Entwurf und Selektion von EGF-R spezifischen Peptiden ... · PDF fileEntwurf und Selektion von EGF-R spezifischen Peptiden, sowie Generierung und Charakterisierung von Peptid-Enzym-Fusionen

Entwurf und Selektion von EGF-R spezifischen Peptiden,

sowie Generierung und Charakterisierung von

Peptid-Enzym-Fusionen

für die zielgerichtete Lokalisation am

epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor

Inaugural Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde

der Fakultät für Biologie

der Albert-Ludwigs Universität Freiburg

vorgelegt von

Illip Burmester

aus Frankfurt/Main

Mai 2008

Dekan der Fakultät für Biologie: Prof. Dr. Ad Aertsen

Betreuer der Arbeit: Jun.Prof. Dr. Kristian Müller

Co-Referent: PD Dr. Dirk Schneider

Vorsitzender der Dissertationskommision: Prof. Dr. Eberhard Schäfer

Tag der Verkündung des Prüfungsergebnisses: 24.11.2009

Meiner Familie

Danksagungen Juniorprof. Dr. Kristian Müller danke ich für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe und die

Bereitstellung eines hochinteressanten Themas, welches ich im Rahmen eines Stipendiums

der Novartis Stiftung für therapeutische Forschung bearbeiten durfte.

Dr. Katja Arndt danke ich für ihr immer offenes Ohr und die Diskussionen bei den

Laborseminaren.

Meinem Kumpel Jochen Hecky danke ich für alle schönen und schweren Stunden, die mit

„Badesalz“ und viel Spaß erträglicher wurden.

Annette, ich glaube wir waren ein gutes Team!

Urs, Du warst immer ein sprudelnder Quell der Motivation mit Deiner mitreißenden Art.

Jody, we had a lot of fun in the lab, at lunch time and at the Kohler-Eck!

Allen Mitstreitern im Labor danke ich für die gute Stimmung.

Bei Gudrun Krüger möchte ich mich für Ihren unermesslichen Erfahrungsschatz bedanken,

von dem ich unendlich profitiert habe.

Bei Susanne Knall bedanke ich mich für die gute technische Hilfe.

Dr. Ekkehard Schulze danke ich für die exzellente Unterstützung am LI-COR Odyssey und

bei der konfokalen Immunfluoreszenz.

Prof. Dr. Sippel möchte ich für anregende und kritische Diskussionen danken, die im

schwierigen Fahrwasser für Orientierung sorgten.

Veröffentlichungen und Manuskripte

„EGF-R Targeted Multimeric Peptide-Enzyme Fusion Construct, Generated By Genetic

Fragmentation And Phage Display Selection”

Illip Burmester, Annette Gaida, Katja M. Arndt, Kristian M. Müller

-in Präparation-

„Rational Design of EGF-R Binding Peptides“

A. Gaida, I. Burmester, K. M. Arndt, K. M. Müller

-eingereicht-

„Life CAT/Dead CAT“

S. C. Stebel A. Gaida, I. Burmester, K. M. Arndt, K. M. Müller

-in Präparation-

Posterpräsentationen

Illip Burmester, Kristian M. Müller, “A Dominant Binding Motif of an Antibody Interacting with

EGF-Receptor Identified by Random DNA Fragmentation and Phage Display Selection”

Protein Sorting, Freiburg, Germany, March 6th - 8th 2005

Illip Burmester, Annette Gaida, Kristian M. Müller, “An antibody derived peptide as a

targeting module for the tumor marker EGF-Receptor”

Bioperspectives 2005, Wiesbaden, Germany, May 10th - 12th 2005

Illip Burmester, Annette Gaida, Kristian M. Müller, „Identification of an EGF-Receptor binding

peptide module for tumor targeting based on genetic fragmentation and phage display”,

Targeting the Kinome, Basel, Switzerland, December 4th - 6th 2006

Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne zulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus anderen Quellen direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter Angabe der Quellen gekennzeichnet. Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- beziehungsweise Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Die Bestimmung der Promotionsordnung der Fakultät für Biologie der Universität Freiburg sind mir bekannt, insbesondere weiß ich, dass ich vor Vollzug der Promotion zur Führung des Doktortitels nicht berechtigt bin. ___________________________ Illip Burmester

1 Einleitung ............................................................................ 1

1.1 Die EGF-R Familie .................................................................. 1

1.2 Biologische Funktion des EGF-R ......................................... 2

1.3 Liganden der EGF-R Familie ................................................. 3

1.4 Struktur des EGF-R ................................................................ 4

1.5 Rezeptor Aktivierung ............................................................. 5

1.6 EGF-R in der Tumorbiologie ................................................. 6

1.7 Wichtige Strategien zur zielgerichteten Inaktivierung des EGF-R ..................................................................................... 7

1.7.1 Antikörper ......................................................................................................... 7 1.7.2 Tyrosinkinase Inhibitoren ................................................................................ 9

1.8 Chloramphenikol-Acetyltransferase ................................... 10

1.9 EGF-R spezifischer, monoklonaler Antikörper 425 ........... 12

1.10 Einsatz von Peptiden in der Tumortherapie ....................... 13

2 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit ............................... 14

3 Konzeption der Ansätze ................................................... 15

4 Kapitel 1. Ansätze zum semirationalen Peptiddesign .. 20

4.1 Isolierung des Zielproteins sEGF-R aus A431 Zellkulturüberstand ............................................................. 20

4.2 Phage Display basierte Anreicherung eines EGF-R spezifischen Peptidmoduls aus einer Single-Chain Antikörper Genbibliothek .................................................... 21

4.2.1 Einleitung ........................................................................................................ 21 4.2.2 Ergebnisse ...................................................................................................... 22

4.2.2.1 Generierung der Genbibliothek durch DNase I Fragmentierung des scFv 425 Gens ........................................................................................ 22

4.2.2.2 Phage Display Selektion ........................................................................ 23 4.2.2.3 Bindungs-Rangliste drei dominanter Phagenklone aus der letzten

Selektionsrunde ..................................................................................... 26

4.3 Generierung eines N- und C-terminal Peptid dekorierten Fusionsenzyms: S-CAT-S, und Darstellung der Interaktionsstudien mit dem EGF-R ................................... 27

4.3.1 Einleitung ........................................................................................................ 27 4.3.2 Ergebnisse ...................................................................................................... 27

4.3.2.1 Klonierung der SSHIFTF codierenden Sequenz an das cat-Gen ........ 27 4.3.2.2 Rekombinante Herstellung und Reinigung ........................................... 28 4.3.2.3 Nachweis EGF-R spezifischer Bindung des S-CAT-S Konstrukts

mittels ELISA .......................................................................................... 29 4.3.2.4 Nachweis zellulärer Bindung und Analyse der zellulären Distribution

mittels konfokaler Immunfluoreszenz ................................................... 35 4.3.2.5 Test auf S-CAT-S : sEGF-R Interaktion mittels

Oberflächenplasmonresonanz .............................................................. 39 4.3.2.6 Wirkung des S-CAT-S Konstrukts auf den Wundverschluss von A431

Zellen ....................................................................................................... 42 4.3.2.7 Test auf Interaktion des S-CAT-S Fusionsproteins mit

membranständigem EGF-R auf A431 Zellen mittels Durchflusszytometrie ............................................................................. 45

4.3.3 Diskussion ...................................................................................................... 47

4.4 Das QWSSHIFTF-Streptavidin Konstrukt ........................... 50 4.4.1 Einleitung ........................................................................................................ 50 4.4.2 Ergebnisse ...................................................................................................... 51

4.4.2.1 ELISA basierter Versuch eines Bindungsnachweises für den QWSSHIFTF Streptavidin Komplex an immobilisierte sEGF-R Proteinoberfläche ................................................................................... 51

4.4.2.2 Bindungsnachweis für den QWSSHIFTF : NeutrAvidin Komplex an A431 Zellen mittels Durchflusszytometrie ............................................ 53

4.4.3 Diskussion ...................................................................................................... 55

4.5 Das S-GST-S Fusionsprotein .............................................. 56 4.5.1 Einleitung ........................................................................................................ 56 4.5.2 Ergebnisse ...................................................................................................... 56

4.5.2.1 Rekombinante Herstellung und Reinigung ........................................... 56 4.5.2.2 ELISA basierter Test auf S-GST-S : sEGF-R Interaktion ...................... 58

4.5.3 Diskussion ...................................................................................................... 58

4.6 Das SSHIFTF-Bla-T-Zip Konstrukt ...................................... 59 4.6.1 Einleitung ........................................................................................................ 59 4.6.2 Ergebnisse ...................................................................................................... 60

4.6.2.1 Klonierung und Reinigung ..................................................................... 60 4.6.3 Diskussion ...................................................................................................... 61

5 Kapitel 2 Ansätze zum rationalen Peptiddesign ........... 62

5.1 CDR H3 abgeleitetes Peptid als bindendes Modul für die Fusion an das CAT Enzym .................................................. 62

5.1.1 Einleitung ........................................................................................................ 62 5.1.2 Ergebnisse ...................................................................................................... 63 5.1.3 Das „CDR-Shuffling“ Vektorsystem ............................................................. 63 5.1.4 Klonierung, Reinigung und Interaktionsstudien des H3-CAT-H3

Fusionsproteins ............................................................................................. 66

5.1.4.1 ELISA basierter Test auf CDR H3 vermittelte Bindung des H3-CAT-H3 an immobilisierten sEGF-R .................................................................... 67

5.1.4.2 Untersuchung auf zelluläre Lokalisierung des H3-CAT-H3 mittels konfokaler Immunfluoreszenz ............................................................... 68

5.1.4.3 Biacore .................................................................................................... 69 5.1.5 Diskussion ...................................................................................................... 70

5.2 Der EGF-R Dimerisierungsarm als Inhibitor ...................... 71 5.2.1 Einleitung ........................................................................................................ 71 5.2.2 Ergebnisse ...................................................................................................... 73

5.2.2.1 Reinigung des biotinylierten EGF-R DA Peptids und anschließende Dekoration des Streptavidin zur Generierung eines Streptavidin : EGF-R DA Targetingkomplexes ..................................................................... 73

5.2.2.2 Oberflächenplasmonresonanz basierter Test auf EGFR-DA vermittelte Bindung an den sEGF-R ........................................................................ 75

5.2.2.3 FACS basierter Test auf EGFR-DA vermittelte Lokalisierung von EGFR-DA : NeutrAvidin OregonGreen 488 Komplexen auf A431 Zellen ................................................................................................................. 77

5.2.2.4 EGFR-DA vermittelte Inhibition des Wundverschlusses bei A431 Zellen ....................................................................................................... 78

5.2.3 Diskussion ...................................................................................................... 80

6 Ergänzendes Kapitel, Computer gestützte Simulation . 82

6.1 Einleitung ............................................................................. 82

6.2 Ergebnisse ........................................................................... 83

6.3 Diskussion ............................................................................ 87

7 Material & Methoden ......................................................... 89

7.1 Methoden .............................................................................. 89 7.1.1 Zellkultur ......................................................................................................... 89

7.1.1.1 Anzucht von A431 Kulturen ................................................................... 89 7.1.1.2 Ruhigstellung von Zellen ....................................................................... 89 7.1.1.3 Passagieren von A431 Kulturen für die Isolierung des löslichen

sEGF-R aus Zellkulturüberstand ........................................................... 90 7.1.1.4 Reinigung des sEGF-R aus Zellkulturüberstand .................................. 90 7.1.1.5 Fixieren von Zellen ................................................................................. 91

7.1.2 Phage Display ................................................................................................ 91 7.1.2.1 Amplifikation von Phagen ...................................................................... 91 7.1.2.2 Phagenselektion ..................................................................................... 92

7.1.3 Proteinbiochemische Methoden ................................................................... 93 7.1.3.1 Rekombinante Proteinexpression in E. coli RV308 .............................. 93 7.1.3.2 Zellaufschluss ........................................................................................ 93 7.1.3.3 SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ........................... 94 7.1.3.4 Coomassie-Blau Färbung von Proteingelen ......................................... 95 7.1.3.5 Western-Blot Analyse ............................................................................ 96

7.1.4 Chromatographische Methoden.................................................................... 96 7.1.4.1 Affinitätschromatographische Methoden ............................................. 96 7.1.4.2 Größenausschlusschromatographie .................................................... 98

7.1.5 Bindungsnachweismethoden ........................................................................ 99 7.1.5.1 Konfokale-Immunfluoreszenz ................................................................ 99 7.1.5.2 ELISA..................................................................................................... 100

7.1.5.3 Biacore .................................................................................................. 101 7.1.5.4 Durchflußzytometrie ............................................................................. 102

7.1.6 Zellaktivierungsassays ................................................................................ 102 7.1.6.1 Wundheilungsexperiment .................................................................... 102

7.1.7 Gentechnische Methoden ............................................................................ 104 7.1.7.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ...................................................... 104 7.1.7.2 DNase I Verdau ..................................................................................... 105 7.1.7.3 Präparation von Plasmid-DNA ............................................................. 105 7.1.7.4 Restriktionsverdau ............................................................................... 105 7.1.7.5 Agarose-Gel-Elektrophorese ............................................................... 105 7.1.7.6 Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ............................ 106 7.1.7.7 Ligation ................................................................................................. 106 7.1.7.8 Transformation ..................................................................................... 107 7.1.7.9 Kinasierung von Oligonukleotiden...................................................... 107 7.1.7.10 Hybidisierung komplementärer Oligonukleotide............................ 107 7.1.7.11 Dephosphorylierung von Plasmidvektoren .................................... 107

7.2 Material ............................................................................... 108 7.2.1 Zelllinien ....................................................................................................... 108 7.2.2 Bakterienstämme ......................................................................................... 108 7.2.3 Nährmedien .................................................................................................. 108 7.2.4 Rekombinante DNA-Technik ....................................................................... 108 7.2.5 Antikörper ..................................................................................................... 109 7.2.6 Puffer ............................................................................................................ 109

7.2.6.1 Allgemein .............................................................................................. 109 7.2.6.2 sEGF-R Reinigung ................................................................................ 109 7.2.6.3 Reinigung der CAT-Fusionsproteine .................................................. 110 7.2.6.4 Reinigung der GST-Fusionsproteine .................................................. 110 7.2.6.5 Reinigung der β-Laktamase Fusionsproteine .................................... 110 7.2.6.6 SDS-Gelelektrophorese........................................................................ 110

7.2.7 Säulen und Säulenmaterial.......................................................................... 111 7.2.8 Geräte und Software .................................................................................... 111 7.2.9 Chemikalien .................................................................................................. 112 7.2.10 Allgemeine Plastikware ............................................................................ 114

8 Literatur ........................................................................... 115

9 Anhang ............................................................................ 123

9.1 Abkürzungen ...................................................................... 123

9.2 Plasmidkarten .................................................................... 125

Zusammenfassung

Zusammenfassung

Die zentrale Bedeutung des EGF-R bezüglich der Regulation zellulärer Kernprozesse

(Proliferation, Differenzierung, Migration, anti-Apoptose, etc.) bildete die Grundlage für die

Entwicklung zahlreicher EGF-R basierter Therapieansätze. Einige Tyrosinkinaseinhibitoren

und EGF-R Familien spezifische Antikörper wurden bereits für die Behandlung von Tumoren

in Europa und den USA zugelassen.

In der vorliegenden Arbeit sollte die grundlegende Möglichkeit der Verwendung kleiner

Peptide als spezifisch bindende Module für die Fusion mit enzymatisch aktiven

Proteingerüsten ausgelotet werden.

Im semi-rationalen Ansatz wurden aus einer scFv 425 basierten Genbibliothek mittels Phage

Display Peptide isoliert, die den EGF-R spezifisch binden sollten. Phagenklone aus der

letzten Selektionsrunde zeigten in ELISA Experimenten auf immobilisiertem sEGF-R und auf

A431 Zellen ein deutliches Bindungssignal. Den isolierten Sequenzen war ein

charakteristisches HXX-Tripeptidmotiv gemeinsam. Die Struktur des parentalen Antikörpers

mAK 425 zeigte rückversichender weise exponierte Histidinseitenketten in zwei CDR-

Schleifen. Die Ergebnisse der Selektion erschienen daher konsistent.

Durch die Fusion der selektierten Peptidsequenz SSHIFTF an das trimere Enzym

Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT) wurde ein Fusionsprotein generiert (S-CAT-S) und

auf EGF-R spezifische Interaktion getestet. In Abhängigkeit der angewandten Methode

konnte eine spezifische Lokalisation des S-CAT-S Fusionsenzyms am EGF-R nicht

zweifelsfrei nachgewiesen werden. Mittels ELISA und konfokaler Immunfluoreszenz konnte

eine Bindung nachgewiesen werden, zeigte jedoch leichten unspezifischen Hintergrund.

Mittels Durchflusszytometrie und BIAcore konnte dagegen keine Bindung an A431 Zellen

bzw. an sEGF-R nachgewiesen werden. Die Neigung des CATwt Enzyms zu unspezifischer

Bindung und die mutmaßlich geringe Affinität des Peptids könnten für die beobachteten

Phänomene ursächlich gewesen sein.

Eine potentielle Bindestelle des Peptids SSHIFTF konnte unter Verwendung des Programms

AutoDock4 berechnet werden, die mit den experimentellen Ergebnissen und Daten aus der

Literatur konform war. Die berechnete Konformation zeigte das Peptid in einer Interaktion mit

dem EGF-R unter bedeutender Beteiligung des Histidins, welches in auffälliger Weise als

Tripeptidmotiv in allen angereicherten Phagenklonen aus der Selektion präsent war. Für den

parentalen Antikörper mAK 425 wurde eine Kompetition mit dem natürlichen Liganden EGF

beschrieben. Mit dieser Beobachtung konform zeigte die gerechnete Konformation das

Peptid, welches aus der CDR L3 entstammt, in unmittelbarer räumlicher Nähe zur EGF-

Kontaktstelle.

Zusammenfassung

In einem weiteren Projekt wurde die hypervariable Schleife der schweren Kette des mAK 425

(CDR H3) als bindendes Modul abgeleitet, da diese CDR bei vielen Antikörper-Antigen

Kontakten den größten Beitrag zur Bindung leistet, und an das CAT Enzym fusioniert (H3-

CAT-H3). Eine CDR H3 vermittelte Bindung des H3-CAT-H3 Fusionsproteins an den EGF-R

konnte weder mittels ELISA und konfokaler Immunfluoreszenz, noch mittels BIAcore

nachgewiesen werden.

Die Analyse der Kristallstruktur des EGF-R offenbarte einen weiteren potentiellen

Angriffspunkt für die Entwicklung eines EGF-R Inhibitors. Ein Teil der Domäne II, auch

Dimerisierungsarm bezeichnet, ist an zwei, für die Rezeptoraktivierung, wesentlichen

Interaktionen beteiligt. Die intramolekulare Interaktion mit der Domäne IV hält den Rezeptor

in der inaktiven Konformation, während die intermolekulare Interaktion mit dem

Dimerisierungsarm einer weiteren Domäne II den Großteil der Interaktionsfläche im aktiven

Rezeptordimer ausmacht.

Eine Bindung des Dimerisierungsarms (MYNLPTTQMDV) konnte mittels ELISA, BIAcore

und Durchflusszytometrie nicht nachgewiesen werden, was erwartet werden konnte, da der

Dimerisierungsarm in beiden möglichen (aktive und inaktive) Konformationen unzugänglich

vorliegt. Im Wundheilungsexperiment mit A431 Zellen konnte bei Koinkubation von EGF und

Dimerisierungsarm eine Reduktion der EGF induzierten Stimulation auf das Niveau der

Mediumkontrolle beobachtet werden. Bei alleiniger Inkubation mit dem Dimerisierungsarm

wurde die intrinsische Proliferationsrate der A431 Zellen auf ein Maß unter der

Mediumkontrolle reduziert. Mit den experimentellen Ergebnissen konform könnte folgender

Wirkmechanismus postuliert werden: Nach EGF induzierter Rezeptorumlagerung wird für

kurze Zeit die Domäne II exponiert und kann durch den Dimerisierungsarm gebunden

werden, was eine Dimerisierung mit einem zweiten aktiven Rezeptor und folglich die

Aktivierung unterbinden könnte. Ohne EGF induzierte Exponierung der Domäne II könnte

das Peptid dagegen nicht an den EGF-R binden, da die Domäne II in der autoinhibierten,

unzugänglichen Konformation vorläge.

Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Die EGF-R Familie

Die Familie der Epidermalen Wachstums Faktor Rezeptoren (EGF-R) umfasst die vier eng

verwandten Mitglieder EGF-R (ErbB1/HER1), ErbB2 (HER2/Neu), ErbB3 (HER3) und ErbB4

(HER4). Bei dieser Familie handelt es sich um membranintegrale Rezeptor-Tyrosinkinasen

(RTK) mit extrazellulärer Ligandenbindungsdomäne und intrazellulärer Tyrosinkinase

Domäne. Diese regulieren fundamentale zelluläre Prozesse, die das Schicksal einer Zelle

terminieren; dazu gehören Proliferation, Anti-Apoptose, Migration, und Differenzierung. Eine

besondere Aufgabe kommt den verschiedenen Rezeptoren bei der Embryonalentwicklung in

den spezifischen Organen zu.

Aufgrund der Steuerung dieser zentralen zellulären Vorgänge unterliegt die Aktivität der RTK

in normalen Zellen einer strikten Kontrolle. Aktivierende Veränderungen an der Struktur oder

der Signalleitung der RTK führen folglich zu Entwicklung, Progression und auch

aggressiverem Wachstum humaner Tumore.

Beinahe 25 Jahre nach der Entdeckung des EGF-R durch Stanley Cohen und Mitarbeiter im

Jahre 1978 wurde dessen Kristallstruktur in den Jahren 2002/03 durch mehrere

Arbeitsgruppen komplexiert mit EGF (Ogiso, Ishitani et al. 2002), mit TGFa (Garrett, McKern

et al. 2002) und in der inaktiven Konformation (Ferguson, Berger et al. 2003) unabhängig

voneinander gelöst. Die Kristallstrukturen des ErbB2 und ErbB3 Rezeptors wurden von Cho

und Leahy (Cho und Leahy 2002; Cho, Mason et al. 2003) aufgeklärt. Die ErbB4

Kristallstruktur wurde von Bouyain und Leahy (Bouyain, Longo et al. 2005) gelöst.

Strukturelle Besonderheiten weisen der ErbB2 Rezeptor auf, der in einer aktiven

Konformation (Cho, Mason et al. 2003) vorliegt und keinen bekannten Liganden besitzt (Citri,

Skaria et al. 2003), dem ErbB4 Rezeptor fehlt dagegen die Tyrosinkinase Aktivität. Die durch

diese Arbeiten gewonnenen grundlegenden Erkenntnisse zeichnen heute ein detailliertes

Modell der Rezeptoraktivierung auf molekularer Ebene und haben großen Einfluss auf die

Entwicklung von Tumortherapien genommen.

Einleitung

2

1.2 Biologische Funktion des EGF-R

Die Tyrosin-Kinase-Rezeptoren (RTK) der ErbB Familie steuern zentrale zelluläre Vorgänge,

die über das Überleben, die Proliferation, Differenzierung und die Motilität der Zelle

entscheiden. Ein komplexes Geflecht von kreuzvernetzten Signalleitungskaskaden wird

durch die Rezeptoren dieser Familie gesteuert (Abbildung 1). Zu den wichtigsten EGF-R

initiierten Signalkaskaden zählen: ERK, JAK/STAT, PKC und PI-3K.

Die zentrale Bedeutung der ErbB Rezeptoren während der Embryonalentwicklung wurde

durch Knockout-Studien an Mäusen gezeigt. Hierbei zeigten sich die durch Rezeptor

Knockouts verursachten Folgen als besonders schwerwiegend, mit Rezeptor spezifischen

Schwerpunkten bei den betroffenen Organen. EGF-R Knockout Mäuse zeigen embryonale

oder perinatale Letalität. Die Embryos und Neugeborenen weisen starke Schäden der

Lunge, der Haut, des Gastrointestinaltrakts und einiger Bereiche des Gehirns auf (Miettinen,

Berger et al. 1995; Threadgill, Dlugosz et al. 1995; Sibilia, Steinbach et al. 1998). ErbB2

Knockout Mäuse zeigen ebenfalls einen embryonal letalen Phänotyp, jedoch weisen diese

schwere Schäden im peripheren Nervensystem auf (Morris, Lin et al. 1999; Woldeyesus,

Abbildung 1.) EGF-R induzierte Signalleitungskaskaden. Das Phosphorylierungsmuster der intrazellulären regulatorischen Domäne beeinflusst die spatio/temporale Induktion der Signalleitungskaskaden (aus (Reuter, Morgan et al. 2007).

x 2

Einleitung

3

Britsch et al. 1999). Im Gegensatz zu den durchweg letalen Rezeptor Knockouts sind die

Folgen einzelner Liganden-Knockouts weniger dramatisch, was sich in einer mit

wildtypischen Artgenossen vergleichbaren Lebensdauer ausdrückt (Mann, Fowler et al.

1993). Diese Daten lassen vermuten, dass die ErbB Rezeptoren während der Entwicklung

eine zentrale und spezifische Rolle bei der Signalintegration spielen und sich eine gewisse

Redundanz bei den Liganden entwickelt hat.

1.3 Liganden der EGF-R Familie

Zu den Liganden der EGF-R Familie, die zu den Peptidhormonen zählen, gehören EGF,

TGFa, Amphiregulin (AR), Betacellulin (BTC), Epiregulin (EPR), Epigen, Heparin bindendes

EGF (HB-EGF) und die Neureguline (NRG) (Harari und Yarden 2000; Yarden und

Sliwkowski 2001). Die Liganden können nach ihrer Spezifität in drei Klassen unterteilt

werden. Zu den EGF-R spezifischen Liganden zählen EGF, TGFa und AR, die zweite

Gruppe umfasst BTC, HB-EGF und EPR, die eine duale Spezifität für den EGF-R und

ErbB4 aufweisen. NRG-1 und NRG-2 weisen ebenfalls duale Spezifität für die Rezeptoren

ErbB3 und ErbB4 auf, die NRG-3 und NRG-4 dagegen nur für ErbB4.

Einleitung

4

1.4 Struktur des EGF-R

Die Kristallstruktur der extrazellulären Domäne des aktiven EGF-R wurde im Jahre 2003

unabhängig in zwei Gruppen aufgeklärt. Die EGF komplexierte (Ogiso, Ishitani et al. 2002)

und die TGF-a komplexierte Struktur (Garrett, McKern et al. 2002) zeigten übereinstimmend

ausschließlich Rezeptor vermittelte Dimer-Kontakte. Diese Arbeiten deckten somit einen

vollständig neuen Dimerisierungsmechanismus für RTK auf, da alle bis dato bekannten RTK

durch bivalente Liganden dimerisiert und damit

aktiviert wurden. Die Kristallstruktur des EGF

komplexierten EGF-R Dimers zeigte jedoch, dass

zwischen den beiden EGF Molekülen im Dimer eine

Distanz von 79 Å liegt. Der Nomenklatur von Lax et al.

folgend (Lax, Burgess et al. 1988; Lax, Johnson et al.

1988) wird die extrazelluläre Liganden-

Bindungsdomäne in die Domänen I bis IV unterteilt.

Die Domänen I und III vermitteln die Interaktionen zu

den Liganden und sind als rechtshändige -Helices

aufgebaut. Domänen II und IV weisen eine

charakteristische starke Disulfidverbrückung auf.

Domäne II ist maßgeblich an der Rezeptor:Rezeptor-

Interaktion beteiligt und trägt den größten Teil zur

gesamten Kontaktfläche von 1270 Å2 bei. Ein

charakteristisch aus der Struktur herausragender Arm

der Domäne II wurde als Dimerisierungsarm

bezeichnet, welcher wesentliche Kontakte im

Rezeptordimer vermittelt. Domäne IV trägt ebenfalls

einen Teil zur Kontaktfläche des Rezeptordimers bei

und ist weiterhin an der autoinhibitorischen Interaktion mit dem Dimerisierungsarm beteiligt.

An die extrazelluläre Domäne schließen sich die kurze Transmembran- und

Juxtamembrandomäne an, gefolgt von der Tyrosinkinasedomäne und der abschließenden

regulatorischen Domäne, die spezifische Bindemotive für Adapterproteine enthält.

Abbildung 2.) Schematische Repräsentation des EGF-R aus Burgess et al. Mol. Cell, 2003.

Einleitung

5

1.5 Rezeptor Aktivierung

Der Dimerisierungsmechanismus des EGF-R stellt eine Besonderheit unter den RTK dar.

Wie bei dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), dem

Nervenwachstumsfaktor (NGF) und dem humanen Wachstumsfaktor (hGH), wurde zunächst

eine durch Bivalenz des Liganden vermittelte Dimerisierung vermutet (Gullick 1994;

Lemmon, Bu et al. 1997; Tzahar, Pinkas-Kramarski et al. 1997). Die Auflösung der

A.

B.

Abbildung 3.) Vergleich der Proteinstrukturen des aktiven (B.) EGF-R Dimers (PDB-ID: 1IVO) und des inaktiven (A.) EGF-R Monomers (PDB-ID: 1NQL). A. Die inaktive Konformation zeigt den Dimerisierungsarm (orange) in der autoinhibierenden Interaktion mit Domäne IV (grün). Durch die Distanz zwischen den Domänen I und III (grau) kann EGF keine hochaffine Bindung mit beiden Domänen eingehen. B. Nach EGF induzierter Umlagerung des Rezeptors wird die Domäne II aus der inhibierenden Interaktion befreit und interagiert mit der Domäne II eines weiteren aktiven EGF-R Monomers. Der Dimerisierungsarm eines Rezeptors (orange) interagiert dabei mit der Basis (pink) der Domäne II des anderen Rezeptors.

Kristallstrukturen verschiedener Mitglieder der ErbB Rezeptor-Familie in aktivierten und

inaktiven Konformationen (Cho und Leahy 2002; Garrett, McKern et al. 2002; Ogiso, Ishitani

et al. 2002; Cho, Mason et al. 2003; Ferguson, Berger et al. 2003; Garrett, McKern et al.

2003) zeigte aber einen völlig neuen Mechanismus, bei dem je ein Ligand mit nur je einem

Rezeptor interagiert. Die Bindung eines Liganden an ein Rezeptormonomer induziert eine

Konformationsänderung, wobei eine ausgeprägte Umlagerung der Domänen I und III, die die

Kontakte zu den Liganden bilden, relativ zueinander erfolgt, der Dimerisierungsarm der

Domäne II exponiert und aus der inhibitorischen Interaktion mit der Domäne IV befreit wird.

Die Dimerisierung erfolgt hierauf ausschließlich durch Rezeptor-Rezeptor Interaktionen,

I

III

I

III

II

II

Einleitung

6

woran vorwiegend die Domäne II, in geringerem Umfang vermutlich auch Domäne IV

(Berezov, Chen et al. 2002) beteiligt sind. Im Gegensatz zu anderen Rezeptoren sind die

Liganden nicht direkt an der Interaktion beteiligt.

Die Dimerisierung des aktivierten EGF-R erfolgt zu Homodimeren und zu Heterodimeren,

vorzugsweise mit ErbB2 (Graus-Porta, Beerli et al. 1997; Duneau, Vegh et al. 2007). Nach

dieser Signalleitungskaskade initiierenden Homo- bzw. Hetero-Dimerisierung zweier

Rezeptormoleküle, erfolgt die trans-Autophosphorylierung definierter Tyrosinreste in der

jeweiligen intrazellulären Aktivierungsdomäne (Daub, Weiss et al. 1996).

1.6 EGF-R in der Tumorbiologie

Aufgrund der Implikation der ErbB Rezeptoren in zentralen, zellulären Prozessen, die das

Überleben, die Proliferation, Mobilität und Apoptosis von Zellen steuern, findet man sie

entsprechend häufig bei der Entstehung von Tumoren, sowie deren aggressivem Wachstum

und Metastasierung involviert. Für den EGF-R konnte erstmals eine direkte Verbindung

zwischen Rezeptor-Tyrosinkinasen und humanen Tumoren nachgewiesen werden. Erste

Hinweise, dass der EGF-R zur malignen Transformation von Zellen beitragen kann, beruhen

auf einer Arbeit von Downward et al. 1984 (Downward, Yarden et al. 1984), die eine hohe

Homologie einer EGF-R Peptidsequenz zum v-erbB Onkogen feststellten. Durch diese

inspiriert, folgten Arbeiten, die zeigen konnten, dass eine Überexpression des EGF-R oder

ErbB2 die maligne Transformation von NIH-3T3 Zellen induzieren (Di Fiore, Pierce et al.

1987). Weitere Arbeiten konnten den kausalen Zusammenhang zwischen EGF-R Anomalien

und der Entstehung von Tumoren herstellen. Der EGF-R stellt seither einen der wichtigsten

und meist untersuchten Tumormarker dar.

Die häufigsten in Tumoren gefundenen Anomalien der ErbB Rezeptoren sind auf

Genamplifizierung beruhende Überexpression des Rezeptors (Ohgaki, Dessen et al. 2004;

Sunpaweravong, Sunpaweravong et al. 2005), Mutation und damit verbundene konstitutive

Aktivierung des Rezeptors (Humphrey, Wong et al. 1990; Yamazaki, Ohba et al. 1990),

sowie parakrine und autokrine Stimulation durch Liganden zurückzuführen.

Dieser zentralen Bedeutung des EGF-R bei der Entstehung von Tumoren stehen jedoch nur

insgesamt 9 ErbB spezifische Antikörper gegenüber, von denen bis heute nur 3 als

Therapeutika durch die FDA zugelassen wurden, gleichwohl die Idee, Antikörper für EGF-R

spezifische Tumortherapie einzusetzen bereits vor 20 Jahren beschrieben wurde (Murthy,

Basu et al. 1987; Rodeck, Herlyn et al. 1987), was die Komplexität und Problematik der

zielgerichteten Tumortherapie deutlich zum Ausdruck bringt.

Einleitung

7

1.7 Wichtige Strategien zur zielgerichteten Inaktivierung des EGF-R

In den folgenden Abschnitten wird auf die Strategien eingegangen, die zu den klinisch

fortgeschrittenen und intensiv studierten zuzuordnen sind.

1.7.1 Antikörper

Anti-EGF-R Tumortherapien basierend auf Inhibition der Rezeptorfunktion zeigten in der

Klinik keinen so durchschlagenden Erfolg, wie man es von den präklinischen Studien hätte

erwarten können. Dies liegt sicherlich an der Kombination von physiologischen

Veränderungen in Tumorgeweben (Unabhängigkeit und/oder Redundanz vieler Signalwege)

und den suboptimalen Parametern (Tumorpenetration, maximal erreichbare Dosis, etc) vieler

Therapeutika.

Zu den intensiv untersuchten Antikörpern gehört Erbitux (Cetuximab), der durch die

amerikanische „Food and Drug Administration“ (FDA) im Jahre 2004 für die Behandlung von

Patienten mit fortgeschrittenen Kolonkarzinomen zugelassen wurde, die nicht mehr auf

Behandlung mit Irinotecan ansprechen. Die Zulassung beruhte auf einer Studie, die eine

klinische Reaktion von 11% als Monotherapie und 22,9% als Kombinationstherapeutikum

zeigte (Cunningham, Humblet et al. 2004). Mit einer Reaktionsrate von 10% zeigte sich der

vollständig humane Antikörper Panitumumab (ABX-EGF) bei Patienten mit fortgeschrittenem

Kolonkarzinom ähnlich erfolgreich (J. R. Hecht 2004). Auch der humanisierte Antikörper

Matuzumab (EMD 72000) war bei der Behandlung von Kolonkarzinoma nicht erfolgreicher

(Vanhoefer, Tewes et al. 2004); (R. Salazar 2004).

Tabelle 1.) Übersicht über Antikörper in klinischen Studien bzw. mit Zulassung durch die FDA. Stand: Juni 2007

Handelsname Zielprotein Firma Entwicklungsstatus Alternativbezeichnung Typ

Matuzumab EGF-R Merck KGaA klinische Studien EMD 72000 humanisierter AK

Erbitux EGF-R ImClone & Merck FDA Zulassung,

2004 Cetuximab, IMC-C225 chimärer AK

HuMax-EGFR EGF-R in FDA Fast Track

Panitumumab EGF-R Amgen/Abgenix FDA Zulassung,

2006 Vectibix, ABX-EGF vollst. humaner AK

TheraCIM EGF-R YM Biosciences & CIM klinische Studien hR-3 humanisierter AK

Mab 806 EGF-R vIII Ludwig Institut

Herceptin ErbB2 Genentech & Roche FDA Zulassung,

1998 Trastuzumab humanisierter AK

Omnitarg ErbB2 Genentech klinische Studien Pertuzumab, 2C4 humanisierter AK

MDX-211 ErbB2 & Fc

RI klinische Studien

Einleitung

8

Einige Studien zeigten eine höhere Effizienz bei frühzeitigem Einsatz der Antikörper in

Kombination mit Chemo- und Strahlentherapie. In einer Studie konnte für Erbitux eine

Reaktionsrate von 80% nachgewiesen werden (Matar, Rojo et al. 2004). In einer weiteren

Studie mit Patienten, die an fortgeschrittenen Nacken-und-Kopf-Tumoren leiden konnte eine

signifikante Steigerung der mittleren Überlebensdauer von 54 Monaten gegenüber 28

Monaten ohne Erbitux gezeigt werden.

Die beschriebenen Sachverhalte zeigen deutlich den enormen Aufwand zur Optimierung der

Anwendungsparameter für jeden einzelnen Antikörper und die relativ limitierte Effizienz der

entwickelten Antikörper im klinischen Einsatz, entgegen viel versprechender präklinischer

Studien.

Bisher befinden sich 9 anti-ErbB Antikörper in verschiedenen Phasen klinischer Studien, von

diesen erhielten Erbitux und Herceptin die Zulassung für die Behandlung von kolorektal

Karzinomen (Erbitux) bzw. ErbB2 überexprimierenden Brustkrebs (Herceptin) durch die FDA

(Tabelle 1).

Einleitung

9

1.7.2 Tyrosinkinase Inhibitoren

Neben Antikörpern stellen die Tyrosinkinase Inhibitoren (TKI) die zweite große Klasse EGF-

R spezifischer Inhibitoren. Tyrosinkinase Inhibitoren binden reversibel order irreversibel an

die Kinasedomäne des Rezeptors. Auch diese Klasse EGF-R spezifischer Therapeutika

setzt auf die Inhibition der Rezeptorfunktion und unterliegt somit dem gleichen, wie schon für

die Antikörper beschrieben, konzeptionellen Nachteil (1.7.1).

Durch die Verfügbarkeit der Kristallstrukturen der EGF-R Familienmitglieder und dem

Fortschritt in der Computer gestützten Simulation erfuhr die Klasse kleiner Moleküle dennoch

einen großen Aufschwung in der pharmazeutischen Industrie, die im „high throughput“

Verfahren große chemische Bibliotheken auf potentielle Inhibitoren durchsuchten.

Ein prominentes Beispiel eines in präklinischen Studien sehr erfolgreichen (Baselga und

Averbuch 2000; Ciardiello, Caputo et al. 2000), aber in späteren breit angelegten klinischen

Studien wenig erfolgreichen (Thatcher, Chang et al. 2005) TKIs ist Gefitinib. Später sollte

sich herausstellen, dass eine Mutation in der Tyrosinkinase-Domäne indikativ für eine

erfolgreiche Therapie mit Gefitinib war (Lynch, Bell et al. 2004). Ein irreversibler Pan-ErbB-

TKI ist Carnetinib, dessen Funktionsmechanismus auf der Alkylierung eines Cysteins in der

ATP-Bindetasche einerseits (Smaill, Rewcastle et al. 2000) und auf der durch

Ubiquitinylierung induzierten Rezeptordegradation andererseits beruht (Citri, Alroy et al.

2002). Tabelle 2 zeigt eine Übersicht ErbB spezifischer Tyrosinkinase Inhibitoren (Bianco,

Gelardi et al. 2007).

Tabelle 2) Anti-EGF-R Tyrosinkinase Inhibitoren

Substanz Zielprotein Tumor

ZD1839, Gefitinib EGF-R NSCLC

OSI-774, Eroltinib EGF-R, EGF-RvIII NSCLC, Pankreas

CI-1033, Carnetinib Pan-ErbB SCC

ZD6474 EGF-R, VEGF-R-2, RET NSCLC

EKB-569 EGF-R, ErbB2 Kolorektal

PKI-166 EGF-R, ErbB2 Prostata, renal

GW-572016 EGF-R, ErbB2 Brust, NSCLC

ARRY-334543 EGF-R, ErbB2 Brust, Lunge, Epidermis

PD153035 EGF-R Glioma, Brust, SCCHN

AEE788 EGF-R, VEGF-R-2 Glioma, Kolon

BMS 599626 EGF-R, ErbB2 Solide Tumore

Einleitung

10

1.8 Chloramphenikol-Acetyltransferase

Das Enzym Chloramphenikol-Acetyltransferase I (CATI) vermittelt die bakterielle Resistenz

gegen das Antibiotikum Chloramphenicol, einem potenten Inhibitor der bakteriellen

Proteinsynthese mit breitem Wirkspektrum (Schwarz, Kehrenberg et al. 2004). Die CAT

Enzymfamilie wird in die Typ-A und Typ-B Acetyltransferasen unterteilt, wobei zur ersteren

mindestens 16 Gruppen und zu letzterer fünf Gruppen gezählt werden. Das catI Gen wurde

ursprünglich als Teil des Transposons Tn9 in E.coli identifiziert und stellt den Prototypen der

A-1 Gruppe dar (Alton und Vapnek 1979). Die drei aktiven Zentren des homo-trimeren

Enzyms liegen an den Schnittstellen der drei Untereinheiten (Day, Murray et al. 1995), wobei

A.

B.

Abbildung 4.) Stereo-„Cartoon“ Darstellung der bakteriellen Chloramphenikol-Acetyltransferase (CAT, PDB-ID: 1NOCb). A. Aufsicht auf das trimere Enzym. Untereinheiten sind farblich unterschieden. Termini aller Untereinheiten wurden als Kugeln dargestellt. B. Seitenansicht der trimeren CAT, um 90 ° gekippte Darstellung.

Einleitung

11

das H-195 (Nomenklatur für CATIII) das katalytisch aktive Zentrum bildet und entsprechend

hochkonserviert ist (Kleanthous, Cullis et al. 1985).

Die Termini der trimeren CATI sind tolerant gegenüber Modifikationen, liegen exponiert an

der Oberfläche des Enzymkomplexes (Abbildung 4) und bieten damit gute Voraussetzungen

für die Fusion EGF-R spezifischer Peptide. Die sechsfache Valenz der fusionierten Peptide

sollte zudem eine gute Ausgangsbasis für das Zustandekommen eines Aviditätseffekts

darstellen. Die gute rekombinante Expressionsrate des cytosolischen CAT Enzyms in E. coli

RV308 und die effiziente Einschrittreinigung aus Rohzellextrakten machten das Enzym

weiterhin zu einem geeigneten Kandidaten für die Verwendung als Modellenzym.

Einleitung

12

1.9 EGF-R spezifischer, monoklonaler Antikörper 425

Die für die vorliegende Arbeit generierten Peptide wurden aus dem murinen monoklonalen

Antikörper 425 (mAK 425) abgeleitet.

Der mAK 425 wurde erstmals 1987 von Rodeck et al. publiziert (Rodeck, Herlyn et al. 1987)

und zeigte in dieser Studie mit einem Kd-Wert von ~1 nM eine hohe Affinität zum EGF-R auf

A431 Zellen. Bei Konzentrationen > 1nM konnte ein inhibitorischer Effekt auf das Wachstum

von A431 Zellen festgestellt werden, der von den Autoren als zytostatisch, jedoch nicht

zytotoxisch beschrieben wurde. Ferner kompetitiert der mAK 425 mit dem natürlichen

Liganden EGF um die Bindestellen am Rezeptor, induziert effizient die Rezeptor-

Internalisierung, und verhindert auch die Rezeptor-Phosphorylierung (Murthy, Basu et al.

1987).

Bis heute wurde keine Proteinstruktur des

mAK 425 beschrieben, der als Quelle für

die Ableitung zielgerichtet bindender

Peptide diente. Die dreidimensional

Struktur des mAK 425 wurde daher in

Ermangelung einer Kristallstruktur durch

den Dienst „Web Antibody Modelling“

(WAM) berechnet (Abbildung 5).

Die variablen Regionen von Antikörpern,

die die Spitze eines Antikörpers bilden,

bestehen zum einen aus den relativ

konservierten, strukturgebenden

„framework“ Regionen und zum anderen

aus den hypervariablen Schleifen (CDR),

die die Antigenkontaktstelle bilden. Die

hypervariablen Schleifen werden mit

Ausnahme der CDR H3 nach der Anzahl an AS und der Präsenz bestimmter AS in

kanonische Klassen unterteilt. Die Schleifen einer kanonischen Klasse zeigen eine sehr

große Strukturhomologie zwischen unterschiedlichen Antikörpern.

Abbildung 5.) Dreidimensionale Struktur des mAK 425 berechnet mit “WAM”. Die Sequenz des durch Phage Display selektierten und für das S-CAT-S Konstrukt verwendeten Peptids ist rot eingefärbt. Programm: MacPyMOL

Einleitung

13

1.10 Einsatz von Peptiden in der Tumortherapie

Obgleich Peptide adäquate Voraussetzungen sowohl für die Tumortherapie als auch für die

optische Bildgebung von Tumoren aufweisen (Heppeler, Froidevaux et al. 2000), ist die

Verfügbarkeit von EGF-R spezifischen Peptiden bis heute äußerst limitiert.

Aufgrund der geringen Größe von Peptiden weisen diese zwar eine gute Gewebegängigkeit

auf, werden jedoch sehr rasch, in Abhängigkeit der Größe, aus der Blutbahn eliminiert, was

einer spezifischen Anreicherung im Tumorgewebe entgegensteht (DeNardo, Yao et al.

2003). Daher musste die rasche Eliminierung von Peptiden aus dem Blutkreislauf durch

renale Filtration und enzymatische Degradation mithilfe z.B. der PEGylierung optimiert

werden, um den nachteiligen Aspekt der geringen Größe auszugleichen (Caliceti und

Veronese 2003; Werle und Bernkop-Schnurch 2006).

Die Affinität von EGF-R spezifischen Peptiden liegt meist im mikromolaren Bereich (Park,

Zhang et al. 2000; Karasseva, Glinsky et al. 2002), und konnte durch Multimerisierung unter

Ausnutzung des Aviditätseffekts bis in den niedrigen nanomolaren Bereich gesteigert werden

(Houimel, Schneider et al. 2001). Mittels Phage Display konnten Li et al. ein EGF-R

spezifisches Peptid mit mutmaßlich nanomolarer Affinität isolieren (Li, Zhao et al. 2005),

ohne dass bis heute, trotz vielfältiger Einsatzmöglichkeiten und hoher Nachfrage nach

Rezeptor spezifischen Peptiden, eine Folgepublikation nachgelegt werden konnte.

Die Auflistung zeigt die wichtigsten bis heute publizierten, EGF-R Familien spezifischen

Peptide:

KCCYSL, ErbB2 spezifisches Peptid, isoliert mittels Phage Display, (Karasseva,

Glinsky et al. 2002)

Pab-XXXXXX, ErbB2 spezifisches Peptid, isoliert mittels Phage Display, (Houimel,

Schneider et al. 2001)

AHNP, ErbB2 spezifisches Peptid, CDR H3 abgeleitetes Peptid, (Park, Zhang et al.

2000)

GE-11, EGF-R spezifisches Peptid, isoliert mittels Phage Display, (Li, Zhao et al.

2005)

Die offensichtliche Unterrepräsentation EGF-R spezifischer Peptide, obgleich Peptide in der

Bildgebung und Tumortherapie heute bereits eine bedeutende Rolle spielen (Sergeeva,

Kolonin et al. 2006; Balestrieri und Napoli 2007), war Ansporn für die vorliegende Arbeit.

