TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ETEFON İLE KLORPRİFOS ETİL’ İN TEK VE BİR ARADA

ETKİLERİNİN RAT BAĞIRSAK KASINDA IN VITRO

OLARAK ARAŞTIRILMASI

M. Alp ÇETİNKAYA

FARMAKOLOJİ VE TOKSİKOLOJİ ANABİLİM DALI

DOKTORA TEZİ

DANIŞMAN

Prof. Dr. Emine BAYDAN

2006 – ANKARA

iii

İÇİNDEKİLER

Kabul ve Onay ii

İçindekiler iii

Önsöz v

Simgeler ve Kısaltmalar vi

Şekiller Dizini viii

Çizelgeler Dizini ix

1. GİRİŞ 1

1.1. İnce Bağırsak Metabolizması 5

1.2. İnce Bağırsaklarda Kolinerjik Etkinlik 6

1.3. Etefon 11

1.4. Klorprifos 14

1.5. Kombinasyon Çalışmaları 18

1.6. Etki Gücü ve Etkililiğin Saptanması 26

1.7. Çalışmanın Amacı 27

2. GEREÇ VE YÖNTEM 29

2.1. Araç ve Gereçler 29

2.1.1. Deney Hayvanları 29

2.1.2. Deney Araçları 29

2.1.3. Kimyasal Maddeler 30

2.1.4. Tyrode Çözeltisinin Bileşimi 30

2.2. Yöntem 31

2.3. Protokoller 32

2.3.1. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Asetilkolinin Etkisinin

Araştırılması

32

2.3.2. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefonun Etkisinin

Tek Başına Araştırılması

32

2.3.3. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefonun Etkisinin

Asetilkolin ile Birlikte Araştırılması

32

iv

2.3.4. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Klorprifosun Etkisinin

Tek Başına Araştırılması

33

2.3.5. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Klorprifosun Etkisinin

Asetilkolin ile Birlikte Araştırılması

33

2.3.6. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefon ve Klorprifosun

Bir Aradaki Etkilerinin Asetilkolin ile Birlikte Araştırılması

34

2.3.7. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Yapılan Diğer Denemeler 34

2.3.7.1. Bağırsak Ortamının Enzimatik Etkinliğinin (AKE) Belirlenmesi 34

2.3.7.2. Çözücünün Dokular Üzerine Etkinliğinin Belirlenmesi 34

2.4. İstatistiksel Analiz 35

3. BULGULAR 36

3.1. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Asetilkolinin Etkisi 36

3.2. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefonun Tek Başına Etkisi 38

3.3. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefonun Asetilkolin ile

Birlikte Etkisi

39

3.4. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Klorprifosun Tek Başına Etkisi 43

3.5. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Klorprifosun Asetilkolin ile

Birlikte Etkisi

44

3.6. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefon ve Klorprifosun

Bir Aradaki Etkileri

48

3.7. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Yapılan Diğer Denemelerin

Bulguları

52

3.7.1. Bağırsak Ortamının Enzimatik Etkinliği (AKE) 52

3.7.2. Çözücünün Dokular Üzerine Etkinliği 55

4. TARTIŞMA 56

5. SONUÇ VE ÖNERİLER 63

ÖZET 65

SUMMARY 66

KAYNAKLAR 67

ÖZGEÇMİŞ 72

v

ÖNSÖZ Giderek artan insan sayısına bağlı olarak yaşamsal talepler de artmaktadır. Bu taleplerin başında canlıların yaşamı için zaruri olan gıdaların kalite ve miktar yönünden iyileştirilmesi gelmektedir. Ürünlerin albenisini, dayanıklılığını, ve miktarını artırmak amacıyla geçmişten günümüze kadar değişik kimyasal maddelerin ve metodların kullanımı söz konusu olmuştur ve halen de bu amaçla değişik kimyasal maddelerin devreye sokulması söz konusu olmaktadır. İyi niyetle, fakat bilinçsizce, bir arada yapılan bu uygulamaların çoğu sağlık sakıncalarını da beraberinde getirir. Aslında, söz konusu bu maddeler tüketime sunulmadan önce çok yönlü testlerden geçirilir. Ancak, spesifik bir uygulama şekli olmadıktan sonra, bu maddelerin bir aradaki etkileşimleri üzerinde testler yapılmaz. Bununla birlikte bu konu pek çok araştırmacı ve hatta bilinçli tüketicinin her zaman ilgisini çekmiştir. Yapılan az sayıdaki konuya yönelik araştırmalar da eş zamanlı uygulanan kimyasal maddelerin istenmeyen etkilere neden olabileceğini göstermektedir.

Yapılan bu araştırmada, Türkiye’ de ve yurt dışında geniş kullanım alanı bulan ve aynı mekanizmayla etkilerini gösteren organik fosforlu pestisidlerden klorprifos ile bitki gelişim düzenleyicilerden etefonun bir arada kullanılmasıyla yapabilecekleri etkilerin in vitro koşullarda rat ince bağırsağı üzerinde yapılan testlerle ortaya konması amaçlanmıştır.

Bu çalışmada yardım, destek ve ilgilerini esirgemeyen, başta danışman hocam Prof. Dr. Emine Baydan olmak üzere, tez izleme komitemde bulunan hocalarım Prof. Dr. Ayhan Filazi ve Prof. Dr. İlksin Pişkin’ e, bilgi ve önerileriyle çalışmalarıma yardımcı olan Farmakoloji ve Toksikoloji Anabilim dalı başkanı Prof. Dr. Sezai Kaya’ ya, Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji bölümü öğretim üyesi Doç. Dr. Pelin Kelicen’ e ve ayrıca laboratuar çalışmalarım sırasında bana yardımcı olan başta Araş. Gör. Sinan İnce olmak üzere tüm araştırma görevlisi arkadaşlarım ile anabilim dalı görevlilerine teşekkür ederim. Çalışmalarım sırasında sabır ve özverilerini esirgemeyen aileme de teşekkürü bir borç bilirim.

vi

SİMGELER VE KISALTMALAR

AK Asetilkolin

AKE Asetilkolinesteraz

ATP Adenozin Trifosfat

BGD Bitki Gelişim Düzenleyicisi

BKE Bütirilkolinesteraz

CAR Karbaril

CD [3H]cis-dioksolan

Cmax Maksimum derişim

CPF Klorprifos

CYP Sitokrom P450

DZN Diazinon

EAA Eğrinin Altında Kalan Alan

EC Etkili derişim

Emax Maksimum Etkililik

ESS Enterik Sinir Sistemi

ETF Etefon

IC İnhibe Edici Derişim

IMHP 2-isopropyl-4-methyl-6-hydroxypyrimidine

KAE Karboksilesteraz

Kd Reseptör Çözünme Sabitesi

KE Kolinesteraz

LD Öldürücü Doz

MH Maleik Hidrazid

MPS Metil-paratiyon

MSS Merkezi Sinir Sistemi

NO Nitrik Oksit

NOAEL Olumsuz Yan Etki Görülmeyen Düzey

OF Organik Fosforlu

vii

pD2 EC50’ nin negatif logaritması

p-F-HHSiD p-floro hekzohidroksiladifenidol

PON1 Paraoksonaz

QNB Kinuklidinil benzilat

RfD Referans Doz

SEM Standart Hata

TCP (3,5,6-trikloro-2-pridinol)

THA Tacrine

viii

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 1.1 Etefonun kimyasal yapısı (C2H6ClO3P) 11

Şekil 1.2 Klorprifosun kimyasal yapısı (C9H11Cl3NO3PS) 14

Şekil 1.3 Klorprifosun metabolizması 16

Şekil 3.1 Rat duodenumunda AK kümülatif derişim-cevapları 37

Şekil 3.2 Rat ileumunda AK kümülatif derişim-cevapları 37

Şekil 3.3 Rat duodenumu ve ileumunda kümülatif ETF uygulama

cevapları

38

Şekil 3.4 Rat duodenumunda ETF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 39

Şekil 3.5 Rat ileumunda ETF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 40

Şekil 3.6 Rat duodenumunda ETF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 41

Şekil 3.7 Rat ileumunda ETF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 42

Şekil 3.8 Rat duodenumu ve ileumunda kümülatif CPF uygulama

cevapları

43

Şekil 3.9 Rat duodenumunda CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 44

Şekil 3.10 Rat ileumunda CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 45

Şekil 3.11 Rat duodenumunda CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 46

Şekil 3.12 Rat ileumunda CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 47

Şekil 3.13 Rat duodenumunda ETF+CPF (10-10 M) inkübasyonunun

etkisi

48

Şekil 3.14 Rat ileumunda ETF+CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 49

Şekil 3.15 Rat duodenumunda ETF+CPF (10-7 M) inkübasyonunun

etkisi

50

Şekil 3.16 Rat ileumunda ETF+CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 51

Şekil 3.17 Rat duodenumunda 10-7 M fizostigminin yanıtı 53

Şekil 3.18 Rat ileumunda 10-7 M fizostigminin yanıtı 53

Şekil 3.19 Rat duodenumunda 3x10-7 M fizostigminin yanıtı 54

Şekil 3.20 Rat ileumunda 3x10-7 M fizostigminin yanıtı 54

ix

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 3.1 Rat duodenumu ve ileumunda AK’ in kümülatif

uygulanmasında en yüksek kasılmayı veren değerlerin mg

olarak ortalaması

36

Çizelge 3.2 Rat duodenumu ve ileumunda AK derişim-cevap eğrilerinin

Emax ve pD2 değerleri

36

Çizelge 3.3 Rat duodenumu ve ileumunda tek başına ETF’ nin kastırıcı

etkisi

38

Çizelge 3.4 Rat duodenumunda ETF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 39

Çizelge 3.5 Rat ileumunda ETF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 40

Çizelge 3.6 Rat duodenumunda ETF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 41

Çizelge 3.7 Rat ileumunda ETF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 42

Çizelge 3.8 Rat duodenumu ve ileumunda tek başına CPF’ nin kastırıcı

etkisi

43

Çizelge 3.9 Rat duodenumunda CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 44

Çizelge 3.10 Rat ileumunda CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 45

Çizelge 3.11 Rat duodenumunda CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 46

Çizelge 3.12 Rat ileumunda CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 47

Çizelge 3.13 Rat duodenumunda ETF+CPF (10-10 M) inkübasyonunun

etkisi

48

Çizelge 3.14 Rat ileumunda ETF+CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 49

Çizelge 3.15 Rat duodenumunda ETF+CPF (10-7 M) inkübasyonunun

etkisi

50

Çizelge 3.16 Rat ileumunda ETF+CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 51

Çizelge 3.17 Rat bağırsağında asetonun AK üzerine etkisi 55

1

1. GİRİŞ

Pestisid terimi, pest mücadelesi veya kontrolü için kullanılan bir grup kimyasal

bileşiği kapsamaktadır. Pestisidler etkilerinin hedefleri esas alınarak insektisidler,

fungisidler, herbisidler, rodentisidler ve mollusküsidler gibi çeşitli sınıflarda

gruplandırılır. Pestisidlerin ekonomik ve halk sağlığı yararları vardır. Vektör

kaynaklı hastalıkların kontrolü, tarımsal üretimi artırmak ve pestlerin kontrolü için

yıllardır kullanılmaktadır. Bireyler ya mesleki olarak (pestisid imalathanesinde veya

ticari pestisid uygulamalarında) ya da çevresel olarak (pest mücadelesi yapılan

meyve ve sebzeler gibi gıdalardan) pestisidlere maruz kalabilirler. Bireyler ayrıca

konutlarında da pestisidlere maruz kalabilirler (Williams ve ark., 2000).

Pestisidler, belirli “pest” türlerinde toksisite göstermeleri için çevreye bilinçli olarak

salınan tek çevre kirleticileridir. Maalesef, seçiciliğin tam olmaması nedeniyle

sıklıkla insanlarda ve diğer hedef olmayan türlerde zehirlenme problemlerine yol

açarlar. Organik Fosforlu (OF) pestisidler bugün dünyada kullanılan insektisidler

içinde en önemli kimyasal sınıftır (Howard ve Pope, 2002). OF bileşikler en sık

kullanılan insektisidler olarak, pire tasmalarında, karınca tuzaklarında, sinek

kâğıtlarında, ev ve endüstriyel insektisid ürünlerinde bulunurlar. Bu bileşiklerle ilgili

zehirlenmeler çeşitli nedenlere bağlı olarak gelişebilir (Tush ve Anstead, 1997).

Lipofilik doğalarından dolayı OF bileşikler sindirim, solunum ve dermal yollarla çok

kolay şekilde emilebilir (Williams ve ark., 2000). OF bileşiklere en yaygın maruziyet

yolu deri ve ağız yoludur (Tush ve Anstead, 1997).

OF bileşikler, insanlarda toksik etkilerini, asetilkolinin (AK) sinaps aralığındaki

etkisinin devamlılığını ve postsinaptik nöronun sürekli depolarizasyonunu sağlayan

asetilkolinesteraz (AKE) enziminin dönüşümsüz baskılanmasına neden olarak

gösterirler (Tush ve Anstead, 1997; Howard ve Pope, 2002). Enzim baskılanmasına

bağlı olarak aşırı AK birikimi, post-sinaptik kolinerjik reseptörlerin aşırı

uyarılmasına neden olur ve buna bağlı olarak salivasyon, lakrimasyon, ürinasyon,

defekasyon, bradikardi, miozis, bulantı, solunum fonksiyon bozukluğu gibi kolinerjik

2

zehirlenme belirtileri gelişir (Mortensen ve ark., 1998; Karanth ve Pope, 2000;

Howard ve Pope, 2002; Karanth ve ark., 2004).

OF insektisidler geniş şekilde akut toksisite düzeyi gösterirler ve hem insanlar hem

de hayvanlar için kazara akut ve kronik maruziyetlerde ciddi tehlikeler ortaya

çıkarırlar. Gençler, birçok OF insektisidin akut toksisitesine yetişkinlerden çok daha

fazla duyarlıdırlar ve gelişmekte olan sinir sistemleri sebebiyle büyük risk altında

bulunabilirler. İnsektisid ile kontamine giyecekler, yatak çarşafları ve oyuncaklar

gibi nesnelerden kaynaklanan ciddi zehirlenme olguları, çocuklarda bildirilmektedir.

Gençlerin yetişkinlerden OF toksisitesine çok daha duyarlı olması gerçeği, büyük

endişe kaynağıdır (Atterberry ve ark., 1997).

Yaygın şekilde uygulanan birçok OF insektisid, zayıf antikolinesteraz doğasında olan

fosforotiyonatlardır (Atterberry ve ark., 1997). OF insektisidlerin öncelikli etki şekli

ve akut şekilde hayatı tehdit eden etkisi, etkin okson metabolitleri tarafından AKE’

nin inhibisyonunu takiben kolinerjik sinapslarda asetilkolin birikimi ile bir dizi

nörotoksik etki oluşturmasıdır (Kousba ve ark., 2003). Oksonlar ana bileşikten

yaklaşık 3 kat fazla daha güçlü inhibitörlerdir (Atterberry ve ark., 1997; Kousba ve

ark., 2003). Oksonlar sadece hedef noktalarda (yani sinapslar ve nöromüsküler

bağlantılar) AKE’ nin güçlü inhibitörleri değil ayrıca aliesterazlar veya hedef

olmayan dokularda kolinesterazlar gibi diğer serin esterazların da güçlü

inhibitörleridir. Aliesterazlar (karboksilesterazlar), bilinmeyen fizyolojik fonksiyonu

olan serin esterazlardır ki, OF zehirlenmeleri esnasında koruyucu bir rol

üstlenebilirler. Bu hedef olmayan esterazların fosforilasyonu stoikiometrik olarak bir

kısım oksonu yok eder ve oksonun o kısmının hedef AKE’ yi inhibe etmesinden

korur (Atterberry ve ark., 1997).

OF pestisidler sıklıkla bir diğeriyle kombinasyon halinde ve/veya yardımcı

maddelerle kullanılırlar. Çoğunlukla kombinasyonlar arasında sinerjizma

oluşmaktadır (Axelrad ve ark., 2002). Pest mücadelesinde, birçok insektisid yaygın

şekilde kullanıldığından, çok sayıda OF bileşiğe eş zamanlı olarak maruz kalma

3

durumu özellikle tarım ve halk sağlığı çalışanları arasında yüksektir. Ayrıca, gıda ve

diğer kaynaklardan, bu tip insektisidlere ayrı ayrı ancak yakın zamanlı maruziyetler

olabilir. Her ne kadar tek başlarına OF insektisidlerin sağlığa zararları nispeten iyi

tanımlanmış olsa da, birçok OF insektisidin bir aradaki toksisiteleri üzerine az bilgi

vardır (Karanth ve ark., 2004).

