만성 형 간염에서 HBsAg 및 HBcAg의 간세포 내 발현양상과 … · 2) 간조직염색 포르말린에고정된조직은통상적인조직처리과 정을통하여 파라핀에

대한간학회지 제 7 권 제 4 호 2001 ; 401- 412

서 론

만성 B형 간염에서 바이러스의 증식과 활성도를

반영하는 지표로는 혈청 내의 B형 간염 e항원

(hepatitis B e antigen, HBeAg ), B형 간염 바이러

스(hepatitis B viru s, HBV ) DNA 및 HBV DNA

만성 B형 간염에서 HBsAg 및 HBcAg의 간세포 내 발현양상과병리조직학적 소견과의 상관관계

계명대학교 의과대학 내과학교실, 병리학교실*

조광범 ·손정호 ·박경식 ·권두영 ·황재석 ·허정욱 ·안성훈 ·박승국 ·김상표 *

Abstract

The Correlation Between The Histologic Activity and Fibrosis and The Distribution ofIntrahepatic HBsAg and HBcAg in Patients With Chronic Hepatitis B

Kwang Bum Cho, M.D., Jung Ho Sohn, M.D., Kyung Sik Park, M.D.,Du Young Kwon, M.D., Jae Seok Hwang, M.D., Jung Wook Hur, M.D.,

Sung Hoon Ahn, M.D., Soong Kuk Park, M.D., and Sang Pyo Kim, M.D.*

Departments of Internal Medicine and Pathology*,Keimyung University School of Medicine, Taegu, Korea

Background/ A ims : The purpose of this study was to assess the correlation between histologic activityand fibrosis and the distribution of intrahepatic hepatitis B core antigen (HBcAg) and surface antigen(HBsAg) in patient s with chronic hepatitis B. Methods : 141 patients (M:F =141:27) with biopsy - provenchronic hepatitis B, abnormal liver function, and a positive HBV viral marker (serum HBeAg, serum HBVDNA) were enrolled. Result s : HBcAg was expressed in 96 of 141 patient s (68.1%), nHBcAg in 23 (16.3%),cHBcAg in 58 (41.2%), and n- cHBcAg in 15 (10.6%). In the cases of HBsAg, 114 of 141 patients (80.9%)were expressed as cHBsAg, 2 (1.4%) as mHBsAg, and 16 (11.3%) as m- cHBsAg. The presence ofintrahepatic HBcAg and HBsAg according to Gudat s classification was not correlated with activity andfibrosis. But the groups with nuclear expression of HBcAg revealed less inflammatory activity (grade,p =0.003), and less fibrotic stage (p = 0.002) than with cytoplasmic or no expression of HBcAg. HBsAg wasnot . Conclusion s : These observations suggest that inflammatory activity and fibrosis of chronic hepatitisB are related to the presence of HBcAg in hepatocytes and the expression of HBcAg. This is a veryimportant finding in hepatocytolysis. (Korean J Hepatol 2001;7 :401- 412)

Key W ords : Immunohistochemistry, Hepatitis / Viral / HBV, HBcAg, HBsAg, Stage, Histological grade

접수 2001년 8월 8일 ; 수정본 접수 2001년 11월 15일 ; 승인 2001년 11월 28일Abbreviations : ALT, alanine aminotransferase; ALP, alkaline phosphatase; AST, aspartate aminotransfertase; HBV, hepatitisB virus ; HBeAg, hepatitis B e antigen; HBcAg, hepatitis B core antigen; HBsAg, hepatitis B surface antigen; H &E, hem atoxylin and eosin ; cHBsAg , cytoplasmic expression of hepatitis B surface antigen; mHBsAg , membranousexpression of hepatitis B surface antigen; nHBcAg, nuclear expression of hepatitis B core antigen; cHBcAg, cytoplasmicexpression of hepatitis B core antigen; n- cHBcAg, nuclear and cytoplasmic expression of hepatitis B core antigen; NK

cell, natural killer cell.책임저자 : 조광범 , 대구광역시 중구 동산동 194번지 소화기내과 (우 ) 700- 712

Phone: 053) 250- 7415; Fax : 053) 250- 7434; E- mail: kw [email protected]

401

The Korean Journal of Hepatology : Vol. 7. No. 4. 2001

polymerase, 간 조직 내의 B형 간염 c항원(hepatitis

B core antigen, HBcAg), HBV DNA, 간 조직 소

견 등이 있으며 이들 간에는 밀접한 관계가 있는

것으로 알려져 있다.1- 5 이중 간 조직내 HBcAg은

HBV감염의 표지자일뿐만 아니라 HBV의 증식 및

숙주 면역반응의 표적항원으로 작용하여 세포 내

의 HBcAg의 분포와 염증반응과는 밀접한 관련이

있다고 한다.6 - 9또 간 조직 검사에서 문맥역과 문

맥역 주위의 염증, 간소엽 내 실질의 반복되는 염

증은 간염진행의 중요한 지표로 삼고 있다.10 간 조

직의 B형 간염 s항원(hepatitis B surface antigen,

HBsAg)과 HBcAg은 면역조직화학기법을 이용하

여 확인할 수 있으며,11 이러한 항원이 세포의 어느

부위에 존재하느냐에 따라 바이러스의 증식과 연

관되어 간염의 염증반응과 관련이 있는 것으로 알

려져 있었다.12 그러나 간세포 내의 B형 간염 항원

의 존재위치와, 만성 간염의 새로운 분류법으로 알려

진 간세포 괴사와 염증의 정도에 따른 등급(grade)

과 섬유화 정도의 지표인 병기(stage)를 이용한 분

류법과의 상관관계는 아직 밝혀진 바가 없다. 이에

저자는 새로운 만성간염의 분류법에 의한 간염의

진행정도와, 간세포 내의 HBsAg 및 HBcAg의 발

현유무 및 발현위치와의 상관관계를 알아보기 위

하여 본 연구를 시행하였다.

대상과 방법

1. 대상

1999년 3월에서 2001년 8월까지 계명대학교 동

산의료원 소화기내과에 내원한 간 조직 생검을 통

하여 만성활동성 간염으로 확진된 환자 중 임상적

으로 alanine aminotransferase (ALT )치가 증가되

었고 HBV 표지자(혈청 내 HBsAg, HBeAg, HBV

DNA)가 양성인 141명(남자:여자=114:27)을 대상

으로 하였다.

