count (THC) (A) and phenoloxidase activity (B) of P. monodon kept at a salinity of 25‰ at the beginning, and after 12,24, 48 and 96 h transfer to 5‰, 15‰, 25‰ and 35‰. Each bar represents the mean value from eight shrimp with standard error. See Fig. 2 forstatistical information.results also showed that P. damselae subsp. damselae incubated in TSB containing 2.5% NaCl displayed more virulencein P. monodon.With respect to the hosts themselves, it is reported that white shrimp L. vannamei were more susceptible to V. alginolyticus

when the animals were transferred to 5‰and 15‰from 25‰in 24 h [27]. In the present study, we founda similar phenomenon: P. monodon were more susceptible to P. damselae subsp. damselae when the animals weretransferred from 25‰ to 5‰ and 15‰ after 24 h, and to 5‰, 15‰ and 35‰ after 96 h. It is concluded that changein salinity can trigger disease outbreaks by affecting the defense mechanism of the host: the susceptibility of P. monodonto P. damselae subsp. damselae is enhanced by change in low salinity (5‰ and 15‰), and high salinity (35‰).In decapod crustaceans, circulating haemocytes can be affected by extrinsic factors such as temperature, pH, salinity,dissolved oxygen and ammonia [28e30]. Saˆo Paulo shrimp Farfantepenaeus paulensis reared at 34‰had a significantlyhigher THC (20% more) as compared to the shrimp reared at 22‰and 13‰[29]. The THC of L. vannameidecreased by 21% and 49% for the shrimp transferred to 15‰ and 5‰, respectively, from 25‰ in 12 h [27]. Similarobservations were made in the present study: both THC and DHC of P. monodon decreased significantly in the shrimptransferred to 15‰and 5‰, respectively, from 25‰in 12 h. Further research is needed to clarify whether the changein THC results from proliferation of the cells, or movement of cells from tissues into circulation [31], or osmosis of thewater between haemolymph and medium for osmotic regulation.Prophenoloxidase activity increased directly with salinity for the yellowleg shrimp Farfantepenaeus californiensisreared in salinity levels of 28‰, 32‰, 36‰, 40‰and 44‰[32], for the white shrimp L. vannamei reared in salinity levels of 5‰, 15‰, 25‰and 35‰[27], and for the tiger shrimp P. monodon reared in salinity levels of 5‰, 15‰and25‰ in the present study. Both phenoloxidase activity and respiratory burst are well correlated with the number of THC for white shrimp L. vannamei in the range of 5‰e35‰ [27]. In the present study, both phenoloxidase activity and respiratory burst are also well correlated with THC and DHC for the tiger shrimp P. monodon in the range of 5‰e35‰. This fact indicated that decrease of phenoloxidase activity is a consequence of decreases in THC, semi-granular cells and granular cells [29].

Total haemocyte count (×105 ml

Gambar. 3. haemocyte Total (THC) (A) dan aktivitas phenoloxidase (B) dari P. monodon disimpan pada salinitas 25 ‰ di awal, dan setelah 12,24, 48 dan 96 transfer jam sampai 5 ‰, 15 ‰, 25 ‰ dan 35 ‰. Setiap bar merupakan nilai rata-rata dari delapan udang dengan kesalahan standar. Lihat Gambar. 2 untukstatistik informasi.

Sehubungan dengan host sendiri, dilaporkan bahwa udang putih L. vannamei lebih rentan terhadap V. alginolyticus saat hewan tersebut dipindahkan ke salinitas 5 ‰ dan 15 ‰ dari 25 ‰ dalam 24 jam [27]. Dalam studi ini, kami menemukan fenomena yang sama: P. monodon lebih rentan terhadap P. damselae subsp. damselae ketika dipindahkan dari salinitas 25 ‰ ke 5 ‰ dan 15 ‰ setelah 24 jam, dan untuk 5 ‰, 15 ‰ dan 35 ‰ setelah 96 jam. Dengan demikian disimpulkan bahwa perubahan dalam salinitas bisa memicu wabah penyakit dengan

mempengaruhi mekanisme pertahanan host: kerentanan P. monodon untuk P. damselae subsp. damselae ditingkatkan oleh perubahan salinitas rendah (5 ‰ dan 15 ‰), dan salinitas tinggi (35 ‰).

