Epi.1983.Wahlgren.clinExpImmunol.characterization of the Humoral Immune Response in Plasmodium Falciparum Malaria II IgG Subclass Levels of Anti-P Falciparum Antibodies in Different

8/14/2019 Epi.1983.Wahlgren.clinExpImmunol.characterization of the Humoral Immune Response in Plasmodium Falciparum

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C l i n . e x p . I m m u n o l . ( 1 9 8 3 ) 5 4 , 1 3 5 - 1 4 2 .

C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e h u m o r a l i m m u n e r e s p o n s e i nP l a s m o d i u m f a l c i p a r u m m a l a r i a . I I . I g G s u b c l a s s l e v e l s o fa n t i - P . f a k i p a r u m a n t i b o d i e s i n d i f f e r e n t s e r a

M. WAHLGREN,*t K . BERZINS,* P . PERLMANN* & M. P E R S S O N J * D e p a r t m e n t o fI m m u n o l o g y , U n i v e r s i t y o f S t o c k h o l m ; t D e p a r t m e n t o f I n f e c t i o u s D i s e a s e s , K a r o l i n s k a I n s t i t u t e t ,R o s l a g s t u l l H o s p i t a l , S t o c k h o l m a n d T D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l I m m u n o l o g y , K a r o l i n s k a I n s t i t u t e t ,H u d d i n g e H o s p i t a l , H u d d i n g e , S w e d e n( A c c e p t e d f o r p u b l i c a t i o n 9 May 1 9 8 3 )

SUMMARYT h e I g G s u b c l a s s l e v e l s o f a n t i - P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m a n t i b o d i e s i n h u m a n s e r a w e r ed e t e r m i n e d i n ELISA w i t h m o n o c l o n a l m o u s e a n t i b o d i e s s p e c i f i c f o r t h e human I g Gs u b c l a s s e s a s a n a l y t i c a l r e a g e n t s . T h e p a r a s i t e a n t i g e n w a s a t r o p h o z o i t e / s c h i z o n te n r i c h e d p r e p a r a t i o n o f i n v i t r o c u l t i v a t e d P . f a l c i p a r u m . S e r u m s a m p l e s w e r e f r o mS w e d i s h m a l a r i a p a t i e n t s a n d a d u l t L i b e r i a n s . P a r a s i t e s p e c i f i c a n t i b o d i e s w e r e f o u n d i na l l f o u r s u b c l a s s e s . R e l a t i v e l y e l e v a t e d l e v e l s o f I g G 1 a n t i b o d i e s w e r e f o u n d b o t h i nS w e d i s h p a t i e n t s a n d i n t h e L i b e r i a n s . R e l a t i v e t o t h e L i b e r i a n s , h i g h I g G 2 a n t i b o d y l e v e l sw e r e s e e n i n m o s t S w e d i s h p a t i e n t s . I n L i b e r i a n s e r a b u t n o t i n t h o s e f r o m S w e d i s hp a t i e n t s e l e v a t e d I g G 3 l e v e l s w e r e f o u n d . I n t w o S w e d i s h p a t i e n t s f o l l o w e d c o n s e c u t i v e l yf o r a p e r i o d o f 1 5 w e e k s , e l e v a t e d l e v e l s o f I g G 1 a n d I g G 3 a n t i b o d i e s w e r e s e e n a f t e rr e l a p s e . No d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e g r o u p s i n r e g a r d t o t h e l e v e l s o f I g G 4 a n t i b o d i e s w e r en o t i c e d . T h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e S w e d i s h p a t i e n t s a n d t h e L i b e r i a n s w e r e a l s o i n p a r tr e f l e c t e d b y d i f f e r e n c e s i n t h e t o t a l a m o u n t s o f t h e f o u r I g G s u b c l a s s e s .K e y w o r d s P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m m a l a r i a I g G s u b c l a s s e s ELISA

INTRODUCTIONI n s p i t e o f h i g h l e v e l s o f a n t i - p l a s m o d i a l a n t i b o d i e s i n m a l a r i a p a t i e n t s s e r a , a p r o t e c t i v e i m m u n i t yi s a c q u i r e d o n l y a f t e r m u l t i p l e e x p o s u r e s t o t h e p a r a s i t e o v e r a l o n g p e r i o d o f t i m e . T h e r e a s o n s f o rt h i s a r e n o t known a n d f u r t h e r k n o w l e d g e o f b o t h t h e a n t i g e n s i n v o l v e d a n d t h e a n t i b o d i e s e l i c i t e dd u r i n g d i f f e r e n t p h a s e s o f t h e d i s e a s e i s u r g e n t l y n e e d e d . S i n c e t h e b i o l o g i c a l e f f e c t o r f u n c t i o n s o ft h e d i f f e r e n t I g G s u b c l a s s e s v a r y g r e a t l y ( S p i e g e l b e r g , 1 9 7 4 ) t h e s e r u m c o n c e n t r a t i o n s o f a n t i b o d i e sb e l o n g i n g t o a g i v e n s u b c l a s s may r e f l e c t t h e i r c l i n i c a l r o l e i n t h e c o u r s e o f a n i n f e c t i o n . I n t h ea c c o m p a n y i n g p a p e r ( W a h l g r e n , B e r z i n s & P e r l m a n n , 1 9 8 3 ) w e h a v e d e s c r i b e d a n ELISA f o rm e a s u r i n g a n t i b o d y l e v e l s i n P . f a l c i p a r u m m a l a r i a . T h i s a s s a y h a s now b e e n f u r t h e r d e v e l o p e d t od e t e r m i n e t h e a n t i b o d y s u b c l a s s o f a n t i - p a r a s i t e a n t i b o d i e s .

C o r r e s p o n d e n c e : Dr M a t s W a h l g r e n , D e p a r t m e n t o f I m m u n o l o g y , U n i v e r s i t y o f S t o c k h o l m , S - 1 0 6 9 1S t o c k h o l m , S w e d e n .' 3 5


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M. W a h i g r e n e t a l .MATERIALS AND METHODS