F ig ure 1. Grading of chronic hepatitis (H&E stain, X200). (A), minmal activity ; (B), mild activity ; (C), moderate activity ;(D), severe activity .

402

Kwangbum Cho, et al. The Correlation Between The Histology and The Distribution of Intrahepatic HBsAg and HBcAg

2 . 방법

1) 간 생검

환자를 앙와위로 눕히고 양 팔을 머리위로 올려

서 생검할 부분이 잘 드러나게 한 뒤 초음파로 검

사할 부분을 확인한 후 일곱 번째와 여덟 번째 늑

골간과 우측 중간액와선이 만나는 부위를 포타딘

액으로 소독하고 2% lidocain용액으로 피하와 늑

간근육, 벽측복막, 간의 피막을 마취시켰다. 이후 환

자가 숨을 절반정도 내쉰 상태에서 정지시킨 다음

ACN1610 천자침(Medical Device T echnologies,

USA)을 이용하여 두 편의 조직을 얻은 다음 10%

중성 포르말린에 고정하였다.

2) 간조직 염색

포르말린에 고정된 조직은 통상적인 조직처리과

정을 통하여 파라핀에 포매한 후 형태학적 조직관

찰을 위한 hematoxylin 및 eosin (H&E) 염색과,

특수염색으로 섬유조직을 보기 위한 Gomori은 주입

법 및 Masson s trichrome 염색을 각각 시행하였다.

3) 만성 간염의 분류

광학 현미경을 이용하여 Batts와 Ludwig13에 의한

분류법에 따라 등급과 병기를 조사하였으며, 등급은

H&E 염색 상에서 조각괴사(piecemeal necrosis)의

유무와 간소엽 내 세포괴사의 정도에 따라 문맥역

내 염증만 있고 조각괴사나 간소엽 내 괴사는 없는

경우를 등급 0 (portal inflammation only; no

activity ), 국소적으로 문맥역 주변에 조각괴사가

있고 가끔 산발적인 간소엽 내 괴사가 보이는 경우

를 1 (minimal), 몇 개 또는 전체의 문맥역에서

조각괴사를 관찰할 수 있고 약간의 간소엽 내 괴사

가 관찰되는 경우를 2 (mild), 모든 문맥역에 조

각괴사가 관찰되고 상당한 부분의 간소엽 내 괴사

가 관찰되는 경우를 3 (moderate), 문맥역간 교각

괴사(bridging necrosis)를 보이고 광범위한 간소엽

내 괴사와 염증반응이 나타난 경우를 4 (severe)로

F ig ure 2 . Staging of chronic hepatitis (Trichrome stain, (A ) (B) x200, (C) (D) X100). (A ), portal fibrosis ; (B), periportalfibrosis; (C), septal fibrosis; (D), cirrhosis .

403

대한간학회지 제 7 권 제 4 호 2001

하였다(그림 1).

병기는 Gomori 은 주입법 및 Masson s trichrome

염색 상에서 섬유화의 정도에 따라 분류하였으며,

문맥역에 정상적인 결체조직이 관찰되면 0 (no

fibrosis ), 문맥역에만 국한된 섬유화가 보이면 1

(portal fibrosis), 문맥역 주변부 또는 약간의 문맥

역간 섬유화만 있으면 2 (periportal fibrosis ), 구

조적 변형을 동반하는 문맥역간 섬유화가 있으면

3 (septal fibrosis -no obvious cirrhosis ), 간경변

이 있으면 4 (cirrhosis)로 나누었다(그림 2).

4) 간세포 내의 HBsAg 및 HBcAg에 대한 면역세포

화학 검색

파라핀으로 포매한 블록으로부터 얻은 간 조직

절편을 탈 파라핀과 함수과정을 거친 후, methanol

과 0.1% 과산화수소가 섞인 용액에 30분간 실온에

서 담가 내인성 peroxidase와의 반응을 차단하였

다. HBsAg과 HBcAg에 대한 면역세포화학 검색

은 상품화된 DAKO LSAB Plus KIT (DAKO,

USA)를 이용하여 immunoperoxidase염색을 시행

하였다. 항원의 조직 내 발현을 위해 HBsAg에 대한

1차 항혈청(mouse anti- sera against HBsAg)과

HBcAg에 대한 1차 항혈청(rabbit anti- sera against

HBcAg)을 각각의 조직 절편 위에 놓아 실온에서 60

분간 반응을 시킨 후 2차 연결항체(biotinylated

link antibody)로 실온에서 15분간 반응을 시켰다.

이후 peroxidase가 부착된 streptavidin을 결합시킨

후 DAB (3,3 - diaminobenzidine tetrahydrochloride)

를 10분간 도포하여 발색하고 Harris hematoxylin

으로 대조 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.

양성 대조는 면역화학적 검색으로 발현이 증명된

B형 간염환자의 조직을 사용하였고 음성대조는 1차

항체 대신에 완충액을 이용하였다.

5) 간세포 내의 HBsAg 및 HBcAg의 발현

HBsAg의 발현 양상은 세포질에 발현한 경우를

F ig ure 3 . Expression of intrahepatic HBsAg and HBcAg in the patients with chronic hepatitis B. (A ), membranous (arrow )staining of HBsAg ; (B), cytoplasmic (arrow ) staining of HBsAg ; (C), nucleus (arrow ) as well as (D) cytoplasmic (arrow )staining of HBcAg are seen (Immunoperoxidase stain, X400).

404

조광범 외 8인. HBsAg 및 HBcAg의 발현양상과 조직소견과의 상관관계

cHBsAg, 세포막에 발현한 경우를 mHBsAg, 세포

막과 세포질에 모두 발현한 경우를 m- cHBsAg,

발현하지 않은 경우는 HBsAg(- )로 구분하였고,

HBcAg은 발현 부위에 따라 핵에 국한된 경우를

nHBcAg, 세포질에 국한된 경우를 cHBcAg, 핵과

세포질 모두에 공존한 경우를 n- cHBcAg, 발현하

지 않은 경우는 HBcAg (- )로 구분하였다(그림 3).

