2.4. Enzime imobilizate

Principiul general al procedeelor de imobilizare a enzimelor constă în legarea sau fixarea unei enzime sau a unui sistem multienzimatic de suportul insolubil în apă, în condiţiile păstrării proprietăţilor catalitice, respectiv specificitatea de acţiune şi posibilitatea de a acţiona la pH şi temperatură asemănătoare enzimelor libere (neimobilizate).

Suporturile sau matricile utilizate în imobilizarea enzimelor pot fi de natură anorganică: silicea coloidală, caolinita, particule sau perle de sticlă cu grad de porozitate controlat, oxizi metalici (alumina, oxid de zirconiu, oxid de titan, etc.), şi de natură organică: celuloza şi derivaţii acesteia, agaroză, amidon, dextran, colagen, polimeri obţinuţi prin polimerizarea unor monomeri de tipul acrilamidă, acid metacrilic ş.a., răşini formaldehidice etc.

In funcţie de natura legăturilor care se stabilesc între enzime şi suportul de imobilizare, procedeul sau metodele de imobilizare pot fi fizice sau chimice.

Procedeele fizice se bazează pe imobilizarea enzimelor prin intermediul legăturilor fizice ca de exemplu, interacţiuni electrostatice, formarea de legaturi ionice, formarea de legături de hidrogen, interacţiuni proteină-proteină etc., diferenţiindu-se în acest sens (Figura 5):

- adsorbţia pe suporturi insolubile în apă (cărbune, clei, răşini schimbătoare de ioni, celuloză, sticlă etc);

- includerea în structuri macromoleculare (această incluziune se realizează prin polimerizarea unor materiale ca poliacrilamidă în silicagel, amidon, în prezenţa moleculelor de enzimă, astfel încît se formează o matrice de polimer în care sunt incluse moleculele de enzimă şi în care atît substratul cît şi produsul poate să difuzeze);

- microîncapsulare în membrane semipermeabile;- imobilizarea în celule de ultrafiltrare.

Procedeele chimice de imobilizare a enzimelor se referă la cele care conduc la formarea de legături covalente sau parţial covalente, între grupările funcţionale, care însă nu sunt esenţiale pentru manifestarea activităţii catalitice (nu sunt implicate în situsul catalitic al enzimei), şi un suport activat chimic, insolubil în apă. In cadrul acestor procedee se pot evidenţia (fig. 6):

- legarea covalentă a enzimelor de suporturi insolubile, care posedă grupări reactive sau care pot fi activate prin diferite reacţii chimice;

- copolimerizarea enzimelor cu un monomer reactiv şi legarea încrucişată (cross-linking) sau reticulare intra- şi intermoleculară a enzimelor legate de un suport cu un reactiv multifuncţional.

1

La imobilizarea enzimelor trebuie să se aibă în vedere următoarele: conformaţia spaţială a moleculelor de enzimă în sistemul imobilizat este diferită de cea a mediului natural din care s-a extras enzimă. Pe de altă parte, structura tridimensională a moleculei de enzimă este distorsionată de legăturile sale cu suportul; micromediul moleculei de enzimă imobilizat este diferit de cel al enzimei aflate în soluţie, afectîndu-se viteza de difuzie a substratului şi a produşilor de reacţie. Inhibiţia de substrat şi de produs poate, de asemenea juca un rol important; procesul de transport al substanţelor este un proces pasiv, în comparaţie cu situaţia enzimei din celula vie, iar aceasta va avea desigur influenţă şi asupra vitezei de reacţie.

Imobilizarea enzimelor pe un suport anorganic sau organic provoacă schimbări în comportamentul acestora şi în cinetica reacţiilor: se măreşte stabilitatea enzimei (stabilitatea enzimei atît în stare statică cît şi în stare dinamică fiind influenţată de procedeul de imobilizare, măsura acestei stabilităţi fiind 1/2 din durata de viaţă a enzimei); se schimbă afinitatea enzimei faţă de substrat, aceasta fiind influenţată de durata lor de contact care, la rîndul ei, este determinată de viteza fluxului sau viteza de agitare a substratului în contact cu sistemul suport-enzimă, de viteza de difuzie a substratului la enzimă imobilizată; se modifică caracterul catalizei prin trecere de la cataliza omogenă la cea eterogenă.

La folosirea enzimelor imobilizate poate avea loc o variaţie a pH-ului optim iar randamentul în produsul de transformare este micşorat. De exemplu, prin folosirea amiloglucozidazei în soluţie, plecînd de la o suspensie de amidon cu 33% s.u., se ajunge la un randament de transformare în glucoza de 95,5— 96%, în timp ce la folosirea amiloglucozidazei imobilizate, randamentul este de 92—93%.

In orice caz, preparatele de enzime imobilizate, faţă de cele libere sau solubile, prezintă o serie de avantaje printre care se amintesc următoarele:

- refolosirea repetată a enzimei, cu aceeaşi cantitate de enzimă putându-se transforma cantităţi mai mari de substrat;

- se poate lucra în sistem semicontinuu sau continuu, cu automatizarea procesului, ceea ce asigură un control precis al parametrilor de lucru;

- are loc o creştere a vitezei de lucru, prin controlul riguros al vitezei fluxului de substrat şi al concentraţiei acestuia;

- se poate stopa reacţia enzimatică la momentul dorit şi se evită trecerea enzimei în produsul transformat;

- costurile globale de producţie sunt mai mici în comparaţie cu procedeele de folosire .a enzimelor libere;

- se pot utiliza şi enzime care nu sunt trecute pe lista GRAS (Generally Recognised as Safe).

Factorii critici ce trebuie luaţi în considerare la folosirea enzimelor imobilizate sunt următorii:

- eficienţa economică a imobilizării este determinată de costul enzimei, suportului şi metoda de imobilizare;

- activitatea enzimei imobilizată care este în funcţie de tehnica de imobilizare, caracteristicile materialului de suport, viteza de difuzie a substratului la enzimă şi a produsului de transformare;

- caracteristicile substratului ce trebuie transformat;- stabilitatea enzimei care trebuie menţinută un timp cât mai îndelungat;- contaminarea microbiologică a sistemului enzimă-suport în timpul utilizării reactorului

respectiv.

2