View
230
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 2/21
Betode dalam penelitian dengan #erdasarkan @ Ikatan spesifik antara antigen )Ag* C
antibody)Ab* terdiri dari @
$. 1eknik ualitatif @ 1iap berikatan pada Ag spesifik
. 1eknik uantitatif @ <umlah Ikatan Ag-Ab ditentukan dengan nilai absorbansi.
Ma'am $i$tem metode an diuna#an da"am e"i$a )- Dire+t
- Indire+t
- Sand"i+h
- apture
ME*+E PEMERIKSAAN ELISA
ELISA diperkenalkan pada tahun $%=$ oleh 6eter 6erlmann dan Eva Engvall untuk
menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan
menggunakan en(im sebagai pelapor. telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang
medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana,
sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi
spesifik di+u+ikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya.
Antibodi ini terikat dengan suatu en(im, dan pada tahap terakhir, ditambahkan
substansi yang dapat diubah oleh en(im menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA
fluoresensi, saat +ahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel,
kompleks antigen?antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat
disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.6enggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk
antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu
permukaan solid )biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene*, baik yang non-spesifik
)melalui penyerapan pada permukaan* atau spesifik )melalui penangkapan oleh antibodi lain
yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut Fsandwich’ ELISA*. Setelah antigen
diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen.
Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan en(im, atau dapat dideteksi se+ara
langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan en(im melalui biokonjugasi. Di
antara tiap tahap, plate harus di+u+i dengan larutan deterjen lembut untuk membuang
kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pen+u+ian terakhir, dalam
plate ditambahkan substrat en(imatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yangmenunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. 1eknik ELISA yang lama menggunakan
substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik
yang jauh lebih sensitive.
Prin$i- metode ELISAmereaksikan antibodi dan antigen se+ara spesifik, perbedaannya ada pada substrat
) (at yang digunakan untuk mendeteksi suatu hasil reaksi * yang digunakan. 6ada ELISA,
hasil reaksi akan memun+ulkan "arna yang bisa diukur dengan alat yang disebut olorimetri.
6ada Gluores+en+e, hasil reaksi berupa pendaran +ahaya yang terba+a oleh fluoresensi,
sedangkan pada hemilumines+en+e hasil reaksi berupa pendaran kimia"i yang terba+a olehhemilumines+ent.
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 3/21
Jeni$ Pemeri#$aan ELISA
Langkah-langkah Htidak langsungH ELISA mengikuti mekanisme di ba"ah ini@ -
• Sebuah solusi buffer dari antigen yang akan diuji untuk ditambahkan ke setiap sumur
dari lempeng mikro , di mana ia diberi "aktu untuk mematuhi plastik melalui
interaksi biaya.
• Sebuah solusi non-protein bereaksi, seperti bovine serum albumin atau kasein ,
ditambahkan untuk memblokir setiap permukaan plastik di sumur yang masih dilapisi
oleh antigen.
• Selanjutnya antibodi primer ditambahkan, yang mengikat se+ara khusus terhadap
antigen lapisan tes yang baik. Antibodi primer ini juga bisa dalam serum donor akandiuji untuk reaktivitas terhadap antigen.
• Setelah itu, sebuah antibodi sekunder yang ditambahkan, yang akan mengikat antibodi
primer.. Antibodi sekunder ini sering memiliki en(im yang melekat padanya, yang
memiliki efek yang dapat diabaikan pada sifat pengikatan antibodi.
• Sebuah substrat untuk en(im ini kemudian ditambahkan. Seringkali, perubahan "arna
substrat ini pada reaksi dengan en(im. 6erubahan "arna menunjukkan bah"a
antibodi sekunder telah terikat antibodi primer, yang sangat menyiratkan bah"a donor
memiliki reaksi kekebalan terhadap antigen uji. al ini dapat membantu dalam pengaturan klinis, dan dalam D.
• Semakin tinggi konsentrasi antibodi primer yang hadir dalam serum, semakin kuat
perubahan "arna. Seringkali spektrometer digunakan untuk memberikan nilai
kuantitatif untuk kekuatan "arna.