Pada krustasea berkaki sepuluh, sirkulasi hemosit dapat dipengaruhi oleh faktor ekstrinsik seperti suhu, pH, salinitas, oksigen terlarut, dan amonia [28-30]. Udang Sao Paulo Farfantepenaeus paulensis disimpan di salinitas 34 ‰ memiliki THC yang lebih tinggi secara signifikan (20% lebih) dibandingkan dengan udang dipelihara di 22 ‰ dan 13 ‰ [29]. THC L. vannamei masing-masing menurun sebesar 21% dan 49% untuk udang yang dipindahkan ke salinitas 15 ‰ dan 5 ‰, dari 25 ‰ di 12 jam [27]. Pengamatan serupa dilakukan dalam penelitian ini: baik THC dan DHC P. monodon masing-masing mengalami penurunan secara signifikan dalam udang yang dipindahkan ke 15 ‰ dan 5 ‰ dari 25 ‰ dalam 12 jam. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengklarifikasi apakah perubahan hasil THC karena pengaruh dari proliferasi sel-sel, gerakan sel dari jaringan ke dalam sirkulasi [31], atau osmosis air antara hemolimf dan media untuk regulasi osmotik.

Aktivitas Prophenoloxidase meningkat seiring dengan salinitas untuk udang kaki kuning Farfantepenaeus californiensis yang dipelihara di tingkat salinitas sebesar 28 ‰, 32 ‰, 36 ‰, 40 ‰ dan 44 ‰ [32], untuk udang putih vannamei L. dipelihara dalam tingkat salinitas 5 ‰, 15 ‰, 25 ‰ dan 35 ‰ [27], dan untuk udang windu P. monodon yang dipelihara di tingkat salinitas dari 5 ‰, 15 ‰ dan 25 ‰ dalam penelitian ini. Kedua kegiatan phenoloxidase dan ledakan pernapasan (respiratory burst) berkorelasi baik dengan jumlah THC untuk udang putih L. vannamei dalam kisaran 5 ‰ – 35 ‰ [27]. Dalam penelitian ini, kedua aktivitas phenoloxidasedan ledakan pernapasan (respiratory burst)juga berkorelasi baik dengan THC dan DHC untuk udang windu P. monodon dalam kisaran 5 ‰ – 35 ‰. Kenyataan ini menunjukkan bahwa penurunan aktivitas phenoloksidase merupakan konsekuensi dari penurunan THC, sel semi-granular dan sel granular [29].

Total hemosit count (× 105 mlFig. 4. Respiratory burst (A) and superoxide dismutase (SOD) activity (B) in the haemocytes of P. monodon kept at a salinity of 25‰ at thebeginning, and after 12, 24, 48 and 96 h transfer to 5‰, 15‰, 25‰and 35‰. Each bar represents the mean value from eight shrimp with standarderror. See Fig. 2 for statistical information.

Gambar. 4. Respiratory burst (A) dan superoksida dismutase (SOD) aktivitas (B) di hemosit P. monodon disimpan pada salinitas 25 ‰ diawal, dan setelah 12, 24, 48 dan 96 transfer jam sampai 5 ‰, 15 ‰, 25 ‰ dan 35 ‰. Setiap bar merupakan nilai rata-rata dari delapan udang dengan standarkesalahan. Lihat Gambar. 2 untuk informasi statistik.

White shrimp L. vannamei when transferred to 5‰ and 15‰ after 24 h decreased the release of superoxide anionand SOD activity, as compared to the shrimp reared in 25‰ and 35‰ [28]. In the present study, we found that tigershrimp P. monodon when transferred to 5‰, 15‰ and 35‰ decreased the release of superoxide anion and SOD activityafter 12 h, as compared to the shrimp reared in 25‰. This fact suggested that the activity of NADPH oxidaseresponsible for the release of superoxide anion decreased together with a decrease in the activity of superoxide dismutase

(SOD) responsible for scavenging superoxide anion. Further research is needed to examine the activities ofcatalase and peroxidase [33] for P. monodon transferred to different salinity levels.Phagocytosis can be affected by environmental parameters in invertebrates [7]. For example, the phagocytic activityand clearance efficiency of Macrobrachium rosenbergii against the pathogen Lactococcus garvieae were significantlylower in freshwater than those in 5‰ and 15‰ [34]. The phagocytic activity and clearance efficiency of V.alginolyticus decreased for L. vannamei transferred to 5‰ and 15‰ from 25‰ in 12 h [28]. In the present study,it was found that the phagocytic activity and clearance efficiency of P. damselae subsp. damselae decreased forthe P. monodon transferred to 5‰, 15‰ and 35‰ from 25‰ in 96 h. This correlated with increased susceptibilityof P. monodon to P. damselae subsp. damselae when the shrimp were transferred to 5‰, 15‰ and 35‰ from

Udang putih L. vannamei saat dipindahkan ke salinitas 5 ‰ dan 15 ‰ setelah 24 jam menurunkan pelepasan anion superoksida dan aktivitas SOD, dibandingkan dengan udang dipelihara di 25 ‰ dan 35 ‰ [28]. Dalam studi ini, kami menemukan udang windu P. monodon saat dipindahkan ke salinitas 5 ‰, 15 ‰ dan 35 ‰ menurunkan pelepasan anion superoksida dan aktivitas SOD setelah 12 jam, dibandingkan dengan udang dipelihara dalam 25 ‰. Fakta ini menunjukkan bahwa aktivitas oksidase NADPHbertanggung jawab atas pelepasan anion superoksida yang menurun bersama-sama dengan penurunan aktivitas superoxide dismutase (SOD) bertanggung jawab untuk pengerukan anion superoksida. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menguji aktivitas katalase dan peroksidase [33] untuk P. monodon yang dipindahkan ke tingkat salinitas yang berbeda.

