1

Biokémia gyakorlatEnzimek fogalma, jellemzői.

Lipáz enzim működése, aktivitás mérése.

EnzimekFehérjék, amelyek csökkentik a reakció energiagátját, katalizátorként hatnak.

Csak a sebességet befolyásolják, nem az egyensúlyt.

Az egyes enzimek aktivitásához ük é l á kötődő szükséges, lazán kötődő, nem

fehérje természetű enzimalkotórészt KOENZIMnek nevezik.

A régies elnevezés szerint a koenzimaz enzim fehérjerészével (APOENZIM) alkotja a katalitikus hatást mutató hatékony enzimet (HOLOENZIM).

Koenzim + Apoenzim = Holoenzim

Enzimek

Az enzimek működését aktivitásnak nevezzük.

Minden enzim fehérje, emiatt működésük erősen függ ahőmérséklettől és a pH-tól, mindegyikre jellemző egyhőmérséklet- és pH-optimum.Az enzimek specifikusak - széles szubsztrátspecificitású enzim

- szűk szubsztrátspecificitású enzimAz aktivitás pontos és törvényes (SI) egysége a katal (kat:katalitikus aktivitás): ami egy másodperc alatt végbemenő1 mol-nyi szubsztrát átalakítását jelenti1 kat = 1 mol szubsztrát/sNem hivatalos (nem SI), de nemzetközileg elfogadottnemzetközi egység U (unit) a használatos aktivitást jelző.1 U = 1 mikromol szubsztrát/ min

Enzimek jellemzőiReverzibilis komplexet alkotnak a szubsztráttal. Az aktív hely részei:

- szubsztrát kötő hely- katalitikus hely

Az enzimreakciókszabályozása

A szabályozott enzimreakciók sorozata eredményezi aszervezet biokémiai reakcióinak a többségét. Ez nem más, mintaz anyagcsere-folyamatok láncolata, a metabolizmus.

Szabályzás módjai:- külső szabályozás: a működések integrációját, szabályozásáty g j , y

végző idegi- és vegyi-szervezés, azaz aneurohormonális szabályozás.

- belső (endogén) szabályozás: egyedi sejtben, függetlenül a külsőkontrolltól,valósul meg az önszabályozás.

- visszacsatolás (feed back), vagy alloszterikus gátlás;

- alloszterikus aktiválás;- kompetitív gátlás.

MetabolizmusokMetabolizmus = anyagcsere: anyag-, energia- és információáramlás

- Építő (Anabolizmus): Egyszerű anyagból összetett lesz,energiára van szükség. Szintézis folyamatok ilyenek, pl. fotoszintézis,fehérje szintézis, zsírsavak szintézise.

- Lebontó (Katabolizmus): Az összetett anyagoklebontódnak egyszerű anyagokra, energia szabadul fel. Ez az energia(katabolitikus energia) a sejtben átalakul munkavégzési- éstartalékenergiává, és egy része felszabadul mint hőenergia, pl.zsírsavak lebontása.Metabolizmusok szervezetünkben:

- szénhidrátok- fehérjék- zsírok- nukeinsavak

2

A zsírokA növények és az állatok fő energiaraktározó

anyagai a zsírok, amelyek trigliceridek formájában képezik a szervezet energiaforrását.

A zsírok sok állatnál térkitöltő és ig t lő g ( l b él il bő szigetelőanyag (pl. az embernél ilyen a bőr

alatti zsírszövet), de lökéstompító szerepe is van (pl. a sarkon és a tenyéren található zsírpárnák).

A zsírok különféle trigliceridek keverékei, amelyeknek mindegyike három zsírsavból (hosszabb szénláncú karbonsavak) és egy glicerinből áll.

Zsírsav + glicerin = triglicerid/triacil-glicerid

Lipáz enzimTáplálékkal felvett trigliceridek emésztését végzi.Fokozatosan bontják le a triglicerideket, tehát a reakció első lépésében diglicerid, majd monoglicerid keletkezik, és csak ezután válik a hidrolízis teljessé.

Lipázok előfordulásaEmlősök hasnyálmirigye (Pankreász lipáz)és mája

Ricinusmag

Olajos magvakOlajos magvak

Gabonamagvak

Tej

Egyes penészgombák

Baktériumok

Lipázok felhasználása

Sajtgyártásnál a mikroorganizmusok által termelt lipázt a sajtaroma fokozására lehet hasznosítani.

Tejcsokoládé-gyártásnál a tejzsírok csekély hidrolízisével a termék tejes karakterét lehet növelni

Lipáz enzim jellemzésepH optimumuk 7.0 – 8.8 (gyengén lúgos közegben

maximális aktivitásúak).

Hőmérsékleti optimumuk 30–40 °C között van.

Katalizáló hatásukat a kalciumionok fokozzák, mert ezeka felszabaduló zsírsavakat oldhatatlan kalciumsók alak-jában lekötik.

Katalizáló hatásukat gyakran –30 °C-ig is megtartják(zsírtartalmú húsok és zöldségfélék hűtve tárolásakorlehet jelentős).

Lipáz aktiválása: kolipázzal.

A lipázok annál aktívabbak, minél kisebbek az emulgeáltolajcseppek → Működésüket segíti: epe(sav) – emulgeáljaa zsírokat.

Epesavak funkciói

A májműködés a koleszterin „lebontásával”, átalakításávaltermeli az epesavat, megszabadítva a szervezetet a fölöslegbenmaradó, s így már valóban káros koleszterintől.

Az így képződött epesavak segítségével fokozódik akoleszterin közvetlen kiürülése a májból a bélbe, melynek egyj , y gyrésze visszaszívódik, a többi pedig a széklettel elhagyja aszervezetet (elégtelen májműködés → fölös mennyiségű koleszterinmarad a szervezetben, ami viszont az érelmeszesedéskialakulásának egyik tényezője)

Elősegíti a koleszterin oldódását – meggátolja az epekő kiválást.