En(im bertindak sebagai penguat, bahkan jika hanya sedikit en(yme-linked tetap terikat
antibodi, molekul en(im akan menghasilkan banyak molekul sinyal. Dalam keterbatasan akal
sehat, en(im dapat terus menghasilkan "arna tanpa batas "aktu, tetapi yang lebih utama
antibodi hadir dalam serum antibodi donor lebih sekunder J en(im akan mengikat, dan "arna
lebih +epat akan berkembang.. 0elemahan utama dari ELISA tidak langsung adalah bah"ametode imobilisasi antigen non-spesifik, ketika serum digunakan sebagai sumber antigen tes,
semua protein dalam sampel bisa tetap berpegang pada pelat mikro dengan baik, konsentrasi
begitu ke+il analit dalam serum harus bersaing dengan protein serum lainnya ketika mengikat
ke permukaan baik. Sand"i+h atau langsung ELISA memberikan solusi untuk masalah ini,
dengan menggunakan HmenangkapH antibodi spesifik untuk antigen tes untuk menariknya
keluar dari +ampuran molekul serum itu.
ELISA dapat dijalankan dalam format kualitatif atau kuantitatif. asil kualitatif
memberikan hasil positif atau negatif sederhana )ya atau tidak* untuk sampel. utoff antara
positif dan negatif ditentukan oleh analis dan mungkin statistik. Dua atau tiga kali standar
deviasi )kesalahan yang melekat dalam tes* sering digunakan untuk membedakan positif dari
sampel negatif. Dalam kuantitatif ELISA, densitas optik )KD* dari sampel dibandingkandengan kurva standar, yang biasanya pengen+eran serial solusi dikenal-konsentrasi dari
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 4/21
molekul target. Sebagai +ontoh, jika sebuah sampel uji mengembalikan KD $,', titik pada
kurva standar yang memberi KD $,' harus dari konsentrasi analit yang sama sebagai
sampel Anda.
7ambar untuk hak tersebut termasuk penggunaan antibodi sekunder terkonjugasi untuk
en(im, meskipun, dalam arti teknis, hal ini tidak diperlukan jika antibodi primer adalah
konjugasi en(im. 5amun, penggunaan konjugasi antibodi sekunder-menghindari proses yangmahal untuk men+iptakan en(im-linked antibodi untuk setiap antigen yang satu mungkin
ingin mendeteksi. Dengan menggunakan antibodi en(yme-linked yang mengikat "ilayah G+
dari antibodi lain, antibodi ini en(yme-linked yang sama dapat digunakan dalam berbagai
situasi. 1anpa lapisan pertama antibodi HmenangkapH, setiap protein dalam sampel )termasuk
protein serum* dapat menyerap kompetitif ke permukaan piring, menurunkan jumlah antigen
amobil. 6enggunaan antibodi spesifik dimurnikan untuk melampirkan antigen ke plastik
menghilangkan kebutuhan untuk memurnikan antigen dari +ampuran yang rumit sebelum
pengukuran, menyederhanakan uji, dan meningkatkan spesifisitas dan sensitivitas pengujian
tersebut.
A.*AR P/S*AKA
•
• http@??moko2$."ordpress.+om?'$$?'&?M?tinjauan-tentang-elisa?
• @ http@??id.shvoong.+om?eNa+t-s+ien+es?bioengineering-and-biote+hnology?$$2M-metode-
elisa-en(ym-linked-immunosorbent?OiN(($dla%NpP
http://retha-ithu.blogspot.co.id/2012/06/pemeriksaan-elisa.html
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 5/21
• Skip to navigation
• Skip to main content
• Skip to primary sidebar
• Skip to secondary sidebar
• Skip to footer
Moko Aptenebar !lmu "engetahuan
• #ome
• $%&
• S!'( %"
• )*+(,S )
• (-))
• )3,+%
•
!+
• %%%# S*%
4 "enghambatan %ngiogenesis
ife ong earner 5
Tinjauan tentang ELISA<un M
6osted by admin
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 6/21
1 7otes
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay )ELISA* adalah suatu teknik biokimia yang terutama
digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam
suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologitumbuhan, dan juga berbagai bidang industri.
6enggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen
tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu
permukaan solid )biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene*, baik yang non-spesifik
)melalui penyerapan pada permukaan* atau spesifik )melalui penangkapan oleh antibodi lain
yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut F sandwich’ ELISA*.
Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks
dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan en(im, atau dapat dideteksi
se+ara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan en(im melalui biokonjugasi.
Di antara tiap tahap, plate harus di+u+i dengan larutan deterjen lembut untuk membuang
kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pen+u+ian terakhir, dalam
plate ditambahkan substrat en(imatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang
menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. 1eknik ELISA yang lama menggunakan
substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik
yang jauh lebih sensitif.
A-"i#a$i ELISA
ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, karenanya
merupakan metode yang sangat berguna untuk menentukan konsentrasi antibodi dalam
serum )seperti dalam tes I/*, dan juga untuk mendeteksi adanya antigen. Betode ini juga
bisa diaplikasikan dalam indiustri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam
makanan seperti susu, ka+ang, "alnut, almond, dan telur. ELISA juga dapat digunakan
dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan +epat pada berbagai kelas obat.
e%era-a *i-e ELISA
A. Indirect ELISA
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 7/21
1ahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk menentukan #on$entra$i anti%odi
dalam serum adalah@
$. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada
permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik
dengan +ara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan
kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel
yang akan diuji.
. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting , seperti bovine serum albumin )#SA* atau
kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. 1ahap ini dikenal sebagai
blocking , karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.
2. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari
antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakanuntuk antigen standar. 0arena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-
spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.
. Plate di+u+i, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan
dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan
lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.
4. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan
dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi en(im dengan substrat
spesifik. 1ahap ini bisa dile"ati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan en(im.
&. Plate di+u+i untuk membuang kelebihan konjugat en(im-antibodi yang tidak terikat.
=. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh en(im untuk mendapatkan sinyal kromogenik?
fluorogenik? elektrokimia.
M. asil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik?
elektrokimia lainnya.
En(im bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat en(im yang
tetap terikat, molekul en(im akan memproduksi berbagai molekul sinyal. 0erugian utama
dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga
setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga
konsentrasi analit yang ke+il dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat
pengikatan pada permukaan lubang. Bekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada gambar di
ba"ah ini.
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 8/21
. Sandwich ELISA )untuk ujian besok pelajari yang ini saja*
1ahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut@
1. 8isiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi 9penangkap
2. Semua non spesik binding sites pada permukaan diblokir
;. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
<. %ntibodi primer ditambahkan= supaya berikatan secara spesik dengan
antigen
6. %ntibodi sekunder yang berikatan dengan en>im dimasukkan= yang akanberikatan dengan antibodi primer
?. Plate dicuci= sehingga kon@ugat antibodi-en>im yang tidak terikat dapatdibuang
A. 8itambahkan reagen yang dapat diubah oleh en>im men@adi sinyalberBarna/ berCuoresensi/ elektrokimia
D. 8iukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dariantigen
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 9/21
0euntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel
yang tidak murni, dan mampu mengikat se+ara selektif antigen yang dikehendaki. 1anpa
lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel )termasuk protein
serum* dapat diserap se+ara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas
antigen yang terimobilisasi. 6rinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikutini@
2. ELISA kompetitif
1ahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas
sebelumnya, yaitu@
1. %ntibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
2. omplek antigen-antibodi ini selan@utnya ditambahkan pada lubang yangtelah dilapisi antigen
;. Plate dicuci= sehingga kelebihan antibodi tercuci Esemakin banyak antigendalam sampel= semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigenyang menempel pada permukaan lubang= karena inilah disebut kompetisi
. 8itambahkan antibodi sekunder yang spesik utnuk antibodi primer.%ntibodi sekunder ini berpasangan dengan en>im
<. Substrat ditambahkan= en>im akan mengubah substrat men@adi sinyalkromogenik/ Cuoresensi.
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 10/21
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal
yang dihasilkan. 6rinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini@
Se+ara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikut@
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 11/21
Sekian dulu artikel tentang ELISA, sampai jumpa.
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 12/21
Sa%tu, 0 A-ri" 2012
*ES* ELISA
Sejarah ELISA
Sebelum pengembangan ELISA, satu-satunya pilihan untuk melakukan suatu
immunoassay adalah radioimmunoassay, teknik menggunakan antigen berlabel radioaktif
atau antibodi. Dalam radioimmunoassay, radioaktivitas memberikan sinyal, yang
menunjukkan apakah suatu antigen tertentu atau antibodi hadir dalam sampel.
adioimmunoassay pertama kali dijelaskan dalam kertas oleh osalyn Sussman !alo" dan
Salomo #erson diterbitkan pada tahun $%&'. Sebuah mikrobiologi menggunakan en(im suatu
Linked tes Assay )ELISA* immunosorbent, dalam rangka untuk mengembangkan metode
untuk deteksi +epat antigen p I/ dalam sampel darah.
0arena radioaktivitas menimbulkan an+aman kesehatan potensial, alternatif yang
lebih aman itu di+ari. Sebuah alternatif yang +o+ok untuk radioimmunoassay akan mengganti
sinyal non-radioaktif di tempat sinyal radioaktif. 0etika en(im )seperti peroksidase* bereaksi
dengan substrat yang sesuai )seperti A#1S atau 2,2 3, 4,43-tetramethylben(idine*, perubahan
"arna terjadi, yang digunakan sebagai sinyal. 5amun, sinyal tersebut harus dikaitkan dengan
keberadaan antibodi atau antigen, yang mengapa en(im harus dihubungkan dengan antibodi
yang sesuai. 6roses menghubungkan se+ara independen dikembangkan oleh Stratis Avrameas
dan 7# 6ier+e. 0arena itu perlu untuk menghilangkan antibodi atau antigen terikat dengan
men+u+i, antibodi atau antigen harus tetap ke permukaan "adah:. !aitu, immunosorbent telah
harus dipersiapkan. Sebuah teknik untuk men+apai hal ini diterbitkan oleh ;ide dan <erker
6orath pada tahun $%&&.