P . f a l c i p a r u m a n t i g e n a n d h u m a n r ed b l o o d c e l l a n t i g e n . T h e a n t ig en p r e p a r a t io n s u s e d w e r ea l i q u o t s o f t h o s e d e s c r i b e d i n t h e p r e c e d i n g p a p e r ( W a h l g r e n e t a l . , 1 9 8 3 ) .S e r u m s a m p l e s . T e n s e r u m s a m p l e s w e r e f r o m 1 0 i n - p a t i e n t s w i t h P . f a l c ip a r u m m a l a r i a a tR o s l a g s t u l l H o s p i t a l , S t o c k h o l m . A l l g a v e s t r o n g r e a c t i o n s i n t h e P . f a l c i p a r u m ELISA ( W a h l g r e ne t a l . , 1 9 8 3 ) . T w e l v e c o n s e c u t i v e s e r u m s a m p l e s w e r e f r o m t w o a d d i t i o n a l S w e d i s h p a t i e n t s (HP a n dC A ) w i t h r e l a p s i n g c h l o r o q u i n e r e s i s t a n t m a l a r i a ( A r o n s s o n e t a l . , 1 9 8 1 ) . S i x s e r a w e r e f r o m s i xa d u l t L i b e r i a n s , l i v i n g i n a m a l a r i a e n d e m i c a r e a o f L i b e r i a (Hedman e t a l . , 1 9 7 9 ) . C o n t r o l s e r a w e r ef r o m f i v e h e a l t h y S w e d i s h b l o o d d o n o r s . A l l s e r a w e r e a b s o r b e d w i t h n o r m a l human e r y t h r o c y t eg h o s t s a s d e s c r i b e d ( W a h l g r e n e t a l . , 1 9 8 3 ) .M o u s e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . A n t i b o d i e s s p e c i f i c f o r human I g G s u b c l a s s e s w e r e a k i n d g i f t o fDr N . R . L i n g , D e p a r t m e n t o f I m m u n o l o g y , T h e M e d i c a l S c h o o l , B i r m i n g h a m , UK. T h ea n t i b o d i e s w e r e d e r i v e d f r o m t h e f o l l o w i n g c l o n e s : a n t i - I g G I , J L 5 1 2 ; a n t i - I g G 2 , GOM1 a n dGOM2; a n t i - I g G 3 , Z G 4 ; a n t i - I g G 4 , R J 4 . F o r f u r t h e r d e t a i l s s e e Lowe e t a l . ( 1 9 8 2 ) . W h o l e a s c i t i cf l u i d s w e r e u s e d i n a l l t e s t s . T h e s p e c i f i c i t i e s o f t h e m o n o c l o n a l r e a g e n t s w e r e a s c e r t a i n e d i n a nELISA i n w h i c h t h e m i r c o w e l l s w e r e c o a t e d w i t h h u m a n m y e l o m a p r o t i e n s o n e w i t h K a n d o n e w i t hA l i g h t c h a i n s o f e a c h o f t h e I g G s u b c l a s s e s 1 - 4 r e s p e c t i v e l y . No c r o s s - r e a c t i v i t i e s w e r e s e en e x c ep tf o r a w e a k o n e o b t a i n e d w i t h a n t i - I g G 3 w h e n t e s t e d w i t h t h e A I g G 2 m y e l o m a p r o t e i n . I n h i b i t i o ne x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d i n w h i c h d i f f e r e n t a m o u n t s o f m y e l o m a p r o t e i n w e r e a d d e d t o t h em o n o c l o n a l a n t i b o d i e s b e f o r e t h e a s s a y ( W a h l g r e n e t a l . , 1 9 8 3 ) . C o m p l e t e i n h i b i t i o n w a s e a s i l yo b t a i n e d i n t h e h o m o l o g o u s i n h i b i t o r / a n t i b o d y c o m b i n a t i o n s a n d n o c r o s s - r e a c t i o n s w e r e s e e n . A l lm o n o c l o n a l a n t i b o d i e s w e r e s t o r e d a t - 2 0 C i n s m a l l a l i q u o t s u n t i l u s e .

A n t i - m o u s e i m m u n o g l o b u l i n ( I g ) c o n j u g a t e . I m m u n o s o r b e n t p u r i f i e d r a b b i t a n t i - m o u s e i m -m u n o g l o b u l i n a n t i b o d i e s w e r e u s e d . A n t i b o d i e s c r o s s - r e a c t i n g w i t h human i m m u n o g l o b u l i n w e r er e m o v e d o n a h u m a n I g G - S e p h a r o s e 4 B c o l u m n . C o n j u g a t i o n w i t h a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( A L P )w a s p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d ( W a h l g r e n e t a l . , 1 9 8 3 ) .A n a l y s i s o f P . f a l c i p a r u m a n t i b o d i e s o f d i f f e r e n t I g G s u b c l a s s e s . O p t i m a l d i l u t i o n s o f t h er e a g e n t s w e r e d e t e r m i n e d b y t i t r a t i o n s w i t h a f e w k n o w n p o s i t i v e p a t i e n t s ' s e r a a n d n e g a t i v e c o n t r o ls e r a . T h e o p t i m a l d i l u t i o n o f t h e P . f a l c i p a r u m a n t i g e n s t o c k s o l u t i o n ( 7 m g / m l ) was 1 : 1 , 0 0 0 a n dt h a t o f t h e t e s t s e r a was 1 : 2 0 0 . F o r t h e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t h e y w e r e f o r a n t i - I g G l ( 4 m ga n t i b o d y / m l ) 1 : 5 0 0 , f o r a n t i - I g G 3 ( 4 . 4 m g a n t i b o d y / m l ) 1 : 1 , 0 0 0 a n d f o r I g G 4 ( 2 m g a n t i b o d y / m l )1 : 1 , 0 0 0 . F o r a n t i - I g G 2 , t w o d i f f e r e n t m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s ( 3 - 9 a n d 2 6 m g / m l , r e s p e c t i v e l y ) w e r em i x e d a n d u s e d a t a d i l u t i o n o f 1 : 1 , 0 0 0 . T h e o p t i m a l d i l u t i o n o f t h e r a b b i t a n t i - m o u s e I g c o n j u g a t ew a s 1 : 3 , 0 0 0 .T h e p r o c e d u r e o f c o a t i n g t h e m i c r o t i t r e p l a t e s w i t h P . f a l c i p a r u m a n t i g e n was a s d e s c r i b e d( W a h l g r e n e t a l . , 1 9 8 3 ) . H o w e v e r , t h e i n c u b a t i o n f o r a f t e r c o a t i n g w i t h b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A )a t 4 C was e x t e n d e d t o l a s t o v e r n i g h t . A f t e r w a s h i n g a n d a d d i t i o n o f RB C a b s o r b e d t e s t s e r u m , t h ep l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 4 0 C o v e r n i g h t a n d w a s h e d a g a i n . A l i q u o t s o f t h e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e sw e r e t h e n a d d e d t o t h e w e l l s . T h e p l a t e s w e r e i n c u b a t e d o v e r n i g h t a t room r e m p e r a t u r e , w a s h e d a n dt h e c o n j u g a t e was t h e n a d d e d . A f t e r a f i n a l i n c u b a t i o n o v e r n i g h t a t 4 C t h e p l a t e s were w a s h e d a n ds u p p l e m e n t e d w i t h 0 - 1 m l / w e l l o f p - n i t r o p h e n y l p h o s p h a t e d i l u t e d i n e n z y m e s u b s t r a t e b u f f e r . T h ep r e c i s e i n c u b a t i o n t i m e s w e r e a d a p t e d on t h e b a s i s o f t h e r e a c t i o n s o b t a i n e d w i t h s t a n d a r d s e r ai n c l u d e d i n e a c h t e s t . A l l s e r a w e r e t e s t e d i n d u p l i c a t e s .

