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Entwicklung einer auf subtraktiver Hybridisierung basierenden Nachweismethode
zur Identifizierung differentieller Genexpression in Eukaryonten
Dissertationzur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaft-Dr. rer. nat.-
Dem Fachbereich Biologie/Chemieder Universität Bremen
Li Li Bremen, 2003
1. Gutachter: Prof. Dr. Hildebrandt
2. Gutachter: Prof. Dr. Beyersmann
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung....................................................................................................................................1-19
1.1 Differentielle Genexpression..........................................................................................................1
1.2 Methoden zur Analyse differentieller Genexpression....................................................................2
1.3 Probleme, die bei der Genom-Subtraktion zu bewältigen sind....................................................13
1.4 Auswahl eines Testsystems zur Überprüfung eines Genom-Subtraktionssystems......................16
1.5 Transgene Solanum als Modellsystem zur Genom-Subtraktion bei hochkomplexen
Eukaryonten.................................................................................................................................17
1.6 Das Ziel der Arbeit ......................................................................................................................19
2 Material und Methoden...........................................................................................................20-52
2.1 Vorbereitung der cDNA ..............................................................................................................20
2.2 Genom-Subtraktion mittels SSH .................................................................................................28
2.3 Überprüfung der DSC.................................................................................................................. 33
2.4 Suche nach der Ursache des Versagens der DSC ........................................................................39
2.5 Entwicklung der NSC.................................................................................................................. 41
2.6 Subtraktion mittels SSH/NSC .....................................................................................................42
2.7 Die Logik der Methodenentwickelung.........................................................................................52
Inhaltsverzeichnis
3 Ergebnisse.................................................................................................................................53-84
3.1 Vorbereitung des Tester/Drivers zur Genom-Subtraktion...........................................................53
3.2 Analyse differentieller Genexpression in Kartoffeln mit SSH.....................................................58
3.3 Experiment zur Etablierung der DSC...........................................................................................62
3.4 Suche nach der Schwachstelle der DSC.......................................................................................65
3.5 Entwicklung der NSC...................................................................................................................68
3.6 Kombination SSH/NSC...............................................................................................................72
3.7 SN am Beispiel von Kartoffel-cDNA..........................................................................................78
4 Diskussion.................................................................................................................................85-92
4.1 SN ist ein innovatives, elegantes Genom-Subtraktionssystem ...................................................85
4.2 Bei höheren Eukaryonten ist SNH zur Analyse differenzieller Genexpression gegenüber den
bekannten Methoden zu bevorzugen; sie stellt auch eine gute Alternative zur Identifizierung
genomischer Unterschiede dar...........................................................................................................87
4.3 Ausblick........................................................................................................................................90
Zusammenfassung............................................................................................................................91
Literaturverzeichnis.........................................................................................................................92
Anhang...............................................................................................................................................97
Danksagung.....................................................................................................................................107
1
1 Einleitung
1.1 Differentielle Genexpression
Organismen lassen sich anhand ihrer Gene unterscheiden. Ein vielzelliger Organismus wiederum
exprimiert seine Gene je nach Zell- oder Gewebetyp unterschiedlich. Diese Unterschiede können
dabei sowohl qualitativ als auch quantitativ sein.
Das menschliche Genom codiert für bis zu 30,000-100,000 Gene (Bishop, 1974; Zhang, 1997;
Venter, 2001; the genome international sequencing consortium, 2001). Zu einem gegebenen
Zeitpunkt in einer bestimmten Zelle werden jedoch nur 15-20,000 Gene exprimiert. Ihren
Konzentrationen nach können die eukaryontischen mRNAs in drei relativ homogenen Unterklassen
eingeteilt werden: Nur wenige Sequenzen gehören der am höchsten konzentrierten Klasse an. In
Hela Zellen haben 10-20 Gene in dieser Klasse in der Größenordnung von etwa 8,000 Kopien pro
Zelle; 1 % (350 Sequenzen) sind in der mittel konzentrierten Klasse vorhanden, mit etwa 440
Kopien pro Zelle; die meisten Gene gehören dagegen der am niedrigsten konzentrierten Klasse an
und besitzen durchschnittlich nur 8 Kopien pro Zelle. Den beiden höher konzentrierten mRNA-
Klassen wird eine große Bedeutung bei der Zelldifferenzierung zugesprochen. Die mRNAs in der
höchsten Konzentrationsklasse scheinen gewebespezifisch zu sein, während sich die „house-
keeping“ Gene in der am niedrigsten konzentrierten Klasse befinden (Hastie, 1976).
Die Analyse differentieller Genexpression dient dazu, die biologischen Vorgänge zu verstehen, was
wiederum ermöglichen könnte, ein bestimmtes Geschehen zu lenken. Die Identifizierung eines
Gens oder Genprodukts, das tendenziell bei einem bestimmten Krankheitsbild auftritt, könnte
eventuell zu einer früheren Erkennung und/oder neuen Therapien hinführen. Nahezu 60 % aller
menschlichen Tumore exprimieren z. B. kein funktionsfähiges p53, ein Gen, das in der normalen
Zelle verhindert, dass ein DNA-Schaden bei der Zellteilung an die Nachkommen weitergegeben
wird; während Gene, die für ein robustes Wachstum charakteristisch sind, z. B. die für ribosomale
Proteine codierenden Gene, im Vergleich zum umgebenden Gewebe überexprimiert werden
(Levine, 1991; Zhang, 1997).
Für Fragestellungen, bei denen der Zusammenhang eines Expressionsmusters und z. B. einer
Erkrankung bereits bekannt ist, existiert ein breites Spektrum an Untersuchungstechniken. Wenn
jedoch die Fragestellung darin liegt, ob sich zwei Proben überhaupt in ihren Expressionsprofilen
2
voneinander unterscheiden, kann nur auf wenige und teilweise aufwendige Methoden
zurückgegriffen werden. Neben der Auffindung von entwicklungs- und differenzierungsrelevanten
Genen gilt dies u. a. auch für die Detektion von Transgenen.
1.2 Methoden zur Analyse differentieller Genexpression
Da der Analyse differentieller Genexpression große Bedeutung beigemessen wird, ist in letzter Zeit
eine dynamische Entwicklung der dazu dienenden Techniken zu beobachten, der sich viele
Arbeitsgruppen widmen. Schematisiert lässt sich das Spektrum der Analysetechniken wie folgt in
Abb. 1-1 darstellen.
Die Bevorzugung einer bestimmten Methode bei einer bestimmten Fragestellung hängt von
mehreren Faktoren ab, u. a. der Komplexität der Genome, der Expressionsstärke des Target Gens,
dem Bekanntsein der cDNA Sequenzen, der technischen Ausstattung sowie der
„Forschungstradition“ der jeweiligen Arbeitsgruppe.
Abb. 1-1: Übersicht der gängigen Methoden zur Analyse differenzieller Genexpression
1.2.1 mRNA Differential Display
Die direkteste Methode zum Vergleichen von zwei mRNAs ist das Differential Display (Liang,
1994). Dabei werden die mRNAs systematisch in cDNAs umgeschrieben und die cDNAs dann
parallel auf einem Sequenzierungsgel aufgetrennt und deren Bandenmuster verglichen.
Um die Teilpopulation der zu vergleichenden cDNA-Fragmente zu verkleinern und die Auflösung
der Banden zu erhöhen, werden Ankerprimer für die cDNA-Synthese an den polyA-Enden der
Methoden zur Analyse differenzieller Genexpression
Genom-Subtraktion
SAGE
Mikroarray
Differential Display
3
mRNAs gebunden und die folgende Amplifikation durch PCR mit einem zusätzlichen willkürlichen
Primer durchgeführt. Schematisch lässt sich diese Methode folgendermaßen in Abb. 1-2
veranschaulichen.
Differential Display eignet sich gut für wenig komplexe mRNA-Populationen. Bei höher
komplexen mRNA-Gemischen ist der optische Vergleich der cDNA Bandemuster erheblich
erschwert, da die Auflösung der Banden auf Grund deren hohen Anzahl niedrig wird. Komplette
Repräsentation einer komplexen mRNA Population mit angemessener Auflösung der Banden
dagegen verlangt extrem hohen Arbeitsaufwand.
Abb. 1-2: Schema des mRNA Differential Display mit einem einbasigen Oligo-dT
Ankerprimer, nach Liang (1994)
G (U oder C) AAAAAAAAAAAAAAAAAA
5́ -TTTTTTTTTTTTTTTTTTC(A oder G)
dNTPs
Reverse Transkriptase
G (U oder C) AAAAAAAAAAAAAAAAAAC (A oder G) TTTTTTTTTTTTTTTTT
5́ -AAGCTTTTTTTTTTTC(A oder G)
Abitrary Primer
dNTPs
Taq Polymerase
C (A oder G) TTTTTTTTTTTTTTTTTAbitraryPrimer
C (A oder G) TTTTTTTTTTTTTTTTTAbitraryPrimer
RNA A B
Differentielle Genexpression
mRNA
Reverse Transkription
PCR
Gelanalyse
C
4
1.2.2 Mikroarray
Die Expression von bis zu 50,000 Genen kann mit der Mikroarray-Technik (Heller, 2002) parallel
untersucht werden. Somit eignet sich diese Methode gut zur Herstellung gesamtgenomischer
Genexpressionsprofile. Bei der Mikroarray-Technik werden bis zu 108 Oligos, die verschiedene
cDNAs repräsentieren, auf Trägern (Chips) immobilisiert und mit den markierten cDNAs
hybridisiert. Die Hybridisierungssignale reportieren dann das Vorhandensein sowie die
Expressionsstärke jeder Sequenz (Abb. 1-3).
Abb. 1-3: Mikroarray zur Analyse differentieller Genexpressionsprofile
Die Anwendung der Mikroarray-Technologie setzt allerdings voraus, dass die
Zelle A
Zelle B
H ybridizierung auf M ikroarray
R ohe D aten Q uantifizierung E xpressionstärke
m R N A cD N A
Laser Scanning
R ohdaten
5
Sequenzinformationen der zu untersuchenden Fragmente vorhanden sind. Jedoch sind nur wenige
Organismen durchsequenziert, daher ist die Herstellung eines passenden Chips zu jedem beliebigen
Organismus und jeder beliebigen Fragestellung zurzeit unmöglich. Auch die hohen Kosten und die
hohen technischen Ansprüche bei der Chip-Herstellung, die wenig standardisierte
Versuchsdurchführung und Dateninterprätation verhindern zurzeit in den meisten Fällen die
Etablierung dieser Technik in Routinelabors.
1.2.3 SAGE
Die SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) ist wie das Mikroarray-Verfahren eine Computer
gestützte Technologie (Velculescu, 1995). Durch ein kompliziertes Verfahren werden die cDNAs
durch die Summe ihrer SAGE-Tags repräsentiert. Jeder Repräsentant wird dann sequenziert. Die
Ergebnisse der darauffolgenden, vom Computer unterstützten Vergleich der beiden Pools von
SAGE-Tags weist auf eine mögliche differentielle Genexpression hin (Abb. 1-4).
Abb. 1-4: Schema der SAGE
AAAAATTTTT
AAAAATTTTTGTAC
AAAAATTTTTGTAC
AAAAATTTTTGTAC
CATG CATGA B
CCTACGTACXXXXXXXXXGGATGCATGXXXXXXXXXPrimer A GGATGCATGOOOOOOOOOPrimer B CCTACGTACOOOOOOOOO
CCTACGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACGTAGGGGATGCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGCATCCPrimer A Primer B
GTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACGXXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACGCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGXXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATG
Ditag
Streptavidin
BiotincDNASchnitte mit 4-Base Endonukease , binden an Streptavidin
In 2-Pools verteilen, Ligation mit Adapteren
Schnitte mit Typ-2 Enzyme
Ligation, PCR
Schnitte mit 4-Base Endonuklease,
Isolierung der Ditags, CloningSchnitte mit 4-Basen Endonuklease, Isolierung der Ditags, Klonierung
Ligation mit Adaptoren
Schnitte mit 4-Basen Endonuklease, binden an Streptavidin
6
Die mRNAs werden dabei zuerst mit biotinylierten Oligo-dT-Primern in cDNAs umgeschrieben.
Die cDNAs werden dann mit einer 4-Basen Endonuklease geschnitten und die Fragmente, an die
Biotin gebunden ist, mit Streptavidin isoliert. Die biotinylierten cDNAs werden dann in zwei Pools
verteilt, und anschließend mit zwei Adaptoren versehen, die die Erkennungssequenz eines Typ-2
Enzyms tragen. Die Typ-2 Enzyme schneiden DNA-Sequenzen an den Stellen, die in einer
bestimmten Distanz (8-15 Basen) zu ihrer Erkennungssequenz liegen (Szybalski, 1985). Nach der
Restriktion mit dem Typ-2 Enzym ergeben sich dann Fragmente, die die Adaptorsequenz und einen
kurzen Teil einer cDNA (5-10 Basen) enthalten. Dieser mit Adaptor verbundene cDNA-Teil ist für
jede cDNA spezifisch und wird als deren SAGE-Tag bezeichnet. Die SAGE-Tags aus beiden Pools
werden dann zusammenligiert und die dabei entstandenen Ditags durch PCR amplifiziert. Als
Primer dafür dienen die Sequenzen der beiden Adaptoren. Die amplifizierten Ditags werden dann
mit der gleichen Endonuklease geschnitten, danach gereinigt und kloniert.
Es dauert durchschnittlich 2-3 Monate, um mit SAGE das Expressionsprofil eines eukaryontischen
Organismus, herzustellen. Auch die technischen Ansprüche sind nicht niedrig und die Kosten der
Laborausstattung hoch.
1.2. 4 Genom Subtraktion
Die Analyse differentieller Genexpression wird in Forschungslabors oft mittels Genom-Subtraktion
betrieben, wozu u. a. auch die damit verbundenen relativ niedrigen Kosten und die hohen
technischen Ansprüche beigetragen haben. Es sind dabei keine teuren Geräte wie z. B. eine
Sequenzierungsapparatur wie bei SAGE nötig.
„Genom-Subtraktion“ bezeichnet den Vorgang, die gemeinsamen Sequenzen zwischen zwei
Genomen durch Hybridisierung zu subtrahieren, und die einzigartigen Sequenzen, die nur in einer
der zwei (c)DNA-Präparationen, oder in wesentlich höheren Konzentrationen in einer der (c)DNA-
Präparationen vorhanden sind, anzureichern.
In diesem Zusammenhang nennt man die gesuchten einzigartigen Sequenzen das „Target“. Der
„Tester“ ist dabei das Genom, welches das Target enthält, oder dessen Repräsentant als PCR-
Amplikon. Der „Driver“ ist dagegen das Referenz-Genom, das das Target nicht enthält, oder dessen
Repräsentant als PCR-Amplikon. Alle anderen Sequenzen außer der des Targets bezeichnet man als
„Hintergrundsequenzen“. Dieser Hintergrund ist desto höher, je komplexer die zu vergleichenden
7
Genome sind.
Der Einsatz dieser Genom-Subtraktion geht auf Versuche von Lamar et al. am Y-Chromosom von
Mäusen zurück. In seiner Arbeit wurden DNA-Regionen untersucht, die in männlichen Mäusen
vorhanden waren und in weiblichen jedoch fehlten (Lamar, 1984).
Bei der Untersuchung wurde gescherte DNA weiblicher Mäuse im Überschuss gegen die mit Mbo1
verdaute DNA männlicher Mäuse hybridisiert. Bei der Hybridisierung entstanden drei Arten von
Hybriden: Männlich/männlich, männlich/weiblich und weiblich/weiblich. Nur die
männlich/männlichen Hybride besaßen an beiden Enden die Erkennungssequenz von MBO I,
sodass diese kloniert werden könnten.
Eine Weiterentwicklung dieser Technik stellte die von Kunkel et al. 1985 verwendete Methode bei
der Untersuchung der Duchenne Muskeldystrophie dar (Kunkel, 1985). Die Hybridisierung der
DNA wurde hierbei in einem Phenol-haltigen Puffer durchgeführt. Das Phenol bewirkt eine
Verkürzung der Reassoziationszeit während der Hybridisierung bei Raumtemperatur.
1990 ligierten Strauß et al. vor der Hybridisierung kurze Adaptoren an die mit Endonuklease
verdauten Tester-Fragmente, sodass die Tester/Tester Hybride nach der Hybridisierung mit Hilfe
einer PCR vermehrt werden können (Strauß 1990).
1993 stellten Lisitsyn et al. RDA („representional difference analysis“) vor (Lisitsyn, 1993). Bei
dieser Methode werden vor der Hybridisierung Tester und Driver mit Endonuklease geschnitten,
mit verschiedenen Adaptoren versehen und durch PCR vereinfachend repräsentiert. Diese
Repräsentation durch PCR-Amplikons vereinfacht die Komplexität von eukaryontischen Genomen
80-100 fach, was die Hybridisierung erheblich beschleunigt. Dieser Repräsentationsschritt wurde
von vielen späteren Subtraktionstechniken übernommen.
Für den Tester werden dann die Adaptoren-Sequenzen des PCR-Amplikons wieder entfernt und
nach Reinigung der DNA mit einen anderem Adaptor erneut ligiert. Als Driver dient das PCR-
Amplikon mit oder ohne dessen Adaptor-Sequenz.
Die schrittweise Anreicherung des Targets erfolgt durch mehrere Runden Hybridisierung und die
darauf folgende Anreicherung der Tester/Tester-Hybride durch PCR. Die Tester/Tester-Hybride
sind dabei die Einzigen, die an beiden Enden die Tester-Adaptor-Sequenzen besetzen und so durch
die PCR mit dem Tester-Primer exponentiell reamplifiziert werden. Das Subtraktionsprodukt aus
der vorherigen Runde wird durch Restriktion und Ligation erneut mit einem anderem Adaptor
versetzt und dient als Tester für die nächste Hybridisierungsrunde. Das Austausch des Tester-
8
Adaptors zwischen den Subtraktionsrunden sollte die ungewollte überdurchschnittliche
Anreicherung mancher Hintergrundsequenzen durch PCR mindern, die eventuell im
Subtraktionsprodukt das tatsächliche Target überdecken könnten (Abb. 1-5).
Abb. 1-5: Schema der RDA
Im Jahr 2000 gelangt es A. Nekrutenko mit der RDA spezifische Gensonden für die Feldmausarten
zu entwickeln (Nekrutenko, 2000). Jedoch werden mehrere PCRs und der Austausch des Adaptors
zwischen den Subtraktionsrunden für die RDA benötigt. Daher ist diese Methode relativ
arbeitsintensiv und kontaminationsanfällig.
Tester Driver
Representation durch PCR-Amplikons
Restriktion
Ligationmit neuem Adapter
Adapterumtausch
Hybridisierung
PCR
a
b
c
expontionelle Amplifikationa:
c: keine Amplifikation
lineale Amplifikationb:
Adaptor-AustauschLigation mit einem neuen Adaptor
lineare Amplifikation
9
Die 1996 von Diatchenko et al. entwickelte SSH (Supression Subtractive Hybridisation) ist ein
zurzeit oft benutztes Genom Subtraktionssystem, was sich an der Vielzahl von Publikationen und
auch der großen Resonanz und dem wirtschaftlichen Erfolg der teuren-Kits der Firma „Clontech“
zeigt, die auf diesem Prinzip basieren (Diatchenko, 1996). SSH beruht auf dem Suppressions PCR
Effekt (Siebert, 1995), wobei nach der Hybridisierung nur das Target exponentiell durch PCR
vervielfacht wird, während die Reamplifikation der anderen Sequenzen unterdrückt wird. Dies führt
zu einer starken Anreicherung des Targets.
Suppression der PCR entsteht bei ssDNAs, die an ihren beiden Enden lange, zueinander
komplementäre Sequenzen besitzen. Die Kinetik der Hybridisierung bevorzugt die Formation einer
Pfannen-ähnlichen Sekundärstruktur, was das Annealing der PCR-Primer erheblich erschwert und
eine effiziente Amplifikation solcher Sequenzen stark unterdrückt.
Abb. 1-6: Suppression PCR (Lukyanov, 1994; Siebert, 1995)
Die Anwendung der Suppressions-PCR bei SSH beruht auf der eleganten Konstruktion von
Denaturierung
Annealing
PCR Primer
Keine Primer-Annealing,
Pfanne-ähnliche Struktur, Suppression PCR
Amplifikationkein Primer-Annealing durch Pfannen-ähnliche Struktur, Suppressions PCR
10
Adaptoren/Primern und der besonderen Strategie der Hybridisierung: Für den Tester werden zwei
nicht phosphorylierte Adaptoren konstruiert, die aus je einem längeren (42-44 Basen) und einem
kürzeren (12 Basen) Strang bestehen. Die Teilsequenzen an den Ligationsenden (22 sowie 24
Basen) sind spezifisch für jeden Adaptor und die anderen Teilsequenzen (20 Basen) sind
gemeinsam zwischen den Adaptoren. Der Tester (geschnittene DNA oder cDNA) wird zuerst auf
zwei Pools verteilt, mit je einem der beiden Adaptoren ligiert, dann in getrennten Ansätzen mit
überschüssigem Driver ohne Adaptor solange hybridisiert, bis die Molaritäten der einzelsträngigen
Fragmente von unterschiedlichen Sequenzen sich gerade ausgleichen. Von der Firma Clontech
wird als Erfahrungswert für die Subtraktion eukaryontischer cDNA bei einer Tester Menge von 10
ng und einer Driver Menge von 300 ng eine Zeitspanne von 6-12h angegeben. Für die zweite
Hybridisierung werden die beiden Ansätze dann unter erneuter Zugabe denaturierten Drivers
zusammengeführt und der zweite Hybridisierungsschritt nahezu zur Völlständigkeit geführt.
Clontech empfiehlt dazu eine übernacht-Hybridisierung. Dieser Hybridisierungsansatz wird dann
verdünnt und ein Teil davon dient als Template für die PCR.
Vor der Reamplifizierung werden die PCR-Ansätze ohne Polymerase für einige Minuten bei 75oC
gehalten, um die kürzeren, nicht ligierten Stränge der Adaptoren vom Tester abzulösen. Dann
werden die ligierten längeren Stränge der Tester-Adaptoren durch die Zugabe von Polymerase
verdoppelt. Die erste PCR erfolgt mit einem Primer, der die gemeinsame Sequenz von beiden
Adaptoren besitzt. Alle Tester/Tester-Hybride aus dem ersten Hybridisierungsschritt besitzen die
gleiche Adaptor-Sequenz an deren beiden Enden. Dadurch wird ihre Amplifizierung während dieser
PCR unterdrückt; exponentiell reamplifizierbar sind dabei nur die Tester/Tester-Hybride aus dem
zweiten Hybridisierungsschritt, wobei das Target erheblich angereichert wird, weil es keine
komplementären Sequenzen im Driver findet. Die Tester/Driver-Hybride vermehren sich dagegen
nur linear, die einzelsträngigen Tester-Sequenzen und die nur Driver-haltigen Sequenzen gar nicht.
Das Produkt der ersten PCR wird dann verdünnt und als Template für die zweite PCR verwendet,
mit den speziellen Sequenzen der beiden Adaptoren als Primer. Die zweite PCR reichert das Target
nochmals an (Abb. 1-7).
Gegenüber der RDA ist die Handhabung der SSH mit nur relativ wenigen Hybridizierungsschritten
ohne Adaptoraustausch eine Vereinfachung. Der Zeitaufwand des Verfahrens ist stark verkürzt und
die Quellen der falsch-positiven Ergebnisse sind erheblich vermindert. Nach Clontech gelingt es
mit SSH die Unterschiede nah verwandter prokaryontischer Genome zu detektieren.
Bei der Applikation dieser Methoden bei eukaryontischen cDNAs werden die Targets ebenfalls
11
stark angereichert, dennoch wird zur Identifizierung des Subtraktionsprodukts ein radioaktives,
kostenintensives Screening-Verfahren empfohlen.
Abb. 1-7: Schema der SSH
1999 veröffentlichten J.H. Luo et al. die Methode DSC (Differential Subtraction Chain, Luo, 1999).
Wie bei der RDA werden auch bei der DSC die Genome von dem Tester und dem Driver vor der
Tester mit Adapter 1 Tester mit Adapter 2Driver im Überschuss
1. Hybridisierung
a
b
c
d
a, b, c, d + e
2. Hybridisierung mit denatuiertem Driver
Filling-in
a
b
c
d
e
PCR mit
a: keine Amplifikationb: keine Amplifikation
d: keine Amplifikation
c: lineale Amplifikation
e: expontionelle Amplifikation
2. Hybridisierung mit denaturiertem Driver
Tester mit Adaptor 1 Driver im Überschuss Tester mit Adaptor 2
12
Subtraktion durch PCR vereinfacht repräsentiert. Nach der Hybridisierung bleibt der Tester-
Adaptor in den Heterohybriden einzelsträngig und kann von Mungo Bohnen Nuklease (MBN)
degradiert werden. Die Subtraktion wäre, wie bei der RDA, durch mehrere Hybridisierungsrunden
zu bewältigen, aber ohne die lästigen Schritte des Adaptoraustausches und der PCR zwischen den
Runden (Abb. 1-8), was die Handhabung erheblich vereinfacht und die Kosten niedrig hält. Die
DSC schien elegant und effizient. Luo berichtete, dass es mit DSC möglich wäre, ein singuläres
Target in hoch komplexen humanen Genomen zu detektieren. Aber bisher wird die DSC von
keinem unabhängigen Forscher bestätigt.
Abb. 1-8: Schema der DSC
Tester Driver
Representation durch PCR-Amplikons
Hybridisierung
Mung Bean Nuklease
PCR
13
1.3 Probleme, die bei der Genom-Subtraktion zu bewältigen sind
Wenn ein Tester mit einem Driver bis zur Vollständigkeit hybridisiert wird, entstehen dabei 3
Varianten doppelsträngiger Hybride: Tester/Tester, Tester/Driver und Driver/Driver. Wenn dabei
der Driver noch in absolutem Überschuss vorliegt, bedeutet dies, dass alle Hintergrundsequenzen
im Tester mit ihren Gegenstücken im Driver Heterohybride bilden. Die Tester/Tester-Hybride
stellen dann das Target dar. Um das Target durch Genom-Subtraktion zu isolieren, sind somit
theoretisch vier (miteinander zusammenhängende) Teilprobleme (markiert mit Stern) zu
bewältigen:
Abb. 1-9: Probleme bei der Genom-Subtraktion
Tester Driver
Hybridisierung
Trennung der Hintergrund und Target
Identifizierung des Targets
1* überschüssiger Driver
2* Vollständige Hybridisierung
3* Trennung der Tester-Tester-Hybride von anderen
4* Identifizierung des Targetes
Hintergrund
Target
Hintergrund
Target
14
Driver in absolutem Überschuss
Obwohl ein großer Überschuss an Driver die Subtraktionseffizienz erhöht, und
theoretisch durch Poolen einer großen Menge von (c)DNA, oder Driver-Amplikons, die aus vielen
parallelen PCR-Ansätzen stammen, ein sehr hoher Überschuss an Driver erreicht werden könnte,
ist jedoch die Löslichkeit der DNA in Hybridisierungspuffer begrenzt. Eine größere Menge an
Driver erfordert ein größeres Volumen zur Hybridisierung und bewirkt eine Verdünnung des
Targets, was wiederum zu einer Verlangsamung der Hybridisierung führt.