Emulgeálja a triglicerideket – elősegíti a zsír hidrolízist.

Az epesavak azokat a vírusokat is képesek elpusztítani, melyekkülsô fehérjeburokkal, peplonnal rendelkeznek, pl. herpesz, HIV

3

Epesavak funkcióiAz epesavak a vastagbélben normálisan jelen lévő (Gram-negatív)baktériumok sejtfalának mérgező, nagy molekulájú anyagait,endotoxinjait hatástalanítják, széttördelik.

Endotoxinok → allergizáló hatásúak→ szívritmuszavart is okozhatnak→ lázkeltők→ felelősek a szepszisért, azaz a vérmérgezésért,

különösen műtétek után→ közrejátszhatnak a férfi meddőségben is

Megkönnyíti a zsíroldható vitaminok felszívódását a bélben.

A vitamin → bőr-, légzőszervi és emésztési bajok

D vitamin → csontritkulás, bőrbetegségek

E vitamin → meddőség, izületi (főleg porc) betegségek,daganatos megbetegedések

Zsír mobilizálás a zsírsejtekben

Adrenalin, Glukagon, Epinefrin

Protein foszfatáz

Lipáz aktivitás mérése

Probléma: a szubsztrát nem oldódik vízben, az enzim vizes közegben működik.

• Szubsztrát:tejzsír, felszabaduló zsírsavak lúgos titrálása fenolftalein indikátor mellett.

• Szubsztrát: PNP palmitát felszabaduló PNP• Szubsztrát: PNP-palmitát, felszabaduló PNPmérése spektrofotometriásan 400 nm.

• Szubsztrát: radioaktív jelzett triglicerid (triolein), emulzió képzés lecitinnel.

• Szubsztrát: triglicerid, felszabaduló zsírsavak GC mérése, Me-észter formában.

2008.04.13.

1

Biokémia gyakorlat

Kataláz enzim funkciója, aktivitás mérése

Enzimek általánosjellemzése

1878-ban Wilhelm Kühne (1837–1900) német fiziológus használta először az enzim kifejezést.

Az enzimek az élő szervezetben végbemenő reakciókat katalizálják.

Az enzimek nem változtatják meg a reakciók irányát, csak az egyensúly beálltához vezető reakciók sebességét növelik meg.

Az egyes enzimek aktivitásához szükséges, lazán kötődő, nem fehérje természetű enzimalkotórészt KOENZIMnek nevezik.

A régies elnevezés szerint a koenzim az enzim fehérjerészével (APOENZIM) alkotja a katalitikus hatást mutató hatékony enzimet (HOLOENZIM).

KofaktorokSzámos olyan kémiai reakció van, melyek katalíziséhez nemelegendő a húsz aminosav biztosította kémiai repertoár.

A kofaktorok olyan atomok (pl.fématomok), ionok vagy szervesmolekulák, melyek sztöchiometrikus mennyiségben, közvetlen szerepet játszanak a katalízisben.

A k f k élküli i i ” í k f k lA kofaktor nélküli enzim az „apoenzim”, míg kofaktorral„holoenzim”.

A kofaktor lehet erősen kötött „prosztetikus csoport”, melyvagy kovalensen kötött, vagy ha nem, akkor csak az enzimdenaturálásával távolítható el.

A szerves molekulájú kofaktorokat „koenzimek”-nek isnevezik. A vitaminok zöme koenzimek kiinduló anyaga.

A koenzimek lehetnek prosztetikus csoportok, de lehetnekreverzibilisen kötődő ko-szubsztrátok is.

Kofaktorok

Koenzimek Az enzimek osztályzása

Az enzimeket hivatalosan a katalizált kémiai reakció típusa szerintosztályozzák, katalogizálják

2008.04.13.

2

Biológiai oxidáció

Szén oxidációja:

-CH3 alkil-CH2-OH (hidroxi) alkohol

O-C (karbonil) aldehidC (karbonil) aldehid

HO

-C (karboxil) karbonsavOH

CO2 dekarboxilezés

Biológiai oxidáció

A hidrogének (elektronok) koenzimekre kerülnek és ezek szállítják a terminális oxidáció helyére, ahol oxigénre kerülnek, miközben víz keletkezik

Elektrontranszfer módjai:

- e- átvitel fém ionok részvételével- e- átvitel H+ átvitellel FAD → FADH2 2e-

- e- átvitel H- ion formában NAD(P)+ → NAD(P)H +H+ 2e-

Elektrontranszfert katalizáló enzimek

OxidázokOxigén az e- akceptor.- víz keletkezéssel járó (citokróm oxidáz Cu2+ →Cu+)- H2O2 keletkezéssel járó (flavoproteinek FAD, FMN)

Dehidrogenázok (oxigén nem vesz részt)koenzim: NAD+, NADP+

prosztetikus csoport: FAD, FMN(glikolízis, citrát ciklus, e- transzport lánc)

Hidroperoxidázokelektron donor: Fe2+, glutation, aszkorbinsavelektron akceptor: H2O2 vagy szerves peroxidokpl. peroxidáz, kataláz

Oxigenázok (az oxigén beépül a szubsztrátba)– Monooxigenáz O +H2O (NADPH v. NADH kell) – Dioxigenáz - O2 mindkét atomját beépítik a célmolekulába

(NADPH v. NADH kell)

Molekuláris oxigén vízzé történő redukciója során keletkező szabadgyökök és intermedierek

O2e - O2

- Szuperoxid anion gyök

O2- + H+ HO2

HO2 +e -

H+ H2O2 Hidrogénperoxid

Protonált szuperoxid gyök

2

H2O2 OH OH+ disszociációHidroxil gyök

H2O2 + H+ e - OH H2O+

OH H+ e -+ H2O

Hidrogén-peroxid a humán szervezetben

A sejtek számára 20–50 µmol/l H2O2 koncentráció mérsékelten, míg az 50 µmol/l feletti már erősen toxikus.