6ada tahun $%=$, 6etrus 6erlmann dan Eva Engvall di >niversitas Sto+kholm diS"edia, dan Anton S+huurs dan #auke van ;eemen di #elanda mandiri makalah yang
disintesis pengetahuan ini ke dalam metode untuk melakukan EIA ? ELISA.
Penertian ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay )ELISA* adalah suatu teknik biokimia yang
terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau
antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidangmedis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana,
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 13/21
sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi
spesifik di+u+ikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya.
Antibodi ini terikat dengan suatu en(im, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang
dapat diubah oleh en(im menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat
+ahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks
antigen?antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan
berdasarkan besarnya fluoresensi.
6enggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu.
Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid
)biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene*, baik yang non-spesifik )melalui penyerapan
pada permukaan* atau spesifik )melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk
antigen yang sama, disebut F sandwich’ ELISA*. Setelah antigen diimobilisasi, antibodi
pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat
berikatan juga dengan en(im, atau dapat dideteksi se+ara langsung oleh antibodi sekunder
yang berikatan dengan en(im melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus di+u+i
dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak
terikat. Setelah tahap pen+u+ian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat en(imatik untuk
memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel.
1eknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode
terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif.
A-"i#a$i ELISA
ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel,
karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi
antibodi dalam serum )seperti dalam tes I/*, dan juga untuk mendeteksi kehadiran antigen.
Betode ini juga bisa diaplikasikan dalam industri makanan untuk mendeteksi allergen
potensial dalam makanan seperti susu, ka+ang, "alnut, almond, dan telur. ELISA juga dapat
digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan +epat pada berbagai kelas obat.
ELISA adalah tes skrining dahulu banyak digunakan untuk I/ karena kepekaan
tinggi. Dalam ELISA, serum seseorang dien+erkan '' kali lipat dan diterapkan pada pelat
yang antigen I/ yang terpasang. <ika antibodi terhadap I/ hadir dalam serum, mereka
dapat mengikat antigen I/. 6elat ini kemudian di+u+i untuk menghapus semua komponen
lain dari serum. Sebuah Hantibodi sekunderH khusus disiapkan - antibodi yang mengikat
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 14/21
antibodi lain - kemudian diterapkan ke piring, men+u+i diikuti oleh yang lain. Ini antibodi
sekunder se+ara kimia"i terkait di muka untuk en(im.
HAnti Ig7 manusiaH Antibodi 7anda Sand"i+h ELISA
Dengan demikian, piring akan berisi en(im sebanding dengan jumlah antibodi
sekunder terikat ke piring. Sebuah substrat untuk en(im diterapkan, dan katalisis oleh en(im
mengarah ke perubahan pada "arna atau fluoresensi. asil ELISA dilaporkan sebagai nomor:
aspek paling kontroversial dari tes ini adalah menentukan H+ut-offH titik antara positif dan
hasil negatif. Sebuah titik +ut-off dapat ditentukan dengan membandingkannya dengan
standar yang dikenal. <ika tes ELISA digunakan untuk skrining obat di tempat kerja,
konsentrasi +ut-off, 4' ng ? mL, misalnya, didirikan, dan sampel yang berisi konsentrasi
analit standar akan disiapkan. Diketahui bah"a menghasilkan sinyal yang lebih kuat daripada
sampel dikenal adalah Hpositif.H Bereka yang menghasilkan sinyal lemah, yang Hnegatif.H
Dokter Dennis E #id"ell dan Alister /oller men+iptakan tes.
0egunaan lain dari ELISA meliputi@
$. deteksi antibodi mikobakteri dalam 1#.
. deteksi rotavirus dalam tinja.
2. deteksi penanda hepatitis # dalam serum.
. deteksi enterotoksin E. +oli dalam tinja.