Einleitung

14

2 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit

Seit der Entdeckung des EGF-R und seiner Bedeutung bei der Steuerung zentraler zellulärer

Funktionen, die das Überleben steuern, standen und stehen sowohl Antikörper als auch

Kinase-Inhibitoren besonders im Fokus der molekularen Tumortherapie. Einige Antikörper

(Tabelle 1) und Kinase-Inhibitoren haben in den vergangenen 5 Jahren durch die FDA in den

USA die Zulassung für die Behandlung von Tumoren meist als zweitlinien Therapeutikum

oder Kombinationstherapeutikum mit herkömmlicher Strahlen- und Chemotherapie erhalten.

Das ursprüngliche Ziel dieser Therapeutika war jedoch der Einsatz als Monotherapeutikum,

um Nebenwirkungen, die durch die Strahlen- und Chemotherapie hervorgerufen werden, zu

minimieren. Dieses Ziel konnte bis heute nicht erreicht werden.

Die Wirkmechanismen von Antikörpern (und deren Derivaten) und Kinaseinhibitoren setzen

auf die Inhibition der Rezeptorfunktion, um die aberante Funktion desselbigen, welche als

ursächlich für die Entstehung des Tumors betrachtet wird, zu blockieren und somit die

entarteten Zellen abzutöten. Ein solcher Ansatz bedingt naturgemäß immer einen

erheblichen Selektionsdruck auf die behandelten Zellen, dem diese durch Anpassung und

Mutation entgehen können, wobei die in der Regel höhere Proliferationsrate von Tumorzellen

einen diesbezüglich begünstigenden Faktor darstellt. Auf Dauer besteht also der

konzeptionelle Nachteil, dass sich die behandelten Tumore dem Selektionsdruck und damit

der Behandlung entziehen können (Pao, Miller et al. 2005; Rubin und Duensing 2006;

Wheeler, Huang et al. 2008).

Der in der vorliegenden Arbeit dargestellte Ansatz hingegen zielte nicht auf die Inhibition der

biologischen Funktion des Rezeptors, sondern sollte klären, ob unter Ausnutzung eines

Aviditätseffekts durch Multimerisierung von Peptiden auf einem enzymatisch aktiven

Gerüstprotein eine spezifische Lokalisation eines Targetingkonstrukts am EGF-R und als

Fernziel eine Diskriminierung zwischen Zellen mit normaler und hoher Oberflächendichte des

EGF-R möglich wären.

Eine sekundär administrierte inaktive Wirkstoffvorstufe könnte in einer späteren klinischen

Anwendung am Tumor enzymatisch in die aktive Form des Wirkstoffs umgesetzt werden, der

die Tumorzellen unabhängig von der biologischen Funktion des Rezeptors, abtöten sollte.

Die Vorliegende Arbeit sollte grundlegend die Möglichkeit, Peptide als spezifische

Bindungsmediatoren für eine spätere Anwendung in der Wirkstoffaktivierungstherapie

(Rooseboom, Commandeur et al. 2004; Sharma, Bagshawe et al. 2005; Egri und Takats

2006) ausloten.

Einleitung

15

3 Konzeption der Ansätze

Die fortgeschrittensten und teilweise bereits bis in die klinische Anwendung vorgedrungenen

Ansätze zur Inhibition der EGF-R Funktion in der Tumortherapie haben in den letzten Jahren

ihre klinische Effizienz durch Anwendung als Kombinationstherapeutika deutlich steigern

können und haben sich bei einigen Spezialfällen sogar als sehr erfolgreich erwiesen (Erbitux,

Iressa). Dennoch konnte die klinische Wirkung nicht die hohen Erwartungen aus den

präklinischen Studien einiger Antikörper und TKI erfüllen (Mendelsohn und Baselga 2006).

Diese Umstände verdeutlichen die Notwendigkeit zur Nutzung einer Effektorfunktion über die

einfache Inhibition der Rezeptorfunktion hinaus. Einen Ansatz diese Effektorfunktion mit der

zielgerichteten Markierung des EGF-R zu verknüpfen stellt die Fusion des Pseudomonas

aeruginosa Endotoxins A (ETA) mit dem scFv 425 dar (Bruell, Stöcker et al. 2003). Ein

anderer sehr eleganter Ansatz wurde von Novac et al. publiziert. Hierbei wurde ein

kovalenter, hoch aktiver MHC/Peptid Komplex mit einem aus dem C225 Antikörper

abgeleiteten „single chain“ Antikörper fusioniert. Der MHC/Peptid Komplex induzierte effizient

zytotoxische T-Zellen (CTL) an der Tumorzelle, die daraufhin durch die CTL abgetötet wurde

(Novak, Noy et al. 2007).

Der hier dargestellte Ansatz soll in Ergänzung der vorangehend erwähnten Ansätze die

Möglichkeiten eines zielgerichtet den EGF-R bindenden Peptid/Enzym Konstrukts für die

spätere Anwendung in der Wirkstoffaktivierungstherapie ergründen.

Ein solches Konstrukt benötigt zwei Module, zum einen das Modul, welches die spezifische

Bindung vermittelt, und zum anderen das enzymatisch aktive Modul. Da Antikörper und aus

diesen abgeleitete Fragmente erheblich an Molekulargewicht zu dem bereits großen Gerüst-

Protein hinzufügen würden, wurden in dieser Arbeit kurze Peptide als bindende Module

generiert. In dem hier erstmals beschriebenen Ansatz für die Ableitung einer Peptidbibliothek

aus der Sequenz eines bereits existenten, künstlichen Liganden diente die Sequenz des

scFv 425 als Quelle. Diese Methode kann jederzeit auch auf kombinierte Gen-Bibliotheken

von natürlichen und künstlichen Liganden (z.B. Antikörper, Antikörperfragmente, Kamel-

Antikörper, etc.) erweitert werden.

Einleitung

16

Abbildung 6) Schematische Darstellung der Technik zur Generierung von Peptidbibliotheken aus einzelnen oder kombinierten scFv Genbibliotheken. A. & B. DNase I Fragmentierung des scFv 425 Gens. C. Klonierung der generierten Fragmente in die Sma I Restriktionsschnittstelle des modifizierten Phagenvektors M13 KE. D. 6 Selektionsrunden der Phagenbibliothek auf sEGF-R und A431 Zellen. E. Vergleich der 3 meistvertretenen Phagenklone mittels ELISA. F. Die Sequenz von Klon #3 (SSHIFTF) stammt aus der CDR 3 der leichten Kette des mAk425. G. Sequenz von Klon #3 wurde 5´- und 3´zum cat-Gen kloniert. Fusionsprotein wurde S-CAT-S benannt.

Einleitung

17

Der vermeintliche Nachteil geringerer Affinität eines Peptids sollte durch Fusion an das

trimere Enzym ausgeglichen werden, da durch die Fusion an den N- und C-Terminus der

trimeren Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT) eine sechsfache Valenz erreicht wird und

damit der Aviditätseffekt hervorgerufen werden sollte. Der Aviditätseffekt kann prinzipbedingt

vornehmlich auf EGF-R überexprimierenden Zellen zum tragen kommen, da nur hier

ausreichend Interaktionspartner für das Konstrukt zur Verfügung stehen. Der in der

vorliegenden Arbeit dargestellte Ansatz, Peptide mit mittlerer Affinität als Bindemodule

einzusetzen und durch eine multivalente Präsentation auf einem Enzym, welches zugleich

als Gerüst und enzymatisch aktive Komponente fungiert, aviditätsbasierte Bindung an das

Ziel zu rekonstituieren, wird erstmals beschrieben. Auf diese Weise sollte auch die

Möglichkeit einer Diskriminierung zwischen EGF-R überexprimierenden Tumorzellen und

gesunden Zellen mit geringerer Oberflächenexpression des EGF-R ergründet werden. Durch

Arbeiten anderer Gruppen wurde inzwischen nachgewiesen, dass multivalente Interaktionen

mittlerer aparenter Affinität vorteilhaft für die gleichmäßige Verteilung und Retention des

Konstrukts im und am Tumor sind (Adams, Tai et al. 2006).

Das Enzym CAT wurde in diesem Fall gewählt, da es funktionell als Trimer vorliegt und

beide Termini frei zugänglich an der Oberfläche der Enzymstruktur liegen. Somit eignet sich

das Enzym für eine multivalente Präsentation des bindenden Peptidmoduls. Ferner zeigt sich

CAT tolerant gegenüber Modifikationen an beiden Termini.

Beschreibung der experimentellen Strategie:

Das Gen des scFv 425 wurde durch kontrollierte DNase I Behandlung zu Fragmenten von

ca. 20 bis 30 Basenpaaren verdaut (Abbildung 6,A. & B.). Die generierten Fragmente wurden

„blunt end“ in die Sma I Restriktionsschnittstelle des modifizierten M13 KE Phagenvektors

kloniert (Abbildung 6, C.). Die Peptid präsentierenden Phagen wurden nachfolgend einer

Affinitätsselektion auf immobilisiertem sEGF-R und A431 Zellen unterzogen (Abbildung 6 D.).

Die alternierende Vorgehensweise, bei der zunächst zwei Runden auf immobilisiertem

Rezeptor, dann zwei Runden auf A431 und abschließend wieder auf immobilisiertem

Rezeptor unter schrittweise erhöhter Stringenz selektiert wurde, sollte die Anreicherung von

nicht-EGF-R spezifischen Phagen unterbinden. Nach der letzten Selektionsrunde wurden

Phagen auf Platten vereinzelt und individuelle Klone sequenziert. Die drei häufigsten

Phagenklone wurden amplifiziert und einem ELISA auf immobilisiertem EGF-R unterzogen,

um deren Bindungsfähigkeit zu verifizieren (Abbildung 6, E.). Phagenklon #3 wurde für das

weitere Vorgehen ausgewählt. Die Sequenz dieses Klons stammt aus der hypervariablen

Region der leichten Kette des mAk425 (Abbildung 6, F.) Die selektierte Sequenz wurde an

beide Termini des cat-Gens fusioniert (Abbildung 6, G.). Das Fusionskonstrukt wurde in E.

Einleitung

18

coli RV308 rekombinant exprimiert und in einer Einschrittreinigung mittels

Affinitätschromatographie bereits zu hoher Reinheit isoliert. Abschließend wurde das

gereinigte Protein über eine Gelfiltrationssäule umgepuffert und von Chloramphenicol

abgetrennt. Das gereinigte Fusionsprotein S-CAT-S wurde im nachfolgend weiter

charakterisiert.

Einleitung

19

Gliederung des experimentellen Ergebnisteils:

In Kapitel 1 wird auf den Ansatz des semirationalen Peptiddesigns eingegangen, dieses

umfasst die Fragmentierung der aus dem scFv 425 abgeleiteten genetischen Bibliothek, die

sich daran anschließende Phage Display basierte Selektion eines EGF-R bindenden

Peptids, sowie die Anwendung des selektierten Peptids in Fusionskonstrukten mit den

enzymatisch aktiven „Proteingerüsten“ Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT),

Gluthathion-S-Transferase (GST) und der -Laktamase . Kapitel 1 beschäftigt sich darüber

hinaus mit dem Peptid der Aminosäuresequenz QWSSHIFTF, welches auf der selektierten

Sequenz (SSHIFTF) basierend die gesamte dritte hypervariable Schleife der schweren Kette

des mAK 425 umfasst.

In Kapitel 2 werden zwei Peptide beschrieben, die durch rationales Peptiddesign abgeleitet

wurden. Bei dem Peptid H3 handelt es sich um ein aus dem mAK 425 abgeleitetes Peptid,

welches die gesamte dritte hypervariable Schleife der schweren Kette umfasst. Dieses

Peptid wurde als Fusionskonstrukt mit dem CAT Enzym untersucht. Das zweite in diesem

Kapitel behandelte Peptid wurde anders als alle anderen dargestellten Peptide aus dem

EGF-R selbst abgeleitet.

Im ergänzenden Kapitel wird die computergestützte Vorhersage möglicher

Rezeptorbindungsstellen für die Peptide beschrieben. Da bis heute keine Kristallstruktur des

mAK 425 : EGF-R Komplexes publiziert wurde, wurde der Versuch unternommen, mithilfe

des Programms Autodock4 eine Vorhersage bezüglich einer potentiellen Bindungsstelle am

EGF-R zu treffen.

Ergebnisse

20

4 Kapitel 1. Ansätze zum semirationalen Peptiddesign

In diesem Kapitel soll der semirationale Ansatz zur Ableitung eines EGF-R spezifischen

Peptides für die potentielle Anwendung z.B. in der Wirkstoffaktivierungstherapie dargestellt

werden.

4.1 Isolierung des Zielproteins sEGF-R aus A431 Zellkulturüberstand

Die von A431 Zellen in das Kulturmedium sekretierte Variante des EGF-R (sEGF-R) diente

als Zielmolekül für ELISA, BIAcore und die Phagen-Selektion. Der sEGF-R entsteht bei A431

Zellen aus einer 2.8 kb mRNA, einer Splice-Variante der vollständigen EGF-R mRNA, die für

den sekretierten sEGF-R (115 kDa apparentes Molekulargewicht) kodiert (Mayes und

Waterfield 1984; Ullrich, Coussens et al. 1984). Das Molekulargewicht von 115 kDa kommt

durch ausgeprägte Glykosilierung zustande, die Polypeptidkette selbst weist ein

Molekulargewicht von 70 kDa auf. Der Überstand konfluenter, in Hungermedium (DMEM/F12

Medium ohne FCS) kultivierter A431 Zellen wurde geerntet. Der sEGF-R wurde mittels

Affinitätschromatographie unter Verwendung des EGF-R spezifischen, an Chitinbeads

gekoppelten scFv 425 aus dem Kulturüberstand isoliert. SDS-Gel Analysen bestätigten einen

hohen Reinheitsgrad des isolierten Proteins (Abbildung 7, A.). Typischerweise wurden aus 1

l Kulturüberstand 500 µg - 700 µg Protein gewonnen. Die Identität des isolierten sEGF-R

wurde durch Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen die N-terminale Domäne

des EGF-R in einem Western-Blot bestätigt (Abbildung 7, B.).

A.

B.

Abbildung 7) A. 12.5 % SDS-Gel des aus Zellkulturüberstand isolierten sEGF-R. Der Rezeptor konnte in einer Ein-Schritt Reinigung zu hoher Reinheit isoliert werden. Die ersten vier Elutionsfraktionen wurden aufgetragen. B. Die Identität des isolierten sEGF-R wurde mittels monoklonalem Antikörper (14C8, NanoTools) gegen die N-terminale Domäne durch Western-Blot bestätigt.

Ergebnisse

21

4.2 Phage Display basierte Anreicherung eines EGF-R spezifischen Peptidmoduls aus einer Single-Chain Antikörper Genbibliothek

4.2.1 Einleitung

Die einleitend beschriebenen, bereits in der Entwicklung als auch in der Anwendung weit

fortgeschrittenen EGF-R spezifischen Bindemodule, wie Antikörper und Single-Chain-

Antikörper haben in den letzten Jahren deutliche Erfolge verzeichnet und bilden die

Grundlage für die gesteigerte Effizienz in der Tumortherapie. Jüngere klinische Studien

zeigten aber auch ihre Grenzen auf, da der Wirkmechanismus in der Regel auf reiner

Inhibition der Rezeptorfunktion beruht, einige Tumore aber per se oder sich dem

therapeutische Druck entziehend unabhängig von der EGF-R Aktivierung werden (Pao,

Miller et al. 2005; Rubin und Duensing 2006; Wheeler, Huang et al. 2008). Um diese

Problematik aufzugreifen wurden einige Ansätze veröffentlicht (Würdinger, Verheije et al.

2005; Dalken, Giesubel et al. 2006; Novak, Noy et al. 2006), die auf einer spezifischen

Bindung an den EGF-R beruhen, darüber hinaus aber noch eine Effektorfunktion umfassen

(z.B. ADEPT, GDEPT, Antikörper-Toxin Fusionen). Für solche Strategien sind aus

theoretischen Überlegungen große Antikörper und auch aus diesen abgeleitete Single-

Chain-Antikörper und Fragmente zu groß, da sie an ein potenziell bereits großes Enzym

gekoppelt werden müssen was zu schlechter Tumorpenetration, inhomogener Verteilung im

Gewebe und langer Zirkulation durch die Blutbahn führt.

Der Einsatz von Peptiden als spezifische Bindemodule erscheint daher als der nächste

folgerichtige Evolutionsschritt in dem Bestreben, die molekulare Tumortherapie an die

Parameter für den erfolgreichen klinischen Einsatz zu anzupassen.

Seit der ersten Anwendung der Phage Display Technologie durch Smith et al. (Smith 1985)

wurde diese Technologie unzählige Male eingesetzt, um spezifisch bindende Peptide zu

isolieren. Dabei konnte beobachtet werden, dass häufig Domänen oder Sequenzen natürlich

vorkommender Proteine angereichert wurden (Hartley 2002; Smothers, Henikoff et al. 2002).

Eine Bibliothek mit bereits angereicherten Sequenzen sollte daher die Wahrscheinlichkeit

spezifische Peptide zu isolieren erhöhen. Die Voranreicherung der Bibliothek wurde durch

die Verwendung des scFv 425 Gens umgesetzt, das als genetische Quelle diente.

Ergebnisse

22

4.2.2 Ergebnisse

4.2.2.1 Generierung der Genbibliothek durch DNase I Fragmentierung des scFv 425 Gens

Um eine Ausgangsbibliothek mit möglichst vielen potentiell bindenden Peptiden zu

generieren, wurde das PCR Amplifikat des EGF-R spezifischen scFv 425 Gens, mittels

DNase I Verdau, fragmentiert. Die solchermaßen erzeugten Fragmente wurden nachfolgend

in einen Phagenvektor „blunt end“ in die SmaI Restriktionsschnittstelle hinein kloniert. Die in

den Phagenvektor klonierten Fragmente

werden auf dem Phagen als N-terminale

Gen III Fusionen präsentiert und sind somit

für eine interaktionsbasierte Selektion

zugänglich. Der Verdau wurde nach 30 s,

60 s Und 120 s abgestoppt (Abbildung 8).

Die Größenverteilung der erhaltenen

Fragmente wurde auf einem Harnstoffgel

überprüft. Der Verdau für 120 s ergab die

gewünschte Größenverteilung im Bereich

von 20 bis 60 Basenpaaren. Die

Fragmente wurden nachfolgend einer

Klenow Behandlung unterzogen, um glatte

Enden für die weitere Klonierung zu

generieren. Als Zielvektor diente ein

modifizierter M13KE Vektor, welcher im

Leseraster 5´ zum Gen III für eine SmaI

Restriktionsschnittstelle kodiert. Über SmaI

klonierte Fragmente werden als N-

terminale P III Fusionen auf der

Phagenoberfläche präsentiert und sind folglich einer direkten Interaktionsselektion

zugänglich.

Abbildung 8) Auftrennung der DNA-Fragmente auf einem Harnstoffgel. DNase I Fragmentierung des PCR-Produkts wurde zu den angegebenen Zeitpunkten gestoppt, auf ein Harnstoffgel aufgetragen, elektro-phoretisch aufgetrennt und mit Ethidium-bromid angefärbt.

Ergebnisse

23

4.2.2.2 Phage Display Selektion

Der modifizierte VCS M13 Vektor enthält eine SmaI Restriktionsschnittstelle 5´ zum Gen III

des Phagen. In die SmaI Restriktionsschnittstelle wurden die durch DNase I Verdau und

Klenow behandelten Fragmente „blunt end“ kloniert. Nur Fragmente, die das Leseraster des

nachfolgenden Gen III erhalten produzieren funktionelle Phagen und werden auf der

Phagenhülle präsentiert. Die Peptid präsentierenden Phagen sind folglich einer Selektion auf

Interaktionsbasis zugänglich.

Das Design der Phagen-Selektion wurde so ausgelegt, dass die Anreicherung unspezifisch

bindender Phagen minimiert werden sollte. Die ersten zwei Selektionsrunden fanden auf

immobilisiertem sEGF-R statt, denen zwei Selektionsrunden auf EGF-R überexprimierenden

A431 Zellen folgten. Zum Abschluss wurde wiederum auf immobilisiertem sEGF-R selektiert.

Dieses Vorgehen sollte Phagen eliminieren, die z.B. an denaturierten, immobilisierten sEGF-

R gebunden haben oder an andere Zelloberflächenmoleküle als den EGF-R.

Nach insgesamt sechs Selektionsrunden wurden zunächst 10 individuelle Klone isoliert und

sequenziert, um angereicherte Sequenzen zu identifizieren. Die Aminosäuresequenzen

Tabelle 3) 19 AS Sequenzen Individueller Phagenklone aus der letzten Selektionsrunde. Ein Klon enthielt nur die Sequenz des Ausgangsphagen. Insgesamt wurden 20 Phagenklone sequenziert. Bedingt durch die Klonierungsstrategie stehen den angegebenen Sequenzen die Aminosäuren Methionin und Alanin voran.

S S H I F T F Klon 3



H I F T F G S G T Klon 9

H N V R H F S L H N L Q Klon 7





H N V R H F S L H R Klon 8

G L N S P I H S R Klon 2




G L N S P I H S Klon 19

R Q G G L V Q P S Klon 1

A R A T A T Klon 16

S V T Y M Klon 18

P S P A T Klon 20

Ergebnisse

24

SSHIFTF (drei- bzw. vierfach vertreten) und HNVRHFSLHNLQ (zwei- bzw. dreifach

vertreten) waren am häufigsten vertreten (Tabelle 3). Durch die später durchgeführte

Sequenzierung weiterer zehn Klone wurde das Zahlenverhältnis zu Ungunsten der SSHIFTF

Sequenz zur

HNVRHFSLHNLQ Sequenz (fünf- bzw. sechsfach vertreten) hin verschoben. Die

Aminosäuresequenz SSHIFTF der Klone #3, #4 und #5 entsprach der dritten hypervariablen

Schleife der leichten Kette (CDR L3), während die übrigen isolierten Sequenzen keiner

Aminosäuresequenz aus dem Antikörper entsprachen (Abbildung 9).

Ein Sequenzhomologievergleich mittels T-Coffee (Poirot, O'Toole et al. 2003) erbrachte

einen niedrigen Homologiewert von 32 für die drei häufigsten Sequenzen (Abbildung 10, A.).

Auffallend war die Präsenz von Histidinmotiven in den drei dominanten Sequenzen. Anhand

der Struktur des mAK 425 war die stark exponierte Stellung des Histidin in der CDR L3

deutlich erkennbar, was eine nicht unerhebliche Beteiligung an dem Bindungsschnittstelle

zwischen Antikörper und EGF-R nahelegte (Abbildung 9). Darüberhinaus zeigte die Struktur

einen weiteren, exponierten Histidinrest in der CDR H2. Die herausragende Präsenz zweier

Histidinreste an der Grenzfläche zwischen Antigen und Antikörper untermauerte diese

Hypothese. Daher wurde ein Sequenzhomologievergleich aller mit dem Histidin beginnenden

(Abbildung 10, B.) bzw. in der mittleren Position befindlichen (Abbildung 10, C.) drei

A.

B.

Abbildung 9) A. Dreidimensionales Modell des mAK 425. Die Koordinaten des mAK 425 wurden über den Dienst „Web Antibody Modelling“ (WAM) berechnet. Die durch Phage Display isolierte Sequenz SSHIFTF wurde in orange dargestellt und entspricht der CDR L3, aus die Histidinseitenkette hervorragt. B. Vergrößerung der CDR L3. Exponierte Position der Histidinseitenkette.

Ergebnisse

25

Aminosäure umfassenden Peptidmotive mittels T-Coffee durchgeführt, der gute

Homologiewerte von 79 respektive 71 erbrachte.

Entgegen dem niedrigen Sequenzhomologiewert für die drei dominanten Sequenzen aus der

Phage Display Selektion ergab sich aus der Analyse der Tripeptidmotive in Verbindung mit

der exponierten Lage des Histidins im Modell des mAK 425 eine plausible Erklärung für die

Selektion gerade dieser Sequenzen aus der Peptidbibliothek.

Für das weitere Vorgehen wurde die Sequenz SSHIFTF ausgewählt, da sie in ELISA

Experimenten ein geringfügig höheres Bindungssignal aufwies, vor allem aber direkt einer

antigenbindenden Schleife aus dem parentalem mAK 425 zuzuordnen war, während die

übrigen Sequenzen aus anderen Leserastern stammten.

A.

B.

C.

Abbildung 10) Sequenzhomologievergleich mittels T-Coffee. A. Drei dominante Sequenzen aus der Phage Display Selektion wurden auf mögliche Sequenzhomologie untersucht. Berechnet wurde ein niedriger Wert von 32. B. Berechnung der Sequenzhomologie aller mit Histidin beginnenden Tripeptidmotive aus den drei dominanten Sequenzen lieferte einen guten Wert von 79. C. Alle Tripeptidmotive mit einem Histidin in mittlerer Position erbrachten einen geringfügig niedrigeren Wert von 71.

Ergebnisse

26

4.2.2.3 Bindungs-Rangliste drei dominanter Phagenklone aus der letzten Selektionsrunde

Drei der meist vertretenen Phagenklone aus der letzten Selektionsrunde wurden in einem

ELISA auf immobilisiertem sEGF-R bezüglich ihrer Bindungsfähigkeit getestet (Abbildung 11,

A.), um die für das weitere Vorgehen zu verwendende Peptidsequenz zu ermitteln. Das

Signal des Kontrollphagen VCS M13, der kein Peptid als Gen III Fusion präsentiert, wurde

von allen Signalen subtrahiert. Klon #3 (Peptidsequenz: SSHIFTF) zeigte ein geringfügig

höheres Signal als die Klone #7 (Peptidsequenz: HNVRHFSLHNLQ) und #11

(Peptidsequenz: GLNSPIHSR). Nachfolgend wurde die Bindungskompetenz des

Phagenklons #3, der die Peptidsequenz SSHIFTF präsentiert auf fixierten A431 Zellen

getestet (Abbildung 11, B.), um zu klären, ob auch membranständiger EGF-R auf

Tumorzellen gebunden würde. Der Phagenklon #3 zeigte ein zweifach höheres

Bindungssignal als die zur Kontrolle eingesetzte, unselektierten 12mer Phagenbibliothek

(NEB). Da die unselektierte 12mer Phagenbibliothek bereits einige spezifisch als auch

unspezifisch bindende Phagenklone enthalten kann, stellte dieser experimentelle Aufbau

eine anspruchsvolle Kontrolle dar, was die Bindungskompetenz der Peptidsequenz SSHIFTF

bestätigte.

A.

B.

Abbildung 11) Phagen ELISA. A. auf immobilisiertem sEGF-R mit drei individuellen Klonen aus der letzten Selektionsrunde. Klon #3 (SSHIFTF) wies ein geringfügig höheres Bindungssignal als die Klone #7 (HNVRHFSLHNLQ) und #11 (GLNSPIHSR). Das Signal des Kontrollphagen VCS M13, der keine Peptide als Gen III Fusion präsentiert, fiel sehr gering aus und wurde von allen Signalen subtrahiert. B. Phagenklon #3 wurde auf fixierten A431 Zellen gegen unselektierte Phagen aus der NEB PhD12 Bibliothek getestet. Diese anspruchsvolle Kontrolle wurde gewählt, um zu zeigen, dass der selektierte Phagenklon gegenüber unselektierter, potentielle Binder enthaltender Phagen-Bibliothek überlegene Bindung aufwies.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

#3 #7 #11

Ab

so

rpti

on

@ 405 n

m

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

#3 NEB 12 mer, unselektiert

Ab

so

prt

ion

@ 4

05 n

m

Ergebnisse

27

Die Peptidsequenz des Klons #3 wurde im Folgenden an beide Termini des Modellenzyms

CAT via kurze Linker Sequenzen fusioniert, um ein zielgerichtet bindendes Modul mit

enzymatischer Aktivität für das „Tumor-Targeting“ zu generieren.

4.3 Generierung eines N- und C-terminal Peptid dekorierten Fusionsenzyms: S-CAT-S, und Darstellung der Interaktions-studien mit dem EGF-R

4.3.1 Einleitung

Nach der Identifizierung eines EGF-R bindenden Peptids mittels Phage Display sollte im

folgenden ermittelt werden, ob die Peptidsequenz (SSHIFTF) eine spezifische Lokalisation

eines Fusionsenzyms am EGF-R vermitteln kann. Das bakterielle, trimere Enzym

Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) schien in mehrfacher Hinsicht gut als

Modellenzym geeignet. Zum einen liegen die Termini der CAT gut zugänglich an der

Oberfläche, zum anderen werden die fusionierten Peptide durch das funktionell trimere

Enzym sechsfach an der Oberfläche präsentiert, was das Zustandekommen eines

bindungsverstärkenden Aviditätseffekts ermöglichen sollte.

Zu diesem Zweck wurde die Peptidsequenz auf genetischer Ebene an das 5´ und 3´ Ende

des cat Gens kloniert. Das resultierende Konstrukt S-CAT-S wurde in E. coli rekombinant

exprimiert, gereinigt und für Bindungsstudien eingesetzt. Dabei wurde ein breites Spektrum

weit verbreiteter und anerkannter Bindungsnachweismethoden, wie ELISA, konfokale

Immunfluoreszenz, BIAcore (Oberflächenplasmonresonanz) und FACS

(Durchflusszytometrie) eingesetzt, in der Absicht, die anfänglich unsicheren ELISA

Ergebnisse validieren zu können.

4.3.2 Ergebnisse

4.3.2.1 Klonierung der SSHIFTF codierenden Sequenz an das cat-Gen

Die durch Phage Display identifizierte Peptidsequenz (SSHIFTF) wurde mittels Primer-

Extension Methode in zwei aufeinander folgenden Schritten 5´ und 3´ an das cat-li Gen

kloniert. Im ersten Schritt wurde unter Verwendung des Oligonukleotids pF_SSHIFTF_CAT

und des Oligonukleotids sr_Hind2 das cat-li Gen 5´ um die SSHIFTF codierende Sequenz in

einer Primer-Extension-PCR erweitert. Das PCR Produkt wurde mit den

Ergebnisse

28

Restriktionsendonukleasen NheI und HindIII verdaut und in einen ebenfalls mit NheI und

HindIII geöffneten pSS30_CATwt Vektor kloniert. Der resultierende Vektor wurde

pIB30_SSHIFTF_CAT benannt, und diente seinerseits als Matrize für die 2. PCR unter

Verwendung des Oligonukleotids sf_lacP1 und des Oligonukleotids pr_CAT_SSHIFTF. Das

resultierende PCR Produkt, welches für ein N- und C-terminal mit der SSHIFTF Sequenz

flankiertes CAT Enzym codiert, wurde wiederum über die Restriktionsschnittstellen NheI und

HindIII in den solchermaßen geöffneten Vektor pSS_30_CATwt kloniert. Der resultierende

Vektor wurde pIB30_SSHIFTF_CAT_SSHIFTF benannt. Die korrekte Sequenz wurde nach

jedem Klonierungsschritt durch Sequenzierung verifiziert. Durch die Klonierungsstrategie

bedingt, kodieren die Vektoren pIB30_SSHIFTF_CAT und pIB30_SSHIFTF_CAT_SSHIFTF

N-terminal zur ersten SSHIFTF Sequenz für zwei zusätzliche Aminosäuren Methionin und

Alanin.

Der Vektor pIB30_SSHIFTF_CAT kodiert für das Konstrukt S-CAT, der Vektor

pIB30_SSHIFTF_CAT_SSHIFTF für das Konstrukt S-CAT-S.

4.3.2.2 Rekombinante Herstellung und Reinigung

Die CAT Konstrukte S-CAT-S, S-CAT und CATwt wurden rekombinant in E. coli RV308

cytoplasmatisch exprimiert und mittels Affinitätschromatographie zu hoher Reinheit isoliert.

Eine Sephadex 200 Gelchromatographie wurde

dennoch angeschlossen, um Chloramphenicol von

den Proben abzureinigen und diese in die

gewünschten Puffer zu überführen. Aus 1 l

Expressionskultur bei 4.6 OD600 konnten ca. 2 mg S-

CAT-S Protein isoliert werden. Das Molekulargewicht

des S-CAT-S Proteins liegt nach Berechnung durch

das Programm GCG bei 29 kDa für das Monomer. Die

Bande des S-CAT-S Proteins lief in denaturierender

SDS-PAGE geringfügig zu niedrig (Abbildung 12), die

korrekte Masse konnte aber massenspekroskopisch

verifiziert werden. Der Massenunterschied zum S-CAT

Protein, das nur eine N-terminale Peptidfusion trägt,

konnte auf dem SDS-Gel nicht aufgelöst werden.

S-CAT-S S-CAT

50 kDa

30 kDa 25 kDa

Marker

Abbildung 12) 12.5 % SDS-Gel nach Coomassie-Färbung. S-CAT-S und S-CAT konnten mittels Einschrittreinigung zu hoher Reinheit isoliert werden.

Ergebnisse

29

4.3.2.3 Nachweis EGF-R spezifischer Bindung des S-CAT-S Konstrukts mittels ELISA

Die sehr gut etablierte und anerkannte Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Methode dient dem schnellen Nachweis eines Antigens. Bei der angewandten Variante des

Sandwich-ELISA wurde der sEGF-R in den Vertiefungen einer 96-Loch Platte immobilisiert.

Am sEGF-R lokalisierte CAT-Konstrukte wurden mittels monoklonalem Maus -CAT

Antikörper und sekundärem -Maus HRP Antikörper durch Farbumschlag nachgewiesen.

Optimierung des hohen, unspezifischen CATwt Hintergrundsignals.

Der primäre Interaktionsnachweis des zielgerichtet bindenden Moduls S-CAT-S wurde

erneut durch ELISA Experimente auf immobilisiertem sEGF-R geführt. In den ersten ELISA

Experimenten zeigte das zur Kontrolle mitgeführte CATwt Protein sehr hohe unspezifische

Hintergrundsignale. Als Ursachen für die hohe unspezifische Bindung des CATwt Proteins

an den sEGF-R wurden verschiedene Möglichkeiten in Betracht gezogen, die sukzessive

ausgetestet wurden. Routinemäßig wurde zunächst versucht mögliche unspezifische

hydrophobe Interaktionen durch Zugabe von Tween20 in steigenden Konzentrationen zu

verringern. Auch eine Erhöhung der Konzentration auf 0.1% und eine Erhöhung der Anzahl

an Waschschritten zeigten keine signifikante Wirkung (Daten nicht gezeigt). Um den Einfluss

freier Cysteine auf die unspezifische Bindung des CATwt zu testen, wurde CATwt in

Gegenwart von 0.5 mM Gluthathion (GSH) inkubiert (Abbildung 13). Die unspezifische

Bindung konnte im besten Fall um 26% verringert werden, bei anderen ELISA Experimenten

zeigte sich jedoch kein signifikanter Unterschied und genügte damit nicht dem Anspruch,

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

% GSH [0.5 mM] Cm [5 mM]

Ab

sorp

tio

n @

40

5 n

m

Abbildung 13) CATwt Hintergrund-signal auf immobilisiertem sEGF-R in Gegenwart von GSH bzw. Chlor-amphenicol. Der Ligand CATwt wurde in PBS, 1% BSA, 0.1% Tween 20 und den jeweils angegebenen Additiva formuliert auf sEGF-R Oberfläche inkubiert, um die unspezifische Bindung zu vergleichen. Die unspezifische Bindung konnte in Gegenwart von GSH leicht gesenkt werden.

Ergebnisse

30

reproduzierbare und eindeutige Aussagen über die Bindungscharakteristika der generierten

CAT Konstrukte treffen zu können.

Weiter wurde untersucht, ob der Entzug von Chloramphenicol durch das Reinigungsprotokoll

einen Einfluss auf die strukturelle Integrität des CAT Proteins haben könnte. Da CAT ein

homo-trimeres Enzym ist, dessen katalytisches Zentrum unter Beteiligung aller drei

Untereinheiten an deren Grenzflächen gebildet wird, lag die Vermutung nahe, dass durch

den Entzug des Substrats die Stabilität des Komplexes beeinträchtigt werden könnte und es

zur Exponierung in der Struktur sonst unzugänglicher Aminosäuren kommen könnte, woraus

eine verstärkte Aggregationsneigung und ein Niederschlag des Proteins auf der Oberfläche

resultieren könnte. Daher wurde das CATwt Protein mit 5 mM Cm versetzt, wobei jedoch

eine verstärkte unspezifische Bindung zu konstatieren war (Abbildung 13).

Definiertere Tests bezüglich des Einflusses der Stabilität des Proteins auf die unspezifische

Bindung, wurden durch Versuche mit verkürzten Varianten des CAT Proteins möglich

(dankenswerter Weise von S. Stebel zur Verfügung gestellt). Da das unspezifische

Hintergrundsignal des CATwt Proteins in etwas geringerem Masse auch auf BSA belegten

Oberflächen deutlich zu messen war, wurde für diesen Versuch BSA anstelle des

zeitaufwändig und kostenintensiv zu isolierenden sEGF-R verwendet. Die N-terminal

(N∆10) und C-terminal (C∆9) verkürzten und dadurch destabilisierten CAT Varianten zeigten

eine sehr hohe unspezifische Bindung verglichen zum CATwt, wobei der Effekt bei der C-

terminal verkürzten Variante, die auch die geringste Stabilität aufweist, am deutlichsten war

(Abbildung 14). Die rückverlängerten und damit wieder stabilisierten Varianten zeigten

übereinstimmend mit der Hypothese ein verringertes Bindungssignal gegenüber den

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

CA

T R

E

Nd10 R

7-

K5

CA

T N

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CA

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CA

T C

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pt.

CA

T C

d9

R3-K

1

CA

Tw

t

Ab

so

rpti

on

@ 4

05 n

m

Abbildung 14) Vergleich der unspezifischen Bindung verschiedener verkürzter und rückverlängerter bzw. optimierter CAT-Varianten, sowie des CATwt Enzyms auf immobilisierter BSA Oberfläche. Verkürzte, nicht rückverlängerte Varianten CAT Cd9 und Nd10 zeigten die höchste unspezifische Bindung auf BSA. Die rückverlängerte Variante CAT RE Nd10 R7-K5 zeigte ein verringertes Signal, welches etwa dem CATwt entsprach. Optimierte Variante CAT Cd9 R3-K1 opt zeigte das niedrigste Signal.

Ergebnisse

31

verkürzten Varianten, aber auch die optimierte, rückverlängerte C∆9 Variante zeigte keine

deutliche Verbesserung im Vergleich zum CATwt (Abbildung 14).

Die Neigung zu unspezifischer Interaktion des CATwt Proteins zeigte sich nicht nur auf dem

immobilisierten sEGF-R, sondern auch auf immobilisierter BSA Oberfläche. Daher wurde ein

möglicher Einfluss der Blockierungslösung auf die unspezifische Bindung untersucht. Neben

Abbildung 15) Vergleich des unspezifischen Hintergrundsignals des CATwt Proteins auf BSA und Milchpulver belegten Oberflächen. Die mit 1% und 4% BSA belegten Oberflächen zeigten ein innerhalb der Fehlertoleranz ähnliches Hintergrundsignal. Milchpulver eignete sich aufgrund des sehr hohen unspezifischen Signals nicht als Blockierungslösung für die CAT Konstrukte.

den üblicherweise eingesetzten 4% BSA wurden 1% BSA und 4% Milchpulver verglichen (

Abbildung 15). Obwohl CATwt auf BSA unspezifische Bindung zeigte, war das Signal auf

der mit 4% stärker mit BSA belegten Oberfläche geringer als auf der mit 1% belegten

Oberfläche. Auf der mit Milchpulver belegten Oberfläche zeigte CATwt das höchste

unspezifische Signal. Die gewünschte Reduktion des Hintergrundsignals wurde erst durch

Verwendung des Polymers Polyvinylpyrolidon (PVP K 30) zur Blockierung erreicht

(Ausgetestet von Annette Gaida, Daten hier nicht gezeigt).

Lösung des Problems nicht reproduzierbarer Bindung des S-CAT-S Konstrukts.

Während der zahlreichen Versuche zur Verringerung des unspezifischen Hintergrundsignals

fiel die schlechte Reproduzierbarkeit des Bindungssignals des S-CAT-S Konstrukts auf.

Durch die Verwendung von PVP in Kombination mit einer Erhöhung der NaCl Konzentration

auf 550 mM konnten letztlich ein gutes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis, sowie eine gute

Reproduzierbarkeit eingestellt werden.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

4% BSA 1% BSA 4% MP

Ab

sorp

tio

n @

40

5 n

m

Ergebnisse

32

Das S-CAT-S Fusionsprotein zeigte im ELISA ein 4,7-fach höheres Bindungssignal als das

CATwt Protein (Abbildung 16, A.). Ferner wurde als erster Nachweis der Spezifität eine BSA-

Oberfläche einbezogen. Das Bindungssignal von S-CAT-S war auf der BSA-Oberfläche auf

das Niveau des CATwt Proteins reduziert. Vergleicht man das Signal des S-CAT-S auf der

sEGF-R mit der BSA-Oberfläche, so zeigte S-CAT-S ein 6,7-fach höheres Signal auf der

A.

B.

Abbildung 16) Interaktionsnachweis durch ELISA auf immobilisiertem sEGF-R. A. Einschätzung der Bindungsspezifität auf sEGF-R Oberfläche und BSA Vergleichsoberfläche. S-CAT-S zeigt ein signifikant höheres Signal auf immobilisiertem sEGF-R als die CATwt Kontrolle. Auf der BSA Kontrolloberfläche zeigen S-CAT-S und CATwt gleich niedrige Bindung. CATwt Kontrolle weist eine minimal höhere Bindung auf sEGF-R verglichen mit CATwt Oberfläche auf. B. Lokalisierung des zielgerichtet bindenden Moduls am EGF-R in Abhängigkeit von der Valenz der präsentierten Peptide. Das Bindungssignal für S-CAT beträgt nur 38% des S-CAT-S Bindungssignals nach Abzug des CATwt Signals von beiden Werten.

spezifischen Oberfläche (Abbildung 16, A.). Darüber hinaus konnte eine Abhängigkeit der

Bindungsstärke von der Anzahl der auf dem Konstrukt präsentierten Peptide gezeigt werden

(Abbildung 16, B.). Diese Ergebnisse können als erster Hinweis auf eine Peptid vermittelte,

spezifische Lokalisierung des Konstrukts am sEGF-R gewertet werden.

Abbildung 17) Nachweis der Spezifität der S-CAT-S : sEGF-R Interaktion mittels Kompetitions-ELISA. Das S-CAT-S Fusionsprotein wurde mit steigenden Konzentrationen an Kompetitor (scFv 425 Bla) parallel auf immobilisiertem sEGF-R inkubiert. Die linke Säule repräsentiert das Signal des S-CAT-S Fusionsproteins ohne Kompetitor. Die molare Konzentration an Kompetitor steigt von links nach rechts. S-CAT-S wurde mit konstanter Konzentration von 340 nM eingesetzt, der Kompetitor wurde mit einer maximalen Konzentration von 3400 nM eingesetzt.

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S-CAT-S CATwt S-CAT-S CATwt

Ab

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on

@ 4

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nm

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S-CAT-S S-CAT CATwt

Ab

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05 n

m

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0,1 10 1000

Ab

so

rpti

on

@ 4

05 n

m

Konzentration Inhibitor [nM]

Ergebnisse

33

Zur Untermauerung der Spezifität der S-CAT-S - sEGF-R Interaktion wurde ein

Verdrängungsexperiment mittels ELISA auf immobilisiertem sEGF-R durchgeführt. Da das

Peptid aus der Sequenz des scFv 425 abgeleitet wurde, war zu erwarten, dass S-CAT-S

durch den scFv 425 zu verdrängen sein sollte. Im Experiment konnte die Verdrängung durch

den scFv 425 Bla in konzentrationsabhängiger Weise gezeigt werden (Abbildung 17). Das

Konstrukt S-CAT-S wurde mit konstanter Konzentration von 340 nM eingesetzt, während die

Konzentration des Inhibitors (scFv 425) auf den zehnfachen Überschuss gesteigert wurde.

Bei der Konzentrationsangabe gilt es zu beachten, das die molare Konzentration für S-CAT-

S immer für das Monomer angegeben ist, das Enzym jedoch überwiegend als Trimer

vorliegt.

Bei 0,34 nM und 3,4 nM Konzentration des scFv 425 Bla konnte noch keine Verdrängung

erzielt werden. Bei equimolarer Konzentration beider Konstrukte wurde das absolute Signal

auf den halben Wert des S-CAT-S Konstrukts ohne Inhibitor verringert. Bei zehnfachem

Überschuss des Inhibitors konnte das Signal auf etwa das Niveau, das typischerweise

CATwt erreicht reduziert werden, was für eine spezifische Interaktion sprechen könnte.

Als weiteres Indiz spezifischer Bindung in ELISA Experimenten wird allgemein ein

sigmoidaler Kurvenverlauf der Bindung bei ansteigender Konzentration des Analyten mit

Sättigung bei hoher Konzentration gewertet. Im sogenannten Titrations-ELISA konnte jedoch

keine für spezifische Bindungen typische Sättigung des Signals nachgewiesen werden. Das

Signal stieg bis zu einer 10 µM Konzentration des S-CAT-S Konstrukts an, ohne eine

Sättigung zu zeigen. Die Sättigung könnte auch erst bei höherer Konzentration einsetzten,

was jedoch nicht getestet wurde, da das S-CAT-S Konstrukt bei Konzentrationen > 30 µM

Abbildung 18) Titrations-ELISA des S-CAT-S Fusionsproteins auf immobilisiertem sEGF-R. S-CAT-S wurde in steigender Konzentration von 1 nM bis 10 µM inkubiert. Das Signal zeigte bis 10 µM Konzentration keine Sättigung

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

1 10 100 1000 10000

Ab

sorp

tio

n @

40

5 n

m

Konzentration [nM]

Ergebnisse

34

zur Aggregation tendiert. Der Bindungsverlauf bei niedrigen Konzentrationen spricht jedoch

für eine spezifische Bindung, da das Signal nicht linear ansteigt, wie es bei unspezifischer

Interaktion mit der Oberfläche zu erwarten wäre.

S-CAT-S ELISA auf A431 Zellen:

Da der ELISA geführte Interaktionsnachweis des S-CAT-S Fusionsproteins auf

immobilisiertem sEGF-R nicht alle Zweifel einer evtl. unspezifischen Bindung ausräumen

konnte, wurden ELISA Experimente auf konfluenten A431 Zellen im 96-Lochplattenformat

durchgeführt. A431 Zellen wurden bis zur Konfluenz in Vollmedium kultiviert und

anschließend für 12 h in Minimalmedium überführt. Die Inkubation des S-CAT-S

Fusionsproteins erfolgte auf fixierten Zellen, um eine mögliche Rezeptor vermittelte

Internalisierung zu verhindern, was die anschließende Detektion mittels HRP gekoppeltem

Nachweisantikörper hätte stören können. Das S-CAT-S Signal war mit 0.8

Absorptionseinheiten um 0.2 höher als das der CATwt Kontrolle (Abbildung 19). Der

Signalunterschied fiel zwar sehr gering aus, zeigte sich aber in mehreren unabhängigen

Versuchen, sodass dieser Unterschied gering aber doch reproduzierbar ausfiel. Den

zellulären ELISA Experimenten war zudem der im Vergleich zu den ELISA-Experimenten auf

immobilisiertem sEGF-R höhere unspezifische Hintergrund des CATwt Enzyms gemein.

Abbildung 19.) Zellulärer ELISA auf fixierten A431 Zellen. Das Bindungssignal des S-CAT-S Konstrukts war auf A431 Zellen tendenziell höher als das Signal der CATwt Kontrolle. Im Rahmen des Fehlers sind die Signale nicht als signifikant verschieden zu werten. Generell war auf A431 Zellen eine Tendenz zu höherem, unspezifischem Signal zu erkennen.

