Enzymer II

Enzymer II

Kinetikk

Enzymkinetikk

• Undersøkelser av kinetikken til et gitt enzym gir kunnskaper om:– Den maksimale hastighet for produktdannelse– Den substratkonsentrasjon som gir halv maksimal hastighet– Styrken og virkningsmåten til forskjellige hemmere, regulatorer

• E +S ES E + P• Konsentrasjonen av S påvirker hastigheten for dannelsen av P• Økt konsentrasjon av S gir økt dannelse av P (når kons. S < kons. E)• S forbrukes under reaksjonen => Konsentrasjonen av S synker og

dermed reaksjonshastigheten• For å eliminere dette problemet utføres måling av P umiddelbart etter

at S kommer i kontakt med E; vi måler initiell hastighet

Initiell hastighet

• Forbruket av S i et kort tidsrom etter start av reaksjon regnes som svært lite

• Ved måling av initiell hastighet regnes konsentrasjonen av S som konstant

• Initiell hastighet, Vo, måles

over korte tidsrom som funksjon av substrat konsentrasjonen

• Enzymkonsentrasjonen holdes konstant i slike målinger

Initiell hastighet

• Ved konstant E ses økende Vo når konsentrasjonen av S øker

• Ved lave S ses kraftig øking i Vo når S øker

• Ved høye S ses liten/ingen øking i Vo når S øker

• Vmax er den maksimale hastighet for produktdannelse med en gitt enzymmengde

• Km er den substratkonsentra-sjon hvor hastigheten for produktdannelse er halvparten av Vmax

Michaelis Menten kinetikk

• Leonor Michaelis og Maud Menten fremsatte sin teori for enzym-reaksjoner i 1913. Denne teorien er basert på en del forutsetninger:

k1

k2

• E + S ES E + P

k-1 k-2

1) Først dannes et ES kompleks i en rask og reversibel reaksjon

2) Deretter omdannes ES til E + P i en noe langsommere reaksjon

3) Reaksjon 2) er den hastighetsbegrensende

4) Hastigheten for dannelse av P er bestemt av konsentrasjonen av ES

5) Initielt er konsentrasjonen av P svært liten slik at vi kan se bort fra k-2


k1

k2

• E + S ES E + P

k-1 k-2

• Enzym foreligger som E og ES• Når S er lav, vil andelen av E som er bundet i ES være liten• Her vil P-dannelse være proporsjonal med øking av S . Det skyldes at

øking av S => øking av ES• Ved høye konsentrasjoner av S vil all E foreligge som ES. Her vil øking i

konsentrasjonen av S ikke kunne øke hastigheten for P- dannelse ytterligere

• Enzymet er mettet med substrat og reakjonshastigheten er maksimal, Vmax• Mettbarhet er karakteristisk for enzymkatalyserte reaksjoner


• Utledning av Michaelis Menten ligningen

ESE + S E + P

k1

k-1

k2

k-2

Siden omdannelsen av ES til E + P er hastighetsbegrensende,

Vil dannelse av P være bestemt av Vo = k2 ES

ES er vanskelig å bestemme

Innfører: Et = E + ES => E = Et - ES

Siden S >> Et og ES << S kan vi forenkle uttrykkene

Utledning av Michaelis-Menten ligning

”Steady-state” innebærer at ES er konstant

Hastighet for dannelse av ES

Hastighet for nedbryting av ES

Steady-state medfører

Løser ligningen med hensyn på ES

Legger til k1 ES S på begge sider og

forenkler


Løser ligningen mhpå ES

Hastighetskonstantene samles

(k2+k-1)/k1 defineres Km

Bruker tidligere uttrykk for ES,

Som omformes til ES = Vo/k2


Innsetting av nytt uttrykk for ES =>

Maksimal hastighet inntreffer når

ES = Et

Dette betyr Vmax = k2 Et

Dette er Michaelis-Menten ligningenDen forteller hastigheten for produktdannelse

i en reakjon med et substrat

Lineweaver-Burke plotVmax og Km er vanskelige å måle når man

avbilder Vo som funksjon av S

Derfor omformer vi uttrykket

Innverterer

Deler opp uttrykket i telleren

Og forenkler


• Enzymreaksjoner hvor Vo som

funksjon av S avbildes med en hyperbolsk kurve følger Michaelis Menten kinetikk

• Antall reaksjonstrinn mellom S og P betyr ikke noe

• Noen enzymer følger ikke Michaelis Menten kinetikk - dette gjelder regulatoriske enzymer

Hva uttrykker Km?

Km = k2 +k-1

k1

Når k2 << k-1 => Km = k-1

k1 dissosiasjonskonstanten (sir noe om affinitet)

Når k2>> k-1 => Km = k2

k1

Hemmere av enzymaktivitet

Deles i to hovedgrupper:

• Reversibel hemming

– Kompetitiv

– Ikke-kompetitiv

– Blandet hemming

• Irreversibel hemming

• Homotrof: enzymet hemmes av sitt eget produkt

• Heterotrof: enzymet hemmes av annen forbindelse

Reversibel hemming av enzymaktivitet

• Kalles også kompetitiv hemming• Hemmeren binder bare fritt enzym• Hemmeren, I, binder til enzymets aktive

sete og hindrer substratbinding• EI fører ikke til dannelse av produkt• S og I konkurrerer om E• Effekten av I kan reduseres ved å øke

konsentrasjonen av S fordi bindingen er reversibel

• Når ES dannes vil P dannes på normal vis

• Kompetitiv hemming => Km øker, men Vmax er uendret

• Vo = Vmax S

Km + S

Kompetitiv hemming• Grafen forteller at det er kompetitiv

hemming• Endring i heldningskoeffisient avhenger

av hemmerens konsentrasjon •

er: = 1 + I

KI

K1 = E I

EI

• Heldningskoeffisienten øker• Skjæring med x-aksen minker <=> Km

øker• Skjæring med y-aksen uendret <=> Vmax

uendret

Kompetitiv hemming i praksis

MetanolforgiftningEnzymet alkohol dehydrogenase omsetter metanol og etanol

Metanol oksideres til formaldehyd som er svært giftig spesielt for øyet

Etanol oksideres til acetaldehyd som også er skadelig men krever langt høyere doser enn formaldehyd

Ved behandling av metanolforgiftning gis etanol i så høye doser at det utkonkurrerer metanol som substrat for enzymet

Ved å holde etanolkonsentrasjonen høy over lang tid vil metanol etterhvert filtreres over i urinen

Ikke-kompetitiv hemming

• Hemmeren bindes ikke til det aktive setet, men til eget sete

• Hemmeren bindes bare til ES komplekser

• Effekt av hemmer kan ikke reduseres med mere substrat

• Binding av hemmer endrer ikke enzymets konformasjon

• Vo = Vmax S

Km + ’ S

Ikke-kompetitiv hemming

• Både Vmax og Km endres

• Vmax reduseres til Vmax/’

• Km reduseres. Den S som før

resulterte i halv maksimal hastighet, reduseres med faktoren ’

• På grafen er heldnings-koeffisienten uendret, men skjæringpunktet for både X- og Y-aksen er endret

Blandet hemming

• Hemmeren bindes ikke til det aktive setet men til et eget sete

• Hemmeren bindes til E såvel som ES

• Dannelsen av produkt følger:

• Vo = Vmax S

Km + ’ S

• Både Km og Vmax endres• Dersom = ’ betegnes

hemmingen som nonkompetitiv

Hemmere av enzymaktivitet

• Ikke-kompetitiv og blandet hemming opptrer i praksis bare i reaksjoner med to eller flere substrater.

• E + S1 + S2 ES1S2/ES2S1 E + P

• En hemmer kan opptre som kompetitiv hemmer av S1 men som ikke-

kompetitiv eller blandet hemmer av S2

Irreversible hemmere

• Binder seg irreversibelt til eller ødelegger enzymets aktive sete, f.eks. ved å endre en viktig funksjonell gruppe

• Viktig undergruppe er ”selvmordshemmerne” eller ”mekanisme-baserte hemmere”

• Disse binder som substratet og gjennomgår første del av katalysen. Deretter bindes de kovalent til enzymets aktive sete og blokkerer all videre aktivitet

• Farmasøytisk industri utnytter slike mekanismer i utforming av legemidler

Irreversible hemmere

Diisopropylfluorophosphate

Diisopropylfluorophosphate

Effekt av reversible hemmere på Vmax og Km

1

2

3

11 2 3

pH optimum

• pH optimum er det pH-område hvor enzymets aktivitet er maksimal

• Varierer mye fra enzym til enzym

• Katalytisk funksjon er ofte avhengig av aminosyresidekjeder som agerer som svake syrer eller baser. Dette er svært pH avhengig

• pH optimum kan fortelle noe om hvilke aminosyrer som er involvert i den katalytiske mekanisme

– pH-optimum omkring pH 7 indikerer at en His deltar i katalysen

pH og katalyse

pH optimum

Regulatoriske enzymer

Enzymer er organisert i reaksjonsveier, hvor produktet fra en reaksjon er substratet for den neste

Regulatoriske enzymer kontrollerer hastigheten i hele reaksjonsveien

Det regulatoriske enzymet er ofte det første enzymet i reaksjonsveien

Regulatoriske enzymer følger ikke Michaelis Menten kinetikk

Enzymenes aktivitet reguleres av allosteriske forbindelser og kalles selv allosteriske enzymer

Allosteriske forbindelser kan være prekursere eller metabolitter og reguleringen er reversible

Mekanisme:

1: Reversibel ikke-kovalent binding av allosterisk regulator

2: Reversibel kovalent modifikasjon

Allosterisk regulering fungerer som finregulering

Reguleringen kan også skje ved proteolytisk spaltning og er irreversibel

Allosteriske enzymer er komplekse, de består av flere/mange subenheter

Feedback regulering

• E1 Threonin dehydratase reguleres allosterisk av reaksjonsveiens sluttprodukt Isoleucin

• Heterotrof allosterisk hemming

Allosteriske enzymer

• Binding av allosterisk regulator medfører konformasjonsendring

• Allosteriske regulatorer har eget bindingssete(r)

• Enzymene veksler mellom mere og mindre aktive former

• Allosterisk regulering kan gi økt eller redusert aktivitet

Allosteriske enzymer følger ikke Michaelis Menten kinetikk

• Allosteriske enzymer er ikke mettbare

• Avbilding av Vo som funksjon av S gir sigmoid kurve

• Km begrepet er ikke gyldig

• K 0, 5 eller S 0, 5 brukes

• Sigmoid kurve signaliseres kooperativitet, subenhetene påvirker hverandres konformasjon og affinitet for substrat

Sigmoid kurve

Sigmoid kurve

Sigmoid kurve

Documents

Enzymer II