Daher kann ein zu großer Überschuss an Driver negativ auf die Kinetik der Hybridisierung wirken.
Aus diesem Gründe wurde der Driver lediglich in „verträglichem“ Überschuss eingesetzt. Bei
eukaryontischen cDNAs erwies sich ein Driver/Tester-Verhältnis zwischen 10-100:1, mit einer
Tester-Menge in der Größenordnung von 100 ng in einem Hybridisierungsvolumen von einigen
Mikrolitern als optimal.
Wenn für die Hybridisierung kein absoluter Überschuss an Driver benutzt wird, wird auch ein
geringer Anteil an Tester-Hintergrundsequenzen Tester/Tester-Hybride bilden, was das Target im
Subtraktionsprodukt verunreinigen würde. Zur weiteren Verminderung dieser
Hintergrundsequenzen wird die Subtraktion oft in mehreren Runden durchgeführt, z. B im Falle
RDA (Birkenmeyer, 2002) und DSC (Luo, 1999).
Hybridisierung bis zur Vollständigkeit
Die eukaryontischen Genome sind hochkomplex, und der größte Anteil der Fragmente ist nur in
sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden. Um die Hybridisierung in absehbarer Zeit nahezu zur
Vollständigkeit zu führen, werden diese bei hoch komplexen eukaryontischen Genomen in Form
ihrer PCR-Amplikons vereinfacht repräsentiert. Dies ist z. B. bei RDA und DSC der Fall.
Weil praktisch keine Hybridisierung zur absoluten Vollständigkeit geführt werden kann, sind
theoretisch nach der Hybridisierung immer noch einzelsträngige Tester und Driver vorhanden, von
denen das Target unterschieden werden muss.
Trennung der Tester/Tester-Hybride von allen anderen Sequenzen
Um das Target zu isolieren, ist das Hauptproblem oft die Unterscheidung der Tester/Tester-Hybride
von allen anderen Sequenzen nach der Hybridisierung. Wenn die Tester/Tester-Hybride durch PCR
15
angereichert werden sollen, muss man dafür sorgen, dass eine exponentielle Amplifikation aller
anderen Sequenzen durch PCR unmöglich wird. Dazu werden außer den besprochenen Strategie
wie bei RDA, SSH und DSC noch verschiedene anderen Strategien entwickelt, durch die sich
einige (meist in den USA patentierten) Methoden voneinander unterscheiden.
Patent 5871927 (Lin, 1999)
Beim Patent 5871927 werden Nukleotid-Analoga vor der Hybridisierung in den Driver eingebaut.
Ein Enzym greift dann nach der Hybridisierung die Analoga in den Tester/Driver- und den
Driver/Driver-Hybriden an und erzeugt Lücken in diesen Sequenzen. Die darauf folgende S1-
Nuklease-Behandlung greift die lückenhaften Hybride an, wodurch diese Hybride nicht mehr durch
PCR amplifizierbar sind. Bei jeder Subtraktionsrunde wird der Driver von Enzymen angegriffen
und abgebaut, sodass vor jeder Hybridisierung neuer Driver zugegeben muss.
Patent 5804382 (Sytkowski, 2002)
Ein Teil des Tester-Adaptors in Tester/Driver-Hybriden ist beim Patent 5804382 wie bei DSC
beschrieben einzelsträngig. Dieser Teil soll dann von Mung Bean Nuklease degradiert werden.
Diese einzelsträngige Form wird bei NSC allein durch die innovative Konstruktion der
Adaptors/Primers gewährleistet, während beim Patent 5804382 die Erkennungssequenzen einer
Endonukleoase in den Driver-Adaptor eingebaut werden, und vor der Hybridisierung an dieser
Stelle ein Teil des Driver-Adaptors von den Driver-PCR-Amplikons gespalten wird.
Patent 5958738 (Lindemann, 1999)
Der Primer zur Synthese der Driver-Amplikons wird bei dem Patent 5985738 so markiert
(Phosphor), dass alle Hybride, die diese markierte Primer-Sequenz enthalten, die Tester/Driver- und
Driver/Driver-Hybride sowie die einzelstängigen Driver und Tester von Nukleasen (Lambda
Exonuklease und Mung Bean Nuklease) angegriffen werden können. Nach der Degradation mit den
Enzymen bleiben nur noch die Tester/Tester-Hybride intakt und werden durch PCR amplifiziert.
Identifizierung des isolierten Targets
Solange die Tester/Tester-Hybride von allen anderen Sequenzen getrennt werden, erfolgt die
16
eventuelle Verifizierung des isolierten Targets bei allen bekannten Techniken auf ähnlichem Weg:
Es wird zunächst durch PCR amplifiziert, dann kloniert und sequenziert. Die Unterscheidung des
„echten“ Targets von den Hintergrundsequenzen im Subtraktionsprodukt erfolgt über Screening-
Verfahren mittels Northern- oder Southern-Blot.
1.4 Auswahl eines Testsystems zur Überprüfung eines Genom-Subtraktionssystems
Nicht jedes Individuenpaar, welches sich im Phänotyp unterscheidet, ist auch als Tester und Driver
geeignet. Genexpression bei Eukaryonten ist ein extrem komplexes Netzwerksystem, dessen
Regulation bisher nur in Teilen verstanden wird. Es gibt in der Natur selten „durchschnittliche
Gesunde“ und „durchschnittliche Kranke“, bei denen die Unterschiede ihrer Genexpression sich
lediglich auf die des untersuchten Gens beziehen. Wenn die Unterschiede zwischen zwei Genomen
aus vielen Sequenzen bestehen, von denen nur wenige niedrig konzentrierte Sequenzen jedoch auch
tatsächlich mit dem untersuchten Phänotyp zusammenhängen, könnten diese „echten“
Targetsequenzen während der Genom-Subtraktion verloren gehen, wenn manche höher
konzentrierte Hintergrundsequenzen durch PCR bevorzugt angereichert werden.
Vor der Subtraktion ist somit immer darauf zu achten, dass der Hintergrund von beiden zu
vergleichenden Genomen möglichst ähnlich sein sollte, wie dies z. B durch das Poolen der (c)DNA
von vielen Individuen eines Phänotyps weitgehend ermöglicht werden könnte.
Bei der Entwicklung einer Subtraktionsmethode, wobei deren Prinzip der Subtraktion noch zu
überprüfen ist, kann man als einfaches Modell künstliche Tester und Driver benutzen, womit man
eine effiziente Subtraktion von einer nicht effizienten leicht unterscheiden kann. Dies ist bei DSC
der Fall. Tester und Driver sind dabei nur ein einziges Lambda-Fragment, das entweder mit dem
Tester-Adaptor oder dem Driver-Adaptor versehen wird. Eine effiziente Subtraktion ist anhand der
nicht Amplifizierbarkeit mittels PCR nach der Hybridisierung zu zeigen.
Weil die Wahrscheinlichkeit der Isolierung einer Targetsequenz von ihrer Konzentration und der
Art und Vielfalt des Hintergrunds abhängt, ist der Erfolg jeder Genom-Subtraktionsmethode nur an
deren Praktizierbarkeit an einem Tester/Driver-Paar, das aus natürlichen Genomen stammt oder
denen weitergehend ähnelt, zu beurteilen. Wenn ein künstliches Tester/Driver-Paar benutzt wird, ist
dabei stets zu beachten, dass das Target nur in Konzentrationen zugegeben wird, wie es der
relativen Expressionsstärke von natürlich vorkommenen mRNAs entspricht.
17
Eine phänotypische Eigenschaft könnte mit dem Vorhandensein oder dem Fehlen eines bestimmten
Fragments in Zusammenhang stehen. Daher sind beide Genome wechselweise als Tester oder
Driver in Betracht zu ziehen.
1.5 Solanum als Modellsystem zur Genom-Subtraktion bei hochkomplexen Eukaryonten
Die Kartoffel, (solanum tubersorum, L., 2n = 4x = 48 Chromosomen, Genomgröße 1012 Bp) ist eine
alte Kulturpflanze der Indianer Südamerikas (Hawkes, 1990; Arumuganathan, 1991). Sie kam um
1570 nach Europa, erlangte gegen Ende des 18. Jahrhunderts sehr große wirtschaftliche Bedeutung.
Die Kulturkartoffeln stammen von tetraploiden Formen ab, die wahrscheinlich aus diploiden
Wildkartoffeln entstanden sind. Solanum findet auch in der Forschung vielfach Verwendung. Die
Kartoffel lässt sich leicht und schnell kultivieren. Frische Kartoffel-Blätter bieten ein gutes
Ausgangsmaterial für die RNA- und mRNA-Isolierung.
Das Kartoffeln Paar Gus und Desiree, stellt ein ideales Testsystem für Eukaryonten zur Beurteilung
einer Genome-Subtraktion-Methode dar, daher dienen sie als Modellsystem zur Überprüfung der in
dieser Arbeit zu entwickelnden Genom-Subtraktionsmethode. Morphologisch sind die beiden
Stämme voneinander nicht zu unterscheiden. Der transgene Stamm Gus ist Desiree, mit dem Gen
Gus aus E.coli mit Hilfe des Ti-Plasmides von Agrobakterium tumefaciens (Horsch R. B., 1985;
Klee H. J., 1987) transformiert. Desiree ist dabei der Referenz-Stamm. Das Transgen, wenn es
experimiert wird, kann als ein Reporter-Target zur Überprüfung eines Genom-Subtraktionssystems
dienen.
Zur Herstellung des transgenen Stamms durch Transformation wird der T-DNA-Komplex
„35S Promoter-gus Gen-ocs Terminator-nos Promotor-npt2 Gen-nos Terminator“
mit Hilfe eines „entwaffneten“ Ti-Plasmides (Ti-Plasmid ohne ocs-Gen für die Octopine-
Synthethase) in das Zellinnere der Solanum eingeschleust.
Das Gus Gen aus E. coli codiert für ß-Glukuronidase, eines der am häufigsten benutzten Reporter-
Gene in transgenen Pflanzen (Gallagher, S. R. 1992). Anfänglich als ein Gen-Fusionsreporter für E.
coli und C. elegans, wird das Gus Gen zurzeit am häufigsten zum Monitoring der Expression der
chimeren Gene in transgenen Pflanzen benutzt. Es gibt keine oder nur geringe Enzym-Aktivität von
ß-Glukuronidase in Pilzen, Drosophila, C. elegans und den meisten Pflanzen (es gibt keine Gus-
Gen in Solanum). Die ß-Glukuronidase hat eine Molekulargewicht von 68,200 kDa und ist stabil
auch in Anwesenheit von Detergenzien und unter unterschiedlichen ionischen Bedingungen (Nester
18
E. W., 1984). Außerdem lässt sich die Aktivität des Gus Gens leicht colorimetrisch oder durch
einen sichtbaren blauen Farbkomplex nachweisen.
Die Detektierung der Expression des Gus Gens erfolgt traditionell durch einen histochemikalischen
Assay (Abb. 1-9), wobei das Substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide (X-Gluc) am Ort der
Enzym-Aktivität blaue Präzipitate erzeugt, oder durch einen fluorimetrischen Assay (Abb. 1-10)
mit dem Substrat 4-methylumbelliferyl-b-D-glucuronide (MUG) oder 4-trifluoromethylumbelliferyl
b-D-glucuronic acid (4-TFMUG) (Jefferson, R. A. 1987; Janssen, B. J., 1989).
Abb. 1-9: Histochemikalischer Assay zur Detektion von Gus-Aktivität. Gus-Tabak. Linke
Seite, unter Licht gewachsen; rechte Seite, im Dunkel gewachsen.
Abb. 1-10: Fluorimetrischer Assay zur Detektion von Gus-Aktivität. 1.3, 5, Kontrolle. 2, 4, 6,
Gewebe mit Gus-Aktivität.
Die Effizienz fast aller damaliger Transformationsmethoden ist so niedrig, dass man gezwungen ist,
möglichst frühzeitig die transformierten von den nicht transformierten Zellen zu trennen. Dazu
wird das selektierbare Markierungsgen npt2 (Walden, 1990), welches für das Toxin-abbauende
Enzym Neomycin-Phosphotranferase codiert, mit in die Zellen transformiert. Beim Einsetzen der
selektiv wirkenden Antibiotika Kanamycin, Neomycin oder Geneticin während der Gewerbekultur-
Phase zur Herstellung der transgenen Pflanzen, werden alle nicht transformierten Zellen entweder
abgetötet oder ihr Wachstum erheblich eingeschränkt, weil der Translationsprozess in den Plastiden
blockiert wird.
Der 35 S-Promotor ist dem Blumenkohlmosaikvirus entnommen. Der nos-Promotor steuert in dem
Ti-Plasmid das Gen für die Nopalinsynthase. Beide sind fast uneingeschränkt in höheren Pflanzen
aktiv, wobei der 35S-Promotor deutlich wirksamer ist (Sander, 1987).
1 2 3 4 5 6
19
Wenn die Einschleusung eines Transgens durch Agrobakterien erfolgt ist, ist die Anzahl der
gewünschten Konstruktionen, das heißt pro Zelle eine vollständige Einzelkopie von dem T-DNA-
Komplex, höher als bei den anderen bekannten Methoden (u.A Mikroinjektion, Elekroporation und
Partikelbeschusstechnik). Der Ort der Integration des Transgens in den pflanzlichen Chromosomen
ist rein zufällig.
Die Expression eines Transgens schwankt erheblich. Es gibt heute viele Beispiele dafür, dass die
Expression des fremden Gens in transgenen Pflanzen ganz ausbleibt oder unerwartet schwach
ausfällt. Der genaue Mechanismus der trangenen Expression wird noch nicht vollständig
verstanden. Es wird in manchem Falle beobachtet, dass sich das stark methylierte fremde Gen in
einer Umgebung mit deutlich geringerem Methylierungsgrad befindet (Meyer, 1992). Pflanzen
können durch Methylierung des Cytosins im Dinukleotid CG oder im Trinukleotid CNG (N kann
jede beliebige Base sein) die Aktivität von Genen abschalten, indem das Methylcytosin nachteilig
in die Protein-DNA-Interaktionen eingreift.
1.6 Das Ziel der Arbeit
Es handelt sich bei dieser Arbeit um eine Methodenentwicklung. Das Ziel der Arbeit ist es, eine
relativ einfache, nicht-radioaktive, routinetaugliche und auf dem Prinzip der Genom-Subtraktion
basierende Methode zur Analyse differentieller Genexpression für Eukaryonten zu entwickeln.
Zunächst wird diese Methodenentwicklung von SSH und 2D-Gelelektrophorese ausgehen. Falls
dieser Ansatz nicht erfolgversprechend sein sollte, ist dann die DSC zu überprüfen und darüber
hinaus eine Subtraktionsmethode, basierend auf dem Prinzip der „negativen Subtraktion“ zu
entwickeln und zu etablieren. Ferner soll geprüft werden, ob sich die Vorteile von SSH und der
„negativen Subtraktion“ zu einer Methode kombinieren lassen.
Als Testmodell für hoch komplexe Eukaryonten werden die cDNAs der beiden Solanum-Stämme
als Tester und Driver der Genom-Subtraktion dienen. Für die Überprüfung der DSC wird dagegen
zur Überschaubarkeit das viel einfachere Lambda Fragment verwendet. Zur Untersuchung der
Sensitivität der Detektion differentieller Genexpression in Eukaryonten durch ein zu entwickelndes
Genom-Subtraktionssystem wird dann ein künstliches Target konstruiert.
20
2 Material und Methoden
2.1 Vorbereitung der cDNA
Als Driver/Tester zur Genom-Subtraktion dienen die mit Endonukleasen geschnittenen cDNAs oder
deren PCR-Amplikons. Die Gesamt-RNA wird aus jungen Blättern der Kartoffeln isoliert und
daraus die mRNA angereichert. Die Intaktheit der mRNA sowie die Expression eines Reporter-
Targets werden mittels Northern-Blot überprüft. Die cDNA wird nach ihrer Synthese mit
Endonuklease geschnitten.
2.1.1 Kultivierung der Kartoffeln
Kartoffel-Knollen werden in Blumenerde gekeimt und die Jünglinge bei 25 oC für einen Monat
wachsen lassen. Junge Blätter werden entweder zur sofortigen RNA-Isolation bearbeitet, oder in
flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 oC für den weiteren Gebrauch gelagert.
2.1.2 Isolierung der Gesamt-RNA
Die Isolierung der Gesamt-RNA wird mit der Guanidinium/Phenol-Methode (Chomczynski, 1987)
durchgeführt. Alle mit RNA in Berührung kommenden Glaswaren werden silikonisiert.
5g junge Blätter werden in flüssigem Stickstoff zu Pulver gemörsert und das gefrorene Pulver in 10
ml Denaturierungslösung überführt, dann 0,1 Vol. NaOAc, pH4, 2M und 1Vol. Wasser-gesättigtes
Phenol, sowie 0,2 Vol. Chloroform/Isoamylalkohol werden addiert, mit sanftem Schütteln nach
jeder Zugabe. Nach einer 15-minütigen Inkubation auf Eis werden die Proben bei 4 oC , mit
10,000g für 20 Min. zentrifugiert und die RNA-haltige obere Phase in 0,8 Vol. Isopropanol
überführt. Die RNA wird dann für 30 Min. bei -20 oC gefällt und anschließend für 20 Min. bei 4 oC,
10,000g zentrifugiert. Das Pellet wird in 75% Ethanol zwei Mal gewaschen und in 2-3 ml H2O
aufgenommen.
Zur Kontrolle ihrer Qualität wird die RNA auf einem 1% MOPS-Gel aufgetrennt. Dabei löst man
in der Mikrowelle 0.25g Agarose in 24 ml MOPS Puffer, lässt die Lösung auf 60-65 oC abkühlen
und mischt dann 0,75 ml Formaldehyd dazu, gießt sofort das Gel und lässt es bis zum Beladen für
0,5 bis 1 Stunde fest werden.
21
3µl (1,5 µg) RNA wird mit 9 µl RNA-Puffer vermischt, bei 55 oC für 10 Min denaturiert und dann
das Gel geladen. Die Auftrennung der RNA erfolgt bei 10 Volt/cm für 40 Min.
Die Absorption der RNA wird mittels Photometer gemessen und ihre Konzentration nach folgenem
Schema berechnet:
µg/µl RNA = OD260 x 0,04 µg/µl x Verdünnungsfaktor
Die Konzentration der gesamten RNA wird auf 2 µg/µl nachjustiert und die RNA in Aliquots von
0,75 ml (1,5 mg) aufgeteilt und bei -80 oC gelagert.
Denaturierungslösung
4 M Guanidinium Thiocyanat; 25 mM Na-Citrat, pH 4,0; 0,5% Na-Laurylsarcosinat; 0,1 M beta-
Mercaptoethanol
MOPS-Puffer
0,02 M MOPS; 8 mM Na-Acetat; 1mM EDTA, pH 7,0
RNA-Puffer
250 µl Formamid, deionisiert mit AG 501-X8; 50 µl Färbelösung (50% Glycerol; 1 mM EDTA; 0,4
% Bromphenolblau; 0,4% Xylencyanol); 10 µg Ethidiumbromid
Phenol, Wasser gesättigt
Phenol zusammen mit gleicher Menge H2O sowie etwas Isoamylalkohol kräftig schütteln und die
Phasen sich trennen lassen. Das Phenol befindet sich in der unteren Phase.
Chloroform/Isoamylalkohol
24:1 (Vol.)
2M Natrium Acetat, pH4
2M Natrium Acetat ansetzen. PH mit Acetat justieren.
2.1.3 Anreicherung der mRNA
0,2g OligodT-Zellulose Pulver (Invitrogen) wird wiederholt in L-Puffer gewaschen (suspendieren
und sanft zentrifugieren, den Überstand vorsichtig verwerfen und die Zellulose erneut
22
suspendieren) bis der PH-Wert unter 8 liegt. 1,5mg RNA (750 µl) wird mit gleichem Volumen 2X
L-Puffer versetzt und bei 65 oC für 5 Min. denaturiert. Nach Abkühlung auf RT wird die RNA-
Lösung auf die Zellulose gegeben, unter sanftem Schütteln für 1 Stunde bei RT inkubiert. Die
Zellulose wird dann bei 2000g, 4 oC für 2 Min. zentrifugiert und der Überstand vorsichtig
verworfen. Das Pellet wird mit den Wasch Puffern I und II je 2 mal gewaschen. Anschließend wird
die mRNA mit 1ml H2O eluiert. Die Anreicherung wird zweimal wiederholt.
Die mRNA wird dann bei -20 oC, übernacht in der Anwesenheit von 0,1 Vol. 2M Natriumacetat,
pH4 und 0,8 Vol. Isopropanol gefällt und durch Zentrifugation für 45 Min bei 10, 000g und 4 oC
pelletiert. Das Pellet wird 2 mal mit 75% Ethanol gewaschen und anschließend in 30µl Aqua bidest.
aufgenommen.
Kontrollen der mRNA auf einem Gel und mit dem Photometer erfolgen wie unter 3.1.2
beschrieben. Die Konzentration der mRNA wird auf 0,5 µg/µl eingestellt, bevor sie in Volumina
von 8µl aufgeteilt und bei -80 oC gelagert wird.
2x L-Puffer
40 mM Tris-Cl, pH7,6; 1M NaCl; 2 mM EDTA; 0,2% N-Laurylsarkosinat
Wasch Puffer I
10 mM Tris-Cl, pH7,6; 0,3 M NaCl; 1 mM EDTA
Wasch Puffer II
10 mM Tris-Cl, pH7,6; 0,15 M NaCl; 1 mM EDTA
2.1.4 Überprüfung der Intaktheit der mRNA
Die Intaktheit der mRNA wird durch Northern-Blot überprüft. Dazu werden je 0,5 µg mRNA von
beiden Stämmen auf einem 1,0% MOPS-Gel aufgetrennt. Die Vakuum-Übertragung der mRNA
von dem Gel auf eine positiv geladene Nylonmembran (Amersham Hybond N+) erfolgt bei 60 Bar
und 2 Stunden mit 20X SSC. Die mRNA wird dann unter UV-Licht bei 325 µm für 30 Sek. fixiert.
Die Prä-Hybridisierung erfolgt bei 42 oC für 2 Stunden, in 5 ml Prä-Hybridisierungspuffer. Die
Hybridisierung erfolgt bei 42 oC über Nacht in 5 ml prä-Hybridisierungspuffer, der 50 ng
denaturierte Sonde enthältet. Als Sonde dient ein mit Digoxigenin markiertes Actin-Fragment.
Gewaschen wird die Membran dann je zweimal in 100 ml 0,5 x SSC bei RT und in 100 ml 0,1x
23
SSC bei 63 oC. Nach einem kurzen Pufferausgleich in Puffer 1 wird die Membran in Puffer 2 für 30
Min. bei RT inkubiert. Die Bindung der Antikörper erfolgt durch eine 30 minütige Inkubation in
Puffer2 plus 0,02% Antikörper bei RT. Die Membran wird dann 2 mal für je 15 Min. bei RT in
Puffer 1 gewaschen. Nach kurzer Äquilibrierung in Puffer 3 erfolgt die Farbentwicklung in 1 ml
Puffer 3, die 3,5 µl X-Phosphat und 4,5 µl NBT enthält, für mehrere Stunden bei RT.
Prä-Hybridisierung-Puffer
Böhringer Standard-Lösung plus 50% deionisiertes Formamid
TAE-Puffer
Tris-Acetat, 0,04 M; EDTA, 1 mM; pH 7,5
Das mit Digoxigenin markierte Aktin-Fragment wird durch PCR synthetisiert.
Dazu wird ein wenig Blattmaterial von dem Stamm Gus in 0,5 ml H2O gegeben, für eine Minute
stark gevortext und anschießend zentrifugiert. Der DNA-haltige Überstand dient dann als Template
der PCR. Für die PCR werden folgende Komponenten zusammengeführt:
H2O auf 25 µl auffüllenPCR-Puffer 1xMg2+ 1,5 mMNukleotide je 2 mM A, G, C, T und 0,3 mM Digoxigenin-U Primer Aktin-1 1 mMPrimer Aktin-2 1 mMTaq Polymerase 1UTemplate 1µl
Aktin-1: 5´-AGT TGT ATG TAG TCT CGT GGA TTC-3´
Aktin-2: 5´-ATG TAT GTT GCT ATT CAG GCT G-3´
Nach einer 2-minütigen initialen Inkubation bei 94oC erfolgt die Amplifikation durch 35 Zyklen:
Denaturierung bei 94 oC für 30 Sek.
Annealing bei 68 oC für 30 Sek.
Elongation bei 72 oC für 60 Sek.
24
Die PCR-Produkte werden auf einem 1% TAE-Agarrose-Gel kontrolliert.
Die Überprüfung der Digoxigenin-Markierung erfolgt durch Dot-Blot. Dazu werden die PCR-
Produkte in fünffachen Zentnerverdünnungen parallel zu denen der Kontrolle auf eine Membran
aufgetragen. Die Menge der Digoxigenin-markierten DNA in der Kontrolle ist bekannt. Nach dem
Trocknen der Membran erfolgt die Detektierung des Digoxigenins wie oben beschrieben. Die
relative Stärke der Signale der Proben im Verhältnis zu denen bei der Kontrolle ist ein Maß für die
Effizienz der Markierung.
2.1.5 Überprüfung der Expression des Gus-Gens
Die Expression des Gus-Gens wird durch Northern-Blot überprüft.
Je 1µg mRNA von beiden Stämmen wird auf einem MOPS-Gel aufgetrennt und geblottet. Als
Sonde dient dabei ein mit Digoxigenin markiertes Gus-Fragment (Dig-Gus). Zur Quantifizierung
der Stärke der Expression, werden auf dem Gel 0,3, 3 und 30pg Gus-Fragment in nicht markierter
Form parallel zu den mRNAs aufgetragen. Blot und Hybridisierung erfolgen wie beschrieben.
Die Probe Dig-Gus und das Gus-Fragment in nicht markierter Form werden durch RT-PCR erzeugt
(TitanTM One Tube RT-PCR-System, Firma Roche).
Als Template der RT-PCR dient die gesamte RNA von Stamm Gus. Die Zusammensetzung der
RT-PCR-Komponenten ist:
Dig-Gus Gus, nicht markiertesH2O auf 50 µl auffüllen auf 50 µl auffüllenRT-PCR-Puffer 1x 1xNukeotide 2 mM dNTPs und 0,3 mM Digoxigenin-U 2 mM dNTPs Primer Gus-1 1 mM 1 mMPrimer Gus-2 1 mM 1 mMDTT 2,5 µl 2,5 µlRNA Inhibitor 0,2 µl 0,2 µlReverse Transkriptase 1µl 1µlTaq Polymerase 1µl 1µlGesamte RNA von Gus 1,8 µl 1,8 µl
Gus-1: CGACGCTCACACCGATACCATC (Nt1347-1368)
25
Gus-2: CCATACCTGTTCACCGACGACG (Nt1647-1626)
Nach einer 2-minütigen initialen Denaturierung bei 94oC erfolgt die Amplifikation durch 35
Zyklen:
Denaturierung bei 94 oC für 30 Sek.