HBsAg은 세포막이나 세포질에 발현한 경우를

양성으로 하였고, HBcAg은 핵에서 발현된 경우를

양성으로 하였다. 발현되는 HBsAg과 HBcAg의

양상을 Gudat 등14의 방법에 따라 네 가지로 분

류하여 등급과 병기와의 상관관계를 조사하였다.

Gudat 등14에 의한 제 I형은 elimination형(HBsAg과

HBcAg함유 세포들이 모두 없거나 간혹 HBcAg함유

세포만 발견되는 경우), 제 II형은 HBcAg predomi-

nance형 또는 면역 억제형(다수의 HBcAg함유

세포가 출현하는 경우), 제 III형은 HBsAg predomi-

nance형 또는 HBcAg free-HBsAg형(다수의 HBsAg

함유 세포가 출현하고 HBcAg은 거의 없는 경우), 제

IV형은 equivalence형 또는 초점성 HBcAg형(소수

의 HBsAg과 HBcAg함유 세포들이 산발적으로 출

현하는 경우)으로 구분하였다(표 1). 또 각 B형 간

염 항원의 발현 유무에 따라 등급과 병기와의 상관

관계를 조사하였다.

3 . 통계

모든 측정치는 평균±표준편차로 표시하였으며 통계

분석은 윈도우용 통계프로그램(SPSSwin, version

8.0)을 이용하였다. 각각의 B형 간염 항원의 조직 내

발현 유무 및 Gudat 등14의 분류에 따른 병기와 등급

의 비교는 다원분산분석(oneway ANOVA)을 이용

하였고, p값이 0.05 미만인 경우에 유의성이 있는 것

으로 판정하였다.

결 과

1. HBcAg과 HBsAg의 조직 내 발현양상

HBcAg과 HBsAg의 조직 내 발현은 총 141예 중

T able 1. Gudat s Classification: Characteristics of Reaction T ypes in Chronic Hepatitis B

Reaction type HB Ag component in liver tissue

I : Elimination type None (occasional HBc)

II : HBc predominance or immunosuppression type HBc in every nuclei focal expression of HBs

III : HBs predominance or non-aggressive type Extensive HBs expression Rarely HBc

IV : HBc-s equivalence or aggressive type Spotty expression of both components, especially HBc

HBcAg, hepatitis B core antigen; HBsAg, hepatitis B surface antigen.

T able 2 . Distribution of Intrahepatic HBcAg and HBsAg of Patients with Chronic Hepatitis B (n=141)

Type of antigen Distribution Number (%)

HBcAg positive

negative

nHBcAgn-cHBcAgcHBcAg*

23 (16.3%)15 (10.6%)58 (41.2%)45 (31.9%)

HBsAg positive

negative

cHBsAgm-cHBsAgmHBsAg

114 (80.9%)16 (11.3%)2 (1.4%)9 (6.4%)

nHBcAg, nuclear expression of HBcAg; n-cHBcAg, nuclear/cytoplasmic expression of HBcAg; cHBcAg, cytoplasmic expression of HBcAg;cHBsAg, cytoplasmic expression of HBsAg; mHBsAg, membranous expression of HBsAg; m-cHBsAg, membranous/cytoplasmic expression

of HBsAg; *, cytoplasmic expression of HBcAg have interpretated as negative.

405


HBcAg은 96예(68.1%)에서 발현이 되었는데 이중

23예(16.3%)에서 핵에 국한된 경우였고 15예(10.6%)

에서 핵 및 세포질에서, 다른 58예(41.2%)에서는 세

포질에서 발현이 되었으며, 45예(31.9%)에서는 발

현이 되지 않았다. HBsAg은 132예(93.6%)에서 발

현이 되었는데 이중 세포질형은 114예(80.9%), 세

포질 및 세포막 동시 발현은 16예(11.3%), 세포막

형은 2예(1.4%)였고, HBsAg이 발현되지 않은 경

우는 9예(6.4%)이었다(표 2).

2 . 대상군의 임상소견

연구대상의 Gudat 등14의 분류에 의한 HBsAg과

HBcAg의 간세포 내 발현 양상은 I형이 7예(5.0%),

II형이 2예(1.4%), III형이 96예(68.1%), IV형이 36

예(25.5%)였다. 평균연령은 각 각 29.6±8.4세(19∼

41), 35.0±11.3세(27∼43세), 31.8±11.9세(12∼63

세), 30.6±10.3세(17∼49세)이었고 평균 ALT치는

각각 213±243 IU/ L (58∼694), 96±23 IU/ L (76∼

116), 259±236 IU/ L (82∼1361), 245±201 IU/ L(7

8∼694)이었다. 각 유형별에 따른 나이와 간기능

검사(총 단백, 알부민, ALT , aspartate aminotrans-

ferase (AST ) 및 alkaline phosphatase (ALP)) 간

에는 통계학적인 유의한 차이는 없었다(표 3).

그리고 HBcAg이 간세포 내에서 발현되는 위치

T able 3 . Characteristics of Patients at Entry by Gudat s Classification of HBcAg and HBsAg

Types I* II† III‡ IV§ p value

Number(%), n=141Age (years)‖

Protein (g/dL)‖

Albumin (g/dL)‖

ALP (IU/L)‖

AST (IU/L)‖

ALT (IU/L)‖

7 (5.0%)29.6±8.47.1±0.94.1±0.699±54

253±258312±243

2 (1.4%)35.0±11.38.1±0.24.6±0.851±661±996±28

96 (68.1%)31.8±11.97.0±0.74.2±0.5112±75224±248259±236

36 (25.5%)30.6±10.37.1±0.64.3±0.5106±45140±134245±201

0.8770.2270.4840.6120.1940.677

Protein, total serum protein; ALP, alkaline phosphatase; AST, aspartate aminotransferase; ALT, alanine aminotransferase.*, elimination type, none of HB Ag component; † , HBc predominence or immunosuppression type; ‡ , HBs predominence or non-aggressivetype; § , HBc-s equivalence or aggressive type; ‖ , Mean±S.D.