D e t e r m i n a t i o n o f a n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n s . M i c r o t i t r e w e l l s were c o a t e d w i t h d i f f e r e n t amounts ( 1n g t o 1 0 i g / m l ) o f m y e l o m a p r o t e i n o f e i t h e r on e o f t h e f o u r I g G s u b c l a s s e s . C o a t i n g w as d o n e w i t ha m i x t u r e ( 1 : 1 ) o f o n e K a n d on e A m y e l o m a p r o t e i n o f e a c h I g G s u b c l a s s , r e s p e c t i v e l y . An ELISAwas t h e n p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d a b o v e . A s t a n d a r d c u r v e w as c o n s t r u c t e d f o r e a c h s u b c l a s s b yp l o t t i n g t h e O D 4 0 5 a g a i n s t t h e d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f t h e m y e l o m a p r o t e i n u s e d f o r c o a t i n g . I no r d e r t o e s t i m a t e t h e amount o f m y e l o m a p r o t e i n a c t u a l l y a d s o r b e d t o t h e w e l l s , p r o t e i n s o f e a c h o ft h e f o u r s u b c l a s s e s w e r e l a b e l l e d w i t h 1 0 m C i / m g N a ' 2 5 1 b y t h e c h l o r a m i n e - T p r o c e d u r e ( H u n t e r &G r e e n w o o d , 1 9 6 2 ) . T h e a d s o r b t i o n t o t h e p l a s t i c o f r a d i o a c t i v e p r o t e i n w as d e t e r m i n e d a f t e r ac o m p l e t e ELISA b y c u t t i n g o u t t h e w e l l s a n d c o u n t i n g t h e r e m a i n i n g r a d i o a c t i v i t y i n a gamma

1 3 6


3/8

i - u m o r a l immune r e s p o n s e i n m a l a r i a I 3 7c o u n t e r . On t h e a v e r a g e , 46% ( r a n g e 2 9 - 6 9 % ) o f t h e amount o f m y e l o m a p r o t e i n , a d d e d a t f o u rd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s , w a s f o u n d t o a d h e r e t o t h e w e l l s , r e g a r d l e s s o f s u b c l a s s . T h e I g G s u b c l a s sc o n c e n t r a t i o n o f t h e a n t i - P . f a l c i p a r u m a n t i b o d i e s w a s d e t e r m i n e d b y c o m p a r i n g t h e OD r e a d i n g so b t a i n e d i n t h e a n t i b o d y ELISA d e s c r i b e d i n t h e p r e c e d i n g p a r a g r a p h w i t h t h o s e o f t h e m y e l o m as t a n d a r d s . T h e I g G s u b c l a s s c o n c e n t r a t i o n s s o o b t a i n e d w e r e m u l t i p l i e d w i t h a f a c t o r o f 0 * 4 6 i no r d e r t o c o r r e c t f o r a d h e r e n c e t o t h e p l a s t i c a n d b y a f a c t o r 2 0 0 t o c o r r e c t f o r t h e d i l u t i o n o f t h es e r u m .T o t a l I g G a n d I gM l e v e l s . T h e l e v e l s o f c e r t a i n t e s t s e r a w e r e d e t e r m i n e d b y s i n g l e r a d i a ld i f f u s i o n i n a g a r o s e ( T r i - P a r t i g e n , B e h r i n g w e r k e A G , M a r b u r g , F R G ) .I g G s u b c l a s s c o n c e n t r a t i o n s . T h e t o t a l c o n c e n t r a t i o n o f d i f f e r e n t I g G s u b c l a s s e s p r e s e n t i n somes e r a w a s d e t e r m i n e d i n a s i m i l a r w a y . A n t i s e r a w e r e s u b c l a s s s p e c i f i c r a b b i t a n t i s e r a f r o m t h e R e dC r o s s B l o o d T r a n s f u s i o n S e r v i c e , A m s t e r d a m , H o l l a n d a n d t h e t e s t s y s t e m s w e r e s t a n d a r d i z e du s i n g a WHO s e r u m p o o l ( 6 7 / 9 7 ) .

RESULTSF i g . 1 s h o w s f o u r s t a n d a r d c u r v e s o b t a i n e d i n t h e s u b c l a s s ELISA b y c o a t i n g t h e m i c r o w e l l s w i t he i t h e r o n e o f t h e m y e l o m a p r o t e i n s a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s s e c t i o n . S i m i l a rc u r v e s w e r e o b t a i n e d w i t h a l l s u b c l a s s e s a l t h o u g h l o n g e r i n c u b a t i o n t i m e s h a d t o b e u s e d i n t h eI g G I a n d I g G 2 a s s a y s d u e t o a l o w e r b i n d i n g c a p a c i t y o f t h e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . I n t h e I g G 2a s s a y t h i s w a s p a r t l y c o m p e n s a t e d f o r b y u s i n g a m i x t u r e o f t w o m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s , d i r e c t e d t od i f f e r e n t e p i t o p e s o n t h e F c f r a g m e n t o f I g G 2 ( L o w e e t a l . , 1 9 8 2 ) .T h e OD r e a d i n g s o b t a i n e d w i t h t h e s u b c l a s s s p e c i f i c m o n o c l o n a l s i n t h e P . f a l c i p a r u m ELISAv a r i e d g r e a t l y f o r i n d i v i d u a l s e r a . F o r t h e 1 0 S w e d i s h p a t i e n t s a n d s i x L i b e r i a n s f r o m a m a l a r i ae n d e m i c a r e a , t h e s e r u m c o n c e n t r a t i o n s o f t h e a n t i - p a r a s i t e a n t i b o d i e s , c a l c u l a t e d f r o m t h es t a n d a r d c u r v e s , r a n g e d f r o m < 1 - 1 1 5 p g / m l f o r I g G l , 1 - 3 3 p g / m l f o r I g G 2 , < 1 - 5 0 p g / m l f o r I g G 3a n d < 1 - 6 5 u g / m l f o r I g G 4 . F o r t h e S w e d i s h c o n t r o l s , n o r e a c t i o n s w e r e o b t a i n e d w h e n t h e y w e r et e s t e d f o r a n t i - P . f a l c i p a r u m a n t i b o d i e s i n t h e I g G 1 , I g G 3 o r I g G 4 a s s a y s . H o w e v e r , w i t h a n t i - I g G 2 ,t h e OD r e a d i n g s w e r e s l i g h t l y e l e v a t e d , c o r r e s p o n d i n g t o s e r u m c o n c e n t r a t i o n s o f < 8 - 5 p g / m l .I n d i v i d u a l a n t i b o d y l e v e l s a r e s h o w n i n F i g . 2 a - d . I n b o t h t h e S w e d i s h a n d L i b e r i a n g r o u p a f e wd o n o r s h a d e l e v a t e d l e v e l s o f a n t i b o d i e s o f t h e I g G l s u b c l a s s . Many o f t h e S w e d i s h p a t i e n t s w i t hp r i m a r y i n f e c t i o n s a l s o h a d e l e v a t e d l e v e l s o f I g G 2 a n t i b o d i e s . I n c o n t r a s t , t h e I g G 2 a n t i b o d y l e v e l so f t h e L i b e r i a n s w e r e l o w . F o r I g G 3 , t h i s w a s d i f f e r e n t i n t h a t t h e L i b e r i a n s t e n d e d t o s h o w h i g h e r