*i-e!ti-e ELISAAda beberapa tipe-tipe ELISA, diantaranya adalah sebagai berikut@
$. Indire+t ELISA
. Sand"i+h ELISA
2. ompetitive ELISA
1 Indire't ELISA
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 15/21
)7ambar Bekanisme Indirect ELISA*
1ahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi
konsentrasi antibodi dalam serum adalah@
a* Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan
lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan +ara
adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar
yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.
b* Suatu larutan pekat dari protein non-interacting , seperti bovine serum albumin )#SA* atau
kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. 1ahap ini dikenal sebagai
blocking , karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 16/21
+* Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari
antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan
untuk antigen standar. 0arena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-
spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.
d* Plate di+u+i, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan
dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan
lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.
e* Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam
lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi en(im dengan substrat spesifik.
1ahap ini bisa dile"ati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan en(im.
f* Plate di+u+i untuk membuang kelebihan konjugat en(im-antibodi yang tidak terikat.
g* Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh en(im untuk mendapatkan sinyal kromogenik?
fluorogenik? elektrokimia.
h* asil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik?
elektrokimia lainnya.
En(im bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat en(im
yang tetap terikat, molekul en(im akan memproduksi berbagai molekul sinyal. 0erugian
utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik,
sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga
konsentrasi analit yang ke+il dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat
pengikatan pada permukaan lubang.
2 Sand3i'h ELISA
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 17/21
1ahapan dalam Sand"i+h ELISA adalah sebagai berikut@
a* Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi FpenangkapQ
b* Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
+* Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
d* 6late di+u+i untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
e* Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan se+ara spesifik dengan antigen
f* Antibodi sekunder yang berikatan dengan en(im dimasukkan, yang akan berikatan dengan
antibodi primer
g* 6late di+u+i, sehingga konjugat antibodi-en(im yang tidak terikat dapat dibuang
h*
Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh en(im menjadi sinyal ber"arna? berfluoresensi?elektrokimia
i* Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen
0euntungan utama dari metode sand"i+h ELISA adalah kemampuannya menguji
sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat se+ara selektif antigen yang dikehendaki.
1anpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel )termasuk
protein serum* dapat diserap se+ara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan
kuantitas antigen yang terimobilisasi.
6rinsip kerja sand"i+h ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini@
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 18/21
4 5om-etiti6e ELISA
1ahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas
sebelumnya, yaitu@
a* Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b* 0omplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi
antigen
+* 6late di+u+i, sehingga kelebihan antibodi ter+u+i )semakin banyak antigen dalam sampel,
semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan
lubang, karena inilah disebut kompetisi
d* Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini
berpasangan dengan en(im
e* Substrat ditambahkan, en(im akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik?
fluoresensi.
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 19/21
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah
sinyal yang dihasilkan. 6rinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini@
Se+ara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikut@
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 20/21
7 e%era-a dan Porta%"e ELISA (M P ELISA& (ELISA Re6er$e di
ma#a"ah an diter%it#an&
Sebuah teknik baru )E6 $ %% M% #$ di E6K #uletin 4.'.'% 5. ''%?'%: >S61K
=4$'&M= di >S61K #uletin ''%?'2?2$: RL '2.M$'.'%,' di SI6K #uletin ''%?'M?'*
menggunakan fase padat terdiri dari polistiren immunosorbent batang dengan M-$ ogives
menonjol. Seluruh perangkat direndam dalam tabung reaksi berisi sampel dikumpulkan dan
langkah-langkah berikut )+u+i, inkubasi dalam +onjugate dan inkubasi dalam +hromogenous*
8/15/2019 Elisa Rabu
http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 21/21
dilakukan oleh men+elupkan ogives di mi+ro"ells standar mi+roplates pra-diisi dengan
reagen.
0euntungan dari teknik ini adalah sebagai berikut@
6ara ogives masing-masing dapat peka terhadap reagen yang berbeda, memungkinkan
deteksi simultan dari antibodi yang berbeda dan ? atau antigen yang berbeda untuk multi-
target tes:
/olume sampel dapat ditingkatkan untuk meningkatkan sensitivitas tes di klinik )darah, air
liur, urin*, makanan )susu +urah, telur dikumpulkan* dan )air* lingkungan sampel:
Satu ogive yang tersisa unsensiti(ed untuk mengukur reaksi non-spesifik sampel:
6enggunaan perlengkapan laboratorium untuk mengeluarkan alikuot sampel, men+u+i
solusi dan reagen dalam mi+ro"ells tidak diperlukan, memfasilitasi pengembangan siap
menggunakan laboratorium-kit dan di tempat kit.
9 Materia" a"am Metode ELISA
Antigen
Bono+lonal Ab
Bi+roplate
#lo+king #uffer
Serum sample
onjugate )se+ondary Ab J En(yme*
Subtrate
Stop Sol.
Diposkan oleh Arini 0risna Kktavia di '=.4M Label@ Imunoserologi