0

0,1

0,2

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0,4

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1

S-CAT-S CATwt

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m

Ergebnisse

35

4.3.2.4 Nachweis zellulärer Bindung und Analyse der zellulären Distribution mittels konfokaler Immunfluoreszenz

Die konfokale Laser-Rastermikroskopie, deren Grundprinzip auf eine Erfindung von Minsky

zurückgeht (Minsky 1988), bietet gegenüber der klassischen Fluoreszenzmikroskopie den

Vorteil, dass nur Fluoreszenz aus einer Fokuseben abgebildet wird, während Fluoreszenz,

die außerhalb der Fokusebene emittiert wurde durch eine Lochblende ausgeblendet wird,

woraus sich eine sehr scharfe Abbildung des Präparates ausschließlich aus der Fokusebene

ergibt. Zudem wird der Laserstrahl, der als Lichtquelle dient auf die zu untersuchende Ebene

maximal fokussiert, sodass die Fluoreszenzfarbstoffe nur innerhalb des Strahlengangs

maximal angeregt werden, wodurch die Fluoreszenzfarbstoffe in den übrigen Ebenen

geschont werden und das Ausbleichen des Präparats während der Untersuchung minimiert

wird. Die Tiefenschärfe, also die optische Dicke des Schnittes wird dabei vom den

Durchmesser der Blende und der numerischen Apertur des Objektivs bestimmt. Werden

mehrere Schichten in unterschiedlichen Fokusebenen auf diese Art abgerastert, ergibt sich

ein dreidimensionales Abbild des Präparates.

In Ergänzung zu den ELISA Experimenten wurden konfokale Immunfluoreszenzanalysen

durchgeführt, die eine Aussage über die genaue Lokalisierung des S-CAT-S Konstrukts an

A431 Zellen ermöglichen sollten. Auf fixierten A431 Zellen wäre eine membranständige

Lokalisierung des S-CAT-S Konstrukts zu erwarten, da es nicht zu einer Rezeptor

vermittelten Internalisierung des Rezeptor : S-CAT-S Komplexes kommen sollte, darüber

hinaus wurden die Zellen nicht permeabilisiert, sodass keine intrazellulären Rezeptoren

zugänglich sein sollten.

Fixierte A431 Zellen wurden mit den jeweiligen Konstrukten, gefolgt vom -CAT Antikörper

und zuletzt mit dem AlexaFluor 488 gekoppelten Nachweisantikörper inkubiert, analog wurde

der scFv 425-Bla mittels anti-ß-Laktamase Antikörper nachgewiesen.

Ergebnisse

36

Überlagerung DAPI + 488 nm 488 nm

Abbildung 20) Konfokale Immunfluoreszenzanalyse des S-CAT-S Konstrukts auf A431 Zellen. In der linken Spalte wurden die Fluoreszenzsignale des Kernfarbstoffes DAPI und des Alexa488 gekoppelten Nachweisantikörpers überlagert. In der rechten Spalte wurde das Fluoreszenzsignal für die Konstrukte separat dargestellt. Die membranständige Fluoreszenz des scFv 425 ist deutlich zu erkennen. S-CAT-S und EGF zeigen membranständige und cytosolische Fluoreszenz, sowie charakteristische punktuelle Bereiche hoher Fluoreszenzdichte. Negativkontrolle wies eine schwächere und sehr diffuse Fluoreszenz auf.

S-CAT-S

EGF

neg. Kontrolle

scFv 425

Ergebnisse

37

Das S-CAT-S Fusionsprotein zeigte auf A431 Zellen eine deutliche, cytosolische

Fluoreszenz, die durch ausgeprägte, punktuell konzentrierte Signale charakterisiert war. Der

natürliche Ligand EGF wies ein mit dem S-CAT-S nahezu identisches Fluoreszenzmuster

auf. Das scFv 425-Bla Konstrukt zeigte wie in anderen Versuchen eine scharf umrissene,

membranständige Fluoreszenz. Die Negativkontrolle verursachte eine nicht zu

vernachlässigende Fluoreszenz, die jedoch von erkennbar schwächerer Intensität war.

Die Auswertung des Fluoreszenzsignals in Korrelation zum DAPI Signal mit dem Programm

ImageJ konnte den visuellen Eindruck bestätigen. Das Verhältnis des durchschnittlichen

Fluoreszenzsignals im GFP-Kanal zum durchschnittlichen DAPI-Signal war bei den

Positivkontrollen (scFv 425-Bla und EGF) 2 bis 3-fach höher als das der Negativkontrolle.

Die normalisierte Fluoreszenzintensität des S-CAT-S war 5.6-fach höher als die der

Negativkontrolle, wies jedoch eine hohe Standartabweichung auf.

Abbildung 21.) Auf das DAPI-Signal normalisierte Fluoreszenz des Signals im GFP-Kanal. Näherungsweise wurde die Fluoreszenzintensität im GFP-Kanal pro Zelle berechnet. Negativkontrolle zeigte das geringste Signal. Positivkontrollen wiesen ca. 2-3 fach höhere Fluoreszenzintensität auf.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Flu

ore

sze

nz

48

8 n

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DA

PI

Ergebnisse

38

In einem weiteren Experiment konnten bei stärkerer Vergrößerung die im Vergleich zum

CATwt stärkere Fluoreszenz des S-CAT-S Fusionsproteins, sowie die cytosolische

Lokalisation verifiziert werden (Abbildung 22). Für das S-CAT-S und CATwt Konstrukt

wurden jeweils die Schnittebenen mit der höchsten Fluoreszenz gezeigt. Der CATwt wies

erneut ein nicht vernachlässigbares Hintergrundsignal auf, das aber schwächer ausfiel als

das Fluoreszenzsignal des S-CAT-S Fusionsproteins.

A. S-CAT-S B. CATwt

Abbildung 22.) Konfokale Immunfluoreszenzanalyse auf fixierten A431 Zellen. A. S-CAT-S zeigte auf A431 Zellen ein stärkeres Fluoreszenzsignal mit höherer Dichte als CATwt. Die cytosolische Distribution war übereinstimmend mit vorherigen Versuchen. B. CATwt wies auf A431 Zellen eine geringere Fluoreszenzdichte auf. Das bei beiden Konstrukten vorhandene Hintergrundsignal wurde in identischer weise durch Anwendung der Schwellenwertfunktion (Pixelmator) abgezogen. Beide Konstrukte wurden mit gleicher Konzentration inkubiert (720 nM für das Monomer kalkuliert).

Ergebnisse

39

4.3.2.5 Test auf S-CAT-S : sEGF-R Interaktion mittels Oberflächenplasmonresonanz

Die auf Oberflächenplasmonresonanz beruhende Technik erlaubt es die Affinität einer

Interaktion in die einzelnen Parameter Assoziation (Ka) und Dissoziation (Kd) aufzulösen.

Diese Technik schien daher besonders gut geeignet, um eine Interaktion zwischen S-CAT-S

und sEGF-R nachzuweisen. Die Interaktionsstudien wurden mit einem BIAcore 3000

durchgeführt. Theoretisch sollte mithilfe dieser Technik der Unterschied in der

Dissoziationsrate zwischen dem hexavalenten S-CAT-S und dem trivalenten S-CAT

Fusionsprotein nachgewiesen werden

können, wie bereits für monovalente bzw.

multivalente „single-chain“ Antikörper

gezeigt werden konnte (Kortt, Dolezal et

al. 2001). Die Menge des auf den

Sensorchip CM-5 gekoppelten sEGF-R

entsprach 3347.4 RU (Abbildung 24).

Stenberg et al konnten zeigen, dass eine

Zunahme von 1000 RU etwa einer

Oberflächenkonzentration von 1 ng/mm²

entspricht (Stenberg, Persson et al.

1991).

Die Bindung der Positivkontrolle EGF an

den sEGF-R konnte trotz ungünstigen

Zeit [s]

0 500 1000 1500 2000

RU

20000

25000

30000

35000

40000

45000

Abbildung 24.) Kopplung des sEGF-R auf einen Sensorchip CM5. 3347.4 RU konnten auf die Oberfläche gekoppelt werden.

Zeit [s]

400 420 440 460 480 500 520

RU

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Abbildung 23.) Sensogramm des EGF auf sEGF-R. Signal war mit 150 RU im Bereich des maximal zu erwartenden Wertes unter Annahme der 1:1 Stöchiometrie. Signal der Referenzflusszelle wurde vom Signal subtrahiert und das verbliebene Signal normalisiert

Ergebnisse

40

Größenverhältnisses für die Oberflächenplasmonresonanz gezeigt werden und entsprach

150 RU (Abbildung 23). Für die in der Literatur beschriebenen Messungen wurde

üblicherweise das EGF auf die Sensoroberfläche gekoppelt und der lösliche sEGF-R darüber

geleitet, um die Messung zu vereinfachen. Nach theoretischen Berechnungen ist bei einer

Kopplung von 3347.4 RU sEGF-R (115 kDa) bei einer 1:1 Stöchiometrie der Bindung bei

vollständiger Sättigung mit EGF (6,4 kDa) ein Signal von ca. 186 RU zu erwarten. Der

gemessene Wert lag mit ca. 150 RU in dieser Größenordnung, womit von ca. 81 %

bindungskompetentem Rezeptor ausgegangen werden konnte.

Das S-CAT-S Konstrukt wurde mit ansteigenden Konzentrationen von 3.25 µM, über 6.5 µM,

bis 13 µM bei einer Flussrate von 20 µl/s über die Sensoroberfläche geleitet. Mithilfe der

Oberflächenplasmonresonanz konnte weder in PBS noch in HEPES Puffer unabhängig von

der Salzkonzentration eine Interaktion mit dem sEGF-R nachgewiesen werden. In allen

Fällen verblieb nach Abzug des Signals der Referenzflusszelle von dem Signal der mit

sEGF-R gekoppelten Flusszelle kein verwertbares, residuales Bindungssignal. Beispielhaft

werden die Messungen unter Verwendung eines mit 550 mM NaCl und 0,01% Tween 20

supplementierten HEPES Puffers dargestellt. Nach Abzug der Referenzflusszelle wurden

negative Werte erhalten, die zudem ausgeprägte Spitzen zu Beginn und Ende der

Probeninjektion zeigten (Abbildung 25). Die Signalspitzen könnten auf eine

Probenverdünnung im Flusssystem des BIAcore Gerätes zwischen den Flusszellen und zum

Abbildung 25.) Oberflächenplasmonresonanzsignal des S-CAT-S Fusionsproteins auf sEGF-R gekoppelter Oberfläche (Sensorchip CM-5). Differenz der Signale von sEGF-R gekoppelter und Referenzflusszelle wurde normalisiert. S-CAT-S wurde in ansteigenden Konzentrationen von 3.25 µM bis 13 µM injiziert. Nach Abzug der Referenzflusszelle konnte kein konzentrationsabhängig ansteigendes Signal detektiert werden.

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

0 10 20 30 40

RU

Zeit [s]

3.25 µM

6.5 µM

13 µM

Ergebnisse

41

anderen auf die niedrig eingestellte Datenerfassungsrate zurückzuführen sein. Das negative

Signal deutet auf einen Puffereffekt hin, obwohl die Proben in dem für die Gelfiltration

identischen Puffer gemessen wurden. Unter der Annahme eines funktional trimeren S-CAT-S

Komplexes (86.7 kDa) sollte bei einer 1:3 Stöchiometrie der S-CAT-S : sEGF-R Interaktion

ein Signal von etwa 841 RU, bei vollständiger Sättigung, zu erwarten gewesen sein. Trotz ca

81 % aktiver Oberfläche konnte keine S-CAT-S : sEGF-R Interaktion mittels

Oberflächenplasmonresonanz nachgewiesen werden.

Ergebnisse

42

4.3.2.6 Wirkung des S-CAT-S Konstrukts auf den Wundverschluss von A431 Zellen

Unter dem Gesichtspunkt einer späteren Anwendung des Konstrukts in der zielgerichteten

Tumortherapie wäre es konzeptionell wünschenswert, dass die Bindung an den EGF-R

nicht zu einer Stimulation der Zelle führt. In Wundheilungsexperimenten wurde die Induktion

EGF CATwt S-CAT-S Ctrl.

0 h

24 h

48 h

Abbildung 26.) Beispiel eines typischen Wundheilungsexperiments an A431 Zellen. In den konfluenten Zellrasen wurde mit einer 1000 µl Pipettenspitze eine Wunde eingeführt, gelöste Zellen mit Minimalmedium entfernt und anschließend mit den angegebenen Konstrukten inkubiert. Der Wundverschluss wurde sofort, nach 24h und 48h dokumentiert. Die zellfreie Fläche wurde unter Verwendung eines Makros mit dem Programm ImageJ dargestellt und berechnet.

Ergebnisse

43

der proliferativen und migratorischen Aktivität von A431 Zellen durch Inkubation mit dem S-

CAT-S Konstrukt analysiert. Bei diesen Experimenten gilt es zu beachten, dass keine direkt

Ableitung der Proliferationsrate der Zellen erfolgen kann, da es nicht möglich ist zwischen

proliferationsbedingter und Antiapoptose bedingter Zunahme der Zellzahl zu unterscheiden.

Es wird folglich ein Mischeffekt aus Proliferation, Antiapoptose und Migration abgegriffen. Da

EGF alle drei Parameter beeinflusst, stellt dieser Experimenttyp dennoch eine gute Methode

dar, um im gesamtzellulären Kontext die Wirkung des S-CAT-S Konstrukts durch Bindung an

den zellulären EGF-R mit der Wirkung des natürlichen Liganden (EGF) zu vergleichen.

Mittels einer 1000µl Pipettenspitze wurde in den konfluenten Zellrasen eine strichförmige

Läsion eingeführt. Abgelöste Zellen wurden durch intensives Waschen entfernt und der

verbliebene Zellrasen anschließend mit den in Minimalmedium formulierten Konstrukten

inkubiert. Die Größe der Wunde wurde nach 24 und 48 Std. durchlichtmikroskopisch

dokumentiert.

Die zellfreie Fläche in Pixel wurde sofort, nach 24 h und 48 h mit dem Programm ImageJ

vermessen (Abbildung 27). Die Differenz der nach 0 h und 24 h vermessenen Wert diente

Abbildung 27.) Wundheilungsexperiment. Der deutlichste Wundverschluss 24 h nach Induktion konnte bei EGF inkubierten Zellen mit 174731 Pixel Differenz zum 0 h Wert festgestellt werden. Die Mediumkontrolle wies einen 1.9-fach verringerten Wundverschluss im Vergleich zur EGF Kontrolle auf. Das S-CAT-S zeigte einen nur 8647 Pixel stärkeren Wundverschluss als die Mediumkontrolle und damit ein 1.74-fach verringerten Wundverschluss verglichen mit der EGF Kontrolle. Die CATwt Kontrolle zeigte mit 72405 Pixel Differenz den geringsten Wundverschluss nach 24 h. Die Verringerung der freien Fläche durch Teilung und Migration von Zellen in die Wundfläche wurde in Pixel 24 h und 48 h nach Induktion ermittelt.

174741

72405

100273

252980

197228

183907

206270

91626

0

50000

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EGF CATwt S-CAT-S ctrl.

Verr

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Pix

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24 h p.I.

48 h p.I.

Ergebnisse

44

als Maß für die Aktivierung der Zellen. Hier wurde ein typisches Wundheilungsexperiment

beispielhaft dargestellt.

Nach 24 Std. war die Wundfläche der mit EGF behandelten Zellen um 174.410 Pixel

verringert und übertraf die Mediumkontrolle um das 1.9-fache. Der Wert für CATwt inkubierte

Zellen lag bei 41 % des Wertes der EGF Kontrolle, der Wert für S-CAT-S bei 57.4 % und die

Mediumkontrolle bei 52.2 %. Mit Ausnahme der EGF inkubierten Zellen lagen die

Unterschiede des Wundverschlusses zwischen CATwt, S-CAT-S und der Mediumkontrolle

im Rahmen des Fehlers für zelluläre Versuche. Es konnte kein induzierender Effekt für das

S-CAT-S festgestellt werden. In Verbindung mit deutlichem Bindungsnachweis des S-CAT-S

an den sEGF-R wäre dies ein vorteilhaftes Ergebnis, da ein stimulierender Effekt für ein

therapeutisches Agens wünschenswert wäre.

Ergebnisse

45

4.3.2.7 Test auf Interaktion des S-CAT-S Fusionsproteins mit membranständigem EGF-R auf A431 Zellen mittels Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie wird klassischer Weise in der Diagnostik eingesetzt, um mittels

spezifischer, fluoreszenzmarkierter Antikörper Oberflächenmarker auf Zellen nachzuweisen,

wie beispielsweise bei der Diagnose der Leukämie. Ebenso lässt sich die Technik aber auch

für den Nachweis der Bindung eines fluoreszenzmarkierten Konstrukts an Zellen einsetzen.

Der Vorteil der Durchflusszytometrie liegt in der Datenerfassung auf Einzelzellebene mit

nahezu beliebig großem Probenumfang. Typischerweise werden 10.000 bis 20.000 Zellen

erfasst. Demgegenüber vermittelt der ELISA nur ein gemitteltes Abbild über die gesamte

Zellpopulation, auch die konfokale Immunfluoreszenz vermittelt entweder nur einen

Überblick, oder sehr genaue Daten nur auf Grundlage einiger weniger Zellen.

A431 Zellen wurden vereinzelt und mit dem Fusionsprotein S-CAT-S inkubiert, der

Nachweis des Konstrukts erfolgte mittels präinkubiertem primären Ziege anti-CAT Antikörper

und sekundärem anti-Ziege Alexa 488 Antikörper. Als Antikörperkontrollen wurden der

sekundäre Antikörper und präinkubierte primärer und sekundärer Antikörper eingesetzt, und

als weitere Negativkontrolle wurde das CATwt Enzym eingesetzt.

Sowohl das CATwt Enzym, als auch die Antikörperkontrollen zeigten kein Hintergrundsignal

im Vergleich zu ungefärbten Zellen (Abbildung 29). Die membranständige Präsentation des

EGF-R auf A431 Zellen konnte durch die Positivkontrolle scFv 425-Bla, einem Fusionsenzym

aus dem scFv 425 und der -Laktamase, gezeigt werden (Abbildung 28). Für das S-CAT-S

Konstrukt konnte unter den angewandten Bedingungen keine Bindung an A431 Zellen

nachgewiesen werden, die Fluoreszenzintensität war mit dem des CATwt Enzyms, welches

keine spezifischen Peptide präsentiert, identisch (Abbildung 28).

Abbildung 28.) FACS basierter Test auf EGFR : S-CAT-S Interaktion mit A431 Zellen. Die Positivkontrolle scFv 425-Bla wies ein deutliches Fluoreszenzsignal auf. CATwt Enzym zeigte kein Hintergrundsignal. Bindung des S-CAT-S konnte nicht gezeigt werden. Überlagerung der CATwt und S-CAT-S Signale ergab keine Signaldifferenz.

Ergebnisse

46

Abb

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Ergebnisse

47

4.3.3 Diskussion

Nach sechs Selektionsrunden auf A431 Zellen und der sezernierten Variante des EGF-R

wurden drei dominante Sequenzen isoliert (SSHIFTF, HNVRHFSLHNLQ, GLNSPIHSR), die

im monoklonalen Phagen-ELISA vergleichbar starke Bindungssignale zeigten (Abbildung

11), was in sich konsistent erschien. Die Sequenz SSHIFTF entstammte als einzige direkt

einer CDR (CDR L3) des parentalen mAK 425, während die übrigen Sequenzen aus

anderen Leserastern entstammten. Ein Sequenzhomologievergleich der mit Histidin

beginnenden Tripeptidmotive (HXX) mittels T-coffee (Poirot, O'Toole et al. 2003) erbrachte

einen guten Homologiewert von 79, der im Lichte einer zweifachen Präsenz eines Histidins

in der Struktur des parentalen mAK 425 (CDR L3 und CDR H2) eine gute Rationale für die

angereicherten Sequenzen lieferte und das Vertrauen in die gute Selektionsmethodik

untermauerte (Abbildung 9, Abbildung 10). Die herausragende Bedeutung von

Tripeptidmotiven bei der Selektion von Peptiden wurde bereits in anderen Arbeiten gezeigt

(Arap, Kolonin et al. 2002; Kolonin, Bover et al. 2006; Kolonin, Sun et al. 2006). Ein weiterer

Aspekt, der eine Rationale für die selektierte Peptidsequenz SSHIFTF lieferte, war die

Beobachtung, dass die CDR L3 bei vielen untersuchten Antikörper-Antigen Paaren für die

meisten inter-Domänenkontakte verantwortlich zeichnete (MacCallum, Martin et al. 1996).

Aufgrund der dargestellten Sachverhalte konnte von einer methodisch und inhaltlich

fundierten Basis der Phage Display basierten Selektion EGF-R spezifischer

Peptidsequenzen, im speziellen der SSHIFTF Sequenz, ausgegangen werden, sodass diese

für die Generierung eines CAT-Fusionsproteins (S-CAT-S) ausgewählt wurde.

Nach anfänglicher schlechter Reproduzierbarkeit des S-CAT-S Bindungssignals in ELISA

Experimenten, welche zum einen auf den variierend hohen Hintergrund des CATwt Enzyms

und zum anderen auf das, unabhängig vom CATwt, schwankende Bindungssignal des S-

CAT-S Fusionsproteins zurückzuführen war, konnten nach ausgiebigen Tests Bedingungen

gefunden werden, unter denen sowohl das CATwt Signal auf niedrigem Niveau, als auch das

S-CAT-S Signal reproduzierbar waren (Abbildung 16). Darüber hinaus konnten unter diesen

Bedingungen in ELISA Experimenten sowohl die konzentrationsabhängige Verdrängung des

S-CAT-S Konstrukts durch den scFv 425 (Abbildung 17), als auch eine Abhängigkeit des

Bindungssignals von der Anzahl präsentierter Peptide gezeigt werden, wobei ersteres auch

mit einem einfachen sterischen Effekt erklärt werden könnte, da es sich beim scFv 425-Bla

um ein Fusionsprotein mit einem relativ großen Enzym (β-Laktamase) handelt. Mittels

zellulärem ELISA auf A431 Zellen konnte ebenfalls eine Bindung des Fusionsproteins

gezeigt werden, wenn das Signal auch nur geringfügig höher war als das Signal der CATwt

Kontrolle, die ein deutliches unspezifisches Signal zeigte (Abbildung 19).

Ergebnisse

48

Da der Bindungsnachweis mittels ELISA nur unter recht spezifischen Bedingungen mit guter

Reproduzierbarkeit gelang, wurden weitere Methoden zum Interaktionsnachweis angewandt,

wobei die Oberflächenplasmonresonanz ebenfalls mit gereinigtem Rezeptor durchgeführt

wurde. Mittels Oberflächenplasmonresonanz konnte jedoch weder unter

Standartbedingungen noch unter den im ELISA getesteten Pufferbedingungen eine Bindung

gezeigt werden (Abbildung 25). Einen möglichen Erklärungsansatz könnte man darin sehen,

dass der sEGF-R während des Kopplungsprozesses, der bei pH 3.4 durchgeführt wurde,

durch erneutes Aussetzen eines niedrigen pH Wertes denaturiert wurde, jedoch ist die

nachgewiesene Bindung des natürlichen Liganden EGF und die daraus errechneten 81%

Aktivität des gekoppelten Rezeptors kontraindikativ für diese Erklärung. Somit konnte mit

zwei unabhängigen Methoden die Bindung des S-CAT-S Konstrukts an den gereinigten

sEGF-R nicht eindeutig und zweifelsfrei nachgewiesen werden.

Mithilfe zwei weiterer, zellbasierter Methoden konnte die Bindung ebenfalls nicht zufrieden

stellend geklärt werden. Als eine anerkannte und weit verbreitete Methode zum

Bindungsnachweis wurde die Durchflusszytometrie eingesetzt. Bei dieser Technik wird die

Bindung an Zelloberflächenmoleküle auf Einzelzellebene mit sehr großem Probenumfang

detektiert. Als Positivkontrollen wurden der scFv 425-Bla und ein EGF NeutrAvidin Oregon

Green 488 Konstrukt eingesetzt, die beide deutliche Fluoreszenzsignale lieferten, sodass

von einer Expression funktionellen Rezeptors auf der Zelloberfläche ausgegangen werden

konnte. Für das S-CAT-S Konstrukt konnte mittels Durchflusszytometrie keine Bindung an

A431 Zellen nachgewiesen werden (Abbildung 28). Die Inkubation der Zellen mit dem S-CAT-

S Konstrukt wurde bei 4°C durchgeführt, um eine potentielle Internalisierung des Konstrukts

zu verhindern, was die anschließende Detektion mit dem sekundären,

fluoreszenzgekoppelten Antikörper verhindert hätte. Somit ist nicht auszuschließen, dass die

Bindung aufgrund der niedrigen Temperatur nicht zustande kommen konnte, obwohl unter

diesen Bedingungen eine Bindung des EGF deutlich gezeigt werden konnte.

Als weitere zellbasierte Methode zum Nachweis einer Peptid vermittelten Bindung des

Fusionsproteins S-CAT-S an A431 Zellen wurde die konfokale Fluoreszenzmikroskopie

hinzugezogen, mit deren Hilfe eine membranständige Lokalisation des Fluoreszenzsignals

im Falle einer Bindung nachgewiesen werden kann. Der als Positivkontrolle eingesetzte scFv

425-Bla zeigte bei diesen Analysen erwartungsgemäß ein deutlich membranständiges

Fluoreszenzsignal (Abbildung 20), da es durch die Fixierung der Zellen nicht zu einer

Internalisierung des membranständigen EGF-R – scFv 425-Bla Komplexes kommen konnte.

Für den natürlichen Ligand EGF wurde sowohl membranständige, als auch cytosolische

Fluoreszenz nachgewiesen, wobei charakteristische Bereiche mit besonders intensiver

Fluoreszenzdichte auftraten. Das Fluoreszenzmuster des Fusionsproteins S-CAT-S war

vergleichbar mit dem Signal des Liganden EGF und zeigte die gleichen Charakteristika. Ein

Ergebnisse

49

cytosolisches Fluoreszenzsignals wäre bei fixierten und nicht permeabilisierten Zellen nicht

unbedingt zu erwarten gewesen, da eine zellvermittelte Internalisierung nicht möglich

gewesen sein sollte, sodass evtl. von einer unzureichenden Fixierung ausgegangen werden

muss. Im Widerspruch zu dieser Interpretation steht aber das deutlich membranlokalisierte

Signal des scFv 425-Bla und das Fehlen cytosolischer Fluoreszenz, obwohl alle Zellen

parallel behandelt wurden. Für den parentalen mAK 425 und den abgeleiteten scFv 425

wurde beschrieben, dass eine EGF-R vermittelte Internalisierung des AK auf A431 Zellen

stattfand (Sunada, Magun et al. 1986; Kreitman 2001). Das relativ hohe Hintergrundsignal

des CATwt Enzyms zeigte sich zuvor auch schon bei den zellulären ELISA Experimenten.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass eine Bindung des S-CAT-S

Fusionsproteins nicht die notwendige Robustheit besitzt, um mit jeder Methode zweifelsfrei

nachgewiesen werden zu können. Die Tatsache, dass weder das S-CAT-S Fusionsprotein,

noch das CATwt Protein einen stimulierenden Einfluss auf A431 Zellen ausübten (Abbildung

26 & Abbildung 27), war aus theoretischen Überlegungen vorteilhaft für die Idee des

späteren potentiellen Einsatzes in der Wirkstoffaktivierungtherapie, jedoch ohne einen

zweifelsfreien Bindungsnachweis nicht von eigenständiger Aussagekraft.

Ergebnisse

50

4.4 Das QWSSHIFTF-Streptavidin Konstrukt

4.4.1 Einleitung

Wie zuvor beschrieben, wurde in der Phage Display basierten Selektion eine Peptidsequenz

isoliert (SSHIFTF), die aus der CDR L3 des mAK 425 stammt, wobei diese nicht die gesamte

elterliche Sequenz umfasste. Es sollte im Folgenden untersucht werden, ob die vollständige

Sequenz der CDR L3 (QWSSHIFTF) der SSHIFTF Sequenz überlegene

Bindungseigenschaften aufweist. Zu diesem Zweck wurde die Sequenz als N-terminal

biotinyliertes Peptid bestellt. Mit diesem Peptid wurden durch Inkubation mit Streptavidin-

A.

B.

Abbildung 30) Darstellung der Peptidsequenz QWSSHIFTF in der modellierten Struktur des mAk 425. A. Vergrößerte Darstellung der Peptidsequenz. B. Stereo-Abbildung der Peptidsequenz. Die Seitenketten des His 93 ragt prominent aus der Struktur heraus.

Ergebnisse

51

HRP oder NeutrAvidin Oregon Green 488 Targeting-Komplexe für ELISA Experimente bzw.

FACS Experimente generiert, was durch den modularen Aufbau einen raschen

Interaktionsnachweis ermöglichte. Aufgrund der starken nicht-kovalenten Interaktion

zwischen Streptavidin und Biotin, eignen sich das dimere, vier Biotinmoleküle bindende

Streptavidin und dessen Derivate gut für die multimere Präsentation EGF-R spezifischer

Peptide zum Bindungsnachweis.

4.4.2 Ergebnisse

4.4.2.1 ELISA basierter Versuch eines Bindungsnachweises für den QWSSHIFTF Streptavidin Komplex an die sEGF-R Proteinoberfläche

Das biotinylierte Peptid QWSSHIFTF wurde in ELISA Experimenten auf Interaktion mit dem

immobilisierten sEGF-R unter zwei experimentellen Konditionen getestet, die einen

Rückschluss auf den Einfluss der Valenz auf die Bindung erlauben sollten. Bei serieller

Inkubation wurden im ersten Schritt wurden zunächst nur die Peptide inkubiert, was das

Zustandekommen eines multimerisierungsbedingten Aviditätseffekts unterbinden sollte.

Nach Entfernung ungebundener Peptide wurden im zweiten Schritt an den EGF-R

gebundene, monomere Peptide mittels Streptavidin detektiert. Bei Präinkubation des Peptids

mit Streptavidin entsteht dagegen ein tetravalenter QWSSHIFTF : Streptavidin-HRP

Komplex, der einen Aviditätseffekt ermöglichen sollte. Dieser Hypothese folgend wäre also

A.

B.

Abbildung 31.) ELISA mit biotinylierten Peptid : Streptavidin Konstrukten. A. Peptide und Streptavidin-HRP wurden seriell auf immobilisiertem sEGF-R inkubiert. Das QWSSHIFTF zeigte ein höheres Bindungssignal als Strep-HRP alleine oder mit Biotin konjugiert. B. Biotinylierte Peptide wurden mit Strep-HRP präinkubiert und anschließend auf dem sEGF-R auf Bindung getestet. Das Bindungssignal des QWSSHIFTF : Strep-HRP Konstrukts war nicht signifikant höher als das Signal der beiden Kontrollkonstrukte. Die EGF : Strep-HRP Positivkontrolle zeigte eine deutlichere Bindung.

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Ergebnisse

52

für die präinkubierten Konstrukte (QWSSHIFTF und EGF) ein höheres Signal zu erwarten als

bei den seriell inkubierten Versuchen. Bei serieller Inkubation war das Signal der EGF-

Positivkontrolle geringfügig höher als die Signale der Negativkontrollen (Abbildung 31, A.).

Das QWSSHIFTF Peptid zeigte, bei großem Fehler, ein höheres absolutes Signal als die

EGF Kontrolle, sodass man nicht von einem eindeutigen Bindungsnachweis ausgehen

konnte (Abbildung 31, A.). Der präinkubierte EGF : Streptavidin-HRP Komplex zeigte ein

erwartungsgemäß hohes Signal (2.3-fach höher als die Negativkontrolle), jedoch konnte für

den QWSSHIFTF : Streptavidin-HRP Komplex kein Bindungssignal detektiert werden, das

signifikant höher war als das der Negativkontrollen, die Differenz der Absorption zu der

Negativkontrolle betrug nur 0.02 Absorptionseinheiten (Abbildung 31, B.). Eine endgültige

Aussage über den Einfluss eines möglichen Aviditätseffekt konnte mangels Bindung des

QWSSHIFTF Peptids nicht getroffen werden, auch für das EGF war dies bei dem gezeigten

Versuch nicht möglich, da die Durchführung der beiden ELISA Experimente unter seriellen

und präinkubierten Bedingungen unabhängig voneinander stattfand. Vorrangig sollte zuerst

die QWSSHIFTF vermittelte Bindung des Targeting-Komplexes gezeigt werden, was auch in

weiteren Versuchen nicht gelang. Aus diesem Grunde wurde auf eine Wiederholung dieses

Vergleichs für EGF verzichtet.

Ergebnisse

53

4.4.2.2 Bindungsnachweis für den QWSSHIFTF : NeutrAvidin Komplex an A431 Zellen mittels Durchflusszytometrie

Ergänzend zu den ELISA basierten Versuchen zum Nachweis einer peptidvermittelten

Bindung wurde versucht mithilfe der Durchflusszytometrie eine Bindung an A431 Zellen

nachzuweisen. Zu diesem Zweck wurde das fluoreszenzmarkierte NeutrAvidin als Modul zur

Multimerisierung des QWSSHIFTF Peptids für FACS Analysen verwendet. NeutrAvidin weist

im Unterschied zu Avidin einen neutralen pI auf und neigt aufgrund der neutralen Ladung

potentiell weniger zu unspezifischen Interaktionen mit der zellulären Matrix, sodass es für

FACS Analysen mit Zellen gut geeignet schien. Die EGF-R spezifische Bindung des Peptids

wurde auf zwei Arten überprüft. In einem Ansatz wurden die biotinylierten Peptide mit

NeutrAvidin Oregon Green 488 vor der Inkubation auf A431 Zellen präinkubiert, so dass ein

mit vier Peptiden dekorierter Komplex resultierte. Im anderen Ansatz wurden zunächst die

Peptide auf den A431 Zellen inkubiert, ungebundene Peptide entfernt und gebundene

Peptide anschließend mit NeutrAvidin Oregon Green 488 detektiert. Als Kontrollen wurden

undekoriertes NeutrAvidin Oregon Green 488 und mit Biotin dekoriertes NeutrAvidin Oregon

Green 488 eingesetzt, die beide ein kaum detektierbares Hintergrundsignal lieferten

(Abbildung 33).

Das als Positivkontrolle eingesetzte EGF zeigte unter beiden experimentellen Bedingungen

deutliche Fluoreszenz, die in zwei Zellpopulationen mit unterschiedlicher

Fluoreszenzintensität zu unterscheiden war, was vermutlich auf nicht gesättigte

Konzentration an Komplexen zurückzuführen war (Abbildung 33). Bei einer Wiederholung mit

präinkubierten Komplexen lieferte die EGF Kontrolle erneut eine deutliche Fluoreszenz,

während das QWSSHIFTF Konstrukt keine Fluoreszenz zeigte (Abbildung 32).

Abbildung 32.) FACS Analyse des QWSSHIFTF : NeutrAvidin Oregon Green 488 Komplexes auf A431 Zellen. Alle Komplexe wurden präinkubiert. Mittels EGF dekorierter Positivkontrolle konnte die membranständige Präsenz des EGF-R nachgewiesen werden. Der QWSSHIFTF dekorierte Komplex zeigte keine Fluoreszenz. Die Überlagerung des EGF Signals mit dem QWSSHIFTF Signal verdeutlichte die nicht messbare QWSSHIFTF vermittelte Bindung.

Ergebnisse

54

Abb

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Ergebnisse

55

4.4.3 Diskussion

Das QWSSHIFTF Peptid, welches der vollständigen CDR L3 des parentalen mAK 425

entspricht, vermittelte weder in ELISA Experimenten, noch bei FACS Analysen eine Bindung

der Streptavidin-HRP respektive NeutrAvidinOG488 Komplexe an den sEGF-R bzw. an

A431 Zellen. In beiden Fällen konnte jedoch für die Positivkontrolle EGF ein deutliches

Bindungssignal festgestellt werden. Die beiden Aminosäuren Q und W scheinen also

mindestens keinen positiven Einfluss auf die Bindung auszuüben. Für das S-CAT-S

Fusionsprotein konnte im ELISA eine Bindung nachgewiesen werden, was bei FACS

Analysen nicht gelang, dagegen konnte für das um die Aminosäuren Q und W veränderte

Peptid auch im ELISA keine Bindung gezeigt werden. Zwar sind die

Streptavidin/NeutrAvidinOG488 Konstrukte nicht direkt mit dem S-CAT-S Fusionsprotein

vergleichbar, da sie sich schon in der Valenz präsentierter Peptide (4 gegenüber 6

präsentierten Peptiden für letzteres Konstrukt) unterschieden, jedoch zeigten die

Experimente, dass auch das vollständig der CDR L3 entsprechende Peptid keine robustere

Bindung an den EGF-R bzw. an A431 Zellen zu vermitteln vermochte.

Ergebnisse

56

4.5 Das S-GST-S Fusionsprotein

4.5.1 Einleitung

Aufgrund der anfänglich hohen Hintergrundsignale durch die Enzymkontrolle CATwt,

wurde alternativ und parallel zur Optimierung der Pufferbedingungen für das CATwt Enzym

ein dimeres Konstrukt auf dem Enzym Glutathion-S-Transferase (GST) basierend generiert.

GST spielt bei der Entgiftung von Xenobiotika in der Leber, wo sie die Konjugation

des Tripeptids GSH katalysieren eine wichtige Rolle (Hayes und Pulford 1995; Hayes und

Strange 1995). Das Enzym GST wird in fast allen Arten und Geweben vorgefunden, wobei

die höchste Aktivität bei Menschen in der Leber, gefolgt von der Niere, vorgefunden wird

(Pacifici, Franchi et al. 1988; Pacifici, Franchi et al. 1988). Eine Überexpression des Enzyms

GST wird häufig bei humanen Tumoren vorgefunden (Tew, Monks et al. 1996). Der Umstand

der Überexpression von GST bei einigen humanen Tumoren diente als Rationale, für die

Entwicklung von Wirkstoffvorstufen, die durch GST im Tumor aktiviert werden (Lyttle,

Satyam et al. 1994; Satyam, Hocker et al. 1996; Gunnarsdottir und Elfarra 1999; Hamilton,

Kavarana et al. 1999).

GST (aus Schistosoma japonicum) eignet sich aus struktureller Sicht für eine

Präsentation der Peptide, da sich die Termini frei zugänglich an der Proteinoberfläche

befinden. Ein potentieller Aviditätseffekt würde bei vier gegenüber sechs präsentierten

Peptiden beim S-CAT-S Konstrukt naturgemäß niedriger ausfallen, jedoch war die Hoffnung

bei ausreichender Affinität des Peptids bei geringerem Hintergrundsignal des GSTwt Enzyms

dennoch eine EGF-R spezifische Lokalisierung des S-GST-S Konstrukts zeigen zu können.

4.5.2 Ergebnisse

4.5.2.1 Rekombinante Herstellung und Reinigung

Die SSHIFTF kodierende Sequenz wurde mittels Primer-Extension-PCR, unter Verwendung

der Oligonukleotide pF_SSHIFTF_CAT und pR_GST_SSHIFTF, an die 5´und 3´ Termini des

gst-li-Gens in pQE16 Hintergrund angehängt. Das PCR-Produkt, welches für das gesamte S-

GST-S Konstrukt codiert, wurde über die Restriktionsschnittstellen NheI und HindIII in den

ebenso geöffneten pLISC Expressionsvektor subkloniert (pIB30_SSHIFTF_GST_SSHIFTF).

Das S-GST-S Konstrukt im pLISC Expressionsvektor wurde in E. coli RV308 exprimiert und

mittels Affinitätschromatographie isoliert. Aus 2 l Kultur konnten ca. 790 µg Protein

Ergebnisse

57

gewonnen werden, was deutlich unter der Ausbeute des GSTwt Enzyms (826 µg Protein aus

1 l Kultur) lag.

Nach der Dialyse wurden 15 µl Probe mittels SDS-PAGE auf korrekte Größe und Reinheit

analysiert. Eine Coomassie Färbung des Gels ergab eine starke, singuläre Proteinbande, die

auf einer Höhe von 27.8 kDa lief, was in guter Übereinstimmung mit dem errechneten

Molekulargewicht von 28.8 kDa liegt (Abbildung 34). Das GSTwt Protein weist ein

Molekulargewicht von 25.8 kDa auf. Korrekte Größe und hohe Reinheit konnten somit

dokumentiert werden.

Abbildung 34.) 12.5 % SDS-PAGE Analyse des S-GST-S Konstrukts. Mittels Coomassie Färbung wurden die Proteinbanden visualisiert. Größe 28.8 kDa konnte auf dem Gel bestätigt werden.

Ergebnisse

58

4.5.2.2 ELISA basierter Test auf S-GST-S : sEGF-R Interaktion

Der ELISA auf immobilisiertem sEGF-R offenbarte ein geringes absolutes Hintergrundsignal

(0.2 bzw. 0.26 Absorptionseinheiten) des GSTwt Enzyms auf sEGF-R immobilisierter

Oberfläche (Abbildung 35). Das S-GST-S zeigte relativ zur GSTwt Kontrolle unterschiedlich

starke Signale in Abhängigkeit der verwendeten Blockierungslösung, war jedoch mit 0.16

bzw. 0.13 Absorptionseinheiten auf sehr geringem Niveau und konnte daher nicht als

indikativ für eine sEGF-R spezifische Bindung angesehen werden.

A. BSA

B. PVP

Abbildung 35.) Test auf eine SSHIFTF vermittelte Lokalisierung des S-GST-S Konstrukts am sEGF-R unter Verwendung von BSA bzw. PVP-K30 als Blockierungslösung. A. Bindungssignal des GSTwt war auf BSA blockierter sEGF-R Oberfläche um 0.04 Aborptionseinheiten geringfügig höher als das Signal des S-GST-S. B. Auf PVP blockierter sEGF-R gekoppelter Oberfläche war das unspezifische Hintergrundsignal des GSTwt um 0.13 Absorptionseinheiten (2-fach) höher als das des S-GST-S.

4.5.3 Diskussion

Für das S-GST-S Konstrukt konnte keine Bindung an den sEGF-R nachgewiesen werden.

Die Bedingungen des GST ELISA wurden analog zu den ersten ELISA Versuchen mit dem

S-CAT-S Konstrukt gehalten. Da kurz nach der Durchführung des ELISA Experiments mit

GST basierten Konstrukte optimale Bedingungen bezüglich der Salzkonzentration in

Verbindung mit PVP als Blockierungslösung für die CAT basierten Konstrukte gefunden

werden konnten, wurde auf eine Optimierung der Parameter für die GST basierten

Konstrukte verzichtet, da diese durch die geringere Valenz präsentierter Peptide

konzeptionell ohnehin benachteiligt sein sollten.

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Ergebnisse

59

4.6 Das SSHIFTF-Bla-T-Zip Konstrukt

4.6.1 Einleitung

Die topologischen Eigenschaften der Präsentation bisher vorgestellter, CAT oder GST

basierter Konstrukte unterscheidet sich deutlich von der Präsentation der Peptide auf den

Phagenpartikeln. Auf Phagen werden die Peptide an der Spitze des Phagen präsentiert und

liegen demzufolge räumlich nahe zusammen, was eine hohe lokale Konzentration des

präsentierten Peptids bedingt (Abbildung 36). Auf den globulären Enzymen werden die

Peptide jedoch auf der Proteinoberfläche verteilt präsentiert, was zu einer vergleichsweise

geringeren lokalen Konzentration führen könnte. Da die Resultate der CAT und GST

basierten Konstrukte zu diesem Zeitpunkt noch uneinheitlich ausfielen, wurde ein

alternativer Ansatz gesucht. Dieser sollte den beschriebenen, theoretischen Nachteil unter

Beibehaltung einer enzymatischen Funktion ausgleichen.

Abbildung 36.) Schematische Repräsentation eines M13 Phagenpartikels. PIII Hüllprotein ist blau, PVIII grün und die spiralisierte DNA violett dargestellt. Die Fusion von Peptiden an das PIII Hüllprotein bedingt eine hohe lokale Konzentration des präsentierten Peptids.

Das Hüllprotein PIII des M13 Phagen und damit auch N-terminal fusionierte Peptide werden

in drei bis fünf Kopien an dessen Spitze präsentiert.

Der in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Plückthun entwickelte Tetrazipper (Pack, Müller et al.

1995) sollte es erlauben, ähnliche topologische Bedingungen wie auf dem M13 Phagen für

ein zu präsentierendes Peptid breit zu stellen. Der Tetrazipper sollte als Gerüst zur

Multimerisierung eines EGF-R spezifischen Peptids dienen.

Die enzymatische Funktion hingegen sollte durch die N-terminale Fusion der -Laktamase

bereitgestellt werden, wobei es sich um eine stabilisierte Variante des Proteins handelt

(Hecky und Müller 2005). Ein stabileres Protein bietet Vorteile für eine spätere hypothetische

therapeutische Anwendung im Hinblick auf die rekombinante, industrielle Fertigung des

Therapeutikums, sowie auf die Halbwertzeit bei dessen Applikation im Körper. Parallel wurde

im Labor an einer Variante der -Laktamase gearbeitet, die als Fernziel einer aufgrund der

Ergebnisse

60

prokaryotischen Herkunft bedingten Immunantwort durch Eliminierung dominanter Epitope

ausweichen sollte (Dr. med. Janina Speck).

Das SSHIFTF Peptid wurde als bindendes Modul an den N-Terminus der -Laktamase

fusioniert, womit sich die Bezeichnung des resultierenden Konstrukts analog zu seinem

strukturellen Aufbau zu „S-Bla-TZip“ ergab.

Der funktionelle Komplex stellt sich als Tetramer dar, der vier -Laktamase Enzyme enthält,

an deren N-Termini jeweils ein SSHIFTF Peptid präsentiert wird. Um sterische Probleme

aufgrund der räumlich dichten Packung von vier Enzymen zu vermeiden wurde in den

flexiblen Linker zwischen -Laktamase und Tetrazipper die Aminosäure Prolin inseriert,

welche einen Knick im Linker verursacht.

4.6.2 Ergebnisse

4.6.2.1 Klonierung und Reinigung

Klonierung:

Ausgehend von einer optimierten Variante der -Laktamase wurden durch mehrstufige

Primer Extensions PCR zunächst die Linkersequenzen und schließlich die SSHIFTF bzw.

Tetrazipper kodierenden Sequenzen an das Gen der -Laktamase kloniert. Im ersten Schritt

wurden unter Verwendung der Primerpaare pF_BlaSS_SSHIFTF_li_BlaS3#6 und

pR_BlaS3#6_li_tzip (Abbildung 37, F1 bzw. R1) die SSHIFTF, jeweilige Linker und ein Teil

der Tetrazipper kodierenden Sequenzen an das -Laktamase-Gen kloniert. Das PCR

Abbildung 37.) Schematische Darstellung des genetischen S-Bla-TZip Konstrukts. Verwendete Pimerpaare wurden symbolisch als geschweifte Klammern dargestellt.

Ergebnisse

61

Produkt diente wiederum als Matrize für die zweite PCR unter Verwendung der Primerpaare

prF_NdeI_BlaSS_sigseq_5end und pR2_BlaS3#6_li_tzip (Abbildung 37, F2 bzw. R2). Das

finale PCR Produkt wurde über die Schnittstellen NdeI und HindIII in den identisch

geöffneten Vektor pJH_BlaSS_Blawt kloniert.

Reinigung:

Das S-Bla-TZip Konstrukt wurde aus 3 L RV308 Expressionskultur durch Periplasma-

aufschluss und anschließende Affinitätschromatographie isoliert. Die Reinigung über eine

Phenylboronat-Säule erbrachte mit einem

maximalen Proteinabsorptionswert von 120 mAU

eine geringe Ausbeute. Ein auf Farbumschlag

basierender Aktivitätstest mit dem Substrat

Nitrocefin zeigte, dass die Reinigung prinzipiell

erfolgreich war (Abbildung 38). Der Durchfluss und

eine Waschfraktion zeigten auch 2 min nach

Zugabe des Substrats kaum Aktivität, während in

der Elutionsfraktion #18 sofort nach Zugabe des

Substrats, trotz der inhibierenden Wirkung des mit

Boronat versetzten Elutionspuffers, ein

Farbumschlag zu dunklem rot stattfand. Die

Konzentration des Proteins war zu gering, um

mittels Coomassie Färbung (untere Nachweisgrenze für Proteine ca. 100 ng/Bande) des

SDS-Gels eine Proteinbande nachweisen zu können.

