Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol (1982) 219:298-300 Graefe's Archive for ClinicaP and Experimental

Ophthalmology © Springer-Verlag 1982

Ein Beitrag zur Darstellung der okuliiren Blut/Gewebe- und Blut/Fliissigkeitsschranken* H. Baurmann und G. Chioralia Univ.-Augenklinik Bonn, Sigmund-Freud-Str. 25, D-5300 Bonn, Bundesrepublik Deutschland

Studies on the Representation of the Ocular Blood]Tissue and Blood]Fluid Barriers

Abstract. In addition to previous fluorescence-microscopic investigations on ocular barriers, quantitative fluorescence- photometric measurements on the eye tissues of albinotic rats were performed. The eyes were enucleated 5-30 min after intravenous injection, and tissue samples were compa- red with analogous eye tissues of untreated animals. The results were (I) different increases of measured data in the region of endothelium and stroma of the cornea, of vessels and stroma of the ciliary body and iris, of choroid and choriocapillaris, as well as of pigment epithelium and retina vessels; (II) no increase of the photometer values was obser- ved in the epithelium of the cornea and in all other external and internal layers of the retina. It is to be assumed that in contrast to the tissues and vessels mentioned in (I), no measurable amounts of fluorescein have penetrated into the retina layers mentioned in (II). Although the fluorescence- photometric method may not be absolutely conclusive, it could be established that measurements are more exact than the qualitative method performed by fluorescence-micros- copic observation.

Zusammenfassung. In Erg/inzung zu frfiheren fluoreszenz- mikroskopischen Untersuchungen okul/irer Barrieren wur- den an Augengeweben albinotischer Ratten quantitative, fluoreszenzphotometrische Messungen vorgenommen. Ge- webeproben yon 5 und 30 Minuten nach intraven6ser Fluo- resceininjektion enukleierten Augen wurden verglichen mit analogen Augengeweben von nicht mit Fluorescein vorbe- handelten Tieren. Es ergaben sich (I) unterschiedlich anstei- gende Mel3werte in den Bereichen von Endothel und Stroma der Cornea, von Gef/il3en und Stroma des Corpus ciliare und der Iris, von Chorioidea und Choriocapillaris sowie yon Pigmentepithel und Geffi6en der Retina; (II) kein Anstieg der Photometerwerte im Epithel der Cornea und in den/ibrigen/iul3eren und inneren Schichten der Retina. Es wird gefolgert, dab in diese Gewebe, im Gegensatz zu denen der Gruppe (I), keine mel3baren Mengen an Fluores- cein fibertreten. Wir glauben, dab die fluoreszenz-photome- trische Methode zwar keine absolute Beweiskraft besitzt, dab sie jedoch exakter ist als die qualitative fluoreszenz- mikroskopische Objektbetrachtung.

* Untersuchungen mit freundlicher Unterstfitzung der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Ba 480)

Einleitung

Da die qualitativen Resultate hinsichtlich der okul/iren Bar- rieren - Blut/Gewebe- und Blut/Kammerwasser-Schranken - in der Literatur erheblich differieren, versuchen wir, eine quantitative Verifizierung durch die fluoreszenzmikroskopi- sche Photometrie zu erzielen, indem wit ein, am Fluores- zenzmikroskop adaptiertes Photometer verwenden.

Untersuchungsmaterial und Methodik

Bei albinotischen Ratten wurden, wie friiher berichtet (Baur- mann u.Mitarb. 1977), in Ketanest-Allgemeinan/isthesie (Ketamin hydrochlorid 10 mg/kg i.m.), Fluorescein-Na- trium, 7 mg/kg, intraven6s appliziert; 5 min und 30 rain nach der Farbstoffinjektion in die V. jugularis wurden die Augen jeweils enukleiert. Ffir die fluoreszenzmikroskopi- sche Untersuchung wurden diese Augen in flfissigem Stick- stoff tiefgefroren ( - 1 9 5 ° C ) und anschliel3end in einer Pearse Gefriertrockenanlage (Speedivac Pearse Tissue Dryer, Model 1) lyophilisiert. Entsprechend den Empfeh- lungen von Chioralia (1977) geschah nachfolgend die Auf- arbeitung zu mikroskopischen Schnitten von 10 g Dicke. Ffir die Betrachtung und Photodokumentation diente uns das Fluoreszenzphotomikroskop Orthoplan yon Leitz, an das ein Photometer MBV Compact von Leitz angeschlossen wurde, mit dem wir die hier zu besprechenden Messungen durchffihrten. Aus jeweils 10 Messungen an den interessie- renden Geweben wurde der Mittelwert errechnet. Zum Ver- gleich wurden analoge Messungen an Augen von Kontroll- tieren durchgeffihrt, die nicht mit Fluorescein beschickt worden waren. Bei diesen wie bei den mit Fluorescein be- handelten Augen wurde Paraplast als Bezugskontrolle ge- w/ihlt, was einem Referenzwert gleichkommt.

