ELVÁLASZTÁSTECHNIKA VI.

ELEKTROFORÉZIS

Dr. Kremmer Tibor

EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEMBudapest

ELEKTROFORÉZISELEKTROFORÉZISELEKTROMIGRÁCIÓELEKTROMIGRÁCIÓ

SZABAD HATÁRFELÜLETŰSZABAD HATÁRFELÜLETŰ(ZÓNA) (ZÓNA)

ELEKTROFORÉZISELEKTROFORÉZIS

GÉLELEKTROFORÉZISGÉLELEKTROFORÉZIS

DETERGENS GÉLELEKTROFORÉZISDETERGENS GÉLELEKTROFORÉZIS

KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZISKAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS

Arne

TISELIUSprofesszor

TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS

Tiselius (1925 – 1930) Szabad határfelületű (zóna) elektroforézis, 1948 Nobel-díj

Elektroforézis hordozók bevezetése (1930 – 1950) - porok (cellulóz) - szűrőpapír - gélek (hidrolizált keményítő, agar-agar, agaróz, agaropektin) - membránok (cellulóz acetát)

Poliakrilamid gélek (1950 – 1960) - pórusméret, molekulaszűrés, gradiens technikák - készülék fejlesztések (slab – disc, horizontális – vertikális)

Detergens gélelektroforézis, SDS-PAGE (1960 – 1970) - Izoelektromos fokuszálás

Kapilláris elektroforézis és kapcsolt technikák 1990 – től - CZE, CGE, MEKC, CIEF, CITP, ACE, CEC

AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG TULAJDONSÁGAI

AZ ELVÁLASZTÁS KÖZEGE (HORDOZÓ)

AZ ELEKTROMOS ERŐTÉR

AZ ELVÁLASZTÁS TÉNYEZŐI

AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI

ELVÁLASZTÁS ELEKTROMOS ERŐTÉRBENTÖLTÉSSEL RENDELKEZŐ MOLEKULÁK ELTÉRŐ

ELEKTROFORETIKUS MOBILITÁSA ALAPJÁN

AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG TULAJDONSÁGAIELEKTROMOS TÖLTÉSSEL RENDELKEZZEN(POZITÍV, VAGY NEGATÍV, IZOELEKTROMOS PONT, pI),

IONIZÁLHATÓ (INDUKÁLHATÓ), VAGY IONOS ÁLLAPOTBA HOZHATÓ (detergens micella) LEGYEN,

KÉMIAI SZERKEZETE (stabilitás),FUNKCIONÁLIS CSOPORTJAI (disszociáció, erős – gyenge)KÖLCSÖNHATÁSAI (aggregáció, asszociáció)

MÉRETE – TÖMEGE (kis molekulák – biopolimerek – fehérjék)ALAKJA (globuláris – fibrilláris)BELSŐ VISZKOZITÁS (konformáció)

OLDÉKONYSÁG, DETEKTÁLHATÓSÁG,

BIOLÓGIAI AKTIVITÁS

AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI

IONOS, VAGY IONIZÁLHATÓ FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK A FEHÉRJÉK MOLEKULA SZERKEZETÉBEN

3

34 aNM DN

RTa6

A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE

A molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggése (eltérése) a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le:

M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a – Stokes-féle rádiusz, D – diffuziós állandó, υ – molekula fajlagos parciális térfogata, η – viszkozitási együttható.

AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI

AZ ELVÁLASZTÁS KÖZEGE (HORDOZÓ)

HALMAZÁLLAPOTA Folyadék (szabad határfelületű, vagy zónális), Szilárd (cellulóz – papír, szemcsék, membránok) Félfolyékony rendszerek (gélek, hidrofil polimerek)

MINŐSÉGE Polaritás, dielektromos állandó, oldószer erősség, Viszkozitás, Hőmérséklet (hűtés !),

ELEKTROKÉMIAI TULAJDONSÁGOK Ionerősség – ion minőség, pH (puffer)

AGARÓZ GÉL SZERKEZETE (Araki, 1956)

TÉRHÁLÓS DEXTRÁN GÉLEK (Sephadex) SZERKEZETE

N,N’-METILÉN BIS-AKRILAMIDDAL TÉRHÁLÓSÍTOTT POLIAKRILAMID GÉLEK

AZ ELEKTROFORÉZIS TECHNIKÁKBAN ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLT PUFFER RENDSZEREKPuffer pH tartomány

Citrát (-dihidrogén, -hidrogén) 2 - 6,0 2,6 - 6,5Dietil barbiturát (Veronál-Na) 7,0 - 10Kálium hidrogén ftalát 2,2 - 6,5Nátrium formiát 3,0 - 4,4Nátrium acetát 4,2 - 5,4Trietanolamin 6,7- 8,7Nátrium borát 8,0 - 9,8Ammónium acetát 8,6-9,8Nátrium dihidrogén foszfát 2,0-6,0 és 8,0-12,0Kálium dihidrogén foszfát 2,0-8,0 és 9,0-13,0

Bis-tris-propán 4.0 – 8.0

ELEKTROFORÉZISAZ ELEKTROFORÉZIS KÖZEGÉNEK JELLEMZŐI

IONERŐSSÉG (I) - IONMINŐSÉG

2

21

ii zcI

összefüggésből számítható, ahol:

ci az i-edik ion koncentrációja,

zi

2 az i-edik ion töltés számának négyzete.

AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI

AZ ELEKTROMOS ERŐTÉR

JELLEGE – HOMOGENITÁSA Lineáris – radiális, síkban – térben,

INTENZITÁSA

E = V . d-1 (Volt /m)

AZ ELEKTROMOS ÁRAMKÖR

Ohm – törvény Joule - hő

V = R . I Q = f (I)

AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAIVÁNDORLÁSI SEBESSÉG () ELEKTROFORETIKUS MOBILITÁS ()

Evtd

(Volt-1sec-1m2)t idő (sec)

= a molekula összetett paramétere, ~10-8 (előjel – irány) „net charge” - eredő (össz) töltés, ionizáltsága (erössége-foka) anyagi minősége, hidrodinamikai ellenállása, közeg viszkozitása, ionerőssége-ion minősége, pH-ja, speciális vezetőképessége

STOKES-féle törvény frikciós együttható (f) i = qi / 6r f = 6r

AZ ELEKTROFORÉZIS GYAKORLATA

Analitikai – preparatív (oszlop, réteg)

Horizontális - vertikális

Disc - slab - kapilláris

Kontinuus - diszkontinuus

Detergens gélelektroforézis (SDS - PAGE) Moltömeg (méret) meghatározás

Izoelektromos fókuszálás (IEF), pl

Tiselius (1948) Nobel-díj

SZABAD HATÁRFELÜLETŰ „ZÓNA”

ELEKTROFORÉZIS

H

HORIZONTÁLISpapír

keményítőmembrán

(cellulóz acetát)GÉL

(agaróz, dextrán, poliakril amid)ELEKTROFORÉZIS

HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK ÉS LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA „KLASSZIKUS” PAPÍRELEKTROFORÉZISSEL

LDL

( + )

HDL

CHYLOMICRON VLDL

HUMÁN

SZÉRUM

LIPO

PROTEINOSZTÁLYOK

(SEM)

HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEIN OSZTÁLYOK ELOSZLÁSA

VLDLLDL

HDL

ELFO

UC

HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK

ELVÁLASZTÁSAELEKTROFORÉZISSEL

AGARÓZ GÉLEN

FESTÉSSudan Black B

HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK ÉS LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA HORIZONTÁLIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZISSEL

HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ÉS LIPIDEK ÖSSZEHASONLÍTÓ DIAGNOSZTIKAI VIZSGÁLATA

ELŐFESTETT EGÉR SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA VERTIKÁLIS (DISC) POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL

VLDL

LDL

HDL

FEHÉRJÉK

MOLEKULATÖMEG MEGHATÁROZÁSA

VERTIKÁLIS (SLAB)

PÓRUS-GRADIENS

SDS-POLIAKRILAMID

GÉLELEKTROFORÉZISSEL

LMWMOLEKULATÖMEG

STANDARD FEHÉRJÉK

EHRLICH ASCITES TUMORSEJT MEMBRÁN FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA VERTIKÁLIS (DISC) SDS-POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL

HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK

ÉS GLIKOPROTEINEK

DETERGENS GÉLELEKTROFORÉZIS

(SDS-PAGE)VIZSGÁLATA

FESTÉS

COOMASSIE BRILLANT BLUE

PERJODÁT-SCHIFF(PAS)

AGP

4,93 5,03 5,06

pI

F1 S A

NP - XXII

L - 1328

O - 9130

O - 8990

HUMÁN SZÉRUM AGP GENETIKAI VARIÁNSAINAK ELVÁLASZTÁSA IZOELEKTROMOS FOKUSZÁLÁSSAL (IEF GÉLELEKTROFORÉZIS)

HUMÁN SZÉRUM LAKTÁT DEHIDROGENÁZ IZOENZIMEK ELVÁLASZTÁSAHORIZONTÁLIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZISSEL

AZ

LDH IZOENZIMEK

TETRAMERSZERKEZETE

ALEGYSÉGEK

H ~ MÁJ (HEPAR)

M ~ IZOM (MUSCLE)

TEJSAV + NAD

LDHPIROSZŐLŐSAV + NADH

FENAZIN METOSZULFÁT

NADH + TETRAZÓLIUMKÉK NAP + FORMAZÁN

AZ LDH in situ KIMUTATÁSÁNAK SZINREAKCIÓJA

KÓROS HUMÁN SZÉRUM LDH-IZOENZIM FELVÉTELEK

KÜLÖNBÖZŐ KÓROS HUMÁN SZÉRUM LDH-IZOENZIM FELVÉTELEKDENZITOMETRIÁS KIÉRTÉKELÉSE