4.6.3 Diskussion

Das S-Bla-TZip Fusionsprotein konnte erfolgreich kloniert werden. Die Expression und

Reinigung gelangen nur zu geringen Mengen, die nicht ausreichend waren, um auf einem

Coomassie gefärbten SDS-Gel nachgewiesen werden zu können. Um geeignete Mengen für

Interaktionsstudien bereitstellen zu können, hätte das Fusionsprotein in größerem Maßstab

exprimiert werden müssen. Ein 10 l Fermenter, in dem OD600 Werte von 80 – 100 erzielt

werden können, hätte vermutlich ausreichende Mengen erbracht. Der Ansatz wurde aus

zeitlichen Gründen nicht weiter verfolgt.

Abbildung 38.) Aktivitätstest des gereinigten S-Bla-TZip Konstrukts. Nitrocefin wurde zu den Proben

gegeben, bei -Laktamase Aktivität erfolgte ein Farbumschlag von gelb zu rot.

Ergebnisse

62

5 Kapitel 2 Ansätze zum rationalen Peptiddesign

In dem vorliegenden Kapitel soll der rationale Ansatz zur Generierung EGF-R spezifischer

Peptide beschrieben werden.

5.1 CDR H3 abgeleitetes Peptid als bindendes Modul für die Fusion an das CAT Enzym

5.1.1 Einleitung

Antikörper sind in der Lage eine beinahe unbegrenzte Varietät an Antigenen spezifisch zu

erkennen. Dieser enormen Vielfalt an Antikörper/Antigen Paaren steht eine verblüffend

geringe Varianz in der Struktur von Antikörpern entgegen. Die variablen, Antigenkontakt

vermittelnden Regionen eines Antikörpers setzen sich aus einer stark konservierten,

strukturgebenden β-Faltblattdomäne und den hypervariablen, antigenbindenden Schleifen

(CDR), die eine große Sequenzvariabilität aufweisen zusammen, wobei die CDRs die

Antigenkontaktfläche ausbilden (Davies, Padlan et al. 1990; Padlan 1994). Kabat und

Kollegen fanden durch einen Vergleich der Sequenzen mehrerer hypervariabler Schleifen

heraus, dass 13 Positionen innerhalb der leichten Kette und sieben Positionen innerhalb der

schweren Kette der hypervariablen Schleifen konserviert sind und folgerten, dass diese

Aminosäuren strukturgebende und keine Spezifität vermittelnde Funktionen erfüllen (Kabat,

Wu et al. 1977; Kabat 1978). Andere Gruppen konnten außerdem zeigen, dass in vielen

CDRs eine Korrelation zwischen der Anzahl der Aminosäuren in einer hypervariablen

Schleife und deren Konformation unabhängig von der Identität der Aminosäuren besteht

(Fehlhammer, Schiffer et al. 1975; Padlan und Davies 1975; Padlan 1977; Padlan 1977;

Padlan, Davies et al. 1977; de la Paz, Sutton et al. 1986). Chothia et al. unterteilten auf

diesen Arbeiten basierend die hypervariablen Schleifen in „Canonische Klassen“ ein

(Chothia und Lesk 1987). Diesem Modell folgend wird eine CDR in Abhängigkeit der Länge

und einiger Schlüsselpositionen in eine der kanonischen Klassen mit übereinstimmender

Konformation des Peptidrückgrats eingeteilt. Die übrigen Aminosäuren der CDR

determinieren die Spezifität zum Antigen und weisen eine hohe Variabilität auf. Die CDR H3

der schweren Kette ließ sich dagegen nicht in kanonische Klassen unterteilen, da sich die

Längenvarianz und die Sequenzvariabilität sehr ausgeprägt darstellten und somit keine

Strukturzuordnung möglich war. In vielen Strukturen wurde aber die bedeutende Rolle der

Ergebnisse

63

CDR H3 bei der Antigenbindung deutlich, da die häufigsten Kontakte von dieser CDR

vermittelt wurden (MacCallum, Martin et al. 1996).

Den semi-rationalen Ansatz zur Ableitung eines EGF-R spezifischen Peptides ergänzend

sollten in einem rationalen Ansatz die hypervariablen, antigenbindenden Schleifen (CDR)

des mAk 425 direkt als spezifisch bindende Peptide abgeleitet werden.

Die CDR H3 der schweren Kette wurde zunächst für die Klonierung an das CAT Enzym

ausgewählt, da diese CDRs häufig den größten Beitrag an der Interaktion mit dem Antigen

leisten (Mariuzza, Phillips, 1987; MacCallum, Martin, 1996). Zudem wurde bereits ein

Peptidomimetikum (AHNP) aus den CDR H3 Schleifen zweier anti-ErbB2 Antikörper, dem

mAk 7.16.4 und Herceptin erfolgreich abgeleitet (Park, Zhang, 2000). Aufgrund dieser Daten

erschien die CDR H3 des mAK 425 als aussichtsreicher Kandidat.

Ein Teilprojekt dieses Ansatzes bestand in der Entwicklung und Klonierung eines flexiblen,

modularen Vektorsystems, welches die zielgerichtete Kombinatorik beliebiger CDR-

kodierender Sequenzen an die 5´ und 3´-Enden des cat-Gens erlauben sollte.

5.1.2 Ergebnisse

5.1.3 Das „CDR-Shuffling“ Vektorsystem

Zielsetzung war die Entwicklung eines modularen Vektorsystems, mit dessen Hilfe die

effiziente und zielgerichtete Klonierung linear verketteter CDRs in beliebigen, gewünschten

Kombinationen ermöglicht werden sollte. Zu selbigem Zwecke wurden sechs

Ausgangsvektoren kloniert, die jeweils für eine CDR kodieren. Die Sequenz der jeweils drei

CDRs aus der schweren und der leichten Kette wurden aus dem mAK 425 abgeleitet.

Die CDR kodierenden Sequenzen wurden als komplementäre Oligonukleotide mit

passenden Überhängen synthetisiert (Dr. Igloi), hybridisiert, kinasiert und in den NheI und

SpeI geöffneten Grundvektor (pKMEf_B_O_S) kloniert. Die CDR Sequenz wird von zwei

Restriktionsschnittstellen mit kompatiblen Überhängen flankiert (NheI 5´ und SpeI 3´ zur

CDR), wobei der NheI Restriktionsschnittstelle noch eine BspHI Sequenz vorangestellt voran

gestellt wurde.

Die Wahl der Restriktionsschnittstellen erlaubt nun eine zielgerichtete Insertion einer CDR Y,

die über die Schnittstellen BspHI und SpeI aus dem Vektor isoliert wurde, 5´ vor eine zweite

CDR X in korrekter Orientierung in den BspHI und NheI geöffneten CDR X kodierenden

Vektor, da NheI und SpeI kompatible Überhänge aufweisen (Abbildung 39, A.). Der

Ergebnisse

64

resultierende Vektor kodiert für zwei linear verknüpfte CDRs, wobei die

Restriktionsschnittstellen an den 5´ und 3´-Termini rekonstituiert wurden, sodass die

Insertion weiterer CDRs möglich ist.

Analog zur Insertion einer CDR 5´ zur CDR X kann verfahren werden, um eine CDR 3´-

terminal einzufügen, dabei wird eine CDR Z über die Restriktionsschnittstellen NheI und

EcoRI aus dem Donorvektor isoliert und in den SpeI und EcoRI geöffneten

Rezipientenvektor, der für die CDR X kodiert, kloniert (Abbildung 39, B.).

Ergebnisse

65

A.

B.

Abbildung 39.) Schematische Darstellung des Vektorsystems zur zielgerichteten Kombination beliebiger CDR codierender Sequenzen zu einer linearen Peptidkette. A. Eine weitere CDR kodierende Seqenz wird in korrekter Orientierung 5´ vor die vorhandene CDR eingefügt. B. Analoges vorgehen, um eine CDR zielgerichtet am 3´ Ende einzufügen.

Ergebnisse

66

5.1.4 Klonierung, Reinigung und Interaktionsstudien des H3-CAT-H3 Konstrukts

Klonierung, rekombinante Expression und Reinigung:

Das Plasmid pIB30_CAT-li fungierte wie schon für das S-CAT-S Konstrukt als

Rezipientenvektor. In zwei Schritten wurden zunächst das H3-CAT und anschließend das

H3-CAT-H3 Fusionsprotein kloniert. Komplementäre, für die CDR H3 (RDYDYDGRYFDY)

kodierende Oligomere (oligo_shuffle_H3_U & oligo_shuffle_H3_L) mit NheI und SpeI

kompatiblen Überhängen wurden hybridisiert und

kinasiert. Im ersten Schritt wurden die CDR H3

kodierende Oligomere in den NheI geöffneten

Vektor kloniert, sodass die Sequenz im

Leseraster 5´ zum CAT-li Gen inseriert wurde

(pIB30_H3_CAT_li_#6). Dieser mit SpeI geöffnete

Vektor diente wiederum als Rezipient für die

Insertion der CDR H3 am 3´ Ende. Der finale

Vektor (pIB30_H3_CAT_H3_#8) kodierte somit

für ein N- und C-terminal mit der CDR H3

Sequenz via Glycin-Serin-Linker dekoriertes CAT

Enzym, welches H3-CAT-H3 benannt wurde.

Das H3-CAT-H3 Fusionsenzym wurde in E. coli

RV308 exprimiert. Zellen wurden durch

Ultraschallbehandlung aufgebrochen und das

Fusionsprotein mittels Affinitätschromatographie

aus dem Zellextrakt isoliert. An die

Affinitätschromatographie wurden je nach

Verwendungszweck eine Dialyse oder Gelfiltration

(für BIAcore Messungen) zur Abtrennung von

Chloramphenicol und Überführung in die jeweiligen Puffer angeschlossen. Das H3-CAT-H3

Fusionsenzym konnte durch eine Einschritt-Affinitätschromatographie bereits zu hoher

Reinheit isoliert werden (Abbildung 40).

Abbildung 40) 12.5 % SDS-PAGE Analyse des H3-CAT-H3 Konstrukts. Mittels Coomassie Färbung wurden die Proteinbanden visualisiert. Proteinbande lief auf der erwarteten Höhe von 31 kDa.

Ergebnisse

67

5.1.4.1 ELISA basierter Test auf CDR H3 vermittelte Bindung des H3-CAT-H3 an immobilisierten sEGF-R

Mittels ELISA wurde auf eine potentielle Interaktion des H3-CAT-H3 Konstrukts mit

immobilisiertem sEGF-R getestet. Als Negativkontrolle wurden der primäre und sekundäre

Antikörper ohne CAT Konstrukte auf dem sEGF-R inkubiert. CAT-li Konstrukt, welches die

Linkersequenzen an N- und C-Terminus präsentiert, wurde als weitere Kontrolle mitgeführt.

Das Signal des H3-CAT-H3 Konstrukts zeigte keinen signifikanten Unterschied zur CAT-li

Kontrolle (0.3 bzw. 0.31 Abs. @ 405 nm) (Abbildung 41). Für das H3-CAT-H3 Konstrukt

konnte somit keine Bindung auf immobilisiertem sEGF-R nachgewiesen werden. Das

Hintergrundsignal des CAT-li Konstrukts war im Vergleich zur Antikörperkontrolle gering

(0.07 Absorptionseinheiten Differenz). Das S-CAT-S Signal war mit einer Absorption von

0.79 2.4-fach höher als das CAT-li Signal.

Abbildung 41) ELISA basierter Test auf H3-CAT-H3 Interaktion mit immobilisiertem sEGF-R. H3-CAT-H3 Signal war nicht höher als des Signal der Negativkontrolle CAT-li. Für das H3-CAT-H3 konnte keine Bindung mittels ELISA nachgewiesen werden. Das Hintergrundsignal des CAT-li Konstrukts war gering im Vergleich zur Antikörperkontrolle (%). Das zum Vergleich mitgeführte S-CAT-S Konstrukt zeigte deutliche Bindung.

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0.8

0.9

H3-C A T-H3 C at-li % S-C A T -S

Abs. @

405 n

m

Ergebnisse

68

5.1.4.2 Untersuchung auf zelluläre Lokalisierung des H3-CAT-H3 mittels konfokaler Immunfluoreszenz

Mithilfe der Immunfluoreszenz sollte auf Bindung sowie die membranständige Lokalisation

des H3-CAT-H3 Konstrukts auf A431 Zellen getestet werden. Als Positivkontrolle diente das

scFv 425-Bla Konstrukt, welches eine scharfe, membranständige Färbung auf A431 Zellen

zeigte. Deutlich waren die Färbung der strahlenartigen Zellfortsätze, sowie die flächige

Färbung der flachen, breiten Zellfortsätze zu erkennen (Abbildung 42, A.). Wie auch bei

zellulären ELISA Experimenten, zeigte das CATwt Enzym wiederum ein deutliches

Hintergrundsignal (Abbildung 42., A.) Das H3-CAT-H3 Konstrukt zeigte ebenfalls ein

membranständiges Signal, was jedoch nicht stärker als das der CATwt Kontrolle ausfiel und

darüber hinaus nicht durch den scFv 425-Bla kompetitierbar war (Abbildung 42, C.), was auf

eine unspezifische, allein durch das CAT-Gerüstprotein vermittelte, Interaktion hinweist. Da

das Peptid des H3-CAT-H3 Konstrukts der CDR H3 des scFv 425 entspricht, sollte man von

einer Verdrängung durch den scFv 425-Bla ausgehen können.

A. B. C.

Abbildung 42.) Konfokale Immunfluoreszenz an A431 Zellen. Das H3-CAT-H3 Konstrukt wurde zum Test auf membranständige Lokalisation auf A431 Zellen inkubiert. A. scFv 425-Bla wurde als Postivikontrolle für die membranständige Lokalisation des Fluoreszenzsignals eingesetzt. B. Die CATwt Negativkontrolle zeigte ein deutliches Hintergrundsignal. C. Die Fluoreszenz des H3-CAT-H3 Konstrukts war zwar membranständig, jedoch in der Intensität nicht stärker als die CATwt Negativkontrolle und zudem nicht durch den scFv 425-Bla inhibierbar.

Ergebnisse

69

5.1.4.3 Biacore

Als alternative Methode zum ELISA wurde mittels Oberflächenplasmonresonanz versucht

eine mögliche Interaktion zwischen dem sEGF-R und dem H3-CAT-H3 nachzuweisen. Es

wurden 3862 RU Rezeptor auf die Oberfläche eines CM-5 Sensorchips gekoppelt, eine

weitere Flusszelle wurde inaktiviert und diente als Referenzflusszelle. Das H3-CAT-H3

Konstrukt wurde seriell mit ansteigenden Konzentrationen (2.45 µM, 4.9 µM, 9.8 µM) bei

einer Flussrate von 30 µl/min über die Sensoroberfläche geführt, wobei die Proben zunächst

über die Referenzflusszelle und anschließend über die sEGF-R gekoppelte Flusszelle

geleitet wurden.

A. B.

Nach Abzug des Signals der Referenzflusszelle von dem Signal der sEGF-R gekoppelten

Flusszelle konnten keine Bindungskurven für die Bestimmung der kinetischen Parameter

erhalten werden (Abbildung 43). Die Signalspitzen zu Beginn und Ende jeder Injektion waren

auf die geringe Datenerfassungsrate zurückzuführen. Die Darstellung der einzelnen

Bindungskurven auf sEGF-R gekoppelter und Referenzflusszelle machte deutlich, dass

keine konzentrationsabhängige Bindungskurve zu erhalten war (Abbildung 44). Unter den

getesteten Bedingungen ließ sich mittels Oberflächenplasmonresonanz keine Interaktion

zwischen dem sEGF-R und H3-CAT-H3 nachweisen.

21000

22000

23000

24000

25000

26000

200 300 400 500 600

RU

Zeit [s]

3520

3530

3540

3550

3560

3570

3580

200 300 400 500 600

RU

Zeit [s]

Abbildung 43) A. Sensogramm des H3-CAT-H3 Konstrukts auf sEGF-R gekoppelter Flusszelle (rote Linie) und Referenzflusszelle (blaue Linie) Kurvenaussschlag war auf beiden Flusszellen praktisch identisch. B. Sensogramm des H3-CAT-H3 Konstrukts auf sEGF-R gekoppelter Oberfläche nach Abzug des Signals der Referenzflusszelle. Es konnten keine konzentrationsabhängingen Bindungskurven festgestellt werden. Das Konstrukt wurde mit steigenden Konzentrationen (2.45 µM, 4.9 µM, 9.8 µM) bei einer Flussrate von 30 µl/min seriell injiziert.

Ergebnisse

70

Abbildung 44.) Überlagerte Sensogramme des H3-CAT-H3 Konstrukts in ansteigenden Konzentrationen auf sEGF-R und Kontrollflusszelle. Nach Abzug der Referenzflusszelle (gestrichelte Linien) konnte kein Bindungssignal erhalten werden.

5.1.5 Diskussion

Das aus der CDR H3 abgeleitete Peptid vermochte weder in ELISA Experimenten, noch in

konfokalen Immunfluoreszenzanalysen, noch in BIAcore Experimenten eine Bindung des

CAT Enzyms an den sEGF-R bzw. an A431 Zellen zu vermitteln. Bemerkenswerterweise war

das Bindungssignal des H3-CAT-H3 Fusionsproteins konstant niedriger als das wechselnd

hohe Hintergrundsignal des CATwt Enzyms, was auf eine Bedeutung der Termini für das

unspezifische Hintergrundsignal hinweist. Aus den Resultaten ließen sich zwei mögliche

Erklärungsansätze ableiten. Einerseits könnte die Affinität des H3 Peptids zu gering sein, um

eine Bindung des Fusionsprotein H3-CAT-H3 an den EGF-R zu vermitteln. Andererseits

könnte die Affinität des H3 Peptids ausreichend sein, würde jedoch durch Rückbindung an

das CAT-Enzym, bedingt durch die Hyrdophobizität des Peptids, an einer Interaktion mit dem

EGF-R gehindert, wobei gleichzeitig Bereiche des CAT Enzyms, die für die unspezifische

Bindung verantwortlich sind abgeschirmt würden. Ein solches Modell könnte erklären, dass

keine Bindung beobachtet werden konnte und gleichzeitig der unspezifische Hintergrund

konstant unter dem Niveau des CATwt Enzyms lag.

Ergebnisse

71

5.2 Der EGF-R Dimerisierungsarm als Inhibitor

5.2.1 Einleitung

Die Liganden induzierte Dimerisierung aller ErbB Familienmitglieder erfolgt im Gegensatz zu

vielen anderen Rezeptor-Tyrosin-Kinasen gänzlich Rezeptor vermittelt (Burgess, Cho et al.

2003). Maßgeblich an den inter-Rezeptor Interaktionen ist dabei die von Ogiso et al. als

Dimerisierungsarm bezeichnete Schleife der Domäne II beteiligt. Dieser Dimerisierungsarm

umfasst die AS 242 bis 259 (PDB ID: 1IVO) und ragt charakteristisch aus der Struktur

hervor. Im aktiven Rezeptordimer interagiert dabei der Dimerisierungsarm der Domäne II

eines Rezeptors mit der Domäne II des anderen Rezeptors. Diese inter-Domäne II

Interaktion wird einerseits durch hydrophobe Wechselwirkungen der AS Y246, P248 und

Y251 des Dimerisierungsarms mit den AS F230*, F263*, A265*, Y275* und R285* der

Domäne II des Interaktionspartners vermittelt, zum anderen sind Wasserstoffbrücken

A.

B.

Abbildung 45.) A. Darstellung der Wasserstoffbrücken und hydrophoben Interaktionen zwischen dem Dimerisierungsarm eines aktiven Rezeptors mit der Domäne II eines aktiven Rezeptor Partners (aus Ogiso et al. 2002). B. Gleiche Darstellung aus verändertem Blickwinkel

Ergebnisse

72

zwischen den Resten Y251•R285*, Q252•A286* und Y246•C283* beteiligt (Abbildung 45).

Die zentrale Bedeutung der AS R285, Y251 und F263 für die Rezeptordimerisierung konnte

durch Aminosäureaustausche (R285S, Y251S, F263A) gezeigt werden. Die

Kombination des R285S Austausches mit entweder dem Y251A oder dem F263A

Austausch führte zu einem fast vollständigen Verlust der Rezeptoraktivität bezüglich der

Rezeptor- und Erk-Phosphorylierung (Ogiso, Ishitani et al. 2002).

Kristallstrukturen des inaktiven EGF-R (Ferguson, Berger et al. 2003) und des nicht

Liganden gebundenen ErbB3 (Cho, Mason et al. 2003) zeigen den Dimerisierungsarm in

einer weiteren für die EGF-R Biologie wichtigen Interaktion. In diesen Strukturen interagiert

der Dimerisierungsarm intra-molekular mit Resten der Domäne IV, wodurch der

Dimerisierungsarm unzugänglich für einen aktiven Dimerisierungspartner verborgen wird.

Die relative Anordnung der Domänen I und II zueinander ist nahezu identisch in der inaktiven

und der aktiven Konformation, die relative Anordnung der Domänen I und III zueinander

unterscheidet sich zwischen beiden Strukturen aber deutlich. Die Distanz der Domänen

unterbindet dabei eine gleichzeitige Interaktion des EGF mit den Domänen I und III in der

inaktiven Konformation.

Diese zentrale Bedeutung des Dimerisierungsarms sowohl in der aktiven, als auch in der

inaktiven Konformation sollte sich als Ansatz zur Entwicklung eines inhibitorischen Peptids

nutzen lassen. Wie bereits für Peptidomimetika der Domäne IV des ErbB2 Rezeptors (Park,

Zhang et al. 2000) gezeigt, sollte ein Peptid abgeleitet werden, das die Dimerisierung zwei

Abbildung 46.) „Stick“ Darstellung des aus dem Dimerisierungsarm abgeleiteten Peptids (EGFR-DA). Wasserstoffbrücken wurden als gestrichelte Linien mit Distanzen [Å] dargestellt. Seitenketten wurden aus Gründen der Übersicht nicht dargestellt (MacPyMOL).

Ergebnisse

73

aktiver EGF-Rezeptoren nach Liganden induzierter Umlagerung in diesem speziellen Fall

durch Blockierung des Dimerisierungsarms verhindern sollte.

Aus der Struktur des aktiven EGF-R Dimers (PDB ID: 1IVO) wurde die Sequenz

MLYNPTTQMDV als Peptid abgeleitet und EGFR-DA benannt (Abbildung 46). Die

Aminosäuren wurden so ausgewählt, dass N- und C-Terminus in entgegengesetzte

Richtungen weisen, um Modifikationen an den Termini zu ermöglichen, ohne die Struktur des

Peptids zu stören. Aufgrund des Prolin induzierten Knicks in der Peptidsequenz und der

ausgeprägten intramolekularen Wasserstoffbrücken sollte das Peptid in Lösung die

dargestellte Konformation annehmen können.

Das EGFR-DA Peptid wurde in zwei Versionen bestellt, zum einen ohne weitere Modifikation

und zum anderen als biotinylierte Variante, um das Peptid entsprechend auf potentiell

inhibierende Wirkung auf A431 Zellen, bzw. eine mögliche Peptid vermittelte Lokalisation

eines Streptavidin : Peptid Komplexes an den EGF-R zu testen, was wiederum durch einen

potentiellen Aviditätseffekt, bedingt durch die tetravalente Präsentation auf dem

Streptavidinkomplex, begünstigt werden sollte.

5.2.2 Ergebnisse

5.2.2.1 Reinigung des biotinylierten EGF-R DA Peptids und anschließende Dekoration des Streptavidin zur Generierung eines Streptavidin : EGF-R DA Targetingkomplexes

Das EGF-R DA Peptid wurde von der Firma Peptidesynthetics zunächst in einer Variante

bestellt, die einen kurzen Glycinlinker zwischen dem N-terminalen Biotin und der

Peptidsequenz enthielt. Das Peptid wurde in H2O rekonstituiert, war jedoch sehr schwer

löslich und wurde nachfolgend zuerst in Azetonitril (ACN) gelöst und anschließend mit H2O

auf 30% ACN eingestellt. Mit einer kleinen Menge des rekonstituierten Peptids wurde ein

erster analytischer Lauf mit einer Reversed Phase HPLC durchgeführt, die einen

charakteristischen Doppelpeak zeigte. Eine Probe des zweiten Peaks wurde zur

Überprüfung massenspektrometrisch untersucht und lieferte ein korrektes Molekulargewicht.

Mit der verbliebenen Probe wurde daraufhin ein präparativer Lauf an der Reversed Phase

HPLC durchgeführt, der jedoch nicht mehr den charakteristischen Doppelpeak zeigte. Nach

weiteren erfolglosen Versuchen wurde eine Probe erneut massenspektrometrisch

untersucht, wobei sich herausstellte, dass das Peptid degradiert war. Untersuchungen

Ergebnisse

74

seitens des Herstellers zeigten eine vollständige Degradation des Peptids innerhalb weniger

Stunden.

Die finale Version des biotinylierten EGF-R DA Peptids enthielt als alternativen Linker eine

Aminohexansäure zwischen Biotin und Peptidsequenz und wies laut Hersteller eine

Halbwertzeit von ca 72 h auf.

Für Bindungsstudien am BIAcore wurde das Peptid zunächst über die Reversed Phase

HPLC gereinigt, anschließend bei 42-fachem Überschuss 1 h bei 4°C mit Streptavidin

inkubiert, um die Bildung eines Streptavidin : EGF-R DA Komplexes zu ermöglichen. Der

gebildete Komplex wurde über eine Gelfiltrationssäule (Superdex 200) von ungebundenen

Peptiden gereinigt, welche sonst bei Bindungsstudien als Kompetitoren wirken würden. Die

Fraktionen 26 – 30 wurden vereinigt und auf 7 µM konzentriert.

Abbildung 47.) Gelfiltration des Streptavidin : EGF-R DA Komplexes mittels Superdex 200 Säule. Fraktionen 26 – 30 wurden vereinigt und konzentriert. Bei den Fraktionen 37 – 39 handelt es sich vermutlich um überschüssiges Peptid.

Ergebnisse

75

5.2.2.2 Oberflächenplasmonresonanz basierter Test auf EGFR-DA vermittelte Bindung an den sEGF-R

Der biotinylierte Dimerisierungsarm (EGFR-DA) wurde für BIAcore Experimente aus

Gründen der leichteren Detektion mit Streptavidin komplexiert, sodass ein Konstrukt mit

einem Molekulargewicht von ca. 58 kDa entstand. Da das Signal der Bindung proportional

zur Masse ist, können sehr kleine Peptide nur mit Schwierigkeiten detektiert werden. Der

Komplex aus EGFR-DA Peptid und Streptavidin wurde bei 7 µM Konzentration injiziert. Das

Signal der sEGF-R belegten Oberfläche zeigte im Maximum 4 RU Differenz zur

Referenzflusszelle (Abbildung 48). Bei einem Größenverhältnis von ca. 1:2 wäre selbst unter

Annahme einer Stöchiometrie von 2 Rezeptormolekülen zu einem Streptavidin-Komplex

noch ein Signal von ca. 836 RU zu erwarten gewesen. Aufgrund der Größe des Komplexes

von 58 kDa konnte bei einem Signal von 4 RU nicht von einer Bindung ausgegangen

werden. Die Funktionalität der sEGF-R Oberfläche konnte durch den natürlichen Liganden

EGF überprüft werden, der ein Signal von 150 RU auf der gekoppelten Oberfläche zeigte,

was 81% aktivem sEGF-R entsprach (Abbildung 23). Auf die Messung einer

Verdünnungsreihe, die erforderlich ist, um eindeutige Aussagen über Spezifität der Bindung

und die kinetischen Parameter der Bindung zu treffen zu können, wurde verzichtet, da schon

bei einer Konzentration von 7 µM keine Bindungskurve erhalten werden konnte.

A. B.

Abbildung 48.) Der EGFR-DA/Streptavidin Komplex zeigte auf sEGF-R gekoppelter Oberfläche kein Bindungssignal am BIAcore Instrument. A. Normalisierte Signale des Strep:EGFR-DA Komplexes auf Referenz und sEGF-R gekoppelter FZ. Rot = Referenzflusszelle, schwarz = sEGF-R gekoppelte FZ. B. Nach Abzug des Signals der Referenzflusszelle verblieben 4 RU, wobei die Kurve in den negativen Bereich abfiel.

-40

-20

0

20

40

60

80

0 50 100 150

RU

Zeit [s]

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 50 100 150

RU

Zeit [s]

Ergebnisse

76

Ferner wurde das unmodifizierte EGFR-DA Peptid bei 273 µM Konzentration getestet. Nach

Abzug der Referenzflusszelle verblieb ein residuales Signal von 6 RU. Unter der Annahme

einer 1:1 Stöchiometrie der Bindung wäre bei einem Größenverhältnis von 1:77 (sEGF-R :

115 kDa, EGFR-DA : 1.5 kDa) ein Signal von maximal 45 RU zu erwarten gewesen. Das

gemessene Signal von 6 RU ließe sich unter der Annahme von ca. 13 % aktivem

(bindungskompetenten) Rezeptor erklären. Da die Messung aber auf derselben Oberfläche

mit 81%iger Aktivität durchgeführt wurde, wie auch schon der EGFR-DA Streptavidin

A.

B.

Abbildung 49.) A. Sensogramm des EGFR-DA Peptids auf sEGF-R gekoppelter (rote Kurve) und Referenzflusszelle (blaue Kurve). Werte beider Flusszellen wurden jeweils auf Referenzlinie normalisiert. B. Differenz zwischen sEGF-R gekoppelter und Referenzflusszelle ergab ein Signal von 6 RU. Bei 100 % bindungskompetentem Rezeptor wären maximal 50 RU zu erwarten gewesen.

-20

0

20

40

60

80

100

200 210 220 230 240 250 260

RU

Zeit [s]

-40

-20

0

20

40

200 210 220 230 240 250 260

RU

Zeit [s]

Ergebnisse

77

Komplex, scheidet diese Möglichkeit aus. Weitere Messungen mit ansteigenden

Konzentrationen hätten Aufschluss über eine Mögliche Bindung und kinetische Parameter

liefern können, konnten jedoch aufgrund der schlechten Löslichkeit nicht durchgeführt

werden. Zusammen mit dem Ergebnis des EGFR-DA : Streptavidin Komplexes konnte daher

nicht von einer eindeutigen Bindung des EGFR-DA Peptids an den sEGF-R ausgegangen

werden.

5.2.2.3 FACS basierter Test auf EGFR-DA vermittelte Lokalisierung von EGFR-DA : NeutrAvidin Oregon Green 488 Komplexen auf A431 Zellen

Mithilfe der Durchflusszytometrie wurde eine peptidvermittelte Bindung des NeutrAvidin

Oregon Green 448 : EGFR-DA Konstrukts an A431 Zellen untersucht. Als Negativkontrolle

wurde NeutrAvidin Oregon Green 488 mit Biotin, als Positivkontrolle dagegen mit

biotinyliertem EGF dekoriert. Die Negativkontrolle zeigte ein sehr geringes Hintergrundsignal,

welches von ungefärbten Zellen kaum zu unterscheiden war (Abbildung 50). Wie aufgrund der

Vorversuche zu erwarten war, zeigte das EGF dekorierte NeutrAvidin Oregon Green 488 auf

A431 Zellen eine sehr deutliche Fluoreszenz (Abbildung 50, zweites Diagramm v.l.), womit

sich die Handhabung der Zellen bei der Vereinzelung und die Färbeprozedur als sehr

konsistent herausstellte. Jedoch gelang es nicht für das EGFR-DA dekorierte Konstrukt eine

Fluoreszenz nachzuweisen. Eine Überlagerung der Fluoreszenzsignale der Biotin-Kontrolle

und des EGFR-DA Komplexes zeigte keine Differenz (Abbildung 50, erstes Diagramm v.r.).

Abbildung 50.) FACS Analyse der EGF-R DA vermittelten Bindung des NeutrAvidin Oregon Green 488 : EGFR-DA Komplexes an A431 Zellen. A431 Zellen wurden vereinzelt, gewaschen und 30´ bei 4°C inkubiert. Ungebundene Komplexe wurden durch zwei Waschschritte entfernt. Die Negativkontrolle (NeutrAvidin 488 + Biotin) zeigte kein Hintergrundsignal, die Positivkontrolle (NeutrAvidin 488 + EGF) zeigte eine deutliche Fluoreszenz. Für den EGFR-DA konnte kein Fluoreszenzsignal nachgewiesen werden. Eine Überlagerung der Negativkontrolle und des EGFR-DA zeigte, dass beide Signale nahezu identisch waren. Die Skalierung des NeutrAvidin 488 + EGF Diagramms unterscheidet sich von den übrigen Diagrammen.

Ergebnisse

78

5.2.2.4 EGFR-DA vermittelte Inhibition des Wundverschlusses bei A431 Zellen

Der EGFR-DA sollte konzeptionell primär als Inhibitor der Rezeptoraktivierung dienen, die

zelluläre Signalkaskaden initiiert, die wiederum Proliferation, Anti-Apoptose und Migration

stimulieren. Diese Parameter lassen sich in Wundheilungsexperimenten abgreifen, da bei

einer Aktivierung der Zellen ein beschleunigter Wundverschluss des verletzten Zellrasens

beobachtet werden kann. Für Wundheilungsexperimente wurde das EGFR-DA Peptid ohne

Modifikationen eingesetzt (Peptidsequenz: MLYNPTTYQMDV). A431 Zellen wurden in 6-

Lochplatten bis zum Erreichen der Konfluenz in Vollmedium kultiviert und anschließend für

24 h in Minimalmedium überführt, um die Zellen von jeglichen Wachstumsfaktoren zu

depletieren. Unter Zuhilfenahme einer 1000 µl Pipettenspitze wurde eine strichförmige

Läsion in den konfluenten Zellrasen eingeführt und abgelöste Zellen anschließend durch

intensives waschen mit Minimalmedium entfernt. Die Zellen wurden sodann mit den in

Minimalmedium formulierten Peptiden inkubiert. Die Dokumentation der Wundschließung

erfolge durchlichtmikroskopisch sofort und nach 45 h (Abbildung 51, A.). Die zellfreie Fläche

wurde im Programm ImageJ unter Verwendung eines Makros in Pixel gemessen. Aus der

Differenz der jeweiligen zellfreien Fläche nach 45 h und 0 h wurde die neu besiedelte Fläche

nach Stimulation als Maß der Zellaktivierung kalkuliert. Wie zu erwarten zeigten EGF

stimulierte Zellen mit einem Wundverschluss von 193528 Pixeln die stärkste Aktivierung

(Abbildung 51, B.). Aufgrund der intrinsischen, EGF unabhängigen Proliferation von A431

Zellen war bei der Mediumkontrolle ein Wundverschluss von 118980 Pixeln zu beobachten,

was 61.5 % der Fläche EGF stimulierter Zellen entsprach. Der EGFR-DA induzierte mit

58364 Pixeln den geringsten Wundverschluss, was 30 % der Fläche EGF induzierter Zellen

entsprach und gleichzeitig um den Faktor 2 geringer war als die Mediumkontrolle. Bei

Koinkubation von EGFR-DA und EGF konnte ein um 54779 Pixel geringerer

Wundverschluss verglichen mit dem EGF induzierten Wundverschluss beobachtet werden,

was einer Inhibition um 28.3 % entsprach. Der absolute Wert des Wundverschlusses lag mit

138749 Pixeln nahe an der Mediumkontrolle und übertraf diese nur um 19769 Pixel.

Ergebnisse

79

A.

B.

Abbildung 51.) Wundheilungsexperiment an konfluenten A431 Zellen. A. Mittels 1000 µl Pipettenspitze wurde eine Läsion in den Zellrasen eingeführt. Peptide wurden in angegebenen Konzentrationen in Minimalmedium formuliert zu den Zellen gegeben. Zellfreie Fläche wurde sofort und 45 h nach Stimulation unter Verwendung des Programms ImageJ analysiert. B. Differenz der zellfreien Fläche wurde als Maß für die Aktivierung gewertet. Stärkster Wundverschluss mit 193528 Pixel war bei EGF inkubierten Zellen zu sehen. Die Mediumkontrolle zeigte einen auf 60 % reduzierten Wundverschluss verglichen mit EGF behandelten Zellen. Durch Koinkubation von EGF mit dem EGFR-DA konnte die stimulierende Wirkung des EGF deutlich reduziert werden und betrug nur 10.2 % mehr als die Mediumkontrolle. Das EGFR-DA Peptid alleine reduzierte den Wundverschluss auf 30 % des Wertes für EGF.

193528

58364

138749118980

0

50000

100000

150000

200000

EGF EGFR-DA EGFR-DA + EGF Mediumkontrolle

Wu

nd

vers

ch

luss [

Pix

el]

Ergebnisse

80

5.2.3 Diskussion

Das Streptavidin : Dimerisierungsarm Konstrukt wurde mittels Oberflächenplasmonresonanz

auf Interaktion mit dem EGF-R getestet. Es konnte jedoch bei steigenden Konzentrationen

von 1.75 µM bis 7 µM keine Interaktion mit dem sEGF-R festgestellt werden. Bei einem

Molekulargewicht von ca 58 kDa für das Streptavidin Konstrukt sollte eine größenbedingte

Nachweislimitierung ausgeschlossen werden können, da unter der Annahme einer 1:1

Stöchiometrie des EGF-R zu Konstrukt Bindungsverhältnisses bei 3495.2 RU gekoppeltem

Rezeptor ein Signal von 1672 RU zu erwarten gewesen wäre. Das maximale Signal von 4

RU, welches zudem keinen charakteristischen Bindungsverlauf zeigte, war nicht indikativ für

eine peptidvermittelte Bindung.

Zusätzlich wurde das unmodifizierte EGFR-DA Peptid bei hoher Konzentration gemessen

(273 µM), um die Möglichkeit eines negativen Einflusses des Streptavidin auf die Faltung

des biotinylierten Peptids als Ursache für die nicht nachweisbare Bindung auszuschließen.

Das gemessene Signal von 6 RU entsprach jedoch ebenfalls nicht dem zu erwartenden Wert

von ca. 45 RU. Diese Messung kann jedoch durch das ungünstige Größenverhältnis von

gekoppeltem Rezeptor (115 kDa) zu Peptid (1.5 kDa) bedingt nicht als eindeutig negativ

gewertet werden. Abhilfe hätte hier ein reverser Ansatz schaffen können, bei dem das Peptid

auf eine Streptavidin Oberfläche gekoppelt wird und der lösliche EGF-R gemessen wird.

Aufgrund eingeschränkter sEGF-R Resourcen konnte dieses Experiment jedoch zum

damaligen Zeitpunkt nicht durchgeführt werden.

Mittels BIAcore Experimenten konnten keine eindeutige Bindung des EGFR-DA Peptids

nachgewiesen werden.

Als zellbasierte Methode zum Nachweis einer Interaktion mit dem EGF-R wurde die

Durchflusszytometrie angewandt. Für den EGFR-DA:NeutrAvidin488 Komplex konnte keine

Bindung an A431 Zellen festgestellt werden, während für die Positivkontrolle

EGF:NeutrAvidin488 ein sehr starkes Fluoreszenzsignal zu verzeichnen war. Die niedrige

Inkubationstemperatur von 4°C könnte sich nachteilig auf eine Bindung auswirken, wurde

aber gewählt, um eine Internalisierung des Komplexes auf den unfixierten Zellen zu

vermeiden. Gleichwohl konnte bei den Messungen am BIAcore bei 20°C ebenfalls keine

Bindung festgestellt werden, sodass dieser Einfluss der Temperatur nicht plausibel erschien.

Die Wirkung des EGFR-DA auf zentrale zelluläre Prozesse, wie Proliferation,

Migration und Anti-Apoptose wurde in einem Wundheilungsexperiment getestet. Der EGF-R

DA könnte eine leicht inhibierende Wirkung auf A431 Zellen ausüben, was sich in einer

Wundschließung äußerte, die sogar um den Faktor 2 unter der Mediumkontrolle lag

(Abbildung 51). Bei Ko-Inkubation von EGFR-DA und EGF resultierte in einer deutlich

verminderten Aktivierung der Zellen verglichen mit EGF behandelten Zellen um 28% auf

Ergebnisse

81

etwa das Niveau der Mediumkontrolle entsprach. Die Wirkung des Dimerisierungsarms

könnte daher bei EGF induzierter Umlagerung und daraus resultierender Exponierung des

DA eintreten. Der aktivierte Rezeptor mit exponiertem, bindungskompetenten

Dimerisierungsarm könnte nach nun erfolgender Bindung des EGFR-DA Peptids nicht mehr

mit einem zweiten aktiven Rezeptor interagieren, wodurch die EGF induzierte Proliferation

unterdrückt würde. Ein solches Modell unterstützend konnte bei Koinkubation von EGF und

EGFR-DA (10-facher Überschuss an EGFR-DA) die aktivierende Wirkung des EGF etwa auf

das Maß der intrinsischen Proliferationsrate reduziert werden. Ein Effekt des EGFR-DA

würde folglich nur bei EGF induzierter Aktivierung und dadurch bedingter

Rezeptorumlagerung eintreten. Mit diesem Modell wären auch die Ergebnisse aus den

Interaktionsstudien mit immobilisiertem Rezeptor konform, unter der Annahme, dass der

Rezeptor zu ca. 90% in der autoinhibierten Konformation vorliegt und somit nicht mit dem

EGFR-DA interagieren könnte. Solche Bedingungen könnten in ELISA und BIAcore

Experimenten zutreffend sein. Mithilfe der Durchflusszytometrie an unfixierten A431 Zellen

konnte keine Bindung des EGF-R DA : NeutrAvidin Oregon Green 488 Konstrukts

festgestellt werden, jedoch wurde nicht mit EGF ko-inkubiert. Um eine eindeutige Aussage

über den Wirkmechanismus des EGF-R Dimerisierungsarms treffen zu können, wären

weitere Experimente notwendig. Zunächst müssten die Wundheilungsexperimente

wiederholt werden, um die Reproduzierbarkeit des gezeigten Ergebnisses zu dokumentieren.

3D Softagar Matrix Experimente mit A431 und wichtiger noch anderen, EGF abhängigen

Zelllinien wären die Methode der Wahl, um den postulierten Wirkmechanismus des EGF-R

DA Peptids zu untersuchen.

Ergebnisse

82

6 Ergänzendes Kapitel, Computer gestützte Simulation

6.1 Einleitung

In Ermangelung einer Kristallstruktur des mAk 425:EGF-R Komplexes war es nicht möglich

potentielle Bindungsstellen für die abgeleiteten Peptide zu identifizieren. Eine Eingrenzung

auf mögliche Epitope, die von den Peptiden erkannt werden könnten, wurde die

computergestützter Vorhersage molekularer Komplexe (molekulares Docking) angewandt.

Die gewonnenen Erkenntnisse sollten es zukünftig ermöglichen, die experimentell

identifizierten Peptide so zu verändern, dass eine optimale Passgenauigkeit in der

Bindetasche erreicht werden kann. Zunächst jedoch wurde das Programm AutoDock 4

(http://autodock.scripps.edu/) angewendet, um die biochemischen und biophysikalischen

Bindungsstudien um rechnerische Erklärungsmodelle zu erweitern.

Einleitend ist zu sagen, dass molekulares Docking nicht die hohe Präzision der Algorithmen

der molekularen Dynamik aufweist, sich jedoch viele mögliche Interaktionspaare in

überschaubarer Zeit testen lassen. Dagegen lässt die exaktere molekulare Dynamik die

Analyse nur weniger Interaktionspaare in vertretbarem zeitlichen Rahmen zu.

AutoDock wurde bereits erfolgreich eingesetzt, um unbekannte Bindungsstellen zu

identifizieren, diese Vorgehensweise wurde als „Blind Docking“ bezeichnet (Hetenyi und van

der Spoel 2002). In diesen Studien wurden jedoch maximal drei Aminosäuren umfassende

Peptide gerechnet, wobei die Größe der Zielproteine mit ca. 250 AS etwa einer Domäne des

EGF-R entsprach.

AutoDock4 (Morris, Goodsell et al. 1998) setzt auf den Lamarck´schen genetischen

Algorithmus (LGA) kombiniert mit Empirischer Funktion der freien Energie, um

Interaktionspaare zu berechnen. Die empirische Funktion der freien Energie wurde anhand

eines Satzes von 30 Protein-Liganden Paaren mit bekannten Kristallstrukturen optimiert.

http://autodock.scripps.edu/

Ergebnisse

83

6.2 Ergebnisse

Die Koordinaten des aktiven EGF-R Moleküls (PDB-ID: 1IVO) wurden für die Berechnungen

in zwei Domänen unterteilt. Das Docking an die gesamte Rezeptorstruktur hätte

Gridabstände von > 1 Å bedingt, wodurch die Genauigkeit der Berechnung kompromittiert

worden wäre. Durch die Aufteilung in zwei Domänen konnte der Gridabstand auf 0.6 Å

reduziert werden, was für die Berechnung von Liganden-Rezeptor Bindestellen hinreichende

Genauigkeit liefern sollte (Hetenyi und van der Spoel 2002). Geringere Gridabstände wirken

sich zwar positiv auf die Genauigkeit der Berechnung aus, erhöhen aber den Speicherbedarf

invers zur dritten Potenz des Gridabstandes (Hetenyi, Kortvelyesi et al. 2002).

Das Docking wurde in der Regel unter Verwendung folgender Parameter durchgeführt (ca.

35 h Prozessorzeit): Rezeptor = vollständig rigide, Peptid vollständig flexibel, ga_run = 50

(Anzahl individueller Docking Versuche), ga_pop_size = 300 (Anzahl an Individuen in jeder

Generation), ga_num_evals = 25×106 (maximale Anzahl an Energiekalkulationen

insgesamt), ga_num_generations = 2000 (maximale Anzahl an Generationen insgesamt),

sw_max_its = 300 (Anzahl an Solis & Wets Iterationen, lokale Suche), ls_search_freq =

0.06 (Wahrscheinlichkeit für die Durchführung einer lokalen Solis & Wets Suche je

Individuum; für sw_max_its = 300 6 % von 300 Individuen oder, 18 Individuen,

durchlaufen eine lokale Suche). Das Docking bricht bei Erreichen der maximalen Anzahl an

Energiekalkulationen (ga_num_evals) bzw. der maximalen Anzahl an Generationen ab, je

nachdem welcher Wert früher erreicht wird. Hetenyi et al. konnten zeigen, dass die

Genauigkeit der Docking-Ergebnisse bei einer ga_pop_size = 300 ein Plateau erreichte

(Hetenyi und van der Spoel 2002), bei höheren Werten nahm die Anzahl der zur Verfügung

stehenden Kalkulationen pro Individuum ab, sodaß die Wahrscheinlichkeit das

Energieminimum finden zu können abnahm.

Die Docking-Ergebnisse wurden hinsichtlich zweier Kriterien ausgewertet, zum einen wurde

die beste gefundene Konformation mit niedrigster freier Energie der Bindung auf sinnvolle

Interaktionen untersucht, zum anderen wurde das am stärksten bevölkerte Cluster, bei einer

rmsd Toleranz von 12 Å, mit niedrigster freier Energie der Bindung auf Konformationen, die

stimmige Interaktionen zeigten untersucht.

Die beste Konformation aus dem Docking an die Domäne I der EGF-R Struktur wies eine

schwache freie Energie der Bindung von -3.12 kcal/mol auf. Zwei potentielle

Wasserstoffbrückenbindungen konnten zwischen Peptidbackbone und Glu181 des

Rezeptors, sowie dem Met des Peptids und dem Asp167 des Rezeptors mittels

AutodockTools identifiziert werden. Die potentielle Bindestelle war weder mit der EGF-

Kontaktfläche, noch mit der Kontaktfläche zur Domäne III überlappend. Eine Analyse der

Log-Datei zeigte, dass alle 50 Dockingversuche durch Erreichen der maximalen Anzahl an

Ergebnisse

84

Generationen (ga_num_generations = 2000) terminiert wurden, während die Anzahl der

Energiekalkulationen mit 6 - 7×106 konstant um den Faktor 3.8 unter dem erlaubten Wert lag

(ga_num_evals = 25×106). Zudem erschienen 50 Dockingversuche für die große Oberfläche

der EGF-R Domänen zu niedrig angesetzt.