T able 4 . Expression Pattern of Intrahepatic HBcAg and HBsAg According to Liver Function

HBcAg HBsAg

nHBcAg

23(16.3%)

cHBcAg

58(41.2%)

n-cHBcAg

15(10.6%)

HBcAg(- )

45(31.9%)

pvalue

cHBsAg

114(80.9%)

mHBsAg

2(1.4%)

m-cHBsAg

16(11.3%)

HBsAg(- )

9(6.4%)

pvalue

protein (g/dL)* 7.4±0.6 7.1±0.7 6.9±0.8 6.9±0.7 0.116 7.1±0.7 6.0±0.4 6.8±0.7 7.3±0.9 0.306

Albumin (g/dL)* 4.4±0.5 4.2±0.5 4.3±0.5 4.2±0.5 0.457 4.3±0.5 3.7±0.4 4.2±0.4 4.2±0.6 0.409

ALP (IU/L)* 89±36 109±52 123±53 114±96 0.454 110±70 64±6 118±55 87±51 0.566

AST (IU/L)* 130±160 226±238 146±71 226±262 0.220 210±237 107±91 153±125 210±239 0.747

ALT (IU/L)* 169±146 239±203 342±226 293±271 0.065 260±234 133±105 236±171 264±232 0.860

protein, total serum protein; ALP, alkaline phosphatase; AST, aspartate aminotransferase; ALT, alanine aminotransferase; nHBcAg, nuclearexpression of HBcAg; cHBcAg, cytoplasmic expression of HBcAg; n-cHBcAg, nuclear/cytoplasmic expression of HBcAg; cHBsAg,cytoplasmic expression of HBsAg; mHBsAg, membranous expression of HBsAg; m-cHBsAg, membranous/cytoplasmic expression of HBsAg;

HBcAg(- ), No expression of HBcAg; HBsAg(- ), No expression of HBsAg. *, Mean±S.D.

406


에 따라 핵에 국한된 경우, 세포질에서 발현이 되

는 경우, 핵 및 세포질에서 발현되는 경우, 발현이

되지 않은 경우로 나누어 간 기능검사를 비교하였

을 때 발현위치에 따른 차이는 없었다. HBsAg의

경우도 세포질에서 발현한 경우, 세포질 및 세포막

에 동시 발현하는 경우, 세포막에서만 발현하는 경

우, HBsAg이 발현되지 않은 경우로 나누어 간 기

능 검사를 비교하였을 때 발현위치에 따른 차이는

없었다(표 4).

3 . HBsAg과 HBcAg의 간세포 내 발현양상에

따른 조직학적 염증반응의 등급과 병기

Gudat 등14의 분류에 의한 HBsAg과 HBcAg의

조직내 발현양상과, 조직학적 염증반응의 등급과

병기와의 연관관계를 다원분산분석을 통해 보았을

때, 등급에서 p값이 0.014, 병기에서는 p 값이 0.062

로, 등급에서 의미가 있는 것처럼 보였으나 Chi-

square test상 5 이하의 군을 형성하는 기대도수

(expected frequency)가 56.3%로 통계학적인 의미

를 부여하기 어려웠다(표 5).

그러나 HBsAg 및 HBcAg의 간조직 내 발현유

무와 조직학적인 등급과 병기를 다원분산분석을

통해 연관관계를 조사하였을 때, HBcAg 음성군의

경우 양성군에 비해 중등도(moderate)의 염증등급

을 가지는 경우가 49예:10예(47.6%: 26.3%), 중중

(severe)의 염증등급을 가지는 경우에서는 26예:5

예(25.2%:13.2%)로 p값이 0.001로 유의성이 있게

HBcAg 음성군에서 염증반응의 등급이 높았다.

섬유화를 나타내는 병기에서도 HBcAg 음성군에

서 양성군에 비해 문맥역간 섬유화(septal fibriosis)

이상의 진행을 나타내는 경우가 46예:9예(44.6%:

23.7%, p =0.002)로 유의성이 있게 높았다.

HBsAg의 경우에서는 발현유무에 관계없이 등

급과 병기 모두에서 p값이 각각 0.486와 0.354로서

통계학적 유의성이 없었다(표 6).

4 . HBsAg 및 HBcAg의 간조직 내 발현위치에

따른 조직학적 염증반응의 등급과 병기

HBsAg과 HBcAg 각각이 간세포 내에서 발현되는

위치와 조직학적인 등급과 병기와의 연관관계를

다원분산분석을 통해 조사하였을 때, HBsAg의 경

우 염증등급에서 p값이 0.006이며 섬유화 병기의

경우 p값이 0.219로서 염증등급에서 의미가 있는

것처럼 보이나 Chi- square test상 5 이하의 군을

T able 5 . Gudat s Classification of HBcAg and HBsAg According to Histopathologic Status

HBsAg/HBcAg expression type

I* II† III‡ IV§ number p value

7 (5.0%) 2 (1.4%) 96 (68.1%) 36 (25.5%) 141 (100%)

Grade 1234

1 (14.3%)1 (14.3%)4 (57.1%)1 (14.3%)

1 (50.0%)1 (50.0%)

00

3 (3.1%)23 (24.0%)45 (46.9%)25 (26.0%)

7 (19.4%)14 (38.9%)10 (27.8%)5 (13.9%)

12 (8.5%)39 (27.7%)59 (41.8%)31 (22.0%)

0.014‖

Stage 01234

01 (14.3%)4 (57.1%)1 (14.3%)1 (14.3%)

01 (50.0%)1 (50.0%)

00

06 (6.3%)

46 (47.9%)42 (43.8%)2 (2.1%)

2 (5.6%)8 (22.2%)17 (47.2%)7 (19.4%)2 (5.6%)

2 (1.4%)16 (11.3%)68 (48.2%)50 (35.5%)5 (3.5%)

0.062

Grade (activity) 1, minimal; 2, mild; 3, moderate; 4, severe.Stage (fibrosis) 0, no fibrosis; 1, portal; 2, periportal; 3, septal; 4, cirrhosis.*, elimination type, none of HB Ag component; † , HBc predominence or immunosuppression type; ‡ , HBs predominence or non-aggressive

type; § , HBc-s equivalence or aggressive type; ‖ , p<0.05, but 9 cell (56.3%) have expected count less than 5 by χ2 - test.