Dünya çapında, bir yılda yaklaşık 3 milyon OF insektisid zehirlenme olayı olmakta,

bunların da hemen hemen 200.000’ i ölümle sonuçlanmaktadır. Bunlara ilaveten,

insanlar gıdalardaki kalıntıların tüketilmesiyle ve su kaynaklarının kontamine

olmasıyla, ayrıca solunum ve deri teması yoluyla düşük düzeylerde OF insektisidlere

maruz kalmaktadır. Önemli şekilde akut toksisite olması potansiyeline göre, OF

insektisid maruziyetini doğru bir biçimde ölçme gereksinimi vardır (Kousba ve ark.,

2003).

Gıdaların güvenliğinde pestisidlerle bulaşma konusunda halkın kaygısı, pestisidlerin

ruhsatlandırmasında öncelikli yönlendirici kuvvetlerden biri olmaktadır. Ham veya

işlenmiş tarımsal ürünler üzerinde bulunmasına izin verilen en yüksek yasal pestisid

kalıntı miktarı yani tolerans, tek başına sağlık konusunda temel oluşturmamaktadır.

İnsanların, besinsel maruziyetten ve tüm besinsel olmayan kaynaklardan pestisidlere

bir arada toplam maruz kalma riski ve insan sağlığını korumada, besinlerdeki

toleransların yeterliliğine karar vermek için benzer etki şekline sahip diğer

pestisidlerden kümülatif toksik etki potansiyeli de belirtilmemektedir. Pestisidlerin

etkileriyle ilgili halkın endişesi, bazı pestisidlerin hayvanlarda üreme

endokrinolojisini bozduğu ve insanlar için de benzer sonuçları olabileceğini gösteren

çalışmalarla şiddetlenmektedir. Bunlara ilaveten, bebekler ve çocuklar gibi

muhtemelen duyarlı alt popülasyonların gıdalar yoluyla pestisidlere maruziyet

potansiyeli ile ilgili endişeler ifade edilmektedir (Cochran, 2002).

Etefon, tarımsal ürünlerde hasat öncesi ve sonrası olgunlaşmayı hızlandırmada,

çiçeklenmeyi başlatmada ve diğer bitki cevaplarının oluşturulmasında kullanılan bir

bitki gelişim düzenleyicisidir (BGD) ve etkisini etilen gazını salgılatarak gösterir

4

(Segall ve ark., 1991; U.S. EPA., 1995; Tomlin, 1997; Haux ve ark., 2000). Etefon

1965 yılında keşfedilmiş, 1973 yılında bitki gelişim düzenleyici olarak ticari şekilde

piyasaya sunulmuştur. Etefon birçok meyve, sebze, tahıl ürünleri ile peyzaj ve sera

bitkilerinde kullanılmak üzere ruhsatlandırılmaktadır. Etefon; Ethrel, Florel,

Flordimex gibi yaygın ticari adlarıyla tanınmaktadır (U.S. EPA., 1995). Etefon, bir

OF bileşik olarak her ne kadar kolinerjik nitelikte zehirlenme belirtilerine neden

olmadığı ifade edilse de etki mekanizması yönünden diğerleriyle aynı yolu

kullanmaktadır (Haux ve ark., 2002).

Klorprifos, geniş spektrumlu klorlu bir OF insektisid ve akarisiddir. Birçok besin ve

yem bitkisinde böcekleri ve akarları kontrol altına almak için ilk olarak 1965 yılında

ruhsatlandırılmıştır (Smegal, 2000). Çeşitli tarımsal besinler, süs bitkileri, seralar,

kapalı alan pest kontrol ürünleri, karınca kontrolü, sivrisinek mücadelesi ve pet

tasmaları kullanım alanını oluşturur (Nostrandt et al., 1997; Smegal, 2000; Abu-Qare

et al., 2001). Dow AgroSciences, klorprifosun 1998 yılı kentsel kullanımının %70’

inin karınca mücadelesini içerdiğini belirtmektedir (Smegal, 2000). Klorprifos;

Dursban, Lorsban, Empire, Polaris, Master gibi yaygın ticari isimleri ile

tanınmaktadır (U.S. EPA., 2002).

Klorprifos, AK adlı nörotransmitterin yıkımından sorumlu enzim olan AKE’ ın

dönüşümsüz inhibisyonu yoluyla akut toksisiteye yol açar (Chanda ve ark., 1997).

Bu AKE inhibisyonunu metabolitlerinden biri olan klorprifos-okson yoluyla yapar.

Klorprifos en sık kullanılan pestisidlerdendir ve suda ve besinlerde kirletici olarak

bulunabilir (Cook ve Shenoy, 2003).

5

1.1. İnce Bağırsak Metabolizması

Bir kimyasalın veya bir ilacın ağızdan emilimi hem bağırsak hem de karaciğer

metabolizması ile değiştirilebilir. Her ne kadar, bağırsakların kan akışı ve doku

hacmi karaciğerden biraz daha düşükse de, yaygın mikrovillus yapısı, emilim için

çok ideal olan geniş bir yüzey alanı sağlar (Poet ve ark., 2003).

Hem kemirgen hem de insan bağırsak epitel hücreleri (enterositler) geniş alanda

ilaçları ve ksenobiyotikleri metabolize etme yeteneği olan enzimler içerdiğinden,

yakın zamanda yapılan çok sayıda klinik-öncesi ve klinik çalışma, ilk-geçiş

metabolizmasında bağırsakların önemini göstermiştir. İlaçların veya kimyasalların

oral biyoyararlanımı, bağırsak emilimi ve onunla ilişkili ilk-geçiş metabolizmasının

ölçüsünün bir fonksiyonudur. Gıdalardaki düşük düzeydeki pestisid kalıntılarının

alınması potansiyelinin ışığında, bağırsak ve karaciğer metabolizmasının rolünü daha

iyi anlamak, özellikle risklerin değerlendirilmesi için gereklidir. OF insektisidlerin

toksik gücü, hedef bölgeye ulaşan doz ve detoksifikasyona karşı biyoaktivasyon

oranları arasındaki dengeye bağlıdır (Poet ve ark., 2003).

Bağırsak enterositlerinden köken alan mikrozomlar, hem desülfürasyon hem de

dearilasyon reaksiyonlarını içeren benzer bir sitokrom P450 (CYP)-aracılı

metabolizma profili göstermektedir. Her ne kadar, vücuttaki birçok dokunun biraz

CYP aktivitesine sahip olduğu bilinse de, baskın kanı, karaciğerin CYP

metabolizması ile ilişkili öncelikli organ olduğu ve mide-bağırsak kanalından emilen

kimyasalların ve ilaçların ilk-geçiş metabolizmasından sorumlu olduğudur. Son

yapılan çalışmalarda da açıktır ki, ince bağırsaklardaki enterositler de CYP metabolik

kapasitesine sahiptir ve bazı enzimler (3A4 gibi) söz konusu olduğunda enterositler

içindeki derişim karaciğer ile kıyaslanabilir düzeydedir. OF bileşiklerin kendi okson

metabolitlerine metabolize olmasına muhtemelen CYP3A4, 2B6 (insanda), 2B1/2

(ratta) ve 2D6 (insanda) aracılık eder. Her ne kadar insan bağırsağındaki ve

karaciğerindeki enzim profili farklı olsa da, hem karaciğerde hem de ince

bağırsaklardaki yaygın CYP, 3A4’ dür (Poet ve ark., 2003).

6

1.2. İnce Bağırsaklarda Kolinerjik Etkinlik

Mide-bağırsak motor aktivitesinin koordinasyonu ve ayarlanması, iki karmaşık

sinirsel girdinin etkileşimine bağlıdır: bağırsak duvarının içinde tamamen temel

oluşturan enterik sinir sistemi (ESS) ve dıştan sinirler yoluyla (vagal, sempatik)

bağırsağa etkilerini yollayan merkezi sinir sistemi (MSS). MSS ve ESS arasındaki

etkileşim, stres, yemek ve davranış gibi mide-bağırsak cevaplarında önemlidir. Vagal

motor yolaklar, başlıca üst mide-bağırsak kanalı, distal kolon ve rektumu düzenler.

İnce bağırsaklarda, vagal girdiler myenterik sinirlere gönderilir. Bağırsak sempatik

sinir sistemi, bağırsağa giren post-gangliyonik lifleri olan pre-vertebral

gangliyonlarda bulunan sinir hücre gövdesinden oluşur (Seiler ve ark., 2005). Mide-

bağırsak kanalında besinlerin karıştırılması, itilmesi ve emilmesi işlemleri lokal

olarak periferik sinir sisteminin kısıtlı bir parçası olan enterik sinir sistemi yoluyla

kontrol edilmektedir (Brunton ve ark., 2006).

Mide-bağırsak kanalı için intrinsik olan iki büyük sinir lifi ağı vardır: dış longitudinal

ve orta dairesel kas katmanları arasında myenterik pleksus (Auerbach pleksusu) ve

orta dairesel katman ve mukoza arasında submukozal pleksus (Meissner pleksusu)

(Ganong, 2003). Myenterik pleksus, mide-bağırsak düz kasının kasılmasında ve

gevşemesinde önemli bir rol oynarken, submukozal pleksus, mide-bağırsak epitelinin

salgısal ve absorbtif fonksiyonuna, yerel kan akışı ve nöroimmun etkinliklere

dahildir (Brunton ve ark., 2006). ESS, mide-bağırsak fonksiyonunun düzenlenmesi

ile ilgili olan MSS’ nin yer değiştirmiş bir kısmı olarak görülmektedir. MSS’ ye

parasempatik ve sempatik lifler tarafından bağlanır ancak bu bağlantılar olmadan da

otonom olarak görev yapabilir (Ganong, 2003). AK, ESS’ de en önemli

nörotransmitterdir (Davis ve ark., 1998). Mide-bağırsak kanalının kas katmanları

ikili olarak, hücre gövdeleri bağırsak duvarında bulunan uyarıcı ve inhibe edici

motor nöronlar tarafından innerve edilir. AK, ESS’ de parasempatik sinirlerin

transmitteri olmasına ilaveten, yukarı çıkan intramural yolaklardaki nikotinik AK

reseptörlerine de etki eden öncelikli uyarıcı transmitterdir. Bununla birlikte,

7

kolinerjik sinir iletiminin farmakolojik olarak engellenmesi tamamen uyarıcı iletimi

ortadan kaldırmaz çünkü P maddesi ve nörokinin A gibi taşikinin ko-transmitterler

AK ile birlikte salınır ve uyarıcı cevaba katkıda bulunur. Her ne kadar, aşağı inen

motor yolaklarda AK önemli rol oynayabilse de, bu tip yolaklardaki diğer önemli

uyarıcı nörotransmitter P2X pürin reseptörleri yoluyla etkiyen ATP’ dir (Brunton ve

ark., 2006). Rat ince bağırsaklarındaki muskarinik reseptörler başlıca submukozal

nöronlarda bulunan M1 muskarinik reseptörler ve enterositlerde bulunan M3

muskarinik reseptörlerdir. M3 reseptörler çoğu düz kas tipinde kasılmalara aracılık

eder (Becerra ve ark., 2001).

AK, mide-bağırsak kanalındaki iyi bilinen bir nörotransmitterdir ve AK tarafından

muskarinik kolinoseptörlerin aktivasyonu bağırsak ve kolon kontraksiyonlarının

ortaya çıkmasında önemlidir (Tezuka ve ark., 2004). İnce bağırsaklarda, intra-mural

kolinerjik sinirlerden salgılanan AK, nikotinik kolinerjik reseptörlerde enterik

sinirlerin uyarılmasını sağlama ve muskarinik kolinerjik reseptörlerde ince bağırsak

kaslarının kasılmasını sağlama görevi yapar. Böylece, ince bağırsakların AK

tarafından düzenlenen kontraktil fonksiyonu, büyük oranda enterik sinirlerin yapısal

ve fonksiyonel bütünlüğüne bağlıdır (Taha ve ark., 2002).

Asetilkolin (AK), kolinin asetil esteridir. Büyük oranda küçük sinaptik veziküllerde,

yüksek derişimlerde AK salgılayan nöronların terminal uçlarında bulunur. AK’ nin

sentez ve yıkımında sırasıyla kolin asetiltransferaz ve asetilkolinesteraz rol oynar

(Brunton ve ark., 2006). Kolinerjik nöronlar, sentetik enzim kolin asetiltransferaz

aracılığıyla kolin ve kofaktör asetil koenzim A’ dan asetilkolin sentezler (Pope ve

ark., 2005). Kolin asetiltransferaz, AK’ nin sentezindeki ilk basamağı (asetil koenzim

A ile kolinin asetilasyonu) katalizler. Kolinden sentezlendikten sonra, AK öncelikli

olarak sinir sonlarındaki depo veziküllerine alınır (Ganong, 2003; Brunton ve ark.,

2006). Kolinerjik nöronlara bir nakledici vasıtasıyla kolinin etkin bir alımı vardır.

Kolin ayrıca nöronlarda da sentezlenir. Asetat, indirgenmiş koenzim A ile asetat

gruplarının kombinasyonu vasıtasıyla etkinleştirilir (Ganong, 2003). AK molekülleri,

veziküler asetilkolin taşıyıcıları ile sinaptik veziküllere paketlenmiştir. Terminal

depolarizasyonda, sinaptik veziküller plazma membranı ile birleşir ve sinaptik

8

boşluğa AK salgılar (Pope ve ark., 2005). Veziküler taşıyıcı AK’ nin veziküllere

alınmasını sağlar, bu işlem doyurulabilir ve ATP-az’ a bağımlıdır. Aksiyon

potansiyeli motor sinir sonuna ulaştığında, senkronize şekilde 100 veya daha fazla

vezikülden AK ekzositoz yoluyla salınır (Brunton ve ark., 2006). Normal şartlar

altında, AKE hızlı ve etkili bir şekilde AK’ yi hidrolize eder. İnaktivasyondan önce,

AK molekülü, ya postsinaptik hücre zarı boyunca iyon akışını değiştirerek ya da

hücre içi ikinci mesajcıları üreterek hücresel fonksiyonu değiştirmek üzere

postsinaptik kolinerjik reseptörlerle etkileşir (Pope ve ark., 2005).

AK’ nin motor sistemde ve diğer nöronal sinapslarda nörotransmitter olarak görev

yapabilmesi için, sinapsın cevap özelliklerine göre belirlenen zaman aralığında

ortamdan alınması veya etkisizleştirilmesi gerekmektedir (Brunton ve ark., 2006).

Repolarizasyonun oluşması için sinapsdan uzaklaştırma işlemi, AK’ nin kolin ve

asetata hidrolizi yoluyla gerçekleşir, reaksiyon AKE enzimi tarafından katalizlenir.

Bu enzim ayrıca gerçek veya spesifik kolinesteraz olarak da adlandırılır. Afinitesi

çok büyük ölçüde AK için olsa da, diğer kolin esterlerini de hidrolize eder (Ganong,

2003).

Vücutta çok farklı çeşitte esteraz mevcuttur (Ganong, 2003). Hayvan

kolinesterazları, kolinerjik ve kolinerjik olmayan dokularda, ayrıca plazmada ve

diğer vücut sıvılarında yaygın olarak bulunan enzimlerdir. Substrat

özgünlüklerindeki, aşırı substrattaki davranışlarındaki ve inhibitörlerden kolay

etkilenmelerindeki farklılıklara göre iki sınıfa ayrılır: Asetilkolinesteraz veya “gerçek

kolinesteraz” (AKE) ve bütirilkolinesteraz (BKE). BKE, psödokolinesteraz, spesifik

olmayan kolinesteraz veya basit kolinesteraz olarak da bilinir. AKE asetilkolini diğer

kolinesterazlardan daha hızlı hidrolize eder ve bütirilkolin üzerinde az çok etkindir.

Bunun aksine, BKE ayrıcalıklı olarak bütirilkoline etkir ama asetilkolini de hidrolize

eder. Aşırı substrat ile AKE’ nin baskılanması, onu BKE’ den ayıran anahtar

özelliklerden biridir. BKE, substrat fazlalığında substrat aktivasyonu gösterir. Doku

dağılımları da birbirinden farklıdır: AKE’ nin beyinde, kasta ve alyuvar zarında bol

miktarda bulunduğu bilinirken, BKE karaciğer, bağırsak, kalp, böbrek ve akciğerde

yüksek aktiviteye sahiptir. İnsan, at, fare gibi birçok tür plazmalarında yüksek BKE

9

aktivitesi gösterirken, rat, plazmasında BKE’ den çok AKE aktivitesine sahiptir.

Serum BKE karaciğerde sentezlenir ve plazmaya salgılanır (Çokuğraş, 2003).