Unter optimierten Parametern (ga_num_generations = 27000, ga_run = 250) wurde das

Docking wiederholt, konnte aber nicht erfolgreich beendet werden, da das

System nach ca. 2-wöchiger Berechnung wegen Überhitzung ausfiel. In einem weiteren

Versuch wurde nur die Anzahl unabhängiger Dockings (ga_run) auf 250 eingestellt. Die

benötigte Prozessorzeit belief sich auf 134 h. Die Konformation mit der niedrigsten freien

Energie der Bindung wies einen Wert von -4.47 kcal/mol auf, vier weitere Konformationen mit

Bindungsenergien von -3.29 kcal/mol bis -3.71 kcal/mol konnten mit diesen Parametern

gefunden werden, die in der vorherigen Berechnung nicht vorhanden waren. Mit insgesamt

17 Konformationen, die Bindungsenergien besser als -2 kcal/mol aufwiesen, konnten im

Vergleich zum Dockingexperiment mit ga_run = 50 (1 Konformation mit Bindungsenergie

besser als -2 kcal/mol) deutlich bessere Ergebnisse erzielt werden (Abbildung 52). Abbildung

52 zeigt Konformationen, die mit einer rms Toleranz von 12.0 Å zu Clustern mit gleichen

Bindungsenergien zusammengefasst wurden. Idealerweise sollten die am stärksten

bevölkerten Cluster zur niedrigsten Bindungsenergie hin konvergieren, sodass letztendlich

nur ein Cluster verbleibt. Bei ga_run = 50 dominierte ein Cluster mit 8 Individuen bei ca. -1

A. ga_run = 50 B. ga_run = 250

Abbildung 52) Cluster-Analyse aller gerechneten Konformationen bei 12 Å rms-Toleranz. A. Bei ga_run = 50 wies die beste gerechnete Konformation eine freie Energie der Bindung von -3.12 kcal/mol auf. B. Bei ga_run = 250 lag die freie Energie der Bindung der besten gerechneten Konformation bei -4.47 kcal/mol. Das am stärksten bevölkerte Cluster wies zudem eine 1 kcal/mol niedrigere freie Energie der Bindung im Vergleich zur Berechnung mit ga_run = 50 auf.

Ergebnisse

85

kcal/mol (Abbildung 52, A.). Die Analyse der gedockten Konformationen dieses Clusters

zeigte jedoch nur Peptidstrukturen, die in gestreckter Konformation vorlagen und nur mit dem

N-terminalen Met Interaktionen mit dem Rezeptor eingingen und wurden daher nicht als

erfolgreiche Dockingversuche gewertet. Die Clusteranalyse des Dockings mit ga_run = 250

(Abbildung 52, B.) zeigte eine deutliche Konvergenz zu niedrigeren Bindungsenergien, da

einerseits die Konformation mit niedrigster Bindungsenergie einen 1.35 kcal/mol niedrigeren

Wert verzeichnete als die beste Konformation bei ga_run = 50 (-4.47 kcal/mol vs. -3.12

kcal/mol), und andererseits das am stärksten bevölkerte Cluster eine um ca. 1 kcal/mol

niedrigere Bindungsenergie aufwies als bei ga_run = 50. Zunächst wurde die Konformation

mit der niedrigsten berechneten Bindungsenergie des Dockings mit ga_run = 250 analysiert.

Unmittelbar auffällig war die direkte räumliche Nähe der berechneten Bindestelle des

MASSHIFTF Peptids zur EGF-Kontaktfläche (Abbildung 53, A.). Die weitere Analyse der

berechneten Peptid-Rezeptor Interaktion zeigte 5 potentielle Wasserstoffbrückenbindungen

zwischen den Seitenketten der AS Glu21R, Gln28R und Asp51R des EGF-R und den

Seitenketten Thr9, His6, dem Stickstoff der Peptidbindung zwischen den AS Met und Ala und

dem N-terminalen Stickstoff des Met. Die Distanzen zwischen den Interaktionspaaren

(Met:Glu21R, His:Glu21R, His:Gln28R, Thr:Asp51R) liegen im Bereich zwischen 2.06 Å und

2.34 Å (Abbildung 53, B.). Weiterhin wurde eine mögliche hydrophobe Interaktion

ausgemacht, in die die Seitenkette des Phe7 des Peptids und die Seitenketten der AS Phe24

und Tyr50 des EGF-R involviert sein könnten, wobei die hydrophoben AS Phe24 und Tyr50

den hydrophoben Boden einer Spalte bilden, in welche die Seitenkette Phe7 hineinragt

(Abbildung 53, C.). Die Orientierung der AS Phe7 und Tyr50 zueinander konnte als

annähernd parallel betrachtet werden, während Phe7 fast im Winkel von 90° aber leicht

versetzt zu Phe24 war.

Ergebnisse

86

A.

B.

C.

Abbildung 53) Autodock4 Programm wurde verwendet, um potentielle Bindungsstellen für das Peptid MASSHIFTF auf der EGF-R Oberfläche zu identifizieren. A. Berechnete Bindungsstelle des MASSHIFTF Peptids am EGF-R liegt in unmittelbarer räumlicher Nähe zur EGF Bindestelle, die Reste der Domäne I und III umfasst. EGF-R: graue „Cartoon“ Darstellung, EGF: goldfarben dargestellt, MASSHIFT Peptid: rot dargestellt. B. Darstellung der fünf potentiellen Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Peptid und EGF-R. Oberfläche des EGF-R und die beteiligten Seitenketten wurden grau dargestellt. „Stick“ Darstellung des Peptids. C. Potentielle, hydrophobe Interaktion der Phenylalaninseitenkette des Peptids mit Phe24

R und Tyr50

R des EGF-R.

Ergebnisse

87

6.3 Diskussion

Die beste gedockte Konformation des Peptids MASSHIFTF an die Domäne I des EGF-R mit

niedrigster freier Energie der Bindung (-4.47 kcal/mol) zeigte das gebundene Peptid in

unmittelbarer räumlicher Nähe zum EGF. Der parentale Antikörper mAK 425 zeigte in

Versuchen EGF-ähnliche aktivierende Eigenschaften und kompetitierte mit EGF um die

Bindung (Rodeck, Herlyn et al. 1987; Rodeck, Williams et al. 1990). Die Bindestelle des

gedockten Peptids, das aus der CDR L3 des mAK 425 stammt, wäre in Übereinstimmung mit

diesen Beobachtungen, da der vollständige Antikörper analog zum natürlichen Liganden die

Domänen I und III, durch Überspannen der EGF-Bindespalte, in der aktiven

Rezeptorkonformation halten könnte. Dies stünde einerseits mit der beobachteten

aktivierenden Eigenschaft des Antikörpers und andererseits mit der Kompetition mit EGF in

Einklang.

Zusätzlich zeigte diese Konformation die His Seitenkette des Peptids in zwei bedeutenden

Wasserstoffbrückenbindungen mit den Seitenketten der AS Glu21R und Gln28R des EGF-R.

Diese Involvierung des His in der Peptid-Rezeptor Interaktion wurde nur in dieser

Konformation gefunden, die gleichzeitig die energetisch günstigste war, was die Bedeutung

der AS His, wie sie schon in der Phage Display basierten Selektion (4.2.2.2) diskutiert wurde

unterstützte. Zwei Beobachtungen wiesen dort auf eine mögliche Bedeutung des His hin: 1.)

zeigte die Struktur des mAK 425 das His in einer deutlich exponierten Orientierung, sodass

die Seitenkette mutmaßlich stark in die Kontaktfläche zwischen Antikörper und Rezeptor

hineinragt (Abbildung 9). 2.) zeigten die selektierten Sequenzen mit His beginnendeTripeptid

Motive mit guten Homologie Werten (4.2.2.2).

Die berechnete freie Energie der Bindung von -4.47 kcal/mol war zwar recht niedrig im

Vergleich zu hoch affinen Interaktionen (Strep-Biot, 17 kcal/mol (PDB-ID: 1STP) (Weber,

Ohlendorf et al. 1989), lag jedoch in einer Größenordnung, die auch für andere niedrig affine

Interaktionen gefunden wurde (Strep-Peptid, 5.3 kcal/mol (PDB-ID: 1PTS) (Weber,

Pantoliano et al. 1992); ABL-SH3-Peptidligand Interaktion 8 kcal/mol (PDB-ID: 1BBZ)

(Pisabarro, Serrano et al. 1998). Diese geringe Bindungsenergie stünde auch in

Übereinstimmung mit den experimentellen Ergebnissen, die vermutlich aufgrund geringer

Affinität in Abhängigkeit des Experimenttyps keine eindeutige Bindung an den EGF-R zeigen

konnten (4.3.3).

Das Docking konnte folglich Bindestelle und Interaktionsmodi errechnen, die mit den

experimentellen Beobachtungen gut in Einklang zu bringen waren, andererseits zeigen die

Clusteranalysen, daß die berechnete Konformation nicht als ausreichend zuverlässig

angesehen werden kann, da sie zwar die niedrigste Bindungsenergie aufwies, nicht aber die

am stärksten bevölkerte Population darstellte.

Ergebnisse

88

Die Konvergenz der stärksten bevölkerten Cluster zu niedrigerer Bindungsenergie hin bei

Erhöhung des ga_run Wertes von 50 auf 250 zeigte, daß die Parameter noch höher

anzusetzen wären, um ein zuverlässigeres Docking zu erhalten. Aufgrund der großen

Oberfläche des EGF-R und der damit einhergehenden Vielfalt an möglichen Bindestellen,

müßte der ga_run Wert vermutlich im vierstelligen Bereich liegen. Ein 10-fach höherer

ga_run Wert würde jedoch auch die Prozessorzeit um den Faktor 10 auf 1340 h erhöhen, da

ein linearer Zusammenhang zwischen benötigter Rechenzeit und dem ga_run Wert besteht.

Die Erhöhung des ga_num_generations Wertes auf 27000 bei ga_run = 250 resultierte in

einem Überlastungsbedingten Abbruch des Dockings nach 2 Wochen Rechenzeit. Diese

Zahlen machen deutlich, dass eine Anhebung beider Parameter (ga_run &

ga_num_generations) die Berechnung nicht mehr in überschaubarem zeitlichen Rahmen auf

einem Einzelplatzsystem durchzuführen zuließ.

Hetenyi et al. konnten mittels Autodock in Blinddocking Versuchen die Konformationen aus

den Kristallstrukturen der untersuchten Protein-Liganden Paare zuverlässig rechnen,

verwendeten dafür aber maximal Tripeptide, wodurch der Rechenaufwand durch die

geringere Anzahl an möglichen Torsionen gegenüber dem hier zu berechnenden Nonapeptid

deutlich reduziert wurde.

In einer jüngst publizierten Arbeit aus der Gruppe von K.M. Ferguson wurde die

Kristallstruktur des Fab-Fragments des auf dem mAk425 basierenden humanisierten

Antikörpers EMD 72000 beschrieben (Schmiedel, Blaukat et al. 2008). Die Struktur zeigte,

dass das Epitop des Fab-Fragments in der Domäne III liegt und dort mit der EGF Bindestelle

überlappt. Diese Ergebnisse stehen in scheinbarem Widerspruch zu den Ergebnissen der

Berechnungen für das SSHIFTF Peptid, es gilt jedoch anzumerken, dass das vollständig

flexibel gerechnete Peptid einen vom Fab-Fragment unterschiedlichen Bindungsmodus

aufweist. Der Histidinrest der CDR L3 zeigte in dieser Struktur, wie schon durch unsere

Berechnungen vermutet, zwei wichtige, Spezifität vermittelnde

Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Rezeptor. Weiter folgern die Autoren, dass keine der

CDR-Schleifen einen dominanten Beitrag zur Bindung leistet, sondern dieser über alle CDR-

Schleifen verteilt ist, was für Antikörper-Antigen Interaktionen wenig verbreitet ist. Diese

Beobachtung könnte die Schwierigkeiten, ein ausreichend affines Peptid aus den CDR-

Schleifen zu isolieren, erklären

Material & Methoden

89

7 Material & Methoden

7.1 Methoden

7.1.1 Zellkultur

7.1.1.1 Anzucht von A431 Kulturen

Aliquots in flüssigem Stickstoff gelagerter A431 Zellen wurden im 37°C Wasserbad

angetaut, durch Zugabe von 10 ml PBS vollständig aufgetaut und darin resuspendiert. Nach

Zentrifugation (1000 x g, 3 min., RT) wurde der Überstand verworfen, die Zellen in 4 ml

Vollmedium resuspendiert und in 25 cm² Gewebekulturflaschen überführt. Zellen wurden bei

37°C unter 5 % CO2 Atmosphäre kultiviert. Für die Reinigung des sEGF-R wurde bei

erreichen der Konfluenz gesplittet und sukzessive auf 175 cm² Gewebekulturflaschen

überführt. Bei beabsichtigter Verwendung für Stimulationsversuche, wurde bei Erreichen von

ca. 15 Zellen je Zellverband im Verhältnis 1:10 gesplittet, um die Zellen synchron im

Zellzyklus zu halten.

Vollmedium: DMEM, 10 % v/v FKS, 1 % v/v Glutamin, 1 % v/v Penicillin/Streptomycin

PBS: 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.5

7.1.1.2 Ruhigstellung von Zellen

Vor allen zellulären Experimenten wurden die A431 Zellen von jeglichen

Wachstumsfaktoren depletiert und ruhiggestellt. Vollmedium wurde abgenommen, die Zellen

zweimal mit Minimalmedium gewaschen und für 24 h bei 37°C, 5% CO2 in Minimalmedium

inkubiert.

Minimalmedium: DMEM, 1% v/v Pen/Strep, 1% v/v HEPES (1 M), 1% v/v Hydrocortison, 1% v/v ITS, 1% v/v BSA

Material & Methoden

90

7.1.1.3 Passagieren von A431 Kulturen für die Isolierung des löslichen sEGF-R aus Zellkulturüberstand

Frisch angesetzte A431 Zellen wurden bei Erreichen der Konfluenz sukkzessive von

25 cm2 auf 175 cm2 Gewebekulturflaschen unter schrittweiser Erhöhung des Anteils an

Minimalmedium (1/3 1/2 2/3 Volumenanteile) überführt. Zellkulturüberstand konfluenter

A431 Zellen in 175 cm² Gewebekulturschalen wurde abgenommen, die Zellen 2 × 10 ml PBS

gewaschen und durch ca. 10-minütige Inkubation (2 ml, 5 × Trypsin, 37°C, 5% CO2)

abgelöst. Die vereinzelten Zellen wurden in 10 ml Vollmedium aufgenommen und für 3 min

bei 1000 × g pelletiert. Zellen wurden in 10 ml Vollmedium resuspendiert und zur weiteren

Expansion auf 4 × 175 cm² Gewebekulturflaschen aufgeteilt. Nach erreichen der maximalen

Anzahl zu führender Gewebekulturflaschen wurde im Verhältnis 1:4 gesplittet. Der

Zellkulturüberstand wurde jeweils abgenommen, zentrifugiert (4°C, 30 min, 5000 UPM,

Heraeus Varifuge 3.0), auf final 1 mM EDTA eingestellt, in flüssigem Stickstoff eingefroren

und bis zur weiteren Reinigung in 50 ml Aliquots bei -80°C gelagert.

5× Trypsin/EDTA: 0.25% Trypsin, 0.5 M EDTA, PBS Vollmedium: DMEM: 10 % v/v FKS, 1 % v/v Glutamin, 1 % v/v Penicillin/Streptomycin Minimalmedium: DMEM, 1% v/v Pen/Strep, 1% v/v HEPES (1 M), 1% v/v Hydrocortison,

1% v/v ITS, 1% v/v BSA PBS: 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.5

7.1.1.4 Reinigung des sEGF-R aus Zellkulturüberstand

Die sekretierte Spleißvariante des EGF-R (Weber, Gill et al. 1984) wurde durch

Affinitätschromatographie aus dem Überstand serumfrei kultivierter A431 Zellen isoliert (Gill

und Weber 1987). Eine Affinitätsmatrix wurde für die Einschrittreinigung verwendet,

basierend auf einem EGF-R spezifischen scFv 425 Tandem-CBD (Chitin-bindende Domäne)

Fusionskonstrukt (scFv 425-CBD-CBD) und einer Chitin-Säulenmatrix (Chitin Beads, Sigma).

Das scFv 425-CBD-CBD Konstrukt wurde in RV308 exprimiert, die Zellen sedimentiert und

bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert. Bei Bedarf wurde das Zellpellet in 20 ml

Zellaufschlusspuffer resuspendiert und durch Sonifizierung aufgeschlossen. Zelldebris wurde

durch Zentrifugation (4°C, 43.000 x g, 45 min) und weitere partikuläre Verunreinigungen

durch Filtration (0.45 µm PVDF Spritzenfilter) abgetrennt. Der Aufschluss wurde auf 0.1 mM

EDTA, 1 M NaCl, 1 % Triton eingestellt. 2 ml Chitin Beads wurden mit 3 x 20 ml

Zellaufschlusspuffer equilibriert (Zentrifugation bei 4°C, 1100 UPM, 10 min) und durch

Inkubation des Zellaufschlusses (über Nacht, 4°C, Rollinkubator) mit dem scFv 425-CBD-

CBD dekoriert. Dekorierte Chitin Beads wurden 3 x mit 20 ml Waschpuffer P1 und 3 x mit

Material & Methoden

91

Waschpuffer P2 gewaschen (4°C, 1100 UPM, 10 min, Heraeus Varifuge 3.0 R) und mit ca.

250 ml bis 300 ml A431 Zellkulturüberstand inkubiert (4°C, über Nacht, Rollinkubator). Mit

sEGF-R beladene Chitin Beads wurden pelletiert (4°C, 1100 UPM, 30 min), mit 40 ml

Waschpuffer P1 und 40 ml P2 gewaschen (4°C, 1100 UPM, 30 min) und in eine 2.5 ml Säule

(MoBiTec) überführt. Gebundener sEGF-R wurde durch eine pH-Wertänderung in 1ml

Fraktionen von der Säule eluiert (Elutionspuffer, Flussrate = 1 ml/min, 4°C) und sofort mit

200 µl 1 M Tris-HCl pH 8.0 neutralisiert. Elutionsfraktionen wurden mittels SDS PAGE

analysiert.

Zellaufschlusspuffer: 20 mM Na-P, 0.3 M NaCl, pH 7.2 Waschpuffer P1: 20 mM Na-P, 0.5 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.1% Trition-X-100, pH 6.5 Waschpuffer P2: 20 mM Na-P, 0.5 M NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 6.5 Elutionspuffer: 0.1 M Glycin-HCl, 0.5 M NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 2.0

7.1.1.5 Fixieren von Zellen

Zellen wurden gewaschen (2 × Minimalmedium), für 10 min. bei RT in 4% PFA/1×

PBS fixiert, 3 × PBS gewaschen und bis zur weiteren Verwendung auf Eis gehalten.

Minimalmedium: DMEM, 1% v/v Pen/Strep, 1% v/v HEPES (1 M), 1% v/v Hydrocortison, 1% v/v ITS, 1% v/v BSA


7.1.2 Phage Display

7.1.2.1 Amplifikation von Phagen

Eine 20 ml E. coli ER2738 Kultur wurde bei OD600 = 0.8 mit 1 × 106 bis 5 × 106

Phagen inokuliert, 10 min bei 37°C inkubiert, um die Infektion zu gewährleisten und

anschließend 6h auf einem Orbitalschüttler inkubiert. Eine längere Amplifikation ist aufgrund

der möglichen Rekombinationsereignisse nicht empfehlenswert. Amplifizierte Phagen

wurden durch Zentrifugation (4°C, 10 min, 5000 UPM, Ausschwinggotor, Varifuge 3.0 R,

Heraeus) von den Bakterien getrennt, in 37.5 ml PBS resuspendiert, durch Zugabe von 1/6

Volumen PEG/NaCl, gefällt (4°C, über Nacht), zentrifugiert (4°C, 30 min, 5000 UPM,

Ausschwingrotor, Varifuge 3.0 R, Heraeus), und weiter 2 x in 1 ml PBST0.05 resuspendiert

und erneut gefällt (1/6 Volumen PEG/NaCl, 4°C, 1h). Phagen wurden final in 1 ml PBST0.05

Material & Methoden

92

resuspendiert. Typischerweise wurden ca. 1 × 1014 Phagen aus der Amplifikation gewonnen,

während ca. 1 × 1011 Phagen aus der Selektion zurückgewonnen werden konnten.

PBST0.05: PBS, 0.05% v/v Tween20

7.1.2.2 Phagenselektion

Die Selektion EGF-R spezifischer Phagen wurde abwechselnd auf immobilisiertem,

aus Zellkulturüberstand isoliertem sEGF-R und auf A431 Zellen durchgeführt. Insgesamt

wurden sechs Selektionsrunden durchlaufen, wobei, beginnend mit immobilisiertem sEGF-R,

alternierend immer je zwei Runden auf immobilisiertem sEGF-R bzw. A431 Zellen

durchgeführt wurden. Dieses Prozedere sollte verhindern, dass zum einen während der

Selektion auf immobilisiertem sEGF-R Phagenklone angereichert werden, die Epitope von

evtl. denaturiertem Rezeptor und damit in der intakten Struktur unzugängliche Epitope

erkennen, und zum anderen während der Selektion auf A431 Zellen solche Phagen

angereichert werden, die andere Oberflächenmarker als den EGF-R erkennen.

2 µg sEGF-R wurden in die Vertiefung einer 96-Loch Platte in Immobilisierungspuffer

auf die Plastikoberfläche gebunden (4°C, über Nacht), 2 x gewaschen (300 µl Waschpuffer)

und verbliebene freie Flächen blockiert (RT, 30 min, Blockierungslösung),

Blockierungslösung wurde abgenommen und 2 x gewaschen. 1×1011 bis 1×1012 Phagen

wurden inkubiert (RT, 1h, unter milder Agitation), 4 × mit 300 µl Waschpuffer gewaschen, um

ungebundene Phagen zu entfernen. Gebundene Phagen wurden durch niedrigen pH eluiert

(RT, 10 min, 200 µl Elutionspuffer) und sofort durch Zugabe von Neutralisierungspuffer

neutralisiert. Die eluierten Phagen wurden für die nächste Selektionsrunde amplifiziert.

Für die Selektion auf A431 Zellen wurden diese in 6-Loch Platten ausgesät, und bei

Erreichen der Konfluenz verwendet. Konfluente A431 Zellen wurden 5 × gewaschen (RT, 2

min, ca. 5 ml PBS) und mit ca. 1×1013 Phagen inkubiert (RT, 1h, unter milder Agitation),

ungebundene Phagen wurden durch fünfmaliges waschen entfernt (RT, 2 min, Waschpuffer

+ 1% w/v BSA). Gebundene Phagen wurden durch niedrigen pH eluiert (RT, 10 min, 1 ml

Elutionspuffer) und sofort durch Zugabe von Neutralisierungspuffer neutralisiert. Zelluläres

Material wurde durch Zentrifugation abgetrennt (RT, 10 min, 20000×g). Die eluierten Phagen

wurden für die nächste Selektionsrunde amplifiziert.

Immobilisierungspuffer: 100 mM NaHCO3, pH 9.4

Blockierungslösung: PBS, 1% w/v BSA, 0.05% v/v Tween20

Waschpuffer: PBS, 0.05% v/v Tween20

Elutionspuffer: 100 mM Glycin-HCl, pH 2.2

Neutralisierungspuffer: 1 M Tris-HCl, pH 8.0

Material & Methoden

93

7.1.3 Proteinbiochemische Methoden

7.1.3.1 Rekombinante Proteinexpression in E. coli RV308

Für die Expression der CAT Konstrukte wurden je 1 l 2xYT Medium aus einem

Glycerinstock inokuliert, mit 25 µg/ml Chloramphenicol (Cm25), 100 µg/ml Ampicillin (Amp100)

und 1 mM IPTG versetzt und über Nacht auf einem Orbitalschüttler bei 37°C inkubiert.

Für die Expression des scFv 425-CBD-CBD Konstrukts wurden 4 l 2xYT (Cm25, 28°C,

Orbitalschüttler) aus einer Übernachtkultur (Cm25, 28°C, Orbitalschüttler) inokuliert und auf

eine OD600 von ca. 0.1 eingestellt. Bei OD600 = 0.8 wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG die

Proteinexpression induziert und bis zu einer OD600 = 4/5 weiter agitiert.

Für die Expression der scFv 452-Bla und BlaXaEGF Fusionsproteine wurden 2 l

2xYT (Amp100, Cm25, 28°C, Orbitalschüttler) aus einer Übernachtkultur (Amp100, Cm25, 28°C,

Orbitalschüttler) inokuliert, das weitere Prozedere erfolgte analog zum scFv 425-CBD-CBD

Konstrukt.

2xYT-Medium: 16 g/l Bacto-Trypton, 10 g/l Hefe-Extrakt, 5 g/l NaCl

7.1.3.2 Zellaufschluss

● Präparation von Totalzelllysaten:

Alle CAT und GST basierten Konstrukte wurden aus Totalzellysat von E. coli RV 308

Zellen isoliert. Für den Aufschluss wurden die Zellen sedimentiert (4°C, 3635 RCF, 40 min.),

der Überstand verworfen und das Zellsediment bei -80°C über Nacht gelagert. Zellen wurden

in 40 ml Resuspensionspuffer pro 1 l Kultur resuspendiert und 10 1 min. im

EtOH/Eiswasser Bad unter Verwendung einer 6 mm Nadel sonifiziert (duty cycle 50 %,

Output 6) um die Zellen aufzubrechen. Zelldebris wurde durch Zentrifugation (4°C, 43.000 x

g, 45 min), weitere partikuläre Verunreinigungen durch Filtration (0.45 µm PVDF

Spritzenfilter) abgetrennt. Die Proteinlösung wurde geeigneten chromatographischen

Methoden zur weiteren Reinigung zugeführt.

Resuspensionspuffer 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7.2

Material & Methoden

94

● Periplasmatische Extraktion von β-Laktamase Fusionsproteinen:

Die bakterielle β-Laktamase wird in den periplasmatischen Raum exportiert. Durch

Osmolyse wird nur die äußere Membran aufgebrochen, während die Cytoplasmamembran

erhalten bleibt, sodass der Aufschluss bereits einen ersten Reinigungsschritt darstellt.

Sedimentierte Zellen wurden in 3 ml TES-Puffer/[g] Zellen resuspendiert und 45 min unter

gelegentlicher Agitation auf Eis inkubiert. Partikuläres Material wurde durch Zentrifugation

entfernt (4°C, 43.000 x g, 45 min), der Überstand durch einen 0.45 µm PVDF Spritzenfilter

passiert und abschließend 3 x gegen je 2 l Na-P Puffer dialysiert (4°C, je ca. 8h).

TES: 100 mM Tris-HCl, 500 mM Sucrose, 1 mM EDTA, pH 8.0 Na-P Puffer: 20 mM Na-P, 125 m M NaCl, pH 7.2

7.1.3.3 SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die von Laemmli entwickelte Methode der SDS-Gelelektrophorese wird für die

Auftrennung von Proteinen nach deren Größe verwendet. Die Porengröße eines Gels wird

durch das Verhältnis von monomerem Acrylamid zum Kreuzvernetzer N,N´-Methylen-Bis-

Acrylamid bestimmt. Das negativ geladene Detergens SDS lagert sich mit einem Molekül pro

drei Aminosäuren an das Protein an, was zur Denaturierung des Proteins führt und die

konstante Korrelation zwischen Größe des Proteins und seiner Ladung bedingt. Durch die

negative Ladung erfährt das Protein im elektrischen Feld eine zur Anode hin gerichtete Kraft,

die es durch das Netz aus polymerisiertem Acrylamid treibt. Je größer das Molekül ist, desto

höher ist der Widerstand und desto stärker wird es zurückgehalten. Näherungsweise ist die

zurückgelegte Strecke im Gel umgekehrt proportional zur relativen Molekülmasse (Mr).

Vor dem eigentlichen Trenngel ist das Sammelgel vorgeschaltet, in dem die Cl- Ionen

(Leition) schneller wandern als das bei dem im Sammelgel herrschenden pH-Wert neutral

vorliegenden Glycins (Folgeion), dabei wird ein zum Leition hin immer stärker werdendes

elektrisches Feld aufgebaut. Die Kombination von zunehmendem elektrischen Feld und

geringerer Maschenweite fokusiert die Proteine unmittelbar hinter der Leitionenfront zu einer

scharfen Bande, wodurch die Proteinbanden im Trenngel definierter aufgtrennt werden.

Material & Methoden

95

Je fünf SDS-Gele wurden nach folgender Anweisung gegossen:

Trenngel (12,5%) Sammelgel

Wasser 12 ml 13.6 ml

Acrylamid:Bisacrylamid 30%: 0.8%

15.8 ml 3.4 ml

1,5 M Tris-HCl pH 8.8 8.8 ml -

1 M Tris-HCl pH 6.8 - 2.6 ml

20% (w/v) SDS 187.5 µl 100 µl

10% (w/v) APS 100 µl 200 µl

TEMED 10 µl 20 µl

Für das Trenngel wurden obige Komponenten vermischt, wobei der Radikalstarter APS

zuletzt zugegeben wurde und zügig in die vorbereitete Gießapparatur überführt. Das

Trenngel wurde mit 1 ml Isopropanol je Gel überschichtet, um eine saubere Gelkante zum

Sammelgel hin zu erhalten. Nach der Polymerisierung des Trenngels wurde das Isopropanol

verworfen, das Sammelgel gegossen und der Kamm luftblasenfrei eingesetzt. Die vollständig

bei RT Polymerisierten Gele wurden vorsichtig aus der Gießkammer entnommen und bei

4°C in feuchten Tüchern gelagert. Aufzutrennende Proben wurden mit 5 x Ladepuffer

versetzt, 3 min bei 95°C denaturiert und auf das Gel aufgetragen. Typischerweise wurden 20

µl Probenvolumen pro Tasche aufgetragen.

Die angelegte Spannung von 80 V wurde auf 120 V erhöht, sobald die Lauffront das

Trenngel erreichte. Der Lauf wurde beendet, sobald die Lauffront aus dem Gel herauslief.

Nach Beendigung des Laufes wurden die Proteinbanden entweder direkt im Gel mittels

Coomassie-Blau Färbung dargestellt, oder das Gel einer weiteren Analyse durch Western-

Blot zugeführt.

7.1.3.4 Coomassie-Blau Färbung von Proteingelen

Für die direkte Darstellung von Proteinbanden mittels Coomassie-Blau wurde das Gel

in Coomassie-Lösung unter gelegentlichem Erhitzen inkubiert. Die Entfärbung erfolgte unter

gelegentlicher Erwärmung in 20 % Essigsäure bis das Gel entfärbt, und die Proteinbanden

deutlich sichtbar wurden.

Die Methode hat eine untere Nachweisgrenze von ca. 100 ng/Bande. Die Färbung beruht auf

unspezifischer Interaktion des Coomassie-Brilliant-Blau R-250 mit basischen und

aromatischen Resten der Aminosäuren.

Material & Methoden

96

7.1.3.5 Western-Blot Analyse

Der Western Blot, auch Immunoblot genannt, dient dem spezifischen Nachweis von

Proteinen mittels Antikörper.

Der Western Blot schließt sich an die SDS-Gelelektrophorese an und erfolgt senkrecht zur

ursprünglichen Laufrichtung des Gels. Die Proteine im Gel werden dabei auf eine Membran

(Nitrocellulose oder PVDF) übertragen (blotting). Die Proteine haften auf der Membran durch

unspezifische, hydrophobe Interaktionen. Spezifische Proteinbanden können durch

Verwendung von Antikörpern nachgewiesen und z.B. durch Umwandlung eines

chromogenen Farbstoffes dargestellt werden.

7.1.4 Chromatographische Methoden

7.1.4.1 Affinitätschromatographische Methoden

● Reinigung des sEGF-R aus Zellkulturüberstand

Siehe: 7.1.1.4 Reinigung des sEGF-R aus Zellkulturüberstand

● Reinigung der CAT-Konstrukte

CAT-Konstrukte wurden aus Totalzelllysat im ersten Reinigungsschritt über eine

selbst gepackte Chloramphenicol-Caproat-Agarose-Säule zu hinreichender Reinheit isoliert.

Als Säulenmatrix diente Chloramphenicol Caproat-Agarose (Sigma-Aldrich). 1.5 ml

Säulenmatrix wurden mit 40-fachem Säulenvolumen equilibriert (4°C, 1 ml/min, Ladepuffer),

der Zellaufschluss geladen (4°C, 1 ml/min) und mit 40-fachem Säulenvolumen gewaschen

(4°C, 1 ml/min, Ladepuffer). Gebundene Proteine wurden eluiert (4°C, 1 ml/min,

Elutionspuffer) und in 1 ml Fraktionen aufgefangen. Die gesamte Reinigung fand im 4°C

Konstantraum unter Verwendung einer Peristaltikpumpe statt. Fraktionen # 1 – 10 wurden

vereinigt, mittels VivaSpin 4 in 2 – 3 Durchgängen auf ein residuales Volumen von ca. 1 ml

eingeengt (4°C, 5000 × g) und abschließend einer Gelfiltration zugeführt, um

Chloramphenicol von der Probe abzutrennen, und die Probe in die geeigneten Puffer zu

überführen.

Lade- und Resuspensionspuffer 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7.2 Elutionspuffer 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA,

5 mM Cm, pH 7.2

Material & Methoden

97

● Reinigung der GST-Konstrukte

GST-Konstrukte wurden über eine GSTrap FF 1ml (GE Healthcare/Amersham) Säule

an einer HPLC-Anlage (Äkta Purifier) automatisiert zu hoher Reinheit isoliert. Die HPLC-

Anlage wurde mit folgendem Programm gesteuert:

0.00 Base Volume

0.00 ColumnPosition Position8

0.00 Message „right column?right place?” Screen “No sound”

0.00 PumpAInlet A2

0.00 Flow 1.000 {ml/min}

0.00 Watch_Pressure Greater_Than 0.5 {MPa} PAUSE

0.00 Wavelength 280 {nm} 254 {nm} 215 {nm}

1.00 AutoZeroUV

6.00 InjectionValve Inject

48.00 InjectionValve Load

108.00 PumpBInlet B2

108.00 Fractionation_900 2.000 {ml}

108.00 Gradient 100.0 {%B} 0.00 {base}

120.00 Fractionation_Stop_900

122.00 End_Method

Die Säule wurde vor der Reinigung mit 40-fachem Säulenvolumen in Bindepuffer equilibriert.

Bindepuffer wurde über PumpAInlet A2 und der Elutionspuffer über PumpBInlet B2

angeschlossen. Elutionsfraktionen mit höchsten Proteingehalten wurden vereinigt, aliquotiert

und bei -80°C gelagert.

Bindepuffer 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.5 Elutionspuffer 50 mM Tris-HCl, 10 mM Glutathion, reduziert, pH8.0

● Reinigung der β-Laktamase Fusionsproteine

Das aktive Zentrum der β-Laktamase hat eine hohe Affinität zu inhibitorisch

wirkenden Borat und Boronat, was für die affinitätschromatographische Reinigung aus dem

Periplasmaextrakt ausgenutzt wurde. Eine selbst gepackte Phenylboronat Sepharose Säule

(ca. 1.5 ml Säulenvolumen) wurde mit Auftragspuffer (40-faches Säulenvolumen) equilibriert.

Der Probenauftrag und die weitere Reinigung erfolgen computergestützt unter Verwendung

des folgenden Programms an einem Äkta-Purifier HPLC-System:

0.00 Base Volume

0.00 Message “loop loaded und connected?” Screen “No sound”

Material & Methoden

98

0.00 Message „PheBo, A1: 20mM NaP, 0.5M NaCl B1: 20mM NaCl, 0.5M

NaCl, 0.5M Borat” Screen “No sound”

0.00 Alarm_Pressure Enabled 1.5 {MPa} 0.0 {MPa}


0.00 PumpAInlet A1

0.00 OutletValve WasteF1

0.00 Flow 0.500 {ml/min}

0.00 Gradient 0.0 {%B} 0.00 {base}

0.00 Wavelength 280 {nm} 254 {nm} 215 {nm}

1.00 AutoZeroUV

2.00 InjectionValve Inject

2.00 OutletValve F2




57.00 Flow 1.000 {ml/min}

137.00 PumpBInlet B1

137.00 Gradient 100.0 {%B} 0.00 {base}


137.00 Flow 0.500 {ml/min}

157.00 PumpAInlet A1

157.00 Gradient 0.0 {%B} 0.00 {base}

157.00 OutletValve WasteF1

157.00 Flow 1.000 {ml/min}

122.00 End_Method

Die proteinhaltigen Elutionsfraktionen wurden vereinigt, 3 × gegen je 2 l Dialyspuffer

dialysiert (4°C, je ca. 8h), steril filtriert (0.45 µm Spritzenfilter) und in Aliquots bei -80°C

gelagert.

Equilibrierungspuffer 20 mM Na-P, 0.5 M NaCl, pH 7.2

Ladepuffer 20 mM Na-P, 0.5 M NaCl, pH 7.2

Elutionspuffer 20 mM Na-P, 0.5 M NaCl, 0.5 M Borat, pH 7.2

Dialysepuffer 20 mM Na-P, 125 m M NaCl, pH 7.2

7.1.4.2 Größenausschlusschromatographie

Über eine Superdex 200 Gelfiltrationssäule (Trennbereich 10 – 600 kDa, ca. 24 ml

Säulenvolumen) wurden die CAT-Konstrukte in HEPES Puffer für BIAcore Untersuchungen

umgepuffert und im Elutionspuffer vorhandenes Chloramphenicol abgetrennt. Streptavidin

Konstrukte wurden ebenfalls mittels Superdex 200 Gelfiltrationssäule von überschüssigen,

ungebundenen Peptiden nach erfolgter Dekoration abgetrennt.

Material & Methoden

99

Die Säule wurde mit 3 Säulenvolumen des Puffers für die späteren Messungen equilibriert,

Für die Reinigung der CAT und Streptavidin Konstrukte wurden 500 µl – 1000 µl

Proteinlösung in einen 1 ml Loop geladen und bei einer Flussrate von 0.7 ml/min auf die

Säule aufgetragen. Über den Fraktionssammler wurden 1 ml Fraktionen aufgefangen. Die

Reinigung erfolgte an einem Äkta-Purifier System. Alle Puffer wurden zuvor filtriert (0.22 µm

Porengröße) und entgast.

HEPES Puffer: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.2

7.1.5 Bindungsnachweismethoden

7.1.5.1 Konfokale-Immunfluoreszenz

A431 Zellen wurden in IBIDI µ-Dish, kombinierte Kultivierungs- und

Fluoreszenzmikroskopie Schalen, in Vollmedium kultiviert. 24h vor der Färbung wurden die

Zellen in Minimalmedium zur Ruhigstellung überführt, 3 × PBS gewaschen, fixiert (4% PFA

in PBS, 15 min, RT), 3 × PBS gewaschen, in 1 ml Blockierungslösung blockiert (1h, RT) und

erneut 3 × PBS gewaschen. Konstrukte wurden 1h auf den Zellen inkubiert (1h, RT, 720 nM,

ca. 300µl Volumen), ungebundene Konstrukte wurden entfernt (7 × 1 ml PBS). Gebundene

CAT-Fusionsproteine wurden mittels primärem Antikörper detektiert (100 µl), ungebundene

Antikörper entfernt (7 × 1 ml PBS), und mittels sekundärem, fluoreszenzmarkiertem

Antikörper (100 µl) visualisiert. Ungebundene sekundäre Antikörper wurden durch waschen

entfernt (7 × 1 ml PBS). Proben wurden bis zur Analyse dunkel und auf Eis gehalten.

Die Detektion des Fluoreszenzsignals erfolgte an einem Zeiss LSM 510UV inversen,

konfokalen Laser-Scanning Mikroskop.


Minimalmedium: DMEM, 1% v/v Pen/Strep, 1% v/v HEPES (1 M), 1% v/v Hydrocortison,

1% v/v ITS, 1% v/v BSA


Primärer-AK: Kaninchen-anti-CAT-IgG Antikörper, 1:1000 verdünnt in PBS

Sekundärer-AK: Anti-Kaninchen AlexaFluor488 gekoppelter Antikörper, 1:200 verdünnt in PBS

Material & Methoden

100

7.1.5.2 ELISA

2 µg sEGF-R wurden in Vertiefungen von 96-Loch Platten immobilisiert (20°C, 2 h,

100 µl), überschüssiger Rezeptor wurde entfernt (2 × 300 µl PBS), evtl. freie Flächen

blockiert (20°C, 2 h, 0.5% w/v PVP-K30 in PBS) und die Blockierungslösung entfernt (2 ×

300 µl PBS). Für Protein-ELISA auf A431 Zellen wurden diese in 96-Loch Platten bis zur

Konfluenz in Vollmedium kultiviert, in Minimalmedium überführt und 24 h später gewaschen

(3 × PBS). Die Blockierung freier Oberflächen erfolgte analog zu den sEGF-R belegten

Oberflächen. Konstrukte wurden auf der sEGF-R Oberfläche inkubiert (320 nM in PBS, 550

mM NaCl, 20°C, 45 min, ELISA-Schüttler), ungebundene Konstrukte entfernt (15 × 300 µl

PBS, 550 mM NaCl). sEGF-R lokalisierte CAT-Konstrukte wurden mittels Kaninchen anti-

CAT Antikörper detektiert (20°C, 45 min, 1:1000 verdünnt in PBS, 550 mM NaCl),

überschüssige Antikörper wurden entfernt (15 × 300 µl PBS, 550 mM NaCl), verbliebene

primäre Antikörper durch sekundären, HRP gekoppelten anti-Kaninchen Antikörper detektiert

(20°C, 45 min, 1:1000 verdünnt in PBS, 550 mM NaCl), überschüssige Detektionsantikörper

entfernt (15 × 300 µl PBS, 550 mM NaCl) und durch Zugabe von 100 µl ABTS mittels

Farbumschlag nachgewiesen (Absorption @ 405 nm, Tecan Sunrise ELISAreader).

Für den Phagen-ELISA auf immobilisiertem sEGF-R wurden 2 µg sEGF-R in die

Vertiefungen einer 96-Loch Platte immobilisiert (10°C, 3 h, 100 µl). Für den Phagen-ELISA

auf A431 Zellen wurden diese in Vertiefungen einer 96-Loch Platte bis zur Konfluenz in

Vollmedium kultiviert und 24 h vor dem Experiment in Minimalmedium überführt.

Ungebundener Rezeptor bzw. Minimalmedium wurde durch Waschen entfernt (3 × PBS).

A431 Zellen wurden fixiert (RT, 30 min, 4% PFA in PBS) und anschließend gewaschen (3 ×

PBS). Freie Oberflächen wurden blockiert (16°C, 3 h, 4% BSA w/v in PBS) und die

Blockierungslösung entfernt (3 × PBS). 1×1013 Phagen wurden auf sEGF-R oder A431

Zellen inkubiert (20°C, 40 min, 100 µl PBS, 1% BSA, 0.05% Tween20), ungebundene

Phagen entfernt (6 × PBS, 1% BSA, 0.05 % v/v Tween 20), verbliebene Phagen mittels anti-

M13 HRP konjugiertem Antikörper detektiert (20°C, 40 min, PBS, 1% BSA, 0.05% Tween20),

überschüssige Antikörper entfernt (6 × PBS, 1% BSA, 0.05 % v/v Tween 20) und durh

Zugabe von 100 µl ABTS nachgewiesen. Der Farbumschlag wurde an einem Tecan Sunrise

ELISAreader bei 405 nm verfolgt.


Primärer-AK: Kaninchen-anti-CAT-IgG Antikörper, 1:1000 verdünnt in PBS

Sekundärer-AK: Anti-Kaninchen-IgG-HRP Antikörper, 1:1000 verdünnt in PBS

Anti-M13-HRP Antikörper, 1:1000 verdünnt in PBS, 1% BSA, 0.05% Tween20

Material & Methoden

101

7.1.5.3 Biacore

Alle Messungen wurden an einem BIAcore 3000 System unter Verwendung des Sensorchips

CM-5 durchgeführt.

● Kopplung eines CM-5 Sensorchips mit sEGF-R:

sEGF-R wurde gemäß Herstellerangaben auf die Oberfläche eines CM-5 Sensorchip

gekoppelt. Referenzflußzelle wurde nach Herstellerangaben inaktiviert und diente als

Kontrolle, um Puffereffekte zu eliminieren.

4 µl sEGF-R (11.3 µM in HEPES-Puffer) wurden mit 196 µl Acetat-Puffer gemischt und bei

einer Flussrate von 30 µl/min 1 min lang auf die aktivierte Sensoroberfläche gekoppelt. Nach

der Kopplung erfolgte die Inaktivierung der Sensorchipoberfläche. Die Kopplung erfolgte

automatisiert unter Verwendung des folgenden Programms:

DEFINE APROG immobEGFR

CAPTION Amine coupling

FLOW 10

DILUTE R1D1 R1D2 R1D3 50 !EDCpos NHSpos mixpos 50%dilution

* INJECT R1D3 70 !EDC/NHS

-0:10 RPOINT Baseline -b

FLOW 10

* INJECT R1D4 150 !Ligand 4 µl sEGFR + 196 µl Acetat 10mM pH3.4

Flow 10

* INJECT R1D5 70 !Ethanolamine deactivation

EXTRACLEAN !Extra washing of flow cell area

15:00 RPOINT immob !Immobilized amount of ligand

END

MAIN

RACK 1 thermo_c

RACK 2 thermo_a

FLOWCELL 4 !Sensogram in flow cell 4

APROG immobEGFR

APPEND CONTINUE

END

● Aufnahme von Sensorgrammen:

CAT Fusionsenzyme wurden mittels Gelfiltration in HEPES-Puffer überführt, der Laufpuffer

wurde für die Messungen am BIAcore verwendet und zuvor filtriert und entgast. Zu

messende Proteinverdünnungsreihen wurden in das Probenaufnahmerack gestellt. Die

Messungen erfolgten bei 20°C und einer Flussrate von 20 µl/min. Die Probeninjektion

erfolgte durch manuelle Eingabe des Befehls „Kinjekt“ in den Befehlsablaufstapel, unter

Angabe der jeweiligen Position der Probe.

Material & Methoden

102

HEPES-Puffer: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4

Acetat-Puffer: 10 mM Acetat, pH 3.4

7.1.5.4 Durchflußzytometrie

A431 Zellen wurden in einer 175 cm² Gewebekulturflasche bis zur Konfluenz kultiviert und

unter Verwendung der Accutase vereinzelt. Alle nachfolgenden Schritte erfolgten auf Eis

unter Verwendung eiskalter Puffer. Im Falle einer Fixierung wurden die Zellen in 4% PFA

supplementiertem PBS für 5 min bei RT inkubiert und anschließend gewaschen (3 × PBS).

Vereinzelte Zellen wurden in 20 Aliquots aufgeteilt und mit den entsprechenden Konstrukten

inkubiert (Tabelle 5 & Tabelle 4) (auf Eis, 30 min, 500µl). Ungebundene Konstrukte wurden

entfernt (2 × PBS), durch Koinkubation von primärem und sekundärem Nachweisantikörper

detektiert (auf Eis, 20 min, 500 µl), ungebundene Antikörper entfernt (2 × PBS) und am

Durchflußzytometer nachgewiesen.