407

T able 6 . Expression of Intrahepatic HBcAg and HBsAg According to Histopathologic Status.

HBcAg HBsAg

HBcAg(+)* HBcAg(- )† HBsAg(+) HBsAg(- )

38 (100.0%) 103 (100.0%) 132 (100.0%) 9 (100.0%)

Grade 1 8 (21.1%) 4 (3.9%) 10 (7.6%) 2 (22.2%)

2 15 (39.5%) 24 (23.3%) 37 (28.0%) 2 (22.2%)

3 10 (26.3%) 49 (47.6%) 55 (41.7%) 4 (44.4%)

4 5 (13.2%) 26 (25.2%) 30 (22.7%) 1 (11.1%)

p value 0.001‡ 0.486

Stage 0 2 (5.3%) 0 2 (1.5%) 0

1 9 (23.7%) 7 (6.8%) 14 (10.6%) 2 (22.2%)

2 18 (47.4%) 50 (48.5%) 63 (47.7%) 5 (55.6%)

3 7 (18.4%) 43 (41.7%) 49 (37.1%) 1 (11.1%)

4 2 (5.3%) 3 (2.9%) 4 (3.0%) 1 (11.1%)

p value 0.002§ 0.354

Grade (activity) 1, minimal; 2, mild; 3, moderate; 4, severe.

Stage (fibrosis) 0, no fibrosis; 1, portal; 2, periportal; 3, septal; 4, cirrhosis.*, nuclear and nuclear/cytoplasmic expression of HBcAg have interpretated as positive; † , cytoplasmic expression of HBcAg have interpretated

as negative; ‡ , p <0.05; § , p<0.05, 5 cells (50.0%) have expected count less than 5 byχ2 - test.

T able 7 . Distribution of Intrahepatic HBcAg and HBsAg According to Histopathologic Status

HBcAg HBsAg

nHBcAg cHBcAg n-cHBcAg cHBsAg mHBsAg m-cHBsAg

23 (100.0%) 58 (100.0%) 15 (100.0%) 114 (100.0%) 2 (100.0%) 16 (100.0%)

Grade

1234

3 (13%)10 (43.5%)6 (26.1%)4 (17.4%)

2 (3.4%)10 (17.2%)31 (53.4%)15 (25.9%)

5 (33.3%)5 (33.3%)4 (26.7%)1 (6.7%)

5 (4.4%)30 (26.3%)51 (44.7%)28 (24.6%)

01 (50.0%)1 (50.0%)

0

5 (31.3%)6 (37.5%)3 (18.8%)2 (12.5%)

p value 0.002* 0.006†

Stage

01234

2 (8.7%)3 (13.0%)14 (60.9%)3 (13.0%)1 (4.3%)

02 (3.4%)

28 (48.3%)26 (44.8%)2 (3.4%)

06 (40.0%)4 (26.7%)4 (26.7%)1 (6.7%)

2 (1.8%)9 (7.9%)

54 (47.4%)45 (39.5%)4 (3.5%)

01 (50.0%)

01 (50.0%)

0

04 (25.0%)9 (56.3%)3 (18.8%)

0

p value 0.001‡ 0.219

Grade (activity) 1, minimal; 2, mild; 3, moderate; 4, severe.Staging (fibrosis) 0, no fibrosis; 1, portal; 2, periportal; 3, septal; 4, cirrhosis.nHBcAg, nuclear expression of HBcAg; cHBcAg, cytoplasmic expression of HBcAg; n-cHBcAg, nuclear/cytoplasmic expression of HBcAg;cHBsAg, cytoplasmic expression of HBsAg; mHBsAg, membranous expression of HBsAg; m-cHBsAg, membranous/cytoplasmic expressionof HBsAg.

*, p<0.05; † , p<0.05, but 7 cells (58.3%) have expected count less than 5 byχ2 - test.‡ , p<0.05, but 8 cells (53.3%) have expected count less than 5 byχ2 - test.


408

조광범 외 8인. HBsAg 및 HBcAg의 발현양상과 조직소견과의 상관관계

형성하는 기대도수(expected frequency)가 53.3%로

통계학적인 의미를 부여하기 어려웠다. 그러나

HBcAg의 경우에서는 핵에 국한되어 발현하는 경

우와 핵과 세포질 모두에서 발현하는 경우가 세포

질에서만 발현되는 경우보다 낮은 단계의 염증등

급과 섬유화 병기를 보였다(표 7).

고 찰

HBV에 의한 간세포의 손상기전이나 만성 간염

으로 이행되는 기전은 아직 명확하지 않지만 대체

로 바이러스에 의한 직접적인 손상보다도 숙주의

면역체계를 통하여 간접적으로 간세포를 손상시키

는 것으로 알려져 있다.15 간세포가 HBV에 감염되

면 주변세포에서는 비특이적 반응으로 인터페론의

생산을 증가시키는 반면 HBV는 인터페론의 유전

자발현을 전사과정에서 억제하고, HBV가 가진 말

단 단백질은 인터페론의 작용을 둔화시키고 있

다.16 여기에 관여하는 세포로는 NK세포(natural

killer cell), macrophage 등이 있다. 또 특이적 면

역반응으로 세포성 면역반응과 체액성 면역반응이

있는데, 세포성 면역반응에 관여하는 세포로는

CD8+ 세포(cytotoxic T cell)와 CD4+ 세포(helper

T cell)가 있으며 세포성 면역반응은 체액성 면역

반응보다 훨씬 이전에 나타난다. CD8+ 세포는 바이

러스에 감염된 세포를 선택적으로 파괴하고 여러 종

류의 lymphokine을 분비하여 이들 lymphokine의 역

할에 따라 B 세포로 하여금 항체를 생산하도록 유

도하며 염증반응을 유발하고, 또 T 세포를 분화시

켜 항바이러스 작용을 유도한다. 이런 작용으로 바

이러스에 감염된 간 세포는 파괴되며 이로 인하여

혈중 AST와 ALT는 상승하게 된다. 체액성 면역

반응으로는 anti- HBc IgM, anti- HBe, anti- HBs

등이 있다.