Ergebnisse

Im einzelnen ergeben sich die in Tabelle 1 zusammengestell- ten Resultate: Aus der Tabelle 1 sind folgende Befunde ersichtlich:

1. Cornea: Gegenfiber den Kontrolltierwerten (A) zeigen beim Epithel die 5 min- und 30 min-Werte keine erfassbare Verfinderung. Das Stroma weist gegenfiber dem Kontroll- wert 11,0 einen deutlichen Anstieg fiber 5 nach 30 rain auf. Beim Endothel findet ein steiler Anstieg (5 min), gefolgt yon einem Wiederabfall zur 30. min hin, statt. Dies Verhalten

0721-832X/82/0219/0298/$01.00

Tabelle 1. Mittelwerte aus je 10 fluoreszenz-photometrischen Meg- daten an Augen

MeBbereiche Mittlere Mel3daten

A B Gewebe Gewebe ohne mit Fluorescein Fluorescein (Kontroll- 5 rain 30 rain tiere) nach nach

Injektion Injektion

Cornea Epithel 5,1 5,6 5,9 Stroma 4,8 8,4 11,0 Endothel 11,0 80,0 42,2

Iris Stroma 11,2 12,0 15,5 Gef/il3e 5,6 74,0 35,0

Corpus ciliate Stroma 12,0 35,0 28,0 Geffil3e 5,9 t 10,0 70,0

Retina Gef/i/3e 5,8 80,0 50,0 inhere plexiforme Schicht 24,0 24,0 24,5 innere Ganglienzellschicht t 1,0 11,0 11,5 fiul3ere plexiforme Schicht 21,5 21,5 21,8 fiul3ere Ganglienzellschicht 16,0 16,0 16,5 Photorezeptoren 38,0 38,0 38,5 Pigmentepithel 21,0 27,0 29,0

Chorioidea Choriocapillaris 18,0 78,0 37,0 Geffige 6,0 75,0 40,0 Stroma 9,7 49,0 37,0

Sklera

Gewebe 7,2 55,0 39,0

Paraplast (Referenz) 2,6 2,6 2,9

A unvorbehandelter Ratten (Kontrolltiere ohne Fluorescein); B mit Fluorescein-Na 5 und 30 min nach Farbstoffinjektion

dfirfte mit dem Fluoresceingehalt des Kammerwassers zu- sammenhfingen.

2. Iris: Das Stroma zeigt nur ein geringes Ansteigen der Mel3daten yon 11,2 Einheiten ohne Fluorescein auf 12,0 Einheiten 5 min und 15,5 Einheiten nach 30 rain Farbstoff- einwirkung. Die GefiiJ3e zeigen dagegen einen starken An- stieg yon 7,4 Einheiten auf 74,0 5 rnin nach Fluorescein, gefolgt von einer Reduktion auf etwa den halben Wert bei 30 rain. Beim

3. Corpus ciliare erkennt man im Vergleich zur Iris insge- samt eine stfirkere Zunahme der MeBwerte im Stroma: Es erfolgt ein Anstieg von 12,0 auf 35,0 bei den Proben 5 rain mit nachfolgendem Abfall auf 28,0 bei 30 rain, w/ihrend bei den GefiiJ3en vom mittleren Ausgangswert 5,9 ein An-

299

stieg auf 110 Einheiten in der 5. und ein Wiederabfall auf 70,0 in der 30. min zu beobachten sind.