Annealing bei 68 oC für 30 Sek.
Elongation bei 68 oC für 60 Sek.
Die PCR-Produkte werden auf einem Gel kontrolliert. Die Überprüfung der Markierungseffizienz
erfolgt wie beschrieben durch Dot-Blot. Die Konzentration des nicht markierten Gus-Fragments
wird mittels Photometer bestimmt.
2.1.6 Synthese der cDNA
cDNA wird nach dem Prinzip des „SmartTM PCR cDNA Synthesis Kit“ von der Firma Clontech
synthetisiert.
2.1.6.1 Prinzip des „SmartTM PCR cDNA Synthesis Kit“
Das Prinzip des Kits wird im Abb. 2-1 schematisiert. Zur Synthese des ersten cDNA-Stranges
bindet man an den PolyA-Schwanz der mRNA einen Oligo(dT)-Anker-Primer. Die terminale
Transferase-Aktivität der reversen Transkriptase addiert eine zusätzliche Sequenz, vorzugsweise
Oligo(dC), an den neu hergestellten ersten Strang. Ein zweites Oligonukleotid, welches am 3´-
Ende Oligo(dG) trägt, bindet an das Oligo(dC). Die reverse Transkriptase verwendet dann dieses
Oligo(dG)-haltige Oligonukleotid als Template und füllt es zu doppelstrangiger DNA auf, daher
wird es auch „template-switch-oligonucleotide“ genannt. Dieses „template-switch-oligonucleotide“
und der Oligo(dT)-Primer enthalten außerdem die Primer-Sequenz für die PCR, durch die die
cDNA amplifiziert wird. Die Oligo(dC) wird am effizientesten an den Enden der vollständigen
ersten Stränge angehängt, daher ist der überwiegende Teil der synthetisierten cDNAs vollständig.
26
Abb. 2-1: Prinzip des SmartTM PCR cDNA Synthesis Kits
2.1.6.2 Synthese des ersten cDNA-Strangs
Folgende Komponenten werden zusammenpipettiert:
mRNA 1µl (500ng)OligodT-Anker-Adaptor 1µl (10pmol)Templat-Switch-Adaptor 1µl (10pmol)H2O 2µl
Die Komponenten werden kurz vermischt und zentrifugiert. Nach einer Inkubation bei 72 oC für 2
Min. werden die Reaktionsgefäße für 2 Min. auf Eis gestellt, bevor folgende Zutaten hinzugefügt
werden und die Ansätze für 1 Stunde bei 42 oC inkubiert werden:
Poly A RNAPoly A 3´5´
2. PCR- Primer
1. Oligo dT-Anker- Adaptor
12
Poly A 3´CCC
Poly A 3´CCCGGG3
3. Template-Switch-Adaptor
Ds cDNA
27
DTT 1µl (20µM)dNTPs 1µl (10µM)5x Puffer für die Erststrang-Synthese 2µl Power Script Reverse-Transkriptase 1µl
Die Adaptoren und Primer enthalten dabei die Erkennungssequenzen für Mbo1 (GATC) anstelle
der von Ras1 wie bei Clontech.
OligodT-Anker-Adaptor:
5´-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGATCT(30)N-1N-3´
N-1 = A, G oder C; N= A, G, C oder T
Template-Switch-Adaptor:
5´-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGATCGCGGG-3´
2.1.6.3 Amplifikation der cDNA durch PCR
Folgende Komponenten werden zusammengemischt:
H2O 80 µl 10x PCR-Puffer 10 µldNTPs 2µl (100
mM)PCR Primer 4µl (100µM)Polymerase Mix 2µlErststrang-cDNA 2µl
PCR Primer: 5´-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGA-3´
Die Amplifikation erfolgt nach folgendem Schema:
Initiate Denaturiering bei 94oC für 2 min.
dann 16 Zyklen bei:
28
Denaturiering bei 94 oC für 30 Sek.
Annealing bei 65 oC für 30 Sek.
und Elongation bei 68 oC für 6 Min.
Die synthetisierten cDNAs werden auf einem TAE-Gel kontrolliert.
2.1.7 Reinigung der cDNA
Man gibt gleiche Volumen von Chloroform/Isoamylalkohol zu den cDNAs, vermischt die Proben
durch Vortexen und zentrifugiert sie für 10 Min bei 13, 000g. Der Überstand wird erneut mit
Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und die cDNA dann in 2,5 Vol. Ethanol und 0,1 Vol. NaOAc
gefällt. Das cDNA-Pellet wird zweimal mit 75% Ethanol gewaschen und dann in H2O
aufgenommen.
2.1.8 Restriktion der cDNA
Folgende Bestandteile werden zusammengeführt:
cDNA 5µgMbo1 10 U10X Puffer 5 µlH2O auf 50 µl auffüllen
Die Restriktion erfolgt übernacht bei 37 oC. Die geschnittene cDNA wird dann auf einem Gel
kontrolliert, gereinigt und nach der Photometer-Messung auf 400 ng/ul eingestellt.
2.2 Genom-Subtraktion mittels SSH
Die Eignung der SSH zur Analyse differenzieller Genexpression in hoch komplexen Eukaryonten
wird am Beispiel von Kartoffeln verifiziert. Dazu wird zuerst SSH an Kartoffel-cDNA
durchgeführt, dann der Effekt dieser SSH-Subtraktion mittels Southern-Blot verifiziert, und
anschließend das SSH-Produkt durch 2D-Gel, Core-PCR und Sequenzierung analysiert.
2.2.1 SSH
29
SSH an Kartoffel-cDNA wird nach dem Prinzip des „PCR select cDNA Subtraction Kit“ der Firma
Clontech durchgeführt, mit geringfügiger Modifikation bezüglich der Adaptoren. Für SSHG/D dient
die mit Mbo1 geschnittene cDNA von Desiree als Driver, die geschnittene cDNA von Gus als
Tester. Für SSHD/D fungieren die cDNAs von Desiree als Tester und Driver zugleich.
2.2.1.1 Adaptoren/Primer
Die modifizierten Adaptor/Primer enthalten die Erkennungssequenzen von Mbo1, anstelle die von
Rsa1 wie bei Clontech (Abb. 2-2):
Abb. 2-2: Adaptoren/Primer der SSH naach Clontech
2.2.1.2 Ligation der Adaptoren an den Tester
Die Tester werden in zwei getrennten Ansätzen nach folgendem Schema mit den Adaptoren ligiert:
Ligation LT1 (Ligation Tester/Adaptor 1) LT2 (Ligation Tester-Adaptor 2)Adaptor 10 pmol Adaptor 1 10 pmol Adaptor 2 Tester-cDNA, geschnitten 100 ng 100 ng Ligase Puffer 1 x 1xLigase 200 U 200 UH2O auf 10µl auffüllen auf 10µl auffüllen
5´-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C TCG AGC GGC CGC CCG GGC AG-3´3´-GGC CCG TCC TAG-5´
5´-TCG AGC GGC CGC CCG GGC AGG A-3´
5´-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG-3´
5´-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C AGC GTG GTC GCG GCC GAG-3´
5´-AGC GTG GTC GCG GCC GAG GA-3´
3´-GC CGG CTC CTA G-5´
Adaptor 1
Adaptor 2
Primer 1
Nested Primer 2
Nested Primer 1
Mbo1
Mbo1
30
Je 2 µl von LT1 und LT2 ergeben zusammen den Ligationsansatz LT. Die Ligation erfolgt
übernacht bei 17oC. Der Erfolg der Ligation und der Effekt der Suppressions-PCR werden durch
PCR überprüft. Als Template dazu werden die Ligationsansätze 1:1000 verdünnt.
PCR P1LT1 P1LT2 P1LT Negative KontrollPCR-Puffer 1x 1x 1x 1xPrimer 1 10 pmol 10 pmol 10 pmol 10 pmolMg2+ 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mM dNTPs 2 mM 2 mM 2 mM 2 mMTemplate LT1, 1µl LT1, 1µl LT, 1µl H2O auf 25 µl auffüllen auf 25 µl auffüllen auf 25 µl auffüllen auf 25 µl auffüllen
Die anfängliche 5-minütige Inkubation bei 75oC in Abwesenheit von Polymerase dient zur
Abkoppelung der nicht ligierten, kürzeren Stränge der Adaptoren. 1 U Taq Polymerase wird dann
dazugegeben, um die längeren Adaptor-Stränge durch eine 10-minütigen Inkubation bei 72 oC zu
verdoppeln. Nach einer anfänglichen 3-minütigen Inkubation bei 94oC folgt die Amplifikation mit
27 Zyklen:
Denaturierung bei 94 oC für 30 Sek.
Annealing bei 66 oC für 30 Sek.
Elongation bei 72 oC für 90 Sek.
Die PCR-Produkte werden auf einem 1,5%igen TAE-Gel kontrolliert.
2.2.1.3 Subtraktive Hybridisierung
Die Subtraktion erfolgt durch zwei Hybridisierungsschritte. In der ersten Hybridisierung werden die
mit unterschiedlichen Adaptoren versehenen Tester in getrennten Ansätzen mit Überschuss an
Driver subtrahiert und die molare Konzentration verschiedener Tester-Fragmente ausgeglichen. Das
geschieht in folgendem Ansatz:
H1 H2Tester 1,5µl LT1 1,5µl LT2 Driver (geschnittene Desiree-cDNA) 1,5µl x 400 ng/µl 1,5µl x 400 ng/µl4X Hybridisierungspuffer 1 µl 1 µl
31
4X Hybridisierungspuffer
30mM Tris-HCl , pH8; 3mM EDTA, pH8; 2M NaCl
Nach einer 2-minütigen Denaturierung bei 98 oC werden die Proben für 7 Stunden bei 63 oC
inkubiert.
Kurz vom Ende der ersten Hybridisierung werden 100ng Driver in 1x Hybridisierungspuffer durch
eine 2-minütige Inkubation bei 98 oC denaturiert. Die beiden Ansätze der ersten Hybridisierung
werden dann ohne erneute Denaturierung in Anwesenheit des frisch denaturierten Drivers
zusammengeführt und bei 63 oC übernacht inkubiert. Um die unspezifischen Bindungen zu
vermindern, wird wenige Minuten vor Ende der zweiten Hybridisierung zu dem
Hybridisierungsansatz 90µl H2O zugegeben.
2.2.1.4 Amplifikation der SSH-Produkt mittels „Nested-PCR“
Die erste PCR erfolgt wie im 2.2.1.2 beschrieben, außer dass der zweite Hybridisierungsansatz
unverdünnt als Template fungiert.
Das Produkt der ersten PCR wird 1:10 verdünnt und als Template für die Nested-PCR verwendet.
Als Positive-Kontrolle wird verdünnte LT als Template verwendet.
Template 1µlPCR-Puffer 1xMg2+ 1,5 mMdNTPs 2 mMNested-Primer 1 und 2 10 pmol Taq Polymerase 1 UH2O auf 25 µl auffüllen
Nach einer anfänglichen 2-minütigen Denaturierung bei 94 oC folgen 12 Zyklen Amplifikation bei:
Denaturing bei 94 oC für 30 Sek.
Annealing bei 68 oC für 30 Sek.
Elongation bei 72 oC für 90 Sek.
32
2.2.2 Überprüfung der SSH-Produkte durch Southern-Blot
Mittels Southern-Blot wird überprüft, ob durch SSH die differentiell erprimierten Gene angereichert
wurden. Als Sonde dienen dabei die mit Digoxigenin markierten SSH-Produkte, die auf die cDNA
vom Tester und Driver hybridisiert werden.
Je 1µg geschnittene cDNA von beiden Stämme wird auf einem 1,2%igen TAE-Gel aufgetrennt.
Der Vakuum-Blot der cDNA auf die positiv geladenen Nylonmembranen erfolgt bei 60 Bar und 2
Stunden mit 0,4 M NaOH. Die Hybridisierung erfolgt wie oben beschrieben.
Die Markierung der SSH-Produkte wird mit einem „Random Primed DNA Labeling Kit“ der Firma
Roche durchgeführt.
Man mischt dabei 10µl (1µg) gereinigte SSHG/D-Produkte mit 2 µl Hexanukleotiden (10 µM), kocht
die Probe für10 Min und stellt sie sofort auf Eis. Anschließend gibt man folgende Komponenten
dazu und inkubiert die Proben für 15 Stunden bei 37 oC:
10X Dig-Labeling-Mix, 2µl
10X Random-Priming-Puffer, 2µl und
Klenow Enzym, 1µl
2.2.3 Analyse der SSHG/D-Produkte
Das SSHG/D-Produkt wird auf den 2D-Gelen aufgetrennt und das Fragment mit höchster DNA-
Konzentration dann mittels „Core-PCR“ erneut amplifiziert. Sequenzierung und das anschließende
Alignment der Sequenz mittels Blastn dient zur Klärung der Identität des SSH-Produktes.
2.2.3.1 2D-Gel Auftrennung
Zuerst werden 10 µl von dem durch PCR amplifizierten SSHG/D-Produkt wie herkömmlich nach
ihrer Größe auf einem 1,5%igen TAE-Agarose-Gel aufgetrennt. Der Gel-Streifen, auf dem sich das
SSH-Produkt befindet, wird ausgeschnitten und quer zur Laufrichtung an die Obererkante eines
zweiten 2%igen Agarrose-Gels angelegt und bei 1,5 V/cm übernacht aufgetrennt. Dieses 2. Gel
enthält einen Farbstoff (Bisbenzimid) von 1µg/ml, der vorzugsweise in AT-Clustern der DNA-
Helix interkaliert. Dieser Farbstoff wird durch eine kovalent gebundene Polyethylenglycol-Kette
(PEG) modifiziert. DNA-Fragmente gleicher Länge werden im zweiten Gellauf je nach AT-Gehalt
33
und damit je nach Menge des gebundenen Farbstoff-PEG-Konstruktes verschieden stark bei der
Wanderung im elektrischen Feld des Gels behindert. Der Farbstoff ist kommerziell erhältlich
(ehem. Hansa Analytik).
2.2.3.2 Core-PCR
Aus der Mitte des stärksten DNA-Signals wird ein kleines Stück aus dem 2D-Gel ausgestanzt und
in ein PCR-Reaktionsgefäß überführt. Die PCR wird anschließend wie in 2.2.1.4 (nur die zweite
PCR) beschrieben zwecks Reamplifikation durchgeführt.
2.2.3.3 Direkte Sequenzierung
Das Produkt der Core-PCR wird sequenziert (Auftragssequenzierung). Als Sequenzierungsprimer
dient einer der beiden Nested-Primer. Das Sequenzen-Alignment erfolgt mit der Software „Blastn“.
2.3 Überprüfung der DSC
DSC wird als eine sehr elegante Methode zur Genom-Subtraktion beschrieben. Jedoch wird diese
Methode bisher von keinem unabhängigen Forscher bestätigt, oder gar benutzt. Um das Prinzip von
DSC zu überprüfen, wird einerseits ein Modellversuch aus der DSC-Literatur wiederholt, und
anderseits das Prinzip der DSC an eukaryontischer cDNA getestet.
2.3.1 DSC am Beispiel eines Lambda-Fragments
In der Literatur wird effiziente Subtraktion durch DSC am Beispiel eines sehr einfachen
Modellsystems beschrieben. Sowohl der Tester als auch der Driver stammen dabei von dem selben
Lambda-Fragment. Der Tester würde durch den Driver subtrahiert, wodurch im DSC-Produkt
kein intakter Tester mehr vorhanden wäre, der durch PCR mit den Tester-Primer erneut amplifiziert
werden kann. Dieser Versuch wird wiederholt.
2.3.1.1 Vorbereitung des Tester/Driver
34
Zuerst wird 1 µg von der mit HindIII/EcoRI geschnittene Lambda-DNA auf einem 1%-igen TAE-
Agarose-Gel aufgetrennt und das 564 Bp-Fragment aus dem Gel eluiert, gereinigt, quantifiziert und
für die Ligation verwendet:
Ligation LT (Ligation-Tester) LD (Ligation-Driver)
Adaptor 10 pmol Tester-Adaptor 10 pmol Driver-Adaptor Lambda Fragment 1ng 1 ng Ligase Puffer 1 x 1xLigase 100 U 100 UH2O auf 10µl auffüllen auf 10µl auffüllen
Tester-Adaptor:
5´-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3´
3´-AGTGGCGTTCGA-5´
Driver-Adaptor:
5´-ACCGACGTCGACTATCCATGAACA-3´
3´-GTACTTGTTCGA-5´
Zur Herstellung eines Adaptors werden gleiche Mengen zweier Primer-Stränge zusammengeführt,
für 5 Min. bei 65 oC denaturiert, dann langsam auf 16 oC (in 4 Stunden) abgekühlt. Die Ligation
erfolgt für 2 Stunden bei 17 oC. Die längeren Stränge der Adaptoren fungieren auch als Primer zur
Synthese der Tester/Driver-Amplikons durch PCR:
T (Tester-Amplikon) D (Driver-Amplikon)Template 1µl LT 1µl LDPCR-Puffer 1x 1xMg2+ 1,5 mM 1,5 mMdNTPs 2 mM 2 mMPrimer 10 pmol Tester-Primer 10 pmol Driver-PrimerTaq Polymerase 1 U 1 UH2O auf 25 µl auffüllen auf 25 µl auffüllen
Nach der anfänglichen Denaturierung für 2 Min. bei 94 oC erfolgt die Amplifikation für 35 Zyklen
bei:
35
Denaturierung bei 94 oC für 1Min.,
Annealing bei 68 oC für 1 Min., und
Elongation bei 72 oC für 1 Min.
Nach der finalen Elongation bei 72 oC für 3 Min. werden die PCR-Produkte auf einem Gel
kontrolliert, die Tester- und Driver-Amplikons aus dem Gel eluiert und quantifiziert.
2.3.1.2 Subtraktive Hybridisierung
Die subtraktive Hybridisierung erfolgt bei 67 oC, in einem 0,5 M NaCl-haltigen Puffer für drei
Stunden, mit einem Tester/Driver-Verhältnis von 1:100 und einer Tester-Menge von 1 ng.
1 ng Tester und 100 ng Driver werden zusammen gereinigt, in 32 µl 3x EE Puffer ( 30 mM EPPS,
pH8; 3 mM EDTA) aufgenommen und mit Öl überschichtet. Nach einer 5-minütigen Denaturierung
bei 99 oC werden 8 µl 5M NaCl dazugegeben. Darauf folgt eine 3-stündige Inkubation bei 67 oC,
bevor die DNA erneut gereinigt und in 20 µl H2O aufgenommen wird. Die anschließende MBN-
Behandlung erfolgt für 30 Min bei 37 oC in:
DNA 20 µl MBN 10 U 10x Puffer 3µl H2O auf 30 µl auffüllen
Die MBN-Reaktion wird dann zweimal mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und 1µl der
DNA in 40 µl H2O überführt. Diese verdünnte DNA dient als Template für die PCR zur
Überprüfung der Subtraktion. Die restliche DNA wird erneut gereinigt und für die zweite
Subtraktion in 32 µl 3x EE Puffer aufgenommen. Insgesamt werden 3 Runden Subtraktion
durchgeführt.
2.3.1.3 Amplifikation der DSC-Produkte durch PCR
Die Amplifikation der DSC-Produkte durch PCR erfolgt mit dem gleichen PCR-Profil wie in
2.3.1.1 beschrieben (wie bei der Synthese der Tester-Amplikons).
36
2.3.2 DSC am Beispiel von Kartoffel-cDNA
Am Beispiel von Kartoffel-cDNA wird überprüft, ob differenzielle Genexpression in Eukaryonten
mit DSC analysiert werden kann.
2.3.2.1 Anwendung der DSC auf Kartoffel-cDNA
Die mit Mbo1 verdaute Desiree- cDNA dient dabei als Driver, die verdaute Gus-cDNA als Tester.
Zur Synthese der Tester/Driver-Amplikons wird folgende Ligation angesetzt:
Ligation LT (Ligation-Tester) LD (Ligation-Driver)
Adaptor 100 pmol Tester-Adaptor * 100 pmol Driver-Adaptor *DNA 100 ng geschnittene Gus-cDNA 100 ng geschnittene Desiree-cDNALigase Puffer 1 x 1xLigase 200 U 200 UH2O auf 10µl auffüllen auf 10µl auffüllen
* Die Adaptoren beinhalten die Erkennungssequenzen von Mbo1.
Tester-Adaptor:
5´-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3´
3´-AGTGGCGTCTAG-5´
Driver-Adaptor:
5´-ACCGACGTCGACTATCCATGAACA-3´
3´-GTACTTGTCTAG-5´
Die Ligation erfolgt übernacht bei 17 oC. Die PCR zur Synthese der Tester/Driver-Amplikons
erfolgt in 20 Zyklen, mit gleichen PCR-Profilen wie in 2.3.1 beschrieben.
Die Subtraktion erfolgt mit 100 ng Tester und 10 µg Driver. Die Zeit der Hybridisierung wird auf
12 Stunden verlängert. Insgesamt werden 4 Runden Subtraktion durchgeführt. Alle anderen
37
ungenannten Schritte erfolgen wie in 2.3.1 beschrieben.
2.3.2.2 Überprüfung der DSC-Produkte mittels Southern-Blot
Zwei Fragen sollen durch die Southern-Blots beantwortet werden: 1) ist das DSC-Produkt
spezifisch für den Tester? 2) Ist das Reporter-Target (Gus) noch in dem DSC-Produkt aufzufinden?
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden Informationen über die Effektivität der Subtraktion
sowie die Sensitivität der Detektion differenzieller Genexpression durch DSC liefern.
Zur Beantwortung der Frage 1 wird das durch Random-Priming mit Digoxigenin markierte DSC-
Produkt auf je 200 ng Tester- und Driver-cDNA hybridisiert.
Zur Beantwortung der Frage 2 wird das Dig-Gus ( 2.1) mit dem DSC-Produkt hybridisiert. Als
Positive Kontrolle werden 3 pg nicht markiertes Gus-Fragment parallel zu dem DSC-Produkt auf
das Gel aufgetragen.
2.3.2.3 Identifizierung des DSC-Produktes
Zur Identifizierung des DSC-Produktes wird dieses kloniert, einige positive Klone willkürlich
ausgewählt, deren Plasmide isoliert und die Inserts sequenziert.
Klonierung
Die DSC-Produkte werden mit dem „TOPO TA Cloning Kit for Sequencing“ Kit von der Firma
Invitrogen kloniert.
Die Ligation des DSC-Produktes und der Plasmide erfolgt in folgender Zusammensetzung:
Frische DSC-Produkte aus der PCR 1µlSalz (1,2 M NaCl, 0,06 M MgCl2) 1µl
Plasmide 1µlH2O 3µl
38
Die Probe wird für 30 Min bei RT inkubiert und dann sofort für die Transformation verwendet. 2µl
des Ligations-Ansatzes werden zu 50 µl frisch aufgetauten, kompetenten E.coli gegeben und für 10
Min. auf Eis gestellt. Dann wird 500 µl SOC-Puffer zu den Zellen gegeben und die Zellen bei 37 oC
für 50 Min inkubiert.
Die E. coli werden anschließend auf LB-Agarose-Platten, die 5mg/L Kanamycin enthalten,
ausplattiert und über Nacht bei 37 oC inkubiert.
Isolierung der Plasmide
Die meisten in Anwesenheit des Antibiotikums entstandenen Klone beinhalten auch Plasmide.
Einige Klone werden zufällig ausgewählt und in je 1,5 ml LB-Medium mit 5 mg/L Kanamycyn bis
zum Ende der Log-Phase kultiviert.
Die Bakteriensuspension werden kurz zentrifugiert, mit PBS-Puffer gewaschen, in 100 µl RNase H-
haltigem GTE Puffer erneut suspendiert und für 5 min. bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 200 µl
NaOH/SDS werden die Proben durch leichtes Schütteln vermischt und für 5 min. auf Eis gestellt,
dann 150 µl PAS-Puffer zugegeben, durch kurzes Vortexen vermischt und erneut für 5 min. auf Eis
gelagert.
Nach der Zentrifugation bei 13,000 g für 20 min. wird der Plasmid-haltige Überstand zweimal mit
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (50:48:2) extrahiert und dann mit Ethanol gefällt. Nach
zweimal Waschen mit 75% Ethanol werden die Plasmide-Pellets in je 10 µl H2O aufgenommen.
RNAase H haltiger GTE-Puffer
50 mM Glucose; 25 mM TrisHCl, pH8; 10 mM EDTA; 0,1 µg/µl RNase H
NaOH/SDS
0,18 N NaOH; 1% SDS
PAS-Puffer
29,5 ml Essigsäure, mit KOH-Plättchen auf pH4,8 einstellen, mit H2O auf 100 ml auffüllen.
Sequenzierung
39
Die Sequenzierung der Inserts wird als Auftragsarbeit vergeben. Als Sequenzierungsprimer dienen
die T7- oder SP6-Sequenzen im Plasmide. Das Sequenz-Alignment erfolgt mit der Software Blastn.
2.4 Suche nach der Ursache des Versagens der DSC
Die Wiederholung des DSC-Modellversuches ist misslungen. Auch DSC am Beispiel von
Kartoffel-cDNA zeigt keinerlei Effekt der Subtraktion. Verschiedene Faktoren, darunter die MBN-
Aktivität und die Adaptoren, werden überprüft, um herauszufinden, was für das Nichtfunktionieren
der DSC ursächlich ist.
2.4.1 Überprüfung der MBN-Aktivität
Um festzustellen, ob die fehlende MBN-Aktivität für das Versagen der DSC verantwortlich ist,
wird die MBN-Aktivität überprüft:
Zwei Ansätze, je 8 µl (100 ng) gereinigte DNA (die überschüssigen DSC-Tester aus 2.3.1) werden
in Gefäße gegeben: Die Probe 1 bleibt unbehandelt; die Probe 2 wird für 2 Min denaturiert und
sofort auf Eis gestellt, dann 1µl 10x MBN-Puffer und 1µl (0,1 U) MBN zugegeben. Die MBN-
Behandlung erfolgt für 10 Min. bei 37 oC.
Der Effekt der MBN-Behandlung wird auf einem Gel kontrolliert.
2.4.2 Überprüfung des Zusammenhanges zwischen dem Aufbau der Adaptoren und der
Funktionalität der DSC
Es wird die Hypothese aufgestellt, dass die fehlende Funktionalität der DSC mit dem Design der
Adaptoren zusammenhängt. Zur Überprüfung dieser Hypothese wird ein Modellsystem entwickelt,
wobei zugleich zwei Tester, die sich nur durch ihre Adaptoren voneinander unterscheiden, von
einem Driver zu subtrahieren versucht werden.