Egyes táplálékok, például a fekete és zöld tea, valamint az instant kávé H2O2 koncentrációja több mint 100 µmol/l.

A vizelet is aránylag nagy koncentrációban (>100 µmol/l) tartalmaz y g gy ( µ / )hidrogén-peroxidot, ami egyes kóros folyamatokban még további növekedést mutathat.

A plazma hidrogén-peroxid-koncentrációja 0–35 µmol/l között változik,míg tumorokban 100 µmol/l feletti is lehet.

Állatkísérletek alapján a gyulladásos folyamatokban lokálisan 10–100 µmol/l hidrogén-peroxid képződhet

A hidrogén-peroxid-koncentráció a nagy katalázaktivitású sejtekben, májsejtekben és vörösvértestekben a legkisebb (0,1 nmol/l).

Hidrogén peroxid keletkezésehumán szervezetben

Szabad gyökös folyamatok során szuperoxid anionból, a szuperoxid-dizmutáz enzim közreműködésével.

A mitokondriális elektrontranszport során öregedésben, apoptózisban.

A xantin-oxidáz közreműködésével ischaemiában (vértelenség) és reperfúzióban (véráramlás visszaállítása).

Izomvesztéskor immobilizáció folyamán és intenzív fizikai megterhelés alkalmával.

Mitokondriális oxidatív stresszben, malignus (rosszindultalú)folyamatokban, diabeteszben és egyéb oxidatív körülmények között.

2008.04.13.

3

H2O2-t termelő enzimek

xantin-oxidáz és az aldehid-oxidáz a citoszolban

a citokróm P450 autooxidáció az endoplazmatikus retikulumban

a húgysav-oxidáz, a D-aminosav-oxidáz és a hidroxisav-oxidáz a peroxiszómákban

a mono-amin-oxidáz és piridoxamin-oxidáz a mitokondriumban

termelik egyes szájban lévő baktériumok és a vizeletben lévő oxidáz enzimek is

membrán lipidek peroxidálódása

fehérjékhez kötődés – inaktiválás

Káros hatások

j

nukleinsavakhoz kötődés – mutagén, karcinogén

oldhatatlan komplexek keletkezése – öregedés

Káros hatások ROS (Reactive Oxigen Species) eliminálása

Enzimatikusan – Szuperoxid dizmutáz (Cu, Zn vagy Mn tartalmú

enzim)2O2· +2H+ → H2O2 +O2

– Peroxidáz– PeroxidázH2O2 vagy lipid peroxid → H2O

– Kataláz (hem fehérje)H2O2

→ H2O + O2

Nem enzimatikusan– Antioxidáns anyagok: C, E, A, vitaminok, glutation,

ubikinon, bilirubin, polifenolok

Katalázok

2 H2O2 2H2O + O2Katalizált reakció:

Csoportosításuk:

Katalázok I. : a legelterjedtebbek a természetben, monofunkciós g j ,hemet tartalmaznak, amelyek további két alosztályra bonthatók:

1. kis molsúlyú alegységekből (<60 kDa )2. nagy molsúlyú alegységekből (> 75 kDa )

épülnek fel.

Katalázok II.: kevésbé elterjedt, két funkciós hemet tartalmaz, növényi peroxidázokkal homológok.

Katalázok III.: nem hemet, hanem Mn-t tartalmazó katalázok.

Kataláz I

A kataláz (E.C. 1.11.1.6.) négy alegységből álló, hemprosztetikus csoportot tartalmazó enzim.

A peroxiszómákban, a glioxiszómákban és – kukoricaesetében – a mitokondriumokban lokalizálódik.esetébe to o d u o b o ód

A katalizált reakció sebessége nagy, viszont a kataláz szubsztrátaffinitása kicsi.

Az enzim csaknem minden növényi és állati sejtben megtalálható.

2008.04.13.

4

Kataláz szerkezete

Hem

Porfirin váz/ Hem

NADP

Enz(Por-FeIII) + H2O2 Enz(Por+.-FeIV= O) + H2O

Enz(Por+.-FeIV= O) + H2O2 Enz(Por-FeIII) + H2O +O2

(1)

(2)

Két lépésben redukálják a hidrogénperoxidot

Monofunkciós hem katalázok

1 lépés: Monooxigén transzfer a hem centrumra, miközben porfirin kation gyökhöz koordinált oxi-ferril részeszecske és víz keletkezik.

2. lépés:Az enzimet a második hidrogénperoxid molekula regenerálja .

Monofunkcióshem katalázok

Pentacoordinate Hexacoordinate

Kataláz aktivitás mérése

Gázvolumetriásan: keletkező termék

H2O2 = H2O + O2

Redox titrálással: maradék szubsztrát

5H2O2 + 2KMnO4 + 4H2SO4 = 2KHSO4 + 2MnSO4 + 8H2O +5O2

- Kénsavas savanyítás: reakció leállítás is.

2008.04.13.

1

Biokémia gyakorlatAminosav anyagcsereAminosav anyagcsere

Tirozináz enzim funkciója, aktivitás mérése

Aminosavak

Az aminosavak (más néven amino-karbonsavak) olyan szerves vegyületek, amelyekmolekulájában aminocsoport (-NH2) éskarboxilcsoport (-COOH) egyaránt előfordul.

Az α-aminosavak kiemelkedő jelentőségűek az élővilág számára,l f h l k l k ( k) kmivel a fehérjemolekulák (proteinek) építőkövei.