2 - 2

0

1 0 1 . 0 0 0 0 1 0 - 0 0 1A n t i b o d y c o a t e d ( u g / m I )F i g . 1 . S t a n d a r d c u r v e s o b t a i n e d i n t h e ELISA w h e n m y e l o m a p r o t e i n s o f t h e f o u r s u b c l a s s e s ( I g G = 0 ;I g G 2 = 0 ; I g G 3 = 0 ; I g G 4 = * ) w e r e c o a t e d o n t h e p l a s t i c a t d i f f e r e n t p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s .

T V *_


4/8

I 3 8 M. W a h l g r e n e t a l .1 2 0 - ( a ) I I b )1 0 0 _ 3 0 _

E _80o 0. 0 _0060 a. 4 0_ C \ J 10 *

2 0 _

P a t i e n t s C o n t r o l s P a t i e n t s C o n t r o l sS L S S L S50 ( c ) 8 ( d )

E EN 1 0 N

0 - oo 0

P a t i e n t s C o n t r o l s P a t i e n t s C o n t r o l sS L S S L SF i g . 2 . T h e l e v e l s o f a n t i - P . f a l c i p a r u m I g G a n t i b o d y s u b c l a s s e s ( e x p r e s s e d i n y g / m l ) i n s e r a . P a t i e n t s : L = s e r af r o m s i x a d u l t L i b e r i a n s , S = s e r a f r o m I O S w e d i s h p a t i e n t s w i t h P . f a l c i p a r u m m a l a r i a . C o n t r o l s : S = s e r a f r o mf i v e S w e d i s h h e a l t h y b l o o d d o n o r s . ( a ) I g G I , ( b ) I g G 2 , ( c ) I g G 3 a n d ( d ) I g G 4 .

a n t i b o d y l e v e l s ( o n e d o n o r v e r y h i g h ) w h i l e t h e I g G 3 a n t i b o d y l e v e l o f t h e S w e d i s h p a t i e n t s w as l o w .B o t h g r o u p s h a d l o w l e v e l s o f I g G 4 a n t i b o d i e s . H o w e v e r , on e L i b e r i a n a n d t w o S w e d e s a l s o h a dr e l a t i v e l y h i g h l e v e l s o f s u c h a n t i b o d i e s .C o n s e c u t i v e s t u d i e s o f a n t i b o d y l e v e l s were p e r f o r m e d on ser um s a m p l e s f r o m t w o S w e d i s hp a t i e n t s ( n o t i n c l u d e d i n F i g . 2 ) who h a d a c q u i r e d c h l o r o q u i n e r e s i s t a n t P . J f a l c i p a r u m m a l a r i a . Ass h o w n i n t h e a c c o m p a n y i n g p a p e r ( W a h l g r e n e t a l . , 1 9 8 3 ) f o r on e o f t h e s e p a t i e n t s ( H P ) , t h e r e w asan e a r l y p e a k i n p a r a s i t e m i a d u r i n g t h e f i r s t w e e k a f t e r o n s e t o f t h e d i s e a s e a n d r e c r u d e s c e n c e s a t 6a n d I 1 1 w e e k s . H e r a n t i - P . f a l c i p a r u m a n t i b o d i e s s h o w e d a f i r s t p e a k d u r i n g t h e t h i r d w e e k a f t e ro n s e t a n d r o s e a g a i n s t r o n g l y a f t e r t h e s e c o n d r e l a p s e , w i t h a h i g h p e a k d u r i n g w e e k s I 1 1 - 1 3 . Ass h o w n i n F i g . 3 a l i q u o t s o f t h e same ser um s a m p l e s f r o m t h i s p a t i e n t h a v e a l s o b e e n s t u d i e d i n t h es u b c l a s s E L I S A . B o t h t h e I g G I a n d I g G 3 r e s p o n s e s s h o w e d m a j o r p e a k s a f t e r t h e s e c o n d r e l a p s e .R e l a t i v e t o I g G l , I g G 3 a p p e a r e d t o b e e v e n more e n h a n c e d t h a n f o u n d i n o t h e r S w e d i s h s e r a ( c f .F i g . 2 a a n d c ) . A l s o t h e I g G 2 a n t i b o d i e s s h o w e d a narrow p e a k a f t e r t h e s e c o n d r e l a p s e b u t t h e l e v e lo f t h i s p e a k w as l o w ( c f . F i g . 2 b ) . T h e I g G 4 a n t i b o d i e s r e m a i n e d a t a l o w l e v e l t h r o u g h o u t . S i m i l a rr e s u l t s were o b t a i n e d w i t h t h e s e r a o f a s e c o n d p a t i e n t ( C A ; d a t a n o t s h o w n ) .T h e t o t a l I g G l e v e l i n so m e s e r a , s t u d i e d b y r a d i a l i m m u n o d i f f u s i o n , r a n g e d f r o m 1 4 2 0 m g / m lw h i c h was s l i g h t l y a b o v e n o r m a l ( n o r m a l r a n g e f o r E u r o p e a n s , 8 - 1 8 m g / m l a s d e t e r m i n e d b y t h eT r i - p a r t i g e n a s s a y . ) T h i s e l e v a t i o n w as t h e same f o r I g M , w h i c h r a n g e d f r o m 1 0 - 4 3 m g / m l( n o r m a l r a n g e f o r E u r o p e a n s 0 - 6 - 2 5 m g / m l ) . I n o r d e r t o o b t a i n a more c o m p l e t e p i c t u r e , m o s t o ft h e s e s e r a were a l s o a n a l y s e d f o r t h e t o t a l c o n c e n t r a t i o n o f e a c h I g G s u b c l a s s . T h e r e s u l t s a r es u m m a r i z e d i n T a b l e I w h i c h a l s o g i v e s t h e c o r r e s p o n d i n g v a l u e s o f t h e I g G s u b c l a s s l e v e l s f o r t h ea n t i - P . f a l c i p a r u m a n t i b o d i e s p r e s e n t i n t h e s e s e r a .