Her ne kadar halen gerçek substratlar bilinmiyorsa da, BKE, hidrofobik ve hidrofilik

karboksilik veya fosforik asit esteri içeren bileşikleri hidrolize edebilir. AK bağlanma

noktalarını hedef alan zehirli bileşiklere bireysel maruziyet olduğunda, toksikolojik

ve farmakolojik önemi açığa çıkar. AKE fonksiyonunun kaybı, kas felci, nöbetler ve

belki asfeksi sonucu ölüme sebep olur. Organofosfat ve karbamat esterleri, pestisid,

insektisid, kimyasal savaş ajanı olarak ve glokom, parazit enfestasyonu, Alzheimer

hastalığı gibi tıbbi bozuklukların tedavisinde ilaç olarak kullanılır. Bu bileşikler hem

AKE hem de BKE’ nin güçlü inhibitörleridir. BKE, antikolinesteraz bileşiklerinin

endojen bir temizleyicisi olarak düşünülebilir. Fizyolojik olarak önemli hedef

noktalarda AKE’ ye ulaşmalarından önce, BKE onları detoksifiye eder (Çokuğraş,

2003).

AK, AKE enzimi tarafından hidrolize edilmesi yanında, hidrolizinde ayrıca BKE’

nin de etkisi olduğu belirtilmektedir. AKE tüm kolinerjik sinapslarda ve BKE

öncelikli olarak kalp dokusunda, düz kaslarda ve plazmada bulunur (Adler ve ark.,

1991). Omurgalılarda, başlıca enterositlerin oluşturduğu bağırsakların mukozal epitel

tabakası, kolinesteraz aktivitesi gösterir. Bu aktiviteden sorumlu enzim ya

tavşanlarda ve kedilerde olduğu gibi asetilkolinesterazdır ya da sığırlarda,

domuzlarda, koyunlarda, ratlarda, farelerde ve kanatlılarda olduğu gibi

bütirilkolinesterazdır. İnsanlarda her iki enzim de bulunur. Duodenumun distal

kısımları BKE açısından yüksek aktiviteye sahiptir (L'Hermite ve ark., 1996). Çoğu

dokuda BKE, toplam kolinesteraz aktivitesinin % 10’ undan az bir önem teşkil eder.

Omurgalı düz kasında ise BKE, toplam kolinesteraz bölümünün kayda değer kısmını

oluşturur (Adler ve ark., 1991). Bununla birlikte, BKE’ nin AKE’ ye göre AK’ ye

yönelik çok daha az bir afinitesi vardır (Adler ve ark., 1991; Ohrui ve ark., 1991).

AK reseptörleri farmakolojik özelliklerine göre iki gruba ayrılır: muskarinik ve

nikotinik kolinerjik reseptörler (Ganong, 2003). Bilindiği gibi, hem kolinerjik hem de

10

adrenerjik sinir sonları otoreseptörler ve heteroreseptörler içerir. AK salınımı bu

sebeple, M2 ve M4 otoreseptörler üzerine kendisi etki gösteren AK de dahil

nöromedyatörler ve diğer transmitterler veya yerel olarak dokularda üretilen

maddeler (örneğin NO) tarafından karışık bir düzenlemeye tabidir. M2 ve M4

otoreseptörlerin etkinleştirilmesini takiben AK salınımının AK-aracılı

inhibisyonunun, fizyolojik bir negatif-feedback kontrol mekanizması olduğu

düşünülmektedir. Muskarinik otoreseptörler ve heteroreseptörler ayrıca hem

agonsitler hem de antagonistler için ilaç hedefi görevi görürler (Brunton ve ark.,

2006).

Kolinesteraz inhibitörleri önemli sayıda AKE molekülüne bağlandığında, AK’ nin

etkili şekilde yıkımlanması önlenir ve transmitter molekülleri sinapsda birikir. Artan

sinaptik AK düzeyleri, postsinaptik hücrelerdeki kolinerjik reseptörlerin sürekli

uyarılmasına ve daha sonra kolinerjik reseptör aracılı uyarım yolaklarının yani hücre

içi cAMP düzeylerinin değişimine sebep olur. Bu hücresel değişiklikler,

doku/organizma düzeyinde fonksiyonel değişikliklere sebep olur (Pope ve ark.,

2005).

AKE’ yi inhibe eden ilaçlar anti-KE maddeler olarak adlandırılır. Kolinerjik sinir

sonlarında AK birikimine sebep olurlar ve böylece merkezi ve periferik sinir sistemi

boyunca kolinerjik reseptörlerin aşırı uyarılmasına eşdeğer etkiler oluşturma

potansiyeline sahiplerdir. Anti-KE maddelerin tipik farmakolojik etkileri öncelikli

olarak, kolinerjik iletim noktalarında AKE tarafından AK’ in hidrolizinin

engellenmesine bağlıdır. Bu şekilde biriken transmitter, kolinerjik uyarımla serbest

bırakılan veya sinir sonundan kendiliğinden salınan AK’ ye olan cevabı artırır.

Hayvan türleri arasında kolinerjik nöron dağılımındaki yaygınlık göz önüne

alındığında, tarımsal insektisidler, pestisidler ve potansiyel kimyasal silahlar

formunda toksik maddeler olarak anti-KE’ ların yaygın uygulama alanına sahip

olması şaşırtıcı değildir. Bununla birlikte, bu sınıftaki birçok bileşik, geniş çapta

terapötik kullanıma sahiptir (Brunton ve ark., 2006).

11

1.3. Etefon

Etefon (ETF) [(2-kloroetil) fosfonik asit] (CAS No: 16672–87–0), doğal bir bitki

hormonu olan etilen gazını salgılatarak meyve olgunlaşmasını teşvik eden,

absisyonu, çiçeklenmeyi başlatan ve diğer bitki cevaplarında kullanılan bir bitki

gelişim düzenleyicidir (Segall ve ark., 1991; U.S. EPA., 1995). ETF, fizyolojik pH’

da kendiliğinden fitohormon olan etilene ayrışan bir kaynak olarak görev yapan en

önemli bitki gelişim düzenleyicilerinden biridir (Zhang ve Casida, 2002).

Şekil 1.1. Etefonun kimyasal yapısı (C2H6ClO3P) (U.S. EPA., 1995).

ETF, gıdaların ve lifli hububatların hasat öncesi ve sonrası olgunlaşmasını teşvik

etmek için kullanılan en önemli bitki gelişim düzenleyicilerinden birisidir. Büyük

oranda pamukta olmak üzere, ABD’ de yıllık kullanımı 5,4 milyon pound ve

Kaliforniya’ da 0,9 milyon pounddur (Haux ve ark., 2002).

Saf etefon 74–75 °C’ de eriyen beyaz mumsu katı bir maddedir. Etefon suda,

alkolde, asetonda ve propilen glikolde çok iyi çözünür, benzen ve toluen gibi

aromatik çözücülerde sadece hafif çözünür ve kerosen ve dizel yağlarda çözünmez.

Molekül ağırlığı 144,5 g/mol’ dür (U.S. EPA., 1995). Yüksek pH’ da, etilenin

salgılanması ile birlikte ayrışma meydana gelir, pH’ sı 5’ den az sulu çözeltileri

stabildir, pKa1 değeri 2,5, pKa2 değeri 7,2’ dir (Tomlin, 1997). Bileşik, yüksek

konsantrasyonlarda (> % 87) mum kıvamında katı bir madde olduğundan

kullanılması zordur. Birçok toksikolojik çalışmada kullanılan ve de pazarlanan, % 71

etefon ve % 21 su içeren teknik üründür. Her ne kadar ETF, bir dibazik fosfonik asit

olsa da, ticari formülasyonları antikolinesteraz aktivite gösterir (INCHEM, 2002).

Teknik sınıf ETF genelde, yüksek oranda asidik olan yoğunlaştırılmış sulu çözelti

12

olarak formüle edilir. Yavaş bir şekilde pH 3’ ün altında ayrışır ancak daha alkali

pH’ larda hızlı şekilde etilen, fosfat ve klor iyonları oluşturmak üzere ayrışır. Basit

şartlar altında, alkoller veya fenollerle sırasıyla monoester alkil veya aril fosfatlar

oluşturmak üzere tepkimeye girerek fosforile edici etkisini yansıtır (Segall ve ark.,

1991).

ETF’ nin birbiriyle alakası olmayan bitkilerde etilen gazı salgılatması ve insanlarda,

köpeklerde, ratlarda ve farelerde plazma BKE aktivitesini baskılaması gibi iki

biyolojik etkisi vardır. AKE’ ye göre BKE’ ye olan etkisi daha seçicidir. ETF’ nin

enzim inhibisyonu üzerindeki etkinliğini belirlemek amacıyla yapılan bir çalışmada

köpek plazma BKE’ si en duyarlı, insan ve fare BKE’ si orta duyarlı ve rat BKE’ si

en az duyarlı olarak bulunmuştur (Haux ve ark., 2000).

BKE aktivitesi ilerleyen ve geri dönüşümsüz şekilde, paraokson gibi klasik triester

fosfatlar ve ayrıca şaşırtıcı şekilde ETF dianion tarafından Ser-198 noktasında

fosforilasyon ile inhibe edilir. ETF ve yakın analogları tarafından BKE aktivitesinin

dönüşümsüz olarak inhibe edilmesi fosfonik asitler arasında eşsizdir, çünkü

çoğunlukla reaktif türler değillerdir ve dönüşümlü enzim inhibitörleri yerine görev

yaparlar (Zhang ve Casida, 2002).

ETF’ nin etki şekliyle ilgili öne sürülen mekanizma, BKE’ nin S198 aktif

noktasından fosforilasyonudur. BKE’ nin ETF ile inhibisyonunun mekanizması,

triester OF bileşiklerin (paraokson gibi) yaptığı AKE ve BKE inhibisyonunun

mekanizmasıyla benzerliklere sahiptir. Bu inhibisyon ilerleyici ve geri

dönüşümsüzdür (Haux ve ark., 2002). Sulu ortamda ETF, fosfat ve etilen

salgılattığından ve su varlığında primer alkolleri fosforile ettiğinden (Haux ve ark.,

2000), bu gözlem, BKE aktif noktasının ETF tarafından, öne sürülen fosforilasyonu

için bir model olarak görev yapar. İnsan plazmasındaki BKE, ETF tarafından yavaş

ama ilerleyici şekilde inhibe edilir. ETF, fosforilasyon yoluyla, kloroetil kısmıyla

derivatizasyon yoluyla veya serbestleşen etilenin reaksiyonu yoluyla inhibe edebilir.

13

ETF, fosforile edici ajanlara göre çok zayıf bir alkile edici ajandır. Ayrıca, sadece

S198’ i değil, BKE’ deki diğer noktaları da derivatize eder (Haux ve ark., 2002).

İncelenen bir düzineden fazla diğer esteraz, BKE’ nin ETF’ ye olduğundan 10 ila

100 kat daha az duyarlıdır. Bu sebeple, BKE inhibisyonu, ETF maruziyeti için en

duyarlı belirleyici olmaktadır. ETF‘ nin bir BKE ve daha az oranda AKE inhibitörü

olmasının keşfi, daha duyarlı olabileceği düşünülen diğer esterazlar tarafından takip

edilmemiştir. Birçok plazma ve karaciğer esterazı in vitro şartlarda duyarlı olsa da,

BKE in vivo olarak en duyarlıdır. Sonuç olarak, BKE inhibisyonu, ETF

maruziyetinin en duyarlı belirteci olarak kalmaya devam etmektedir (Haux ve ark.,

2002).

EPA’ nın kayıtlarına göre ETF, Grup D’ de yer almaktadır (insanlar için

karsinojenliğini gösterir yeterli kanıtın bulunmadığı grup). İnsanlara ağızdan 28 gün

1,8 mg/kg/gün dozunda ETF verilerek yapılan çalışmalara dayanarak referans doz

(RfD) değeri 0,018 mg/kg/gün olarak belirlenmiştir (U.S. EPA., 1995). Ratlarda,

akut oral LD50 değeri 3030 mg/kg ve kronik besinsel NOEL (etki görülmeyen düzey)

değeri 3000 ppm’ dir (Haux ve ark., 2002).

ETF, tavşanların kullanıldığı akut dermal irritasyon çalışmalarında korozif olarak

bulunmuştur; göz iritasyonuna sebep olma potansiyeli mevcuttur ve bu etkileri

nedeniyle Zehirlilik Kategori I’ de (dört kategorinin en üst düzeyi) yer almaktadır.

Ağızdan, deriden ve solunum yolundan orta dereceli akut toksiktir (Zehirlilik

Kategori III) ve deri duyarlılığına yol açmaz (U.S. EPA., 1995).

Farelerde OF pestisidler ile oluşan BKE inhibisyonunun ve süksinilkolin

toksisitesinin güçlenmesinin araştırıldığı bir çalışmada, ETF periton içi olarak (200

mg/kg, 1 saat) farelere uygulandığında, süksinilkolinin LD50 değerini kontroldeki 2,4

mg/kg’ dan 0,59 mg/kg’ a düşürdüğü, bunun da toksisitedeki 4-kat artışı gösterdiği

belirtilmektedir. Serum BKE aktivitesisinin 1 saat ETF uygulaması ile % 77-94

14

inhibe olduğu, farelerin süksinilkolin toksisitesine duyarlı hale geldiği

kaydedilmektedir (Sparks ve ark., 1999).

İnsan ve hayvan beslenmesinde yararlanılan birçok bitkide kullanılan ETF için

tolerans düzeyi yeniden değerlendirilmiştir. Değerler genelde kabul edilebilir

olmakla beraber yine de bazı değişiklikler gerekmektedir. EPA’ nın besin risk

değerlendirmesine göre ETF’ nin ürünlerde kullanılması durumunda en büyük

maruziyet ve risk grubunu bir yaşın altındaki bebeklerin oluşturduğu belirtilmektedir.

Buna rağmen, EPA riskleri hesaplarken basit değerlendirmeler kullanmıştır, bundan

dolayı bebeklerdeki gerçek besinsel maruziyet ve riskin çok düşük olduğuna

inanılmaktadır. Diğer bir risk grubunu ise pestisid uygulayıcıları ile uygulama

sonrası ETF uygulanan ürünlerle temasta olan işçiler oluşturmaktadır (U.S. EPA.,

1995).

1.4. Klorprifos

Klorprifos (CPF) [ O,O-dietil O-(3,5,6-trikloro-2-pridinil) fosforotioat ] temas,

sindirim ve solunum etkisi ile kolinesteraz inhibitörü olarak etkiyen sistemik

olmayan OF insektisiddir. Tarım, bahçecilik, bağcılık ve ormancılık alanında, çok

sayıda üründe, vektör kontrolünde ve diğer halk sağlığı uygulamalarında

kullanılmaktadır (WHO, 2002).

Şekil 1.2. Klorprifosun kimyasal yapısı (C9H11Cl3NO3PS) (WHO, 2002).

Teknik CPF (CAS No: 2912–88–2), erime ısısı 41,5–42,5 °C olan beyaz kristalize

katı bir maddedir. CPF, nötr ve asidik sulu çözeltilerde stabildir, ancak, artan pH ile

15

birlikte stabilitesi azalır. CPF, pratik olarak suda çözünmez, ama birçok organik

çözücüde (aseton, ksilen, metilen klorür gibi) çözünür. Molekül ağırlığı 350,6 g/mol’

dür (U.S. EPA., 2002).

CPF, yaygın şekilde pest kontrolünde kullanılmaktadır ve diğer OF insektisidler gibi

ortak metabolik işlemleri ve toksisite mekanizmalarını paylaşırlar. Ana CPF bileşiği

AKE’ ın zayıf inhibitörüdür ki asıl güçlü AKE inhibitörü olan CPF-oksona CYP-

aracılı oksidatif desülfürasyon ile metabolize olur (Cochran, 2002; Poet ve ark.,

2003). Birçok yönden, okson-metaboliti KE inhibitörü olarak CPF’ den 106 kat daha

aktifdir. Bu metabolit ayrıca, ana bileşikten rat beyin AKE’ ını inhibe etmede 300-

400 kat daha güçlüdür (El-Masri ve ark., 2004). Öncelikli olarak aktif okson

metaboliti (CPF-okson) ile AKE’ ı dönüşümsüz olarak baskılar. CPF-okson AKE’ yi

fosforile ederek AKE’ yi bağlar ve AK’ nin kolin ve asetata metabolize olmasını

engeller. Bu durum, kolinerjik sinapslarda asetilkolin birikimine bağlı olarak bir dizi

nörotoksik etki ile sonuçlanır (Cochran, 2002; Kousba ve ark., 2004).