Das DSC-Driver-Amplikon von 2.3.1 dient erneut als Driver. Das DSC-Tester-Amplikon von 2.3.1
und ein zweiter Tester werden zusammen im gleichen Reaktionsgefäß zu subtrahieren versucht.
Der neue Tester besteht aus dem 564 Bp Lambda-Fragment sowie je 11 Bp Überhang an seinen
beiden Enden. Der Tester-Überhang in den Heterohybriden beträgt bei der DSC 24 Bp, bei der
Subtraktion mit dem neuen Tester ist er jedoch mit 11 Bp viel kürzer.
40
Der zweite Tester, der wegen seiner im Vergleich zum DSC-Tester kürzeren Sequenz als Tk
bezeichnet wird, wird durch „Nested-PCR“ hergestellt. Dazu werden folgende Primer verwendet:
Tk1L
5´- CAGAGAGTCGAAGCTTTAGAGCGATTTATCTTCTG -3´
Tk2L
5´- CAGAGAGTCGA AGC TTT CCT GAC GGA ATG TTA ATT -3´
Tk1
5´- CAGAGAGTCGAAGCTTTAGAGC -3´
Tk2
5´- CAGAGAGTCGAAGC TTT CCT GAC -3´
Wobei die unterstrichenen Teile der Primer den 11 Bp Tester-Überhängen in den Heterohybriden
entsprechen. Die nicht unterstrichenen Teile der Primer stammen von den Sequenzen des Lambda-
Fragmentes.
Die erste PCR erfolgt in folgendem Ansatz:
Template 1 ng Lambda-FragmentPCR-Puffer 1xMg2+ 1,5 mMdNTPs 2 mMPrimer Tk1L, Tk2L, je 10 pmolTaq Polymerase 1 UH2O auf 25 µl auffüllen
Nach der anfänglichen Denaturierung für 2 Min. bei 94 oC erfolgt die Amplifikation für 5 Zyklen
bei:
Denaturierung bei 94 oC für 1Min.,
41
Annealing bei 68 oC für 1 Min., und
Elongation bei 72 oC für 1 Min..
Das Produkt der ersten PCR dient als Template für die zweite PCR:
Template 0,5 µl PCR-Produkt aus erster PCRPCR-Puffer 1xMg2+ 1,5 mMdNTPs 2 mMPrimer Tk1, Tk2, je 10 pmolTaq Polymerase 1 UH2O auf 25 µl auffüllen
Nach der anfänglichen Denaturierung für 2 Min. bei 94 oC erfolgt die Amplifikation für 30 Zyklen
bei:
Denaturierung bei 94 oC für 1Min.,
Annealing bei 68 oC für 1 Min., und
Elongation bei 72 oC für 1 Min..
Das PCR-Produkt Tk wird auf einem Gel kontrolliert, aus dem Gel eluiert und mittels Photometer
quantifiziert. Je 1ng von Tk und DSC-Tester-Amplikon sowie 100 ng DSC-Driver-Amplikon
werden zusammengeführt, mit Ethanol gefällt und in 32 µl 3x EE Puffer aufgenommen. Die
weiteren Schritte der Subtraktion sind wie bei der DSC beschrieben.
Die erneute Amplifikation des Produktes der Tk-Subtraktion erfolgt wie oben beschrieben mittels
einer PCR.
2.5 Entwicklung der NSC
Nachdem gezeigt wurde, dass die fatale Schwäche der DSC auf deren Adaptoren/Primer
zurückgeht, werden entsprechende neue Adaptoren/Primer für eine effiziente Subtraktion
konstruiert. Das daraus resultierende neue Subtaktionssystem mit innovativen Adaptoren/Primern
wird später als NSC (Negative Subtraktion Chain) bezeichnet.
NSC und DSC unterscheiden sich lediglich durch deren Adaptoren/Primer. Für NSC werden die
42
folgenden Adaptoren/Primer konstruiert:
NSC-Tester-Adaptor (BamH1):
A-Ta: 5´-CAGTCAGAGAGCTCTCACA-3´
A-b: 3´-GAGAGTGTTCGA-5´
NSC-Tester-Primer (BamH1):
P-T: 5´-CAGTCAGAGAGCTCTCACAAGCT-3´
NSC-Driver-Adaptor (BamH1):
A-Da: 5´-GACACTCTCACCTCTCACA-3´
A-b: 3´-GAGAGTGTTCGA-5´
NSC-Driver-Primer (BamH1):
P-D: 5´-GACACTCTCACCTCTCACAAGCT-3´
NSC und DSC werden in parallelen Ansätzen am Beispiel des 564 Bp Lambda-Fragments
überprüft. Abgesehen von den unterschiedlichen Sequenzen der Adaptoren/Primer erfolgen alle
Schritte der Subtraktion in gleicher Weise und wie in 2.3.1 beschrieben.
2.6 Subtraktion mittels SSH/NSC (SNH)
Die beiden Techniken, SSH und NSC, werden zur Analyse differenzieller Genexpression in
Eukaryonten kombiniert. Die Idee, auf der diese Kombination beruht, ist, zuerst mittels SSH das
Target anzureichern, dann mittels NSC den restlichen Hintergrund zu eliminieren. Das Prinzip der
SNH (subtraktive, negative Hybridisierung), wird am Beispiel von Kartoffel-cDNA überprüft.
Ferner wird die Sensitivität der Detektion differenzieller Genexpression in Eukaryonten durch SNH
festgestellt, und diese Methode bezüglich der Effektivität der Subtraktion sowie der Sensitivität der
Detektion optimiert.
2.6.1 Subtraktion mittels SNH am Beispiel Kartoffel-cDNA
Am Beispiel von Kartoffel-cDNA wird das Prinzip der SNH überprüft. Als Driver dient dabei die
Desiree-cDNA, als Tester die Gus-cDNA. Die Identität des SNG/D-Produktes wird durch Southern-
Blot, Klonierung und Sequenzierung festgestellt.
43
2.6.1.1 SNH am Beispiel von Kartoffel-cDNA
SNG/D und SNH D/D werden parallel durchgeführt. SNG/D verwendet die Gus-cDNA als Tester, die
Desiree-cDNA als Driver. SND/D benutzt die Desiree-cDNA als Tester und Driver zugleich. Zur
besseren Übersicht wird lediglich SNG/D ausführlich beschrieben. SND/D erfolgt auf analoge Weise.
Die SNH beinhaltet drei Schritte:
1) SSH;
SSHG/D und SSH D/D werden zuerst parallel durchgeführt und die SSH-Produkte durch die erste
PCR amplifiziert.
2) Adapter-Austausch
Von den SSH-Produkten werden die SSH-Adaptor-Sequenzen mittels Endonuklease abgetrennt und
durch Ligation und PCR auf deren Stelle mit den NSC-Adaptoren erneut versehen.
und 3) NSC
Als Tester der NSC dienen die Produkte von SSHG/D, die mit dem Tester-Adaptor der NSC versehen
werden. Als Driver dienen die Produkte von SSHD/D, die mit dem Driver-Adaptor der NSC versehen
werden.
SSH
Zwei SSH-Ansätze werden zuerst parallel durchgeführt. Die Gus-cDNA fungiert bei SSHG/D als
Tester, die Desiree-cDNA als Driver. Die Desiree-cDNA fungiert bei SSH D/D als Tester und Driver
zugleich. Die SSH-Produkte werden durch die erste PCR amplifiziert.
Alle Adaptoren/Primer beinhalten die Erkennungssequenzen von Mbo1.
Zur Herstellung der Tester wird folgende Ligationsreaktion angesetzt:
Ligation LG1 LG2 LD1 LD2Adaptor 10 pmol Adaptor 1 10 pmol Adaptor 2 10 pmol Adaptor 1 10 pmol Adaptor 2Gus-cDNA,
geschnitten
100 ng 100 ng
Desiree-cDNA,
geschnitten
100 ng 100 ng
44
Ligation LG1 LG2 LD1 LD2Ligase Puffer 1 x 1 x 1 x 1 x Ligase 200 U 200 U 200 U 200 UH2O auf 10µl auffüllen auf 10µl auffüllen auf 10µl auffüllen auf 10µl auffüllen
Je 2 µl von LG1 und LG2 zusammen ergeben das LG. Je 2 µl von LD1 und LD2 zusammen
ergeben das LD. Die Ligation erfolgt über Nacht bei 17oC. Der Erfolg der Ligation wird wie in 2.2
beschrieben durch PCR kontrolliert.
Das Tester/Driver-Verhältnis bei der ersten Hybridisierung beträgt 1:80, mit einer Tester-Menge
von 10 ng:
erste Hybridisierung LG1/D LG2/D LD1/D LD2/DTester LG1, 1µl LG2, 1µl LD1, 1µl LD2, 1µlDriver (geschnittene
Desiree-cDNA)
2µl x 400 ng/µl 2µl x 400 ng/µl 2µl x 400 ng/µl 2µl x 400 ng/µl
4X Hybridisierungspuffer 1 µl 1 µl 1µl 1 µl
Nach einer Denaturierung bei 98 oC für 2 Min. werden die Proben bei 63 oC für 1,5 Stunden
inkubiert.
Kurz vor Ende der ersten Hybridisierung werden 2 parallele Ansätze von 300ng Driver in 1µl
Hybridisierungspuffer bei 98 oC für 2 Min. denaturiert. Die beiden Ansätze der ersten
Hybridisierung (LG1/D und LG2/D für SSHG/D; LD1/D und LD2/D für SSHD/D) werden dann ohne
erneute Denaturierung in Anwesenheit des frisch denaturierten Drivers zusammengeführt und bei
63oC über Nacht inkubiert. 90µl H2O werden wenige Minuten vor dem Ende der Inkubation zu den
Ansätzen hinzugegeben.
Die Amplifikation der SSH-Produkte erfolgt durch die erste PCR:
Erste PCR SSHG/D SSHD/D Negative KontrolleTemplate 1µl der zweiten
Hybridisierung SSHG/D
1µl der zweiten
Hybridisierung SSHD/D
PCR-Puffer 1x 1x 1x
45
Erste PCR SSHG/D SSHD/D Negative KontrolleMg2+ 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mMdNTPs 2 mM 2 mM 2 mMPrimer1 20pmol 20pmol 20pmol Taq
Polymerase
1 U 1 U 1 U
H2O auf 50 µl auffüllen auf 50 µl auffüllen auf 50 µl auffüllen
Das angewendete PCR-Profil ist wie in 2.2 beschrieben.
Adaptor-Austausch
In diesem Schritt werden die SSH-Adaptoren der SSH-Produkte durch die NSC-Adaptoren
ausgetauscht. Zuerst werden je 40 µl SSH-Produkt mit Chloroform/Isoamyalkohol extrahiert, mit
Ethanol gefällt und erneut in je 40 µl H2O aufgenommen. Die Restriktion der SSH-Adaptoren
erfolgt übernacht bei 37 oC in folgenden Ansätzen:
gereinigte SSH-Produkte SSHG/D, 40 µl SSHD/D, 40 µlMbo1 10 U 10 U10X Puffer 5 µl 5 µlH2O auf 50 µl auffüllen auf 50 µl auffüllen
Die geschnittenen SSH-Produkte werden erneut mit Chloroform/Isoamyalkohol extrahiert, mit
Ethanol gefällt und in je 15 µl H2O aufgenommen. Die Ligation der NSC-Adaptoren erfolgt
übernacht bei 17 oC in folgenden Ansätzen:
Ligation LT LDNSC-Adapter 10 pmol Tester-Adaptor 20 pmol Driver-AdaptorSSH-Produkt, geschnitten 2 µl SSHG/D 4 µl SSHD/D
Ligation Puffer 1 x 1xLigase 200 U 400 UH2O auf 10µl auffüllen auf 20µl auffüllen
Die Tester/Driver-Amplikons für NSC werden durch PCR synthetisiert:
46
Amplikon NSC-Tester NSC-Driver Negative Kontrolle der PCRTemplate 1µl LT 5µl LDPCR-Puffer 1x 1x 1xMg2+ 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mMdNTPs 2 mM 2 mM 2 mMPrimer NSC-Tester-Primer NSC-Driver-Primer NSC-Tester/Driver-PrimerTaq Polymerase 1 U 5U 1 UH2O auf 25 µl auffüllen auf 125 µl auffüllen auf 25 µl auffüllen
Nach der anfänglichen Denaturierung bei 94 oC für 2 Min. erfolgt die Amplifikation für 15 Zyklen
bei
94 oC, 1Min.
68 oC, 30 Sek. und
72 oC , 90 Sek.
Die PCR-Produkte werden auf einem Gel kontrolliert.
NSC
1µl Tester- und 100 µl Driver-Amplikons werden zusammengeführt, mit
Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, mit Ethanol gefällt und dann in 4 µl NSC -Puffer
aufgenommen. Die Probe wird mit Öl überschichtet und für 5 Min. bei 100 oC denaturiert. Das
Reannealing erfolgt in 12 Stunden bei 63 oC. Einige Minuten vom Ende der Inkubation werden 36
µl H2O zugegeben.
NSC -Puffer
10 mM EPPS, pH8; 1 mM EDTA; 0,5 M NaCl
Der Hybridisierungsansatz wird dann zweimal mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und mit
Ethanol gefällt. Das DNA-Pellet wird in 20 µl H2O aufgenommen. Die MBN-Behandlung bei 37oC
für 30 Min erfolgt in folgendem Ansatz:
Gereinigte DNA 20 µlMBN 5 U
47
Gereinigte DNA 20 µl10X Puffer 3µlH2O auf 30 µl auffüllen
Nach der MBN-Behandlung wird die DNA erneut zweimal mit Chloroform/Isoamylalkohol
extrahiert. 1 µl dieser behandelten DNA wird in 20 µl H2O überführt und dient als Template für die
PCR zur Überprüfung der Subtraktion. Die restliche DNA wird mit Ethanol gefällt und für die
weitere Subtraktion in 4 µl NSC-Puffer aufgenommen. Es werden insgesamt drei Runden
Subtraktion durchgeführt.
Die Amplifikation der NSC-Produkte erfolgt in folgenden Ansätzen:
NSC1 NSC2 NSC3 Negative Kontrolle
Verdünntes NSC-
Produkt als Template
1µl nach der ersten
Subtraktionsrunde
1µl nach der zweiten
Subtraktionsrunde
1µl nach der dritten
Subtraktionsrunde
PCR-Puffer 1x 1x 1x 1xMg2+ 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mMdNTPs 2 mM 2 mM 2 mM 2 mMTester-Primer 10 pmol 10 pmol 10 pmol 10 pmolTaq Polymerase 1 U 1 U 1 U 1 UH2O auf 25 µl
auffüllen
auf 25 µl
auffüllen
auf 25 µl
auffüllen
auf 25 µl auffüllen
Nach einer anfänglichen Denaturierung bei 95 oC für 2 Min. erfolgt die Amplifikation in 30 Zyklen
bei
94 oC, 30 Sek.
68 oC, 30 Sek.
72 oC, 90 Sek.
2.6.1.2 Verifizierung der SNG/D-Produkte mittels Southern-Blot
Zwei Fragen sollen durch die Southern-Blots beantwortet werden: 1) Ist das SNG/D-Produkt
spezifisch für den Tester? und 2) Ist das Reporter-Target (Gus) noch unter den SNG/D-Produkten
aufzufinden? Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden Informationen über die Effektivität der
Subtraktion sowie die Sensitivität der Detektion differenzieller Genexpression durch SNH liefern.
48
Zur Frage 1 wird das durch Random-Priming mit Digoxigenin markierte SNH-Produkt auf je 200
ng Tester- und Driver-cDNA hybridisiert.
Zur Frage 2 wird das Gus- Gen durch PCR mit Digoxigenin markiert und auf das SNG/D-Produkt
hybridisiert, um die Sensitivität der SNH-Technik zu ermitteln.
Das Gus-Gen von E.coli ist insgesamt 1812 Bp lang. Ein 1632 Bp langes markiertes Gus-Fragment
wird durch PCR erzeugt (Dig-Gus-voll). Alle Mbo1-Fragmente des Gus-Genes sind in dem Dig-
Gus-voll repräsentiert.
PCR Dig-Gus-voll
Template 10 ng Gus-cDNA, unverdaut
PCR-Puffer 1xMg2+ 1,5 mMNTPs 2 mM dNTPs + 0,5mM Dig-UPrimer Je 10 pmol von GusvV und GusvRTaq Polymerase 1 UH2O auf 25 µl auffüllen
GusvV: 5´-TGT GGG CAT TCA GTC TGG ATC-3´ Nt53-73
GusvR: 5´-TCA CCG AAG TTC ATG CCA GTC-3´ Nt1784-1764
Nach einer anfänglichen Denaturierung bei 95 oC für 2 Min. erfolgt die Amplifikation in 35
Zyklen:
94 oC, 30 Sek.
64 oC , 30 Sek.
72 oC , 3 Min.,
sowie eine finale Elongation für 5 Min. bei 72 oC.
2.6.1.3 Identifizierung des SNG/D-Produktes durch Klonierung und Sequenzierung
Zur Identifizierung des SNG/D-Produktes wird dieses kloniert, dann 15 positive Klone zufällig
49
ausgewählt, daraus die Plasmide isoliert und Sequenziert. Die Durchführung ist wie in 2.3.2.3
beschrieben.
2.6.2 Untersuchung der Sensitivität der Detektion differenzieller Genexpression in Kartoffeln
durch SNH
Um die Sensitivität der SNH zu bestimmen, wird diese an dem Modell-Tester getestet, der ein
künstliches Target in verschiedenen bekannten Konzentrationen beinhaltet.
2.6.2.1 Vorbereitung des künstlichen Targets
Das 301 Bp Gus-Fragment (ein PCR-Produkt wie in 2.1), das zwei Mbo1-Erkennungssequenzen
beinhaltet, wird mit Mbo1 geschnitten:
Gus (301 Bp) Ca 500 ngMbo1 10 U10x Puffer 1µlH2O auf 10 µl auffüllen
Die Mbo1-Verdauung erfolgt übernacht bei 37 oC. Es entsteht dabei ein 244 Bp Fragment (Gm),
das an seinen beiden Enden die Mbo1-Erkennungssequenzen besitzt.
Die geschnittenen Gus-Fragmente werden auf einem Gel kontrolliert und das 244 Bp Gm aus dem
Gel eluiert, gereinigt und quantifiziert.
2.6.2.2 SNH
Als künstliches Target dient Gm in unterschiedlichen bekannten Mengen. Als Driver dient die
cDNA von Desiree. Die SSH-Tester, die den Driver sowie 0, 20, 100 oder 500 ppm von Gm
enthalten, werden durch Ligation hergestellt:
künstliche Tester Desiree-cDNA
mit 0 ppm Gm
Desiree-cDNA
mit 20 ppm Gm
Desiree-cDNA
mit 100 ppm Gm
Desiree-cDNA
mit 500 ppm GmDesiree-cDNA,
geschnitten
100 ng 100 ng 100 ng 100 ng
Gm - 2 pg 10 pg 50 pgSSH-Adaptor1/2 10 pmol 10 pmol 10 pmol 10 pmol
50
künstliche Tester Desiree-cDNA
mit 0 ppm Gm
Desiree-cDNA
mit 20 ppm Gm
Desiree-cDNA
mit 100 ppm Gm
Desiree-cDNA
mit 500 ppm Gm Ligase Puffer 1 x 1 x 1 x 1 x Ligase 200 U 200 U 200 U 200 UH2O auf 10µl
auffüllen
auf 10µl auffüllen auf 10µl
auffüllen
auf 10µl auffüllen
Die Subtraktion sowie die Identifizierung der SNH-Produkte erfolgen wie in 2.6.1 beschrieben.
2.6.3 Optimierung der SNH
Es werden Experimente durchgeführt, um SNH bezüglich der Art der angewendeten Exonuklease,
der optimalen MBN-Konzentration sowie der geeignetsten Adaptoren zu optimieren.
2.6.3.1 Exonuklease 7 anstelle von MBN für NSC
Überprüft wird es, ob Exonuklease VII anstelle von MBN für NSC verwendet werden kann. Dies
wird einerseits am Beispiel des Lambda-Fragments, andererseits am Beispiel der Kartoffel-cDNA
überprüft. NSCs werden entweder mit 5 U/Reaktion MBN oder gleicher Menge Exonuklease 7
parallel durchgeführt. Die meisten Schritte sind wie in 2.5 und in 2.6.2 beschrieben, außer dass bei
der NSC mit Exonuklease7 die DNA-Reinigungsschritte vor den Exonuklease-Behandlungen
übergangen werden.
2.6.3.2 Optimierung der MBN-Menge
Eine ausreichende MBN-Konzentration ist unentbehrlich zur effizienten Subtraktion durch SNH,
zugleich jedoch deradiert hoch konzentrierte MBN dsDNA. Dadurch wird die Sensitivität der
Detektion differenzieller Genexpression negativ beeinflusst. Gesucht wird deshalb die optimale
MBN-Konzentration für SNH.
SNH mit unterschiedlichen MBN-Konzentrationen
Überprüft werden 0,05, 0,5 und 5 U MBN pro Reaktion. NSC erfolgt wie in 2.5.2 beschrieben mit
unterschiedlichen Mengen von MBN. Das Ausgangesmaterial für NSC sind die mit den NSC-
Adaptoren versehenen SSH-Produkte.
51
Die Sensitivität der SNH-Detektion und die angewendeten MBN-Konzentrationen
Der Zusammenhang zwischen der Sensitivität der SNH-Detektion und der dabei angewendeten
MBN-Konzentrationen wird durch Southern Blot überprüft. Als Sonde dient das Reporter-Target,
das mit Digoxigenin markierte Gus-Gen (2.6.2.2). Hybridisiert wird die Sonde auf die gleichen
Mengen von SNH-Produkten, bei denen unterschiedliche Mengen von MBN eingesetzt werden.
Die Effektivität der Subtraktion und die angewendeten MBN-Mengen
Die SNH-Produkte bei 5 U MBN sind spezifisch für den Tester. Durch Dot-Blot wird dann
überprüft, welcher Anteil der SNH-Produkte bei 0,5 U MBN für den Tester spezifisch ist.
Zwei Dot-Blots werden parallel durchgeführt. Als Sonde dienen dabei die cDNAs von Gus oder
Desiree, die durch Random-Priming mit Digoxigenin markiert werden. Hybridisiert wird auf 30
denaturierte Plasmid-DNA-Proben, die zufällig aus den klonierten SNH-Produkten bei 0,5 U
MBN/Reaktion ausgewählt werden. Je 1,5 µl Plasmid-DNA und 0,2 M NaOH werden dabei
vermischt, und je 1µl parallel auf zwei Membranen gedottet.
2.6.3.3 neue Adaptoren für SNH
Es wird ein Versuch durchgeführt, um neue Adaptoren zu konstruieren, die zugleich die Adaptor-
Sequenzen für SSH und NSC beinhalten, was den umständlichen Adaptor-Austausch überflüssig
macht. Dazu werden folgende Primer eingesetzt:P1T: 5´-CTAATACGACTCACTATAGGGCCAGTCAGAGAGCTCTCACA -3´
P2T: 5´-GAGTAGTCATAGTCAGTGCTGACAGTCAGAGAGCTCTCACA -3´
P1D: 5´-CTAATACGACTCACTATAGGGCGACACTCTCACCTCTCACA -3´
P2D: 5´-GAGTAGTCATAGTCAGTGCTGAGACACTCTCACCTCTCACA -3´
p1: 5´-CTAATACGACTCACTATAGGGCCAG -3´
p2: 5´-GAGTAGTCATAGTCAGTGCTGACAG -3´
Die SSH-Adaptoren werden durch Annealing komplementärer Primer-Sequenzen hergestellt:
SSH-Tester-Adaptor 1 SSH-Tester-Adaptor 2 SSH-Driver-Adaptor 1 SSH-Driver-Adaptor 2P1T/A-b P2T/A-b P1D/A-b P2D/A-b
Die Kontrolle des Suppressions-PCR-Effekts und der Erfolg der Ligation erfolgt wie in 2.2.1.2
beschrieben, mit P1 und P2 anstelle von nur P1 als Primer für PCR. Die Annealing-Temperatur der
Primer liegt bei 69 oC. Sequenzen der Primer A-b siehe 2.5.
52
2.7 Die Logik der Methodenentwickelung
Abb. 2-3: Die Entwickelung der SNH
Zusammenfassend lässt sich die Logik der Methodenentwickelung so darstellen: Beim Fehlschlag
der SSH/2D zur Identifizierung differenzieller Genexpression in Solanum wurde beabsichtigt, die
SSH und DSC zu kombinieren. Beim Misserfolg zur Etablierung der DSC wurde dann die genaue
Ursache dieser Fehlfunktion gesucht, gefunden und entsprechend korrigiert, daraus wurde ein
effizientes Subtraktionssystem namens NSC entwickelt. SSH und NSC wurden dann zu dem
Lösungsweg SNH kombiniert. Die Eignung und Sensitivität der SNH zum Detektieren
differenzieller Genexpression wurde anhand der Solanum-cDNA bestimmt. Ferner wurden
Optimierungsversuche betrieben, die die Sensitivität der SNH steigeren, oder ihre Durchführung
vereinfachen sollten.
SSH/2D-Gel an cDNA aus Solanum
Überprüfung des Prinzips der DSC
Suche nach der Schwachstelle der DSC
Überprüfung des Prinzips der NSC
SSH DSC
Entwicklung der NSC
Bestimmung der Sensitivität zum Detektieren differenzieller Genexpression mittels SNH
Anwendung verschiedener MBN-Mengen zur Optimierung der Sensitivitität der Detektion und der Effektivität der Subtraktion
MBN durch Exonuklease VII ersetzen: Optimierung der Sensitivität und des Arbeitsaufwandes
Konstruktion neuer Adaptoren und Primer
Überprüfung des Prinzips der SNH an cDNA aus Solanum
Kombination der SSH/NSC
53
3. Ergebnisse
3.1 Vorbereitung des Tester/Drivers zur Genom-Subtraktion
Dieser Teil der Arbeit dient zur Vorbereitung und Charakterisierung der Solanum-cDNA als Tester
und Driver der Genom-Subtraktion.
3.1.1 Isolierung der Gesamt-RNA
Die Gesamt-RNA wird mit der Guanidinium/Phenol-Methode aus jungen Blättern der Kartoffeln
von beiden Stämmen isoliert.
Abb.3-1: Gesamt-RNA aus jungen Blättern der Kartoffeln.
Aufgetrennt auf einem 1% MPOS-Gel ist die gesamt-RNA von beiden Stämme rein optisch nicht
voneinander zu unterscheiden. Die Gesamt-RNA zeigt sich dabei als ein Schmier mit mehreren
starken Banden. Der Schmier enthält bis zu 20-30,000 verschiedene mRNA-Sequenzen, meist in
niedrigen Konzentrationen. Die starken Banden sind dagegen den rRNA-Sequenzen zuzurechnen.