A szervezet fehérjéinek és egyéb nitrogéntartalmú alkotórészeinekfelépítéséhez, és ezek újraképzéséhez szükséges aminosavakat atáplálék fehérjéi adják.

Az aminosavak ikerionos szerkezetűek.

Aminosavak

A legtöbb α-aminosav optikailag aktív, két tükörképi izomerje (enantiomerje) lehetséges.

Az alanin két tükörképi izomerje.

Aminosavak kémiai tulajdonságai

Az aminosavak ún. amfoter tulajdonságú vegyületek, vagyis amfolitok: savakkal szemben gyenge bázisként, bázisokkal (lúgokkal) szemben gyenge savként viselkednek.

Vi ld tb á t l ítik ő k ill t ő Vizes oldatban egyaránt semlegesítik az erős savak illetve erős bázisok kis mennyiségét, illetve lényegesen tompítják azokat. → Az ilyen anyagokat puffernek nevezzük.

Ennek óriási szerepe van az élő szervezetekben, mivel azok mind vizes oldatok → Kivédik azokban az elsavasodást, illetve lúgosodást.

Aminosavak

Aminosav anyagkészlet – néhány mg, rögtön továbbalakul.Esszenciális aminosavak: a 20 fehérjeépítő aminosavból 8-at a szervezet nem tud előállítani, azokat kívülről kell bevinni.

Phe, Trp (aromások)Tre, Leu, i-Leu, Val (elágazó)Tre, Leu, i Leu, Val (elágazó)Met (S tartalmú)Lys (bázikus)

Szemiesszenciálisak:Szintézisút van, de lassú, kis mennyiség keletkezikTyr, Cis, Arg, His, Ser, Gly

Nem esszenciális aminosavak(Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Pro, Ser, Tyr)

Aminosavak csoportosítása

2008.04.13.

2

Aminosavak csoportosítása

Aminosavak csoportosítása

Aminosavak funkciói

Szervezet fehérjéinek építőkövei

Peptid kötés

Aminosavak funkciói

Energiaforrások → glükoneogenezis: glükóz szintézise piruvátból kiindulva, piruvát aminosavak lebontásából származhat

→ citrát ciklus:

Változatos funkciójú biomolekulák prekurzorai

(hormonok, porfirin, purin, pirimidin, koenzimek,

alkaloidok)

Aminosavak anyagcseréje

Napi fehérje felhasználás:

100 g evés

400 g testfehérje lebontás

400 g testfehérje felépítés

100 g lebontás/ürítés

Aminosavak átalakulásai

Táplálék fehérjék Extracelluláris aminosavkészlet

glükóz Fehérjék

Intracelluláris aminosavkészlet

Biogén aminok

α-keto-karbonsavak

N-tartalmú biomolekulák

Acil-CoA Citrátkör intermedierek

Endogén aminosavak

NH4+ urea

urea-ciklus

2008.04.13.

3

Aminosavak szénláncának sorsa:Ketoplasztikus aminosavak – zsírsav, ketontestGlükoplasztikus aminosavak - glükoneogenezisKeto- és glükoplasztikusak

piruvát Acetil-CoA Acetoacetil-CoASer

Cys

AlaTrp Cys Ile Leu, Lys, Trp

PheTyr

citrátkör

oxálacetát

Szukcinil-CoA

Alfa-ketoglutarát

fumarát Glu

His, Gln, Pro, Arg

Metil-malonil-CoAVal, Met, Thr, Ile

Tyr

Phe

Asp

Asn

Nem esszenciális aminosavak bioszintézisének kapcsolata a

szénhidrát-anyagcserével

piruvát 3-foszfoglicerát Glükóz

Alatranszaminálás

Ser GlyCys

citrátkör

oxálacetát

Szukcinil-CoA

Alfa-ketoglutarát

Glu

Gln

Asp

Asn

transzaminálás

Pro Arg

transzaminálás

Aminosav anyagcsere kapcsolatai

Urea ciklus

alanin-ciklusglükoneogenezis

glükoneogenezis

Fenilketonuria

Fenilpiruvát

Fenil-laktát

Fenil-acetát

Fenilalanin-hidroxiláz

α-ketoglutarát Trans aminá

fenilalanin-hidroxiláz defektusa

tetrahidrobiopterin (THB) hiánya (kofaktor deffektusos)

a Phe nem tud Tyr-ná alakulni

THB

DHB

Transzamináz Glu

dioxigenáz Cu2+

felhalmozódik, illetve átalakul fenil-piruváttá, fenil-laktáttá, fenil-acetáttá

magas koncentrációjuk károsítja az idegsejtek mielinhüvelyét, szellemi fogyatékosságot eredményez

fontos a korai diagnózis, korai fehérjeszegény diétával (alacsony Phe mennyiség bevitele) megnövelhető az élettartam

Alkaptonuria

Homogentizinsav-1,2 dioxigenáz

(Fe2+)

homogentizinsav-1,2 dioxigenáz defektusa

homogentizinsav felhal-mozódással jár, ami a

Maleilacetát izomeráz

kötőszövetekbe kerül, pigmen formájában tárolódik, szekretálódik a vizeletbe és sötét színű vizeletet okoz

az életet nem veszélyezteti, mivel nem jár tirozin felszaporodásával

Tirozináz

Oxidoreduktáz:– fenoláz aktivitása révén (EC 1.10.3.1) a tirozinból 3,4-

dihidroxi-fenilalanint (DOPA) készít

– polifenol-oxidáz aktivitása révén (EC 1.14.18.1) a DOPA t dopakinonná oxidálja a levegő oxigénjének DOPA-t dopakinonná oxidálja a levegő oxigénjének felhasználásával

Cu2+ ionokat tartalmaz.

A levegő oxigénjét használja fel az L-tirozin dopakinonnáalakításához.