CPF’ nin CPF-oksona metabolik etkinleştirilmesine, CYP450-aracılı oksidatif

desülfürasyonu ve önemli metaboliti trikloropridinol (TCP) ve dietilfosfat

oluşturarak detoksifikasyonuna CYP450-aracılı dearilasyon aracılık eder (Kousba ve

ark., 2003; Poet ve ark., 2003; Kousba ve ark., 2004). CPF-okson, AKE’ nin aktif

noktasındaki serin hidroksil grubunu fosforile eden elektrofilik bir bileşiktir (Kousba

ve ark., 2004). Desülfürasyon ve dearilasyon arasındaki denge çok değişik

düzeylerde AKE inhibisyonu ile sonuçlanır. Birçok çalışma, oksonların BKE ve

karboksilesteraz (KAE) gibi diğer hedef olmayan B-esterazların güçlü inhibitörü

olduğunu göstermiştir (Kousba ve ark., 2003). AKE, BKE ve KAE gibi B-esterazlar

stoikiometrik olarak okson tarafından inhibe edilirken, A-esterazlar (PON1)

enzimatik olarak OF bileşikleri hidrolize eder ancak inhibe olmazlar. CPF-oksonun

PON1 metabolizması, TCP oluşturmak üzere oksonun deaktive olması ile sonuçlanır

(Poet ve ark., 2003). CPF-okson KAE ile bağlanarak veya oksonaz (organik

fosforlularla inhibe olmayan esteraz) ile hidrolize olarak detoksifiye olabilir

(Cochran, 2002). BKE ve KAE stoikiometrik olarak bir kısım oksonu detoksifiye

ettiğinden ve bu kısmın AKE’ yi inhibe etmesini önlediğinden, bu esterazların varlığı

16

AKE inhibisyonuna karşı potansiyel bir koruyucu mekanizma olarak

düşünülmektedir (Karanth ve Pope, 2000; Kousba ve ark., 2003).

Şekil 1.3. Klorprifosun metabolizması (U.S. HHS., 1997).

CPF’ nin, CPF-okson ve TCP (3,5,6-trichloro-2-pyridinol) adlı iki ana metaboliti

bulunmaktadır. TCP, kolinesteraz baskılanmasına yol açmaz ve CPF’ den daha az

zehirli bir maddedir. CPF ve diğer bazı organik fosforlu bileşikler iki aşamalı bir

yolla detoksifiye edilirler. Detoksifikasyon aşamaları, ana bileşiğin, oksona

sitokrom-P450 sistemiyle biyoaktivasyonu ve daha sonra oluşan okson bileşiğinin,

karaciğer veya serum paraoksonazları gibi esterazlar ile hidrolizini içerir (U.S. EPA.,

2002).

CPF’ nin etkisini gösterebilmesi için öncelikle karaciğerde CYP sistemi aracılığıyla

CPF-okson oluşturulması gerekir. Bununla birlikte, beyin de dahil diğer dokularda

karaciğer dışı CYP metabolizması bildirilmiştir. Bu bilgiler bağırsak CYP sisteminin

önemini ve CPF metabolizmasında etkin bir paya sahip olduğunu göstermektedir

(Timchalk ve ark., 2002). CPF-oksonun paraoksonaz (PON1) metabolizması, TCP

oluşturmak üzere oksonun deaktive olması ile sonuçlanır. CPF’ nin TCP’ ye

17

deaktivasyonu ile sonuçlanan CYP-aracılı dearilasyona CYP 2C ve 3A4 aracılık

eder. B-esteraz aktivitesi hem bağırsak hem de karaciğerde benzer iken, PON1

aktivitesi bağırsaklarda yaklaşık 100-kat daha düşüktür. Bununla birlikte, hem

biyoaktivasyon hem de detoksifikasyondan sorumlu metabolize edici enzimler,

karaciğerdekinden daha düşük düzeylerde ince bağırsaklarda da mevcuttur ancak

etkileri yine de önemli derecededir (Poet ve ark., 2003).

Ratlarda, CPF’ nin ağızdan 1 mg/kg dozu yaklaşık 2,5 ng/ml’ lik bir kan düzeyi

sağlar. Bu düzeyde beyin AKE aktivitesinde ölçülebilir bir azalmaya neden olmaz.

Bunun nedeni bu dozda CPF-okson’ un sinir sisteminde AKE enzimini

bağlayamamasıdır. Okson koruyucu mekanizmalarla detoksifiye edilir (Cochran,

2002).

Akut toksisite denemelerinde genç ratların yetişkinlere göre belirgin bir biçimde

CPF’ nin toksik etkilerine daha duyarlı oldukları görülmüştür. Gençlerdeki bu

duyarlılığın nedeni CPF-oksonu detoksifiye etme kabiliyetlerindeki azalmayla ilgili

bulunmuştur (Cochran, 2002). Ayrıca kolinesteraz baskılanması ve davranışsal

etkiler açısından yeni doğanlar yetişkinlere göre ağızdan CPF maruziyetine daha

duyarlıdır (Smegal, 2000).

CPF ağız, deri ve solunum yoluyla akut toksisite bakımından orta derecede zehirlidir

(Zehirlilik Kategorisi II). Testler CPF’ nin toksik etkilerine insanların hayvanlara

benzer şekilde ve muhtemelen daha da duyarlı olduğunu göstermektedir. Cinsiyet

bakımından ise dişiler erkeklere göre biraz daha fazla duyarlıdır (Smegal, 2000).

CPF gebe ratların yavrularında beyin gelişmesinde gecikmiş değişikliklere sebep

olur. Fare ve ratlarda kronik toksisite çalışmalarında CPF’ ye bağlı tümör

oluşumu/karsinojenite kanıtı kaydedilmemiştir. CPF, bakterilerde veya memeli

hücrelerinde mutajenik değildir ama mayada çok hafif genetik değişikliğe ve

bakteride de DNA hasarına sebep olur (Smegal, 2000).

18

Ratlarda ağızdan 1 mg/kg/gün’ lük akut toksisite çalışmasında, erkek ratlarda 3–6

saat sonra % 28–40 oranında plazma kolinesteraz baskılanması görülerek 0,5

mg/kg/günlük bir NOAEL (olumsuz etki görülmeyen düzey) belirlenmiştir. Buna

bağlı kalınarak da akut gıda RfD (referans dozu) 0,005 mg/kg/gün olarak

bulunmuştur. Köpeklerde ve ratlarda yapılan çalışmalarla kronik RfD 0,0003

mg/kg/gün olarak belirlenmiştir. Bu RfD’ ları elde etmek için NOAEL değerlerine

100 güven faktörü uygulanmıştır (Smegal, 2000).

1.5. Kombinasyon Çalışmaları

Toksisite verilerinin çoğu tek bileşik kullanılarak yapılan çalışmaları esas alır

(Gordon ve ark., 2006). Çevresel maruziyet ise çoğunlukla birçok kimyasalın

varlığına bağlıdır. Birçok olguda, bu kimyasallar hem farmakokinetik hem de

farmakodinamik toksisite mekanizmalarıyla birbirleriyle etkileşir (El-Masri ve ark.,

2004). Anti-kolinesteraz insektisid karışımları arasındaki bir etkileşim antagonistik

veya sinerjistik olabilir veya karışım sıfır etkileşim yani aditiflik gösterebilir. Toksik

kimyasal karışımlarına insanların maruziyeti, saflaştırılmış bileşiklere maruziyetten

muhtemelen daha yaygındır, ancak pestisid karışımlarının yan etkileri üzerine

çalışmalar sınırlıdır (Gordon ve ark., 2006). Veri yokluğunda, bir karışımın bir

aradaki toksisitesinin değerlendirilmesinde, geçerli doz veya cevap aditifliği esas

alınır. Her ne kadar aditiflik konsepti çoğunlukla düşük doz düzeylerinde kabul

edildiyse de, düşük çevresel maruziyet düzeylerinde, olası bir sinerjistik veya

antagonistik etkileşimin yokluğu olarak aditiflik kullanılmasının geçerliliği için, bu

düzeylerin kantitatif olarak saptanması gerekmektedir. Etkileşimin belirgin hale

geldiği dozlar, etkileşim eşiği olarak tanımlanmaktadır (El-Masri ve ark., 2004).

Karbamat ve OF karışımlar arasındaki etkileşimler üzerine in vitro ve in vivo

yaklaşımları kullanarak yapılan çok az sayıda çalışma mevcuttur (Gordon ve ark.,

2006).

CPF ve paratiyon, özellikle çiftliklere yakın olmak üzere çevrede bir arada

bulunmaktadırlar. Her iki kimyasal ortak toksisite mekanizmasıyla etki gösterirler.

19

Her ikisi de, aynı hedef moleküle sahiptir ve AKE’ yi inhibe ederler. Bu iki kimyasal

arasında, metabolizma düzeyinde P450 enzimleriyle yarışma yoluyla ve cevap

düzeyinde AKE bağlanma noktalarına yarışma yoluyla etkileşim mevcuttur. CPF ve

paratiyonu örnek alarak ikili bir karışım için bir etkileşim eşiği saptanmasında

Fizyolojik Esaslı Farmakokinetik modelin uygulamasını göstermek amacıyla yapılan

bir çalışmada her kimyasalın 0,08 mg/kg’ dan düşük oral doz düzeylerinde aditiflik

elde edildiği, yüksek dozlarda, enzimatik yarışmalı inhibisyon yoluyla

antagonizmanın etkileşim şekli olduğu ifade edilmektedir (El-Masri ve ark., 2004).

OF pestisid ile zehirlenme olgusunda, periferik dokular ve MSS’ de AKE

inhibisyonu ile ilgili olarak bir toksisite aditifliği varsayımı vardır. Eğer gerçekten

böyleyse, o zaman bu pesitisidlerin karışımlarının fizyolojik etkilerinin de aditif

olabileceği beklenmelidir ancak bu çok nadiren denenmiştir. Karbamat olan

fizostigmin ve OF sinir gazı olan sarin arasındaki antagonizma iyi bir şekilde ortaya

konulmuştur. Anti-KE ajanlar ayrıca fiziko-kimyasal özellikler gösterir ve kolinerjik

sistemler dışında, nörotransmitter yolakların aktivasyonu gibi diğer kolinerjik

olmayan hedefleri olabilir. Bu nedenle, farmakokinetik ve ilave etkiler, anti-KE

pestisidlerin ana etki şeklini değiştirebilir ve karışım halinde verildiklerinde toksisite

ve duyarlılıktaki belirtilen farklılıklara muhtemelen katkıda bulunabilir (Gordon ve

ark., 2006).

Toksikolojik belirteç olarak hipotermi ve KE inhibisyonunu kullanarak CPF ve

Karbaril (CAR) antikolinesteraz insektisidlerinin karışımları arasında bir etkileşim

olup olmadığını değerlendirmek amacıyla yapılan bir çalışmada, CPF, 0 ila 50 mg/kg

ve CAR, 0 ila 150 mg/kg uygulanan yetişkin Long-Evans ratlarında çekirdek ısısının

(Tc) devamlı olarak radyotelemetre ile gözlemlendiği, CPF ve CAR 2:1 ve 1:1

orandaki karışımlarının ısı indeksi (TI) üzerine etkilerinin incelendiği

belirtilmektedir. CPF ve CAR’ ın, belirgin bir hipotermi ve TI’ de doza-bağlı bir

düşüş ortaya koyduğu, CPF:CAR’ ın 2:1 oranda karışımının TI cevabının aditiflik ile

tahmin edilene göre belirgin şekilde daha düşük olduğu ve CPF:CAR’ ın 1:1 oranda

karışımının TI cevabının tahmin edilen aditiflikten belirgin şekilde farklı olmadığı

kaydedilmektedir. Plazma ve beyin KE aktivitesi, farklı rat gruplarında CPF, CAR ve

20

karışımları ile dozlamadan 4 saat sonra ölçüldüğünde, beyin KE’ ın inhibisyonu

açısında 2:1 oranı için, bir doz-aditif etkileşimi olduğu ancak 1:1 oranı için bir

antagonistik etkisi olduğu, ayrıca plazma KE’ si üzerine 2:1 ve 1:1 karışımlarının

yine antagonistik bir etkileşimi olduğu belirtilmektedir. Fizyolojik (ısı) ve

biyokimyasal (KE inhibisyonu) belirteçlerin 2:1 ve 1:1 karışım çalışmaları için

aditiflikten ayrılmasının beklendiği gibi olmadığı, CPF ve CAR arasındaki

etkileşimin, karışımdaki bileşiklerin oranına ve biyolojik belirteçlere bağlı olduğunun

görüldüğü ifade edilmektedir. Çalışmada ayrıca, CPF’ nin hipotermik gücünün CAR’

a göre 5 kat fazla olduğu kaydedilmektedir. CPF’ nin birçok davranışsal ve otonom

sistemler söz konusu olduğunda CAR’ dan devamlı daha güçlü olduğu gösterildiği

belirtilmektedir (Gordon ve ark., 2006).

Farelerde Maleik Hidrazid (MH) ve ETF’ nin tek ve kombine haldeki subkronik

toksik etkilerinin araştırıldığı bir çalışmada, klinik bulgularda, bütün deneme

gruplarında kontrole göre farelerin canlı ağırlık kazancında bir düşüş görüldüğü ve

bu düşüşün kombinasyon gruplarında, kontrole ve tekli gruplara göre daha fazla

olduğu belirtilmektedir. Bunun nedeni olarak MH ve ETF’ nin bir arada karaciğer ve

böbrek üzerine güçlenen toksik etkisine bağlı yem ve su tüketiminde azalma olması

gösterilmektedir. Ayrıca MH ve ETF kombinasyonlarında, etki güçlenmesi olmadığı

ve ETF’ nin düşük dozlarında MH’ nin karaciğerdeki etkisini engellediği ve bunun

artan dozla belirginleştiği kaydedilmektedir. Yine aynı çalışmada MH’ in artan

dozunun ETF ile kombinasyonuna bağlı olarak böbrekteki toksik etkisinin arttığı

ancak ETF dozundaki artışın etkiyi değiştirmediği bildirilmektedir. Araştırmada,

erkek farelerde MH ve ETF’ nin karaciğer ve böbreği tek ve kombine halde iken süre

ve dozlar bakımından etkilediği ancak kombinasyonlarda böbrekteki etkiler genelde

güçlenirken karaciğerde iki madde arasında zıt bir etkileşim olduğu, özellikle

erkeklerde belirgin olmak üzere her ikisinin de artan dozlarında ve uzun süre

maruziyette bu etkinin aşılarak aynı yönde etkileşim olduğu sonucuna varıldığı

belirtilmektedir (Yazar, 2005).

Tavşan ve koyun trakea düz kası üzerine levamizolün etkisinin tek başına ve

triklorfon ile birlikte araştırıldığı çalışmalarda, levamizolün tavşanlarda karbakolün

21

pD2 değerini azalttığı, Emax’ ını artırdığı, betanekol cevabını pD2 düzeyinde

azaltırken, Emax düzeyinde herhangi bir değişiklik yapmadığı belirtilmektedir.

triklorfon (10-4M) ve levamizol (5x10-5M) ile bir aradaki uygulamanın, tek başına

triklorfon uygulamsına göre Emax değerini anlamlı şekilde düşürdüğü, bu durumun

levamizolün triklorfonun etkisini azalttığını gösterdiği ifade edilmektedir.

Tavşanlarda, triklorfon (10-6M)+levamizol ile (5x10-5M) dokunun inkübasyonunun

karbakolün pD2 cevaplarını, triklorfon+karbakolünküne göre belirgin şekilde

düşürdüğü ve bu durumun levamizolün karbakolün bağlandığı reseptörlere

bağlandığını ve karbakolün reseptöre afinitesini azalttığını gösterdiği ve Emax’ da ise

bir değişiklik gözlenmemesinin levamizol+triklorfon kombinasyonunun,

triklorfon+karbakol kombinasyonu düzeyinde bir kolinerjik etkiye neden olduğunu

gösterdiği belirtilmektedir (Üstüner, 2003). Koyun trakea düz kasında levamizol ile

20 dakika inkübasyonun asetilkolinin sadece Emax değerlerini istatistiksel önemde

artırdığı, triklorfon ile inkübasyonun asetilkolin pD2 cevaplarını düşürdüğü ve

triklorfonun levamizol ile beraber inkübasyonunun ise, asetilkolin cevaplarını sadece

levamizol ile inkübasyon yapılmış olanınkine göre, pD2 ve Emax düzeyinde

düşürdüğü ve bu durumun iki madde arasında zıt etkileşim olduğunu gösterdiği ifade

edilmektedir (Baydan ve ark., 2002).