In den Blättern der Kartoffeln haben die rRNAs sowohl eukaryontische als auch prokaryontische
(aus den Chloroplasten) Ursprünge. Dass die Menge von 28S rRNA mehr als die doppelte von 18S
rRNA beträgt, deutet auf die gute Qualität der Gesamt-RNA hin. Aus je 5 g jungen Blättern werden
dabei 8-10 mg gesamt-RNA gewonnen.
28S rRNA, 4800 Basen
18S rRNA, 1800 Basen
54
3.1.2 Anreicherung der mRNA
mRNA wird mit Oligo(dT)-Zellulose angereichert. Der letzte Wasch-Puffer enthält 0,15 M NaCl .
Aus 1,5 mg gesamt-RNA gehen dabei ca. 25-30 µg mRNA hervor.
Abb.3-2: mRNA aus Blättern der Kartoffeln.
Aufgetrennt auf einem MPOS-Gel sind die mRNAs von beiden Stämmen rein optisch voneinander
nicht zu unterscheiden. Die mRNA zeigt sich als ein Schmier ohne ausgeprägte starke Banden, wie
es bei der gesamt-RNA der Fall ist. Die rRNA-Sequenzen sind sichtbar vermindert worden.
3.1.3 Überprüfung der Intaktheit der mRNA
Die Intaktheit der mRNA wird mittels Northern-Blot überprüft.
Abb.3-3: Überprüfung der Intaktheit der mRNA.
Dig-Aktin wird hybridisiert auf: 1. Gus-mRNA; 2. Desiree-mRNA.
Je 0,5µg mRNA von beiden Stämmen werden auf einem MOPS-Gel aufgetrennt, geblottet und mit
dem mit Digoxigenin markierten Aktin-Fragment hybridisiert. Die klaren und starken Signale bei
beiden mRNAs weisen auf die Intaktheit der mRNA hin (Abb.3-3).
Als Sonde dient dabei ein mit Digoxigenin markiertes Aktin-Fragment.
1 2
55
Abb.3-4: PCR-markiertes Dig-Aktin. 1. Größenstandards; 2.Dig-Actin.
Die Markierung der Dig-Aktin erfolgt während der PCR-Anreicherung des 650 Bp langen Aktin-
Fragments aus Kartoffel-DNA (Abb.3-4).
Die Markierungseffizienz des Dig-Aktins wird durch Dot-Blot ermittelt.
Abb.3-5: Dot-Blot zur Ermittelung der Markierungseffizienz bei Dig-Aktin. 1. Dig-Aktin; 2.
Kontrolle. a-e, unverdünnt, sowie 1: 10, 1:100, 1:1000, 1:1000 Verdünnungen. Die am höchsten
konzentrierte Kontrolle a beinhaltet 1ng mit Digoxigenin markierte DNA.
Die Konzentration der Sonde Dig-Aktin wird dabei auf das 10-fache der Kontrolle, rechnerisch auf
10 ng/µl geschätzt (Abb.3-5).
3.1.4 Expression des Reporter-Targets
Die Expression des Reporter-Targets, die des Transgens „Gus“, wird mittels Northern Blot
überprüft. Je 1µg mRNA von beiden Stämmen werden auf einem MOPS-Gel aufgetrennt, geblottet
und mit einem mit Digoxigenin markierten Gus-Fragment hybridisiert. Zur Schätzung der
Expressionsstärke des Transgens wurden auch verschiedene Mengen von dem nicht markierten
Gus-Fragment als quantitative Kontrollen parallel zu den mRNAs aufgetragen.
1
2
a b c d e
1 2
56
Abb.3-6. Die Expression des Gus-Gens. Dig-Gus wird hybridisiert mit: 1. 1µg mRNA von Stamm
Gus; 2. 1µg mRNA von Stamm Desiree; 3-5. 0,3, 3 und 30 pg von dem 301 Bp langen Gus-
Fragment.
Die Expression des Gus-Gens von rechnerisch 1,5-15 Kopien pro Zelle ist lediglich bei dem
transgenen Stamm festzustellen.
Signale sind nur bei der Gus-mRNA und bei den quantitativen Kontrollen (Gus-Fragmenten) zu
sehen, aber nicht bei der Desiree-mRNA. Die Signale bei den Gus-Fragments sind doppelt, weil das
dsDNA-Fragment auf dem MOPS Gel denaturiert wird.
Die Stärke des Signals von 1µg mRNA aus dem Stamm Gus ist ähnlich wie das bei 0,3-3 pg reinem
Gus-Fragment (Abb.3-6). Das Gus-Fragment ist 301-Bp lang. Wenn man davon ausgeht, dass die
mRNA von Kartoffeln eine durchschnittliche Länge von 3000 Bp besitzt, kann man schätzen, dass
die mRNA des Gus-Gens 3-30 ppm der gesamten mRNA ausmacht. Angenommen, dass in einer
Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt insgesamt ca. 500, 000 Kopien mRNAs exprimiert werden,
entspricht die Expressionsstärke des Gus-Gens 1,5-15 Kopien pro Zelle. Daher gehört das Gus-Gen
zu der am niedrigsten exprimierten mRNA-Klasse.
Das 301 Bp lange Gus-Fragment sowie das Fragment in markierter Form als Sonde werden durch
PCR erzeugt (Abb.3-7).
1 2 3 4 5
57
Abb.3-7: Die durch PCR hergestellten Gus-Fragmente.1. Größenstandards; 2. GUS-Fragment,
nicht markiertes; 3. Dig-GUS.
Das Gus-Fragment ist ein PCR Fragment von 382 Bp. Wegen den eingebauten Digoxigenin-
Molekülen läuft das Dig-Gus im Gel langsamer als das unmarkierte Gus.
Die Markierungseffizienz bei Dig-Gus wird durch Dot-Blot kontrolliert.
Abb.3-8: Dot-Blot zur Ermittelung der Markierungseffizienz bei Dig-GUS. 1. Dig-GUS; 2.
Kontrolle. a-e, unverdünnt, sowie 1: 10, 1:100, 1:1000, 1:1000 Verdünnungen.
Die am höchsten konzentrierte Kontrolle a beinhaltet 1ng/µl Digoxigenin markierte DNA.
Die Konzentration der Sonde Dig-Gus wird hierbei auf das 10-fache der Kontrolle, rechnerisch auf
10 ng/µl geschätzt (Abb.3-5).
3.1.5 Synthese und Restriktion der cDNA
cDNA wird nach dem Prinzip des „SmartTM PCR cDNA Synthesis Kit“ synthetisiert. Für Genome-
Subtraktion werden die cDNA anschließend mit Mbo1 geschnitten.
1
2
a b c d e
1 2 3
58
Abb.3-9: cDNA aus Blättern der Kartoffeln. 1. DNA-Größenstandards; 2. durch Mbo1 verdaute
cDNA von Gus; 3. durch Mbo1 verdaute cDNA von Desiree; 4. cDNA von Gus, ungeschnitten; 5.
cDNA von Desiree, ungeschnitten.
Auf einem Gel aufgetrennt zeigt sich die cDNA von jungen Blättern der Kartoffeln als Signale
zwischen 100 Bp und 3 KB. Die mit Mbo1 verdaute cDNA liegt zwischen 100 Bp und 1 KB. Rein
optisch sind die cDNAs von unterschiedlichen Stämmen nicht voneinander zu unterscheiden
(Abb.3-9). Aus einem 100 µl PCR-Ansatz werden ca. 8 µg cDNA gewonnen.
Die Gesamt-RNA wird mit der Guanidinium/Phenol Methode aus Blättern der Kartoffeln isoliert
und im Anschluss mRNA mit Oligo(dT)-Zellulose daraus angereichert. Die Synthese der cDNA
erfolgt nach Clontech mit geringfügigen Modifikationen. Die Qualität der mRNA sowie die
Expressionsstärke eines Reporter-Targets von 1,5-15 ppm werden durch Northern-Blot überprüft.
Die mit Mbo1 verdaute cDNA wird als Tester und Driver der Genom-Subtraktion dienen.
3.2 Analyse differentieller Genexpression in Kartoffeln mit SSH
Mit SSH und 2D-Gelauftrennung kann man ohne Klonierung die unterschiedlichen Fragmente
zweier nah verwandter Pilzstämme identifizieren (Harms, 2002). Überprüft wird hierbei die Frage,
ob mit dieser Technik auch die Analyse differentieller Genexpression in viel komplexeren
Eukaryonten gelingen kann.
1 2 3 4 5
59
3.2.1 SSH am Beispiel von Kartoffel-cDNA
SSH wird bezüglich der Adaptor/Primer-Sequenzen geringfügig modifiziert. Sie werden mit den die
Erkennungssequenzen von Mbo1 anstelle die von Rsa1 versehen. Diese Modifikation macht die
Ligation effektiver.
Abb.3-10. SSH am Beispiel von Kartoffel-cDNA. 1. DNA-Größenstandards; 2. SSHD/D -Produkt;
3. SSHG/D -Produkt.
Zwei SSH-Ansätze werden parallel durchgeführt. Wenn die mit Mbo1 geschnittene cDNA von Gus
als Tester, die geschnittene cDNA von Desiree als Driver fungieren, zeigt sich das SSHG/D-Produkt
auf dem Gel als ein Schmier mit mehreren Banden. Im Gegensatz dazu ist das Produkt der
negativen Subtraktionskontrolle SSHD/D, worin die geschnittene cDNA von Desiree zugleich als
Tester und Driver fungiert, als ein schwächerer Schmier ohne distinkte Banden sichtbar (Abb.3-
10).
3.2.2 Anreicherung des Targets durch SSH
Die Anreicherung des Targets durch SSH wird durch Southern Blot evaluiert.
Abb.3-11. Anreicherung differentiell exprimierter Gene durch SSH. Das mit Digoxigenin
1 2 3
1 2
60
markierte SSHG/D-Produkt wird hybridisiert auf: 1) Mbo1 verdaute cDNA von Gus (Tester); 2)
Mbo1 verdaute cDNA von Desiree (Driver)
Wenn das mit Digoxigenin markierte SSHG/D-Produkt als Sonde auf gleiche Mengen
immobilisierter Tester- und Driver-cDNA hybridisiert wird, erweist sich das Signal bei dem Driver
als ein leichter Schmier mit kaum wahrnehmbaren Banden, bei dem Tester dagegen als ein stärkerer
Schmier mit mehreren starken Banden (Abb.3-11). Dies deutet darauf hin, dass die durch SSH
angereicherten Fragmente in dem Tester höher konzentriert sind. Dies wiederum bedeutet, dass die
differentiell exprimierten Gene durch SSH angereichert werden.
3.2.3 Identifizierung eines im SSHG/D-Produkt am höchsten konzentrierten Fragment mittels
2D-Gelen „Core PCR“ und Sequenzierung
Anders als bei Bakterien Genomen, bei denen die durch SSH angereicherten Fragmente dem Target
entsprechen, stammt dagegen das am höchsten konzentrierte Fragment in dem SSH-Produkt bei
Kartoffel cDNA nicht immer aus den differentiell exprimierten Genen, sondern oft aus den hoch
konzentrierten Hintergrund-Sequenzen.
Abb.3-12. 2D-Auftrennung des SSHG/D-Produkts
Nach der 2D-Gelelektrophorese erscheinen die konzentrierten Fragmente im Produkt der SSHG/D als
leuchtende DNA-Punkte, die sich von dem wolkigen Hintergund abheben (Abb.3-12). Für die
„Core-PCR“ dient die in einem Gel-Stück, das manuell aus dem starken DNA-Signalpunkt auf dem
2D-Gel (Pfeil) ausgestanzt wird, enthaltete DNA als Template.
(2 . D im en sio n )
C o re-P C R
61
Abb.3-13. Core-PCR eines mit SSH angereicherten Fragmentes.
1. DNA-Größenstandards; 2. Produkt der Core-PCR.
Es werden dabei immer auch ungewollte Hintergrund-Sequenzen mit übertragen, die für den
Schmier in dem Produkt der „Core-PCR“ verantwortlich sind (Abb.3-13). Das Haupt-Produkt der
Core-PCR im Form einer distinkten Bande wird aus dem Gel eluiert, gereinigt und sequenziert.
Durch Sequenz-Alignment wird dieses Fragment als Teil des rRNA-Gens identifiziert,welches in
beiden Stämmen vorhanden ist:
TCGCGGGGNNAGAAGACCCTGTGTGGNCCNTNNCTCTAGCTCCCNANTTTGNGGAANTGCACTNNTAAAGGNNTNGTATANGTAGGG
CANCCNCAAGGCNAAAGTGAAACNCCNNTANTTTTAACNNTATTNTACTNATTCCGTGAATNGTNAAGCGGGGCACTGCCCCTATNTT
TGGACCCAAGGCTCGCTNTGCGGNCCGATCNGGNCNGNANACATTGTNANGTGGGGAGTATGGCTGGGGCGGCACATCTAGTGAAAA
GATNACCCATGCGTCNCTAAGATGAGCTCAACCTAGAACAGAATTGTCGTGNGNNACATAAGGGTAAAAGCTCGTTTCGTTTCTNATT
TACAGTNCGAATGCCAACCCGTAAAAGNCNCGGCCTAACAATTCTTTTNACCCTNNGAATTCNAANTTNGAGGGGTNAAAAAGTTNC
AAGGGGATATTTGCTTGGGGATCCAACCGTNATACNAACNANCTTTTTAANCTTTNTGGCCCCCTNCNTTTTTGGAACCNAANTNCCTT
NGGAGGTGGNNCCNCAAAGGAC
Nicotiana tabacum 26S ribosomal RNA gene, complete sequence:
Query: 95 aaggcnaaagtgaaacnccnntanttttaacnntattntactnattccgtgaatngtnaa 154 ||||| ||||||||| || || ||||||| |||| |||| ||||||||||| | ||Sbjct: 2455 aaggcgaaagtgaaataccactacttttaacgttattttacttattccgtgaatcg-gaa 2513 Query: 155 gcggggcactgcccctatntttggacccaaggctcgctntgcggnccgatcnggncngna 214 |||||||||||||||| | ||||||||||||||| ||| ||| | |||||| || | | |Sbjct: 2514 gcggggcactgcccctctttttggacccaaggcttgct-tgcaggccgatccgggcggaa 2572 Query: 215 nacattgtnangtggggagtatggctggggcggcacatctagtgaaaagatnacccatgc 274 ||||||| | ||||||||| ||||||||||||||||||| || ||||||| || || | Sbjct: 2573 gacattgtcaggtggggagtttggctggggcggcacatct-gttaaaagataacgcaggt 2631 Query: 275 gtcnctaagatgagctcaacctagaacagaattgtcgtgngnnacataagggtaaaagct 334 ||| ||||||||||||||| | ||||||||| | ||||| | ||| |||||||||||||Sbjct: 2632 gtc-ctaagatgagctcaa-cgagaacagaaatctcgtgtggaacagaagggtaaaagct 2689 Query: 335 cgtttcgtttctnatttacagtncgaat 362 ||||| | |||| |||| |||| |||||Sbjct: 2690 cgttt-gattctgatttccagtacgaat 2716
1 2
62
Die hier gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass die differentiell exprimierten Gene in Kartoffeln
durch SSH angereichert werden. Dennoch ist die Identifizierung differentieller Genexpression in
hoch komplexen eukaryontischen cDNAs mit SSH/2D-Gelen ohne Klonierung nicht immer möglich.
Das in dem SSHG/D-Produkt am stärksten konzentrierte Fragment wird sich als von der hoch
konzentrierten rRNA stammend erweisen.
3.3 Experiment zur Etablierung der DSC
An zwei Systemen, an einem Lambda-Fragment und an den cDNAs der Solanum, wird das Prinzip
der DSC überprüft.
3.3.1 DSC am Beispiel eines Lambda-Fragments
Die Autoren der DSC berichteten, dass am Beispiel eines Lambda-Fragmentes eine effiziente
Subtraktion durch DSC erzielt worden sei (Luo, 1999). Dabei sollte ein mit dem Tester-Adaptor
versehenes Lambda Fragment durch das gleiche Fragment, das mit dem Driver-Adaptor versehen
wurde, mittels DSC so effizient subtrahiert worden sein, dass im DSC-Produkt kein intakter Tester
mehr vorhanden und die Kontroll-Amplifikation des DSC-Produktes mit dem Tester-Primer
entsprechend negativ verlaufen sei.
Dieser einfache Modellversuch wird originalgetreu wiederholt. Dazu wird zuerst das 564 Bp lange
Lambda Fragment aus einem Gel eluiert, gereinigt und in getrennten Ansätzen durch Ligation und
PCR mit den Driver- und Tester-Adaptoren versehen. 1ng Tester- und 100 ng Driver-Amplikon
werden zusammengeführt und die DSC durchgeführt.
Abb.3-14. DSC am Beispiel eines Lambda-Fragments. 1. DNA-Größenstandards; 2. Tester-
Amplikon; 3. Driver-Amplikon; 4-6. durch PCR amplifizierte Produkte, nach 1-3 Runden DSC.
Im Gegensatz zu der Beschreibung in der Literatur ist dabei jedoch keine effiziente Subtraktion
1 2 3 4 5 6
63
durch DSC festzustellen. Die PCR-Amplifikation des DSC-Produktes mit dem Tester-Primer
verläuft nach der dritten DSC-Runde nach wie vor positiv (Abb.3-14 ).
3.3.2 DSC am Beispiel von Kartoffel-cDNA
Am Beispiel zweier Kartoffel-cDNAs wird das Prinzip der DSC getestet. Ähnlich wie bei dem
Lambda-Fragment ist hierbei keine effiziente Subtraktion durch DSC festzustellen. Das DSC-
Produkt besteht hauptsächlich aus den hoch konzentrierten Hintergrund-Sequenzen.
Abb.3-15. DSC am Beispiel von Kartoffel-cDNA. 1. DNA-Größenstandards; 2. Tester-Amplikon;
3. Driver-Amplikon; 4. DSCG/D-Produkt.
100 ng Gus-cDNA-Amplikon fungiert dabei als Tester, und 10µg Desiree-cDNA-Amplikon als
Driver. Im Gegensatz zu den Tester- und Driver-Amplikons enthält das DSC-Produkt nur wenige
Fragmente (Abb.3-15).
Die Spezifität des DSC-Produkts wird durch Sonthern-Blot kontrolliert:
Abb.3-16. (Un)Spezifität des DSC-Produktes. Das mit Digoxigenin markierte DSCG/D-Produkt
wird hybridisiert mit der: 1. Tester cDNA; 2. Driver cDNA
1 2 3 4
1 2
64
Dieses DSC-Produkt ist jedoch nicht spezifisch für den Tester. Wenn das DSC-Produkt mit
Digoxigenin markiert wird und auf die Driver/Tester cDNA hybridisiert wird, bindet es
gleichermaßen an beiden cDNAs (Abb.3-16).
Aber das Reporter-Target, das Gus-Gen, ist in dem DSC-Produkt nicht mehr aufzufinden, wie die
Hybridisierung des Targets auf dem DSC-Produkt beweist (Abb.3-17).
Abb.3-17. (Un)Sensitivität der Detektion differenzieller Genexpression durch DSC. Dig-Gus
wird hybridisiert mitdem 1. Gus-Fragment; 2. DSCG/D-Produkt.
Das Dig-Gus bindet dabei lediglich auf dem als Kontrolle fungierenden Gus-Fragment, jedoch nicht
auf dem DSCG/D-Produkt. Dies bedeutet, dass das Reporter-Target nicht mehr im DSC-Produkt
vorhanden ist und dass DSC keine sensitive Methode zur Identifizierung differentieller
Genexpression in hoch komplexen Eukaryonten wie Solanum ist.
Dieses DSC-Produkt wird kloniert und einige Klone werden zufällig ausgewählt und sequenziert.
Durch das anschließende Sequenz-Alignment mittels Blastn werden sie als rRNA-Sequenzen
identifiziert.
An einem Lambda-Fragment wird einer der DSC-Versuche aus der Literatur originalgetreu
durchgeführt, dennoch mit anderem Ergebnis. Am Beispiel von cDNAs der Solanum werden nicht
die differentiell exprimierten Gene, sonderen die in den cDNA hoch konzentrierten Sequenzen wie
rRNAs, durch DSC angereichert. Es wird daher bei keinem der beiden getesteten Systeme eine
effiziente Subtraktion durch DSC erzielt.
1 2
65
3.4 Suche nach der Schwachstelle der DSC
Verschiedene Faktoren, darunter die MBN-Aktivität und die Eigenschaften der Adaptoren, werden
überprüft, um herauszufinden, was für den Misserfolg der DSC verantwortlich ist.
3.4.1 Funktionalität der MBN
Es wird ein Experiment durchgeführt, um sicherzustellen, dass die für die DSC angewendete MBN
überhaupt aktiv ist, da sonst keine ssDNA-spezifische Verdauung gewährleistet wäre und somit
keine Subtraktion durch DSC möglich ist.
Abb.3-18. Überprüfung der MBN-Aktivität. 1. DNA-Größenstandards; 2. das denaturierte
Lambda Fragment nach MBN-Behandlung; und 3. das unbehandelte Lambda Fragment .
Der Versuch zeigt, dass das Versagen der DSC nicht auf die fehlende MBN-Aktivität
zurückzuführen ist. Die für die DSC verwendete MBN ist aktiv. Das Enzym ist in der Lage, durch
eine kurzzeitige Einwirkung ein denaturiertes DNA-Fragment vollständig zu degradieren (Abb.3-
18).
3.4.2 Adaptoren der DSC
Die Hypothese, dass die fehlende Fähigkeit zur Subtraktion durch DSC von den 24 Bp-Überhängen
des Testers in den Heterohybriden verursacht wird, wird an einem Modellsystem überprüft. Die
Adaptoren werden dabei als die Ursache für das Versagen der DSC identifiziert.
3.4.2.1 Die Hypothese über die Länge des Tester-Überhanges im Heterohybrid und die
Funktionalität der DSC
1 2 3
66
Auch bei wiederholten Versuchen zeigt sich keine effektive Subtraktion durch DSC. Es wird daher
zur Erklärung des Versagens eine Hypothese aufgestellt:
Schema 3-1: Hypothese über den Zusammenhang der Fähigkeit zur Subtraktion und die
Länge des Tester-Überhanges in Heterohybriden.
Schematisch wird diese Hypothese in Schema 3-1 erklärt: dass der Tester-Überhang in den
Heterohybriden (gleicht hierbei dem Tester-Adaptor) bei der DSC mit 24Bp zu lang für eine
Subtraktion ist. Bei 37oC und 0,05M NaCl können die komplementären Stränge des Tester-
Überhänges aneinander binden, einen Doppelstrang ausbilden, und somit nicht mehr von MBN
ssDNA-spezifisch verdaut werden. Dagegen sollte eine Adaptor-Konstruktion, bei der der Tester-
Überhang in den Heterohybriden so verkürzt ist, dass die komplementären Stränge der Tester-
24 Bp Tester-Überhang in Heterohybriden (DSC) 12 Bp Tester-Überhang in Heterohybriden
Der Tester-Überhang bildet dsDNA Der Tester-Überhang bildet keine dsDNA
Kein Zugang für MBN zugänglich für MBN
PCR mit dem Tester-Primer verläuft positiv
PCR mit dem Tester-Primer verläuft negativ
(Tester)
Keine Subtraktion Effektive Subtraktion
11
67
Überhänge bei 37oC und 0,05M NaCl nicht mehr aneinander binden können, eine effiziente
Subtraktion ermöglichen.
Bei der Einwirkung hoch konzentrierter MBN wird dsDNA, darunter auch das Target, unspezifisch
verdaut. Nur noch der besonders hoch konzentrierte Tester verbleibt mit PCR amplifizierbar.
Dieser verbleibende Rest an DNA entspricht nicht unbedingt dem Target, sondern den am höchsten
konzentrierten Sequenzen im Tester, wie z B den rRNA-Sequenzen in den cDNAs der Kartoffeln.
3.4.2.2 Überprüfung der Hypothese
Am Beispiel des Lambda-Fragmentes wird die oben genannte Hypothese überprüft. Das DSC-
Driver-Amplikon dient erneut als Driver, das DSC-Tester-Amplikon sowie ein neu konstruierter
Tester dienen als Tester. Der neue Tester besteht aus dem 564 Bp Lambda-Fragment sowie je
einem 11 Bp Überhang an seinen beiden Enden. Der Tester-Überhang in den Heterohybriden
beträgt bei dem DSC-Tester 24 Bp, bei dem neuen Tester ist er mit 11 Bp deutlich kürzer.
Abb.3-19. Nur ein verkürzter Tester-Überhang in den Heterohybriden gewährleistet eine
effiziente Subtraktion (Modelversuch zur Überprüfung der Hypothese). 1. und 8. DNA-
Größenstandards; 2-4. durch PCR amplifizierte DSC-Produkte nach 1-3 Runden DSC (Tester-
Überhang in den Heterohybriden 24 Bp); 5-7. durch PCR amplifizierte Subtraktionsprodukte mit
dem neuen Tester, nach 1-3 Runden Substraktion (Tester-Überhang in den Heterohybriden 11 Bp).
Die Ergebnisse des Versuches bestätigen die oben genannte Hypothese. Nach 3-Runden
Hybridisierung und MBN-Behandlung sind alle Sequenzen des neuen Testers subtrahiert, dagegen
bleibt der DSC-Tester nach wie vor durch PCR amplifizierbar (Abb.3-19). Dies, obwohl beide
Tester sich lediglich durch die Länge der Tester-Überhänge in den Heterohybriden unterscheiden,
und ansonsten die gleiche Menge von beiden Testern in gleichen Reaktionsgefäßen in Anwesenheit
1 2 3 4 5 6 7 8
68
des gleichen Drivers zur Subtraktion benutzt werden.
Die Adaptoren erwiesen sich dabei als die fatale Schwäche der DSC. Der Tester-Überhang in den
Heterohybriden (gleicht hierbei dem Tester-Adaptor) bei der DSC ist mit 24Bp zu lang für eine
Subtraktion. Bei 37oC und 0,05M NaCl können die komplementären Stränge des Tester-
Überhänges aneinander binden, einen Doppelstrang ausbilden, und somit nicht mehr von MBN
ssDNA-spezifisch verdaut werden.
3.5 Entwicklung der NSC
Ziel ist es, die DSC so zu korrigieren, dass daraus eine Methode der effizienten Genom-Subtraktion
entsteht.
3.5.1 Neuartige Adaptoren/Primer
Zur Konstruktion der NSC-Adaptoren/Primer werden folgende Kriterien aufgestellt:
1. der Tester-Überhang in den Heterohybriden muss so kurz sein, dass er bei 37oC und 0,05M NaCl,
jene Bedingungen, unter denen die MBN funktioniert, einzelsträngig bleibt und von MBN ssDNA-
spezifisch verdaut werden kann;
2. zugleich müssen die Tester/Driver-Adaptor/Primer lang genug sein, dass die spezifischen PCRs,
u. a. zur Synthese der Amplikons und zur Amplifikation des DSC-Produktes, möglich sind;
3. Die gemeinsamen Sequenzen zwischen den Tester- und Driver-Adaptoren müssen so kurz sein,
dass keine unspezifische PCR, durch Bindung des Tester-Primers an den Driver-Adaptor möglich
ist.