Fontos szerepe van a melanin képzésben.

2008.04.13.

4

Tirozin

DOPA-kinon

polifenol-oxidázaktivitás

Fenoláz aktivitás DOPA - 3,4-dihidroxi-fenilalanin

Melanin képződés

DOPA-krom

melanin

Dopamin(neurotranszmitter)

noradrenalinadrenalin

dopakinon: a bõrben a barna festék elõanyaga

melanin: tirozinból képződő vízben oldhatatlan polimer (A melaninok az élô szervezetekben fenolokból képzôdô bonyolult, kondenzált aromás gyűrűket tartalmazó vörös, barna vagy fekete festékanyagok (pigmentek)).

Melanin

(p g ))

a melanin pigment a Golgi készülékből lefűződő, tirozináz tartalmú melanoszómákban termelődik a pigmentsejtekben (melanocyta)

képződik a szemben, a hajban és a bőrben (melanociták), ahol védelmet nyújt a napsugárzás ellen

albinizmus: a tirozináz enzim gén hiánya okozza, tirozináz nélkül nem termelõdik a szervezetben a melanin, ami a barnulásért, hajszínért és szemszínért felelõs pigment

Tirozináz szerkezete

Cu2+, His, O2-nel reaktív komplex, ami képes oxidálni.

Tirozináz-O2 komplex

Növényi tirozináz

Számos növényben előfordul.

Jelenléte okozza a gyümölcsök, burgonya megbarnulását hámozás felvágás utánmegbarnulását hámozás, felvágás után.

Redukálószerek (aszkorbinsav, citromlé) csökkentik a hatását.

Tirozináz aktivitásmérése

Tirozin szubsztrát– Enzim hatására megbarnul– Mérés 475 nm hullámhosszon

DOPA szubsztrát– Enzim hatására piros DOPAkrom– Mérés 475 nm hullámhosszon

2008.04.13.

5

Tirozináz aktivitásmérése

Tirozináz aktivitásmérése

1

Biokémia gyakorlatSzénhidrát emésztő enzimek és Szénhidrát emésztő enzimek és

alkalmazásukAmiláz enzim funkciója, aktivitás

mérése

Szénhidrátok funkciói

1. Üzemanyagok: energia felszabadítás

2. Energiatárolás: glikogén, keményítő

3. Vázanyagok: sejtfal – növények (cellulóz)3. Vázanyagok: sejtfal növények (cellulóz)sejtmembrán – állatvilág

4. Alkotórészek: nukleinsavakantibiotikumokalkaloidok

5. Kommunikáció: - sejt – sejt pl. adhéziós molekulák- vírus – sejt pl. influenza vírus

• Cellulóz - növényi sejtfal alkotórésze (β-D-glükóz)• Keményítő - növények tartalék tápanyaga (α-D-glükóz)• Glikogén - állati szervezet szénhidrát raktára• Keratánszulfát - (cornea, porc, kötőszövet)• Heparin - (tüdő, máj,bőr,hízósejtek) - véralvadásgátló• Glikoproteinek - (sejtmembrán, testnedvek, szekrétumok), proteoglikánok

Szénhidrátok funkciói

p ( j , , ), p g(váz, porc, csont) - a polipeptidlánchoz az oligoszaharidok kovalens kötéssel kapcsolódnak

• Glikozaminoglikánok – pl. hialuronsav (kötőszövet, üvegtest, izületi folyadék)• Glikokalix - az eukarióták membránjának kb. 5 %-a szénhidrát:

glikoproteinek és glikolipidek. (Funkció: szerkezet felépítés, transzport molekulák, hormonok, enzimek, sejtfelszíni receptorok)

• Baktérium sejtfal poliszaharidok• Vércsoportok - specificitása a vörös vértestek sejtfelszínén lévő

oligoszaharidok különbözőségének tulajdonítható• Agar-Agar - galaktóz polimer, kísérleti célokra használják pl. táptalajként

• Keményítőt kétpolimer alkotja:- Amilóz → α(1-4) kötéssel kapcsolódó

glükózegységekből áll- Amilopektin → α(1-4) kötéssel kapcsolódó

glükózegységekből álli d 24 30 lükó é él (1 6)

Poliszacharidok

→ minden 24-30. glükózegységnél α(1-6) elágazás

• Glikogén → α(1-4) kötéssel kapcsolódó glükózegységekből áll→ amilopektinhez hasonló→ elágazások minden 8-12. glükózegységnél

• Cellulóz → β(1-4) kötéssel kapcsolódó glükózegységekből áll

Poliszacharidok Szénhidrátok emésztése

Monoszacharidként szívódnak fel:(membránban Na+-monoszacharid kotranszporter)

Szénhidrát emésztő enzimek:– alfa-amiláz:

- nyál amiláz – szájban - pankreász amiláz – vékonybélben

• endo enzimek, alfa(1-4) kötéseket bont• oligoszacharid termékek

– oligoszacharidáz enzimek (alfa 1-4 és 1-6)– maltáz (alfa 1-4) (terméke Glükóz)– szacharáz (szukráz) (terméke Glükóz, Fruktóz) – laktáz (béta 1-4) (terméke Glükóz, Galaktóz)

2

Amiláz enzimek

• α-amilázok: endo enzimek, alfa(1-4) kötéseket bontanak a poliszacharid lánc belsejében. Termékek: oligoszacharidok („folyósító” enzim)

• β-amilázok: exo enzimek, alfa(1-4) kötéseket bontanak a poliszacharid lánc végén Terméke: bontanak a poliszacharid lánc végén. Terméke: maltóz („cukrosító” enzim)

• Szinte minden élő szervezetben:• Bakteriális: Bacillus licheniformis eredetű

(ipari keményítő hidrolízis)• Növényi: árpa eredetű (sörgyártás)• Emlős: PPA (modell), HSA, HPA.