7.1.6 Zellaktivierungsassays

7.1.6.1 Wundheilungsexperiment

A431 Zellen wurden in 6-Loch Platten bis zur Konfluenz in Vollmedium kultiviert,

sodann für 24h in Minimalmedium überführt, um die Zellen ruhig zu stellen. Zellen wurden

Tabelle 4) Konzentrationen der eingesetzten Peptide bei PräInkubation mit Neutravidin-OregonGreen488

Kon-strukt

CATwt [5.5 µM] S-CAT-S [5.5 µM] scFv 425 Bla [5.5

µM] CAT Kontrolle Bla Kontrolle

1. AK Kaninchen α-CAT IgG

(1:500) Kaninchen α-CAT IgG

(1:500) Maus α-Bla IgG

(1:50) Kaninchen α-CAT IgG

(1:500) Maus α-Bla IgG

(1:50)

2. AK α-Kaninchen IgG AlexaFluor 488

(1:300)

α-Kaninchen IgG AlexaFluor 488

(1:300)

α-Maus IgG AlexaFluor488

(1:300)

α-Kaninchen IgG AlexaFluor 488

(1:300)

α-Maus IgG AlexaFluor488

(1:300)

Tabelle 5) Konzentrationsangaben für die jeweiligen Konstrukte und Antikörper Kombinationen.

Peptid EGF-Biotin [160 nM] Biotin [160 nM] EGFR-DA [160 nM] QWSSHIFTF [160 nM]

Neutravidin-OregonGreen488 [80 nM] [80 nM] [80 nM] [80 nM]

Material & Methoden

103

unmittelbar vor dem Experiment gewaschen (1 × Minimalmedium). Mithilfe einer 1000µl

Einweg-Pipettenspitze bei exakt senkrechter Haltung wurde unter Aufwendung konstanten

Drucks eine strichförmige Wunde in den Zellrasen eingeführt. Abgelöste Zellen wurden durch

gründliches Waschen entfernt (ca. 5 × mit je 3 ml Minimalmedium). Verwundete Zellen

wurden mit entsprechenden Konstrukten, formuliert in Minimalmedium, inkubiert. Der

Wundverschluss wurde an einem Zeiss Axiovert 100 Mikroskop (5-fache Vergrößerung),

ausgestattet mit einer Canon PowerShot A610, sofort, nach 24h und 48h dokumentiert. Um

sicherzustellen, dass immer derselbe Ausschnitt dokumentiert wird, wurde mittels einer

Kanüle ein Strich senkrecht zur Wunde in die Plastikoberfläche gekratzt, der als

Orientierungshilfe am unteren Bildrand diente. Die Brennweite der Digitalkamera wurde über

einen angeschlossenen Rechner eingestellt, da die Zoomwippe der Kamera keine

reproduzierbaren, identischen Brennweiten lieferte.

Die Auswertung der zellfreien Fläche in Pixel wurde mit dem Programm ImageJ und dem

folgenden Makro vorgenommen:

SetForeground Color (0, 0, 0); run ("Size...", "width=1000 height=750 constrain"); run

("FindEdges"); run ("Log"); run ("Enhance Contrast", "saturated=0.5"); run ("Mean...",

"radius=15 separable"); run ("Threshold"); run ("Despeckle"); run ("FillHoles"); run

("Despeckle"); doWand (500,375); run ("Measure")

Die Differenz der zellfreien Fläche zwischen dem Wert 0h und 24h bzw. 48h nach

Stimulation diente als Maß für die zelluläre Aktivierung.


Minimalmedium: DMEM, 1% v/v Pen/Strep, 1% v/v HEPES (1 M), 1% v/v Hydrocortison,

1% v/v ITS, 1% v/v BSA

Material & Methoden

104

7.1.7 Gentechnische Methoden

7.1.7.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Definierte DNA-Fragmente können mithilfe der PCR in wiederholten Zyklen durch

Verwendung zur Template-DNA komplementärer Oligonukleotide amplifiziert werden. Die

verwendeten Oligonukleotide können darüberhinaus für zusätzliche Informationen kodieren,

die nicht in der eigentlichen Template-DNA vorhanden sind, und so eine zusätzliche

Sequenz an die Termini der ursprünglichen Templatesequenz anhängen (Primer Extensions

PCR). Das Standardprogramm wurde für die meisten PCR-Reaktionen verwendet, wobei die

annealing Temperatur den verwendeten Oligonukeotiden angepasst wurde:

Tabelle 6) Standard-PCR Programm

Zyklen Vorgang Temp. [°C] Zeit [s]

1 Initiale Denaturierung 94°C 180 s

29 Denaturierung 94°C 30 s

annealing 62°C 30 s

Elongation 72°C 60 s/kb template DNA

(Taq)

1 Finaler Elongationsschritt 72°C 600 s

Analytische PCR Reaktionen wurden in einem Volumen von 20 µl, präparative Reaktionen

dagegen in 50 µl durchgeführt. Üblicherweise wurde eine PCR Reaktion nach folgendem

Schema pipettiert:

Tabelle 7) Pipettierschema eines präparativen PCR Ansatzes

Komponenten Menge [µl]

100 ng template DNA x µl

10 × PCR Puffer 5 µl

MgCl2 [25 mM] 5 µl

dNTPs [20 mM] 2 µl

Vorwärtsprimer [5 pmol/µl] 5 µl

Rückwärtsprimer [5 pmol/µl] 5 µl

Taq 0.5 µl

H2O ad 50 µl

Material & Methoden

105

7.1.7.2 DNase I Verdau

10 µg PCR-Produkt wurden mit 0.2 U DNase I in einer PCR-Maschine fragmentiert

(15 °C, 2 min, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MnCl2, 50 µl), die Reaktion wurde durch

Überführung in eiskalte Stoplösung abgestoppt. Generierte Fragmente wurden auf einem

Harnstoffgel analysiert.

Stoplösung: 5 mM EDTA

7.1.7.3 Präparation von Plasmid-DNA

3 ml eine Übernachtkultur wurden sedimentiert, der Überstand verworfen und das

Zellpellet in Lysispuffer resuspendiert. Die Isolation der DNA erfolgte mittels QIAprep Spin

Miniprep Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Alle optionalen Waschschritte wurden

durchgeführt. Abweichend vom Herstellerprotokoll wurde die Zentrifuge bei der Bindung der

DNA an und bei der Elution von der Säule langsam beschleunigt, was einen positiven

Einfluss auf die Ausbeute hatte. DNA wurde mit 20 µl EB-Puffer von der Säule eluiert.

Isolierte Plasmid-DNA wurde bei -20°C gelagert. Typischerweise wurden ca. 10 µg DNA aus

3 ml Kultur isoliert.

EB-Puffer: 10 mM Tris pH 8.8

7.1.7.4 Restriktionsverdau

Für analytische Zwecke wurde 1 µg DNA durch Restriktionsendonukleaseverdau

analysiert. Bei Restriktionsverdauen mit mehreren Enzymen wurde darauf geachtet, dass

nicht mehr als 10 vol% Enzym zum Ansatz gegeben wurden, da sich sonst das Glycerin im

Puffer negativ auf die Aktivität der Enzyme ausüben kann. Gemäß Herstellerangaben wurde

dem Verdau bei Bedarf BSA hinzugefügt

7.1.7.5 Agarose-Gel-Elektrophorese

Die elektrophoretische Auftrennung von DNA Fragmenten zu Analysezwecken wurde

mit Flachbettagarosegelen durchgeführt. Für die Auftrennung von Fragmenten ab ca. 100 bp

aufwärts wurde ein 1% iges (w/v) Agarosegel in TAE Puffer gegossen. Die Agarose wurde in

entsprechendem Volumen TAE Puffer vollständig aufgelöst (Mikrowelle), abgekühlt, mit

Material & Methoden

106

Ethidiumbromid versetzt, und in den vorbereiteten Gelschlitten eingefüllt. Die

aufzutrennenden Proben (typischerweise 1µg DNA) wurden mit 6-fach DNA-Ladepuffer

vermischt. Nach dem Aushärten des Agarosegels wurde das Gel mit den zu analysierenden

proben beladen, ein Größenstandard aufgetragen und in TAE-Laufpuffer bei ca. 100 V

aufgetrennt, bis der untere Blaumarker des Größenstandards den unteren Gelrand erreichte.

Das Gel wurde an einem 254 nm UV-Tisch mittels CCD-Kamera dokumentiert.

TAE-Puffer (50x): 2 M Tris, 1 M Essigsäure, 0.5 M EDTA, pH 8.0

DNA-Ladepuffer (6x): 50 % Glycin, 0.25 % Bromphenolblau und/oder 0.25 % Xylenblau

7.1.7.6 Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

DNA-Fragmente wurden wie voran beschrieben über ein Agarosegel aufgetrennt,

wobei im Unterschied zu analytischen Läufen, die angelegte Spannung auf 80 V und der

Agarosegehalt auf 0.8% (w/v) reduziert wurden. Die Isolation der aufgetrennten Fragmente

erfolgte auf einem langwelligeren UV-Tisch (366 nm), um die Schädigung der DNA zu

minimieren. Das Fragment von Interesse wurde mittels Skalpell aus dem Gel

herausgeschnitten und das Gel anschließend zur Überprüfung auf dem 254 nm UV-Tisch

dokumentiert. Die isolierte DNA wurde mittels QIAquick Gel Extraction Kit aus dem

Agarosegelstück nach Herstellerangaben isoliert.

7.1.7.7 Ligation

Die Ligation von DNA Fragmenten wurde mittels T4-DNA Ligase (1 Unit) gemäß

Herstellerangaben üblicherweise in einem Volumen von 10 µl durchgeführt. Das molare

Verhältnis von Vektor zu Insert wurde auf ca. 1:3 eingestellt. Die Reaktion wurde bei 18°C

über Nacht durchgeführt. Die T4-DNA Ligase wurde durch 20 minütiges Erhitzten auf 65°C

inaktiviert.

Material & Methoden

107

7.1.7.8 Transformation

Chemisch kompetente E.coli XL1-Blue wurden zu Klonierungszwecken aufgetaut, mit

5 µl aus dem Ligationsansatz 30 min auf Eis inkubiert, einem Hitzeschock unterzogen (1 min,

42°C) und nach Zugabe von 1 ml 2xYT 1h inkubiert (37°C, Orbitalschüttler). Für

Proteinexpression wurde die Plasmid-DNA in chemisch kompetente E.coli RV308

transformiert.

2xYT-Medium 16 g/l Bacto-Trypton, 10 g/l Hefe-Extrakt, 5 g/l NaCl

7.1.7.9 Kinasierung von Oligonukleotiden

Da synthetisierte Oligonukleotide keine 5´-Phosphatgruppe aufweisen, müssen diese

zunächst kinasiert werden. Hybridisierte Oligonukleotide wurden mit 10 U T4-

Polynukleotidkinase in einem mit 10 x Ligase-Puffer versehenen 15 µl Ansatz 30 min bei

37°C inkubiert und abschließend hitzeinaktiviert (65°C, 15 min). Die Fragmenten konnten

direkt für eine Ligation eingesetzt werden.

T4 DNA-Ligase Puffer (10x): 400 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT,

5 mM ATP

7.1.7.10 Hybidisierung komplementärer Oligonukleotide

Für die Hybridisierung einzelsträngiger, komplementärer Oligonukleotide zu

doppelsträngigen Fragmenten wurde kochendes Wasser in eine Thermoskanne gefüllt, das

Eppendorfreaktionsgefäß in einem Schwimmer hineingegeben, das Gefäß verschlossen und

über Nacht bei 4°C gelagert.

7.1.7.11 Dephosphorylierung von Plasmidvektoren

Um die Religation des Vektors ohne Insert-DNA zu verhindern wurden die terminalen

Phosphatgruppen mittels Shrimp alkalischer Phosphatase (SAP) abgespalten.

Typischerweise erfolgte die Dephosphorylierung in einem 50 µl Ansatz, versetzt mit DNA, 2

U SAP und 10 x SAP-Puffer für 1 h bei 37°C.

SAP-Puffer (10x): 0.1 M Tris-HCl, 0.1M MgCl2, 1 mg/ml BSA, pH 7.5

Material & Methoden

108

7.2 Material

7.2.1 Zelllinien

A431 humane Tumorzelllinie, (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und

Zellkulturen GmbH, Braunschweig, DSMZ-Nr. ACC 91; ATCC, Manassas, VA, USA)

7.2.2 Bakterienstämme

RV308: E. coli K12-Derivat (DSMZ); su-, ∆lacX74, galISII::OP308, rpsL

XL1-Blue: E. coli K12-Derivat (Stratagene); recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44

relA1 lac [F' proAB lacIq ZΔM15 Tn10 (TetR)]

BL21 E. coli K12 Derivat (Stratagene)

7.2.3 Nährmedien

Luria-Bertani (LB)-Medium 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Hefe-Extrakt, 5 g/l NaCl

LB-Agar-Platten 15 g Bacto-Agar/l LB-Medium

2xYT-Medium 16 g/l Bacto-Trypton, 10 g/l Hefe-Extrakt, 5 g/l NaCl

Vollmedium DMEM, 10% v/v FKS, 1% v/v Glutamin,

1% v/v Pen/Strep

Minimalmedium DMEM, 1% v/v Pen/Strep, 1% v/v HEPES (1 M), 1% v/v

Hydrocortison, 1% v/v ITS, 1% v/v BSA

7.2.4 Rekombinante DNA-Technik

Puffer für Restriktionsverdau e NEB und Fermentas Puffersysteme

BSA Stocklösung (100x) NEB

ATP Sigma Aldrich

EB-Puffer 10 mM Tris pH 8.8

Restriktionsenzyme NEB und Fermentas

Polymerasen Vent-DNA-Polymerase, Fermentas

Taq-Polymerase, Genaxxon

Shrimp Alkalische Phosphatase (SAP) Fermentas

Material & Methoden

109

SAP-Puffer (10x) Fermentas

T4 Polynukleotid-Kinase (PNK) Fermentas

T4 DNA-Ligase Fermentas

T4 DNA-Ligase Puffer (10x) 400 mM TrisHCl, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT,

5 mM ATP

TAE-Puffer (50x) 2 M Tris, 1 M Essigsäure, 0.5 M EDTA, pH 8.0

DNA-Ladepuffer (6x) 50 % Glycin, 0.25 % Bromphenolblau und/oder

0.25 % Xylenblau

QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen

QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen

QIAquick PCR Purification Kit Qiagen

7.2.5 Antikörper

Kaninchen-anti-CAT-IgG Sigma

Maus-anti-Bla-IgG THP Medical Products

Ziege-Anti-Kaninchen-IgG Alexa-Fluor 488 Molecular Probes

Ziege-Anti-Maus-IgG Alexa-Fluor 488 Molecular Probes

Anti-Kaninchen-IgG-HRP Santa Cruz Biotechnology

7.2.6 Puffer

7.2.6.1 Allgemein

PBS 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.5

Na-P Puffer 20 mM Na-P, 125 mM NaCl, pH 7.2

HEPES Puffer 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4

7.2.6.2 sEGF-R Reinigung

Zellaufschlusspuffer 20 mM Na-P, 0.3 M NaCl, pH 7.2

Waschpuffer P1 20 mM Na-P, 500 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.1% Triton-X-

100, pH 6.5

Waschpuffer P2 20 mM Na-P, 500 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 6.5

Material & Methoden

110

Elutionspuffer 100 M Glycin-HCl, 0.1 mM EDTA, 500 mM NaCl, pH 2.0

Natriumphosphatpuffer 20 mM Na-P, 25 mM NaCl, pH 7.2

7.2.6.3 Reinigung der CAT-Fusionsproteine

● Affinitätschromatographie:

Lade- und Resuspensionspuffer 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1mM DTT, 1 mM EDTA, pH

7.2

Elutionspuffer 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA,

5 mM Cm, pH 7.2

● Gelfiltration: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4

7.2.6.4 Reinigung der GST-Fusionsproteine

Bindepuffer 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.5

Elutionspuffer 50 mM Tris-HCl, 10 mM Glutathion, reduziert, pH8.0

7.2.6.5 Reinigung der β-Laktamase Fusionsproteine

TES: 100 mM Tris-HCl, 500 mM Sucrose, 1 mM EDTA, pH 8.0

Equilibrierungspuffer 20 mM Na-P, 0.5 M NaCl, pH 7.2

Ladepuffer 20 mM Na-P, 0.5 M NaCl, pH 7.2

Elutionspuffer 20 mM Na-P, 0.5 M NaCl, 0.5 M Borat, pH 7.2

Dialysepuffer 20 mM Na-P, 125 m M NaCl, pH 7.2

7.2.6.6 SDS-Gelelektrophorese

SDS-Auftragspuffer (5x) 250 mM TrisHCl, 50% (v/v) Glycerin, 10% (w/v) SDS,

0.5% (w/v) Bromphenolblau, 500 mM DTT

Laufpuffer (5x) 125 mM TrisHCl, 1 M Glycin, 20% SDS, pH 8.5

Coomassie-Färbelösung 0.05% (w/v) Coomassie Brilliantblau R-250, 10% (v/v)

Essigsäure, 4% (v/v) Isopropanol

Coomassie-Entfärberlösung 20% (v/v) Essigsäure in H2O

Material & Methoden

111

7.2.7 Säulen und Säulenmaterial

GSTrap HP, 1 ml Amersham

Chloramphenicol-Caproat Agarose Sigma

Phenylboronat MoBiTec

Reversed Phase Säulen:

Jupiter 4u Proteo 90A, 250 x 4.6 mm Phenomenex

Jupiter 4u Proteo 90A, 250 x 10 mm Phenomenex

Superdex 200 Gelfiltrationssäule GE Healthcare

7.2.8 Geräte und Software

Beckman J6, Rotor JS4.2 Beckman Coulter

Sorvall RC-5B Rotor SS 34/ Rotor GS 3 Du Pont Instruments

Varifuge 3.0 R Swingout-Rotor Heraeus Sepatech

Centrifuge 5702 Ausschwingrotor A-4-38 Eppendorf

Centrifuge 5417C Rotor F45-30-11 (Tischzentrifuge) Eppendorf

Microlite Rotor IEC 851 (Tischzentrifuge) ThermoIEC

Schüttelplattform GFL 3015 GFL

Thermoschüttler, KTMR 133 HLC

Orbitalschüttler G25 Incubator Shaker New Brunswick Scientific

Rolltisch Schütt

Sonifizierer Branson

PCR-Maschine Mastercycler gradient Eppendorf

UV/Visible Photometer V-550 Jasco

ESI-Massensppektrometer MAT TSQ 700 Finnigan

Brutschrank Heraeus

Heizblock ORI-Block OB-3 Techne

Labovert FS Leitz

LSM 510 UV, konfokales, inverses Mikroskop Zeiss

Flachbettgelapparatur EC classic ThermoEC

SDS-PAGE-Kammer Amersham

Mikrotiterplattenleser Sunrise Tecan

pH-Meter, Microprocessor pH 537 WTW

Sequenzierautomat,

Material & Methoden

112

ABI Prism TM 310 Genetic Analyser Applied Biosystems

HPLC-Anlage, Äkta Purifier Amersham Pharmacia Biotech

Pipetten Gilson, Pipetman

Vortexer Vortex Genie 2

Sotware:

Autodock4: Garret M. Morris, http://autodock.scripps.edu/

MacPyMOL: A PyMOL-based Molecular Graphics Application for MacOS X (2007),

DeLano Scientific LLC, Palo Alto, CA, USA. http://www.pymol.org

Tecan Xreadplus, Tecan

Carl Zeiss AIM, LSM Image Browser, Zeiss

BIAevaluation, BIAcore (GE Healthcare)

GCG, Accelrys, Cambridge United Kingdom

7.2.9 Chemikalien

ABTS Roche

Acrylamid/Bisacrylamid (30:0.8) Roth

Agarose Gibco BRL

Ammoniumperoxosulfat (APS) Sigma, Merck

Ampicillin Roth

Bacto-Agar Difco

Bacto-Hefeextrakt Difco

Bacto-Trypton Difco

Borsäure Roth

Bradford-Reagenz BioRad

Bromphenolblau LKB

Calciumchlorid Sigma

Chitin Beads Sigma

Chloramphenicol Sigma

Chloramphenicol Caproat-Agarose Sigma

Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) Amersham

Coomassie Brilliant-Blau R-250 Serva

Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma

Dinatriumhydrogencarbonat Merck

Dithiothreitol (DTT) Biomol

Material & Methoden

113

DMEM/F12-Mix Gibco

Essigsäure Roth

Ethanol Roth

Ethidiumbromid Roth

Ethylendiammoniumtetraacetat (EDTA) Sigma

fetales Kälberserum (FKS) Gibco

Glutamin Gibco

Glutaraldehyd Fluka

Glycerin Merck

Glycin Merck

Hepes Gibco

Hoechst 33342 Molecular Probes

Hydrocortison Sigma

Insulin Transferrin Selenium-X-Supplement (ITS) Gibco

Isopropanol Roth

Kaliumacetat Roth

Kaliumdihydrogenphosophat Merck

Magnesiumchlorid Roth

Manganchlorid Merck

Natriumchlorid Roth

Natriumdodecylsulfat (SDS) Roth

Natriumdihydrogenphosphat Merck

Natriumhydrogencarbonat Merck

Natriumhydroxid Roth

N, N, N’, N’-Tetramethylethyldiamin (TEMED) Sigma

Penicillin/Streptomycin Gibco

Rinderserumalbumin Fraktion V (BSA) Roth/Sigma

RPMI 1640 Gibco

Rubidiumchlorid Sigma

Saccharose Roth

Salzsäure Roth

Sephadex G-50 Amersham

Tetracyclin Sigma

Tris-Base Roth

Trypsin Sigma

Tween20 Sigma

Xylencyanol LKB

Material & Methoden

114

7.2.10 Allgemeine Plastikware

1/2 Mikro Einmalküvette Ratiolab

1.5 ml PP-Reaktionsgefäße Nerbe

2.0 ml PP-Reaktionsgefäße Nerbe

15 ml PP-Reaktionsgefäße Greiner

50 ml PP-Reaktionsgefäße Greiner

0.5 ml PCR-Reaktionsgefäße (dünnwandig) Roth

0.2 ml PCR-Reaktionsgefäße (ohne Deckel) PEQLAB

Petrischalen 94/16 mm Greiner

Spritzen (5, 10, 20 ml) Braun

Rotilabo Spritzenfilter (0.22/0.45 µm) Roth

Pipettenspitzen Roth

Petrischalen 6/10 cm Greiner

6-well-Platte Greiner

Gewebekulturflaschen 25 cm2, 175 cm2 Greiner

F96 Maxisorb Nunc Immuno Platte Nunc

Combitips plus 10 ml Eppendorf

Dialyseschläuche (Ausschlussgröße 10 000 Da) Roth

Whatman-Papier 3M

Vivaspin 500 Vivascience Sartorius

Vivaspin 4 Vivascience Sartorius

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Anhang

123

9 Anhang

9.1 Abkürzungen Abb. Abbildung

ABTS 2,2’-Azino-di-3-Ethylbenzthiazolin-Sulfonat

Amp Ampicillin

APS Ammoniumperoxodisulfat

AS Aminosäure

ATP Adenosintriphosphat

Bla β-Lactamase-Protein

bla β-Lactamase-Gen

Bp Basenpaare

BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumine)

CAT Chloramphenicol-Acetyltransferase-Protein

cat Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen

Da Dalton

DAPI 4,6’-Diamidino-2-phenylindol

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

DNase Desoxyribonuklease

dNTPs Desoxyribonukleotidtriphosphate

dsDNA doppelsträngige DNA

DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und

Zellkulturen

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EGF epidermaler-Wachstumsfaktor

EGF-R epidermaler-Wachstumsfaktor-Rezeptor

sEGF-R lösliche, sekretierte Variante des EGF-R

Ax Absorption bei x nm

EtBr Ethidiumbromid

FKS Fetales Kälberserum (fetal calf serum)

FITC Fluorescein-5-Isothiocyanat

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

ITS Insulin Transferrin Selenium

× g Mehrfaches der Gravitation

Anhang

124

KOAc Kaliumacetat

LB Luria-Bertani

Lsg. Lösung

M Molar (mol/l)

MOPS 3-Morpholinopropansulfonsäure

OD Optische Dichte

PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)

PP Polypropylen

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease

RT Raumtemperatur (etwa 25 °C)

SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)

TBE Tris-Borat-EDTA

TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin

TFB Transformationspuffer (transformation buffer)

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

UPM Umdrehungen pro Minute

u Unit

v/v Volumen pro Volumen (volume per volume)

w/v Gewicht pro Volumen (weight per volume)

wt Wildtyp

Anhang

125

9.2 Plasmidkarten

M13KE_SmaI:

(Circular) (MinSite=6) MAP of: M13ke_SmaI.seq check: 5466 from: 1 to: 7238

M13KE VECTOR CONTAINING A NEWLY DESIGNED OLIGO (NOT INGKES)

TO INTRODUCE SmaI SITE INTO Acc65I and EagI opened M13KE

Vector contains NO Cys flanking the SmaI site

Using Enzyme data from: ~/../gcg_data/kk_annot_rebase.txt FileCheck: 6152

REBASE version 305 gcgenz.305

=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=

REBASE, The Restriction Enzyme Database http://rebase.neb.com

Copyright (c) Dr. Richard J. Roberts, 2003. All rights reserved.

=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=

Rich Roberts Apr 30 2003 . . .

Using translation scheme from: ~/../gcg_data/kk_translate1.txt FileCheck: 3604

met atg and val gtg as start codon modified by K. Mueller

Standard Translation Table

With 390 enzymes: *

MinOpen: 25 MaxCuts: 2

April 12, 19107 11:57 ..

AATGCTACTACTATTAGTAGAATTGATGCCACCTTTTCAGCTCGCGCCCCAAATGAAAATATAGCTAAACAGGTTATTGACCATTTGCGAAATGTATCTA

1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100

a N A T T I S R I D A T F S A R A P N E N I A K Q V I D H L R N V S N -

ATGGTCAAACTAAATCTACTCGTTCGCAGAATTGGGAATCAACTGTTACATGGAATGAAACTTCCAGACACCGTACTTTAGTTGCATATTTAAAACATGT

101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200

a G Q T K S T R S Q N W E S T V T W N E T S R H R T L V A Y L K H V -

TGAGCTACAGCACCAGATTCAGCAATTAAGCTCTAAGCCATCCGCAAAAATGACCTCTTATCAAAAGGAGCAATTAAAGGTACTCTCTAATCCTGACCTG

201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

a E L Q H Q I Q Q L S S K P S A K M T S Y Q K E Q L K V L S N P D L -

XmnI

|

TTGGAGTTTGCTTCCGGTCTGGTTCGCTTTGAAGCTCGAATTAAAACGCGATATTTGAAGTCTTTCGGGCTTCCTCTTAATCTTTTTGATGCAATCCGCT

301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400

a L E F A S G L V R F E A R I K T R Y L K S F G L P L N L F D A I R F -

TTGCTTCTGACTATAATAGTCAGGGTAAAGACCTGATTTTTGATTTATGGTCATTCTCGTTTTCTGAACTGTTTAAAGCATTTGAGGGGGATTCAATGAA

401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500

a A S D Y N S Q G K D L I F D L W S F S F S E L F K A F E G D S M N -

TATTTATGACGATTCCGCAGTATTGGACGCTATCCAGTCTAAACATTTTACTATTACCCCCTCTGGCAAAACTTCTTTTGCAAAAGCCTCTCGCTATTTT

501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600

a I Y D D S A V L D A I Q S K H F T I T P S G K T S F A K A S R Y F -

GGTTTTTATCGTCGTCTGGTAAACGAGGGTTATGATAGTGTTGCTCTTACTATGCCTCGTAATTCCTTTTGGCGTTATGTATCTGCATTAGTTGAATGTG

601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700

a G F Y R R L V N E G Y D S V A L T M P R N S F W R Y V S A L V E C G -

GTATTCCTAAATCTCAACTGATGAATCTTTCTACCTGTAATAATGTTGTTCCGTTAGTTCGTTTTATTAACGTAGATTTTTCTTCCCAACGTCCTGACTG

701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800

a I P K S Q L M N L S T C N N V V P L V R F I N V D F S S Q R P D W -

GTATAATGAGCCAGTTCTTAAAATCGCATAAGGTAATTCACAATGATTAAAGTTGAAATTAAACCATCTCAAGCCCAATTTACTACTCGTTCTGGTGTTT

801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900

a Y N E P V L K I A * -

CTCGTCAGGGCAAGCCTTATTCACTGAATGAGCAGCTTTGTTACGTTGATTTGGGTAATGAATATCCGGTTCTTGTCAAGATTACTCTTGATGAAGGTCA

901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000

a M S S F V T L I W V M N I R F L S R L L L M K V S -

BsrGI

|

GCCAGCCTATGCGCCTGGTCTGTACACCGTTCATCTGTCCTCTTTCAAAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTTATGATTGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCT

1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100

a Q P M R L V C T P F I C P L S K L V S S V P L * -

BsaBI

|

AAGTAACATGGAGCAGGTCGCGGATTTCGACACAATTTATCAGGCGATGATACAAATCTCCGTTGTACTTTGTTTCGCGCTTGGTATAATCGCTGGGGGT

1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200

a M E Q V A D F D T I Y Q A M I Q I S V V L C F A L G I I A G G -

Anhang

126

SnaBI BspHI

| |

CAAAGATGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTCGCCTCTTTCGTTTTAGGTTGGTGCCTTCGTAGTGGCATTACGTATTTTACCCGTTTAATGGAAACTTCCTC

1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300

a Q R * -

BbvCI

|

ATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCTCTGTAGCCGTTGCTACCCTCGTTCCGATGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGATCCCGCAAAAGCGGCCT

1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400

a -

BbvCI

|

TTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATGCGTGGGCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAA

1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500

a -

ATTCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAA

1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600

a V K K L L F A I -

SmaI

KpnI AvaI |

Acc65I | XmaI | EagI

| | | | |

TTCCTTTAGTGgtacctttctattctcactctgcccccgggggatcGGCCGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAATCCCATACAGAAAATTCATTTAC

1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700

a P L V V P F Y S H S A P G G S A E T V E S C L A K S H T E N S F T -

BsmI

|

TAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGTTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTAGTTTGTACTGGTGACGAAACT

1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800

a N V W K D D K T L D R Y A N Y E G C L W N A T G V V V C T G D E T -

CAGTGTTACGGTACATGGGTTCCTATTGGGCTTGCTATCCCTGAAAATGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTG

1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900

a Q C Y G T W V P I G L A I P E N E G G G S E G G G S E G G G S E G G -

EciI

|

GCGGTACTAAACCTCCTGAGTACGGTGATACACCTATTCCGGGCTATACTTATATCAACCCTCTCGACGGCACTTATCCGCCTGGTACTGAGCAAAACCC

1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000

a G T K P P E Y G D T P I P G Y T Y I N P L D G T Y P P G T E Q N P -

BseRI

|

CGCTAATCCTAATCCTTCTCTTGAGGAGTCTCAGCCTCTTAATACTTTCATGTTTCAGAATAATAGGTTCCGAAATAGGCAGGGGGCATTAACTGTTTAT

2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100

a A N P N P S L E E S Q P L N T F M F Q N N R F R N R Q G A L T V Y -

Bme1580I

|

ACGGGCACTGTTACTCAAGGCACTGACCCCGTTAAAACTTATTACCAGTACACTCCTGTATCATCAAAAGCCATGTATGACGCTTACTGGAACGGTAAAT

2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200

a T G T V T Q G T D P V K T Y Y Q Y T P V S S K A M Y D A Y W N G K F -

AlwNI BstYI

| |

TCAGAGACTGCGCTTTCCATTCTGGCTTTAATGAAGATCCATTCGTTTGTGAATATCAAGGCCAATCGTCTGACCTGCCTCAACCTCCTGTCAATGCTGG

2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300

a R D C A F H S G F N E D P F V C E Y Q G Q S S D L P Q P P V N A G -

CGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGAGGCGGTTCCGGTGGT

2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400

a G G S G G G S G G G S E G G G S E G G G S E G G G S E G G G S G G -

GGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAGATGGCAAACGCTAATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACAGTCTGACGCTA

2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500

a G S G S G D F D Y E K M A N A N K G A M T E N A D E N A L Q S D A K -

FalI ClaI

| |

AAGGCAAACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTTCCGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGTGA

2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600

a G K L D S V A T D Y G A A I D G F I G D V S G L A N G N G A T G D -

XmnI

|

TTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGGCTCAAGTCGGTGACGGTGATAATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTTCCCTCCCTCAATCG

2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700

a F A G S N S Q M A Q V G D G D N S P L M N N F R Q Y L P S L P Q S -

Anhang

127

AfeI BtgI

| |

GTTGAATGTCGCCCTTTTGTCTTTAGCGCTGGTAAACCATATGAATTTTCTATTGATTGTGACAAAATAAACTTATTCCGTGGTGTCTTTGCGTTTCTTT

2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800

a V E C R P F V F S A G K P Y E F S I D C D K I N L F R G V F A F L L -

MslI

|

TATATGTTGCCACCTTTATGTATGTATTTTCTACGTTTGCTAACATACTGCGTAATAAGGAGTCTTAATCATGCCAGTTCTTTTGGGTATTCCGTTATTA

2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900

a Y V A T F M Y V F S T F A N I L R N K E S * -

TTGCGTTTCCTCGGTTTCCTTCTGGTAACTTTGTTCGGCTATCTGCTTACTTTTCTTAAAAAGGGCTTCGGTAAGATAGCTATTGCTATTTCATTGTTTC

2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000

a -

CspCI CspCI AfeI

| | |

TTGCTCTTATTATTGGGCTTAACTCAATTCTTGTGGGTTATCTCTCTGATATTAGCGCTCAATTACCCTCTGACTTTGTTCAGGGTGTTCAGTTAATTCT

3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100

a -

CCCGTCTAATGCGCTTCCCTGTTTTTATGTTATTCTCTCTGTAAAGGCTGCTATTTTCATTTTTGACGTTAAACAAAAAATCGTTTCTTATTTGGATTGG

3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200

a -

TaqII

|

GATAAATAATATGGCTGTTTATTTTGTAACTGGCAAATTAGGCTCTGGAAAGACGCTCGTTAGCGTTGGTAAGATTCAGGATAAAATTGTAGCTGGGTGC

3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300

a M A V Y F V T G K L G S G K T L V S V G K I Q D K I V A G C -

AAAATAGCAACTAATCTTGATTTAAGGCTTCAAAACCTCCCGCAAGTCGGGAGGTTCGCTAAAACGCCTCGCGTTCTTAGAATACCGGATAAGCCTTCTA

3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400

a K I A T N L D L R L Q N L P Q V G R F A K T P R V L R I P D K P S I -

TATCTGATTTGCTTGCTATTGGGCGCGGTAATGATTCCTACGATGAAAATAAAAACGGCTTGCTTGTTCTCGATGAGTGCGGTACTTGGTTTAATACCCG

3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500

a S D L L A I G R G N D S Y D E N K N G L L V L D E C G T W F N T R -

TTCTTGGAATGATAAGGAAAGACAGCCGATTATTGATTGGTTTCTACATGCTCGTAAATTAGGATGGGATATTATTTTTCTTGTTCAGGACTTATCTATT

3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600

a S W N D K E R Q P I I D W F L H A R K L G W D I I F L V Q D L S I -

GTTGATAAACAGGCGCGTTCTGCATTAGCTGAACATGTTGTTTATTGTCGTCGTCTGGACAGAATTACTTTACCTTTTGTCGGTACTTTATATTCTCTTA

3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700

a V D K Q A R S A L A E H V V Y C R R L D R I T L P F V G T L Y S L I -

TTACTGGCTCGAAAATGCCTCTGCCTAAATTACATGTTGGCGTTGTTAAATATGGCGATTCTCAATTAAGCCCTACTGTTGAGCGTTGGCTTTATACTGG

3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800

a T G S K M P L P K L H V G V V K Y G D S Q L S P T V E R W L Y T G -

TAAGAATTTGTATAACGCATATGATACTAAACAGGCTTTTTCTAGTAATTATGATTCCGGTGTTTATTCTTATTTAACGCCTTATTTATCACACGGTCGG

3801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900

a K N L Y N A Y D T K Q A F S S N Y D S G V Y S Y L T P Y L S H G R -

BsaBI

|

TATTTCAAACCATTAAATTTAGGTCAGAAGATGAAATTAACTAAAATATATTTGAAAAAGTTTTCTCGCGTTCTTTGTCTTGCGATTGGATTTGCATCAG

3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4000

a Y F K P L N L G Q K M K L T K I Y L K K F S R V L C L A I G F A S A -

TATA_box->

TATA_box-> | EarI

| | |

CATTTACATATAGTTATATAACCCAACCTAAGCCGGAGGTTAAAAAGGTAGTCTCTCAGACCTATGATTTTGATAAATTCACTATTGACTCTTCTCAGCG

4001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4100

a F T Y S Y I T Q P K P E V K K V V S Q T Y D F D K F T I D S S Q R -

PacI

|

TCTTAATCTAAGCTATCGCTATGTTTTCAAGGATTCTAAGGGAAAATTAATTAATAGCGACGATTTACAGAAGCAAGGTTATTCACTCACATATATTGAT

4101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200

a L N L S Y R Y V F K D S K G K L I N S D D L Q K Q G Y S L T Y I D -

TTATGTACTGTTTCCATTAAAAAAGGTAATTCAAATGAAATTGTTAAATGTAATTAATTTTGTTTTCTTGATGTTTGTTTCATCATCTTCTTTTGCTCAG

4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4300

a L C T V S I K K G N S N E I V K C N * -

GTAATTGAAATGAATAATTCGCCTCTGCGCGATTTTGTAACTTGGTATTCAAAGCAATCAGGCGAATCCGTTATTGTTTCTCCCGATGTAAAAGGTACTG

4301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4400

a -

Anhang

128

TTACTGTATATTCATCTGACGTTAAACCTGAAAATCTACGCAATTTCTTTATTTCTGTTTTACGTGCTAATAATTTTGATATGGTTGGTTCAATTCCTTC

4401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4500

a -

CATAATTCAGAAGTATAATCCAAACAATCAGGATTATATTGATGAATTGCCATCATCTGATAATCAGGAATATGATGATAATTCCGCTCCTTCTGGTGGT

4501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4600

a -

AclI

|

TTCTTTGTTCCGCAAAATGATAATGTTACTCAAACTTTTAAAATTAATAACGTTCGGGCAAAGGATTTAATACGAGTTGTCGAATTGTTTGTAAAGTCTA

4601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4700

a -

Bme1580I

BsiHKAI

ApaLI |

| |

ATACTTCTAAATCCTCAAATGTATTATCTATTGACGGCTCTAATCTATTAGTTGTTAGTGCACCTAAAGATATTTTAGATAACCTTCCTCAATTCCTTTC

4701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4800

a -

AlfI

|

TACTGTTGATTTGCCAACTGACCAGATATTGATTGAGGGTTTGATATTTGAGGTTCAGCAAGGTGATGCTTTAGATTTTTCATTTGCTGCTGGCTCTCAG

4801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4900

a -

CGTGGCACTGTTGCAGGCGGTGTTAATACTGACCGCCTCACCTCTGTTTTATCTTCTGCTGGTGGTTCGTTCGGTATTTTTAATGGCGATGTTTTAGGGC

4901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5000

a -

MscI

|

TATCAGTTCGCGCATTAAAGACTAATAGCCATTCAAAAATATTGTCTGTGCCACGTATTCTTACGCTTTCAGGTCAGAAGGGTTCTATCTCTGTTGGCCA

5001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5100

a -

Tzip->

|

GAATGTCCCTTTTATTACTGGTCGTGTGACTGGTGAATCTGCCAATGTAAATAATCCATTTCAGACGATTGAGCGTCAAAATGTAGGTATTTCCATGAGC

5101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5200

a -

GTTTTTCCTGTTGCAATGGCTGGCGGTAATATTGTTCTGGATATTACCAGCAAGGCCGATAGTTTGAGTTCTTCTACTCAGGCAAGTGATGTTATTACTA

5201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5300

a -

PsiI

|

ATCAAAGAAGTATTGCTACAACGGTTAATTTGCGTGATGGACAGACTCTTTTACTCGGTGGCCTCACTGATTATAAAAACACTTCTCAAGATTCTGGCGT

5301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5400

a -

BsiHKAI

|

ACCGTTCCTGTCTAAAATCCCTTTAATCGGCCTCCTGTTTAGCTCCCGCTCTGATTCCAACGAGGAAAGCACGTTATACGTGCTCGTCAAAGCAACCATA

5401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5500

a -

f1-ori-|

f1ori_IG5'|

||

GTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCT

5501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5600

a -

f1ori_DNA5'

NaeI |

BsrFI | |

NgoMIV | | BanII

| | | |

TTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCG

5601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5700

a V L Y G T S -

AloI

PpiI

TaqII DraIII f1ori_DNA3' | DrdI

| | | | |

ACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAG

5701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5800

a T P K N L I W V M V H V V G H R P D R R F F A L * V -

Anhang

129

AloI

PpiI AvaI PsiI

| | |

TGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGAACCACCATCAAACAGG

5801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5900

a D S C S K L E Q H S T L S R A I L L I Y K G F C R F R N H H Q T G -

BsmBI

|

ATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCGCTGGTGAA

5901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6000

a F S P A G A N Q R G P L A A T L S G P G G E G Q S A V A R L A G E -

BbeI

SfoI |

BsaHI| |

NarI| |

KasI|| |

||| |

AAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGC

6001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6100

a K K N H P G A Q Y A N R L S P R V G R F I N A A G T T G F P T G K R -

lacO1->

mRNA_lac->

-35lac-| -10lac-| |

lacI-|BtsI CAP-> CAP-| -35lac-> | -10lac-> | |

| | | | | | | | |

GGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG

6101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6200

a A V S A T Q L M * -

EcoO109I

PpuMI

PstI|

lacO1-| S/DI-> lacZ'-> HindIII SphI SbfI| EcoRI

| | | | | || |

AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGT

6201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6300

a M T M I T P S L H A C R S S N S L A V V L Q R -

BmrI EarI PvuI

| | |

CGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCC

6301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6400

a R D W E N P G V T Q L N R L A A H P P F A S W R N S E E A R T D R P -

FspI BglI Bsu36I

| | |

CTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGA

6401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6500

a S Q Q L R S L N G E W R F A W F P A P E A V P E S W L E C D L P E -

BpmI

Eco57MI EciI TstI

| | |

GGCCGATACGGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTAACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTT

6501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6600

a A D T V V V P S N W Q M H G Y D A P I Y T N V T Y P I T V N P P F -

BtgI TstI

| |

GTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTC

6601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6700

a V P T E N P T G C Y S L T F N V D E S W L Q E G Q T R I I F D G V P -

f1ori_IG3'

AclI SwaI

| |

CTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTAAATATTTGCTTATACAATCTTCCTG

6701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6800

a I G * -

BpmI

Eco57MI

ClaI|

||

TTTTTGGGGCTTTTCTGATTATCAACCGGGGTACATATGATTGACATGCTAGTTTTACGATTACCGTTCATCGATTCTCTTGTTTGCTCCAGACTCTCAG

6801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6900

a -

BglII

BstYI MslI

| |

GCAATGACCTGATAGCCTTTGTAGATCTCTCAAAAATAGCTACCCTCTCCGGCATTAATTTATCAGCTAGAACGGTTGAATATCATATTGATGGTGATTT

6901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 7000

a -

GACTGTCTCCGGCCTTTCTCACCCTTTTGAATCTTTACCTACACATTACTCAGGCATTGCATTTAAAATATATGAGGGTTCTAAAAATTTTTATCCTTGC

7001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 7100

a -

Anhang

130

GTTGAAATAAAGGCTTCTCCCGCAAAAGTATTACAGGGTCATAATGTTTTTGGTACAACCGATTTAGCTTTATGCTCTGAGGCTTTATTGCTTAATTTTG

7101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 7200

a -

CTAATTCTTTGCCTTGCCTGTATGATTTATTGGATGTT

7201 ---------+---------+---------+-------- 7238

a M I Y W M -

Enzymes that do cut and were not excluded:

lacI-| CAP-> CAP-| -35lac-> -35lac-| -10lac-> -10lac-| lacO1-> lacO1-| mRNA_lac-> S/DI-> lacZ'-> Tzip->

f1ori_IG5' f1ori_IG3' f1ori_DNA5' f1ori_DNA3' TATA_box-> f1-ori-| Acc65I AclI AfeI AlfI AloI

AlwNI ApaLI AvaI BanII BbeI BbvCI BglI BglII Bme1580I BmrI BpmI BsaBI BsaHI

BseRI BsiHKAI BsmI BsmBI BspHI BsrFI BsrGI BstYI Bsu36I BtgI BtsI ClaI CspCI

DraIII DrdI EagI EarI EciI Eco57MI EcoO109I EcoRI FalI FspI HindIII KasI KpnI

MscI MslI NaeI NarI NgoMIV PacI PpiI PpuMI PsiI PstI PvuI SbfI SfoI

SmaI SnaBI SphI SwaI TaqII TstI XmaI XmnI

Enzymes that do not cut:

lacI-> tHP-> tHP-| lacZ-| S/DII-> SD-2-> T7g10up1-> T7g10up1-| T7g10up2-> T7g10up2-| T7g10SD-> T7g10SD-|

T7g10SDs-> T7g10SDs-| OmpA-> OmpA-| pelB-> pelB-| pelB_Sfi-| pelB_FseNot-> pelB_FseNot-| phoA-> phoA-|

sFLAG-> sFLAG-| sFLAG_Eco-| lFLAG-> lFLAG-| glyli1-> glyli1-| glyli2-> glyli2-| glyli3-> glyli3-| glyli4->

glyli4-| linkerA-> linkerA-| linkerB-> linkerB-| McPC_VH-> McPC_VH-| McPC_VL-> McPC_VLm-> McPC_VL-| McPCconst->

McPCconst-| 425_VH-> 425_VH-| 425_VL-> 425-VL1-| 425-VL2-| M1-VH-> M1-VH-| M1-VHm-| M1-VLs-> M1-VLl-> M1-VL-|

hinge_v1-> hinge_v1-| hinge_v2-> hinge_v2-| hinge_v3-> hinge_v3-| hinge_v4-> hinge_v4-| zip-> zip-| Tzip-|

dhlx-> dhlx-| trimA-> trimA-| trimB-> trimB-| trimC-> trimC-| polzip-> polzip-| lacrepE-> lacrepE-| lacrepK->

lacrepK-| hetROPa-> hetROPa-| loopnewa-> loopnewa-| hetROPb-> hetROPb-| loopnewb-> loopnewb-| CH1-> CH1-|

CL-> CL-| biot37-> biot37-| biot54-> biot54-| groES-> groES-| p53-> p53-| spacer2-> spacer2-| spacer3->

spacer3-| his5-> his5-| his5EG-> his5EG-| his5-> his5-| his6-> his6-| lpp-> lpp-| T7term-> T7term-|

hok/sok_ins5' hok/sok_ins3' hok/sok5' hok/sok3' hok5' hok3' sok5' sok3' parB5' parB3' skp_cas5'

skp_cas3' skp5' skp3' bla_sig-> bla_sig-| bla-> bla-| CAT-> CAT-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori->

<-ori_ini ori_rep5' ori_rep3' ori_rep_wt3' WinZipA1-> WinZipA1-| WinZipA2-> WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2->

WinZipB2-| DHFR[1]-> DHFR[1]-| DHFR[2]-> DHFR[2]-| dummy-> dummy-| CATdel6-| CATdel8-| CATdel9-| CATdel11-| CATdel4->

CATdel7-> CATdel11-> EGFP-> F64L S65T H231L EGFP-| transcript_start enhancer_region-> enhancer_region-|

transl_ini-> transl_ini-| f1_ori-> SV40_ori-> SV40_ori-| pUC_ori-> PUC_ori-| CMV_promoter-> CMV_promoter-| mRNA_3'_end

Kan/Neo-R-> Kan/Neo-R-| AarI AatII AccI AcuI AflII AgeI AhdI AleI ApaI AscI

AsiSI AvrII BamHI BbsI BcgI BciVI BclI BfrBI BlpI BmgBI BmtI BplI BsaI

BsgI BsiWI BspEI BssHII BssSI BstAPI BstBI BstEII BstXI BstZ17I EcoICRI EcoNI EcoRV

FseI FspAI HincII HpaI MfeI MluI NcoI NheI NotI NruI NsiI PasI PflMI

PfoI PmeI PmlI PshAI PspOMI PspXI PsrI RsrII SacI SacII SalI SanDI SapI

ScaI SexAI SfiI SgrAI SpeI SrfI StuI StyI Tth111I XbaI XcmI XhoI ZraI

Enzymes excluded; MinCuts: 1 MaxCuts: 2

padenyl_signal-> padenyl_signal-| AflIII ApoI AseI BaeI BaeI BanI Bpu10I BpuEI BsaAI

BsaWI BsaXI BsaXI BseYI BsiEI Bsp1286I BspMI BsrBI BsrDI BtgZI DraI EaeI HaeII

Hin4I Hin4I MmeI MspA1I NdeI NspI PciI PvuII SfcI SmlI SspI TaqII TatI

pKMEf_Basis_Oligo_Shuff (Circular) (MinSite=6) MAP of: pKMEF_Basis_Oligo_Shuff check: 6587 from: 1 to: 3814

Oligo: Basis_Oligo_Shuff was cloned into pKMEf425bla. 425bla fragment

was excised by XbaI + HindIII digest, the oligo was inserted into

same restriciotn sites. Vector contains restriction sites to clone

in CDRs.