69
Schema 3-2: Adaptoren/Primer der NSC
Schema 3-2 zeigt eine Möglichkeit, wie ein solches System aussehen könnte. Der Tester/Driver-
Adapter/Primer besetzt dabei je einen spezifischen und einen gemeinsamen Teil. Der spezifische
Teil des Tester-Adaptor/Primers gleicht dem Tester-Überhang in den Heterohybriden und ist 11Bp
lang, bleibt bei 37oC und 0,05M NaCl einzelsträngig und kann somit von MBN verdaut werden.
Die gesamte Länge der Adaptoren ist 23bp. Bei dieser Länge ist auch eine spezifische
Amplifikation durch PCR möglich.
Dieses Modell wird in folgenden Adaptoren/Primern realisiert (der unterstrichene Teil ist je nach
der angewendeten Endonuklease variabel:
Tester-Adaptor: 5´-CAGTCAGAGAGCTCTCACA-3´
3´-GAGAGTGTTCGA-5´
Tester-Primer: 5´-CAGTCAGAGAGCTCTCACAAGCT-3´
Tester-Adaptor/Primer Driver-Adaptor/Primer
Adaptor in Heterohybriden
11 Bp 12 Bp 11 Bp 12 Bp
MBN-Behandlung
PCR mit dem Tester-Primer
PCR verläuft negativ;
(Effiziente Subtraktion)
70
Driver-Adaptor: 5´-GACACTCTCACCTCTCACA-3´
3´-GAGAGTGTTCGA-5´
Driver-Primer: 5´-GACACTCTCACCTCTCACAAGCT-3´
3.5.2 Schema der NSC
NSC und DSC unterscheiden sich lediglich durch ihr Adaptoren/Primer.
Schema 3-3: Schema der NSC
Schematisch lässt sich eine Subtraktion durch NSC wie in Schema 3-3 veranschaulichen. Die NSC-
Tester und -Driver werden mit unterschiedlichen Adaptoren versehen. Die Tester- und Driver-
Adaptoren/Primer besetzen je einen spezifischen (11Bp) und einen gemeinsamen Teil (12 Bp). Der
Tester Driver
Hybridisierung
MBN
Erneute Hybridisierung
PCR mit dem Tester-Primer
Target
71
spezifische Teil des Tester-Adaptors in den Heterohybriden bleibt einzelsträngig und wird
anschließend von MBN degradiert. So verwandelt sich Tester in Driver und die Subtraktion erfolgt
mit doppelter exponenzieller Rate. Die Subtraktion erfolgt durch mehrere Hybridisierungsrunden,
ohne erneute Zugabe von Driver zwischen den Runden.
3.5.3 NSC und DSC am Beispiel eines Lambda-Fragments
NSC und DSC werden in parallelen Ansätzen am Beispiel des Lambda-Fragments überprüft.
Abb.3-20. NSC und DSC am Beispiel eines Lambda-Fragments. 1. DNA Größenstandards; 2-4.
die durch PCR amplifizierten DSC-Produkte, nach 1-3 Runden DSC ; 5-7. die durch PCR
amplifizierten NSC-Produkte, nach 1-3 Runden NSC.
Obwohl beide Methoden sich lediglich durch ihre Adaptoren/Primer unterscheiden, wird eine
effiziente Subtraktion lediglich durch NSC erzielt, nicht aber durch DSC (Abb.3-20). Nach 3
Runden NSC wird das Lambda-Tester vollständig subtrahiert, währen es nach 3 Runden DSC noch
durch PCR amplifizierbar ist.
Ein wirksames Subtraktionsverfahren, genannt NSC („negative subtraction chain“, analog zu DSC,
„differential subtraction chain“), wird entwickelt. NSC und DSC unterscheiden sich lediglich
durch ihre Adaptoren/Primer. Der Tester/Driver-Adapter/Primer der NSC is 23bp lang und besetzt
einen spezifischen und einen gemeinsamen Teil. Der spezifische Teil des Tester-Adaptor/Primers
gleicht dem Tester-Überhang in den Heterohybriden und ist 11Bp lang, bleibt bei 37oC und 0,05M
NaCl einzelsträngig und kann von MBN verdaut werden.
1 2 3 4 5 6 7
72
3.6 Kombination von SSH und NSC
Ziel ist es, SSH und NSC so zu kombinieren, dass daraus eine effiziente und sensitive Methode zur
Genom-Subtraktion entsteht.
3.6.1 Das Prinzip der SNH
Durch SSH könnte eine Targetsequenz bis zu 1000-fach angereichert werden, jedoch sind bei hoch
komplexen eukaryontischen cDNAs nach nur einer einzigen Subtraktion immer noch so viele
störende Hintergrundsequenzen im Subtraktionsprodukt zu erwarten, dass die eventuelle Isolierung
des tatsächlichen Targetes schwierig ist und oft auch radioaktives Screening verlangt.
Die NSC erschien als ein sehr elegantes System, aber ihre Sensitivität würde nicht sehr hoch sein,
da die Mung Bean Nuklease, die zur Degradierung der einzelsträngigen Tester-Adapter in
Tester/Driver-Heterohybriden zugegeben wird, auch eine unspezifische Verdauung der dsDNA
verursachen kann. Niedrig konzentriertes Target könnte somit während der Subtraktion „verloren
gehen“.
So entstand die Idee, die beiden Methoden zu kombinieren, zuerst das Target durch SSH
anzureichern, dann den restlichen Hintergrund durch NSC zu eliminieren. Diese Strategie lässt
sich wie folgt mit Hilfe eines Schemas kurz schildern:
Schema 3-4. Genom-Subtraktion durch SNH
T ester D river D riverD river
SSH T /D SSH D /D
D as SSH T /D -Produkt w ird m it dem T ester-A daptor der N SC versehen
D as SSH D /D-Produkt w ird m it dem D river-A daptor der N SC versehen
N SC
T arget
SSH
A daptor-A ustausch
N SC
SN H
73
Der Ablauf der SNH sieht wie folgt aus:
Das Ziel ist es, ein Target, das nur in DNA1 vorhanden ist, aber in DNA2 fehlt, durch Subtraktion
zu identifizieren.
Dazu werden zuerst werden zwei parallele SSH-Reaktion durchgeführt. SSH1/2 benutzt DNA1 als
Tester, DNA2 als Driver. SSH 2/2 verwendet DNA2 als Tester und Driver zugleich. Durch SSH1/2
sollte das Target angereichert und die Anzahl verschiedener Hintergrund-Sequenzen in cDNA1 auf
niedrigem Niveau ausgeglichen werden. Dementsprechend sollte die Anzahl verschiedener
Hintergrund-Sequenzen in DNA2 durch SSH2/2 auf niedrigem Niveau ausgeglichen werden. Wenn
DNA1 und DNA2 nahe verwandt sind, ähneln sich die Hintergrund-Sequenzen in DNA1 und
DNA2. Im Anschluss wird NSC durchgeführt, mit dem SSH1/2-Produkt als Tester und dem SSH2/2-
Produkt als Driver.
Weil SSH und NSC mit unterschiedlichen Adaptor/Primer-Sequenzen arbeiten, erfolgt zwischen
der SSH und der NSC ein Adaptoren-Austausch. Dieser Austausch realisiert sich durch das
Entfernen der SSH-Adaptoren/Primer mittels einer Endonuklease und die erneute Ligation der
NSC-Adaptoren auf die geschnittenen SSH-Produkte.
Normalerweise wird zur Amplifikation der SSH-Produkt eine genestete PCR durchgeführt, jedoch
trägt hauptsächlich die erste PCR mit dem Suppressions-PCR-Effekt zur Anreicherung des Targets
durch SSH bei. Die zweite PCR der SSH dient lediglich dazu, das SSH-Produkt für die weitere
Analyse in ausreichender Menge herzustellen. Auch zur Synthese der Tester/Driver-Amplikons für
NSC muss eine PCR durchgeführt werden. Eine Über-Amplifikation durch PCR führt oft zur
Selektion verschiedener Sequenzen. Aus diesem Grund wird hierbei auf die zweite PCR der SSH
verzichtet.
3.6.2 Strategie I zur Optimierung der SNH: Exonuklease VII anstelle von MBN
Degradation der einzelsträngigen Tester-Überhänge in Heterohybriden, z. B durch MBN, ist
essentiell für eine erfolgreiche SNH. MBN in hoher Konzentration verdaut jedoch auch dsDNA,
darunter natürlich auch das Target. Daher kann die Sensitivität der SNH bei der Detektion
differenzieller Genexpression durch die Anwendung der MBN negativ beeinträchtigt werden.
Um diesen Widerspruch aufzulösen wird versucht, anstelle von MBN Exonuklease 7 für die NSC
zu benutzen. Ähnlich wie die MBN baut Exonuklease 7 ssDNA von beiden Enden her ab. Die
74
Exonuklease VII ist jedochstreng ssDNA-spezifisch und ist auch aktiv in Anwesenheit von EDTA.
Diese Beschaffenheit verspricht eine höhere Sensitivität beim Detektieren differenzieller Gene und
eine Vereinfachung der Handhabung der NSC, indem der Reinigungsschritt zum Entfernen des
EDTAs vor jeder Exonuklease-Behandlung entbehrlich wird.
Die NSC mit Exonuklease VII wird zuerst an einem Lambda-Fragment durchgeführt.
Abb.3-21. NSC mit Exonuklease VII (anstelle von MBN) an einem Lambda-Fragment. 1.
DNA Größenstandards; 2-4. 1.-3. NSC-Produkte, mit Exonuklease VII.
Dabei zeigt sich, dass bei dem Lambda-Fragment eine effiziente Subtraktion auch mit Exonuklease
VII anstellen von MBN erreicht wird(Abb.3-21). Nach 3 Runden NSC mit Exonuklease VII wird
das Lamba-Tester vollständig subtrahiert und daher nicht mehr durch PCR amplifizierbar. Dies
spricht für eine Optimierung der SNH durch Anwendung der Exonuklease VII.
Im weiteren wird überprüft, ob sich durch die Verwendung von ExoVII anstelle von MBN auch bei
den Kartoffel-cDNA erreichen läßt. Dazu wird der gleiche SNH-Versuch, mit dem die Sensitivität
der SNH getestet wird (siehe 3.7.3), durchgeführt, wobei Exonuklease VII anstelle von MBN
verwendet wird (Abb.3-22).
1 2 3 4
75
Abb.3-22. SNH an Kartoffel-cDNAs, mit Exonuklease VII. 1. DNA Größenstandards; 2-5.
Ligationskontrollen der Tester mit 0, 20, 100 oder 500 ppm künstlichem Target; 6-9. Die SSH-
Produkte der Tester mit 20, 100, 500 oder 0 ppm künstlichem Target; 10-12. SNH-Produkt der
Tester mit 20, 100 oder 500 ppm künstlichem Target.
Die SNH mit Exonuklease VII anstelle von MBN wird jedoch bei der Identifizierung differentieller
Genexpression in Kartoffeln als nicht zufriedenstellend erwiesen und daher spricht gegen einer
Optimierung der SNH durch Anwendung der Exonuklease VII. Bei der Kartoffel-cDNA mit dem
100 ppm konzentrierten künstlichen Target ist durch NSC mit Exonuklease VII zwar eine
Subtraktion festzustellen, jedoch enthält das NSC-Produkt außer dem Target noch Fragmente, die
größer als das Target sind und auf dem Gel als ein Schmier über dem Target sichtbar sind. Bei der
Subtraktion mit dem 500 ppm Target ist dies noch deutlicher der Fall, sodass durch NSC aus einem
„sauberen“ SSH-Produkt ein „unsauberes“ NSC-Produkt wird. Über dem Target liegt bei dem
NSC-Produkt ein deutlicher Schmier, obwohl allein durch SSH das Target so stark angereichert
wird und die Hintergrund-Sequenzen so effektiv subtrahiert werden, dass das SSH-Produkt dadurch
ein sauberes, gut definiertes Target-Fragment wird. Daher ist bei 500 ppm Target durch die NSC
mit Exonuklease VII keine Subtraktion festzustellen, stattdessen sogar ein störender Faktor.
Bei dem Lambda-Fragment wird eine effiziente Subtraktion sowohl mit MBN als auch mit
Exonuklease VII erreicht, während bei den Kartoffel-cDNAs eine effiziente Subtraktion lediglich
mit MBN erreicht wird. Eine Erklärung dazu wäre, dass bei der Ligation der NSC-Adaptoren auch
die Bildung des Artefaktes „Adaptor-Hintergrundsequenz-Target-Adaptor“ als Nebenprodrukt
unvermeidbar ist. In diesen Beiprodukten finden sich viele unterschiedliche Sequenzen in relativ
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
76
niedriger Konzentrationen, die zwar während der NSC mit MBN durch MBN verdaut werden und
daher die Subtraktion nicht stören, aber während der NSC mit Exonuklease VII nicht effizient
subtrahiert werden können und damit erhebliche Hintergrundprobleme im SNH-Produkt
verursachen. Bei der NSC mit dem Lambda-Fragment ist kein entsprechender Hintergrund
aufgetaucht, da der NSC-Tester als DNA-Bande aus einem Gel eluiert wird und daher kein oder
sehr wenig von jenen ungewollten Beiprodukten in die Hybridisierung übergeführt wird.
3.6.3 Strategie II zur Optimierung der SNH: SNH ohne Adaptor-Austausch
Es werden Versuche durchgeführt, um neue Adaptoren zu konstruieren, die zugleich für SSH und
NSC verwendet werden können,und mit denen der umständliche Adaptoren-Austausch überflüssig
gemacht werden kann. Schmatisch lässt die Idee hinter den Versuchen so darstellen:
Schema 3-5: Skizze zur SNH ohne Adaptor-Austausch
Theoretisch gibt es dazu folgende Konstruktion: die Adaptoren P1T und P2T für den SNH-Tester,
sowie die Adaptoren P1D und P2D für den SNH-Driver. P1 und P2 stehen dabei für Primer1 und
Primer2, die Primer für die erste PCR der SSH. T und D stehen für die Tester- und Driver-Primer
der NSC. Die Tm von P1 und P2 sind höher als die von T und D, aber viel nieriger als die der
DNA1P1T DNA1P2T DNA2P1D DNA2P1DAdaptor-Ligation
1. Hybridisierung + DNA2 + DNA2 + DNA2 + DNA2
+ DNA2 + DNA22. Hybridisierung
1. PCR der SSH SSH1/2P1P2 SSH2/2P1P2
PCR zur Synthese der NSC-Amplikons
SSH1/2TSSH2/2D
NSC (SSH1/2T) / (SSH2/2D)NSC-Subtraktion
SNH
77
Adaptoren.
Die Idee ist es, zuerst den Tester der SNH mit den beiden SSH-Tester-Adaptoren und den Driver
mit den beiden SSH-Driver-Adaptoren zu versehen. Angenommen, dass die erste PCR der SSH mit
P1 und P2 dem Suppressions-PCR-Effekt unterliegt, woraufhin die Struktur der Adaptoren deutet,
kann dabei das Target angereichert werden und die Anzahl der Hintergrund-Sequenzen
ausgeglichen werden. Das SSHT/D-Produkt enthält die Sequenz des Primers T, und das SSHD/D-
Produkt die Sequenz des Primers D. Die Synthese der Tester- und Driver-Amplikons für NSC
können wie gewöhnlich durch PCR mit den Primer T und D erfolgen. Dadurch wird der Adaptor-
Austausch übersprungen, wobei die Handhabung der SNH erheblich vereinfacht und die Quelle für
Fehler verringert würde.
Zu obengenanntem Zwerk werden Adaptoren und Primers bestellt und der erwartete Suppressions-
PCR-Effekt wird durch PCR überprüft:
Abb.3-23. die in 2.6.3 konstruierten Adaptoren/primer erzeugen keinen Suppressions-PCR-
Effekt. 1. DNA-Größenstandards; 2-8. PCR-Produkte, die mit folgenden Template und Primern
erzeugt werden:
PCR-Produkt Primer Template2 P1, P2 H2O3 P1 Gus-cDNA, mit P1T versehen4 P2 Gus-cDNA, mit P2T versehen5 P1, P2 Gus-cDNA, mit P1T und P2T versehen6 P1 Desiree-cDNA, mit P1D versehen7 P2 Desiree-cDNA, mit P2D versehen8 P1, P2 Desiree-cDNA, mit P1D und P2D versehen
Leider erzeugen die im Laufe der Arbeit konstruierten Adaptoren/Primer nicht wie gewünscht den
Suppressions-PCR-Effekt. Die PCR mit P1 oder P2 als Primer, und den cDNAs als Template, die
1 2 3 4 5 6 7 8
78
mit nur einem der Adaptoren versehen werden, verlaufen positiv. Die in dieser Arbeit entwickelte
Methode bleibt also auf den Austausch der Adaptoren angewiesen.
Auch wenn die in dieser Arbeit getesteten Adaptoren, die die Sequenzen für SSH- und NSC-
Adaptoren zugleich tragen und mit denen der umständliche Adaptor-Austausch überflüssig gemacht
werden sollte, nicht zufriedenstellend sind, erscheint es doch möglich, die SNH basierend auf
diesem Prinzip zu optimieren. Theoretisch kann man dazu folgende Adaptoren konstruieren:
für den Tester: P1M1T und P2M2T
für den Driver: P1M1D und P2M2D
M1 und M2 stehen dabei für kurze, GC-reiche Sequenzen, die zu einem starken Suppressionseffekt
beitragen sollten. Die Kriterien zur Konstruktion der anderen (Teil-) Sequenzen und das Prinzip
einer SNH ohne Adaptor-Austausch sind wie beschrieben.
Weil die herkömmlichen Verfahren nur Primer/Adaptor-Sequenzen bis zu 50 Basen zuverlässig
herstellen können, ist die Länge der M1 und M2 nicht unbegrenzt, daher die Herausforderung dabei
ist: M1 und M2 so kurz wie möglich zu gestalten, damit es keine Schwierigkeiten bei der
Adaptoren-Synthethese gibt, und zugleich die Tm der Sequenzen so hoch wie möglich halten, damit
der Suppressions-PCR-Effekt gewährleistet wird. Dazu sind umfangreiche experimentelle Arbeiten
nötig.
SSH und NSC werden zu einem effizienten und sensitiven Genom-Subtraktionssystem, genannt SNH
(subtraktive, negative Hybridisierung), kombiniert. Die Analyse differenzieller Genexpression für
hoch komplexe Eukaryonten durch SNH erfolgt zuerst durch die Anreicherung des Targets durch
SSH, dann die Eliminierung des restlichen Hintergrunds durch NSC zu eliminieren.
3.7 SNH am Beispiel von Kartoffel-cDNA
Am Beispiel von Kartoffel-cDNA wird das Prinzip und die Sensitivität und Effektivität der SNH
überprüft.
3.7.1 SNH am Beispiel von Kartoffel-cDNA
79
SNH mit 5 U MBN pro Reaktion wird am Beispiel von Kartoffeln-cDNA durchgeführt.
Abb.3-24. SNH am Beispiel von Kartoffel-cDNA. 1. DNA-Größenstandards; 2. Tester; 3. Driver;
4. SSHG/D -Produkt ; 5. SSHD/D-Produkt; 6-8. NSCG/D-Produkt nach 1-3 Runden Subtraktion.
Es werden sowohl in dem SSHG/D-Produkt als auch in dem SSHD/D-Produkt einige Fragment
gegenüber dem Hintergrund stärker angereichert. Die SNG/D-Produkte erscheinen als einige klar
definierte DNA-Fragmente auf dem Gel, die nicht ganz den stärksten Banden in den SNG/D-
Produkte entsprechen(Abb.3-24). Dies beweist eine selektive Subtraktion durch NSC.
Die Spezifität der SNH-Produkt wird durch Southern Blot kontrolliert:
Abb.3-25. Das SNHG/D-Produkt ist spezifisch für das Tester. Das mit Digoxigenin markierte
SNG/D -Produkt wird hybridisiert mit: 1. dem Tester, Gus-cDNA; 2. dem Driver, Desiree-cDNA.
Wenn diese SNH-Produkte mit Digoxigenin markiert und auf die cDNA von Tester und Driver
hybridisiert werden, binden sie nur an die Tester-cDNA (Abb.3-25). Dies besagt, dass das SNH-
Produkt spezifisch für den Tester ist. SNH erweist sich daher als ein effizientes Genom-
Subtraktion-System für hoch komplexe eukaryontische cDNA.
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2
80
Dieses SNHG/D-Produkt wird mit Hilfe des „Topo4-TA cloning Kit for sequencing“ kloniert, daraus
15 Plasmid-Präperationen angefertigt und diese sequenziert.
A Arabidopsis thaliana xyloglucan endo-
transglycosylase-like protein
4 Sequenzen
B Arabidopsis thaliana, serine/threonine
kinase
2 Sequenzen
C Arabidopsis thaliana unknown protein
(At5g13260) mRNA
4 Sequenzen
D1 Andere unbekannten Proteine 2 SequenzenD2 pflanzliche DNA 3 Sequenzen
Tabelle 3-1. Die Identität der SNHG/D-Produkte
Nach anschließendem Sequenzenalignment mit Blastn werden 12 Sequenzen von SNHG/D-Produkte
als für (hauptsächlich pflanzliche) Proteine codierend identifiziert (siehe Anhang). Auch dies
spricht dafür, dass die SNH eine effiziente Genom-Subtraktionsmethode ist, weil sonst viel mehr
Hintergrundsequenzen wie rRNA-Sequenzen in den Produkten bei einer erfolglosen Subtraktion zu
erwarten sind.
Die Sensitivität der SNH zur Identifizierung differentieller Genexpression wird auch durch
Southern Blot kontrolliert:
Abb.3-26. SNH (mit 5 U MBN pro Reaktion) zeigt niedrige Sensitivität bei der Detektion
differenzieller Genexpression. Das mit Digoxigenin markierte Reporter-Target (Dig-Gus-v) wird
hybridisiert mit: 1. geschnittene Gus-cDNA; 2. SSHG/D-Produkt; 3-5. NSCG/D-Produkte nach 1-3
Runden Subtraktion.
Das Reporter-Target Gus-Gen, das mit einer Stärke von 1-15 Kopien pro Zelle exprimiert wird, ist
jedoch schon nach der 1. NSC vollständig von MBN degradiert und wird daher nicht mehr durch
1 2 3 4 5
81
Southern-Blot detektiert (Abb.3-26). Dies besagt, dass die SNH mit 5 U MBN nicht sensitive genug
ist, um die differentiell exprimierten Gene der niedrigsten Konzentrationsklasse wie Gus zu
identifizieren, was auch bei der Anwendung hoch konzentrierter MBN zu erwarten ist.
3.7.2 Die Optimale MBN-Menge für SNH
Die effiziente Verdauung der ssDNA durch MBN ist essentiell für die Funktionalität der NSC,
jedoch verdaut MBN in großen Mengen dsDNA auch unspezifisch. Zu geringe MBN-
Konzentrationen könnten daher zu uneffizienter Subtraktion führen, zu hohe Konzentrationen
dagegen zur unspezifischen Verdauung der niedrig konzentrierten Target-Sequenzen. Dies würde
eine Verminderung der Sensitivität dieser Methode bei der Detektion differenzieller DNA-
Fragmente bedeuten.
Gesucht wird daher die optimale MBN-Konzentration, bei der eine effiziente Subtraktion möglich
ist, zugleich jedoch wenig dsDNA durch MBN unspezifisch verdaut wird, und somit die Sensitivität
der Detektion und die Effektivität der Subtraktion bei der NSC optimal sind.
Dazu wird SNH mit unterschiedlichen MBN-Konzentrationen durchgeführt und anschließend die
Sensitivität der Detektion und die Effektivität der Subtraktion der NSC in Abhängigkeit von den
angewendeten MBN-Mengen überprüft.
Die Sensitivität der Detektion differentiell exprimierter Gene und die Effektivität der Subtraktion
allgemeiner Sequenzen durch SNH ist optimierbar bezüglich der Menge der angewendeten MBN.
Die optimale Menge der MBN hängt von der Natur der jeweiligen Fragstellung ab, z. B. ob dabei
hoch oder eher niedrig konzentrierte Sequenzen gesucht werden: bei den Kartoffel-cDNAs stammt
das SNH-Produkt bei 5 Enzymeinheiten pro Reaktion vollständig aus den differentiell exprimierten
Genen; bei 0,5 Enzymeinheiten pro Reaktion entsprechen hingegen nur 70-80% der SNH-Produkte
der differentiellen Expression; bei noch niedrigerer MBN-Einwirkung (0,05 Enzymeinheiten pro
Reaktion) wird die Subtraktion kaum wahrnehmbar; bei deutlich mehr als 5 Enzymeinheiten pro
Reaktion werden dagegen alle Tester-Sequenzen während der NSC degradiert.
SNH mit unterschiedlichen MBN-Konzentration
SNG/D wird mit 0,05, 0,5 und 5U MBN pro NSC-Runde an Kartoffel-cDNA durchgeführt.
82
Abb.3-27. SNH-Produkt mit unterschiedlichen MBN-Mengen. 1. DNA Größenstandards; 2-4.
SNHG/D-Produkte, nach 1-3 Runden NSC.
Bei niedriger MBN Einwirkung verstärkt sich der Hintergrund des SNH-Produktes (Abb.3-27).
Dies könnte darauf hinweisen, dass die angewendete MBN-Menge Einfluss auf die Sensitivität und
Spezifität der Subtraktion hat.
Effektivität der Subtraktion und die angewendete MBN-Konzentration
Der Zusammenhang zwischen der Effektivität der Subtraktion und der angewendete MBN-
Konzentration wird durch Southern Blot kontrolliert:
Abb.3-28. 80% der SNHG/D-Produkte bei 0,5 U MBN pro NSC-Runde erweisen sich als
differentiell exprimierte Sequenzen. A. Die mit Digoxigenin markierte Driver-cDNA wird mit
den klonierten SNH-Produkten hybridisiert. B. Die mit Digoxigenin markierte Tester-cDNA wird
mit den klonierten SNH-Produkten hybridisiert.
Wie erwartet verringert sich die Effektivität der Subtraktion mit abnehmender MBN-Konzentration.
Wenn die mit Digoxigenin markierte SNH-Produkte mit dem Tester/Driver hybridisiert werden,
zeigen sie sich bei 5U MBN als differentiell exprimierte Fragemente (Abb. 3-25). Bei weniger
MBN bindet dagegen ein Teil des SNH-Produkts auch an den Driver. Wenn die mit Digoxigenin
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
A 5 U B 0,5 U C 0,05 U
A
B
83
markierten Tester/Driver-cDNAs mit dem klonierten SNH-Produkt bei 0,5 U MBN hybridisiert
werden, erweisen sich nur 80% (24/30) der Klone als differentiell exprimierte Sequenzen (binden
nur an dem Tester). Die übrigen 20% (6/30) sind Sequenzen, die sowohl im Tester und als auch im
Driver vorhanden sind (binden auch an dem Driver) (Abb.3-28).