Amilázok felhasználása

Keményítő ipar: könnyen emészthető maltóz szirup és glükóz előállítás

Söripar: árpa amilázok →keményítő lebontás

Diagnosztikum: amiláz szint növekedés - mumpsz, pancreatitis

Emésztést segítő gyógyszer: Dipankrin- amiláz

Kenyérsütés: amiláz – keményítő hidrolízise oligoszacharidokká (édes íz, ropogós héj)

Mosószerekben: keményítő szennyeződés eltávolítása

- Élesztővel történik, növényi alapanyagból

- Az élesztő számára a keményítő nem hasznosítható

- Malátásítás folyamata: Árpa csíráztatása → amiláz termelés (AMY1 AMY2) → keményítő hidrolízis

Sörgyártás

termelés (AMY1, AMY2) → keményítő hidrolízis

α-Amilázok szerkezete

• α-hélixek és β-redők, (α/β) 8 hordó szerkezet

• hurkok kötik össze • hurkok kötik össze

→ alhelyek

• változatos alhely szerkezet

• eredettől függ

OH O

OH

ONH

2

OH

O

-4

NO

H

O

O

NE2 E2D2

O

Asn105Asp147

Asp197

His101

Trp59

Trp58

Gln63Tyr151

His201 WGly306

D2

Redukáló vég

Nem redukáló vég Ca2+

HSAmy: Szubsztrát kötő hely

NH

NH

O

OOH

OH

O

OOH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

H

NH

3

N D1

OHis305

-3

-2-1

N

NH

NH

NH

2

OE2 OE1

E2

OH OD1 D2

+1

+2N

O

NH

3H is299

Arg195Leu165

Tyr62

Asp300Glu233

Glu240

Lys200Ile235

OE2

NZ

O

E2

W

WW

WO

H

Ser163

O

O

OOH

OH

OO

H

OH

OH

OH

Cl-

Katalitikus aminosavak

Barley amylase: Szubsztrát kötő hely

szubsztrát-kötésben szereplő aminosavak

vízmolekulák

szubsztrátmolekula glükóz-egységei

3

Amiláz vizsgálatok

• Bontási kép vizsgálatok:– HPLC termékanalízis

Szubsztrát: CNP-G8 Termékek: DP 2-5

Amiláz vizsgálatok

A bontási kép megmutatja, hogy az adott méretű szubsztrátot az enzim mekkora méretű termékekre képes hasítani és

azok milyen arányban keletkeznek.

18 50 30 2 51 44 5

• Alhely térkép készítés:– SUMA program

HSA és Y151M alhely térképe

G - G - G - G - G - G - CNP0,6

-1,9

0 0

-1,5

1,3

-1,4

0 0

2 6

0,6

-2

0

2

ol)

-6,5

-8,8

-12

-6,1-5,6

-2,6

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-5 -4 -3 -2 -1 1 2 3

Subsite number

App

aren

t bin

ding

ene

rgy

(kJ/

mo

HSAY151M

Amiláz vizsgálatok

• Kinetikai mérések:– természetes eredetű inhibítorok (fehérje, tanninok)– szintetikus inhibítorok

• Enzimes szintézisek

• Modell számítások

Amilázokaktivitásmérése

• Keményítő szubsztrát– I2-keményítő reakció – Redukáló cukor meghatározás

– Somogyi-Nelson– Dinitro-szalicilsav– KFe(CN)6KFe(CN)6

• Oligoszacharid szubsztrátok: G5-G7– Redukáló cukor meghatározás (redukáló végek!)

• Kromofor csoportot tartalmazó szubsztrátok:– Segédenzimekkel: CNP-G7 amiláz kit (klinikai

módszer)1. Amiláz: CNP-G7 → CNP-G2 + CNP-G3 + CNP-G42. α-glükozidáz: CNP-G2 + CNP-G3 → CNP-G3. β-glükozidáz: CNP-G → CNP + G

– Rövid szubsztráton: CNP-G3, GalG2-CNP

Gyakorlat• Bacillus subtilis amiláz oldat

• Malátakivonat: amiláz + maltáz

• Reakció követése: I2-keményítő reakció.2 y

• Hígítási sor: felező hígítás (csökkenő koncentrációjú enzim)

1

Biokémia gyakorlat

β-glükozidáz enzim kinetikai vizsgálata

Enzimek

Biokémiai reakciókat katalizáló fehérjék.

Az élő szervezet körülményei között működnek (állandó hőmérséklet és nyomás, szűk koncentráció tartomány).

Jellemzőik: - óriási katalitikus erő- nagyfokú specificitás- szabályozottság- működésükhöz gyakran igényelnek kofaktort

Enzimreakciók sebességének vizsgálata

Egy enzim ill. enzim-szubsztrát (enzim-szubsztrátanalóg) komplextérszerkezetéből nem tudjuk meghatározni, hogy az enzimmennyire hatékonyan katalizálja a reakciót. (Hasonlóan ahhoz,ahogy egy versenyló kinézete nem mondja meg egyértelműen, hogyaz milyen gyorsan tud futni.)

Ezt az enzim-katalizált kémiai reakció sebességének mérésébőlderíthetjük ki.

Az enzim-katalizált reakció sebességének enzim-koncentrációtól,szubsztrát-koncentrációtól, pH-tól, más anyagok jelenlététől,hőmérséklettől stb. való függéséből értékes információk nyerhetőka katalízis mechanizmusáról.

Az ilyen jellegű mérések az ún. kinetikai mérések.

