Jg. ~a, Heft 41I~2 LVDWm RAUSC~ und SIEGFRIED I~ITTER $ Erfahrungen mit dem ,,roten SH-Reagens". 1009 1. November 1955

Leberfermentes. lg[an ersieht aus der Abbfldung, dag das Lebefferment bei Beriieksichtigung des ver- sch~edenen Proteineinsatzes etwa 100mal wirksamer ist, als das ttefe~erment. Weiterhin f~llt auf, dab beim Leberferment eine charakteristisehe S~ttigungskurve vorliegt, w/ihrend beim IIefeferment die Reaktions- gesehwindigkeit proportional zur Substratkonzen- tration ansteigt und erst bei sehr hohen Glycerin- aldehydkonzentrationen den Beginn einer S/~ttigung andeutet. Letzferes ist sehr wahrseheinlieh dutch unspezifisehe Hemmung der hohen Substratkonzen- tration vorget~uscht, wie die Auswertung der Kurven nach LI~]~W]~vE~ und BvR~r~6 belegt. Fiir IIefe ergibt sich (Abb. 2) praktisch keine Affinit/it zu Glycerinaldehyd (die Miehaeliskonstante ist grbBer a]s 0,5 Mole/L), w~hrend das Leberferment dureh eine Michaetiskonstante yon 3 × 10 -2 Mol/L. gekenn- zeichnet ist. Die Konstanten sind mit d,l-Glyeerin- a]dehyd bereehnet, da wir keine eindeutige Aussage fiber die sterisehe Spezifit~t des Fermentes maehen k6nnen (s. hierzu auch ~).

Zusammen/assung. 1. Die bisher zur ErldKrung der Beseh]eunigung des Atkoholabbaues dureh Brenz- traubensiiure oder Fructose angenommene Theorie, dab durch Erh6hung der station~ren Pyruvatkonzen- tration in der Leber ein ~rasserstoffacceptor ~fir da.s bei der Alkoholdehydrierung anfallende D P N H zur Verftigung gestellt wiirde, kann nieht auffeeht er- halten werden: naeh T~EORELL, CHANCE und Bo~- ~IC~S~X ist bei der Aikoholdehydrierung nieht die DPNIt-Reoxydat ion an anderen Fermenten ge- sehwindigkeitsbestimmend, sondem die Abdissoziation des D P N H veto Alkohotdehydrase-DPNH-Komplex.

2. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dab die naeh Pyruvat- und Fructosegabe erh6hte statio- n~re Konzentration des Alkoholdehydrase-DPN-Kom- plexes eine besehleunigte Alkoholdehydrierung im Einklang mit den kinetischen Messungen yon T ~ O - ~nLL und CHa~-CE erldi~rt, und dag weiterhin der beim Fructoseabbau anfallende Glycerinaldehyd durch direkte Re~ktion mit dem Alkoholdehydrase-DPNH- Komplex eine solche Besehleunigung bewirken kann.

Literatur. I LELOI~, L. F. , and J. ~. Mv~oz: Biochemic. J. 32, 299 (1938). - - ~ WESTERFIELD, W . W., E. STOTZ and i%. L. BERG: J. of Biol. Chem. 149, 237 (1943). - - ~ STuIr~- ~tVT~, K., u. H. N ~ V ~ R : Ned. Ktin. 1951, 591. - - ~ P~E~- se~E~, A., A. Bm~NsTEr~ und H. ST~v~: Helvet. physioI. Aeta 10, 74 (1952). - - a LEUTIIARDT, F., ]~. TEST.& U. H. P. WOLF: Helvet. chim, Acta 36, 227 {1953). - - ~ WOLF, tt. P., tl. F. LEUTHARDT: IIelvet. chim. Acta 36, 1463 (1953). --- LECTH~gDT, F., u. H. P. WOLF: IIelvet. chim. Acta 37, 1732 (1954). - - 7 WILLI~r~s-As~g, H. G., and J. B±NKs: Arch.

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Abb. 2. Bes~immung der ~[iehaeliskonstante naeh ~INEWEAVER und BUICK xs. Zur Auswertung gelang~en die in Abb. 1 wiedergegebenen Date~ :Ftir Hefe-ADH ergib~ sich als Nichaeliskonstante mit d,l-Glycerinaldeh~.4

~0,5 ~Iol/L. Filr Leber-ADH 3 x 10 -~ 1~ol/L.