5/8

H u m o r a l i m m u n e r e s p o n s e i n m a l a r i a

* n

a YI5 1 0W e e k s a f t e r o n s e t o f d i s e a s eF i g . 3 . T h e l e v e l s o f a n t i - P . f a l c i p a r u m I g G a n t i b o d y s u b c l a s s e s ( e x p r e s s e d i n p g / m l ) i n e i g h t s e r a f r o m p a t i e n tH . P . d u r i n g a 1 5 w e e k s p e r i o d . T h e p a t i e n t h a d c h l o r o q u i n e r e s i s t a n t P . f a l c i p a r u m m a l a r i a w i t h p a r a s i t er e l a p s e s ( i n d i c a t e d b y a r r o w s ) . ( a ) I g G l ( 0 ) , ( b ) I g G 2 ( 0 ) , I g G 3 ( - ) a n d I g G 4 ( a ) .T a b l e 1 . I m m u n o g l o b u l i n a n d a n t i b o d y l e v e l s i n n i n e s e r a f r o m p a t i e n t s e x p o s e d t o P . f a l c i p a r u m m a l a r i a

T o t a l ( m g / m l ) P a r a s i t e s p e c i f i c ( p g / m l )P a t i e n t I g G IgM I g G I I g G 2 I g G 3 I g G 4 I g G I I g G 2 I g G 3 I g G 4M.D.-L 2 0 2 - 3 1 3 2 - 9 2 - 3 0 . 1 5 0 2 - 5 7 - 5 2 - 0 0P . J . - L n t n t 90 4 0 1 - 5 0 - 2 1 6 1 9 3 - 7 0 - 2 5P.B.-L n t n t 1 1 3 - 0 1 - 6 0 3 n t n t n t n tT 1 1 5 4 - L 2 0 1 7 n t n t n t n t 1 0 9 - 5 3 - 0 0 - 1 5C . J . - S 1 9 1 0 8 - 8 50 03 0 - 2 5 2 3 1 9 0 2 0K . P . - S 1 9 4 - 3 76 39 0 4 0 1 1 6 1 0 000E.H.-S 1 5 2 - 2 7 - 8 4 - 0 1 - 2 0 1 1 0 3 5 3 - 7 0 - 1 5B . P . - S 1 4 1 - 4 6 - 7 3 - 4 0 2 0 4 1 1 5 5 1 0 0 - 2 5B . J . - S 1 4 2 - 8 n t n t n t n t 4 5 5 1 0 0 - 2 5

L = L i b e r i a n , S = S w e d i s h , nt= n o t t e s t e d .

DISCUSSIONI n t h e p r e c e d i n g p a p e r ( W a h l g r e n e t a l . , 1 9 8 3 ) w e d e s c r i b e d a n ELISA f o r m e a s u r i n g t h e l e v e l s o fa n t i b o d i e s t o P . f a l c i p a r u m i n p a t i e n t s ' s e r a . T h i s a s s a y h a s now b e e n d e v e l o p e d f u r t h e r f o re s t i m a t i n g t h e I g G s u b c l a s s l e v e l s o f a n t i - P . f a l c i p a r u m a n t i b o d i e s . T h e s e d e t e r m i n a t i o n s w e r ep e r f o r m e d b y i n c l u d i n g m o n o c l o n a l m o u s e a n t i b o d i e s s p e c i f i c f o r t h e human I g G s u b c l a s s i n t o t h ea s s a y s y s t e m . T h u s b y u s i n g a t h r e e l a y e r a n t i b o d y a s s a y i t w a s p o s s i b l e t o m e a s u r e t h ec o n c e n t r a t i o n o f s p e c i f i c a n t i b o d i e s o f a g i v e n s u b c l a s s i n a s i n g l e t e s t .When t h e t o t a l a m o u n t o f I g G a n t i - P . f a l c i p a r u m a n t i b o d i e s p r e s e n t i n d i f f e r e n t s e r a w a s

1 2 5 F - ( a )

5 0 1 -

I 3 9

- 2 5" I

7 . 1 1>1 1 0

" 7 - 5 -

I k lI7 ( hi

5 0 O _

2 - 5 _

a 1 5.