=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=



=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=





With 348 enzymes: *


May 23, 19103 14:10 ..

PflMI EarI lacI->

| | |

acccgacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgtta

1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100

a T R H H R M A Q N L S R Y G M I A P G R E S I Q G G E C E T S N V I -

b V V N V K P V T L -

c -

BstAPI

|

tacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaag

101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200

a R C R R V C R C L L S D R F P R G E P G Q P R F C E N A G K S G S -

b Y D V A E Y A G V S Y Q T V S R V V N Q A S H V S A K T R E K V E A -

c -

Anhang

131

BsgI

|

cggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccct

201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

a G D G G A E L H S Q P R G T T T G G Q T V V A D W R C H L Q S G P -

b A M A E L N Y I P N R V A Q Q L A G K Q S L L I G V A T S S L A L -

c -

Hin4I BmrI BsaHI

| | |

gcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcc

301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400

a A R A V A N C R G D * -

b H A P S Q I V A A I K S R A D Q L G A S V V V S M V E R S G V E A -

c -

AflIII

ApaLI MluI BclI BsgI

| | | |

tgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcct

401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500

a -

b C K A A V H N L L A Q R V S G L I I N Y P L D D Q D A I A V E A A C -

c -

BbsI BmrI

| |

gcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagca

501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600

a -

b T N V P A L F L D V S D Q T P I N S I I F S H E D G T R L G V E H -

c -

ApaI

BanII

BstEII PspOMI |

| | |

tctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcact

601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700

a -

b L V A L G H Q Q I A L L A G P L S S V S A R L R L A G W H K Y L T -

c -

BcgI BcgI

| |

cgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttccca

701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800

a -

b R N Q I Q P I A E R E G D W S A M S G F Q Q T M Q M L N E G I V P T -

c -

BssHII

|

ctgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggacatctcggtagtgggata

801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900

a -

b A M L V A N D Q M A L G A M R A I T E S G L R V G A D I S V V G Y -

c -

HincII

BbsI HpaI

| |

cgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaa

901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000

a M L Y P A V N H H Q T G F S P A G A N Q R G P L A A T -

b D D T E D S S C Y I P P L T T I K Q D F R L L G Q T S V D R L L Q -

c -

BsaXI

BbeI |

SfoI | |

BsaHI| | |

NarI| | |

KasI|| | |

||| | |

ctctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctcccc

1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100

a L S G P G G E G Q S A V A R L T G E K K N H P G A Q Y A N R L S P -

b L S Q G Q A V K G N Q L L P V S L V K R K T T L A P N T Q T A S P R -

c -

KpnI

tHP-> |

EaeI AseI lacI-|Acc65I| |

| | | || |

gcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcggtacccgataaaagcggcttcctgacaggagg

1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200

a R V G R F I N A A G T T G F P T G K R A V S G T R * -

b A L A D S L M Q L A R Q V S R L E S G Q * -

c -

Anhang

132

CAP-> -35lac-| -10lac-|

tHP-| AseI | CAP-| -35lac-> | -10lac-> |

| | | | | | | |

ccgttttgttttgcagcccacctcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgt

1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300

a -

b -

c -

BmtI

BplI|

lacO1-> lacZ-| NheI ||

mRNA_lac-> lacO1-| S/DI-> lacZ'-> XbaI| BspHI AfeI| ||

| | | | || | || ||

gtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgaatttCTAGAGAAGGAGATATACtcATGagcAGCgctagcACC

1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400

a -

b -

c -

EcoRI

BanII |

SacI |

EcoICRI | |

AvaI | | | HindIII BstAPI

SpeI XhoI | | |his5-> his5-| | lpp-> DraIII lpp-|

| | | | | | | | | | |

AGCACTAGTggctcgagctcggaattcCACCATCATCACCATTAGtAagcttgacctgtgaagtgaaaaatggcgcacattgtgcgacattttttttgtc

1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500

a -

b V K N G A H C A T F F L S -

c -

f1ori_IG5'

BamHI |

| |

tgccgtttaccgctactgcgtcacggatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacactt

1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600

a -

b A V Y R Y C V T D P H A P C S G A L S A A G V V V T R S V T A T L -

c -

f1ori_DNA5'

NaeI |

NgoMIV | |

| | |

gccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcggggcatccctttag

1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700

a -

b A S A L A P A P F A F F P S F L A T F A G F P R Q A L N R G I P L G -

c -

DraIII

BsaAI | f1ori_DNA3'

| | |

ggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccc

1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800

a -

b F R F S A L R H L D P K K L D * -

c -

AloI

PpiI

AloI BsaXI | PsiI

| | | |

tttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggatt

1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900

a -

b -

c -

SspI f1ori_IG3'

| |

ttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcactt

1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000

a -

b -

c -

ttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgtcgagacgttgggtgaggttccaactttc

2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100

a -

b -

c -

Bpu10I CAT->

| |

accataatgaaataagatcactaccgggcgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatggagaaaaaaatcactggatatac

2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200

a -

b -

c M E K K I T G Y T -

Anhang

133

caccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacg

2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300

a -

b -

c T V D I S Q W H R K E H F E A F Q S V A Q C T Y N Q T V Q L D I T -

BspEI

DraI Hin4I BsmI |

| | | |

gcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggagttccgtatgg

2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400

a -

b -

c A F L K T V K K N K H K F Y P A F I H I L A R L M N A H P E F R M A -

caatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaata

2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500

a V F T L V T P F S M S K L K R F H R S G V N T -

b -

c M K D G E L V I W D S V H P C Y T V F H E Q T E T F S S L W S E Y -

ccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatg

2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600

a T T I S G S F Y T Y I R K M W R V T V K T W P I S L K G L L R I C -

b -

c H D D F R Q F L H I Y S Q D V A C Y G E N L A Y F P K G F I E N M -

BtgI

MscI NcoI

PflMI DraI EaeI | StyI SspI

| | | | | |

tttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaat

2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700

a F S S Q P I P G * -

b -

c F F V S A N P W V S F T S F D L N V A N M D N F F A P V F T M G K Y -

BsmI

|

attatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtctgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattaca

2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800

a -

b -

c Y T Q G D K V L M P L A I Q V H H A V C D G F H V G R M L N E L Q -

ScaI

TatI | CAT-|

| | |

acagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaatttttttaaggcagttattggtgcccttaaacgcctggtgctacgcctgaataagtgataataagc

2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900

a -

b -

c Q Y C D E W Q G G A * -

BsiEI

BstBI Tth111I | AgeI

| | | |

ggatgaatggcagaaattcgaaagcaaattcgacccggtcgtcggttcagggcagggtcgttaaatagccgcttatgtctattgctggtttaccggttta

2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000

a -

b -

c M A E I R K Q I R P G R R F R A G S L N S R L C L L L V Y R F I -

Bsu36I Bpu10I BtgI

| | |

ttgactaccggaagcagtgtgaccgtgtgcttctcaaatgcctgaggccagtttgctcaggctctccccgtggaggtaataattgctcgacatgaccaaa

3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100

a -

b -

c D Y R K Q C D R V L L K C L R P V C S G S P R G G N N C S T * -

colEI_cas->

PpiI |

| |

atcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgct

3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200

a -

b -

c -

AcuI

|

tgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagat

3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300

a -

b -

c -

Anhang

134

ori_rep3'

|

accaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtg

3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400

a -

b -

c -

AlwNI BsiEI ApaLI

| | |

gctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgca

3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500

a -

b -

c -

ori_rep5'

|

cacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacag

3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600

a -

b -

c -

BssSI

|

gtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctc

3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700

a -

b -

c -

ori->

<-ori_ini

|

tgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggc

3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800

a V M L V R G A E P M E K R Q Q R G L F T V P G L L L A -

b -

c -

colEI_cas-|

|

cttttgctcacatg

3801 ---------+---- 3814

a F C S H -

b M -

c -


lacI-> lacI-| tHP-> tHP-| CAP-> CAP-| -35lac-> -35lac-| -10lac-> -10lac-| lacO1-> lacO1-| mRNA_lac->

S/DI-> lacZ'-> lacZ-| his5-> his5-| lpp-> lpp-| f1ori_IG5' f1ori_IG3' f1ori_DNA5' f1ori_DNA3' CAT->

CAT-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori-> <-ori_ini ori_rep5' ori_rep3' Acc65I AcuI AfeI AflIII AgeI

AloI AlwNI ApaI ApaLI AseI AvaI BamHI BanII BbeI BbsI BcgI BclI BmrI

BmtI BplI Bpu10I BsaAI BsaHI BsaXI BsgI BsiEI BsmI BspEI BspHI BssHII BssSI

BstAPI BstBI BstEII Bsu36I BtgI DraI DraIII EaeI EarI EcoICRI EcoRI Hin4I HincII

HindIII HpaI KasI KpnI MluI MscI NaeI NarI NcoI NgoMIV NheI PflMI PpiI

PsiI PspOMI SacI ScaI SfoI SpeI SspI StyI TatI Tth111I XbaI XhoI


S/DII-> SD-2-> T7g10up1-> T7g10up1-| T7g10up2-> T7g10up2-| T7g10SD-> T7g10SD-| T7g10SDs-> T7g10SDs-| OmpA->

OmpA-| pelB-> pelB-| pelB_Sfi-| pelB_FseNot-> pelB_FseNot-| phoA-> phoA-| sFLAG-> sFLAG-| sFLAG_Eco-|

lFLAG-> lFLAG-| glyli1-> glyli1-| glyli2-> glyli2-| glyli3-> glyli3-| glyli4-> glyli4-| linkerA-> linkerA-| linkerB->

linkerB-| McPC_VH-> McPC_VH-| McPC_VL-> McPC_VLm-> McPC_VL-| McPCconst-> McPCconst-| 425_VH-> 425_VH-| 425_VL->

425-VL1-| 425-VL2-| M1-VH-> M1-VH-| M1-VHm-| M1-VLs-> M1-VLl-> M1-VL-| hinge_v1-> hinge_v1-| hinge_v2-> hinge_v2-|

hinge_v3-> hinge_v3-| hinge_v4-> hinge_v4-| zip-> zip-| Tzip-> Tzip-| dhlx-> dhlx-| trimA-> trimA-|

trimB-> trimB-| trimC-> trimC-| polzip-> polzip-| lacrepE-> lacrepE-| lacrepK-> lacrepK-| hetROPa-> hetROPa-|

loopnewa-> loopnewa-| hetROPb-> hetROPb-| loopnewb-> loopnewb-| CH1-> CH1-| CL-> CL-| biot37-> biot37-|

biot54-> biot54-| groES-> groES-| p53-> p53-| spacer2-> spacer2-| spacer3-> spacer3-| his5EG-> his5EG-|

his5-> his5-| his6-> his6-| T7term-> T7term-| hok/sok_ins5' hok/sok_ins3' hok/sok5' hok/sok3' hok5'

hok3' sok5' sok3' parB5' parB3' skp_cas5' skp_cas3' skp5' skp3' bla_sig-> bla_sig-| bla->

bla-| ori_rep_wt3' WinZipA1-> WinZipA1-| WinZipA2-> WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2-> WinZipB2-| DHFR[1,2]->

DHFR[1,2]-| DHFR[3]-> DHFR[3]-| AarI AatII AccI AflII AhdI AleI AscI AsiSI AvrII

BaeI BbvCI BfrBI BglI BglII BlpI BmgBI BsaI BsaBI BseRI BsiWI BspMI BsrGI

BstZ17I ClaI EagI EcoNI EcoO109I EcoRV FalI FseI FspI FspAI MfeI NdeI NotI

NruI NsiI NspI PacI PciI PfoI PmeI PmlI PpuMI PshAI PsrI PstI PvuI

RsrII SacII SalI SanDI SapI SbfI SexAI SfiI SgrAI SmaI SnaBI SphI SrfI

StuI SwaI XmaI XmnI ZraI


AclI ApoI BanI BciVI Bme1580I BpmI BpuEI BsaWI BsaXI BseYI BsiHKAI BsmBI Bsp1286I

BsrBI BsrDI BsrFI BstXI BstYI BtsI DrdI EciI Eco57MI HaeII Hin4I MmeI MslI

MspA1I PpiI PvuII SfcI SmlI TaqII TaqII XcmI

Anhang

135

pKMEf_shuffle_H1 BmtI

BplI|



| | | | || | || ||

GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTTCTAGAGAAGGAGATATACtcATGagcAGCgctagcGGT

1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400

c M S S A S G -

EcoRI

BanII |

SacI |

EcoICRI | |

AvaI | | |

PspXI | | |

XhoI | | | HindIII

AlwNI SpeI AloI| | | |his5-> his5-| | lpp->

| | || | | | | | | |

ggcGGCACCAGCCACTGGATGCACGGTTCAGgcaCTAGTggctcgagctcggaattcCACCATCATCACCATTAGtAAGCTTGACCTGTGAAGTGAAAAA

1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500

c G G T S H W M H G S G T S G S S S E F H H H H H * M -

pKMEf_shuffle_H2

BmtI

BplI|



| | | | || | || ||


1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400

c M S S A S G -

EcoRI

BanII |

SacI |

EcoICRI | |

AvaI | | |

PspXI | | |

EagI SpeI XhoI | | |his5->

| | | | | | |

ggcGGCGAGTTTAATCCCAGCAACGGCCGTACTAACTACAATGAGAAATTCAAGAGCGGTTCAGgcaCTAGTggctcgagctcggaattcCACCATCATC

1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500

c G G E F N P S N G R T N Y N E K F K S G S G T S G S S S E F H H H H -

f1-ori-|

HindIII BstAPI f1ori_IG5'|

his5-| | lpp-> DraIII lpp-| BamHI ||

| | | | | | ||

ACCATTAGtAAGCTTGACCTGTGAAGTGAAAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTTTTGTCTGCCGTTTACCGCTACTGCGTCACGGATCCCCACGCG

1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600

c H *

pKMEf_shuffle_H3 BmtI

BplI|



| | | | || | || ||


1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400

c M S S A S G -

EcoRI

BanII |

SacI |

EcoICRI | |

AvaI | | |

PspXI | | | HindIII

EagI SpeI XhoI | | |his5-> his5-| |

| | | | | | | | |

ggcGGCCGGGACTATGATTACGACGGACGGTACTTTGACTACGGTTCAGgcaCTAGTggctcgagctcggaattcCACCATCATCACCATTAGtAAGCTT

1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500

c G G R D Y D Y D G R Y F D Y G S G T S G S S S E F H H H H H * -

Anhang

136

pKMEf_shuffle_L1

BmtI

BplI|



| | | | || | || ||


1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400

c M S S A S G -

EcoRI

BanII |

SacI |

EcoICRI | |

NspI AvaI | | |

AflIII | PspXI | | | HindIII

PciI | FalI SpeI XhoI | | |his5-> his5-| |

| | | | | | | | | | |

ggcGGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAACTTACATGTATGGTTCAGgcaCTAGTggctcgagctcggaattcCACCATCATCACCATTAGtAAGCTTGACCTG

1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500

c G G S A S S S V T Y M Y G S G T S G S S S E F H H H H H * -

pKMEf_shuffle_L2 BmtI

BplI|



| | | | || | || ||


1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400

c M S S A S G -

EcoRI

BanII |

SacI |

EcoICRI | |

AvaI | | |

PspXI | | | HindIII

SpeI XhoI | | |his5-> his5-| | lpp->

| | | | | | | | |

ggcGGCGACACATCCAACCTGGCTTCTGGTTCAGgcaCTAGTggctcgagctcggaattcCACCATCATCACCATTAGtAAGCTTGACCTGTGAAGTGAA

1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500

c G G D T S N L A S G S G T S G S S S E F H H H H H * -

pKMEf_shuffle_L3 BmtI

BplI|



| | | | || | || ||


1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400

c M S S A S G -

EcoRI

BanII |

SacI |

EcoICRI | |

AvaI | | |

PspXI | | | HindIII

SpeI XhoI | | |his5-> his5-| |

| | | | | | | |

ggcGGCCAGCAGTGGAGTAGTCACATATTCACGGGTTCAGgcaCTAGTggctcgagctcggaattcCACCATCATCACCATTAGtAAGCTTGACCTGTGA

1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500

c G G Q Q W S S H I F T G S G T S G S S S E F H H H H H * -

Anhang

137

pIB30_H3_li_CAT_li_H3 (Circular) (MinSite=6) MAP of: pIB30_H3-li_CAT-li_H3.seq check: 1607 from: 1 to: 4533

Ausgangsvektor pSS30CATwt,Linker und Schnittstellen(Nhe u. Spe)

wurden mittels PCR eingefuegt

Primer p_f_CAT_Nhe_linker bzw. p_r_CAT_Spe_linker



=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=



=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=





With 362 enzymes: *


August 26, 19104 15:05 ..

PflMI EarI lacI->

| | |

ACCCGACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTA

1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100


BstAPI

|

TACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAG

101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200


BsgI

|

CGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCT

201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300


GCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCC

301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400


AflIII

MluI BclI BsgI

| | |

TGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCT

401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500


BbsI

|

GCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCA

501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600


ApaI

BanII

BstEII PspOMI |

| | |

TCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACT

601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700


BcgI

|

CGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCA

701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800


BssHII EcoRV

| |

CTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATA

801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900


HincII

BbsI HpaI

| |

CGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAA

901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000


Anhang

138

BsaXI

BbeI |

SfoI | |

NarI| | |

BsmBI KasI|| | |

| ||| | |

CTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCC

1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100


lacI-| CAP-> CAP-|

| | |

GCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATT

1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200


lacO1->

mRNA_lac->

-35lac-| -10lac-| |

-35lac-> | -10lac-> | | lacO1-| S/DI-> lacZ'->

| | | | | | | |

AGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTA

1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300

b -

lacZ-| BmtI

XbaI| NdeI NheI | EagI

|| | | | |

CGAATTTctagataacgagggcaacatATGgctagcGGTggcGGCCGGGACTATGATTACGACGGACGGTACTTTGACTACGGTTCAGgcactagcggtg

1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400

b M A S G G G R D Y D Y D G R Y F D Y G S G T S G G -

gctccggtggtggctctggcggtggcgAGaaaaaaATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCA

1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500

b S G G G S G G G E K K I T G Y T T V D I S Q W H R K E H F E A F Q -

GTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTT

1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600

b S V A Q C T Y N Q T V Q L D I T A F L K T V K K N K H K F Y P A F -

BspEI

BsmI |

| |

ATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAgTTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACA

1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700

b I H I L A R L M N A H P E F R M A M K D G E L V I W D S V H P C Y T -

CCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTG

1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800

b V F H E Q T E T F S S L W S E Y H D D F R Q F L H I Y S Q D V A C -

BsmBI PflMI

| |

TTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAAC

1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900

b Y G E N L A Y F P K G F I E N M F F V S A N P W V S F T S F D L N -

BtgI

NcoI

MscI StyI

| |

GTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATC

1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000

b V A N M D N F F A P V F T M G K Y Y T Q G D K V L M P L A I Q V H H -

CATdel6-|

CATdel8-| |

ScaI | |

CATdel9-|| | |

CATdel11-| || | |

BsmI | TatI|| | | CAT-|

| | ||| | | |

ATGCCGTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGggtggcggttctggtggcgg

2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100

b A V C D G F H V G R M L N E L Q Q Y C D E W Q G G A G G G S G G G -

EagI SpeI HindIII lpp->

| | | |

ctccggtggcactagcGGTggcGGCCGGGACTATGATTACGACGGACGGTACTTTGACTACGGTTCAGgcactagttgataagcttGACCTGTGAAGTGA

2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200

b S G G T S G G G R D Y D Y D G R Y F D Y G S G T S * -

BstAPI f1ori_IG5'

DraIII lpp-| BamHI |

| | | |

AAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTTTTGTCTGCCGTTTACCGCTACTGCGTCACGGATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGG

2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300

b M A H I V R H F F C L P F T A T A S R I P T R P V A A H * -

Anhang

139

f1ori_DNA5'

NaeI |

NgoMIV | |

| | |

TGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTT

2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400

b -

DraIII

BsaAI |

| |

CCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTA

2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500

b V L Y G T S T P K N L I R V M V H V -

AloI AloI

f1ori_DNA3' | DrdI BsaXI |

| | | | |

GTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCC

2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600

b V G H R P D R R F F A L * V D S C S K L E Q H S T L -

PsiI

|

TATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAAC

2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700

b S R S I L L I Y K G F C R F R P I G * -

f1ori_IG3'

|

AAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGC

2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800

b V A L F G E M C A E P L F V Y F S K Y I Q I C I R -

BspHI EarI bla_sig->

| | |

TCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGC

2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900

b S * -

bla-> AcuI

bla_sig-|| BssSI |

|| | |

ATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTC

2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000

b M L K I S W V H E W V T S N W I S -

XmnI

|

AACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTG

3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100

b T A V R S L R V F A P K N V F Q * V A R Y Y P V L -

ScaI

BcgI TatI |

| | |

ACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGAC

3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200

b T P G K S N S V A A Y T I L R M T W L S T H Q S Q K S I L R M A * -

PvuI

|

AGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTT

3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300

b -

TTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAG

3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400

b -

FspI

|

CAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGG

3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500

b -

BglI BsaI

| |

ACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCA

3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600

b -

AhdI

|

GATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGA

3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700

b -

Anhang

140

bla-|

|

TTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTT

3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800

b -

BspHI colEI_cas->

| |

TGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTT

3801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900

b -

AcuI

|

CTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTG

3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4000

b -

ori_rep3'

|

GCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCT

4001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4100

b -

AlwNI

|

GCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGC

4101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200

b V A I S R V L P G W T Q D D S Y R I R R S G R A -

ori_rep5'

|

TGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCG

4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4300

b E R G V R A H S P A W S E R P T P N * -

BssSI

|

AAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCC

4301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4400

b -

ori->

DrdI <-ori_ini

| |

TGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGG

4401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4500

b -

colEI_cas-|

|

TTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATG

4501 ---------+---------+---------+--- 4533

b -


lacI-> lacI-| CAP-> CAP-| -35lac-> -35lac-| -10lac-> -10lac-| lacO1-> lacO1-| mRNA_lac-> S/DI-> lacZ'->

lacZ-| lpp-> lpp-| f1ori_IG5' f1ori_IG3' f1ori_DNA5' f1ori_DNA3' bla_sig-> bla_sig-| bla-> bla-|

CAT-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori-> <-ori_ini ori_rep5' ori_rep3' CATdel6-| CATdel8-| CATdel9-| CATdel11-|

AcuI AflIII AhdI AloI AlwNI ApaI BamHI BanII BbeI BbsI BcgI BclI BglI

BmtI BsaI BsaAI BsaXI BsgI BsmI BsmBI BspEI BspHI BssHII BssSI BstAPI BstEII

BtgI DraIII DrdI EagI EarI EcoRV FspI HincII HindIII HpaI KasI MluI MscI

NaeI NarI NcoI NdeI NgoMIV NheI PflMI PsiI PspOMI PvuI ScaI SfoI SpeI

StyI TatI XbaI XmnI


tHP-> tHP-| S/DII-> SD-2-> T7g10up1-> T7g10up1-| T7g10up2-> T7g10up2-| T7g10SD-> T7g10SD-| T7g10SDs->

T7g10SDs-| OmpA-> OmpA-| pelB-> pelB-| pelB_Sfi-| pelB_FseNot-> pelB_FseNot-| phoA-> phoA-| sFLAG->

sFLAG-| sFLAG_Eco-| lFLAG-> lFLAG-| glyli1-> glyli1-| glyli2-> glyli2-| glyli3-> glyli3-| glyli4-> glyli4-|

linkerA-> linkerA-| linkerB-> linkerB-| McPC_VH-> McPC_VH-| McPC_VL-> McPC_VLm-> McPC_VL-| McPCconst-> McPCconst-|

425_VH-> 425_VH-| 425_VL-> 425-VL1-| 425-VL2-| M1-VH-> M1-VH-| M1-VHm-| M1-VLs-> M1-VLl-> M1-VL-| hinge_v1->

hinge_v1-| hinge_v2-> hinge_v2-| hinge_v3-> hinge_v3-| hinge_v4-> hinge_v4-| zip-> zip-| Tzip-> Tzip-|




spacer3-| his5-> his5-| his5EG-> his5EG-| his5-> his5-| his6-> his6-| T7term-> T7term-| hok/sok_ins5'

hok/sok_ins3' hok/sok5' hok/sok3' hok5' hok3' sok5' sok3' parB5' parB3' skp_cas5' skp_cas3' skp5'

skp3' CAT-> ori_rep_wt3' WinZipA1-> WinZipA1-| WinZipA2-> WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2-> WinZipB2-|

DHFR[1]-> DHFR[1]-| DHFR[2]-> DHFR[2]-| dummy-> dummy-| CATdel4-> CATdel7-> CATdel11-> AarI AatII AccI

Acc65I AfeI AflII AgeI AleI AlfI AscI AsiSI AvaI AvrII BaeI BbvCI BfrBI

BglII BlpI BmgBI BplI Bpu10I BsaBI BseRI BsiWI BspMI BsrGI BstBI BstZ17I Bsu36I

ClaI CspCI EcoICRI EcoNI EcoO109I EcoRI FalI FseI FspAI KpnI MfeI NotI NruI

NsiI NspI PacI PciI PfoI PmeI PmlI PpuMI PshAI PspXI PsrI PstI RsrII

SacI SacII SalI SanDI SapI SbfI SexAI SfiI SgrAI SmaI SnaBI SphI SrfI

StuI SwaI Tth111I XhoI XmaI ZraI


AclI ApaLI ApoI AseI BanI BcgI BciVI Bme1580I BmrI BpmI BpuEI BsaHI BsaWI

BsaXI BseYI BsiEI BsiHKAI Bsp1286I BsrBI BsrDI BsrFI BstXI BstYI BtgZI BtsI DraI

EaeI EciI Eco57MI HaeII Hin4I Hin4I MmeI MslI MspA1I PpiI PpiI PvuII SfcI

SmlI SspI TaqII TaqII XcmI

Anhang

141

pIB30_SSHIFTF_CAT_SSHIFTF

(Circular) (MinSite=6) MAP of: pIB30_SSHIFTF_CAT_SSHIFTF.seq check: 3649 from: 1 to: 4455

Ausgangsvektor pSS30CATwt,Linker und Schnittstellen(Nhe u. Spe)

wurden mittels PCR eingefuegt

Primer p_f_CAT_Nhe_linker bzw. p_r_CAT_Spe_linker



=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=



=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=





With 362 enzymes: *


November 5, 19104 14:49 ..

PflMI EarI lacI->

| | |


1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100


BstAPI

|


101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200


BsgI

|


201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300



301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400


AflIII

MluI BclI BsgI

| | |


401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500


BbsI

|


501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600


ApaI

BanII

BstEII PspOMI |

| | |


601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700


BcgI

|


701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800


BssHII EcoRV

| |


801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900


HincII

BbsI HpaI

| |


901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000


Anhang

142

BsaXI

BbeI |

SfoI | |

NarI| | |

BsmBI KasI|| | |

| ||| | |


1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100


lacI-| CAP-> CAP-|

| | |


1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200


lacO1->

mRNA_lac->

-35lac-| -10lac-| |


| | | | | | | |


1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300

b -

lacZ-| BmtI

XbaI| NdeI NheI |

|| | | |

CGAATTTctagataacgagggcaacatATGgctagcAGTAGTCACATATTCACGTTCggtggctccggtggtggctctggcggtggcgAGaaaaaaATCA

1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400

b M A S S S H I F T F G G S G G G S G G G E K K I T -

CTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCT

1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500

b G Y T T V D I S Q W H R K E H F E A F Q S V A Q C T Y N Q T V Q L -

BspEI

BsmI |

| |

GGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAg

1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600

b D I T A F L K T V K K N K H K F Y P A F I H I L A R L M N A H P E -

TTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCT

1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700

b F R M A M K D G E L V I W D S V H P C Y T V F H E Q T E T F S S L W -

GGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTAT

1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800

b S E Y H D D F R Q F L H I Y S Q D V A C Y G E N L A Y F P K G F I -

BtgI

NcoI

BsmBI PflMI MscI StyI

| | | |

TGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACC

1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900

b E N M F F V S A N P W V S F T S F D L N V A N M D N F F A P V F T -

BsmI

|

ATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTA

1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000

b M G K Y Y T Q G D K V L M P L A I Q V H H A V C D G F H V G R M L N -

CATdel6-|

CATdel8-| |

ScaI | |

CATdel9-|| | |

CATdel11-| TatI|| | | CAT-| SpeI

| ||| | | | |

ATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGggtggcggttctggtggcggctccggtggcAGTAGTCACATATTCACGTTCactagttg

2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100

b E L Q Q Y C D E W Q G G A G G G S G G G S G G S S H I F T F T S * -

BstAPI f1ori_IG5'

HindIII lpp-> DraIII lpp-| BamHI |

| | | | | |

ataagcttGACCTGTGAAGTGAAAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTTTTGTCTGCCGTTTACCGCTACTGCGTCACGGATCCCCACGCGCCCTGTA

2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200

b M A H I V R H F F C L P F T A T A S R I P T R P V -

GCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTT

2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300

b A A H * -

Anhang

143

f1ori_DNA5'

NaeI |

NgoMIV | |

| | |

TCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTT

2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400

b V L Y G T S T P K N L -

DraIII AloI AloI

BsaAI | f1ori_DNA3' | DrdI BsaXI |

| | | | | | |

GATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCC

2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500

b I R V M V H V V G H R P D R R F F A L * V D S C S -

PsiI

|

AAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACA

2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600

b K L E Q H S T L S R S I L L I Y K G F C R F R P I G * -

f1ori_IG3'

|

AAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAA

2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700

b V A L F G E M C A E P L F V Y F S K -

BspHI EarI bla_sig->

| | |

ATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG

2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800

b Y I Q I C I R S * -

bla-> AcuI

bla_sig-|| BssSI |

|| | |

CCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGT

2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900

b M L K I S W V H E W -

XmnI

|

GGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGT

2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000

b V T S N W I S T A V R S L R V F A P K N V F Q * V -

ScaI

BcgI TatI |

| | |

GGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAA

3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100

b A R Y Y P V L T P G K S N S V A A Y T I L R M T W L S T H Q S Q K -

PvuI

|

AGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGG

3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200

b S I L R M A * -

ACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAG

3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300

b -

FspI

|

CGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGA

3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400

b -

BglI BsaI

| |

TGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGG

3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500

b -

AhdI

|

TATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATC

3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600

b -

bla-|

|

GCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAA

3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700

b -

Anhang

144

BspHI colEI_cas->

| |

GGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGG

3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800

b -

ATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCA

3801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900

b -

AcuI ori_rep3'

| |

ACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAG

3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4000

b -

AlwNI

|

CACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACC

4001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4100

b V A I S R V L P G W T Q D D S Y R -

GGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTA

4101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200

b I R R S G R A E R G V R A H S P A W S E R P T P N * -

ori_rep5' BssSI

| |

TGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAA

4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4300

b -

ori->

DrdI <-ori_ini

| |

ACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGC

4301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4400

b -

colEI_cas-|

|

CAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATG

4401 ---------+---------+---------+---------+---------+----- 4455

b -



lacZ-| lpp-> lpp-| f1ori_IG5' f1ori_IG3' f1ori_DNA5' f1ori_DNA3' bla_sig-> bla_sig-| bla-> bla-|

CAT-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori-> <-ori_ini ori_rep5' ori_rep3' CATdel6-| CATdel8-| CATdel9-| CATdel11-|

AcuI AflIII AhdI AloI AlwNI ApaI BamHI BanII BbeI BbsI BcgI BclI BglI

BmtI BsaI BsaAI BsaXI BsgI BsmI BsmBI BspEI BspHI BssHII BssSI BstAPI BstEII

BtgI DraIII DrdI EarI EcoRV FspI HincII HindIII HpaI KasI MluI MscI NaeI

NarI NcoI NdeI NgoMIV NheI PflMI PsiI PspOMI PvuI ScaI SfoI SpeI StyI

TatI XbaI XmnI












hok/sok_ins3' hok/sok5' hok/sok3' hok5' hok3' sok5' sok3' parB5' parB3' skp_cas5' skp_cas3' skp5'

skp3' CAT-> ori_rep_wt3' WinZipA1-> WinZipA1-| WinZipA2-> WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2-> WinZipB2-|

DHFR[1]-> DHFR[1]-| DHFR[2]-> DHFR[2]-| dummy-> dummy-| CATdel4-> CATdel7-> CATdel11-> AarI AatII AccI

Acc65I AfeI AflII AgeI AleI AlfI AscI AsiSI AvaI AvrII BaeI BbvCI BfrBI

BglII BlpI BmgBI BplI Bpu10I BsaBI BseRI BsiWI BspMI BsrGI BstBI BstZ17I Bsu36I

ClaI CspCI EagI EcoICRI EcoNI EcoO109I EcoRI FalI FseI FspAI KpnI MfeI NotI

NruI NsiI NspI PacI PciI PfoI PmeI PmlI PpuMI PshAI PspXI PsrI PstI

RsrII SacI SacII SalI SanDI SapI SbfI SexAI SfiI SgrAI SmaI SnaBI SphI

SrfI StuI SwaI Tth111I XhoI XmaI ZraI


AclI ApaLI ApoI AseI BanI BcgI BciVI Bme1580I BmrI BpmI BpuEI BsaHI BsaWI

BsaXI BseYI BsiEI BsiHKAI Bsp1286I BsrBI BsrDI BsrFI BstXI BstYI BtgZI BtsI DraI

EaeI EciI Eco57MI HaeII Hin4I Hin4I MmeI MslI MspA1I PpiI PpiI PvuII SfcI

SmlI SspI TaqII TaqII Xcm

Anhang

145

pIB30_SSHIFTF_GST_SSHIFTF

(Circular) (MinSite=6) MAP of: pIB30_SSHIFTF_GST_SSHIFTF.seq check: 6958 from: 1 to: 4457

ASSEMBLE August 1, 19105 16:09

Symbols: 1 to: 1331 from: catwt.seq ck: 424 , 1 to: 1331

pLisc_SAF: Cloning the VL gene from pHJ300FF with SacI/HindIII into

pLisc_SF to remove the KpnI site in VL. This enyzme now cuts once.

H11: Contains the H40 (P40A) and the H6364 (SA6364AD) mutation.

Symbols: 1332 to: 1375 from: pf_sshiftf_cat.seq ck: 6620, 8 to: 51 . . .



=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=



=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=





With 387 enzymes: *


August 1, 19105 16:21 ..

PflMI lacI->

| |


1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100


BstAPI

|


101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200



201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300



301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400


AflIII

MluI BclI

| |


401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500


BbsI

|


501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600


ApaI

BanII

BstEII PspOMI |

| | |


601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700



701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800

b R N Q I Q P I A E R E G D W S A M S G F Q Q T M Q M L N E G I V P T –

BssHII EcoRV

| |


801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900


HincII

BbsI HpaI

| |


901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000


Anhang

146

BsaXI

BbeI |

SfoI | |

NarI| | |

PvuII BsmBI KasI|| | |

| | ||| | |


1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100


PvuII lacI-| CAP-> CAP-|

| | | |


1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200


lacO1->

mRNA_lac->

-35lac-| -10lac-| |


| | | | | | | |


1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300

b -

lacZ-| BmtI

XbaI| NdeI NheI | EcoNI

|| | | | |

CGAATTTctagataacgagggcaacatATGGctagcAGTAGTCACATATTCACGTTCggtggctccggtggtggctctggcggtggcTCCCCTATACTAG

1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400

b M A S S S H I F T F G G S G G G S G G G S P I L G -

EcoO109I SapI

| |

GTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGA

1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500

b Y W K I K G L V Q P T R L L L E Y L E E K Y E E H L Y E R D E G D -

MscI

|

TAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATA

1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600

b K W R N K K F E L G L E F P N L P Y Y I D G D V K L T Q S M A I I -

NspI

AflIII |

TATA_box-> PciI |

| | |

CGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTG

1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700

b R Y I A D K H N M L G G C P K E R A E I S M L E G A V L D I R Y G V -

BstBI

XmnI |

| |

TTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCA

1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800

b S R I A Y S K D F E T L K V D F L S K L P E M L K M F E D R L C H -

SwaI BclI hok/sok3'

| | |

TAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCG

1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900

b K T Y L N G D H V T H P D F M L Y D A L D V V L Y M D P M C L D A -

ScaI

TatI |

| |

TTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCT

1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000

b F P K L V C F K K R I E A I P Q I D K Y L K S S K Y I A W P L Q G W -

GGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGggtggcggttctggtggcggctccggtggcAGTAGTCACATATTCACGTTCta

2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100

b Q A T F G G G D H P P K S D L G G G S G G G S G G S S H I F T F * -

f1-ori-|

BstAPI f1ori_IG5'|

HindIII lpp-> DraIII lpp-| BamHI ||

| | | | | ||

gtaaaagcttGACCTGTGAAGTGAAAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTTTTGTCTGCCGTTTACCGCTACTGCGTCACGGATCCCCACGCGCCCTG

2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200

b -

TAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCC

2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300

b -

Anhang

147

f1ori_DNA5'

NaeI |

NgoMIV | |

| | |

TTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAAC

2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400

b -

DraIII AloI AloI

BsaAI | f1ori_DNA3' | DrdI BsaXI |

| | | | | | |

TTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTT

2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500

b -

PsiI

|

CCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAA

2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600

b -

padenyl_signal->

SspI f1ori_IG3' padenyl_signal-| |

| | | |

CAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCT

2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700

b -

BspHI SspI bla_sig->

| | |

AAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGT

2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800

b -

bla-> AcuI

bla_sig-|| BssSI |

|| | |

CGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGA

2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900

b -

XmnI

|

GTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTAT

2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000

b -

ScaI

TatI |

| |

GTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGA

3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100

b -

PvuI

|

AAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGA

3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200

b -

GGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACG

3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300

b -

FspI

|

AGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTG

3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400

b -

padenyl_signal->

padenyl_signal-| |

BglI | | BsaI

| | | |

GATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGC

3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500

b -

AhdI

|

GGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGA

3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600

b -

bla-|

|

TCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAA

3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700

b -

Anhang

148

pUC_ori->

BspHI colEI_cas-> |

| | |

AAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAA

3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800

b -

GGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTAC

3801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900

b -

AcuI ori_rep3'

| |

CAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGT

3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4000

b -

AlwNI

|

AGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTA

4001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4100

b -

CCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGC

4101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200

b -

ori_rep5' BssSI

| |

TATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGG

4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4300

b M R K R H A S R R E K G G Q V S G K R Q G R N R R A H E G A S R G -

ori->

DrdI <-ori_ini

| |

AAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAAC

4301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4400

b K R L V S L * V M L V R G A E P M E K R -

PUC_ori-| colEI_cas-|

| |

GCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATG

4401 ---------+---------+---------+---------+---------+------- 4457

b Q Q R G L F T V P G L L L A F C S H -



lacZ-| lpp-> lpp-| hok/sok3' f1ori_IG5' f1ori_IG3' f1ori_DNA5' f1ori_DNA3' bla_sig-> bla_sig-| bla->

bla-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori-> <-ori_ini ori_rep5' ori_rep3' TATA_box-> f1-ori-| pUC_ori-> PUC_ori-|

padenyl_signal-> padenyl_signal-| AcuI AflIII AhdI AloI AlwNI ApaI BamHI BanII BbeI

BbsI BclI BglI BmtI BsaI BsaAI BsaXI BsmBI BspHI BssHII BssSI BstAPI BstBI

BstEII DraIII DrdI EcoNI EcoO109I EcoRV FspI HincII HindIII HpaI KasI MluI MscI

NaeI NarI NdeI NgoMIV NheI NspI PciI PflMI PsiI PspOMI PvuI PvuII SapI

ScaI SfoI SspI SwaI TatI XbaI XmnI












hok/sok_ins3' hok/sok5' hok5' hok3' sok5' sok3' parB5' parB3' skp_cas5' skp_cas3' skp5' skp3'

CAT-> CAT-| ori_rep_wt3' WinZipA1-> WinZipA1-| WinZipA2-> WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2-> WinZipB2-|

DHFR[1]-> DHFR[1]-| DHFR[2]-> DHFR[2]-| dummy-> dummy-| CATdel6-| CATdel8-| CATdel9-| CATdel11-| CATdel4-> CATdel7->

CATdel11-> EGFP-> F64L S65T H231L EGFP-| transcript_start enhancer_region-> enhancer_region-| transl_ini->

transl_ini-| f1_ori-> SV40_ori-> SV40_ori-| CMV_promoter-> CMV_promoter-| mRNA_3'_end Kan/Neo-R-> Kan/Neo-R-| AarI

AatII AccI Acc65I AfeI AflII AgeI AleI AlfI AscI AsiSI AvaI AvrII BaeI

BbvCI BfrBI BglII BlpI BmgBI BplI Bpu10I BsaBI BseRI BsiWI BsmI BspEI BspMI

BsrGI BstZ17I Bsu36I BtgI ClaI CspCI EagI EcoICRI EcoRI FalI FseI FspAI KpnI

MfeI NcoI NotI NruI NsiI PacI PfoI PmeI PmlI PpuMI PshAI PspXI PsrI

PstI RsrII SacI SacII SalI SanDI SbfI SexAI SfiI SgrAI SmaI SnaBI SpeI

SphI SrfI StuI StyI Tth111I XhoI XmaI ZraI


AclI ApaLI ApoI AseI BanI BcgI BcgI BciVI Bme1580I BmrI BpmI BpuEI BsaHI

BsaWI BsaXI BseYI BsgI BsiEI BsiHKAI Bsp1286I BsrBI BsrDI BsrFI BstXI BstYI BtgZI

BtsI DraI EaeI EarI EciI Eco57MI HaeII Hin4I Hin4I MmeI MslI MspA1I PpiI

PpiI SfcI SmlI TaqII TaqII XcmI

Anhang

149

pKMEf425Bla

(Circular) (MinSite=6) MAP of: pKMEf425bla.seq check: 4352 from: 1 to: 5401

pAK400(length:5936bp)



=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=



=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=





With 362 enzymes: *


August 27, 19104 14:08 ..