이러한 만성 B형 간염에서 바이러스의 증식과

활성도를 반영하는 지표로는 혈청 내 HBeAg, HBV

DNA 및 HBV DNA polymerase, 간 조직 내 HBcAg,

HBV DNA, 간조직 소견 등이 있으며 이들간에는

매우 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다. 이

중 간조직 내 HBcAg은 HBV감염의 표지자일뿐만

아니라 HBV의 증식 및 숙주 면역반응의 표적항원

으로 작용하여 간세포 내의 HBcAg의 분포와 염증

반응과는 밀접한 관련이 있다고 한다.6 - 9

HBeAg은 HBV에 감염된 간세포에서 분비되는

가용성인 nucleocapsid 단백질로서 또 다른 nucleo-

capsid 단백질인 HBcAg과 T 및 B 세포에 대한 항

원 결정기(epitopes)를 공유한다.17 또 바이러스 증

식과 밀접한 관계가 있으며 급성감염 초기에 출현

하여 정상적인 회복기에는 없어지나 만성간염으로

이행 시에는 계속 존재하게 된다.

HBcAg은 처음 간세포의 리보솜에서 비입자형

으로 생성된 다음 핵으로 이동되어 입자형으로 변

형되고 다시 세포질로 유리되어 조면소포체(rough

endoplasmic reticulum)에서 HBsAg과 함께 Dane

입자를 형성18한다고 하는데, 이러한 관점에서 보

면, 핵뿐만 아니라 세포질 내에서도 HBcAg이 발

현될 수 있다 하겠다. 그러나 현재까지는 세포질에

서만 발현한 HBcAg은 음성으로 판독하고 있는 실

정이기에 여기에 대한 더 많은 연구가 필요하겠다.

김 등4은 만성 B형 간염환자 40명을 대상으로 간

조직 내 B형 간염 항원의 발현율을 조사한 결과

HBsAg는 36예(90%), HBcAg은 18예(45%)로 보

고하였으며, 김 등11은 만성 간염에서 간 조직내

HBcAg의 경우 57.6%에서 양성반응을 보였다고

보고하였는데, 본 연구에서는 HBcAg 양성 96예

(68.1%)와 HBsAg 양성 132예(93.6%)로 HBcAg군

이 약간 높게 관찰되었다. 이는 전자4의 경우 40예

중 간경변으로 진행한 경우 7예가 포함되어 있었

고, 이들에게서 모두 HBcAg이 음성으로 검출되었

기 때문에 본 연구보다 낮은 빈도의 HBcAg 양성

율을 보인 것으로 생각된다.

숙주의 면역상태를 고려하여 세포 내 HBsAg과

HBcAg의 발현양상을 분석한 연구 중 Gudat 등14

은 HBsAg과 HBcAg의 발현양상을 4가지로 분류

하였다. 본 연구에서는 모든 대상자가 만성 B형 간

염이었음에도 불구하고 Gudat 등14이 분류한 제 I

형이 7예(5.0%) 관찰되었고, 제 II형은 2예(1.4%),

제 III형이 96예(68.1%), 제 IV형이 36예(25.5%)이

409


었다. 제 I형은 주로 급성 간염에서 볼 수 있다고

하였는데 만성 간염에서 이렇게 많은 수가 나온 이

유로는, HBsAg 또는 HBcAg은 대부분 간조직 내

에서 국소적 또는 드물게 분포하여 간 조직내 B형

간염 항원의 발현율은 조직의 크기와 관계가 있기

때문으로 사료된다.11 즉 대부분의 간조직검사가

두 세 개의 침생검 조직으로 구성되어 있기 때문에

표본오차로 인한 가능성도 고려해야겠다. 제 II형

에서 IV형은 만성간염에서 주로 보인다고 하였는

데, 이중 제 II형이 2예(1.4%)밖에 나타나지 않은

이유로는 본 연구의 대상환자 모두가 혈중 ALT치

가 높으며 혈중 HBeAg과 HBV DNA치가 모두 양

성인 환자들이기에, 과거 만성 지속성 간염의 범주

에 해당되는 환자가 포함이 안되었기 때문으로 사

료된다.

과거에는 만성 간염의 진단기준으로서 조각괴사

나 문맥염증이 강조되어 왔으나 최근에 와서는 간

소엽의 염증이 환자의 예후와 더 관련이 있음이 강

조되고 있다.19 Batts와 Ludwig13 분류에서는 간실

질의 괴사와 염증을 기준으로 하여 간실질 손상의

등급(grade)과 섬유화의 병기(stage)에 따른 간염

의 진행과정을 나타내어 이전의 만성 간염 분류보

다 훨씬 합리적이다. 본 연구는 새로운 분류법에

의한 만성간염의 진행정도와, 간세포 내의 HBsAg

및 HBcAg의 발현유무 및 발현위치와의 상관관계

를 알아보기 위하여 시행하였는데, 각 항원의 발현

유무와 발현위치에 따른 간 기능의 상태를 비교를

하였을 때 각각의 군별로 차이가 없었다. 이는 간

기능이 간세포 내 HBsAg 또는 HBcAg의 존재와

무관함을 보여주는 기존의 사실과 일치하였다(표

2, 3).

HBcAg은 핵뿐만 아니라 세포질 내에서도 관찰

이 되는데 HBcAg은 T -림프구 세포독성의 표적항

원이므로 만일 바이러스가 직접적으로 감염된 간

세포를 파괴한다면 이들 항원이 나타나는 조직에서

더 심한 간세포의 손상을 관찰할 수 있어야 한다. 그

러나 각 항원의 발현위치(nHBcAg, n- cHBcAg또는

cHBcAg, cHBsAg, mHBsAg, m- cHBsAg)에 따

른 간 실질 손상의 등급(grade) 및 섬유화의 병기

(stage)에 어떤 차이가 있는지 보기 위하여 상관관

계를 보았을 때, Gudat 등14이 제안한 세포 내

HBsAg과 HBcAg의 발현양상에 따른 분류에서는

간 실질 손상의 등급에서 각 군간에 유의성이 있는

것처럼 보였으나 Chi- square test상 5 이하의 군을

형성하는 기대도수(expected frequency)가 56.3%

로 통계학적인 의미를 부여하기 어려웠다. 따라서

간기능검사상 정상을 보이고 있는 만성 간염환자

들을 포함한 충분한 수의 대상환자에 대한 연구도

필요하리라 사료된다.