of Bioehem. 50, 513 (1954). - - 8 HOLZER, t~., J. HAAN u. S. SO,EIDER: Biochem. Z. 326, 451 (1955). - - 9 T~EO~ELL, H, u. R. BOXmO~SEN: Acta chem. seand. (Copenh.) 5, 1105 (1951). - - THEO~ELL, H., U. B. C~ANCE: Acta chem. scand. (Copenh.) 5, 1127 (1951). --10 BONmC~SEN, R." 4. Colloquium der Ges. fiir Physiolog. Chemic. Berlin: Springer 1953. S. 151. ~ Siehe z. B. ttO~ZER, H.: 4. Colloquium der Ges. ftir Physiolog. Chemie. Berlin: Springer 1953. S. 89, - - ~ THEORELL, H.: 7. Tagg der Ges. ftir Physiolog. Chemie, Kiel, 21. Sept. 1954. --- ~a HOI~ZE1L H., S. Se~tNEIDEt¢ U. K. LtNGE: Angew. Chem. 67, 276 (1955). - - ~ BONNIC~SEg, R.: Aeta chem. se~nd. (Copenh.) 4, 715 (1950). - - 1~ t~£CKER, E.: J. of Biol. Chem. 183, 313 (1950).--~ LI~.wE~w:~, H., and D. BUICK: J. Amer. Chem. See. 56, 658 (1.934).

ERFAHRUNGEN MIT DEM ,,ROTEN SH-REAGENS" ZUR QUANTITATIVEN BESTDIMUNG VON THIOLGRUPPEN.

Von

LUDWIG t~AUSCH u n d SIEGFRIED I~ITTER.

Aus der Hautklinik der Westfiilischen Wilhelmmmiversi~t~t Mfinster (Direk~or: Prof. Dr. P. JORDAN).

Unter den quantitativen Methoden zur Thio]- gem Milieu gelbsten Thiolverbindungen naeh intensiver gruppenbestimmung erwecktdasvonFnEsc~undKvN 1 Misehung beider Fliissigkeiten einen in beiden Phasen in neuerer Zeit angegebene, auf Vorarbeiten yon BEN- unlbsliehen Grenzschiehtniedersehlag. Die Nieder-

2 ~E:rT und YPHANTIS sowie BENlgETT a beruhende Ver- schlagsmenge soil dem vorhandenen SH-Gehalt pro- fahren besonders aueh dermatologisches Interesse, portional sein, da ein Molekiil RF mit einer Stt-Gruppe well es bei chemiseher Spezifit£t theoretiseh auf reagiert. DementsprechendwirddieRF-Konzentrat ion niedermo]ekulare wie proteingebundene SH-Gruppen im AmyIacetat vermindert und die goldbraune RF- anwendbar ist. Wir haben daher Versuche mit dem Lbsung farbsehwi~eher. D~ sie naeh Mischung mit ,,roten SH-geagens", 1-(4-Chtoromercuriphenylazo)- konzentrierter tIC1 tiefrot wird, ist der Farbsehwund naphthoL(2) durchgeffihrt* colorimetrisch gut mel3bar. Eine hohe Farbdichte

Prinzip der Methode: Der rote Farbstoff (RF) entsprichteinergeringen, eineniedrigeFarbdiehte einer bildet aus seiner Lbsung in Amy]acetat mit in w~gri- grogen SH-Menge.

* Fiir die Syn~hese des Farbstoifes sin4 wir ]terrn Doz. Dr. iN. D. I n 4 V e r s u c h e n ( I 0 0 E i n z e l m e s s u n g e n ) m i t V e r - GUNDER)iANbJ, Organ.-Chem. Institut der Universit~t Mlinster, ftir die i~nderung yon Zeit oder Frequenz bei verschiedenen ~berlassung einer Probe des Original-Farbstoffes Herrn Prof. Dr. tL S. Glutathion (GSH)-Konzentrationen ergab sieh, dab B ~ N ~ r , Depk of Anatomy, Univ. Washington, US-& zu Dank ver- pfliehtet, mit 20 min F/illungszeit nur in bestimmten Grenzen

1010 LUDWIG R~vsc~r und SIEGFRIED I~ITTER: Effahrungen mit dem ,,roten SH-Reagens". Klinische Wochenschrif t

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suszukommen ist. Diese Verhgl~nisse lassen sich mit etwas herabgesetzter Frequenz besonders eindrucks- voll darstelien (repri~sentatives Beispiel s. Abb. 1). Das Ausma$ der Fgllungsreakt.ion die (RF 4- Thiol --> Grenzniederschlag) ist demnach bei reinen wgBrigen Sulfhydril-LSsungen, z.B. von GSH, yore Mengenver- hgltnis RF: GSH und der Durchmischungsintensitgt beider Phasen (Kontaktfl/~che der beiden Flfissigkeiten, Schiittelfrequenz und Zeit) a,bhi~ngig. Je mehr sich die GSH-Menge der vorgelegten RF-~enge n~hert,

desto langsamer verl~uft die Reaktion und eine Steigerung der Durch- mischung ~ d zur quan- titativen Bindung nStig.