EarI lacI->

| |


1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100

c P T P S N G A K P F A V W H D S A R K R V N S G W * -

BstAPI

|


101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200

c -

BsgI

|


201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

c -


301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400

c -

AflIII

MluI BclI BsgI

| | |


401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500

c M T R M P L L W K L P -

BbsI

|


501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600

c A L M F R R Y F L M S L T R H P S T V L F S P M K T V R D W A W S I -

ApaI

PspOMI |

| |


601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700

c W S H W V T S K S R C * -

BcgI

|


701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800

c M R A S F P -

BssHII

|

CTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGACATCTCGGTAGTGGGATA

801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900

c L R C W L P T I R W R W A Q C A P L P S P G C A L V R T S R * -

HincII

BbsI HpaI

| |


901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000

c -

Anhang

150

BbeI

SfoI |

NarI| |

KasI|| |

||| |


1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100

c -

KpnI

tHP-> |

lacI-|Acc65I| |

| || |

GCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGGTACCCGATAAAAGCGGCTTCCTGACAGGAGG

1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200

c -

-35lac-| -10lac-|

tHP-| CAP-> CAP-| -35lac-> | -10lac-> |

| | | | | | |

CCGTTTTGTTTTGCAGCCCACCTCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGT

1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300

c -

T7g10SDs-> pelB->

lacO1-> lacZ-| | T7g10SDs-||

mRNA_lac-> lacO1-| S/DI-> lacZ'-> XbaI| | NdeI||

| | | | || | |||

GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTTCTAGAGAAGGAGATATACATATGAAATACCTATTGCCT

1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400

c M K Y L L P -

sFLAG->

pelB_Sfi-||

NcoI ||

NaeI | ||

SfiI| | || 425_VH->

NgoMIV|| |pelB-||| sFLAG-|| PstI

||| | ||| || |

ACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCGGACTACAAAGACGAAGTGCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAAGC

1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500

c T A A A G L L L L A A Q P A M A D Y K D E V Q L Q Q S G A E L V K P -

StuI

|

CTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTACACCTTCACCAGCCACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGGCTGGACAAGGCCTTGAGTG

1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600

c G A S V K L S C K A S G Y T F T S H W M H W V K Q R A G Q G L E W -

EagI AccI

| |

GATCGGAGAGTTTAATCCCAGCAACGGCCGTACTAACTACAATGAGAAATTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAC

1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700

c I G E F N P S N G R T N Y N E K F K S K A T L T V D K S S S T A Y -

NspI

|

ATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCAGTCGGGACTATGATTACGACGGACGGTACTTTGACTACTGGGGCCAAG

1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800

c M Q L S S L T S E D S A V Y Y C A S R D Y D Y D G R Y F D Y W G Q G -

glyli2->

BseRI 425_VH-|| 425_VL-> SacI

PshAI | Bsu36I || glyli2-|| EcoICRI |

| | | || || | |

GGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGACATCGAGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCAT

1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900

c T T V T V S S G G G G S G G G G S G G G G S D I E L T Q S P A I M -

KpnI

FalI|

Acc65I ||

NspI | ||

BspMI AflIII | | ||

PstI | PciI | | || BamHI

| | | | | || |

GTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACTATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAACTTACATGTATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAGA

1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000

c S A S P G E K V T M T C S A S S S V T Y M Y W Y Q Q K P G S S P R -

EcoO109I

AloI PpuMI

| |

CTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGTTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGG

2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100

c L L I Y D T S N L A S G V P V R F S G S G S G T S Y S L T I S R M E -

Anhang

151

AscI

425-VL2-| BssHII

| |

AGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTCACATATTCACGTTCGGCTCGGGgACAGAACTgGAGATCAAACGgGGCTCGGGCGC

2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200

c A E D A A T Y Y C Q Q W S S H I F T F G S G T E L E I K R G S G A -

bla-> BssSI

| |

GCCGGGTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATC

2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300

c P G H P E T L V K V K D A E D Q L G A R V G Y I E L D L N S G K I -

XmnI

|

CTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGC

2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400

c L E S F R P E E R F P M M S T F K V L L C G A V L S R I D A G Q E Q -

ScaI

BcgI TatI |

| | |

AACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATG

2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500

c L G R R I H Y S Q N D L V E Y S P V T E K H L T D G M T V R E L C -

PvuI

|

CAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGG

2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600

c S A A I T M S D N T A A N L L L T T I G G P K E L T A F L H N M G -

GATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGT

2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700

c D H V T R L D R W E P E L N E A I P N D E R D T T M P V A M A T T L -

FspI

|

TGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTC

2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800

c R K L L T G E L L T L A S R Q Q L I D W M E A D K V A G P L L R S -

BsaI

|

GGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCC

2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900

c A L P A G W F I A D K S G A G E R G S R G I I A A L G P D G K P S -

AhdI bla-|

| |

CGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGggcct

2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000

c R I V V I Y T T G S Q A T M D E R N R Q I A E I G A S L I K H W A S -

BsaBI

SfiI his5->| his5-| HindIII lpp-> BstAPI lpp-|

| || | | | | |

cggGGGCCgatcaccatcatcaccatcattagtAAGCTTGACCTGTGAAGTGAAAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTTTTGTCTGCCGTTTACCGC

3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100

c G A D H H H H H H * M A H I V R H F F C L P F T A -

f1ori_IG5'

BamHI |

| |

TACTGCGTCACGGATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAG

3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200

c T A S R I P T R P V A A H * -

f1ori_DNA5'

NaeI |

NgoMIV | |

| | |

CGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAG

3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300

c V -

BsaAI f1ori_DNA3'

| |

TGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAG

3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400

c L Y G T S T P K N L I R V M V H V V G H R P D R R F F A L * -

AloI PsiI

| |

TCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGG

3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500

c V D S C S K L E Q H S T L S R S I L L I Y K G F C R F R -

Anhang

152

SspI f1ori_IG3'

| |

CCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGT

3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600

c P I G * V A L F G E M C -

GCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGtcgagacgttGGGTGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAAT

3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700

c A E P L F V Y F S K Y I Q I C I R S C R D V G * -

Bpu10I CAT->

| |

AAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATA

3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800

c M E K K I T G Y T T V D I -

TCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGA

3801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900

c S Q W H R K E H F E A F Q S V A Q C T Y N Q T V Q L D I T A F L K T -

BspEI

BsmI |

| |

CCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAgTTCCGTATGGCAATGAAAGACGG

3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4000

c V K K N K H K F Y P A F I H I L A R L M N A H P E F R M A M K D G -

TGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTC

4001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4100

c E L V I W D S V H P C Y T V F H E Q T E T F S S L W S E Y H D D F -

CGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAG

4101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200

c R Q F L H I Y S Q D V A C Y G E N L A Y F P K G F I E N M F F V S A -

MscI NcoI SspI

| | |

CCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGG

4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4300

c N P W V S F T S F D L N V A N M D N F F A P V F T M G K Y Y T Q G -

CATdel8-|

ScaI |

CATdel9-|| |

CATdel11-| || |

BsmI | TatI|| |

| | ||| |

CGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGAT

4301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4400

c D K V L M P L A I Q V H H A V C D G F H V G R M L N E L Q Q Y C D -

CATdel6-| CAT-|

| |

GAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAGCGGATGAATGGCAG

4401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4500

c E W Q G G A * M A E -

BstBI Tth111I AgeI

| | |

AAATTCGAAAGCAAATTCGACCCGGTCGTCGGTTCAGGGCAGGGTCGTTAAATAGCCGCTTATGTCTATTGCTGGTTTACCGGTTTATTGACTACCGGAA

4501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4600

c I R K Q I R P G R R F R A G S L N S R L C L L L V Y R F I D Y R K -

Bsu36I Bpu10I

| |

GCAGTGTGACCGTGTGCTTCTCAAATGCCTGAGGCCAGTTTGCTCAGGCTCTCCCCGTGGAGGTAATAATTGctcgACATGACCAAAATCCCTTAACGTG

4601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4700

c Q C D R V L L K C L R P V C S G S P R G G N N C S T * -

colEI_cas->

|

AGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAA

4701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4800

c -

ACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTC

4801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4900

c -

ori_rep3'

|

CTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTG

4901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5000

c V -

GCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTT

5001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5100

c A I S R V L P G W T Q D D S Y R I R R S G R A E R G V R A H S P A W -

Anhang

153

ori_rep5'

|

GGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGC

5101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5200

c S E R P T P N * -

BssSI

|

GGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTC

5201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5300

c -

ori->

<-ori_ini colEI_cas-|

| |

GATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACAT

5301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5400

c -

G

5401 - 5401

c -



S/DI-> lacZ'-> lacZ-| T7g10SDs-> T7g10SDs-| pelB-> pelB-| pelB_Sfi-| sFLAG-> sFLAG-| glyli2-> glyli2-|

425_VH-> 425_VH-| 425_VL-> 425-VL2-| his5-> his5-| lpp-> lpp-| f1ori_IG5' f1ori_IG3' f1ori_DNA5' f1ori_DNA3'

bla-> bla-| CAT-> CAT-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori-> <-ori_ini ori_rep5' ori_rep3' CATdel6-| CATdel8-|

CATdel9-| CATdel11-| AccI Acc65I AflIII AgeI AhdI AloI ApaI AscI BamHI BbeI

BbsI BcgI BclI Bpu10I BsaI BsaAI BsaBI BseRI BsgI BsmI BspEI BspMI BssHII

BssSI BstAPI BstBI Bsu36I EagI EarI EcoICRI EcoO109I FalI FspI HincII HindIII HpaI

KasI KpnI MluI MscI NaeI NarI NcoI NdeI NgoMIV NspI PciI PpuMI PshAI

PsiI PspOMI PstI PvuI SacI ScaI SfiI SfoI SspI StuI TatI Tth111I XbaI

XmnI


S/DII-> SD-2-> T7g10up1-> T7g10up1-| T7g10up2-> T7g10up2-| T7g10SD-> T7g10SD-| OmpA-> OmpA-| pelB_FseNot->

pelB_FseNot-| phoA-> phoA-| sFLAG_Eco-| lFLAG-> lFLAG-| glyli1-> glyli1-| glyli3-> glyli3-| glyli4-> glyli4-|


425-VL1-| M1-VH-> M1-VH-| M1-VHm-| M1-VLs-> M1-VLl-> M1-VL-| hinge_v1-> hinge_v1-| hinge_v2-> hinge_v2-| hinge_v3->

hinge_v3-| hinge_v4-> hinge_v4-| zip-> zip-| Tzip-> Tzip-| dhlx-> dhlx-| trimA-> trimA-| trimB->

trimB-| trimC-> trimC-| polzip-> polzip-| lacrepE-> lacrepE-| lacrepK-> lacrepK-| hetROPa-> hetROPa-| loopnewa->

loopnewa-| hetROPb-> hetROPb-| loopnewb-> loopnewb-| CH1-> CH1-| CL-> CL-| biot37-> biot37-| biot54->

biot54-| groES-> groES-| p53-> p53-| spacer2-> spacer2-| spacer3-> spacer3-| his5EG-> his5EG-| his5->

his5-| his6-> his6-| T7term-> T7term-| hok/sok_ins5' hok/sok_ins3' hok/sok5' hok/sok3' hok5' hok3'

sok5' sok3' parB5' parB3' skp_cas5' skp_cas3' skp5' skp3' bla_sig-> bla_sig-| ori_rep_wt3' WinZipA1->

WinZipA1-| WinZipA2-> WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2-> WinZipB2-| DHFR[1]-> DHFR[1]-| DHFR[2]-> DHFR[2]-|

dummy-> dummy-| CATdel4-> CATdel7-> CATdel11-> AarI AatII AfeI AflII AleI AlfI AsiSI

AvrII BaeI BbvCI BfrBI BglII BlpI BmgBI BmtI BplI BsiWI BspHI BsrGI BstZ17I

ClaI CspCI EcoNI EcoRI EcoRV FseI FspAI MfeI NheI NotI NruI NsiI PacI

PfoI PmeI PmlI PspXI PsrI RsrII SacII SalI SanDI SapI SbfI SexAI SgrAI

SmaI SnaBI SpeI SphI SrfI SwaI XhoI XmaI ZraI


AclI AcuI AloI AlwNI ApaLI ApoI AseI AvaI BanI BanII BcgI BciVI BglI

Bme1580I BmrI BpmI BpuEI BsaHI BsaWI BsaXI BsaXI BseYI BsiEI BsiHKAI BsmBI Bsp1286I

BsrBI BsrDI BsrFI BstEII BstXI BstYI BtgI BtgZI BtsI DraI DraIII DrdI EaeI

EciI Eco57MI HaeII Hin4I Hin4I MmeI MslI MspA1I PflMI PpiI PpiI PvuII SfcI

SmlI StyI TaqII TaqII XcmI

Anhang

154

pKB2_425_CBD_CBD

(Circular) (MinSite=6) MAP of: pKB2_425_CBD_CBD.seq check: 3317 from: 1 to: 5954

FEATURES Location/Qualifiers

-35_signal 17_20

/label=-35\lacI

-10_signal 42_48

/label=-10\lacI

CDS 83_1165 . . .



=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=



=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=





With 390 enzymes: *


May 21, 19108 22:27 ..

EarI lacI->

| |

acccgacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgtta

1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100


tacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaag

101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200

c -

cggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccct

201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

c -

gcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcc

301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400

c -

AflIII

ApaLI MluI BclI

| | |

tgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcct

401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500


BbsI

|

gcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagca

501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600


ApaI

BstEII PspOMI |

| | |

tctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcact

601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700


BcgI

|

cgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttccca

701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800

c M R A S F P -

BssHII

|

ctgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggacatctcggtagtgggata

801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900


BbsI HpaI

| |

cgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaa

901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000

c -

Anhang

155

BbeI

SfoI |

NarI| |

KasI|| |

||| |

ctctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctcccc

1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100

c -

KpnI

tHP-> |

AseI lacI-|Acc65I| |

| | || |

gcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcggtacccgataaaagcggcttcctgacaggagg

1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200

c -

CAP-> -35lac-| -10lac-|

tHP-| AseI | CAP-| -35lac-> | -10lac-> |

| | | | | | | |

ccgttttgttttgcagcccacctcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgt

1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300

c -

T7g10SDs-> pelB->



| | | | || | |||

gtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgaatttctagagaaggagatatacatatgaaatacctattgcct

1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400

c M K Y L L P -

sFLAG->

pelB_Sfi-||

NcoI ||

NaeI | ||

BglI| | ||

SfiI| | || 425_VH->

NgoMIV|| |pelB-||| sFLAG-||

||| | ||| ||

acggcagccgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggcggactacaaagacgaagtgcaactgcagcagtctggggctgaactggtgaagc

1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500

c T A A A G L L L L A A Q P A M A D Y K D E V Q L Q Q S G A E L V K P -

StuI

|

ctggggcttcagtgaagttgtcctgcaaggcttccggctacaccttcaccagccactggatgcactgggtgaagcagagggctggacaaggccttgagtg

1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600

c G A S V K L S C K A S G Y T F T S H W M H W V K Q R A G Q G L E W -

AccI

|

gatcggagagtttaatcccagcaacggccgtactaactacaatgagaaattcaagagcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctac

1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700

c I G E F N P S N G R T N Y N E K F K S K A T L T V D K S S S T A Y -

NspI

|

atgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtgccagtcgggactatgattacgacggacggtactttgactactggggccaag

1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800

c M Q L S S L T S E D S A V Y Y C A S R D Y D Y D G R Y F D Y W G Q G -

BseRI glyli2->

BstEII 425_VH-|| 425_VL-> SacI

PshAI | Bsu36I || glyli2-|| EcoICRI |

| | | || || | |

ggaccacggtcaccgtctcctcaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgacatcgagctcacccagtctccagcaatcat

1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900

c T T V T V S S G G G G S G G G G S G G G G S D I E L T Q S P A I M -

KpnI

FalI|

Acc65I ||

NspI | ||

AflIII | | ||

PciI | | || BamHI

| | | || |

gtctgcatctccaggggagaaggtcactatgacctgcagtgccagctcaagtgtaacttacatgtattggtaccagcagaagccaggatcctcccccaga

1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000

c S A S P G E K V T M T C S A S S S V T Y M Y W Y Q Q K P G S S P R -

EcoO109I

PpuMI

|

ctcctgatttatgacacatccaacctggcttctggagtccctgttcgtttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatgg

2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100

c L L I Y D T S N L A S G V P V R F S G S G S G T S Y S L T I S R M E -

Anhang

156

EcoRI

XhoI 425-VL1-||

| ||

aggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtcacatattcacgttcggctcggggacagaactcgagatcaaacgggaattcggcgg

2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200

c A E D A A T Y Y C Q Q W S S H I F T F G S G T E L E I K R E F G G -

AhdI

AvrII MfeI |

| | |

tggctccgaaggcggtggcagcgaaggtggcggcctaggcaccacaaatcctggtgtatccgcttggcaggtcaacacagcttatactgcgggacaattg

2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300

c G S E G G G S E G G G L G T T N P G V S A W Q V N T A Y T A G Q L -

NheI

|

gtcacatataacggcaagacgtataaagctctgcagccccacacctccttggcaggatgggaaccatccaacgttcctgccttgtggcagcttcaagcta

2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400

c V T Y N G K T Y K A L Q P H T S L A G W E P S N V P A L W Q L Q A S -

AhdI

BmtI StuI MfeI |

| | | |

gcggtggcctgaccggtctgaactcaggcctcacgacaaatcctggtgtatccgcttggcaggtcaacacagcttatactgcgggacaattggtcacata

2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500

c G G L T G L N S G L T T N P G V S A W Q V N T A Y T A G Q L V T Y -

HindIII

BlpI |

BmtI| |

NheI || |

| || |

taacggcaagacgtataaagctctgcagccccacacctccttggcaggatgggaaccatccaacgttcctgccttgtggcagcttcaagctagctaagct

2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600

c N G K T Y K A L Q P H T S L A G W E P S N V P A L W Q L Q A S * -

f1-ori-|

f1ori_IG5'|

lpp-> lpp-| BamHI ||

| | | ||

tgacctgtgaagtgaaaaatggcgcacattgtgcgacattttttttgtctgccgtttaccgctactgcgtcacggatccccacgcgccctgtagcggcgc

2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700

c M A H I V R H F F C L P F T A T A S R I P T R P V A A H -

attaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgcc

2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800

c * -

f1ori_DNA5'

NaeI |

NgoMIV | |

| | |

acgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagg

2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900

c V L Y G T S T P K N L I R -

BsaAI f1ori_DNA3'

| |

gtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactgg

2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000

c V M V H V V G H R P D R R F F A L * V D S C S K L E -

PsiI

|

aacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaattt

3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100

c Q H S T L S R S I L L I Y K G F C R F R P I G * -

f1ori_IG3'

SspI f1_ori->|

| ||

aacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacatt

3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200

c V A L F G E M C A E P L F V Y F S K Y I -

caaatatgtatccgctcatgtcgagacgttgggtgaggttccaactttcaccataatgaaataagatcactaccgggcgtattttttgagttatcgagat

3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300

c Q I C I R S C R D V G * -

CAT->

|

tttcaggagctaaggaagctaaaatggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttca

3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400

c M E K K I T G Y T T V D I S Q W H R K E H F E A F Q -

DraI

|

gtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggccttt

3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500

c S V A Q C T Y N Q T V Q L D I T A F L K T V K K N K H K F Y P A F -

Anhang

157

BspEI

BsmI |

| |

attcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggagttccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttaca

3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600

c I H I L A R L M N A H P E F R M A M K D G E L V I W D S V H P C Y T -

ccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtg

3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700

c V F H E Q T E T F S S L W S E Y H D D F R Q F L H I Y S Q D V A C -

PasI DraI

| |

ttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaac

3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800

c Y G E N L A Y F P K G F I E N M F F V S A N P W V S F T S F D L N -

MscI NcoI SspI

| | |

gtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatc

3801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900

c V A N M D N F F A P V F T M G K Y Y T Q G D K V L M P L A I Q V H H -

CATdel6-|

CATdel8-| |

ScaI | |

CATdel9-|| | |

CATdel11-| || | |

BsmI | TatI|| | | CAT-|

| | ||| | | |

atgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaatttttttaaggcagtta

3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4000

c A V C D G F H V G R M L N E L Q Q Y C D E W Q G G A * -

BstBI Tth111I

| |

ttggtgcccttaaacgcctggttgctacgcctgaataagtgataataagcggatgaatggcagaaattcgaaagcaaattcgacccggtcgtcggttcag

4001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4100

c -

NotI

|

ggcagggtcgttaaatagccgcttatgtctattgctggtttaccggtttattgactaccggaagcagtgtgaccgtgtgcttctcaaatgcctgcggccg

4101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200

c -

skp_cas5'

XhoI SpeI| BspHI SacII HpaI

| || | | |

cctcgagactagtagatcgtcctgggtcatgacaaccgcggacgcctggcacaagcctaaatgctcacggtattttgggttaaccatgaacgtaatgtga

4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4300

c -

McPC_VL->

SgrAI EcoRV | AlfI

| | | |

cctgtttgtgcagattgcatggacgcaacgccggtgatgacgatatcgccatcaccgtgtagttctgcatccaactgctgcgctaaatcagccagtcgaa

4301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4400

c -

skp3' ClaI

| |

ttgaaggcattacttatttaacctgtttcagtacgtcggcagtgatgtcttttacatcgctgctgttgtaagcaacggcgtttgcatcaacaaccagatc

4401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4500

c -

EcoRV

BsaBI | BmgBI

| | |

gatatcctggctgttggcaacggatttcacagcagtctggatacgagtaaccagtttgccgcgttcttcgttggaacgacgtgcgcgatcctgctcaaaa

4501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4600

c V R D P A Q K -

AsiSI

BlpI BmgBI PvuI

| | |

gcctgcgctttctgagcaaaagtctggcgctgagccatcacgtctttttccagcttagtgcgatcgctgcccgctttcatggactgcagctttttcattt

4601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4700

c P A L S E Q K S G A E P S R L F P A * -

tagcctgcagatcggtttccatacgctgcagttcgctggcacggcctttgaactcattttccagcgtgttagaaacaccggttttctgcgctacctgctg

4701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4800

c -

Anhang

158

BsaI skp5'

| |

gaacaggctgcccatgttgacgattgcaattttgtcagccgcctgagcagaagttgccagtgctaaaccgagacctgcagctaataaccactttttcaca

4801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4900

c -

AlfI

|

ataaactccttaccatcccatttgcaccggagggtgcagttctttgcgtggcccggcgatcttatattgatcgcctaaagtcatcgctacactaccacta

4901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5000

c -

SexAI

|

cattcctttgtggagaacacttaccaggttttaccgatgttaaactggaactgttctgccttgtctccatcgtactttttgaacggctgggcgtaggaga

5001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5100

c V E N T Y Q V L P M L N W N C S A L S P S Y F L N G W A * -

NotI

skp_cas3' |

AccI | |

BcgI SalI| SpeI | |

| || | | |

acaccaacggccccaatggggacatccattgtaatgcgatacccgcagacatacggatattgcttggatctgtcgacactagtgcggccgctttgctcag

5101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5200

c -

pUC_ori->

colEI_cas-> |

| |

gctctccccgtggaggtaataattgctcgacatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaagga

5201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5300

c -

tcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaa

5301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5400

c V V C L P D Q E L P T -

ori_rep3'

|

ctctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagc

5401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5500

c L F P K V T G F S R A Q I P N T V L L V * -

accgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccg

5501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5600

c -

ApaLI

|

gataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctat

5601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5700

c -

ori_rep5' BssSI

| |

gagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaa

5701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5800

c -

ori->

<-ori_ini

|

cgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgcc

5801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5900

c -

PUC_ori-| colEI_cas-|

| |

agcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatg

5901 ---------+---------+---------+---------+---------+---- 5954

c M -



S/DI-> lacZ'-> lacZ-| T7g10SDs-> T7g10SDs-| pelB-> pelB-| pelB_Sfi-| sFLAG-> sFLAG-| glyli2-> glyli2-|

McPC_VL-> 425_VH-> 425_VH-| 425_VL-> 425-VL1-| lpp-> lpp-| skp_cas5' skp_cas3' skp5' skp3' f1ori_IG5'

f1ori_IG3' f1ori_DNA5' f1ori_DNA3' CAT-> CAT-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori-> <-ori_ini ori_rep5' ori_rep3'

CATdel6-| CATdel8-| CATdel9-| CATdel11-| f1_ori-> f1-ori-| pUC_ori-> PUC_ori-| AccI Acc65I AflIII AhdI

AlfI ApaI ApaLI AseI AsiSI AvrII BamHI BbeI BbsI BcgI BclI BglI BlpI

BmgBI BmtI BsaI BsaAI BsaBI BseRI BsmI BspEI BspHI BssHII BssSI BstBI BstEII

Bsu36I ClaI DraI EarI EcoICRI EcoO109I EcoRI EcoRV FalI HindIII HpaI KasI KpnI

MfeI MluI MscI NaeI NarI NcoI NdeI NgoMIV NheI NotI NspI PasI PciI

PpuMI PshAI PsiI PspOMI PvuI SacI SacII SalI ScaI SexAI SfiI SfoI SgrAI

SpeI SspI StuI TatI Tth111I XbaI XhoI


S/DII-> SD-2-> T7g10up1-> T7g10up1-| T7g10up2-> T7g10up2-| T7g10SD-> T7g10SD-| OmpA-> OmpA-| pelB_FseNot->

pelB_FseNot-| phoA-> phoA-| sFLAG_Eco-| lFLAG-> lFLAG-| glyli1-> glyli1-| glyli3-> glyli3-| glyli4-> glyli4-|

Anhang

159

linkerA-> linkerA-| linkerB-> linkerB-| McPC_VH-> McPC_VH-| McPC_VLm-> McPC_VL-| McPCconst-> McPCconst-| 425-VL2-|

M1-VH-> M1-VH-| M1-VHm-| M1-VLs-> M1-VLl-> M1-VL-| hinge_v1-> hinge_v1-| hinge_v2-> hinge_v2-| hinge_v3-> hinge_v3-|

hinge_v4-> hinge_v4-| zip-> zip-| Tzip-> Tzip-| dhlx-> dhlx-| trimA-> trimA-| trimB-> trimB-|

trimC-> trimC-| polzip-> polzip-| lacrepE-> lacrepE-| lacrepK-> lacrepK-| hetROPa-> hetROPa-| loopnewa-> loopnewa-|

hetROPb-> hetROPb-| loopnewb-> loopnewb-| CH1-> CH1-| CL-> CL-| biot37-> biot37-| biot54-> biot54-|

groES-> groES-| p53-> p53-| spacer2-> spacer2-| spacer3-> spacer3-| his5-> his5-| his5EG-> his5EG-|

his5-> his5-| his6-> his6-| T7term-> T7term-| hok/sok_ins5' hok/sok_ins3' hok/sok5' hok/sok3' hok5'

hok3' sok5' sok3' parB5' parB3' bla_sig-> bla_sig-| bla-> bla-| ori_rep_wt3' WinZipA1-> WinZipA1-|

WinZipA2-> WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2-> WinZipB2-| DHFR[1]-> DHFR[1]-| DHFR[2]-> DHFR[2]-| dummy->

dummy-| CATdel4-> CATdel7-> CATdel11-> EGFP-> F64L S65T H231L EGFP-| transcript_start enhancer_region->

enhancer_region-| TATA_box-> transl_ini-> transl_ini-| SV40_ori-> SV40_ori-| CMV_promoter-> CMV_promoter-| mRNA_3'_end

Kan/Neo-R-> Kan/Neo-R-| AarI AatII AfeI AflII AleI AscI BaeI BbvCI BfrBI BglII

BplI BsiWI BsrGI BstZ17I CspCI EcoNI FseI FspI FspAI NruI NsiI PacI PfoI

PmeI PmlI PspXI PsrI RsrII SanDI SapI SbfI SmaI SnaBI SphI SrfI SwaI

XmaI XmnI ZraI


padenyl_signal-> padenyl_signal-| AclI AcuI AgeI AloI AloI AlwNI ApoI AvaI BanI

BanII BcgI BciVI Bme1580I BmrI BpmI Bpu10I BpuEI BsaHI BsaWI BsaXI BsaXI BseYI

BsgI BsiEI BsiHKAI BsmBI Bsp1286I BspMI BsrBI BsrDI BsrFI BstAPI BstXI BstYI BtgI

BtgZI BtsI DraIII DrdI EaeI EagI EciI Eco57MI HaeII Hin4I Hin4I HincII MmeI

MslI MspA1I PflMI PpiI PpiI PstI PvuII SfcI SmlI StyI TaqII TaqII TstI

TstI XcmI pIB_425_TZip

(Circular) (MinSite=6) MAP of: pIB_425_TZip.seq check: 6825 from: 1 to: 4626

ASSEMBLE September 2, 19105 17:11

Symbols: 1 to: 1307 from: pkm30425pcchcl.seq ck: 3908, 1 to: 1307

Stammbaum: pASK30 - pLisc - pACKzip - pKMsclhfzip

kloniert aus SalI XbaI Verdau des pACKzip (Vektorfragment 3980Bp) und

pLisc_safh11 (Fragment 677 Bp)

enthaelt: McPc603sc, 3 Mutationen in der schweren Kette (h11), Linker . . .



=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=



=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=





With 390 enzymes: *


September 2, 19105 17:16 ..

PflMI EarI lacI->

| | |


1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100


BstAPI

|


101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200


BsgI

|


201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300



301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400


AflIII

MluI BclI BsgI TstI

| | | |


401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500



501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600


Anhang

160

ApaI

BanII

BstEII PspOMI |

| | |


601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700


BcgI

|


701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800


BssHII EcoRV

| |


801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900


HincII

HpaI

|


901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000


BbeI

SfoI |

NarI| |

PvuII BsmBI KasI|| |

| | ||| |


1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100


PvuII lacI-| CAP-> CAP-|

| | | |


1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200


lacO1->

mRNA_lac->

-35lac-| -10lac-| |


| | | | | | | |


1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300

b -

sFLAG->

pelB_Sfi-||

BtgI ||

NcoI ||

StyI ||

NaeI | ||

T7g10SDs-> pelB-> BglI| | ||

lacZ-| | T7g10SDs-|| SfiI| | ||

XbaI| | NdeI|| NgoMIV|| |pelB-|||

|| | ||| ||| | |||

CGAATTTctagagaaggagatatacatatgaaatacctattgcctacggcagccgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggcggactaca

1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400

b M K Y L L P T A A A G L L L L A A Q P A M A D Y K -

425_VH->

sFLAG-|| PstI PflMI

|| | |

aagacgaagtgcaactgcagcagtctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagttgtcctgcaaggcttccggctacaccttcaccagcca

1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500

b D E V Q L Q Q S G A E L V K P G A S V K L S C K A S G Y T F T S H -

StuI EagI

| |

ctggatgcactgggtgaagcagagggctggacaaggccttgagtggatcggagagtttaatcccagcaacggccgtactaactacaatgagaaattcaag

1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600

b W M H W V K Q R A G Q G L E W I G E F N P S N G R T N Y N E K F K -

AccI NspI

| |

agcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtgccagtc

1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700

b S K A T L T V D K S S S T A Y M Q L S S L T S E D S A V Y Y C A S R -

BseRI glyli2->

BstEII 425_VH-||

PshAI | BsmBI ||

StyI BtgI | | Bsu36I ||

| | | | | ||

gggactatgattacgacggacggtactttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcggg

1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800

b D Y D Y D G R Y F D Y W G Q G T T V T V S S G G G G S G G G G S G -

Anhang

161

BanII

SacI

EcoICRI |

TstI | |

425_VL-> | | | BspMI

glyli2-|| | | | PstI |

|| | | | | |

tggcggcggatctgacatcgagctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcactatgacctgcagtgccagctcaagtgta

1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900

b G G G S D I E L T Q S P A I M S A S P G E K V T M T C S A S S S V -

KpnI

FalI|

Acc65I ||

NspI | ||

AflIII | | ||

PciI | | || BamHI

| | | || |

acttacatgtattggtaccagcagaagccaggatcctcccccagactcctgatttatgacacatccaacctggcttctggagtccctgttcgtttcagtg

1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000

b T Y M Y W Y Q Q K P G S S P R L L I Y D T S N L A S G V P V R F S G -

EcoO109I

AloI PpuMI

| |

gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtcacatattcac

2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100

b S G S G T S Y S L T I S R M E A E D A A T Y Y C Q Q W S S H I F T -

hinge_v2->

EcoRI | Tzip->

XhoI 425-VL1-|| | AccI hinge_v2-||

| || | | ||

gttcggctcggggacagaactcgagatcaaacgggaattcccgaaaccgtctaccccgccgggttcttctcgtctgaaacagatcgaagacaaactggaa

2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200

b F G S G T E L E I K R E F P K P S T P P G S S R L K Q I E D K L E -

HindIII

Tzip-| | lpp->

| | |

gaaatcctgtctaaactgtaccacatcgaaaacgaactggctcgtatcaaaaaactgctgggtgaacgtTGATAAGCTTGACCTGTGAAGTGAAAAATGG

2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300

b E I L S K L Y H I E N E L A R I K K L L G E R * M A -

f1-ori-|

f1ori_IG5'|

BstAPI lpp-| BamHI ||

| | | ||

CGCACATTGTGCGACATTTTTTTTGTCTGCCGTTTACCGCTACTGCGTCACGGATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTG

2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400

b H I V R H F F C L P F T A T A S R I P T R P V A A H * -

f1ori_DNA5'

NaeI |

NgoMIV | |

| | |

GTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTC

2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500

b -

BsaAI

|

AAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCC

2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600

b V L Y G T S T P K N L I R V M V H V V G H -

f1ori_DNA3' AloI

| |

ATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCG

2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700

b R P D R R F F A L * V D S C S K L E Q H S T L S R -

PsiI SspI

| |

GTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATAT

2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800

b S I L L I Y K G F C R F R P I G * -

padenyl_signal->

f1ori_IG3' padenyl_signal-| | BspHI

| | | |

TAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAG

2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900

b V A L F G E M C A E P L F V Y F S K Y I Q I C I R S * -

SspI EarI bla_sig->

| | |

ACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGC

2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000

b -

Anhang

162

bla->

bla_sig-|| BssSI

|| |

CTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCG

3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100

b M L K I S W V H E W V T S N W I S T A -

XmnI

|

GTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGG

3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200

b V R S L R V F A P K N V F Q * V A R Y Y P V L T P G -

ScaI

BcgI TatI |

| | |

GCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGA

3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300

b K S N S V A A Y T I L R M T W L S T H Q S Q K S I L R M A * -

PvuI

|

GAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACA

3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400

b -

ACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGC

3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500

b -

FspI

|

AACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTT

3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600

b -

padenyl_signal->

padenyl_signal-| |

BglI | | BsaI

| | | |

CTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTA

3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700

b -

AhdI

|

AGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCA

3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800

b -

bla-|

|

TTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAAT

3801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900

b -

pUC_ori->

BspHI colEI_cas-> |

| | |

CTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCG

3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4000

b -

TAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAG

4001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4100

b -

ori_rep3'

|

CAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATC

4101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200

b -

CTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGG

4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4300

b V A I S R V L P G W T Q D D S Y R I R R S G R A E R -

ori_rep5'

|

GGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAG

4301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4400

b G V R A H S P A W S E R P T P N * -

BssSI

|

AAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGG

4401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4500

b -

Anhang

163

ori->

<-ori_ini PUC_ori-|

| |

TTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGG

4501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4600

b -

colEI_cas-|

|

CCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATG

4601 ---------+---------+------ 4626

b -



lacZ-| T7g10SDs-> T7g10SDs-| pelB-> pelB-| pelB_Sfi-| sFLAG-> sFLAG-| glyli2-> glyli2-| 425_VH-> 425_VH-|

425_VL-> 425-VL1-| hinge_v2-> hinge_v2-| Tzip-> Tzip-| lpp-> lpp-| f1ori_IG5' f1ori_IG3' f1ori_DNA5'

f1ori_DNA3' bla_sig-> bla_sig-| bla-> bla-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori-> <-ori_ini ori_rep5' ori_rep3'

f1-ori-| pUC_ori-> PUC_ori-| padenyl_signal-> padenyl_signal-| AccI Acc65I AflIII AhdI AloI ApaI

BamHI BanII BbeI BcgI BclI BglI BsaI BsaAI BseRI BsgI BsmBI BspHI BspMI

BssHII BssSI BstAPI BstEII Bsu36I BtgI EagI EarI EcoICRI EcoO109I EcoRI EcoRV FalI

FspI HincII HindIII HpaI KasI KpnI MluI NaeI NarI NcoI NdeI NgoMIV NspI

PciI PflMI PpuMI PshAI PsiI PspOMI PstI PvuI PvuII SacI ScaI SfiI SfoI

SspI StuI StyI TatI TstI XbaI XhoI XmnI


tHP-> tHP-| S/DII-> SD-2-> T7g10up1-> T7g10up1-| T7g10up2-> T7g10up2-| T7g10SD-> T7g10SD-| OmpA-> OmpA-|

pelB_FseNot-> pelB_FseNot-| phoA-> phoA-| sFLAG_Eco-| lFLAG-> lFLAG-| glyli1-> glyli1-| glyli3-> glyli3-|

glyli4-> glyli4-| linkerA-> linkerA-| linkerB-> linkerB-| McPC_VH-> McPC_VH-| McPC_VL-> McPC_VLm-> McPC_VL-| McPCconst->

McPCconst-| 425-VL2-| M1-VH-> M1-VH-| M1-VHm-| M1-VLs-> M1-VLl-> M1-VL-| hinge_v1-> hinge_v1-| hinge_v3-> hinge_v3-|

hinge_v4-> hinge_v4-| zip-> zip-| dhlx-> dhlx-| trimA-> trimA-| trimB-> trimB-| trimC-> trimC-|

polzip-> polzip-| lacrepE-> lacrepE-| lacrepK-> lacrepK-| hetROPa-> hetROPa-| loopnewa-> loopnewa-| hetROPb-> hetROPb-|

loopnewb-> loopnewb-| CH1-> CH1-| CL-> CL-| biot37-> biot37-| biot54-> biot54-| groES-> groES-|

p53-> p53-| spacer2-> spacer2-| spacer3-> spacer3-| his5-> his5-| his5EG-> his5EG-| his5-> his5-|

his6-> his6-| T7term-> T7term-| hok/sok_ins5' hok/sok_ins3' hok/sok5' hok/sok3' hok5' hok3' sok5'

sok3' parB5' parB3' skp_cas5' skp_cas3' skp5' skp3' CAT-> CAT-| ori_rep_wt3' WinZipA1-> WinZipA1-|

WinZipA2-> WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2-> WinZipB2-| DHFR[1]-> DHFR[1]-| DHFR[2]-> DHFR[2]-| dummy->

dummy-| CATdel6-| CATdel8-| CATdel9-| CATdel11-| CATdel4-> CATdel7-> CATdel11-> EGFP-> F64L S65T H231L

EGFP-| transcript_start enhancer_region-> enhancer_region-| TATA_box-> transl_ini-> transl_ini-| f1_ori-> SV40_ori->

SV40_ori-| CMV_promoter-> CMV_promoter-| mRNA_3'_end Kan/Neo-R-> Kan/Neo-R-| AarI AatII AfeI AflII

AgeI AleI AlfI AscI AsiSI AvrII BaeI BbvCI BfrBI BglII BlpI BmgBI BmtI

BplI Bpu10I BsaBI BsiWI BsmI BspEI BsrGI BstBI BstZ17I ClaI CspCI EcoNI FseI

FspAI MfeI MscI NheI NotI NruI NsiI PacI PasI PfoI PmeI PmlI PspXI

PsrI RsrII SacII SalI SanDI SapI SbfI SexAI SgrAI SmaI SnaBI SpeI SphI

SrfI SwaI Tth111I XmaI ZraI


AclI AcuI AloI AlwNI ApaLI ApoI AseI AvaI BanI BbsI BcgI BciVI Bme1580I

BmrI BpmI BpuEI BsaHI BsaWI BsaXI BsaXI BseYI BsiEI BsiHKAI Bsp1286I BsrBI BsrDI

BsrFI BstXI BstYI BtgZI BtsI DraI DraIII DrdI EaeI EciI Eco57MI HaeII Hin4I

Hin4I MmeI MslI MspA1I PpiI PpiI SfcI SmlI TaqII TaqII TstI XcmI

Anhang

164

pIB_SSHIFTF_BlaFLshuff3#6_TZip

(Circular) (MinSite=6) MAP of: pIB_SSHIFTF_BlaFLshuff3#6_Tzip.seq check: 8556 from: 1 to: 4789

ASSEMBLE July 19, 19105 14:12

Symbols: 1 to: 1381 from: pkje_blafl_shuff3_#6.seq ck: 4703, 1 to:

1381

blawt-Expr. in Minvektor

Planung:16.01.01

Symbols: 1382 to: 1426 from: pf_blass_sshiftf_li_bla_s3_#6.seq ck: 6985,

43 to: 87

ASSEMBLE July 12, 19105 09:42 . . .



=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=



=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=





With 387 enzymes: *


July 19, 19105 14:27 ..

PflMI EarI lacI->

| | |


1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100


BstAPI

|


101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200

c -

BsgI

|


201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

c -


301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400

c -

AflIII

MluI BclI BsgI

| | |


401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500



501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600


ApaI

BanII

BstEII PspOMI |

| | |


601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700


BcgI

|


701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800

c M R A S F P -

BssHII

|

CTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGACATCTCGGTAGTGGGATA

801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900


Anhang

165

HincII

HpaI

|


901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000

c -

BsaXI

BbeI |

SfoI | |

NarI| | |

KasI|| | |

||| | |


1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100

c -

KpnI

tHP-> |

lacI-|Acc65I| |

| || |

GCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGGTACCCGATAAAAGCGGCTTCCTGACAGGAGG

1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200

c -

-35lac-| -10lac-|

tHP-| CAP-> CAP-| -35lac-> | -10lac-> |

| | | | | | |

CCGTTTTGTTTTGCAGCCCACCTCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGT

1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300

c -

T7g10SDs-> bla_sig->



| | | | || | |||

GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTTCTAGAGAAGGAGATATACAtATGagtattcaacatttc

1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400

c M S I Q H F -

BmtI

bla_sig-| |

NheI | | bla->

| | | |

cgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctAGcAGTCACATATTCACGTTCggtggcggtagcggtggcggtagtCACC

1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500

c R V A L I P F F A A F C L P V F A S S H I F T F G G G S G G G S H P -

AcuI

BssSI |

| |

CAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTT

1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600

c E T L V K V K D A E D Q L G A R V G Y I E L D L N S G K I L E S F -

XmnI

|

TCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAgGAGCAACTCGGTCGC

1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700

c R P E E R F P M M S T F K V L L C G A V L S R I D A G Q E Q L G R -

ScaI

BcgI TatI |

| | |

CGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCA

1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800

c R I H Y S Q N D L V E Y S P V T E K H L T D G M T V R E L C S A A I -

PvuI FspI

| |

TAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTgCTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCgCAACATGGGGGATCATGTAAC

1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900

c T M S D N T A A N L L L T T I G G P K E L T A F L R N M G D H V T -

FspI

|

TCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGAcGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTA

1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000

c R L D R W E P E L N E A I P N D E R D T T T P V A M A T T L R K L -

TTAtCTGGtGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGtCCTTCCGG

2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100

c L S G E L L T L A S R Q Q L I D W M E A D K V A G P L L R S V L P A -

BsaI

|

CTGGtTGGTTTATaGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCtCGTATCGTAGT

2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200

c G W F I A D K S G A G E R G S R G I I A A L G P D G K P S R I V V -

Anhang

166

AhdI bla-|

| |

TATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGaGCCTCACTGATTAAGCATtggGGTGGCggcggtggc

2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300

c I Y T T G S Q A T M D E R N R Q I A E I G A S L I K H W G G G G G -

SmaI

SrfI

AvaI |

XmaI | Tzip->

| | |

agcccgggcggtggcagccgtctgaaacagatcgaagacaaactggaagaaatcctgtctaaactgtaccacatcgaaaacgaactggctcgtatcaaaa

2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400

c S P G G G S R L K Q I E D K L E E I L S K L Y H I E N E L A R I K K -

HindIII BstAPI

Tzip-| | lpp-> DraIII lpp-| BamHI

| | | | | |

aactgctgggtgaacgtTAGTAAGCTTGACCTGTGAAGTGAAAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTTTTGTCTGCCGTTTACCGCTACTGCGTCACG

2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500

c L L G E R * M A H I V R H F F C L P F T A T A S R -

f1-ori-|

f1ori_IG5'|

||

GATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTT

2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600

c I P T R P V A A H * -

f1ori_DNA5'

NaeI |

NgoMIV | |

| | |

TCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCA

2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700

c V L Y G T -

DraIII AloI

BsaAI | f1ori_DNA3' |

| | | |

CCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTT

2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800

c S T P K N L I R V M V H V V G H R P D R R F F A L * -

AloI

BsaXI | PsiI

| | |

AATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAA

2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900

c V D S C S K L E Q H S T L S R S I L L I Y K G F C R F R P I G * -

SspI f1ori_IG3'

| |

AAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCC

2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000

c V A L F G E M C A E P L -

TATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGtcgagacgttGGGTGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACC

3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100

c F V Y F S K Y I Q I C I R S C R D V G * -

Bpu10I CAT->

| |

GGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCAT

3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200

c M E K K I T G Y T T V D I S Q W H -

CGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAA

3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300

c R K E H F E A F Q S V A Q C T Y N Q T V Q L D I T A F L K T V K K N -

BspEI

BsmI |

| |

ATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAgTTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGAT

3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400

c K H K F Y P A F I H I L A R L M N A H P E F R M A M K D G E L V I -

ATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTA

3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500

c W D S V H P C Y T V F H E Q T E T F S S L W S E Y H D D F R Q F L -

PflMI

|

CACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGG

3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600

c H I Y S Q D V A C Y G E N L A Y F P K G F I E N M F F V S A N P W V -

Anhang

167

BtgI

NcoI

MscI StyI SspI

| | |

TGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCT

3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700

c S F T S F D L N V A N M D N F F A P V F T M G K Y Y T Q G D K V L -

CATdel6-|

CATdel8-| |

ScaI | |

CATdel9-|| | |

CATdel11-| || | |

BsmI | TatI|| | |

| | ||| | |

GATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGC

3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800

c M P L A I Q V H H A V C D G F H V G R M L N E L Q Q Y C D E W Q G -

CAT-| BstBI

| |

GGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAGCGGATGAATGGCAGAAATTCGAAAGC

3801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900

c G A * M A E I R K Q -

Tth111I AgeI

| |

AAATTCGACCCGGTCGTCGGTTCAGGGCAGGGTCGTTAAATAGCCGCTTATGTCTATTGCTGGTTTACCGGTTTATTGACTACCGGAAGCAGTGTGACCG

3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4000

c I R P G R R F R A G S L N S R L C L L L V Y R F I D Y R K Q C D R -

Bsu36I Bpu10I BtgI

| | |

TGTGCTTCTCAAATGCCTGAGGCCAGTTTGCTCAGGCTCTCCCCGTGGAGGTAATAATTGctcgACATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCC

4001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4100

c V L L K C L R P V C S G S P R G G N N C S T * -

pUC_ori->

colEI_cas-> |

| |

ACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACC

4101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200

c -

AcuI

|

AGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAG

4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4300

c -

ori_rep3' AlwNI

| |

CCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGT

4301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4400

c V A I S R -

GTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGAC

4401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4500

c V L P G W T Q D D S Y R I R R S G R A E R G V R A H S P A W S E R P -

ori_rep5'

|

CTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGA

4501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4600

c T P N * -

BssSI

|

ACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGAT

4601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4700

c -

ori->

<-ori_ini PUC_ori-| colEI_cas-|

| | |

GCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATG

4701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+--------- 4789

c -



S/DI-> lacZ'-> lacZ-| T7g10SDs-> T7g10SDs-| Tzip-> Tzip-| lpp-> lpp-| f1ori_IG5' f1ori_IG3' f1ori_DNA5'

f1ori_DNA3' bla_sig-> bla_sig-| bla-> bla-| CAT-> CAT-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori-> <-ori_ini

ori_rep5' ori_rep3' CATdel6-| CATdel8-| CATdel9-| CATdel11-| f1-ori-| pUC_ori-> PUC_ori-| Acc65I AcuI AflIII

AgeI AhdI AloI AlwNI ApaI AvaI BamHI BanII BbeI BcgI BclI BmtI Bpu10I

BsaI BsaAI BsaXI BsgI BsmI BspEI BssHII BssSI BstAPI BstBI BstEII Bsu36I BtgI

DraIII EarI FspI HincII HindIII HpaI KasI KpnI MluI MscI NaeI NarI NcoI

NdeI NgoMIV NheI PflMI PsiI PspOMI PvuI ScaI SfoI SmaI SrfI SspI StyI

TatI Tth111I XbaI XmaI XmnI

Anhang

168


S/DII-> SD-2-> T7g10up1-> T7g10up1-| T7g10up2-> T7g10up2-| T7g10SD-> T7g10SD-| OmpA-> OmpA-| pelB-> pelB-|

pelB_Sfi-| pelB_FseNot-> pelB_FseNot-| phoA-> phoA-| sFLAG-> sFLAG-| sFLAG_Eco-| lFLAG-> lFLAG-| glyli1->

glyli1-| glyli2-> glyli2-| glyli3-> glyli3-| glyli4-> glyli4-| linkerA-> linkerA-| linkerB-> linkerB-| McPC_VH->

McPC_VH-| McPC_VL-> McPC_VLm-> McPC_VL-| McPCconst-> McPCconst-| 425_VH-> 425_VH-| 425_VL-> 425-VL1-| 425-VL2-|

M1-VH-> M1-VH-| M1-VHm-| M1-VLs-> M1-VLl-> M1-VL-| hinge_v1-> hinge_v1-| hinge_v2-> hinge_v2-| hinge_v3-> hinge_v3-|

hinge_v4-> hinge_v4-| zip-> zip-| dhlx-> dhlx-| trimA-> trimA-| trimB-> trimB-| trimC-> trimC-|

polzip-> polzip-| lacrepE-> lacrepE-| lacrepK-> lacrepK-| hetROPa-> hetROPa-| loopnewa-> loopnewa-| hetROPb-> hetROPb-|

loopnewb-> loopnewb-| CH1-> CH1-| CL-> CL-| biot37-> biot37-| biot54-> biot54-| groES-> groES-|

p53-> p53-| spacer2-> spacer2-| spacer3-> spacer3-| his5-> his5-| his5EG-> his5EG-| his5-> his5-|

his6-> his6-| T7term-> T7term-| hok/sok_ins5' hok/sok_ins3' hok/sok5' hok/sok3' hok5' hok3' sok5'

sok3' parB5' parB3' skp_cas5' skp_cas3' skp5' skp3' ori_rep_wt3' WinZipA1-> WinZipA1-| WinZipA2->

WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2-> WinZipB2-| DHFR[1]-> DHFR[1]-| DHFR[2]-> DHFR[2]-| dummy-> dummy-|

CATdel4-> CATdel7-> CATdel11-> EGFP-> F64L S65T H231L EGFP-| transcript_start enhancer_region->

enhancer_region-| TATA_box-> transl_ini-> transl_ini-| f1_ori-> SV40_ori-> SV40_ori-| CMV_promoter-> CMV_promoter-|

mRNA_3'_end Kan/Neo-R-> Kan/Neo-R-| AarI AatII AccI AfeI AflII AleI AlfI AscI AsiSI

AvrII BaeI BbvCI BfrBI BglI BglII BlpI BmgBI BplI BsaBI BseRI BsiWI BspHI

BspMI BsrGI BstZ17I ClaI CspCI EagI EcoICRI EcoNI EcoO109I EcoRI EcoRV FalI FseI

FspAI MfeI NotI NruI NsiI NspI PacI PciI PfoI PmeI PmlI PpuMI PshAI

PspXI PsrI PstI RsrII SacI SacII SalI SanDI SapI SbfI SexAI SfiI SgrAI

SnaBI SpeI SphI StuI SwaI XhoI ZraI


padenyl_signal-> padenyl_signal-| AclI ApaLI ApoI AseI BanI BbsI BcgI BciVI Bme1580I

BmrI BpmI BpuEI BsaHI BsaWI BsaXI BseYI BsiEI BsiHKAI BsmBI Bsp1286I BsrBI BsrDI

BsrFI BstXI BstYI BtgZI BtsI DraI DrdI EaeI EciI Eco57MI HaeII Hin4I Hin4I

MmeI MslI MspA1I PpiI PpiI PvuII SfcI SmlI TaqII TaqII XcmI

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Entwurf und Selektion von EGF-R spezifischen Peptiden ... · PDF fileEntwurf und Selektion von EGF-R spezifischen Peptiden, sowie Generierung und Charakterisierung von Peptid-Enzym-Fusionen