이 등12은 혈청 내 HBsAg양성인 40예의 간조직

검사에서 HBcAg의 발현양상을 관찰하였을 때

핵에서만 양성반응을 보였을 때는 hematoxylin -

eosin염색상에서 미약한 염증반응을 보였으며, 세

포질 내에서 양성반응을 보인 예에서는 진행성의

심한 염증소견을 보여 HBcAg의 발현양상이 병변

의 진행과정과 관련이 있다는 보고를 하였다. 본

연구에서 HBsAg 및 HBcAg이 발현된 군과 발현

되지 않은 군 사이에서 간 실질 손상의 등급(grade)

에 어떤 차이가 있는지, 섬유화 정도(stage)에 어떤

차이가 있는지 보기 위하여 상관관계를 조사하였

을 때, HBcAg 양성일 때에는 간실질의 손상정도

(grade)에서 p값이 0.001로 의미있게 HBcAg 음성

군에 비하여 손상정도가 약했으며 섬유화 정도에

있어서도 음성군에 비하여 섬유화 정도가 유의하

게 낮았다(p =0.002). 그리고 각 항원의 발현 위치에

따른 차이를 보았을 때 HBcAg의 경우에서는 핵에

국한되어 발현하는 경우와 핵과 세포질 모두에서

발현하는 경우가 세포질에서만 발현되는 경우보다

낮은 단계의 염증등급(p =0.002)과 섬유화 병기

(p =0.001)를 보여 이 등12과 같은 결과를 보여 주었

다. 이는 전술18한 바와 같이, HBcAg은 처음 간세

포의 리보솜에서 비입자형으로 생성된 다음 핵으

로 이동되어 입자형으로 변형되고 다시 세포질로

유리되어 조면소포체(rough endoplasmic reti-

culum)에서 HBsAg과 함께 Dane입자를 형성한다

는 사실과, 또 B형 간염 바이러스 보유자가 면역

관용 상태를 벗어나게 되면 세포 독성 T 림프구에

의하여 B형 간염 바이러스에 감염된 간세포가 제

410


거된다고 하는 사실과 관계가 있다고 생각된다. 즉

핵 속에서 HBcAg이 발현될 때는 상대적으로 면역

관용기를 벗어난 지 얼마 안되었기 때문에 세포 독

성 T 림프구에 의한 간세포제거가 조금밖에 일어

나지 않아서 전체적인 염증등급과 섬유화 병기가

HBcAg이 발현 안되거나 세포질에서만 발현을 보

이는 cHBcAg군보다 상대적으로 작게 나타났으며,

역으로 보면 ALT치가 높고 혈중 HBeAg 양성이

며 혈중 HBV DNA 양성이지만 간조직에서는

cHBcAg나 HBcAg음성을 나타내는 군은 상대적

으로 진행된 만성간염을 나타낸다는 사실이다. 이는

안 등20이 보고한 바와 같이 HBcAg이나 HBsAg의

발현양상은 병리학적 진단에 따른 특별한 차이를

보이지 않는다는 것과는 상반되며, 오히려 간조직

내 HBcAg은 HBV의 증식 및 숙주 면역반응의 표

적항원으로 작용하여 간세포 내의 HBcAg의 분포

와 염증반응과는 밀접한 관련이 있다6 - 9는 것과

Chu 등2 1이 보고한 바와 같이 HBcAg의 발현이 간

의 염증반응과 관계있다는 결과와 일치한다. 또

HBcAg의 발현양상이 만성 활동성 간염의 조직소

견을 보이는 환자에서도 간조직생검의 시점과 임

상 양상에 따라서도 바뀔 수 있다는 박 등22의 연구

와 일치된다고 생각된다.

본 연구에서는 HBcAg의 발현 유무에 따라 간조

직 검사상의 염증의 등급과 섬유화병기에 따른 차

이를 보였었다. 이로 미루어 보아 세포내 HBcAg

이 면역학적 간세포 손상의 표적항원임을 추정할

수 있었으나 좀 더 많은 연구가 있어야 하겠다.

요 약

목적 : HBsAg 및 HBcAg의 간세포 내 발현 유

무 및 발현 위치와 만성 간염의 새로운 분류법인

염증의 등급(grade)와 섬유화에 따른 병기(stage)

를 이용한 분류법과의 상관관계를 조사하기 위하

여 이 연구를 시행하였다. 대상과 방법 : 1999년 3

월에서 2001년 8월까지 계명대학교 동산의료원 소

화기내과에 내원한, 간조직 생검을 통하여 만성활

동성 간염으로 확진된 환자 중 임상적으로 ALT치

가 증가되었고, HBV 표지자(혈청 내 HBsAg,

HBeAg, HBV DNA)가 양성인 141명(남자:여자

=141:27)을 대상으로 하였다. 간 조직은 Batts와

Ludwig에 의한 분류법에 따라 등급 및 병기를 조

사하였으며, 면역조직화학염색을 시행하여 발현되

는 HBsAg과 HBcAg의 양상을 Gudat 등이 제안

한 방법에 따라 네 가지로 분류하여, 염증의 등급과

섬유화의 병기와의 상관관계를 알아보았다. 또

HBsAg과 HBcAg의 발현 유무 및 발현 위치에 따라

염증의 등급와 섬유화의 병기간의 상관관계를 구하

였다. 결과 : HBcAg과 HBsAg의 조직 내 발현은

총 141예중 HBcAg은 96예(68.1%)에서 발현이

되었는데, 이중 23예(16.3%)에서 핵에 국한된 경

우(nHBcAg)였고 15예(10.6%)에서 핵 및 세포질

(n- cHBcAg)에서, 다른 58예(41.2%)에서는 세포질

(cHBcAg)에서 발현이 되었으며, 45예(31.9%)에서

는 발현이 되지 않았다. HBsAg은 132예(93.6%)에

서 발현이 되었는데 이중 세포질형(cHBsAg)은

114예(80.9%), 세포질 및 세포막 동시 발현(m-

cHBsAg)은 16예(11.3%), 세포막형(mHBsAg)은 2

예(1.4%)였고, HBsAg이 발현되지 않은 경우는 9

예(6.4%)이었다.