Da FLESCH und K c ~ t beim ttomogenisieren mit 0,9% NaC1-LSsung besonders niedrige SH- Werte erhMten hatten, untersuchten wir in 4 weiteren Versuchen mit 50 Einzelmessungen den Einflu$ yon NaC1-Zu- si~tzen auf die Fi~llungs- reaktion. Daraus ergab sich, alas weir unter den biologisch zu erwarten- den liegende NaC1-Kon- zentrationen die Fi~llung noch deutlich hemmen und damit zu hSheren Farbdichten (niedrigen Werten) ffihren. F~ir KC1

o 0,% 0,2 ~q ~ ~,o ergab sich prinzipiell das ~ # / / gleiche, bei gemischten

Abb. 1. Einflu$ der Schfi%elzei~ auf Ztls~z6n ein summierter die F~lhmgsreak~ion (Frequenz

:160/min). - - - - - ]~[aximal Effekt. D i e F a r b v e r s t ~ t r - m6gliche Ausf~llung (errechnet). kungsreaktion blieb u n -

beeinfluftL Eine Ver- ringerung dieses Fehlers konnte durch Steigerung der Durchmischung erreicht werden, wie Abb. 2 (zwecks k]arer Darstel]ung des Effektes wiederum mit herabgesetzter Frequenz) zeigL Demnach er-

T~belle 1. Hemmung der JTdiUungsreaktion durch Metaphosphor- sdgure (0,2 mg GSH/Ansatz).

% ~¢[etaphosphors~ure E - - Eo im Ansatz

0 1 2 3 5

10

0,1920 0,2900 0,3510 0,3707 0,3507 0,4200

Maximale Extinktion ohne :F/£llung = 0,5407

scheint die Verbindtichkeit der mit reinen Thiol- lSsungen erhMtenen Eiohkurve fiir die Ablesung der Werte yon Bestimmungen in biologischem Mate- rim fragwiirdig. Bei Untersuohung eiweiBfreier Fil- trate mui~ auBerdem mit ~einer StSrung dutch Ent- eiwei6ungsmitte! gereo~mt werden. Fiir Metaphos- phorsgure zeigt Tabelle 1 ein repr/isentatives Beispiel yon 4 Versuchen mit insgesamt 28 Einzelmessungen.

Entsprechende Ergebnisse erhielten wir mit Sulfosali- cylsi~ure.

Die Farbverstgrkungsreaktion erwies sich Ms weni- get stSrungsempfindlich. Die Verwendung vonGummi- stopfen mui~ vermieden werden. Bei Bestimmungen in Homogen~ten wgre an eine StSrung durch i n LSsung gehende Lipoide zu denken.

Es ist also zu erwartcn, dab bei der ThiolkSrper- bestimmung mit dem RF meist geringere I~%rte vorgetguscht werden diirften. MSglichcrweise lassen sich die Fehlerquellen reduzieren durch relativ geringes SH-Angebot (wodurch die vollstgndige Fifllung er-

0,s

T I

% 'mg%

0 10 20 g# 120 300 rain F~7/unq~ze/f

Abb. 2. Teilweise kompensierender EinfluB der Fifllungszeit auf die dutch ~aCl (Konzentrationsungabe bezogen atff wgBrige Phase) bohinderte Atm- fg]lung (Frequenz 160/rain). - - - - Bei 0,2 mg GSH maximal mSgliche

Ffillung (orrechnet).

leichtert und infolge st~.rkerer Verdiinnung des Aus- gangsmaterials g]eichzeitig der EinfluB yon SMzen und anderen StSrfaktoren vermindert wird) und dutch Steigerung von Fi~llungszeit und Schiittelfrequenz. Um die Verbindlichkeit der Eichkurve zu erhgrten, sind Wiedergewinnungsversuche an biologischem Material notwendig.

Zusammen/assung. Untersuchungen zur Thiol- gruppenbestimmung nach FLESCH und Kv~ t mit 1-(4- CMoromercuriphenylazo)-naphthol-(2) ergaben: Die Fgllungsreaktion, SH 4- Farbstoff, ist hochgradig abhgngig yon der Durchmischungsintensitgt (vor Mlem -con Schfittelfrequenz und -dauer), vom motaren Verh/iltnis der angebotenen SH-~enge zum vorge- legten Farbstoff und vom Vorhandensein eines auch geringen Neutralsalzgehaltes sowie eiweiBfgllenden S~uren. Gepriif~ wurden: NAGS, KC1, Metaphosphor- sgure und Sulfosalicylsgure, deren Zusatz in jedem Fa]le eine deutliche Behinderung der Fgllung bewirkte. Einige Ansatzgunkte ffir eine Modifikation der Methode werden erwghnt.

Ziteratur. i FLESC~, P., ~nd E. Kc~: Proc. Soc. Exper. Biol. ~. Med. 74, 249 (1950). - - ~ ]~E~ETT, H. S, and-D:A. ¥~'~A~TZS : J. Amer. Chem. Soc. 70, 3522 (1948). --3 BEnnETT, H. S. : Anat. Rec. 100, 640 (1948).