Genellikle suda çözünmediklerinden dolayı, birçok pestisid çok değişik çözücüde

formüle edilir ve sıklıkla güçlendiricilerle bir arada kullanılır. Pestisidlerin bir arada

kullanıldığı durumlarda, sadece bu pestisidler arasında değil, ayrıca pestisidler,

çözücüler ve güçlendirici maddeler arasında da etkileşim potansiyeli vardır. Teorik

olarak, bu etkileşimler, etkisiz bir bileşiğin etkin bir bileşiğin etkisini artırdığı

potansiyelizasyon şeklinde, bir etkin bileşiğin diğer bir etkin bileşiğin etkisini

artırdığı sinerjizma şeklinde, bir bileşiğin diğerinin etkisini azalttığı inhibisyon

şeklinde olabilmektedir. Alternatif olarak, bileşikler etkileşmeyebilmekte ve bunların

kombine etkileri basitçe her bir bileşiğin aditif etkisi olabilmektedir (Axelrad ve ark.,

2002).

Pestisidler ve pestisid formülasyonlarının bileşenleri arasında etkileşimin araştırıldığı

bir in vitro nörotoksisite çalışmasında, NB2A nöroblastoma hücreleri, OF Diazinon

22

ve CPF varlığında farklılaşmak için uyarılmışlardır. Her ne kadar OF bileşiklerin

genellikle in vivo olarak piretroidlerden daha nörotoksik olduğu düşünülse de, burada

kullanılan in vitro nörotoksisite denemeleri, nöroblastoma hücrelerine doğrudan

uygulandığında piretrumun OF diazinon ve CPF’ den daha nörotoksik olduğunu

göstermektedir. Çalışmada, her bileşiğin kendi başına yapacağı etkilerden tahmin

edilen, aditif etkilere kıyasla bir aradaki bileşiklerin artmış veya azalmış etkileri

kapsamında etkileşimler saptandığı ve sinerjizmanın, CPF ve Ticari Formülasyon 1’

de bulunan solventlerin biri arasında ve 10 µM CPF ve 500 nM piretrum

kombinasyonları arasında saptadığı belirtilmektedir. Tüm diğer OF ve preparat

kombinasyonlarının nörotoksisite yönünden aditif olduğu ifade edilmektedir. CPF’

nin, pro-konvülzif aktivitesinde ksilen ile aditifliği olduğu ancak sinir hücresi

farklılaşması üzerine etkilerinde CPF ve çözücüler arasında sinerjizma olduğunu

bildirilmektedir. Normal spiritlerin içindeki çözücüler, CPF’ nin toksisitesini

artıracak çok sayıda yolla etki edebilir. CPF’ nin hücre zarından geçişini teşvik

edebilir böylelikle çok yüksek etkili hücre içi derişime izin verir. Bunun dışında,

çözücülerin varlığında artan toksisitenin bir bölümü sinir doku tarafından

pestisidlerin sınırlı bir oranda metabolik işlemlere uğradığı varsayılarak, sinir hücresi

tarafından pestisidlerin metabolizmasının bazı yönleri üzerine bir etkileşime bağlı

olabilir. Örneğin, aseton bazı CYP enzimlerinin oluşumunu artırırken, etanol asetona

metabolize olur ve sonra CYP aktivitesini artırmaktadır. Bu veriler, çoklu OF-içeren

pestisid formülasyonlarına maruziyetin hücresel düzeyde doğrudan bir mekanizma

ile sinerjistik nörotoksisiteye sebep olabileceğini göstermektedir. Çalışmada

kombinasyonlar arasında sinerjizmanın belirlendiği, diğer bütün organik fosforlu

kombinasyonları ve ürünlerinin, nörotoksisite açısından aditif etkili olduğu ve

çalışma sonucunda çoklu organik fosforlu pestisid formülasyonlarının doğrudan

mekanizmayla hücresel düzeyde sinerjistik nörotoksisiteye neden olabileceği

belirtilmektedir (Axelrad ve ark., 2002).

Yaygın şekilde kullanılan iki OF insektisid olan CPF ve metil paratiyonun (MPS)

ikili karışımlarının etkileşimli toksisitelerinin yetişkin ratlarda ardışık veya eş

zamanlı uygulamayı takiben kıyaslanmasının çalışıldığı bir araştırmada, CPF ve 4

saat sonra MPS uygulanan yetişkin ratlarda, aynı dozlar ancak önce MPS’ nin

23

uygulandığı ratlara göre daha çok toksisite belirtisi ve daha yaygın ölüm görüldüğü

belirtilmektedir. Ayrıca her iki OF insektisidin aynı zamanda uygulandığı ratlara

kıyasla CPF’ nin önce uygulandığı grupta daha çok toksisite kaydedildiği ifade

edilmektedir. Bazı dokularda, kolinesteraz inhibisyonunun, MPS’ nin önce

uygulandığı ve eş zamanlı maruziyet gruplarına kıyasla CPF’ nin önce uygulandığı

grupta daha yüksek olduğu ve böylece, ardışık uygulama ile hem fonksiyonel hem de

biyokimyasal toksisite belirteçlerinin iki insektisidin benzer dozlarının verildiği

ancak önce CPF maruziyeti olanda daha yaygın şekilde etkilendiği bildirilmektedir.

Toksik etki için hem CPF hem de MPS kendi ilgili oksonlarına metabolik olarak

aktive olmak zorunda olduğundan, ilk önce CPF uygulanan ratlarla kıyaslandığında

bu grupta gözlemlenen düşük toksisiteye katkıda bulunabilen eş zamanlı maruziyetle

biyoaktivasyon noktaları için yarışabileceği de belirtilmektedir. Maruziyet sırasının

önemli şekilde toksisiteyi belirleyebildiği sonucuna varıldığı ve bunun sinirsel

fonksiyon ile doğrudan ilgili olmayan anahtar detoksifikasyon esterazların

tükenmesinden kaynaklandığı belirtilmektedir (Karanth ve ark., 2004).

Ratlarda, CPF ve DZN’ nin ikili karışımlarına ağızdan maruz kalmayı takiben

farmakokinetik ve farmakodinamik etkileşimlerinin araştırıldığı bir çalışmada ratlara,

ağızdan CPF, DZN veya bir CPF/DZN karışımı uygulandığı ve uygulamadan 0, 3, 6,

12 ve 24 saat sonra kan ve beyin ayrıca 24.saatte idrar örnekleri toplanması sonucu,

CPF, DZN ve ilgili metabolitleri TCP ve IMHP’ nin, kan ve/veya idrarda

hesaplandığı ve kolinesteraz inhibisyonunun beyin, alyuvar ve plazmada ölçüldüğü

belirtilmektedir. CPF/DZN’ ye 15/15 mg/kg düşük dozda maruz kalmanın, CPF,

DZN veya kandaki metabolitlerinin farmakokinetiğini değiştirmediği, yüksek ikili

doz olan 60/60 mg/kg’ ın Cmax ve EAA’ yı artırdığı ve her iki bileşik için klirensi

azalttığı ve bunun muhtemelen CYP metabolizması için CPF ve DZN arasındaki

yarışmaya bağlı olduğu ifade edilmektedir. Kolinesterazın doza-bağımlı şekilde

baskılanmasının hem tek hem de bir arada maruziyetler için dokularda kaydedildiği

ve baskılanma derecesinin plazma>alyuvar>=beyin şeklinde olduğu, kolinesteraz

baskılanması için toplam nispi etki gücünün CPF/DZN>CPF>DZN şeklinde olduğu

belirtilmektedir. Görünür farmakokinetik etkileşimlerin olmadığı düşük ikili dozda

(15/15 mg/kg) kolinesteraz cevabının kıyaslanmasının, toplam kolinesteraz cevabının

24

aditif olduğunu gösterdiği vurgulanmaktadır ve deneylerin, pestisid karışımları için

potansiyel farmakokinetik ve farmakodinamik etkileşimlerle ilgili önemli veriler

sunduğu ve bu insektisidlere mesleki veya çevresel maruziyetle birlikte oluşan

potansiyel kümülatif risklerin değerlendirilmesi için gerekli kavrayışı sağlayacağı

belirtilmektedir (Timchalk ve ark., 2005).

OF insektisidler, neredeyse tüm tarımsal ve ticari uygulamalarda pest kontrolü için

rutin olarak kullanılmaktadır, bu yüzden, profesyonel uygulayıcıların, tarımsal

alanlarda çalışanların ve genel nüfusun insektisid karışımlarına maruz kalabileceğini

ummak tamamen mantıklıdır. Bu yüzden, bu insektisidlere maruziyet, çiftliklerin ve

bahçelerin yakınında yaşayan tarım çalışanları ve ailelerinin ve pestisidlerin evde

uygulanmasıyla veya gıdalardaki kalıntılar yoluyla maruz kalabilen genel nüfusun

dahil olduğu geniş bir popülasyon segmentini içerebilir. Kullanılan çok çeşitli

pestidlere bağlı olarak, hem mesleki hem de çevresel maruziyet öncelikli olarak

karışımlarla ilgili olanlardır; bununla birlikte sadece birkaç çalışma, eş zamanlı veya

ardışık OF pestisid karışımlarına maruziyetin toksikolojik etkilerini tanımlamaya

başlamıştır. Çok sayıda biyo-gözlemleme çalışması idrarda birçok OF metabolitlerin

varlığını ölçmektedir ve bu alanda çalışan işçilerde plazma KE baskılanması

bildirmektedir. Bunlara ilaveten, tarımla uğraşan ailelerin ve çiftlik ve bahçelerin

yakınında yaşayan ailelerin çocukları, konutlarında veya yakınlarında bu kimyasal

maddelerinin yüksek oranda kullanılmasına bağlı olarak karışık kimyasal

maruziyetten kaynaklanan büyük bir risk altında olabilir. Benzer farmakokinetik ve

etki şekli özellikleri esas alındığında, OF insektisid karışımları arasında etkileşim

için bir potansiyel varsayılmaktadır (Timchalk ve ark., 2005).

Gıdalarda kalıntıları sıklıkla bulunan 5 pestisid karışımı (alfa-sipermetrin,

bromopropilat, karbendazim, klorprifos ve mankozeb) ile ratlarda ağızdan 28 günlük

tekrarlı doz toksisite çalışmasında, Danimarka Veteriner ve Gıda Yönetimi

tarafından incelenen örneklerde pestisid kalıntılarının meyve, sebze ve tahıllarda

bulunduğu, Danimarka’ da üretilen meyvelerden alınan test örneklerinin % 30-40’

ında ve Danimarka dışında üretilen meyvelerden alınan test örneklerinde yaklaşık %

70-75 pestisid kalıntısı bulunduğu ve ayrıca meyve ve sebzelerin % 26’ sında çoklu

25

pestisid kalıntısı bulunduğu ve CPF’ nin, Danimarka’ da gıdalarda maksimum kalıntı

düzeyinin aşıldığı pestisidlerden birisi olduğu ifade edilmektedir. Çalışmada, diğer

yaygın şekilde bulunan pestisid kombinasyonlarına aynı anda maruziyetin

toksikokinetik veya toksikodinamik etkileşim ile CPF’ nin toksisitesini değiştirebilip

değiştiremeyeceğini değerlendirmek için beşi arasında en toksik olan güçlü AKE

inhibitörü CPF üzerine odaklanıldığı ve hedef olarak CPF tarafından plazma ve beyin

AKE inhibisyonunun aynı anda dört pestisidin alfa-sipermetrin, bromopropilat,

karbendazim ve mankozeb uygulanmasının karaciğerde veya diğer toksikokinetik

etkileşimlerle CPF’ nin artan metabolizması yoluyla artıp artmayacağını aydınlığa

kavuşturulması olduğu belirtilmektedir. Sonuç olarak, yaşam parametrelerinde klinik

toksisite yan etkileri gözlemlenmediği, tüm grupların deney süresi boyunca ağırlık

kazandığı ve her bir cinsiyette gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar

bulunmadığı bildirilmektedir. Tüm grupların, yem ve su tüketiminde normal bir

yaşa-bağlı azalma gösterdiği ve motor aktivitede doza-bağlı değişiklikler olmadığı

ifade edilmektedir. Aynı çalışmada, plazma ve nispi beyin AKE aktivitesi

incelemelerinde, plazma AKE’ de hafif ancak istatistiksel olarak anlamlı olan düşük

aktivitenin kontrol olarak kullanılan erkeklere kıyasla bazı gruplardaki erkeklerde

tespit edildiği, plazma AKE düzeyinin erkeklere kıyasla dişilerde yaklaşık 3 kat daha

yüksek bulunduğu bildirilmektedir. Kesin veya nispi beyin AKE aktivitesinde

uygulamaya bağlı farklılıklar bulunmadığı belirtilmektedir. Plazma pestisid derişimi

yönünden yapılan denemelerde ise CPF’ nin bazı örneklerde bulunduğu ancak bunun

nicelendirilme düzeyinin altında düşük derişimde bulunduğu ifade edilmektedir.

CPF’ nin yıkımlanma ürünü TCP’ nin bazı gruplardaki tüm örneklerde bulunduğu ve

derişimlerinin doza bağımlı gibi olduğu belirtilmektedir. Yine bazı gruplardaki

erkeklerinin böbreklerinde nispi organ ağırlığının istatistiksel olarak anlamlı şekilde

arttığı ve bazı gruplarda hem erkek hem de dişi ratlarda nispi karaciğer ağırlığında

istatistiksel olarak anlamlı bir artış olduğu vurgulanmaktadır (Jacobsen ve ark.,

2004).

Her gün, insanlar çok sayıda pestiside gıdalar yoluyla eş zamanlı olarak maruz

kalmaktadır. Bununla birlikte, gıdalardaki pestisid kalıntılarının risk

değerlendirmesinde şu anki pratik, genellikle tek bileşikler üzerine yapılan çalışmalar

26

üzerine kurulmuştur. Aynı şekilde, tüketici sık sık gıdalar yoluyla birden çok

pestiside maruz kalır, pestisid kombinasyonlarına maruziyeti takiben yan etki bilgisi

sınırlıdır. Pestisidler bir arada alındığında, tek pestisidlere maruziyeti takiben

gözlenenlerden nicel ve/veya nitel olarak farklı olan toksik etki gözlemlenebilir.

Kimyasalların birlikte etkisinin veya kombinasyonların etkileşiminin üç temel şekli

tanımlanmıştır: basit benzer etki, basit benzemeyen etki ve gerçek etkileşim. Basit

etki, karışımdaki her kimyasalın aynı mekanizmayla aynı şekilde etkidiğini ve

bireysel olarak kimyasalların güçlerinde sadece farklılık olduğu durumu içine alır.

Basit benzemeyen etki, karışımdaki her kimyasalın kendi etkilerini gösterdiği ancak

karışımdaki diğer kimyasalların etkilerini değiştirmediği anlamına gelir. Son

durumda, etkileşim, daha güçlü bir etkiyle (sinerjizma) veya daha zayıf bir etkiyle

(antagonizm, inhibisyon) sonuçlanabilir. Basit karışımlar ve kompleks karışımlar

arasında ayrım yapılmaktadır. Basit bir karışım, nispeten az sayıda kimyasaldan yani

on veya daha az kimyasaldan oluşurken, kompleks karışımlar, onlarca, yüzlerce veya

binlerce kimyasaldan (örneğin bir iş alanı atmosferi gibi) oluşmaktadır (Jacobsen ve

ark., 2004).

1.6. Etki Gücü ve Etkililiğin Saptanması

Genel olarak, ilaç-reseptör etkileşimi ilk olarak ilacın reseptöre bağlanmasıyla ve

ikinci olarak bir biyolojik sistemde bir cevabın oluşmasıyla tanımlanmaktadır. İlk

fonksiyon, ilacın reseptör ile geri dönüşümlü olarak birleşmesine sebep olan

kimyasal kuvvetler tarafından yönetilen afinitenin kimyasal özellikleri tarafından

idare edilirken, ilaç-reseptör kompleksinden bir cevabın oluşması efikasite (ilacın ne

kadar iyi bir agonist ilaç olduğunu saptayan belirli bir ilaca ait intrinsik özelliktir)

olarak tanımlanan bir özellik tarafından idare edilir (Brunton ve ark., 2006).

İlaçlar biyolojik sistemlerde iki gözlemlenen özelliğe sahiptir: Potens ve etkinin

büyüklüğü (biyolojik bir cevap oluştuğunda). Potens, dört faktör tarafından kontrol

edilir: ikisi reseptörleri içeren biyolojik sistemle ilgilidir (reseptör yoğunluğu ve

dokunun uyarı-cevap mekanizmasının verimliliği) ve diğer ikisi reseptör-ilaç

27

etkileşimi ile ilgilidir (afinite ve efikasite). Aynı biyolojik sistemde, eşit efikasiteye

sahip iki agonistin nispi potensi hesaplanırken, verilen bir etkinin oluşması için yarı-

maksimal etkili derişimin (EC50) saptanmasıyla agonistin tarif edilmesi uygundur.