Fagositosis dapat dipengaruhi oleh parameter lingkungan invertebrata [7]. Sebagai contoh, aktivitas fagositosis dan efisiensi clearance Macrobrachium rosenbergii terhadap patogen Lactococcus garvieae secara signifikan lebih rendah di air tawar daripada di salinitas 5 ‰ dan 15 ‰ [34]. Kegiatan fagositik dan efisiensi clearance V. alginolyticus menurun untuk L. vannamei yang dipindahkan ke salinitas 5 ‰ dan 15 ‰ dari 25 ‰ di 12 jam [28]. Dalam studi ini,ditemukan bahwa aktivitas fagositosis dan efisiensi pembersihan P. damselae subsp. damselae menurun untuk P. monodon yang dipindahkan ke 5 ‰, 15 ‰ dan 35 ‰ dari 25 ‰ di 96 jam. Hal ini berkorelasi dengan peningkatan kerentanan P. monodon terhadap P. damselae subsp. damselae ketika udang telah dipindahkan ke 5 ‰, 15 ‰ dan 35 ‰ dari 25 ‰ di 96 jam. Fakta ini juga menunjukkan bahwa budidaya P. monodon pada tingkat salinitas iso-osmotik menunjukkan ketahanan yang lebih tinggi terhadap infeksi patogen dengan meningkatkan kemampuan kekebalan tubuh.

Fig. 5. Phagocytic activity (A) and clearance efficiency (B) in the haemocytes of P. monodon against P. damselae subsp. damselae kept at a salinityof 25‰ at the beginning, and after 12, 24, 48 and 96 h transfer to different salinity levels. Each bar represents the mean value from eightshrimp with standard error. See Fig. 2 for statistical information.

Gambar. 5. Fagositosis aktivitas (A) dan efisiensi klirens (B) di hemosit P. monodon terhadap subsp damselae P.. damselae disimpan di sebuah salinitas

dari 25 ‰ di awal, dan setelah 12, 24, 48 dan 96 transfer h ke tingkat salinitas yang berbeda. Setiap bar merupakan nilai rata-rata dari delapanudang dengan kesalahan standar. Lihat Gambar. 2 untuk informasi statistik.25‰ in 96 h. This fact also indicated that P. monodon cultured at an iso-osmotic salinity level exhibited higher resistanceagainst pathogen infection by increasing its immune ability.In conclusion, the present study documented that concentration of NaCl at 2.5% significantly increased the growthrate of P. damselae subsp. damselae, and an addition of 2.5% NaCl in TSB medium resulted in an increased virulenceof P. damselae subsp. damselae to P. monodon. The susceptibility of P. monodon to P. damselae subsp. damselaecorrelated with reductions in immune parameters including THC, HC, phenoloxidase activity, SOD activity, phagocyticactivity and clearance efficiency when shrimp were transferred from 25‰ to low salinity (5‰ and 15‰) andhigh salinity (35‰).AcknowledgementsThis research was supported by grants from the National Science Council (NSC 93-2313-B-019-013 and NSC 93-2815-C-019-016-B), ROC. We thank Mr. S.T. Yeh and Miss Y. W. Fu for their assistances in the experiment.References

Sebagai kesimpulan, penelitian ini mencatat bahwa konsentrasi NaCl sebesar 2,5% meningkatkan secara signifikan tingkat pertumbuhan P. damselae subsp. damselae, dan penambahan NaCl 2,5% pada medium TSB mengakibatkan peningkatan virulensi dari P. damselae subsp. damselae terhadap P. monodon. Kerentanan P. monodon terhadap P. damselae subsp. damselae berkorelasi dengan penurunan parameter kekebalan termasuk THC, HC, aktivitas phenoloxidase, aktivitas SOD, aktivitas fagositosis, dan efisiensi clearance ketika udang dipindahkan dari salinitas 25 ‰ ke salinitas rendah (5 ‰ dan 15 ‰) dan salinitas tinggi (35 ‰).

Ucapan Terima Kasih

Penelitian ini didukung oleh dana dari National Science Council (NSC 93-2313-B-019-013 dan NSC 93-2815-C-019-016-B), ROC. Kami berterima kasih kepada Mr S.T. Yeh dan Miss Y. W. Fu untuk bantuan mereka dalam percobaan.

Referensi