1 0 0 o _

I - ' J _


6/8

1 4 0 M. W a h i g r e n e t a l .e s t i m a t e d b y s u m m a t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e d i f f e r e n t s u b c l a s s e s , l o w v a l u e s w e r e o b t a i n e d( c f . T a b l e 1 ) i n c o m p a r i s o n t o w h a t h a s b e e n f o u n d b y o t h e r s ( C u r t a i n e t a l . , 1 9 6 4 ) . M o r e o v e r , i n t h ef e w s e r a t e s t e d , t h e a m o u n t o f P . f a l c i p a r u m a n t i b o d i e s o f I g G 1 , 2 , 3 o r 4 s u b c l a s s w a s a r e l a t i v e l ym i n o r f r a c t i o n o f t h e t o t a l a m o u n t s o f t h e s u b c l a s s e s p r e s e n t . H o w e v e r , t h e t o t a l s u b c l a s sc o n c e n t r a t i o n s w e r e m e a s u r e d b y r a d i a l i m m u n o d i f f u s i o n w i t h p o l y c l o n a l r a b b i t a n t i b o d i e s a n d t h ev a l u e s f o r t h e a b s o l u t e c o n c e n t r a t i o n s g i v e n a r e n o t c o m p a r a b l e . T h e s u b c l a s s ELISA may b ee x p e c t e d t o g i v e l o w v a l u e s s i n c e t h e m o u s e a n t i b o d i e s w e r e m o n o c l o n a l a n d t h e i r a v i d i t i e s a s w e l l a st h o s e o f t h e a n t i - P . f a l c i p a r u m a n t i b o d i e s w e r e u n k n o w n . S i n c e t h e a s s a y i n c l u d e s many w a s h i n gs t e p s , a n t i b o d y l o s s e s a r e b o u n d t o o c c u r . I t may f u r t h e r b e a r g u e d t h a t t h e a n t i - P . f a l c i p a r u ma n t i b o d i e s b e l o n g i n g t o d i f f e r e n t s u b c l a s s e s may c o m p e t e w i t h e a c h o t h e r a t t h e l e v e l o f t h e a n t i g e n ,r e s u l t i n g i n f a l s e n e g a t i v e o r l o w e s t i m a t e s f o r a n t i b o d i e s o f t h e l e s s f r e q u e n t s u b c l a s s e s . H o w e v e r ,t h e s e n s i t i v i t y o f ELISA m a d e i t p o s s i b l e t o m i n i m i z e t h i s c o m p e t i t i o n b y u s i n g h i g h s e r u m d i l u t i o n sa n d , t h e r e f o r e , t o w o r k i n a n t i g e n e x c e s s . O u r r e s u l t s i n d i c a t e t h a t c o m p a r i s o n o f t h e l e v e l s o fa n t i b o d i e s b e l o n g i n g t o d i f f e r e n t s u b c l a s s e s a r e m e a n i n g f u l i n t h e P . f a l c i p a r u m s y s t e m .A n t i - P . f a l c i p a r u m a n t i b o d i e s w e r e f o u n d w i t h i n a l l f o u r I g G s u b c l a s s e s . A s w a s t o b e e x p e c t e d ,a n t i b o d i e s o f t h e I g G l s u b c l a s s w e r e f r e q u e n t a n d r e l a t i v e l y e l e v a t e d l e v e l s w e r e s e e n b o t h i nS w e d i s h a n d L i b e r i a n s e r a . H i g h I g G 3 a n t i b o d y l e v e l s r e l a t i v e t o t h e S w e d i s h s e r a w e r e p r i m a r i l ys e e n i n t h e L i b e r i a n s e r a . H o w e v e r , w h e n c o n s e c u t i v e s e r u m s a m p l e s f r o m p a t i e n t s H . P . w e r ea n a l y s e d , a p r o n o u n c e d i n c r e a s e w a s f o u n d o f t h e I g G 3 l e v e l a f t e r t h e s e c o n d r e l a p s e ( F i g . 3 ) . I nc o n t r a s t , t h e S w e d i s h p a t i e n t s h a d s t r i k i n g l y h i g h l e v e l s o f I g G 2 a n t i b o d i e s a s c o m p a r e d w i t h t h eL i b e r i a n s ( F i g . 2 b ) . No d i s t i n c t t r e n d s f o r t h e t w o g r o u p s c o u l d b e d i s c e r n e d i n r e s p e c t t o I g G 4a n t i b o d i e s . T h e d i f f e r e n c e s i n a n t i b o d y l e v e l s w e r e p a r t i a l l y r e f l e c t e d b y d i f f e r e n c e s i n t h e t o t a la m o u n t s o f t h e d i f f e r e n t I g G s a s s e e n i n a s m a l l n u m b e r o f s e r a a v a i l a b l e f o r t h e s e t e s t s . S u m m a t i o no f t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e f o u r s u b c l a s s e s f o r e a c h i n d i v i d u a l p a t i e n t s g a v e s i m i l a r v a l u e s a s t h ed e t e r m i n a t i o n o f t o t a l I g G . C o n s i d e r i n g t h e f a c t t h a t d i f f e r e n t s t a n d a r d s w e r e u s e d i n t h e s e t e s t s ( s e eM a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) , t h e v a l u e s a g r e e d r e a s o n a b l y w e l l . B o t h t h e S w e d i s h p a t i e n t s a n d t h eL i b e r i a n s h a d h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t o t a l I g G . F o r t h e S w e d i s h p a t i e n t s , I g G I w a s 6 1 O % o f t h e t o t a lI g G ( s u m o f I g G l - 4 ) w h i c h i s c l o s e t o n o r m a l , w h i l e t h e i r t o t a l I g G 2 w a s h i g h ( 3 2 % ) ( M o r e l l ,S k v a r i l & B a r a n d u n , 1 9 7 6 ) . T h e c o r r e s p o n d i n g p r o p o r t i o n s f o r t h e L i b e r i a n s w e r e 6 7 % f o r I g G la n d 2 0 % f o r I g G 2 . H o w e v e r , t h e t h r e e L i b e r i a n s h a d a v e r y s u b s t a n t i a l e l e v a t i o n i n I g G 3 ( 1 1 % )w h i l e t h e t o t a l I g G 3 v a l u e f o r t h e S w e d i s h p a t i e n t s w a s n o r m a l ( 4 . 5 % ) ( M o r e l l e t a l . , 1 9 7 6 ) . B o t hg r o u p s h a d n o r m a l a n d s i m i l a r l e v e l s o f I g G 4 . N o t m u c h i n f o r m a t i o n i s a v a i l a b l e r e g a r d i n g I g Gs u b c l a s s l e v e l s i n m a l a r i a p a t i e n t s . H o w e v e r , S a l i m o n o u , W i l l i a m s & O s u n k o y a , ( 1 9 8 2 ) r e c e n t l yr e p o r t e d t h a t N i g e r i a n p a t i e n t s w i t h a c u t e m a l a r i a h a d e l e v a t e d l e v e l s o f I g G 1 w h i l e a l l o t h e rs u b c l a s s e s w e r e s l i g h t l y d i m i n i s h e d .T h e r e a s o n s f o r r e l a t i v e l y e l e v a t e d I g G 3 a n t i - P . f a l c i p a r u m a n t i b o d y l e v e l s i n L i b e r i a n s e r a a n d ,i n p a r t i c u l a r , f o r t h e h i g h I g G 2 a n t i b o d y l e v e l s i n m o s t S w e d i s h p a t i e n t s a r e n o t k n o w n . G e n e t i cd i f f e r e n c e s i n a l l o t y p i c r e s t r i c t i o n b e t w e e n t h e d o n o r g r o u p s may b e c o n s id er ed a n d a r e f u r t h e ri n v e s t i g a t e d b y Gm t y p i n g o f a n t i b o d i e s a n d t o t a l I g G . P o l y s a c c h a r i d e s s u c h a s d e x t r a n o r l e v a n a r eknown t o g i v e r i s e t o a n t i b o d i e s o f t h e I g G 2 s u b c l a s s ( Y o u n t e t a l . , 1 9 6 8 ) . S i n c e s u c h s u b s t a n c e s a r ea l s o known t o b e p o l y c l o n a l B c e l l a c t i v a t o r s ( C o u t i n h o , M o l l e r & R i c h t e r , 1 9 7 4 ) , p a r a s i t e d e r i v e dm a t e r i a l o f a s i m i l a r n a t u r e c o u l d w e l l b e r e s p o n s i b l e f o r b o t h I g G 2 a n t i b o d y f o r m a t i o n a n d ag e n e r a l e l e v a t i o n o f t o t a l I g G 2 i n a c u t e l y i n f e c t e d p a t i e n t s . S i n c e t h e L i b e r i a n s e r a i n c l u d e d i n t h i ss t u d y w e r e f r o m d o n o r s w i t h f e w o r no p a r a s i t e s i n t h e i r b l o o d , t h i s c o u l d e x p l a i n t h e i r l o w e r I g G 2a n t i b o d y l e v e l s b u t n o t t h e i r r e l a t i v e e l e v a t i o n o f I g G 3 . M o s t l i k e l y , t h e e x p l a n a t i o n o f t h ed i f f e r e n c e s i n I g G s u b c l a s s e x p r e s s i o n b e t w e e n t h e tw o d o n o r g r o u p s a r e more c o m p l e x a n d i n v o l v ec o m b i n e d e f f e c t s o f p o l y c l o n a l B c e l l a c t i v a t i o n a n d a T c e l l r e g u l a t e d s w i t c h i n i m m u n o g l o b u l i n Cg e n e e x p r e s s i o n , d e p e n d e n t on t h e i m m u n e s t a t u s o f t h e serum d o n o r s ( M a r t i n e z - A l o n s o , C o u t i n h o& A u g u s t i n , 1 9 8 0 ; M o n g i n i , S t e i n & P a u l , 1 9 8 1 ) .S e v e r a l i n t e r d e p e n d e n t f a c t o r s s u c h a s m i t o g e n i c i t y o f t h e p a r a s i t e ( G r e e n w o o d & V i c k , 1 9 7 5 ) ,a n t i g e n i c v a r i a t i o n ( M . H o m m e l , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) , i m b a l a n c e s i n t h e T c e l l s y s t e m( T r o y e - B l o m b e r g e t a l . , 1 9 8 3 ) a s w e l l a s o t h e r s ( f o r r e v i e w s e e P l a y f a i r , 1 9 8 2 ; A l l i s o n & E u g u i , 1 9 8 2 )may b e r e s p o n s i b l e f o r t h e d e l a y e d o n s e t o f a c q u i r e d i m m u n i t y i n P . f a l c i p a r u m m a l a r i a . T h ep r e s e n t f i n d i n g s m i g h t i m p l y t h a t t h e s u b c l a s s o f t h e a n t i b o d i e s f o r m e d i n d i f f e r e n t p h a s e s o f