Sensitivität der Detektion und die angewendete MBN-Konzentration
Der Zusammenhang zwischen der Sensitivität der Detektion und der angewendete MBN-
Konzentration wird durch Southern Blot kontrolliert:
Abb.3-29. Die Sensitivität der Detektion durch SNH nimmt mit der Einwirkung von weniger
MBN zu. Das mit Digoxigenin markierte Reporter-Target (Dig-Gus-v) wird hybridisiert mit: 1.
Gus-cDNA, mit Mbo1 geschnitten; 2. SSHG/D-Produkten; 3-5. Die SNH-Produkte nach 1-3 Runden
NSC, mit 5U MBN pro Reaktion; 6-8. Die SNH-Produkte nach 1-3 Runden NSC, mit 0,5 U MBN
pro NSC-Runde; 9-11. Die SNH-Produkte nach 1-3 Runden NSC, mit 0,05 U MBN pro NSC-
Runde.
Wie erwartet nimmt die Sensitivität der Detektion durch SNH mit geringerer MBN-Einwirkung zu.
Bei 5U MBN pro NSC-Runde ist das Reporter-Target (Gus-Gen) schon nach der ersten NSC nicht
mehr auffindbar. Bei 0,5 U MBN findet es sich noch nach der 2. NSC-Runden. Bei nur 0,05 U
MBN gelangt es noch in das endgültige SNH-Produkt.
3.7.3 Die Sensitivität der SNH zur Detektion differenzieller Genexpression
Die Sensitivität der SNH zur Detektion differenzieller Genexpression wird an einem Modelsystem
getestet. Als Driver dient dabei die cDNA von Desiree. Die Tester enthalten die Desiree-cDNA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
84
sowie 0, 20, 100 oder 500 ppm von dem künstlichen Target. Die dabei angewendete MBN beträgt 5
U pro Behandlung.
Abb.3-30. Die Sensitivität der SNH zur Detektion differenzieller Genexpression (5U MBN).
1.DNA Größenstandards; 2-5. Ligationskontrollen der Tester mit 0, 20, 100 oder 500 ppm
künstlichem Target; 6-9. Die SSH-Produkte des Testers mit 0, 20, 100 oder 500 ppm Target; 10-12.
SNH-Produkt des Testers mit 20, 100 oder 500 ppm Target. cDNA von Kartoffeln dient dabei als
Hintergrund der Subtraktion.
Die SNH zeigt sich dabei als 5-fach sensitiver als SSH, mit einer Sensitivität zur Detektion fremder
Gene von 100 ppm in Solanum. Das SSH-Produkt bei 500 ppm Target sowie die SNH-Produkte
bei 100 und 500 ppm Target werden durch Klonierung und Sequenzierung als identisch mit dem
zugefügten Target identifiziert.Durch SSH allein ist es möglich, das Target in der höchsten
Konzentration (500 ppm) zu identifizieren, bei niedrigeren Mengen (100 ppm, 20 ppm) wird das
Target im SSH-Produkt von den Hintergrund-Sequenzen überdeckt. SNH ist dagegen fähig, das
Target in einer Konzentration von 100 ppm zu detektieren. Auch das Target von 20 ppm wird durch
SNH stark angereichert.
SNH erweist sich dabei als ein effizientes Genom-Subtraktionssystem für hoch komplexe
Eukaryonten. Das SNH-Produkt (mit 5 U MBN ) ist spezifisch im Tester vorhanden und kodiert
verschiedene pflanzliche Proteine. Wie erwartet verringert sich die Effektivität der Subtraktion mit
abnehmender MBN-Konzentration, und zugleich nimmt die Sensitivität der Detektion zu. Die SNH (
mit 5 U MBN) zeigt sich dabei als 5-fach sensitiver als SSH, mit einer Sensitivität zur Detektion
fremder Gene von 100 ppm in Solanum. Diese Steigerung von Sensitivität bezeichnet eine
qualitative Optimierung zur Detektion differenziell exprimierter Gene.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
85
4 Diskussion
4.1 SNH ist ein innovatives, elegantes Genom-Subtraktionssystem
Ein für die Routine geeignetes Genom-Subtraktionssystem (SNH) zur Analyse differenzieller
Genexpression in hoch komplexen Eukaryonten wird im Rahmen dieser Arbeit aufgebaut. Diese
Methode basiert auf der Kombination von SSH, einem bewährtes System zur Genom-Subtraktion
bei Prokaryonten, und NSC, einer aus der patentierten aber nicht praktizierbaren DSC
weiterentwickelten Methode. Dieses Verfahren ist robust, relativ sensitiv, schnell und einfach
durchführbar, kostengünstig und nicht radioaktiv.
Die wichtigsten Neuerungen bei der SNH beziehen sich auf zwei Aspekte: 1. die Entwicklung der
NSC und, 2. die Kombination von SSH und NSC.
Die Entwicklung der NSC
Bei der patentierten DSC scheint es sich um eine elegante Methode zu handeln. Jedoch wird sie
bisher von keinem unabhängigen Forscher bestätigt (Jaccoud , 2001). Auch unsere Versuche, einen
der originalen DSC-Versuche aus der Literatur (mit dem Lambda-Fragment) zu wiederholen, und
mit der DSC die differenziell exprimierten Gene in Eukaryonten zu identifizieren, schlugen fehl
(Absatz 3.3, Abb. 3-14, 15, 16, 17). Es wurde dann eine Hypothese (Schema 3-1) aufgestellt, dass
es sich um ein systemimmanentes Problem handelt und die DSC in der publizierten Form nicht
praktikabel sein könnte. Diese Hypothese, dass der Tester-Überhang in den Heterohybriden bei der
DSC (gleicht hierbei dem Tester-Adaptor)mit 24Bp zu lang für eine Subtraktion ist, wird dann
durch ein einfaches Experiment am Beispiel eines Lambda-Fragments überprüft und bestätigt.
Dazu werden neue Adaptoren/Primer konstruiert, wobei der Tester-Überhang in den
Heterohybriden auf 11Bp verkürzt und so eine effiziente Subtraktion ermöglicht wird (Abb. 3-19).
Nachdem bewiesen wurde, dass die Konstruktion der DSC schon theoretisch nicht funktionsfähig
ist und zu keiner effizienten Subtraktion führen kann und ihre Schwachstelle die Adaptoren/Primer
sind, wird sie entsprechend korrigiert und daraus ein effizientes Subtraktionssystem namens NSC
(Negative Subtraktion Chain) mit innovativen Adaptoren/Primern entwickelt ( Schema 3-2, 3-3).
Der Tester/Driver-Adapter/Primer der NSC ist 23bp lang und besetzt einen spezifischen und einen
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gemeinsamen Teil. Der spezifische Teil des Tester-Adaptor/Primers gleicht dem Tester-Überhang
in den Heterohybriden und ist 11Bp lang, bleibt bei 37oC und 0,05M NaCl einzelsträngig und kann
von MBN verdaut werden. In parallelen Versuchen am Beispiel eines Lambda-Fragments wird
bewiesen, dass eine effiziente Subtraktion nur mit NSC, aber nicht mit DSC zu erreichen ist
(Abb.3-20).
Bei NSC bleibt der Driver während der Hybridisierung intakt, auch bei jeder Subtraktionsrunde
wird Tester in Driver umgewandelt, daher ist keine erneute Zugabe von Driver zwischen den
Runden nötig, was bei den bekannten Methoden jedoch meistens notwendig ist.
Kombination der SSH und NSC
Durch SSH könnte eine Targetsequenz theoretisch bis zu 1000-fach angereichert werden
(Diatchenko, L., 1993), jedoch sind bei hoch komplexen cDNAs aus Solanum nach nur einer
einzigen Subtraktion immer noch so viele störende Hintergrundsequenzen im Subtraktionsprodukt
vorhanden, dass die eventuelle Isolierung des tatsächlichen Targets schwierig ist. Wie am Beispiel
zweier Kartoffeln gezeigt wird, machen die hoch konzentrierten Hintergrund-Sequenzen, darunter
rRNA Sequenzen, einen großen Teil des SSH-Produktes aus (Absatz 3-2, Abb. 3-10, 11, 12, 13).
Wegen dieses hohen Hintergrundes ist radioaktives Screening zur eventuellen Verifizierung der
„echten“ differentiell exprimierten Sequenzen unentbehrlich. Mit SNH ist es aber möglich, einige
der differenziell exprimierten Gene direkt zu identifizieren.
Die Sensitivität der Subtraktion mittels NSC allein ist begrenzt, da die Mung Bean Nuklease, die
zur Degradierung der einzelsträngigen Tester-Adaptoren in Tester/Driver-Heterohybriden
zugegeben wird, auch eine unspezifische Verdauung der dsDNA verursachen kann. Niedrig
konzentriertes Target könnte somit während der Subtraktion „verloren gehen“.
Aus der Kombination von SSH und NSC geht eine sensitive und effiziente Methode zur Analyse
differenzieller Genexpression in hoch komplexen Eukaryonten hervor. Durch die Kombination von
SSH und NSC wird die Effektivität der Subtraktion im Vergleich zu der SSH gesteigert, und
zugleich die Sensitivität der Detektion im Vergleich zur NSC erhöht. Die Eignung dieser
Kombination zur Subtraktion natürlich vorkommener eukaryontischer cDNAs wird schließlich am
Beispiel von zwei Kartoffel-cDNAs überprüft und bestätigt.
Die Sensitivität der Detektion differenzieller Genexpression mittels SNH und SSH wird anhand der
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Solanum-cDNA mit einem künstlichen Target in definierten Konzentrationen bestimmt. Die
Sensitivität der Detektion ist dabei mit SNH um das fünffache höher als mit SSH allein (Abb. 3-
30). Mit SSH ist es möglich, ein 500 ppm Target in Kartoffel-cDNA ohne Screening-Verfahren zu
identifizieren, mit SNH hingegen ist das Detektieren eines Targets von 100 ppm erfolgreich. Die
hierbei bestimmte SSH-Sensitivität ist übereinstimmend mit dem Angaben von der Firma Clontech,
die 200 ppm Fremdgene als positive Kontrolle zu ihren SSH-Assays bei Eukaryonten dazu gibt.
Die Genom-Größe der Kartoffel ist größer als die der Menschen, insofern sind die Ergebnisse bei
Kartoffel im Prinzip auf das menschlichen Genom, woran größtes Interesse besteht, übertragbar.
4.2 Bei höheren Eukaryonten ist SNH zur Analyse differenzieller Genexpression gegenüber
den bekannten Methoden zu bevorzugen; sie stellt auch eine gute Alternative zur
Identifizierung genomischer Unterschiede dar
Die wichtigsten Auswahlkriterien einer passenden Methode zur Genom-Subtraktion sind: Die
Komplexität der zu untersuchenden Genome, die Konzentrationen der Zielsequenzen und die
Handhabbarkeit der Analysemethode.
Die Komplexität eines Genoms wird traditionell durch Hybridisierungs-Versuche anhand seines
Verhaltens und der Kinetik während der Hybridisierung bestimmt (Bishop, 1974; Hastie, 1976 ).
Generell wird angenommen, dass die Komplexität eines Genoms proportional zu seiner Größe ist.
Die Genome verschiedener Organismen sind ihrer Größe (siehe Anhang) nach grob in drei Klassen
einzuteilen: Die Genome der Bakterien und die der einfachen Pilze sowie die cDNAs der
komplexeren Pilze mit einer Genom-Größe von 105-6 Bp in der untersten Komplexitätsklasse; die
Genome der komplexeren Pilze und die cDNAs der höheren Organismen in der mittleren Klasse,
wo eine Komplexität von 107-8 Bp herrscht; und die genomischen DNAs von höheren Organismen,
die aus bis zu 109-11 Bp bestehen, wobei die Genome von Tieren nahe der unteren Grenze von 109
Bp liegen.
Die unterschiedlichen Phänotypen von Stämmen gleicher Art sind oft auf ein „single copy“ Gen
zurückzuführen. Eine 4-Basen-Endonuklease verdaut DNA zu Fragmenten mit einer
durchschnittlichen Größe von 256bp. Wenn ein solches Restriktionsfragment aus einem „single
copy“ Gen stammt, besitzt es rein rechnerisch eine Konzentration von ca. 10 ppm bei Bakterien (E.
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coli), und 0,001 bis 0,1 ppm bei höheren Organismen. Der Anteil eines Fragments in der cDNA
hängt von der Stärke seiner Expression ab, daher können die Konzentrationen verschiedener
cDNA-Sequenzen in höheren Organismen zwischen weniger als 1 und mehr als 1000 ppm
variieren. Die Komplexität der Hintergrundsequenzen bei der Genom-Subtraktion ist im Falle der
cDNAs höherer Organismen jedoch viel höher als die der Bakterien. Daher wird generell
angenommen, dass die Schwierigkeit, eine Genom-Subtraktion zur Völlständigkeit zu führen, in der
Reihefolge von Bakterien-DNA, eukaryontischer cDNA und genomischer eukaryontischer DNA
zunimmt.
Zur Unterscheidung zweier Bakterien-Stämme sind alle die in der Einleitung besprochen Methoden
erfolgsversprechend. Dazu werden oft SSH/2D-Gel, die Finger-Printing Technik mit paralleler
Homo- und Heterohybridisierung, oder RFLP benutzt, denn diese Techniken sind relativ schnell
und einfach durchzuführen.
RFLP enthält einen PCR-Schritt, welcher die Genomkomplexität vereinfacht, aber zugleich das
Spektrum der Fragmente vermindert. Durch eine solche PCR werden auch genomische
Unterschiede erfasst, die lediglich auf eine Punkt-Mutation zurückzuführen sind (Smith, 1997).
Mit der Einführung der Suppressions-PCR ist die SSH/2D-Gel die zurzeit schnellste und
zuverlässigste Methode, mit der ein Target ohne Vorinformation bezüglich seiner Sequenz aus
einem Hintergrund in Bakteriengenomen identifiziert wird. Ein weiterer Subtraktionsschritt durch
NSC ist dazu nicht nötig.
In der mittleren Komplexitätsklasse wurden in dieser Arbeit alle jene Methoden, bei denen eine
manuelle Trennung der mRNA verlangt wird, wegen der hohen Labilität der mRNA nicht
berücksichtigt. Die mRNA wird hier immer zuerst in cDNA umgeschrieben und das dabei
unvermeidliche Verlorengehen bestimmter rarer mRNAs als System-Schwäche akzeptiert, weil es
bisher keine Methode gibt, mit Hilfe derer man alle Unterschiede zwischen zwei mRNAs mit
absoluter Sicherheit erfassen kann.
Die SNH ist zur Identifizierung differenzieller Gene der mittleren Komplexitätsklasse zu
bevorzugen, weil sie den robuststen, schnellsten und kostengünstigsten Weg darstellt, der zu einem
erfolgreichen Detektieren führt. Die Sensitivität der SNH zur direkten Detektion differentieller
Genexpression ist 5-fach höher als die der SSH (Abb. 3-30). Diese 5-fache Steigerung der
Sensitivität durch SNH gegenüber SSH bezeichnet jedoch einen Qualitätssprung: 100 ppm, die
Sensitivität der SNH zur Identifizierung differentieller Genexpression, ist gerade die Konzentration,
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mit der eine eukaryontische mRNA in der mittleren Konzentrationsklasse zu erwarten ist. Dies
bedeutet, dass mit SSH allein es lediglich möglich ist, die Sequenzen in der höchsten
Konzentrationsklasse zu detektieren, deren Anzahl in eukaryontischen cDNAs jedoch sehr begrenzt
ist. Mit SNH dagegen ist es möglich, auch die Sequenzen der mittleren Klasse zu erfassen, die
einen weitaus größeren Anteil der differentiell exprimierten Gene ausmacht.
2D-Gelauftrennung im Anschluss auf SSH führt zur direkten (ohne Klonierung) Identifizierung
differentieller Fragmente bei den Genomen der Bakterien oder denen der niedrigen Pilze (Harms,
2002), aber SSH/2D-Gel reicht nicht aus, differentielle Genexpression in Solanum sicher zu
identifizieren (Abb. 3-10, 11, 12, 13). Außerdem wird dazu großes manuelles Geschick benötigt,
damit nur die Zielbande aus dem Gel entnommen wird, und trotz des starken Hintergrunds wenig
von den kontaminierenden Nebenbanden in die nachfolgenden Arbeitsschritte eingetragen wird, da
dies später erhebliche Schwierigkeiten bei der Verifizierung des Targets verursachen könnte.
Zur Identifizierung eines differentiell exprimierten Gens der mittleren Komplexitätsklasse halten
sich alle anderen bisher bekannten Techniken in ihrer Brauchbarkeit die Waage. Der Zeitverbrauch
ist bei der SSH mit radioaktiven Screening und bei der SNH ähnlich, zwischen 2 bis 3 Wochen. Mit
der RDA werden drei bis vier Wochen benötigt, und mit der SAGE sogar zwei bis drei Monate. Bei
Chips ist die Vorkenntnis der Sequenzinformation eine Voraussetzung, und bei der SAGE das
Vorhandensein einer Apparatur zur „high-throughput“ Sequenzierung. Bei der RDA bringt der
Adaptor-Austausch intensivere Handhabung mit sich, wodurch sich die Kontaminationsanfälligkeit
stark erhöht.
Zum Detektieren eines niedrig konzentrierten Targets in Organismen der höchsten
Komplexitätsklasse halten sich SSH, SNH und RDA hinsichtlich ihrer Brauchbarkeit in etwa die
Waage. Jedoch gibt es dazu bisher noch keine robuste Methode.
Das Screening mit radioaktiven Proben bei SSH und die anschließende Subtraktion mit NSC bei
SNH bereiten vergleichbare Schwierigkeiten. Bei der SSH müsste die zum Screening nötige
Genbank sehr groß sein, um mit relativ hoher Sicherheit zu dem gesuchten „single copy“ Gen in
einem sehr komplexen Genom zu gelangen. Auch wenn durch die SSH das Target 1000-fach
angereichert wird, macht ein Restriktionsfragment von einem Gen, das im Genom (109 Bp) in
einer einzigen Kopie vorliegt, nur einen Anteil von 100 ppm in dem SSH-Produkt aus. Daher
würden mindestens 46050 [n=ln(1-p)/ln(1-1000*0,1ppm); p=0,99] Klone gebraucht werden, um mit
einer Sicherheit vom 99% das Fragment zumindest einmal in der Genbank zu erhalten. Wenn
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außerdem beim Screening das ganze Genom als Sonde markiert wird, um auch bei den „single
copy“ Genen spezifische Signale zu bekommen, ist radioaktive Arbeit nötig, was mit höheren
Ansprüchen an die Ausstattung des Arbeitsplatzes einher geht. Zur Unterscheidung von zwei hoch
komplexen genomischen DNAs ist eine Optimierung der SNH für jede Genom-Größe nötig. Eine
Analyse mit der RDA ist auch mit intensiver Handhabung verbunden und außerdem sehr
kontaminationsanfallig.
Die SAGE mit einem Zeitverbrauch von bis zu drei Monaten wird als zu langsam für die Routine
empfunden. Außerdem können dabei die Proben nur nacheinander untersucht werden, nicht aber in
parallelen Versuchen, wie dies bei den auf der Hybridisierung basierenden Methoden der Fall ist.
4.3 Ausblick:
Auch wenn sich die SNH bei Solanum gut bewährt hat, und theoretisch die Ergebnisse aus dieser
Arbeit mit Solanum prinzipiell als übertragbar auf das menschliche Genomen angesehen werden
können, weil das Genom der Kartoffeln eher komplexer als das der Menschen ist, wird erst eine
erfolgreiche Anwendung dieser Methode bei menschlichen (oder menschenähnlichen) Genomen,
denen unser Haupt-Interesse gilt, zu ihrer besseren Akzeptanz bei den auf diesem Gebiet tätigen
Arbeitsgruppen führen.
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Zusammenfassung
Ein für die Routine geeignetes Genom-Subtraktionssystem zur Analyse differenzieller
Genexpression in hoch komplexen Eukaryonten wird aufgebaut. Dieses Verfahren ist robust, relativ
sensitiv, kostengünstig und nicht radioaktiv. Es stellt eine gute Alternative zu anderen bekannten
Methoden dar. Die Basis für die Methoden-Entwicklung ist SSH und DSC.
Zuerst wird festgestellt, dass die SSH mit 2D-Gel-Auftrennung nicht fähig ist, die differenziell
exprimierten Gene in Kartoffeln zu isolieren. Zwar wird das Reporter-Target durch SSH
angereichert, das in dem SSHG/D-Produkt am stärksten konzentrierte Fragment stammt jedoch nicht
aus einem Target, sondern aus einer hoch konzentrierten Hintergrund-Sequenz.
Es wird dann bewiesen, dass eine Subtraktion durch DSC gar nicht möglich ist. Ferner wird eine
Hypothese über das Nichtfunktionieren der DSC aufgestellt und anschließend wird diese durch ein
Experiment bestätigt: die Tester-Überhänge in den Heterohybriden sind mit 24Bp so lang, dass sie
bei 37 oC und 0,05M NaCl dsDNA bilden, die nicht von MBN ssDNA-spezifisch verdaut werden
kann. Eine effiziente Subtraktion ist aus diesem Grunde unmöglich.
Auf Grund dieser Befunde wird ein effizientes Genom-Subtraktionssystem namens NSC entwickelt,
welches sich durch seine innovativen Adaptoren/Primer von der DSC unterscheidet. Eine effiziente
Subtraktion durch NSC wird am Beispiel eines Lambda-Fragmentes demonstriert.
Anschließend wird dann die Kombination der SSH mit der NSC etabliert, genannt SNH
(subtraktive, negative Hybridisierung), die die Sensitivität der SSH-Detektion und die Effektivität
der NSC-Subtraktion miteinander verbindet. An den Kartoffel-cDNAs wird gezeigt, dass diese
SNH fähig ist, die differenzielle Genexpression in hoch komplexen Eukaryonten erfolgreich zu
untersuchen.
Die Sensitivität der Detektion durch SSH allein wird auf 500 ppm für ein Fremd-Fragment in den
Kartoffel-cDNA-Präparationen beziffert; die der SNH (5 U MBN) hingegen auf 100 ppm. Diese
Steigerung der Sensitivität bedeutet eine Qualitätssteigerung bei der Detektion differenzieller
Genexpression in Eukaryonten, weil die SNH in der Lage ist, die cDNA in der mittleren
Konzentrationsklasse, der die meisten für die Differenzierung verantwortlichen Sequenzen
angehören, direkt (ohne Screening) zu identifizieren.
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96
Zitierte Manuals
BD Clontech PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit
BD Clontech PCR-Select™ Bacterial Genome Subtraction Kit
BD Clontech PCR-Select™ Differential Screening Kit
BD Clontech Smart PCR cDNA Synthesis Kit
Invitrogen TOPO TA Cloning Kit for Sequencing
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Anhang 1: Abkürzungsverzeichnis
DTT dithiothreitot
DSC differential subtraction chain
EDTA ethylenediaminetetraaceticacid
EPPS N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N'-3-ethanesulfonic-acid
MBN mung bean nuclease
MOPS 3-[N-morpholino]propane-sulfonic acid); (4-morpholinepropanesulfonic acid)
NSC negative subtraction chain
PBS phosphate buffered saline
RDA representation differential analysis
RT Raumtemperatur
SAGE serial analysis of gene expression
SNH subtractive, negative Hybridisierung
SSH suppression subtractive hybridisation
G/D (für Subtraktion) Gus-cDNA als Tester, Desiree-cDNA als Driver
D/D (für Subtraktion) Desiree-cDNA als Tester und Driver zugleich
U Unit
KDa Kilodalton
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Anhang 2: SNG/D-Produkte
A(Arabidopsis thaliana xyloglucan endo-transglycosylase-likeprotein, MPA24.8 mRNA, 4 Sequenzen)
Sequenz 8ATCACGGGGATAGAGAGACAATATCTGCAATGGAGGGTAATATAGGTTTTCTCAATGCCGAGCTTGCTGTTGTAGCCGACATAGAGAAGAAGAGAGAAGAAAGAGAGAGGAGGAGATTGCGACAACAAAGGAGATAGAGAACAAAAGGTAAGCAGCGCTTCAGGCCCAACTAACTTTTCTTTTTGAATCAGGAAAAAATCTTCCTCCATGTCCGGGGAGTAACGGTGAAGAGAATGATAAGTCTGATAAGGAGAGTGAGGGTGATGAGGAGACTAAGGGTGATGAGGAGTAGTTGTATCT
Arabidopsis thaliana xyloglucan endo-transglycosylase-like protein (MPA24.8) mRNA, Query: 126 caaaggagatagagaacaaa 145 ||||||||||||||||||||Sbjct: 333 caaaggagatagagaacaaa 352
Sequenz 13CAAGCTCAGAATTAACCTCACTAAAGGGACTAGTCCTGCAGGTTTAAACGAATTCGCCCTTCASTCAGAGAGCTCTCACAGATCAAACAATTCSAAAAATATAGAAGTCTAARATGTCAAATAGATACAACTACTCCTCATCACCCTTAGTCTCCTCATCACCCTCACTCTCCTTATCAGACTTATCATTCTCTTCACCGTTACTCCCCGGACATGGAGGAAGATTTTTTCCTGATTCAAAAAGAAAAGTTAGATTGGGCCTGAAGCGCTGCTTACCTTTTGTTCTCTATCTCCTTTGTTGTCGCAATCTCCTCCTCTCTCTTTCTTCTCTCTTCTTCTCTATGTCGGCTACAACAGCAAGCTCGGCATTGMGAAMACCTATATTACCCTCCATTGCAGATATTGTCTCTCTATCCCCGTGATCTGTGAGAGCTCTCT
homology to the Arabidopsis thaliana xyloglucan endo-transglycosylase-likeprotein(MPA24.8) mRNA, complete cds.