Böylelikle, EC50 değerlerinin kıyaslanmasıyla agonist potensinin ölçülmesi, farklı

agonistlerin bir test sisteminde bir cevap oluşturması için ve bir diğerinde

kıyaslanabilir etkinliğin tahmin edilmesi için kapasitesinin ölçülmesinin bir

metodudur. Agonist etkinliğinin hesaplanmasının diğer bir metodu, agonistin

maksimum cevap oluşturmadığı bir sistemde yaptığı en yüksek etkilerin (Emax)

kıyaslanmasıdır. Emax’ ların kullanılmasının avantajı, bu özelliğin sadece efikasiteye

bağlı olmasıyken, potens hem afinite hem de efikasitenin karma bir fonksiyonudur

(Brunton ve ark., 2006).

EC50, bazal çizgi ve Emax arasında yarı yolluk bir cevap oluşturan agonist derişimi

olarak ifade edilmektedir (Motulsky ve Christopoulos, 2003). Emax, ilacın

oluşturduğu maksimum etki ve EC50, Emax’ ın % 50’ sine eşit bir etki (yarı

maksimum etki) oluşturan molar ilaç derişimidir (Kayaalp, 2002). EC50 belirli bir

ilaç için doz-cevap eğrisinin yerini belirlediğinden, agonistin potensinin

ölçülmesinde en sık kullanılan bir ölçüdür. Bununla birlikte, agonistin reseptörüne

bağlanması olan Kd ile çoğunlukla aynı değildir, diğer bir ifadeyle Kd gibi ilacın

afinitesinin doğrudan bir ölçüsü değildir. pD2, EC50’ nin negatif logaritması olarak

tanımlanmaktadır. Potensi, bu şekilde ifade etmenin özel bir avantajı olmasa da bazı

alanlarda bu şekilde kullanılması yaygındır (Motulsky ve Christopoulos, 2003).

İlacın efikasitesinin (etkililiği) deneysel farmakoloji bağlamında göstergesi ilacın

maksimum (Emax değeri) etkisidir (Kayaalp, 2002).

28

1.7. Çalışmanın Amacı

Türkiye’ de ve yurt dışında geniş kullanım alanı olan organik fosforlu pestisidlere

değişik şekillerde maruziyet söz konusudur. Bu pestisidler üzerinde değişik

kombinasyon çalışmaları bulunmaktadır. Yapılan taramalara göre güvenli olduğu

vurgulanan ve toksik etkileri bireysel olarak incelenen etefon ve klorprifos hakkında

kombinasyon çalışması bulunmamaktadır. Klorprifos için daha fazla olmak üzere

klorprifos ve etefon için yapılmış ayrı araştırmalar bulunmaktadır. Bu araştırmalara

göre özellikle etefon genel anlamda güvenli bir madde olarak değerlendirilmektedir.

Ancak, bilindiği gibi yapılan testler saha koşullarına bire bir uymamaktadır.

Dolayısıyla normal yaşamda kimyasal maddelerin birine değil pek çoğuna aynı anda

maruz kalınması söz konusu olmaktadır. Bunun neticesinde in vivo koşullarda

kimyasal maddeler arasında aynı veya zıt yönde etkileşimler görülebilir. Bu durum

zararsız gibi belirlenen bir maddenin daha toksik etkili olmasına veya tamamen

etkisiz hale geçmesine neden olabilir.

Bu araştırma ile pestisid olarak pek çok ülkede olduğu gibi yurdumuzda da halk

sağlığı alanında pestlerle mücadele için yaygın olarak kullanılan klorprifos ile bir

bitki gelişim düzenleyicisi olarak geniş kullanım alanına sahip etefon arasındaki

etkileşimlerin in vitro koşullarda belirlenmesi amaçlandı. Böylece gerek insan ve

gerekse hayvan sağlığı bakımından önem taşıyan ve özellikle de zararsız olarak

görülen etefonun benzer etki mekanizmasına sahip klorprifos ile bir araya gelmesi

durumunda toksik etkinliğinin artıp artmayacağı belirlenmeye çalışıldı. Piyasada

kullanılan bu maddelere karşı olası maruziyet durumunda ne tür etkilerin olacağını

araştırmak amacıyla bu maddeler tek başlarına ve bir arada in vitro olarak rat ince

bağırsak kaslarına uygulandı ve etkileri incelendi. Bu tezin hipotezi, etefon ve

klorprifosun bir arada rat bağırsağında in vitro kolinerjik etkinliği artıracağıdır.

29

2. GEREÇ VE YÖNTEM

2.1. Araç ve Gereçler

2.1.1. Deney Hayvanları

Çalışmada, Sağlık Bakanlığı Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı Serum

Üretim ve Araştırma Laboratuarı Deney Hayvanı Üretim Bölümünden temin edilen

150–160 gram ağırlığında Wistar Albino soyu, 42 adet 3 aylık erkek rat

kullanılmıştır. Denemeler, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Farmakoloji ve

Toksikoloji Anabilim dalının Farmakodinami laboratuarında yürütülmüştür.

2.1.2. Deney Araçları

İzole Organ Banyosu

TDA 99 polygraph sistem (MAY)

FDT-10A izometrik gerim ileticisi (MAY)

WBC 3044V3 su banyosu ve sirkülasyon sistemi (MAY)

Bilgisayar

% 95 O2, % 5 CO2 içeren gaz karışım tüpü

Hassas Terazi (Sartorius Basic BA110S)

Otomatik pipetler: (Jencons – Sealpette 10–100 µl)

(Biohit Proline – Isolab 100–1000 µl)

Cerrahi malzemeler (pens, makas)

Petri kutusu

Enjektör 10 ml’ lik

Deiyonize su cihazı

30

2.1.3. Kimyasal Maddeler

Etefon (EFHUN 250 cc – Agrobest Ankara – 480 g/l saf Etefon), deiyonize suda 1 M

stok çözeltisi hazırlandı ve deiyonize su ile hazırlanan sulandırmaları kullanıldı.

Klorprifos (Klorprifos teknik – Dow AgroSciences), asetonda çözdürülerek 10-2 M

stok çözeltisi hazırlandı ve deiyonize su ile hazırlanan sulandırmaları kullanıldı.

Asetilkolin klorür (MA: 181,7 g/mol – Sigma A6625), deiyonize suda 1 M stok

çözeltisi günlük olarak hazırlandı ve deiyonize su ile hazırlanan sulandırmaları

kullanıldı.

Fizostigmin (MA: 413,5 g/mol – Eserin salisilat – Sigma E8500), deiyonize suda 10-2

M stok çözeltisi hazırlanarak kullanıldı.

Aseton (CH3COCH3 – Merck 1.00013)

Dietil eter ((C2H5)2O – Merck 1.00926)

2.1.4. Tyrode Çözeltisinin Bileşimi

Sodyum klorür (NaCl – Merck 1.16104): 136,9 mmol

Potasyum klorür (KCl – Merck 4935): 2,68 mmol

Kalsiyum klorür %95 (CaCl2 – Riedel-de Haen 12018): 1,8 mmol

Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2.6H2O – Merck 2503231): 1,05 mmol

Sodyum bikarbonat (NaHCO3 – J.T.Baker 0025010009): 11,9 mmol

Sodyum dihidrojenfosfat dihidrat (NaH2PO4.2H2O – Merck 1.06345): 0,4 mmol

D (+)-Glikoz monohidrat (C6H12O6.H2O – Merck 1.04074): 5,5 mmol

Deiyonize su

31

2.2. Yöntem

Yaklaşık 150–160 gram ağırlığındaki ratlar deneylere başlamadan bir gece önce aç

bırakılarak sadece su verildi. Hayvanlar eter anestezisi altında servikal dislokasyon

yöntemi ile öldürüldü (Tezuka ve ark., 2004). Ötenazi tekniğinin seçiminde, bazı

ötenazi metodlarının vasküler araşidonik metabolizma ve vasküler ve intestinal düz

kas kontraktilitesi üzerine etkilerini saptamak için tasarlanan bir çalışma esas alındı.

Söz konusu araştırmada, ratlara, dekapitasyon (DC), pentobarbital aşırı doz (PB)

veya CO2, metoksifluran (Met-DC) veya eter (eter-DC) ile anesteziyi takiben DC ile

ötenazi yapıldığı ve sonuçta, Met-DC ve PB’ nin vasküler prostasiklin sentezini ve

düz kas kontraktilitesini değiştirdiği, eter-DC’ nin bu parametreler üzerinde (düz kas

kontraktilitesi üzerine) değişiklik yapmadığı belirtilmektedir (Butler ve ark., 1990).

Hayvanın karın boşluğu, sternumdan başlayarak ventrale doğru ve göğüs kafesinin

karın boşluğuna birleştiği hat boyunca yanlara doğru T şeklinde açıldı. İnce

bağırsağın tamamı, iliosekal bağlantı ve pilorus kısımlarından ve çevre dokularla

olan bağlantılarından kesilerek Tyrode çözeltisi içeren bir petriye alındı. İlgili ince

bağırsak segmentleri tespit edilip mezenteryum ve pankreas gibi çevre doku

kalıntılarından temizlendi. Yaklaşık 1 cm uzunluğunda kesilen ince bağırsak parçası

daha önceden hazırlanmış ve içinde 10 ml Tyrode çözeltisi (37 °C, pH 7,4) bulunan

izole organ banyosuna her iki ucu açık olacak şekilde bağlanarak, 1 gram gerim

verilerek asıldı. Deney boyunca dokuya % 95 oksijen ve % 5 karbondioksit gaz

karışımı uygulandı.

Bir saat süreyle dengelenmeye bırakılan doku, her 15 dakikada bir Tyrode çözeltisi

ile 3 kez yıkandı. Dengelenme sonrasında deneylere başlanarak elde edilen

kasılmalar ve gerimdeki değişimler izometrik gerim ileticisi aracılığı ile ölçüldü ve

bilgisayara kaydedildi. Elde edilen yanıtların değerlendirilmesi, söz konusu ilaçların

pD2 ve Emax parametrelerinin karşılaştırılması ile yapıldı. En yüksek kasılmada elde

edilen değer %100 kabul edilerek, diğer derişimlerde elde edilen kasılmaların %

32

değerleri hesaplandı. Bu hesaplardan, “GraphPad Prism version 4.00 for Windows”

paket programı kullanılarak pD2 ve Emax değerleri tespit edildi.

2.3. Protokoller

2.3.1. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Asetilkolinin Etkisinin Araştırılması

Dokular organ banyosunda dengelendikten sonra asetilkolin her seferinde 0,5 log

artışla 10-9–10-4 M derişim aralığında kümülatif olarak hem duodenum hem de ileum

dokusuna ayrı ayrı uygulandı. Elde edilen yanıtların pD2 ve Emax değerleri ve en

yüksek kasılmayı veren değerlerin mg olarak ortalaması hesaplandı.

2.3.2. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefonun Etkisinin Tek Başına

Araştırılması

Dokular organ banyosunda dengelendikten sonra etefon kümülatif olarak 10-10, 10-9,

10-8, 10-7 ve 10-6 M derişimlerde hem duodenum hem de ileum dokusuna ayrı ayrı

uygulandı. Elde edilen yanıtlardan, en yüksek artış % 100 kabul edilerek yüzdelik

artış şeklinde hesaplanıp, ortalamaları alındı. Ayrıca etefonun en yüksek kasılmayı

veren değerlerinin mg olarak ortalamaları hesaplanıp, duodenum ve ileum dokusunda

kastırıcı etkisi de ortaya konuldu.

2.3.3. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefonun Etkisinin Asetilkolin ile

Birlikte Araştırılması

Dokular organ banyosunda dengelendikten sonra asetilkolin her seferinde 0,5 log

artışla 10-9–10-4 M derişim aralığında kümülatif olarak hem duodenum hem de ileum

33

dokusuna ayrı ayrı uygulandı. Dokunun yanıtları alındıktan sonra, 15 dakika ara ile

doku 3 kez yıkandı. Daha sonra doku etefon (Ön deneme sonuçlarına göre en

seyreltik derişim olan 10-10 M ile en iyi kasılmayı veren derişimin bir alt derişimi

olan 10-7 M değerinin uygulamalarda kullanılmasına karar verildi) ile 10 dakika

süreyle inkübe edildi, üzerine asetilkolin derişimleri 0,5 log artışla (10-9–10-4 M)

kümülatif olarak uygulandı. Elde edilen yanıtların pD2 ve Emax değerleri hesaplandı.

2.3.4. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Klorprifosun Etkisinin Tek Başına

Araştırılması

Dokular organ banyosunda dengelendikten sonra klorprifos kümülatif olarak 10-10,

10-9, 10-8, 10-7 ve 10-6 M derişimlerde hem duodenum hem de ileum dokusuna ayrı

ayrı uygulandı. Elde edilen yanıtlardan, en yüksek artış % 100 kabul edilerek

yüzdelik artış şeklinde hesaplanıp, ortalamaları alındı. Ayrıca klorprifosun en yüksek

kasılmayı veren değerlerinin mg olarak ortalamaları hesaplanıp, duodenum ve ileum

dokusunda kastırıcı etkisi de ortaya konuldu.

2.3.5. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Klorprifosun Etkisinin Asetilkolin ile

Birlikte Araştırılması

Dokular organ banyosunda dengelendikten sonra asetilkolin her seferinde 0,5 log

artışla 10-9–10-4 M derişim aralığında kümülatif olarak hem duodenum hem de ileum

dokusuna ayrı ayrı uygulandı. Dokunun yanıtları alındıktan sonra, 15 dakika ara ile

doku 3 kez yıkandı. Daha sonra doku klorprifos (Ön deneme sonuçlarına göre en

seyreltik derişim olan 10-10 M değeri ile en iyi kasılmayı veren derişimin bir alt

derişimi olan 10-7 M değerinin uygulamalarda kullanılmasına karar verildi) ile 10

dakika süreyle inkübe edildi, üzerine asetilkolin derişimleri 0,5 log artışla (10-9–10-4

M) kümülatif olarak uygulandı. Elde edilen yanıtların pD2 ve Emax değerleri

hesaplandı.

34

2.3.6. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefon ve Klorprifosun Bir Aradaki

Etkilerinin Asetilkolin ile Birlikte Araştırılması

Dokular organ banyosunda dengelendikten sonra asetilkolin her seferinde 0,5 log

artışla 10-9–10-4 M derişim aralığında kümülatif olarak hem duodenum hem de ileum

dokusuna ayrı ayrı uygulandı. Dokunun yanıtları alındıktan sonra, 15 dakika ara ile

doku 3 kez yıkandı. Daha sonra doku aynı anda etefon ve klorprifos (Tek başlarına

yapılan uygulamalarda kullanılan 10-10 M ve 10-7 M olan derişimleri kullanılmıştır)

ile 10 dakika süreyle inkübe edildi, üzerine asetilkolin derişimleri 0,5 log artışla (10-

9–10-4 M) kümülatif olarak uygulandı. Elde edilen yanıtların pD2 ve Emax değerleri

hesaplandı.

2.3.7. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Yapılan Diğer Denemeler

2.3.7.1. Bağırsak Ortamının Enzimatik Etkinliğinin (AKE) Belirlenmesi

Bağırsak ortamının enzimatik etkinliğinin (AKE) test edilmesi amacıyla fizostigmin

10-7 ve 3x10-7 M derişimlerde duodenum ve ileum dokusuna uygulandı. Elde edilen

yanıtlardan, en yüksek kasılmayı veren değerlerin mg olarak ortalaması hesaplandı.

2.3.7.2. Çözücünün Dokular Üzerine Etkinliğinin Belirlenmesi

Klorprifosun çözücüsü olarak kullanılan asetonun etkisizliğini göstermek amacıyla

dokular organ banyosunda dengelendikten sonra asetilkolin her seferinde 0,5 log

artışla 10-9–10-4 M derişim aralığında kümülatif olarak hem duodenum hem de ileum

dokusuna ayrı ayrı uygulandı. Dokunun yanıtları alındıktan sonra, 15 dakika ara ile

doku 3 kez yıkandı. Daha sonra doku aseton 10-7 M (Deneylerde uygulanan en yoğun

35

klorprifos derişimi ile aynı derişim) ile 10 dakika süreyle inkübe edildi, üzerine

asetilkolin derişimleri 0,5 log artışla (10-9–10-4 M) kümülatif olarak uygulandı. Elde

edilen yanıtların pD2 ve Emax değerleri hesaplandı.