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H u m o r a l i m m u n e r e s p o n s e i n m a l a r i a 1 4 1i n f e c t i o n o r a f t e r d i f f e r e n t l e n g t h o f p a r a s i t e e x p o s u r e may b e i n s t r u m e n t a l i n p r o v i d i n g p r o t e c t i o n .R e s t r i c t i o n s i n t h e I g G s u b c l a s s e s i n v o l v i n g i n c r e a s e d r e l a t i v e l e v e l s o f I g G 3 h a s b e e n o b s e r v e d i ns e v e r a l i n s t a n c e s ( D e v e y & V o a k , 1 9 7 4 ; M o r t i m e r & W i d d o w s o n , 1 9 7 9 ; B e c k , 1 9 8 1 ) . T h e I g Gs u b c l a s s e s a l s o v a r y c o n s i d e r a b l y i n t h e i r c a p a c i t y t o a c t i v a t e v a r i o u s e f f e c t o r c e l l s p a r t i c i p a t i n g i ni m m u n e p r o t e c t i o n ( S p i e g e l b e r g , 1 9 7 4 ) . T h u s , w h i l e I g G I a n d I g G 3 m e d i a t e p h a g o c y t o s i s o r t a r g e tc e l l l y s i s b y m o n o c y t e s o r F c r e c e p t o r b e a r i n g l y m p h o c y t e s , I g G 2 o r 4 a r e i n a c t i v e o r l e s s e f f i c i e n t i nt h i s r e s p e c t ( S p i e g e l b e r g , 1 9 7 4 ; P e r l m a n n & C e r o t t i n i , 1 9 7 9 ) . A n t i b o d y - d e p e n d e n t c e l l u l a r e f f e c t o rm e c h a n i s m s h a v e a l s o b e e n s u g g e s t e d t o p l a y a p r o t e c t i v e r o l e i n m a l a r i a ( B r o w n & S m a l l e y , 1 9 8 0 ,1 9 8 1 ; C e l a d a , C r u c h a u d & P e r r i n , 1 9 8 2 ) . A n t i - P . f a l c i p a r u m a n t i b o d i e s o f t h e I g G I a n d I g G 3s u b c l a s s e s may t h e r e f o r e i n d u c e o r a m p l i f y ( A l l i s o n & E u g u i , 1 9 8 2 ) c e l l - m e d i a t e d p r o t e c t i o n w h i c hI g G 2 ( a n d I g G 4 ) c o u l d n o t d o e v e n i f t h e y w e r e s p e c i f i c f o r t h e s a m e t a r g e t a n t i g e n s . On t h ec o n t r a r y , i n t h i s c a s e , a n t i b o d i e s o f t h e l a t t e r t w o s u b c l a s s e s m i g h t b e i n h i b i t o r y .T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y g r a n t N o . B 8 3 - 1 6 X - 0 6 2 5 2 f r o m t h e S w e d i s h M e d i c a l R e s e a r c h C o u n c i l , t h eS w e d i s h A g e n c y f o r R e s e a r c h C o - o p e r a t i o n w i t h D e v e l o p i n g C o u n t r i e s ( S A R E C ) a n d t h e R o c k e f e l l e rF o u n d a t i o n . We w i s h t o t h a n k I n g a P o n t e n a n d t h e s t a f f a t R o s l a g s t u l l H o s p i t a l f o r t h e i r k i n d h e l p a n dc o - o p e r a t i o n .

REFERENCESA L L I S O N , A . C . & E U G U I , E . ( 1 9 8 2 ) A r a d i c a l i n t e r p r e -t a t i o n o f i m m u n i t y t o m a l a r i a l p a r a s i t e s . L a n c e t , i i ,1 4 3 1 .A R O N S S O N , B . , B E N G T S S O N , E . , B J O R K M A N , A . , P E H R S -S O N , P . O . , R o m w o , L . & W A H L G R E N , M. ( 1 9 8 1 )C h l o r o q u i n e r e s i s t a n t f a l c i p a r u m m a l a r i a i n M a d a -g a s c a r a n d K e n y a . A n n . T r o p . M e d . P a r a s i t o l . 7 5 ,3 6 7 .B E C K , O . E . ( 1 9 8 1 ) D i s t r i b u t i o n o f v i r u s a n t i b o d ya c t i v i t y a m o n g h u m a n I g G s u b c l a s s e s . C l i n . e x p .I m m u n o l . 4 3 , 6 2 6 .B R O W N , J . & S M A L L E Y , M . E . ( 1 9 8 0 ) S p e c i f i c a n t i b o d y -d e p e n d e n t c e l l u l a r c y t o t o x i c i t y i n h u m a n m a l a r i a .C l i n . e x p . I m m u n o l . 4 1 , 4 2 3 .B R O W N , J . & S M A L L E Y , M . E . ( 1 9 8 1 ) I n h i b i t i o n o f t h ei n v i t r o g r o w t h o f P l a s m p o d i u m f a l c i p a r u m b yh u m a n p o l y m o r p h o n u c l e a r n e u t r o p h i l l e u c o c y t e s .C l i n . e x p . I m m u n o l . 4 6 , 1 0 6 .C E L A D A , A . , C R U C H A U D , A . & P E R R I N , L . H . ( 1 9 8 2 )