Sequenz 14ATCACGGGGATAGAGAGACAATATCTGCAATGGAGGGTAATATAGGTTTTCTCAATGCCGAGCTTGCTGTTGTAGCCGACATAGAGAAGAAGAGAGAAGAAAGAGAGAGGAGGAGATTGCGACAACAAAGGAGATAGAGAACAAAAGGTAAGCAGCGCTTCAGGCCCAACTAACTTTTCTTTTTGAATCAGGAAAAAATCTTCCTCCATGTCCGGGGAGTAACGGTGAAGAGAATGATAAGTCTGATAAGGAGAGTGAGGGTGATGAGGAGACTAAGGGTGATGAGGAGTAGTTGTATCTATTTGACATTTTAGACTTCTATATTTTTGGAATTGTTTG
Arabidopsis thaliana AT5g65730/MPA24_8 mRNA,
Query: 126 caaaggagatagagaacaaa 145 ||||||||||||||||||||Sbjct: 402 caaaggagatagagaacaaa 421
Sequenz 11GGGATAGAGAGACAATATCTGCAATGGAGGGTAATATAGGTTTTCTCAATGCCGAGCTTGCTGTTGTAGCCGACATAGAGAAGAAGAGAGAAGAHAGAGAGAGGAGGAGATTGCGACAACAAAGGAGATAGAGAACAAAAGGTAAGCAGCGCTTCAGGCCCAACTAACTTTTCTTTTTGAATCAGGAAAAAATCTTCCTCCATGTCCGGGGGAGTAACGGGTGAAGAGAATtGATTAAGGYtTGACTAGGAGAKGTGWGGGTGATGAGGAGACTMAGGGTGATGAGGAGTAGTTGTATCTATTTGACATTTTAGACTTCTATATTTTTGGGAATTGTTTGATCTGTGAGAGCTCTCTGACTGAAGGGCGAATTCG
Arabidopsis thaliana xyloglucan endo-transglycosylase-like protein (MPA24.8) mRNA, Query: 120 caaaggagatagagaacaaa 139 ||||||||||||||||||||Sbjct: 333 caaaggagatagagaacaaa 352
99
B(Arabidopsis thaliana, serine/threonine kinase (At1g01540) mRNA,2 Sequenzen.)
Sequenz 9TATGGTATTMMaGTGTTSATTTGGGTTGTAAATTTCMATGDAGAGAGGAGTTATGTGAAATCGCYGTAATGGGAATATTTGGTTATGTTGgACCMCCAATATGcTTGTAaYGCGDATGSTTAATGAGAAGAGTGATATTTATAGGTTTGGAATAATTATbAYGGAGATAATTATTSGGAGAATTCYCCTGATTATGGTAGATMC
Arabidopsis thaliana clone C00102 (h) putative protein serine/threonine kinase (At1g01540) mRNA, Query: 125 gagaagagtgatatttataggtttggaataattatbayggagataat 171 |||||||||||||| ||||| || |||||| | || | |||||||||Sbjct: 1003 gagaagagtgatatctatagcttcggaatactaatcatggagataat 1049
Sequenz 10YGCCAGTGGCATCCAAAGCTGTCCGACTTTGGGCTTGCTAAACTCCTCAATGCAGAGAGGAGTTATGTGACAACTCGTGTAATGGGAACATTTGGTTATGTTGCACCAGAATATGCTTGTACCGGCATGCTTAATGAGAAGAGTGACATTTATAGCTTTGGAATACTTATCATGGAGATAATTACTGGGAGAACTCCTGTTGATTATGGTAGACCAAAAGGCGAGACTAATTTGGTGGAGTGGTTAARAaTGAWGGGTKGGgAATCTkAAA
Arabidopsis thaliana clone C00102 (h) putative protein serine/threonine kinase (At1g01540) mRNA, Query: 55 gagaggagttatgtgacaactcgtgtaatgggaacatttggttatgttgcaccagaatat 114 ||||| ||||||||||| |||||||| |||||||| || |||||||| ||||||||||| Sbjct: 922 gagagcagttatgtgactactcgtgtgatgggaactttcggttatgtagcaccagaatac 981Query: 115 gcttgtaccggcatgcttaatgagaagagtgacatttatagctttggaatacttatcatg 174 ||||| ||||| ||| | || ||||||||||| || |||||||| |||||||| ||||||Sbjct: 982 gcttgcaccggaatgttaaacgagaagagtgatatctatagcttcggaatactaatcatg 1041Query: 175 gagataattactgggagaactcctgttgattat 207 |||||||| ||||| |||| || |||||||||Sbjct: 1042 gagataatcactggaagaaacccggttgattat 1074
C(Arabidopsis thaliana unknown protein (At5g13260) mRNA, 4Sequenzen)
Sequenz 1AAGCTCAGCAATTAACCCTCACTAAAGGGCACTAGTCCTGtCAGGTTTAARCGAATTCGTCCCTTCAGCTCAGAGBAGTCTCTCACAGTACTCAKTGGGAGKAGTGTCCTTCCGSAATTCAGCTATCTCATTTGTTCCATTATKTAGGGTGGSTCAATCTCTTTACGTAGgATGCCTTCCCACAGCCTGTCTGCTTCTATCCCCAGACTTCCTCAGATTCTATCAAACTTCTTTCAACATCAACTGCATCATGCAGTGGTTGGTGACTGTtCCGCTRACGGCCAATCCAGACCTGGAAGCCTCTCTTCTGCAATATCCTCTTCTtMMMAATGCGMTTTGGCTCTCCTCCSAAAAGTATGTAAGCCAAGCCTCCTTGAAAAGAACATCTTCCGATTCCTCTTGCCCCAACTCATATGCATCCATCAACTTGGGGTCAGCAGATGATTTAGGATCTGTGAGAGCTCTCTGACT
Arabidopsis thaliana unknown protein (At5g13260) mRNA, Query: 353 aagtatgtaagccaagcctccttgaaaagaacatc 387 ||||| || ||||||||||||||||| ||||||||Sbjct: 1558 aagtacgtgagccaagcctccttgaagagaacatc 1524
Sequenz 2ATCCTAAATCATCTGCTGACCCCAAGTTGATGGATGCATATGAGTTGGGGCAAGAGGAATCGGAAGATGTTCTTTTCAAGGAGGCTTGGCTTACATACTTTTGGAGGAGAGCCAAAGTGCATTGTGTAGAAGAGGATATTGCAGAAGAGAGGCTTCAGGTCTGGATTGGCCGTAGCGGACAGTCACCAACCACTCATGATGCAGTTGATGTTGAAAGAAGTTTGATAGAACTGAGGAAGC
100
TGGGGAWTGAACAGCAGCTGTGGGAAGCATCTCGTAAAGAGATTGACCAACCTAATAATGGAAAAaTGAGTACTGATTCGGAGGCATCTCCATGATCTGTGAGAGCTCTCTGACTGAAGGGCGAATtCGTTTAAACCTGCAGGACTAGT
Arabidopsis thaliana unknown protein (At5g13260) mRNA, Query: 66 gatgttcttttcaaggaggcttggcttacatacttttggaggagagc 112 |||||||| ||||||||||||||||| || ||||| ||||| |||||Sbjct: 1524 gatgttctcttcaaggaggcttggctcacgtacttctggagaagagc 1570
Sequenz 15AAGCTCAGCAATTAACCCTCACTAAAGGGCACTAGTCCTGtCAGGTTTAARCGAATTCGTCCCTTCAGCTCAGAGBAGTCTCTCACAGTACTCAKTGGGAGKAGTGTCCTTCCGSAATTCAGCTATCTCATTTGTTCCATTATKTAGGGTGGSTCAATCTCTTTACGTAGgATGCCTTCCCACAGCCTGTCTGCTTCTATCCCCAGACTTCCTCAGATTCTATCAAACTTCTTTCAACATCAACTGCATCATGCAGTGGTTGGTGACTGTtCCGCTRACGGCCAATCCAGACCTGGAAGCCTCTCTTCTGCAATATCCTCTTCTtMmMaATGCGMTTTGGCTCTCCTCCSAAAAGTATGTAAGCCAAGCCTCCTTGAAAAGAACATCTTCCGATTCCTCTTGCCCCAACTCATATGCATCCATCAACTTGGGGTCAGCAGATGATTTAGGATCTGTGAGAGCTCTCTGACT
Arabidopsis thaliana unknown protein (At5g13260) mRNA,
Query: 66 gatgttcttttcaaggaggcttggcttacatacttttggaggagagc 112 |||||||| ||||||||||||||||| || ||||| ||||| |||||Sbjct: 1393 gatgttctcttcaaggaggcttggctcacgtacttctggagaagagc 1439
Sequenz 12ATCCTAAATCATCTGCTGACCCCAAGTTGATGGATGCATATGAGTTGGGGCAAGAGGAATCGGAAGATGTTCTTTTCAAGGAGGCTTGGCTTACATACTTTTGGAGGAGAGCCAAAGTGCATTGTGTAGAAGAGGATATTGCAGAAGAGAGGCTTCAGGTCTGGATTGGCCGTAGCGGACAGTCACCAACCACTCATGATGCAGTTGATGTTGAAAGAAGTTTGATAGAACTGAGGAAGCTGGGGAWTGAACAGCAGCTGTGGGAAGCATCTCGTAAAGAGATTGACCAACCTAATAATGGAAAAaTGAGTACTGATTCGGAGGCATCTCCATGATCTGTGAGAGCTCTCTGACTGAAGGGCGAATtCGTTTAAACCTGCAGGACTAGT
Arabidopsis thaliana unknown protein (At5g13260) mRNA, complete cds
Query: 66 gatgttcttttcaaggaggcttggcttacatacttttggaggagagc 112 |||||||| ||||||||||||||||| || ||||| ||||| |||||Sbjct: 1393 gatgttctcttcaaggaggcttggctcacgtacttctggagaagagc 1439
D1 (unbekannte Protein, 2 Sequenzen)
Sequenz 7CAAGCTCAGAATTAACCTCACTAAAGGGACTAGTCCTGCAGGTTTAAACGAATTCGCCCTTCASTCAGAGAGCTCTCACAGATCAAACAATTCSAAAAATATAGAAGTCTAARATGTCAAATAGATACAACTACTCCTCATCACCCTTAGTCTCCTCATCACCCTCACTCTCCTTATCAGACTTATCATTCTCTTCACCGTTACTCCCCGGACATGGAGGAAGATTTTTTCCTGATTCAAAAAGAAAAGTTAGATTGGGCCTGAAGCGCTGCTTACCTTTTGTTCTCTATCTCCTTTGTTGTCGCAATCTCCTCCTCTCTCTTTCTTCTCTCTTCTTCTCTATGTCGGCTACAACAGCAAGCTCGGCATTGMGAAMACCTATATTACCCTCCATTGCAGATATTGTCTCTCTATCCCCGTGATCTGTGAGAGCTCTCT
Atropa belladonna partial mRNA, 3'UTR, clone nh13.4 Query: 1 caagctcagaattaacc-tcactaaagggactagtcctgcaggtttaaacgaattcgccc 59 ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct: 513 caagctcagaattaaccctcactaaagggactagtcctgcaggtttaaacgaattcgccc 454Query: 60 ttc 62 |||Sbjct: 453 ttc 451
101
Sequenz 3ATCGGAGAGGAATATTGAGAGTATGCTGTCAGTTGAAATGGCTCTAAGAGGATAGCTCCTCAAGGTAGAGGATGCTGTTATTCTTGCATTGGCACAGCATCGGCGCTCAAATGTAGTCCCGCAGTTCTCTGmTCTGTGAGaGGTCTCTGACTGA
Arabidopsis thaliana genomic DNA, chromosome 5, P1 clone:MQM1, Unidentifizierte Protein Query: 63 aggtagaggatgctgttattcttgcattggcacag 97 |||| |||||||||||||| |||||||| ||||||Sbjct: 74644 aggttgaggatgctgttatgcttgcattcgcacag 74678
D2 (pflanzliche DNA, 3 Sequenzen)
Sequenz 4TTCGCCTTCAGTCAGAKAGCTCTKCAGATCAAAACGAATAAATTTATATCKKAGATGCATCTTTTCATAATAATACACCATCCTTCTGAAATTGTGAATACGTCTCTGAATGTGATGCATTTGAAACATTATAATACGAAGTYATTGTAAGTTGAGTAAAYCTGGGAAGTCGCATATBGTAAAATTACCCAGGAATATGGTTATTCACCCAWTGAAAATTACTTTGATAAATAAGATACAAGgTAWTGKCAAACACATC
Arabidopsis thaliana chromosome 1 BAC F6D5 genomic sequence, Query: 29 tcaaaacgaataaatttat 47 |||||||||||||||||||Sbjct: 1643 tcaaaacgaataaatttat 1661
Sequenz 5AAACGAATAAATTTATATCTTAGATGCACCTTTTCATAATAATACACCAKCCTTCTGAAATTGTGAATACGCCTCTGAATGTGATGCATTTGAAACATTATAATACGAAGTCATTGTTAGTTGAGTAAACCTGGGAAGTGCATATGTAARATTACCCAGGACTATGGTCATTCACCCATTAARAATTACTTTTATAAATRAGATATAAGTATGTCAAACACAYTAAACGAAAAATTGAAAGgARAAAATGG
Genomic sequence for Arabidopsis thaliana BAC F27F5 from chromosome I, Query: 7 ataaatttatatcttagatg 26 ||||||||||||||||||||Sbjct: 134258 ataaatttatatcttagatg 134277
Sequenz 6NTCAAACAATTCCAAAAATATAGAAGTCTAAAATGgTCAAATAGATACAACTACTCCTCATCACCCTTAGTCTCCTCATCACCCTYCACTCTCCTTATCAGACTTATCATTCTCTTCACCGTCACTCTYCGGATCATGGAGGAAGATTTTTTtCCTGATTCAAAAAGAAAAGTTAGTTGGGGCTGAAGCGCGCTTACCTTTGgTCYCCATCYCCTTGGTTGGCGCAWYTTCCTCC
Caenorhabditis elegans cosmid C34B7, Query: 158 ttcaaaaagaaaagttagtt 177 ||||||||||||||||||||Sbjct: 3460 ttcaaaaagaaaagttagtt 3479
102
Anhang3: DOGS abbreviated genome size table (Sat Jan 13 16:42:49MET 2001)
-----------------------------------------------------------Organism Genome size-----------------------------------------------------------Amoeba dubia 670,000,000,000Amoeba proteus 290,000,000,000Ophioglossum petiolatum 160,000,000,000Protopterus aethiopicus 139,000,000,000Fritillaria assyriaca 124,900,000,000Lilium longiflorum 90,000,000,000Amphiuma means 84,000,000,000Necturus maculosus 81,300,000,000Pinus resinosa 68,000,000,000Lilium formosanum 36,000,000,000Coscinodiscus asteromphalus 25,000,000,000Triturus cristatus 20,600,000,000Allium cepa 18,000,000,000Schistocerca gregaria 9,300,000,000Paramecium caudatum 8,600,000,000Bufo bufo 6,900,000,000Scyliorhinus stellatus 6,000,000,000Orycteropus afer 5,763,500,000Leuascus cephalus 5,400,000,000Peromyscus eremiticus 5,294,700,000Tarsius syrichta 5,151,600,000Cercopithecus cephus 5,141,700,000Cercopithecus nigroviridis 5,117,100,000Zea mays 5,000,000,000Hordeum vulgare 5,000,000,000Thomomys townsendii 4,934,500,000Cercopithecus neglectus 4,796,300,000Dypodomys ordii monoensis 4,658,200,000Isodon macrourus 4,589,100,000Isodon obesulus 4,554,500,000Cercopithecus aethiops griseoviridis 4,490,400,000Thomomys bottae 4,485,500,000Parameles nasuta 4,426,200,000Macropus robustus 4,396,600,000Parameles gunni 4,357,200,000Cercopithecus nictitans 4,342,400,000Thomomys umbrinus 4,317,700,000Octodon degus 4,263,400,000Nasalis larvatus 4,258,500,000Didelphis azarae azarae 4,238,700,000Dypodomys spectabilis spectabilis 4,214,100,000Tylacomys lagotis 4,209,100,000Dypodomys ordii compactus 4,174,600,000Macropus giganteus 4,154,800,000Lasiorhinus latifrons 4,145,000,000Lutreolina crassicaudata paranasalis 4,140,000,000Galago senegalensis 4,130,200,000Cercopithecus cynosurus 4,130,200,000Monodelphis dimidiata 4,115,400,000Sciurus carolinensis 4,105,500,000Dypodomys spectabilis baileyi 4,105,500,000Cercopithecus aethiops aethiops 4,075,900,000Phascolomis mitchelli 4,071,000,000Dypodomys agilis perplexus 4,066,000,000Pongo pygmaeus 4,046,300,000Potorous tridactilys 4,026,600,000
103
Marmosa pusilla 4,026,600,000Peromyscus maniculatus 4,006,800,000Terrapene carolina 4,000,000,000Marmosa agilis chacoensis 3,977,200,000Cercopithecus sabaeus 3,962,400,000Cebus albifrons 3,927,900,000Peromyscus crinitus 3,922,900,000Galago crass.crassicaudatu 3,922,900,000Gerbillus pyramidum 3,913,100,000Cercopithecus aethiops tantalus 3,898,300,000Galago alleni 3,878,500,000Didelphis marsupialis aurita 3,848,900,000Ctenomys conoveri 3,848,900,000Cebus capucinus 3,829,200,000Ctenomys leucodon 3,824,200,000Nicotiana tabaccum 3,800,000,000Pan troglodytes 3,799,600,000Dypodomys deserti deserti 3,770,000,000Phascolarctus cinereus 3,765,000,000Ornitorhynchus anatinus 3,725,500,000Ctenomys freter 3,715,700,000Ctenomys boliviensis 3,715,700,000Symphalangus syndactylus 3,705,800,000Cercocebus aterrimus 3,705,800,000Cercocebus atys 3,691,000,000Ctenomys steinbachi 3,681,100,000Alouatta caraja 3,676,200,000Lemur mongoz coronatus 3,656,500,000Dypodomys heermani californicus 3,656,500,000Bos taurus 3,651,500,000Cebus apella 3,631,800,000Mesocricetus auratus 3,621,900,000Gerbillus campestris 3,621,900,000Cercopithecus talapoin 3,617,000,000Erinaceus europaeus 3,612,100,000Pongo pygmaeus 3,607,100,000Macaca silenus 3,582,400,000Ellobius fuscocapillus 3,582,400,000Pan troglodytes 3,577,500,000Ateles belzebuth 3,577,500,000Alouatta villosa 3,577,500,000Colobus polykomos 3,562,700,000Sminthopsis crassicaudata 3,557,800,000Dasyurops maculatus 3,557,800,000Cercatetus nanus 3,557,800,000Cercatetus concinnus 3,557,800,000Cricetulus griseus 3,547,900,000Macaca mulatta 3,543,000,000Nycticebus coucang 3,533,100,000Gorilla gorilla 3,523,200,000Ctenomys lewisi 3,513,400,000Macaca nemestrina 3,508,400,000Macaca fuscata 3,508,400,000Tachyglossus aculeatus 3,498,600,000Sarcophilus arrisi 3,498,600,000Lagothrix lagothricha 3,493,600,000Papio hamadryas 3,478,800,000Dypodomys merriami merriami 3,473,900,000Oryctolagus cuniculus 3,469,000,000Erythrocebus patas 3,469,000,000Cercocebus galeritus 3,464,000,000Mus musculus 3,454,200,000Macaca sylvana 3,454,200,000Papio sphinx 3,449,200,000Dypodomys microps 3,439,300,000
104
Cebuella pygmaea 3,439,300,000Hylobates agilis 3,429,500,000Chalomys laucha 3,424,500,000Ateles paniscus 3,424,500,000Macaca arctoides 3,409,700,000Macaca fascicularis 3,404,800,000Homo sapiens 3,400,000,000Macaca nigra 3,399,900,000Dypodomys panamintinus leucogenys 3,399,900,000Cavia porcellus 3,399,900,000Callithrix jacchus 3,385,100,000Macaca maura 3,380,100,000Apodemus sylvaticus 3,360,400,000Canis familiaris 3,355,500,000Cebus nigrivittatus 3,350,500,000Microtus agrestis 3,330,800,000Tupaia glis 3,325,900,000Equus caballus 3,311,000,000Raja montagui 3,300,000,000Hylobates muelleri muelleri 3,296,200,000Muntiacus muntjak muntjak 3,281,400,000Saimiri sciureus 3,251,800,000Perodicticus potto potto 3,251,800,000Ovis aries 3,251,800,000Perodicticus potto edwardsi 3,246,900,000Hapalemur griseus griseus 3,242,000,000Hylobates klossi 3,222,200,000Holochilus vulpinus 3,217,300,000Ateles geoffroy 3,207,400,000Lepilemur mustelinus 3,202,500,000Lama glama 3,202,500,000Hapalemur simus 3,202,500,000Hapalemur gr.occidentalis 3,202,500,000Galago crass.argentatus 3,202,500,000Lama vicugna 3,197,600,000Capra hircus 3,197,600,000Hylobates moloch 3,192,600,000Hylobates lar 3,192,600,000Apodemus flavicollis 3,177,800,000Lama huanacus 3,163,000,000Hapalemur gr.olivaceus 3,138,300,000Clethrionomys rufocans 3,138,300,000Hapalemur gr.alaotrensis 3,133,400,000Ctenomys opimus 3,118,600,000Akodon xantorhinus 3,118,600,000Sus scrofa 3,108,700,000Xenopus laevis 3,100,000,000Rattus rattus 3,093,900,000Lemur macaco rufus 3,084,100,000Muntiacus reevesi 3,074,200,000Microcebus murinus 3,074,200,000Lemur catta 3,069,300,000Apodemus agrari 3,069,300,000Chalomys musculinus 3,059,400,000Lemur mongoz mongoz 3,049,500,000Lemur macaco fulvus 3,049,500,000Chincilla laniger 3,029,800,000Akodon olivaceus 3,010,000,000Ellobius lutescens 2,990,300,000Neotoma floridana 2,955,800,000Microtus montanus 2,955,800,000Ellobius talpinus 2,955,800,000Dypodomys heermani tularensis 2,955,800,000Bolomys obscurus 2,945,900,000Camelus dromedarius 2,926,200,000
105
Rattus norvegicus 2,900,000,000Tadarida brasiliensis 2,896,600,000Akodon molinae 2,876,800,000Chalomys laucha laucha 2,862,000,000Cabreramys sp. 2,847,200,000Clethrionomys rutilus 2,842,300,000Microtus arvalis 2,837,300,000Arvicola terrestris 2,837,300,000Camelus bactrianus 2,817,600,000Meriones unguiculatus 2,807,700,000Phyllotis griseoflavus 2,797,900,000Eligmontia sp. 2,792,900,000Scapteromys aquaticus 2,768,300,000Peromyscus floridanus 2,768,300,000Clethrionomys glereolus 2,768,300,000Oryzomys nigripes flavescens 2,763,300,000Chalomys callosus callosus 2,763,300,000Akodon mollis 2,728,800,000Loligo loligo 2,700,000,000Limulus polyphemus 2,700,000,000Carcarias obscurus 2,700,000,000Microtus ochragaster 2,699,200,000Akodon dolores 2,694,200,000Microtus longicaudatus 2,659,700,000Oxymycteris rufus platensis 2,630,100,000Caiman crocodylus 2,600,000,000Acomys cahirinus 2,585,700,000Microtus subterraneus 2,546,200,000Thomomys talpoides 2,536,300,000Eumops perotis perotis 2,536,300,000Muntiacus muntjak vaginalis 2,521,500,000Microtus oregoni 2,511,700,000Parascaris equorum 2,500,000,000Natrix natrix 2,500,000,000Microtus pennsylvanicus 2,477,100,000Microtus duodecimcostatus 2,477,100,000Microtus oeconomus 2,437,600,000Microtus californicus 2,432,700,000Akodon azarae 2,393,200,000Callicebus cupreus 2,264,900,000Pipistrellus kuhli 2,260,000,000Callicebus torquatus 2,225,500,000Eptesicus fuscus 2,220,500,000Pteropus giganteus 2,186,000,000Barbastella barbastellus 2,171,200,000Thomomys monticola 2,136,600,000Myotis myotis 2,116,900,000Boa constrictor 2,100,000,000Pipistrellus savii 1,973,800,000Rhinolophus ferrumequinum 1,929,400,000Lampreta planeri 1,900,000,000Danio rerio 1,900,000,000Myotis mistacinus 1,899,800,000Rhinolophus hipposideros 1,894,800,000Rhinolophus euryale 1,840,600,000Myotis capaccinii 1,820,800,000Aplysia californica 1,800,000,000Miniopterus schreibensi 1,707,300,000Python reticulatus 1,700,000,000Cyprinus carpio 1,700,000,000Erysiphe cichoracearum 1,500,000,000Cerebratulus 1,400,000,000Spisula solidissima 1,200,000,000Gallus gallus 1,200,000,000Glycine max 1,115,000,000
106
Strongylocentrotus purpuratus 900,000,000Musca domestica 900,000,000Crassostrea virginica 700,000,000Aurelia aurita 700,000,000Lycopersicon esculentum 655,000,000Oryza sativa 400,000,000Medicago truncatula 400,000,000Fugu rubripes 400,000,000Tetraodon nigroviridis 350,000,000Schistosoma mansoni 270,000,000Sarcocystis cruzi 201,000,000Tetrahymena pyriformis 200,000,000Prosimulium multidentatum 200,000,000Ciona intestinalis 200,000,000Chironomus tentans 200,000,000Paramecium aurelia 190,000,000Drosophila melanogaster 180,000,000Chlamydomonas reinhardtii 100,000,000Caenorhabditis elegans 100,000,000Brugia malayi 100,000,000Arabidopsis thaliana 100,000,000Toxoplasma gondii 89,000,000Eimeria tenella 70,000,000Eimeria acervulina 70,000,000Trypanosoma brucei 35,000,000Navicola pelliculosa 35,000,000Dictyostelium discoideum 34,000,000Emericella nidulans 31,000,000Aspergillus nidulans 31,000,000Plasmodium falciparum 25,000,000Plasmodium berghei 25,000,000Entamoeba histolytica 20,000,000Schizosaccharomyces pombe 14,000,000Saccharomyces cerevisiae 12,067,280Giardia lamblia 12,000,000Giardia intestinalis 12,000,000Escherichia coli 4,639,221Mycobacterium tuberculosis 4,397,000Bacillus subtilis 4,170,000Synechocystis sp. strain PCC6803 3,573,470Mycobacterium leprae 2,800,000Haemophilus influenzae 1,830,137Helicobacter pylori 1,667,867Methanococcus jannaschii 1,664,974Borrelia garinii 953,000Borrelia afzelii 948,000Borrelia burgdorferi 946,000Mycoplasma pneumoniae 816,394Mycoplasma genitalium 580,000Human immunodeficiency virus type 1 9,750-----------------------------------------------------------
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Danksagung
Meiner erste Dank gilt Prof. Hildebrandt, für die Überlassung des interessanten Themas, für seinefürsorgliche Leitung und Unterstützung in Form wöchentlicher Gruppensitzungen, produktiverDiskussionen, und für seine teils nächtigen oder an Wochenenden bezüglich meiner Promotiongeleisteten Arbeiten.
Ein von Dr. Techel beantragtes BMBF-Stipendium machte meinen wissenschaftlichen Aufenthalt inDeutschland finanziell überhaupt erst möglich. Ich danke ihm auch für die meisten produktivenwissenschaftlichen Diskussionen und für die sprachliche Unterstützung, durch die dieseDoktorarbeit besser lesbar wird.
Ich danke Prof. Beyersmann für die sehr schnelle Fertigstellung eines Gutachtens zu dieser Arbeit.
Dr. Heyer vom Max-Plank-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie in Golm danke ich für dieÜberlassung der transgenen Solanum als Testmodell.
Allen Kollegen in der AG Hildebrandt danke ich für die lockere Atmosphäre, für allewissenschaftlichen, technischen oder sprachlichen Unterstützungen.