HBsAg과 HBcAg의 발현 양상에 따른 Gudat

등의 분류를 했을 때 각 군별로 나이와 간 기능검

사의 차이는 없었다. 또 HBsAg과 HBcAg의 발현

유무와 위치에 따라 분류를 했을 때도 간기능검사

상 각 군별로 차이는 없었다. 그러나 HBcAg이 핵

에서 발현하는 경우는 HBcAg이 세포질에서 발현

하는 경우나 발현하지 않는 경우보다 유의하게 염

증의 등급과 섬유화 병기가 낮았다. HBsAg의 경

우에서는 발현한 군과 발현하지 않은 군간에 등급

과 병기 모두에서 유의성이 없었다. 결론 : 만성 B

형 간염에서 HBcAg이 핵에서 발현하는 경우는

HBcAg이 세포질에서 발현하는 경우나 발현하지

않는 경우보다 유의하게 염증의 등급과 섬유화 병

기가 낮았다. HBsAg의 경우에서는 발현한 군과

발현하지 않은 군간에 등급과 병기 모두에서 유의

성이 없었다. 따라서 HBcAg의 존재가 간세포 손

상의 중요한 소견임을 알 수 있었다.

411


색인단어 : 면역조직화학염색, 간염/바이러스성/ B형 간염, HBcAg, HBsAg, Stage, 조직학적 등급

참 고 문 헌

1. 김부성, 정진우, 박두호, 최상욱, 강혜정, 정욱성. 각종 간 질환

에서 B형 간염 바이러스 DNA polymerase활성도와 HBsAg의

상관관계. 대한소화기학회지 1988;20:105- 111.2. 송인성, 김정룡, 이효석, 서정선. 간염 B바이러스의 DNA혈중농도

와 HBeAg/Anti-HBe와의 상관관계. 대한소화기학회지 1989;21:876-881.

3. Hsu HC, Su IJ, Lai MY, et al. Biologic and prognosticsignificance of hepatocyte hepatitis B core antigen expressionin the natural course of chronic hepatitis B virus infection. JHepatology 1987:5;45-50.

4. 김경희, 김형중, 전재윤, 강진경, 최흥재. B형 만성 간질환에 있

어서 viral replication marker와 병리조직학적 소견과의 비교

관찰. 대한내과학회잡지 1985;28:761-769.5. 최상욱, 강혜정, 정욱성 등. 각종 간질환에서 B형간염 바이러

스 DNA polymerase 활성도와 HBeAg의 관계. 대한소화기병

학회지 1988;20:105- 111.6. 이영석. B형 간염바이러스에 의한 면역반응 및 간세포의 손상

기전. 대한간학회지 1997;3:185- 192.7. Naumov NV, Mondelli M, Alexander GJ, Tedder RS,

Eddleston AL, Williams R. Relationship between expressionof hepatitis B virus antigens in isolated hepatocytes andautologous lymphocyte cytotoxicity in patiients with chronicHBV infection. Hepatology 1984;4:63-68.

8. Peters M, Vierling J, Gershwin ME, Milich D, Chisari FV,Hoofnagle JH. Immunology and the liver. Hepatology 1991;13:977-994.

9. Milich RD. Immune response to hepatitis B virus proteins:Relevalance of the murine model. Sem in Liver Disease1991;11:93- 112.

10. Popper H, Schaffner F . The vocabulary of chronic hepatitis .N Engl J Med 1971;284:1154- 1156.

11. 김상표, 김찬환, 이상숙, 정재홍. 간조직내 B형 간염표지자의

검색. 대한병리학회지 1988;22:404-414.12. 이혜경, 김상호. 만성 B형 간염에서 간세포내 HBcAg에 대한

면역 조직 화학적 연구. 대한병리학회지 1989;23:287- 291.13. Kenneth PB, Jurgen Ludwig. Chronic Hepatitis-An update

on terminology and reporting. Am J Surg Pathol 1995;19:1409- 1417.

14. Fred Gudat, Leonardo Bianchi, Wolfgang Sonnabend, GilbertThiel, Werner Aenishenslin, Georg AS. Pattern of core andsurface expression in liver tissue reflects state of specificimmune response in hepatitis B. Lab Invest 1975;32:1-9.

15. 이영석. B형 간염바이러스에 의한 면역반응 및 간세포의 손상

기전. Cited from Wright TL, Terrault NA, Ganem D:Hepatitis B virus. In: Richmann DD, Whitley RJ, Hayden FG(Eds). Clinical Virology. Livingstone: Churchill, 1997;633-681.

16. 이영석. 간염바이러스와 인터페론의 상호 억제작용. 대한간학

회지 1995;1:35- 44.17. 손주현, 기춘석. 만성 바이러스성 간염의 병태생리-만성 B형

및 C형 간염. 대한간학회지 1995;1:13- 28.18. MacSween RN, Anthony PP, Scheuer PJ. Pathology of the

liver. 2nd ed. Livingstone: Churchill, 1987.19. 정환국, 한준열. B형 급성 및 만성간염이 간경변으로 이행하

는 병리조직학적 양상. 대한간학회지 1996;2:134- 144.20. 안희정, 김경호, 박영년, 김호근, 박찬일. 비활성 혈청 HBsAg

보유자의 간조직내 HBcAg 및 HBsAg 발현양상. 대한병리학

회지 1990;24:120- 127.21. Chu CM, Liaw YF. Intrahepatic distribution of hepatitis B

surface and core antigens in chronic hepatitis B virusinfection. Gastroenterology 1987;92:220- 225.

22. 박상진, 한광협, 문희용, 등. 만성 B형 활동성 간염환자에서

HBeAg과 임상양상에 따른 간 조직내 B형 간염 바이러스 Core항원의 발현양상. 대한소화기학회지 1996;28:520-529.

412

Documents

만성 형 간염에서 HBsAg 및 HBcAg의 간세포 내 발현양상과 … · 2) 간조직염색 포르말린에고정된조직은통상적인조직처리과 정을통하여 파라핀에