O p s o n i c a c t i v i t y o f h u m a n i m m u n e s e r u m o n i nv i t r o p h a g o c y t o s i s o f P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m i n -f e c t e d r e d b l o o d c e l l s b y m o n o c y t e s . C l i n . e x p .I m m u n o l . 4 7 , 6 3 5 .C O U T I N H O , A . , M O L L E R , G . & R I C H T E R , W. ( 1 9 7 4 )M o l e c u l a r b a s i s o f B - c e l l a c t i v a t i o n . I . M i t o g e n i c i t yo f n a t i v e a n d s u b s t i t u t e d d e x t r a n s . S c a n d . J . I m -m u n o l . 3 , 3 2 1 .C U R T A I N , C . C . , K I D S O N , C . , C H A M P N E S S , D . L . &G O R M A N , J . G . ( 1 9 6 4 ) M a l a r i a a n t i b o d y c o n t e n t o fg a m m a 2 - 7 S g l o b u l i n i n t r o p i c a l p o p u l a t i o n s .N a t u r e , 2 0 3 , 1 3 6 6 .D E V E Y , M . E . & V O A K , D . ( 1 9 7 4 ) A c r i t i c a l s t u d y o f t h eI g G s u b c l a s s e s o f Rh a n t i - D a n t i b o d i e s f o r m e d i np r e g n a n c y a n d i n i m m u n i z e d v o l u n t e e r s . I m m u n o -l o g y , 2 7 , 1 0 7 3 .G R E E N W O O D , B . M . & V I C K , R . M . ( 1 9 7 5 ) E v i d e n c e f o ra m a l a r i a m i t o g e n i n h u m a n m a l a r i a . N a t u r e , 2 5 7 ,5 9 2 .H E D M A N , P . , B R O H U L T , J . , F O R S L U N D , J . , S I R L E A F , V .& B E N G T S S O N , E . ( 1 9 7 9 ) A p o c k e t o f c o n t r o l l e d

m a l a r i a i n a h o l o e n d e m i c r e g i o n o f W e s t A f r i c a .A n n T r o p . M e d . P a r a s i t o l . 7 3 , 3 1 7 .H U N T E R , W.M. & G R E E N W O O D , F . C . ( 1 9 6 2 ) P r e p -a r a t i o n o f 1 3 I I - l a b e l l e d g r o w t h h o r m o n e o f h i g hs p e c i f i c i t y a c t i v i t y . N a t u r e , 1 9 4 , 4 9 5 .L O W E , J . , B I R D , P . , H A R D I E , D . , J E F F E R I S , R . & L I N G ,N . R . ( 1 9 8 2 ) M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s ( M c A b s ) t od e t e r m i n a n t s on human gamma c h a i n s : p r o p e r t i e so f a n t i b o d i e s s h o w i n g s u b c l a s s r e s t r i c t i o n or s u b -c l a s s s p e c i f i c i t y . I m m u n o l o g y , 4 7 , 3 2 9 .M A R T I N E Z - A L O N S O , C . , C o u T r N H o , A . & A U G U S T I N ,A . A . ( 1 9 8 0 ) I m m u n o g l o b u l i n C - g e n e e x p r e s s i o n . I .T h e c o m m i t m e n t t o I g G s u b c l a s s o f s e c r e t o r y c e l l si s d e t e r m i n e d b y t h e q u a l i t y o f t h e n o n s p e c i f i cs t i m u l i . E u r . J . I m m u n o l . 1 0 , 6 9 8 .M O N G I N I , P . K . A . , S T E I N , K . E . & P A U L , W . E . ( 1 9 8 1 )T - c e l l r e g u l a t i o n o f I g G s u b c l a s s a n t i b o d y p r o d u c -t i o n i n response t o T - i n d e p e n d e n t a n t i g e n . J . e x p .M e d . 1 5 3 , 1 .

M O R E L L , A . , S K V A R I L , F . & B A R A N D U N , S . ( 1 9 7 6 )S e r u m c o n c e n t r a t i o n s o f I g G s u b c l a s s e s . C l i n .I m m u n o b i o l . 3 , 3 7 .M O R T I M E R , G . E . & W I D D O W S O N , J . P . ( 1 9 7 9 ) P r e d o m i -nance o f i m m u n o g l o b u l i n G s u b c l a s s 3 a m o n g t h ec o m p l e m e n t f i x i n g a n t i b o d i e s t o s t r e p t o c o c c a l Ma s s o c i a t e d p r o t e i n . C l i n . e x p . I m m u n o l . 3 7 , 2 4 7 .P E R L M A N N , P . & C E R O T T I N I , J . C . ( 1 9 7 9 ) C y t o t o x i cl y m p h o c y t e s . T h e A n t i g e n s , 5 , 1 7 3 .P L A Y F A I R , J . H . L . ( 1 9 8 2 ) I m m u n i t y t o m a l a r i a . B r .M e d . B u l l . 3 8 , 1 5 3 .S A L I M O N O U , L . S . , W I L L I A M S , A . I . O . & O S U N K O Y A ,B . O . ( 1 9 8 2 ) I g G s u b c l a s s l e v e l s i n m a l a r i a - i n f e c t e dN i g e r i a n s . V o x S a n g . 4 2 , 2 4 8 .S P I E G E L B E R G , H . L . ( 1 9 7 4 ) B i o l o g i c a l a c t i v i t i e s o fi m m u n o g l o b u l i n s o f d i f f e r e n t c l a s s e s a n d s u b -c l a s s e s . A d v . I m m u n o l . 1 9 , 2 5 9 .T R O Y E - B L O M B E R G , M . , S J O H O L M , P . E . , P E R L M A N N , H . ,P A T A R R O Y O , M . E . & P E R L M A N N , P . ( 1 9 8 3 ) R e g u l a -t i o n o f t h e i m m u n e r e s p o n s e i n P . f a l c i p a r u mm a l a r i a . I . N o n - s p e c i f i c p r o l i f e r a t i v e r e s p o n s e s i n


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1 4 2 M. W a h i g r e n e t a l .v i t r o a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f l y m p h o c y t e s . C l i n .e x p . I m m u n o l . 5 3 , 3 3 5 .W A H L G R E N , M . , B E R Z I N S , K . & B E R L M A N N , P . ( 1 9 8 3 )C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e h u m o r a l i m m u n e r e s p o n s ei n P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m m a l a r i a . I . E s t i m a t i o n o fa n t i b o d i e s t o P f a l c i p a r u m o r h u m a n e r y t h r o c y t e s

b y m e a n s o f m i c r o E L I S A . C l i n . e x p . I m m u n o l . 5 4 ,1 2 7 .Y O U N T , W . J . , D O R N E R , M . M . , K U N K E L , H . G . &K A B A T , E . A . ( 1 9 6 8 ) S t u d i e s o n h u m a n a n t i b o d i e s .V I . S e l e c t i v e v a r i a t i o n i n s u b g r o u p c o m p o s i t i o na n d g e n e t i c m a r k e r s . J . e x p . M e d . 1 2 7 , 6 3 3 .

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Epi.1983.Wahlgren.clinExpImmunol.characterization of the Humoral Immune Response in Plasmodium Falciparum Malaria II IgG Subclass Levels of Anti-P Falciparum Antibodies in Different