2.4. İstatistiksel Analiz

İstatistiksel hesaplamalarda ve grafik çiziminde “GraphPad Prism version 4.00 for

Windows” paket programı kullanıldı. Çalışmadan elde edilen veriler aritmetik

ortalama ve standart hata şeklinde ifade edildi. Asetilkolin kontrolü ile ilaçların tek

başlarına veya bir arada uygulanması denemelerinde, karşılaştırılacak ikili gruplar

arasında Wilcoxon eşleştirilmiş ikili örnek testi (Wilcoxon Signed Ranks

Nonparametric Test) kullanıldı. Bağırsağın duodenum ve ileum bölümleri arasında

farklarının kıyaslanmasında Mann-Whitney U-testi kullanıldı. İstatistiksel olarak

önemlilik p<0,05 şeklinde ifade edildi (Motulsky, 2003).

36

3. BULGULAR

3.1. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Asetilkolinin Etkisi

Deneylerde kontrol amacıyla kullanılan tüm kümülatif AK (10-9–10-4 M)

uygulamalarının hem duodenum hem de ileum dokusundaki kastırıcı etkileri en

yüksek kasılmayı veren değerlerin mg karşılığı olarak ortalaması Çizelge 3.1.’ de,

kümülatif AK derişim-cevap eğrilerinin Emax ve pD2 değerleri Çizelge 3.2.’ de

gösterildi. Rat duodenum ve ileum dokusunun kümülatif AK uygulamalarına verdiği

cevaplar Şekil 3.1. ve Şekil 3.2.’ de gösterildi.

Çizelge 3.1. Rat duodenumu ve ileumunda AK’ in kümülatif uygulanmasında en yüksek kasılmayı veren değerlerin mg olarak ortalaması. MADDE DOKU EN YÜKSEK KASILMA (mg ± SEM) N

Duodenum 2020 ± 54 74 Asetilkolin

(10-9 – 10-4 M) Ileum 2376 ± 82* 67

* İki bağırsak bölümü arasındaki fark istatistiksel olarak önemlidir (p<0,05).

Çizelge 3.2. Rat duodenumu ve ileumunda AK derişim-cevap eğrilerinin Emax ve pD2 değerleri. MADDE DOKU Emax ± SEM (%) pD2 ± SEM N

Duodenum 90,32 ± 1,14 6,292 ± 0,062 80 Asetilkolin

(10-9 – 10-4 M) Ileum 94,50 ± 0,91 6,101 ± 0,044 78

Elde edilen sonuçlara göre ileum dokusunda AK’ in kastırıcı etkisinin duodenum

dokusuna göre daha fazla olduğu ve bunun istatistiksel olarak anlamlı olduğu

(p<0,05) görüldü (Çizelge 3.1.). AK’ in kümülatif uygulaması sonucu rat

duodenumunda Emax ve pD2 değerleri sırasıyla 90,32 ± 1,14 ve 6,292 ± 0,062 olarak,

ileumda ise sırasıyla 94,50 ± 0,91 ve 6,101 ± 0,044 olarak bulundu (Çizelge 3.2.).

37

Şekil 3.1. Rat duodenumunda AK kümülatif derişim-cevapları.

Şekil 3.2. Rat ileumunda AK kümülatif derişim-cevapları.

38

3.2. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefonun Tek Başına Etkisi

Etefonun kümülatif olarak 10-10, 10-9, 10-8, 10-7 ve 10-6 M derişimlerde hem

duodenum hem de ileum dokusuna uygulanması sonucunda en yüksek kasılmayı

verdiği değerlerin mg olarak ortalaması Çizelge 3.3.’ de ve verdiği cevaplar ise Şekil

3.3.’ de gösterildi.

Çizelge 3.3. Rat duodenumu ve ileumunda tek başına ETF’ nin kastırıcı etkisi. MADDE DOKU EN YÜKSEK KASILMA (mg ± SEM) N

Duodenum 369 ± 92 11 Etefon

(10-10 – 10-6 M) Ileum 413 ± 63 10

İki bölüm arasındaki fark istatistiksel olarak önemsizdir.

ETF kümülatif (DUODENUM)

10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-50

20

40

60

80

100

120

Derişim (M)

Kasılm

a (%

)

ETF kümülatif (ILEUM)

10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-50

20

40

60

80

100

120

Derişim (M)

Kasılm

a (%

)

Şekil 3.3. Rat duodenumu ve ileumunda kümülatif ETF uygulama cevapları.

Elde edilen sonuçlara göre duodenum ve ileum dokusunda ETF’ nin en yüksek

kastırıcı etkileri arasındaki farkın istatistiksel olarak önemsiz olduğu görüldü

(Çizelge 3.3.). ETF’ nin kümülatif uygulaması (10-10-10-6 M) sonucu rat

duodenumunda ve ileumunda farklı derişimlerde spesifik kademeli derişim-cevabına

uygun olmayan kasılmalara sebep olduğu görüldü. Bu kasılmalarda derişime bağlı

kademeli bir artış olmadığından uygun Emax ve pD2 değerleri hesaplanamadı.

39

3.3. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefonun Asetilkolin ile Birlikte Etkisi

Etefon (10-10 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat duodenumunda pD2 ve Emax

değerleri Çizelge 3.4. ve Şekil 3.4.’ de gösterildi. ETF inkübasyonu yapılmamış

dokulara kıyasla, ETF (10-10 M) uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2

değerlerinde bir artış (sırasıyla 6,200 ± 0,128 ve 6,298 ± 0,118), Emax değerlerinde ise

bir azalma (sırasıyla 87,24 ± 2,14 ve 76,88 ± 5,81) belirlendi. Bu değişiklikler

istatistiksel olarak önemsizdi.

Çizelge 3.4. Rat duodenumunda ETF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi. Duodenum (n: 8) pD2 Emax (%)

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,200 ± 0,128 87,24 ± 2,14

Etefon (10-10 M)

+

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,298 ± 0,118 76,88 ± 5,81

Aynı sütundaki değerler arasındaki farklılıklar önemsizdir.

ETF (10-10 M) DUODENUM pD2

AK ETF (10-10 M) + AK0

1

2

3

4

5

6

7

ETF (10-10 M) DUODENUM Emax

AK ETF (10-10 M) + AK0

25

50

75

100

%

Şekil 3.4. Rat duodenumunda ETF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi.

40

Etefon (10-10 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat ileumunda pD2 ve Emax

değerleri Çizelge 3.5. ve Şekil 3.5.’ de gösterildi. ETF inkübasyonu yapılmamış

dokulara kıyasla, ETF (10-10 M) uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2

değerlerinde bir artış (sırasıyla 5,933 ± 0,162 ve 6,025 ± 0,130), Emax değerlerinde ise

bir azalma (sırasıyla 93,87 ± 2,57 ve 77,38 ± 8,34) belirlendi. Bu değişiklikler

istatistiksel olarak önemsizdi.

Çizelge 3.5. Rat ileumunda ETF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi. Ileum (n: 9) pD2 Emax (%)

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

5,933 ± 0,162 93,87 ± 2,57

Etefon (10-10 M)

+

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,025 ± 0,130 77,38 ± 8,34

Aynı sütundaki değerler arasındaki farklılıklar önemsizdir.

ETF (10-10 M) ILEUM pD2

AK ETF (10-10 M) + AK0

1

2

3

4

5

6

7

ETF (10-10 M) ILEUM Emax

AK ETF (10-10 M) + AK0

25

50

75

100

%

Şekil 3.5. Rat ileumunda ETF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi.

41

Etefon (10-7 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat duodenumunda pD2 ve Emax

değerleri Çizelge 3.6. ve Şekil 3.6.’ da gösterildi. ETF inkübasyonu yapılmamış

dokulara kıyasla, ETF (10-7 M) uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2

değerlerinde bir azalma (sırasıyla 6,340 ± 0,167 ve 6,330 ± 0,164), Emax değerlerinde

ise bir artış (sırasıyla 87,79 ± 2,80 ve 92,95 ± 4,31) belirlendi. Bu değişiklikler

istatistiksel olarak önemsizdi.

Çizelge 3.6. Rat duodenumunda ETF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi. Duodenum (n: 12) pD2 Emax (%)

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,340 ± 0,167 87,79 ± 2,80

Etefon (10-7 M)

+

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,330 ± 0,164 92,95 ± 4,31

Aynı sütundaki değerler arasındaki farklılıklar önemsizdir.

ETF (10-7 M) DUODENUM pD2

AK ETF (10-7 M) + AK0

1

2

3

4

5

6

7

ETF (10-7 M) DUODENUM Emax

AK ETF (10-7 M) + AK0

25

50

75

100

%

Şekil 3.6. Rat duodenumunda ETF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi.

42

Etefon (10-7 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat ileumunda pD2 ve Emax

değerleri Çizelge 3.7. ve Şekil 3.7.’ de gösterildi. ETF inkübasyonu yapılmamış

dokulara kıyasla, ETF (10-7 M) uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2

değerlerinde bir artış (sırasıyla 6,241 ± 0,165 ve 6,447 ± 0,160), Emax değerlerinde ise

bir azalma (sırasıyla 94,88 ± 2,34 ve 82,60 ± 4,15) belirlendi. Bu değişiklikler

istatistiksel olarak (p<0,05) önemliydi.

Çizelge 3.7. Rat ileumunda ETF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi. Ileum (n: 9) pD2 Emax (%)

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,241 ± 0,165 94,88 ± 2,34

Etefon (10-7 M)

+

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,447 ± 0,160* 82,60 ± 4,15*

* Aynı sütundaki değerler arasındaki fark önemlidir (p<0,05).

ETF (10-7 M) ILEUM pD2

AK ETF (10-7 M) + AK0

1

2

3

4

5

6

7 *

ETF (10-7 M) ILEUM Emax

AK ETF (10-7 M) + AK0

25

50

75

100

*

%

Şekil 3.7. Rat ileumunda ETF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi.

43

3.4. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Klorprifosun Tek Başına Etkisi

Klorprifosun kümülatif olarak 10-10, 10-9, 10-8, 10-7 ve 10-6 M derişimlerde hem

duodenum hem de ileum dokusuna uygulanması sonucunda en yüksek kasılmayı

verdiği değerlerin mg olarak ortalaması Çizelge 3.8.’ de ve verdiği cevaplar ise Şekil

3.8.’ de gösterildi.

Çizelge 3.8. Rat duodenumu ve ileumunda tek başına CPF’ nin kastırıcı etkisi. MADDE DOKU EN YÜKSEK KASILMA (mg ± SEM) N

Duodenum 434 ± 64 9 Klorprifos

(10-10 – 10-6 M) Ileum 461 ± 76 9

İki bölüm arasındaki fark istatistiksel olarak önemsizdir.

CPF kümülatif (DUODENUM)

10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-50

20

40

60

80

100

120

Derişim (M)

Kasılm

a (%

)

CPF kümülatif (ILEUM)

10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-50

20

40

60

80

100

120

Derişim (M)

Kasılm

a (%

)

Şekil 3.8. Rat duodenumu ve ileumunda kümülatif CPF uygulama cevapları.

Elde edilen sonuçlara göre duodenum ve ileum dokusunda CPF’ nin en yüksek

kastırıcı etkileri arasındaki farkın istatistiksel olarak önemsiz olduğu görüldü

(Çizelge 3.8.). CPF’ nin kümülatif uygulaması (10-10-10-6 M) sonucu rat

duodenumunda ve ileumunda farklı derişimlerde spesifik kademeli derişim-cevabına

uygun olmayan kasılmalara sebep olduğu görüldü. Bu kasılmalarda derişime bağlı

kademeli bir artış olmadığından uygun Emax ve pD2 değerleri hesaplanamadı.

44

3.5. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Klorprifosun Asetilkolin ile Birlikte

Etkisi

Klorprifos (10-10 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat duodenumunda pD2 ve

Emax değerleri Çizelge 3.9. ve Şekil 3.9.’ da gösterildi. CPF inkübasyonu yapılmamış

dokulara kıyasla, CPF (10-10 M) uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2

değerlerinde bir artış (sırasıyla 6,243 ± 0,140 ve 6,252 ± 0,154), Emax değerlerinde ise

bir azalma (91,16 ± 3,30 ve 82,47 ± 2,38) belirlendi. Bu değişiklikler istatistiksel

olarak önemsizdi.

Çizelge 3.9. Rat duodenumunda CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi. Duodenum (n: 10) pD2 Emax (%)

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,243 ± 0,140 91,16 ± 3,30

Klorprifos (10-10 M)

+

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,252 ± 0,154 82,47 ± 2,38

Aynı sütundaki değerler arasındaki farklılıklar önemsizdir.

CPF (10-10 M) DUODENUM pD2

AK CPF (10-10 M) + AK0

1

2

3

4

5

6

7

CPF (10-10 M) DUODENUM Emax

AK CPF (10-10 M) + AK0

25

50

75

100

%

Şekil 3.9. Rat duodenumunda CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi.

45

Klorprifos (10-10 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat ileumunda pD2 ve Emax

değerleri Çizelge 3.10. ve Şekil 3.10.’ da gösterildi. CPF inkübasyonu yapılmamış

dokulara kıyasla, CPF (10-10 M) uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2

değerlerinde bir artış (sırasıyla 6,031 ± 0,150 ve 6,118 ± 0,165) belirlendi. Bu artış

istatistiksel olarak önemsizdi. Emax değerlerinde ise bir azalma (sırasıyla 94,27 ± 2,90

ve 85,76 ± 2,79) belirlendi. Bu azalma istatistiksel olarak (p<0,05) önemliydi.

Çizelge 3.10. Rat ileumunda CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi. Ileum (n: 10) pD2 Emax (%)

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,031 ± 0,150 94,27 ± 2,90

Klorprifos (10-10 M)

+

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,118 ± 0,165 85,76 ± 2,79*

* Aynı sütundaki değerler arasındaki fark önemlidir (p<0,05).

CPF (10-10 M) ILEUM pD2

AK CPF (10-10 M) + AK0

1

2

3

4

5

6

7

CPF (10-10 M) ILEUM Emax

AK CPF (10-10 M) + AK0

25

50

75

100

*

%

Şekil 3.10. Rat ileumunda CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi.

46

Klorprifos (10-7 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat duodenumunda pD2 ve

Emax değerleri Çizelge 3.11. ve Şekil 3.11.’ de gösterildi. CPF inkübasyonu

yapılmamış dokulara kıyasla, CPF (10-7 M) uygulaması yapılan dokularda AK’ nin

pD2 ve Emax değerlerinde bir artış (pD2 sırasıyla 6,471 ± 0,074 ve 6,625 ± 0,145 ve

Emax sırasıyla 88,09 ± 2,03 ve 96,59 ± 4,06) belirlendi. Bu değişiklikler istatistiksel

olarak önemsizdi.

Çizelge 3.11. Rat duodenumunda CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi. Duodenum (n: 13) pD2 Emax (%)

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,471 ± 0,074 88,09 ± 2,03

Klorprifos (10-7 M)

+

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,625 ± 0,145 96,59 ± 4,06

Aynı sütundaki değerler arasındaki farklılıklar önemsizdir.

CPF (10-7 M) DUODENUM pD2

AK CPF (10-7 M) + AK0

1

2

3

4

5

6

7

CPF (10-7 M) DUODENUM Emax

AK CPF (10-7 M) + AK0

25

50

75

100

125

%

Şekil 3.11. Rat duodenumunda CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi.

47

Klorprifos (10-7 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat ileumunda pD2 ve Emax

değerleri Çizelge 3.12. ve Şekil 3.12.’ de gösterildi. CPF inkübasyonu yapılmamış

dokulara kıyasla, CPF (10-7 M) uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2

değerlerinde bir artış (sırasıyla 6,210 ± 0,070 ve 6,575 ± 0,236), Emax değerlerinde ise

bir azalma (sırasıyla 94,58 ± 2,48 ve 86,26 ± 4,36) belirlendi. Bu değişiklikler

istatistiksel olarak (p<0,05) önemliydi.

Çizelge 3.12. Rat ileumunda CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi. Ileum (n: 15) pD2 Emax (%)

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,210 ± 0,070 94,58 ± 2,48

Klorprifos (10-7 M)

+

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,575 ± 0,236* 86,26 ± 4,36*

* Aynı sütundaki değerler arasındaki fark önemlidir (p<0,05).

CPF (10-7 M) ILEUM pD2

AK CPF (10-7 M) + AK0

1

2

3

4

5

6

7 *CPF (10-7 M) ILEUM Emax

AK CPF (10-7 M) + AK0

25

50

75

100 *

%

Şekil 3.12. Rat ileumunda CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi.

48

3.6. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefon ve Klorprifosun Bir Aradaki

Etkileri

Etefon (10-10 M)+Klorprifos (10-10 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat

duodenumunda pD2 ve Emax değerleri Çizelge 3.13. ve Şekil 3.13.’ de gösterildi.