4. Die Retina zeigt im Bereich der Geffige gegenfiber den Kontrollwerten (5,8) einen steilen Anstieg zur 5. min auf 80 Einheiten mit Wiederabfall auf 50 Einheiten zur 30. min. Das Pigmentepithel weist gegenfiber dem Kontrollwert 21,0 einen m/iBigen Anstieg der Werte fiber 27,0 bei 5 min auf 29,0 bei 30 min auf. Alle fibrigen Retinaschichten verhalten sich nach Fluoresceininjektion gleichmfil3ig indifferent, ver- glichen mit dem Kontrollwert.

5. Die Chorioidea lfil3t im Bereich von Choriokapillaris und chorioidaIen Gefiiflen einen, der Erwartung gem/il3en An- stieg der Mel3werte 5 min nach Fluoresceininjektion und einen nachfolgenden Abfall zur 30. min erkennen. Ein/ihn- liches Verhalten zeigt auch das Stroma, wobei der Anstieg auf vergleichsweise niedrigere Werte erfolgt.

6. Die SkIera verh/ilt sich/ihnlich wie die Chorioidea: Der Anstieg der photometrischen Werte erfolgt deutlich zur 5. rain hin und geht fiber in einen Abfall zur 30. rain hin.

Diskussion

Die vorliegenden photometrischen Untersuchungen erfolg- ten mit dem Zweck der Erg/inzung der literarischen (diffe- rierenden) Aussagen hinsichtlich der Frage, ob das intrave- n6s injiziert Fluorescein vom Irisstroma und vom Retinage- webe aufgenommen werde oder nicht. Insbesondere in be- zug auf die Retina bestehen Meinungsverschiedenheiten, die in Relation zu der, beim Menschen routinemfifSig angewen- deten und von gewissen Nebenwirkungen begleiteten Fluo- resceinangiographie des Augenhintergrundes und des Au- genvorderabschnittes eine gewisse Bedeutung haben k6n- nen. Vor allem Grayson u. Laties (1971) und Grayson et al. (1972/74) konnten an Affen und Kaninchen keinen/£1ber- tritt yon Fluorescein aus der Choriocapillaris fiber das Pig- mentepithel in die Sinneszellschicht der Retina beobachten. Demgegenfiber glaubte einer von uns (Baurmann 1971) bei Albinoratten nach Injektion einer normalen Dosis (7 mg/ kg) yon Fluorescein einen beschr~inkten Fluoresceinfiber- tritt ins Pigmentepithel und yon hier in die retinale Sinnes- epithelschicht und weitere innere Netzhautschichten sowie aus Netzhautgef/iBen in deren Umgebung festzustellen. Da- bei wurde die Diffusion der im Blut ungebunden bleibenden Fraktion (etwa 20%) des Fluorescein-Na vermutet. Diese Meinung erfuhr Unterstfitzung durch die Ergebnisse ande- rer Autoren (Tsukahara u. Ota 1971), die an Albinokanin- chert bei kurzen Zeiten nach Fluoresceininjektion kein, eine Stunde nach Injektion jedoch Farbstoff in der Retina und im angrenzenden Glask6rper beobachteten; ferner durch Resultate von Mizuno u.Mitarb. (1971, 1972/74) und Sasaki u.Mitarb. (1972, 1973), die mit Albino Ratten, Rhesusaffen, pigmentierten Kaninchen und Katzen arbeiteten und bei ,,Uberdosierung °' (10 bis 100 mg/kg) des Fluoresceins deut- liche Farbstofffibertritte vonde r Choriocapillaris fiber das Pigmentepithel in die retinale Sinnesepithelschicht erkann- ten. Baurmann fand bei weiteren Untersuchungsserien die 1971 publizierten Diffusionsverh/iltnisse nicht mehr sicher reproduzierbar und zeigte m6gliche Wege des Fluoresceins im Bereich des hinteren Augenabschnittes auf (1972/74). Die Technik der Aufbereitung der Gewebe ffir die Fluores- zenzmikroskopie wurde von Chioralia (1977) erheblich ver- bessert. Cunha-Vaz (1976, 1978) gab zusammenfassende