Kinetikai mérések célja

Ismeretek az enzimről

Gátlószerek tervezéseEnzim vizsgálatokhozDiagnosztikai célbólGyógyászati alkalmazásNövényvédő szerek

Gátlószerek vizsgálata:HatékonyságMechanizmus…

Enzimkinetikai alapfogalmak

Reakciósebesség (v): időegység alatt átalakuló anyagmennyiség.anyagmennyiségváltozás/idő (nyílt rendszer) vn = dn/dt egység: mol s-1

koncentrációváltozás/idő (zárt rendszerben) v = dc/dt egység: mol dm-3 s-1 (V(térfogat) állandó)vc = dc/dt egység: mol dm s (V(térfogat) állandó)

Szubsztrát S, enzim-szubsztrát komplex ES, termék P

Reakciósebességet befolyásoló anyagok:– katalizátor (enzim) – iniciátor: ami beindítja a reakciót– inhibítor: csökkenti a reakciósebességet

Enzimkinetikai alapfogalmak

Standard enzim egység (U, unit) vagy aktivitás:az a szubsztrátmennyiség, melyet az enzim egységnyi idő alatt, meghatározott körülmények között termékké alakít.Egységei: egység (U, unit), mikromól/perc; katal: (S.I.): mól/sec

Specifikus aktivitás(SA):egységnyi fehérje mennyiségre vonatkozó enzimaktivitás(mikromol/perc×mg). Segítségével egy enzim tisztulása nyomon követhető.

Katalitikus állandó vagy átviteli szám (kcat):egy enzimmolekula (katalitikus hely) által időegység alatt átalakított szubsztrátmolekulák száma (s-1) akkor, ha az enzim teljesen telített szubsztráttal; azaz milyen gyors az enzim, ha az aktív hely telítve van.

2

A [S] és a v közötti kapcsolat vizsgálata

Tény: az enzimkatalizált reakció egy adott szubsztrát eseténsokkal gyorsabb, mint a nem-katalizált reakció.

Tapasztalat: állandó enzimkoncentráció esetén viszonylag kisszubsztrát koncentrációknál a szubsztrát koncentrációnövelésével egyenesen arányosan nő a reakciósebesség.növelésével egyenesen arányosan nő a reakciósebesség.

DE: nagyobb szubsztrát koncentráció értékek esetén akiindulási szubsztrát koncentráció növelésével egyre kevésbénövekedik a reakciósebesség.

Nagyon nagy szubsztrát koncentrációnál a szubsztrátkoncentráció további növelése nem eredményezreakciósebesség növekedést.

A [S] és a v közötti kapcsolat vizsgálata

A mérés:- t (idő) függvényében folyamatosan mérjük a keletkező termék (P) koncentrációját- a görbe egy-egy pontjához húzott érintő egyenes megadja az adott időpillanathoz tartozó reakciósebességet- a t=0-hoz tartozó reakciósebesség a v0, az

k d ti b é

[S1]< [S2]< [S3]< [S4]

(4)

V0(3)

V0(2)V0(1)

az a kezdeti sebesség- „végtelen” t esetén mindegyik görbe vízszintessé válik

A jelenség:- Figyelem: nem egy közvetlen mérés eredménye, hanem sok egyedi mérés matematikai kiértékelése- adott [E] mellett az [S] függvényében a v0egy maximális értékhez tart vmaxV0(1)

V0(2)

V0(3)

V0(4)

A jelenség értelmezése

A jelenség első logikus értelmezését LeonorMichaelis és Maud Menten (1913) dolgozta ki.

1. Az enzim és a szubsztrát között nagyongyorsan kialakul egy ES komplex.

2. Az ES komplex a kialakulása sebességéhezképest lassan bomlik tovább szabad enzimreés termékre.

Briggs-Haldane módosítás (1925): - az ES termékké alakulásának sebessége megegyezik a

keletkezésének sebességével stacionárius (steady-state) állapotban van (tranziens egyensúlyban)

Haldane, J(ohn) B(urdon) S(anderson)1892-1964

Szubsztrát kötés Katalitikus lépés

A jelenség értelmezése

A jelenség értelmezése

konc.

P

idő

SESE

Steady statePre-steady state

A Michaelis-Mentenegyenlet

A Michaelis-Menten egyenlet: v=Vmax [S]

KM + [S]

konc.

Sebességmeghatározó lépés:v = k2 [ES]

[E]teljes = [E]0= [E] + [ES]

d[ES]dt = k1[E][S] - k2[ES] - k-1[ES] ≈ 0 idő

ES

Steady state: d[ES]dt ≈ 0

d[ES]dt = k1[E][S] – (k2 + k-1) [ES] ≈ 0

[E] = [E]0 – [ES]

1KM

[ES] = k1

k2 + k-1[E][S]

KM = k2 + k-1

k1

Michaelis állandó

3

A Michaelis-Mentenegyenlet

[ES] = [E][S]

KM

[E] = [E]0 – [ES]

[ES] = ([E]0 -[ES])[S]

[ES] = ([E]0[S]) –([ES][S])

KM KM

[ES] = ([E]0[S]) –([ES][S])KM[ES] + ([ES][S]) = ([E]0[S])KM

[ES] (KM+ [S]) = [E]0[S] [ES] = [E]0[S]

KM + [S]

A Michaelis-Mentenegyenlet

Az enzimreakció sebessége:

v = k2 [ES][ES] =

[E]0[S]

KM + [S]

Sebességmeghatározó lépés:v = k2 [ES]

v = k2

[E]0[S]

KM + [S]

v=Vmax [S]

KM + [S]A Michaelis-Menten

egyenlet:

Vmax = k2[E]0Vmax esetén:[ES] ≡ [E]0

A [S] és a v közötti kapcsolat

y = m . x + b

v=Vmax [S]

KM + [S]

Dupla reciprok 1 KM + [S] KM 1 1Vo Vmax

. [S] Vmax [S] Vmax.=

(Hans) Lineweaver - (Dean)Burkféle linearizáció

Kinetikai állandók

KM (Michaelis állandó): az a szubsztrát koncentráció, ami a maximális sebesség felének eléréséhez szükséges.