300

Darstellungen fiber das Barrierenproblem im Auge. Obwohl er die, eine m6gliche Farbstoffdiffusion im Retinabereich postulierenden Arbeiten im Gegensatz zu den, eine solche Diffusion negierenden Darstellungen fiberhaupt nicht be- rficksichtigte, wirft er die Frage auf, auf welche Weise denn die vaskul/iren Endothelzellen und die Pigmentepithelzellen irgend etwas transportieren k6nnten, was die Retina beu6- tigt, um ihre Funktion aufrecht zu erhalten. Die Diskussion fiber die Frage der Fluoresceiudiffusion ruhte seither; sie bleibt aber unseres Erachtens aktuell. Unsere, an dieser Stelle wiedergegebene Untersuchuugsergebnisse fluores- zenz-photometrischer Messungen k6nnen nicht den An- spruch auf Allgemeingfiltigkeit erheben; sie mfissen jedoch sicherlich gebfihrend berficksichtigt werden, unabh/ingig yon vorausgegangenen Aussagen. F/Jr die mitgeteilten Untersuchungen w~ihlten wit im Interesse einer kontrastrei- chen Darstelluug zwei relativ weir auseinanderliegende Beo- bachtungszeiten vou 5 und 30 miu nach Fluoresceininjek- tion.

Die erste Beobachtungszeit von 5 min nach Farbstoff liegt schon im relativ welt fortgeschrittenen Ablauf der Kontrastffillung, was den Vorteil hat, dab eventuelle, lang- sam ablaufende Diffusionsvorg/inge und Farbstoffanreiche- rungen in Geweben erfal3t werden k6nnen. Die hervorste- chenden Ergebnisse sind (a) im Bereich des Iristromas das /iul3erst geringe, wenn/iberhaupt verwertbare Ansteigen des ,,Titers" von 11,2 Einheiten ohne Fluoresceineinwirkung auf 12,0 nach 5 rain und 15,5 Einheiten nach 30 rain Fluo- resceinzirkulation; (b) das Fehlen eines Mel3werteanstieges in allen retinalen Schichten bis auf die der Netzhautgefdfle (Anstieg von 5,8 auf 80 Einheiten) sowie des Pigmentepi- thels von 21 auf 29 Einheiten (30 rain). Diesen Ergebnissen zufolge treffen unsere Vorstellungen fiber die Diffusionsvor- g~inge zwischen Chorioidea bzw. Choriocapillaris und/iul3e- ren Netzhautschichten sowie retinalen Kapillaren und inne-

ren Netzhautschichten ffir das Fluorescein-Natrium in ,,normaler" Dosis nicht zu.

Literatur

Baurmann, H. (•97•) Grundlagen der Fluoreszenzangiographie des Augenhintergrundes. Adv. Ophthalm. 24:205-268

Baurmann, H. (1974) Fluorescein microscopy of eye tissue : Success and failure. Proc. ISFA, Tokyo, •972, Igaku Shoin, Tokyo, pp. 226- 229

Chioralia, G. (•977) Ophthalmo-fluoreszenzmikroskopische Tech- uik im Tierexperiment. Inaugural Diss. Bonn

Cunha-Vaz, J.G. (•976) The blood retinal barrier. Doc. Ophthalm. 4:287-327

Cunha-Vaz, J.G. (1978) The blood ocular barriers. Invest. Oph- thalm. 17:1037-1039

Grayson, M., Tsukahara, S., Laties, A.M. (•974) Tissue localiza- tion in rabbit and monkey eye of intravenously administrated fluorescein. Proc. ISFA, Tokyo, 1972, Igaku Shoin, Tokyo, pp. 235-246

Mizuno, K., Sasaki, K., Ohtsuki, K. (•974) Histochemical identifi- cation of fluorescein in ocular tissue. Proc. ISFA, Tokyo, 1972, Igaku Shoin, Tokyo, pp. 221~25

Sasaki, K., Ohtsuki, K., Mizuno, K. (•972) Histochemical identifi- cation of fluorescein sodium in normal and pathological retina. Acta Soc. Ophthalm. Jap. 76:108%1102

Sasaki, K., Ohtsuki, K., Mizuno, K. (1973) Histochemical identifi- cation of fluorescein sodium in normal retina Jap. J. Ophthalm. 17:323-334

Tsukahara, I., Ota, M. (1971) Histologic study on the location of sodium fluorescein in the fundus. Jap. J. Ophthalm. 15:125-131

Tsukahara, I., Ota, M. (1974) Angiographic-histologie study on the location of sodium fluorescein in the fundus. Proc. ISFA, Tokyo, 1972, Igaku Shoin, Tokyo, pp. 230-234

Eingegangeu am 7. Oktober 1982