Független az enzim koncentrációtól.Független az enzim koncentrációtól.

Az enzim „affinitása” a szubsztráthoz, nem mond semmit arról,hogy gyors vagy lassú a reakció.

Jellemző az adott enzim-szubsztrát párra.

Kinetikai állandók

vmax: az a maximális sebesség érték, amit a reakcióadott enzim koncentráció mellett, magas szubsztrát koncentráció esetén elérhet.

Valójában nem maximum, hanem limit.

k = v /E információ a reakciósebességről de kcat= vmax/E0: információ a reakciósebességről, de csak telítési S koncentrációnál (milyen gyors az enzim, ha teljesen telítve van szubsztráttal)

kcat/KM: katalitikus hatékonyságLehetővé teszi az enzimek összehasonlítását.

Átviteli szám: (turnover number) egységnyi idő alatt átalakított molekulák száma.

4

Gátlástípusok

1., Irreverzbilis gátlás – tulajdonképpen inaktiválás

2., Reverzibilis gátlás: vmax KM

- kompetitív (inh + E) változatlan nő

- unkompetitív (inh + ES) csökken csökken

- vegyes típusú gátlás (inh + E)(inh + ES)

nem kompetitív csökken változatlan

Gátlástípusok

1/VVERSENGÉS !!!

1/S

vmax KM- kompetitív (inh + E) változatlan nő

Gátlástípusok

1/V

1/S

vmax KM- unkompetitív (inh + ES) csökken csökken

Gátlástípusok

1/V

1/S-vegyes típusú gátlás (inh + E) (inh + ES) vmax KM

nem kompetitív csökken változatlan

β-Glükozidáz enzim

EC 3.2.1.21- hidroláz

Előfordulás: mandula, barackmag, édesburgonya

F k ió ö é i éd k éFunkció: növényi védekezés

Szubsztrát: amigdalin, prunazin, pNP-β-glükozid (galaktozid, fukozid)

Inhibítor: tioglikozid,

glükonsav-δ-lakton

Emulzin β-glükozidáz

• Édesmandulából származik

• Modell enzim

• Mt: 65 kDa (dimer is lehet)

• pHopt= 5,2-6,0

5

Működési mechanizmus

E + S

ES

E + P

Természetes szubsztrátA B-17 vitamin vagy nitrilozid megjelölés egy nagy csoport víz-oldékony, lényegében nem toxikus, édeskés vegyületre utal. Molekuláik cukorból, hidrogén-cianidból, egy benzolgyűrűből (vagy egy acetonból) állnak.

Amigdalin

Amigdalin előfordulása

az egyik leggyakoribb nitrilozid az amigdalin

gyakorlatilag az összes gyümölcs magjában megtalálható: alma, kajszibarack, cseresznye, őszibarack, szilva, mandarin

nemritkán rendkívül magas, akár 2-3%-os koncentrációban

megtalálható még: - manióka (kasszava)- zöldségek

„B 17 vitamin”, laetrile – (táplálék kiegészítő)

Amigdalin bomlásaAz anyagcsere során a nitrilozid szabad hidrogén-cianiddá,

benzaldehiddé (vagy acetonná) és cukorrá bomlik. A felszabadult HCN-t a rodanáz enzim detoxikálja

Amigdalin jelentőségePálinkafőzés: - csonthéjas gyümölcsöknél mag eltávolítása a cefréből- keserűvé teszi a pálinkát és mérgező hatású- pálinkában még megtűrhető ciántartalom (max. 40 mg/kg HCN)

Gyógyszergyártás: (www.b-17.hu)1.)injekció és tabletta a rákos sejtek csökkentésére és megszüntetésére- hatóanyag a keserű mandulák glikozidja (amigdalin)- hatásmechanizmusa: a hatóanyag felszívódik a szervezetben, az

egészséges sejtekben a rodanáz enzim a cianidot átalakítja rodaniddá, így az az egészséges sejtekre ártalmatlan, míg a rákos sejtek erre nem képesek, így azokat életképtelenné teszi

2.)a rodanáz enzim kén hozzáadásával tiocianáttá alakítja a ciánt, ami egy nagyon hatékony vérnyomásszabályzó vegyület

3.)a benzaldehid egészséges sejt közelében oxidálódik és benzoesavvá alakul, ami ismert fájdalomcsillapító és fertőtlenítő szer

Mesterséges szubsztrát

+ß-glükozidáz

Lúgos közegben

A képződő para-nitrofenol lúgos közegbenpara-nitrofenoláttá alakul, ami sárga színű.

405 nm-n fotometráljuk.

para-nitrofenil β-D-glükopiranozid ß-D-glükóz para-nitrofenol

6

Mesterséges szubsztrát PNP kalbrációs görbe felvétele

Reakciósebesség szubsztrátkoncentrácó-függés vizsgálata

Grafit• Enzimkinetikai kiértékelő szoftver

• Alap kinetikai egyenletek:– Michaelis-Menten– Inhibítor jelenlétében– Inhibítor jelenlétében– Lineweaver-Burk

• Adat feldolgozás

• Egyenes illesztés

• Görbe illesztés-nem lineáris regresszió

Grafit Nem lineáris illesztés

Nem lineáris illesztés Nem lineáris illesztés

7

Nem lineáris illesztés Nem lineáris illesztés

Lineweaver-Burk Lineweaver-Burk

Lineweaver-Burk Lineweaver-Burk

8

Lineweaver-Burk Lineweaver-Burk

Lineweaver-Burk Lineweaver-Burk

[s/M]

1/v

α

KMvmax

tgα =

1vmax

1KM

[1/M] M= mol/dm3