ETF+CPF inkübasyonu yapılmamış dokulara kıyasla, ETF (10-10 M)+CPF (10-10 M)

uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2 değerlerinde bir artış (sırasıyla 6,073 ±

0,045 ve 6,200 ± 0,055) belirlendi. Bu artış istatistiksel olarak (p<0,05) önemliydi.

Emax değerlerinde ise bir azalma (sırasıyla 91,17 ± 1,91 ve 80,15 ± 4,54) belirlendi.

Bu azalma istatistiksel olarak önemsizdi.

Çizelge 3.13. Rat duodenumunda ETF+CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi. Duodenum (n: 11) pD2 Emax (%)

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,073 ± 0,045 91,17 ± 1,91

Klorprifos+Etefon (10-10 M)

+

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,200 ± 0,055* 80,15 ± 4,54

* Aynı sütundaki değerler arasındaki fark önemlidir (p<0,05).

ETF+CPF (10-10 M) DUODENUM pD2

AK ETF+CPF (10-10 M) + AK0

1

2

3

4

5

6

7*

ETF+CPF (10-10 M) DUODENUM Emax

AK ETF+CPF (10-10 M) + AK0

25

50

75

100

%

Şekil 3.13. Rat duodenumunda ETF+CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi.

49

Etefon (10-10 M)+Klorprifos (10-10 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat

ileumunda pD2 ve Emax değerleri Çizelge 3.14. ve Şekil 3.14.’ de gösterildi.

ETF+CPF inkübasyonu yapılmamış dokulara kıyasla, ETF (10-10 M)+CPF (10-10 M)

uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2 değerlerinde bir artış (sırasıyla 5,990 ±

0,085 ve 6,104 ± 0,112) belirlendi. Bu artış istatistiksel olarak önemsizdi. Emax

değerlerinde ise bir azalma (94,90 ± 3,14 ve 81,56 ± 4,11) belirlendi. Bu azalma

istatistiksel olarak (p<0,05) önemliydi.

Çizelge 3.14. Rat ileumunda ETF+CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi Ileum (n: 9) pD2 Emax (%)

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

5,990 ± 0,085 94,90 ± 3,14

Klorprifos+Etefon (10-10 M)

+

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,104 ± 0,112 81,56 ± 4,11*

* Aynı sütundaki değerler arasındaki fark önemlidir (p<0,05).

ETF+CPF (10-10 M) ILEUM pD2

AK ETF+CPF (10-10 M) + AK0

1

2

3

4

5

6

7

ETF+CPF (10-10 M) ILEUM Emax

AK ETF+CPF (10-10 M) + AK0

25

50

75

100

*

%

Şekil 3.14. Rat ileumunda ETF+CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi.

50

Etefon (10-7 M)+Klorprifos (10-7 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat

duodenumunda pD2 ve Emax değerleri Çizelge 3.15. ve Şekil 3.15.’ de gösterildi.

ETF+CPF inkübasyonu yapılmamış dokulara kıyasla, ETF (10-7 M)+CPF (10-7 M)

uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2 değerlerinde bir azalma (sırasıyla 6,398

± 0,085 ve 6,363 ± 0,120) belirlendi. Bu azalma istatistiksel olarak önemsizdi. Emax

değerlerinde de bir azalma (sırasıyla 92,72 ± 1,71 ve 81,90 ± 4,35) belirlendi. Ancak

bu azalma istatistiksel olarak (p<0,05) önemliydi.

Çizelge 3.15. Rat duodenumunda ETF+CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi. Duodenum (n: 16) pD2 Emax (%)

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,398 ± 0,085 92,72 ± 1,71

Klorprifos+Etefon (10-7 M)

+

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,363 ± 0,120 81,90 ± 4,35*

* Aynı sütundaki değerler arasındaki fark önemlidir (p<0,05).

ETF+CPF (10-7 M) DUODENUM pD2

AK ETF+CPF (10-7 M) + AK0

1

2

3

4

5

6

7

ETF+CPF (10-7 M) DUODENUM Emax

AK ETF+CPF (10-7 M) + AK0

25

50

75

100

*

%

Şekil 3.15. Rat duodenumunda ETF+CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi.

51

Etefon (10-7 M)+Klorprifos (10-7 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat

ileumunda pD2 ve Emax değerleri Çizelge 3.16. ve Şekil 3.16.’ da gösterildi.

ETF+CPF inkübasyonu yapılmamış dokulara kıyasla, ETF (10-7 M)+CPF (10-7 M)

uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2 değerlerinde bir artış (sırasıyla 6,164 ±

0,065 ve 6,247 ± 0,069), Emax değerlerinde ise bir azalma (93,76 ± 1,52 ve 86,25 ±

3,67) belirlendi. Bu değişiklikler istatistiksel olarak (p<0,05) önemliydi.

Çizelge 3.16. Rat ileumunda ETF+CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi . Ileum (n: 19) pD2 Emax (%)

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,164 ± 0,065 93,76 ± 1,52

Klorprifos+Etefon (10-7 M)

+

Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)

6,247 ± 0,069* 86,25 ± 3,67*

* Aynı sütundaki değerler arasındaki fark önemlidir (p<0,05).

ETF+CPF (10-7 M) ILEUM pD2

AK ETF+CPF (10-7 M) + AK0

1

2

3

4

5

6

7 *

ETF+CPF (10-7 M) ILEUM Emax

AK ETF+CPF (10-7 M) + AK0

25

50

75

100 *

%

Şekil 3.16. Rat ileumunda ETF+CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi.

52

3.7. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Yapılan Diğer Denemelerin Bulguları

3.7.1. Bağırsak Ortamının Enzimatik Etkinliği (AKE)

Bağırsak ortamının enzimatik etkinliğinin (AKE) uygunluğunun test edilmesi

amacıyla fizostigminin 10-7 ve 3x10-7 M derişimlerde duodenum ve ileum dokusuna

uygulandıktan sonra özellikle 3x10-7 M derişimde fizostigminin dolaylı AKE

inhibitörü etkisi belirgin şekilde gözlemlendi. Dokuda enzimatik etkinlik, AKE

enzim inhibisyonu sonucu özellikle 3x10-7 M derişimde hem duodenum hem de

ileum dokusunda, 10-7 M derişime göre belirgin şekilde kasılma artışı olmasıyla

doğrulandı. Rat duodenum ve ileum dokusunun fizostigminin 10-7 M derişimine

verdiği cevaplar sırasıyla Şekil 3.17. ve Şekil 3.18.’ de ve 3x10-7 M derişimine

verdiği cevaplar sırasıyla Şekil 3.19. ve Şekil 3.20.’ de gösterildi.

53

Şekil 3.17. Rat duodenumunda 10-7 M fizostigminin yanıtı.

Şekil 3.18. Rat ileumunda 10-7 M fizostigminin yanıtı.

54

Şekil 3.19. Rat duodenumunda 3x10-7 M fizostigminin yanıtı.

Şekil 3.20. Rat ileumunda 3x10-7 M fizostigminin yanıtı.

55

3.7.2. Çözücünün Dokular Üzerine Etkinliği

Klorprifosun çözücüsü olarak kullanılan aseton inkübasyonunun AK’ nin pD2 ve

Emax değerlerine etkisi Çizelge 3.17.’ de gösterildi. Aseton (10-7 M) inkübasyonu

yapılmamış dokulara kıyasla, aseton uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2

değerlerinde (duodenum için sırasıyla 6,425 ± 0,075 ve 6,486 ± 0,105 ve ileum için

sırasıyla 6,062 ± 0,054 ve 6,186 ± 0,113) bir artış, Emax değerlerinde ise (duodenum

için sırasıyla 91,28 ± 2,84 ve 87,69 ± 9,43 ve ileum için sırasıyla 97,29 ± 3,97 ve

95,30 ± 7,17) bir azalma tespit edildi. Bu değişiklikler istatistiksel olarak önemsizdi.

Çizelge 3.17. Rat bağırsağında asetonun AK üzerine etkisi. DOKU MADDE pD2 Emax (%) N

AK (10-9-10-4 M)

6,425 ± 0,075 91,28 ± 2,84 5 Duodenum

Aseton (10-7 M)

+ AK (10-9-10-4 M)

6,486 ± 0,105 87,69 ± 9,43 5

AK (10-9-10-4 M)

6,062 ± 0,054 97,29 ± 3,97 6 İleum

Aseton (10-7 M)

+ AK (10-9-10-4 M)

6,186 ± 0,113 95,30 ± 7,17 6

Aynı sütundaki değerler arasındaki farklar önemsizdir.

Elde edilen bu sonuçlardan, klorprifosu çözdürmek amacıyla kullanılan asetonun

AK’ nin pD2 ve Emax değerlerine istatistiksel olarak önemli bir etkisinin olmadığı,

dolayısıyla rat bağırsağında AK uygulamalarının asetondan etkilenmediği görüldü

(Çizelge 3.17.).

56

4. TARTIŞMA

Bu çalışmada, zehirli etkilerini esteraz enzimini baskılayarak gösteren bir pestisid

olan klorprifos ile bitki gelişim düzenleyicisi olan etefonun bir aradaki etkileri rat

duodenumu ve ileumunda in vitro koşullarda araştırıldı.

Rat duodenum dokusunda 10-10 M derişiminde ETF veya CPF inkübasyonu, AK ile

elde edilen derişim-cevap eğrilerinin pD2 ve Emax değerlerinde (Çizelge 3.4. ve 3.9.)

istatistiksel olarak önemli olmayan değişikliklere sebep oldu. Bunun sebebi olarak,

ETF veya CPF’ nin uygulanan derişiminin (10-10 M) dokuda AK ile oluşturulan

derişim-cevap eğrisinin pD2 ve Emax değerlerine etkimede yetersiz kaldığı veya bu

durumun duodenumun kastırıcı etkisinin zayıflığından (Çizelge 3.1.) kaynaklandığı

söylenebilir.

Rat duodenum dokusunda 10-10 M derişiminde olduğu gibi, 10-7 M derişiminde ETF

veya CPF inkübasyonunda da, AK ile elde edilen derişim-cevap eğrilerinin pD2 ve

Emax değerlerinde (Çizelge 3.6. ve Çizelge 3.11.) istatistiksel önemde olmayan

değişiklikler görülmüştür. Burada 10-7 M derişimin de AK ile oluşturulan derişim-

cevap eğrisinin pD2 ve Emax değerlerine etkimede yetersiz kalması ve 10-10 M

derişimindeki gibi benzer sonuçların ortaya çıkması, bu durumun daha çok

duodenumun özelliğinden ileri geldiğini düşündürmektedir. Biyolojik sistemlerde

etkili olabilmeleri için CPF’ nin, CPF-oksona (Cook ve Shenoy, 2003) ve ETF’ nin,

fosfata (fosforile edici etkilerini ortaya koymaları için) dönüşmesi gerekmektedir

(Segall ve ark., 1991). AK ile oluşturulan cevaplar üzerinde bu maddelerin

etkilerinin zayıf görülmesi duodenumda yeterince etkili formlarına

dönüşmemesinden de kaynaklanıyor olabilir.

Rat ileum dokusunda 10-10 M derişimde ETF inkübasyonu, duodenumda olduğu gibi

AK’ nin derişim-cevap eğrilerinin pD2 ve Emax değerlerinde (Çizelge 3.5.) anlamlı

değişikliklere sebep olmazken, CPF (10-10 M) inkübasyonu AK’ nin derişim-cevap

57

eğrilerinin sadece Emax değerlerinde anlamlı bir azalmaya (p<0,05) (Çizelge 3.10.)

sebep olmuştur. Bu durum, CPF’ nin bifazik etkisi ile açıklanabilir; CPF ile ilgili

literatür bilgilerde etkisini asetilkolinesteraz baskılanması ve kolinerjik reseptörlere

bağlanma üzerinden gösterdiği belirtilmektedir. Yapılan bu araştırmada CPF’ nin

maksimum kastırıcı etkisinin AK’ nin maksimum kastırıcı etkisinden daha düşük

olduğu gözlenmiştir. Dolayısıyla, CPF ile önceden yapılan inkübasyon reseptörlerin

bu madde tarafından işgaline ve reseptör sayısında azalmaya sebep olduğundan AK’

nin yeterli reseptöre bağlanamaması ve beklenen kastırıcı etkiyi gösterememesine

neden olmuştur. Maksimum kastırıcı etkisi CPF’ de olduğu gibi AK’ den daha düşük

olan ETF’ de bu durumun görülememe sebebi, bu iki madde arasındaki reseptörlere

karşı gösterilen afinite farkı, kimyasal maddenin etkinliğini değiştirebilen fiziko-

kimyasal farklılıklar olabilir (Gordon ve ark., 2006).

Rat ileum dokusunda 10-7 M derişimde ETF veya CPF inkübasyonu, AK’ nin

derişim-cevap eğrilerinin pD2 ve Emax değerlerinde (Çizelge 3.7. ve Çizelge 3.12.)

anlamlı değişikliklere sebep oldu. Çizelge 3.7. ve Çizelge 3.12.’ de de görüldüğü gibi

ETF veya CPF 10-7 M derişimiyle inkübasyon, AK ile elde edilen derişim-cevap

eğrilerinin pD2 değerlerinde istatistiksel olarak önemli bir artışa (p<0,05) ve Emax

değerlerinde ise istatistiksel olarak önemli bir azalmaya (p<0,05) sebep oldu. Bu

durum, ETF veya CPF inkübasyonunun AK’ nin etki gücünü artırdığını, maksimum

etkisini ise azalttığını göstermektedir. Sonuçlara göre ETF veya CPF inkübasyonuna

bağlı olarak dokuda bir duyarlılık gelişmiş olduğu düşünülebilir; aslında bir enzim

inhibitörü olan ETF ve CPF hem doğrudan reseptörlere bağlanarak ve hem de dolaylı

yoldan AKE’ yi inhibe ederek sinaps aralığında AK biriktirmesi ile, inkübasyon

süresi sonunda ortama ilave edilen AK’ nin de reseptörlere bağlanmasıyla daha

düşük derişimde ve erken kasılmaya sebep olmakta veya kanallar düzeyinde

değişikliklere sebep olarak duyarlılığı artırmaktadır. Kolin esterlerinin etki gücünün

artışına neden olan benzer nitelikte araştırmalar bulunmaktadır. Farelerde OF

pestisidler ile oluşan BKE inhibisyonunun ve süksinilkolin toksisitesinin

güçlenmesinin araştırıldığı bir çalışmada, ETF periton içi olarak (200 mg/kg, 1 saat)

farelere uygulandığında, süksinilkolinin LD50 değerini kontroldeki 2,4 mg/kg’ dan

0,59 mg/kg’ a düşürdüğü, bunun da toksisitedeki 4-kat artışı gösterdiği

58

belirtilmektedir. Serum BKE aktivitesisinin 1 saat ETF uygulaması ile % 77-94

inhibe olduğu, farelerin süksinilkolin toksisitesine daha duyarlı hale geldiği

kaydedilmektedir (Sparks ve ark., 1999).

Muskarinik reseptörlerle etkinleştirilen bağırsak fonksiyonlarının AK’ ye kontraktil

cevaplarının değerlendirildiği ve ratların jejunum ve kolonlarında çalışıldığı bir

araştırmada, M3 muskarinik alt-tiplerin öncelikli olarak AK-ile oluşturulan

kasılmalarda etkili olmasına rağmen diğer alt-tiplerin de bağırsakta bazı diğer

fizyolojik rollerde görev alabildiği, M1 reseptörlerin ise mukozal iyon transportu ve

düz kas katmanında AK salınımının düzenlenmesinden sorumlu olduğu

belirtilmektedir (Tezuka ve ark., 2004).

ETF veya CPF (10-7 M) inkübasyonu ile AK’ nin Emax değerinde görülen düşmenin

sebebi, ileumda 10-10 M CPF ile inkübasyonu takiben AK uygulamasından elde

edilen sonucun açıklamasında olduğu gibi, ETF veya CPF’ nin reseptör sayısında

azalmaya (down-regülasyon) neden olması, mevcut reseptörlerin çoğunun ise

maksimum etkisi AK’ den daha düşük olan ETF (Çizelge 3.1. ve Çizelge 3.3.) veya

CPF (Çizelge 3.1. ve Çizelge 3.8.) tarafından işgal edilmesi olabilir.

Klorprifosa mesleki olmayan maruziyetlerden kaynaklanan risklerin değerlendirildiği

bir makalede, tek veya tekrarlanan CPF uygulamalarında oluşan çok yönlü

cevapların, AK reseptörlerinin down-regülasyonu ve AK sentezinde azalmayla ilgili

olduğu, böylelikle AK’ in presinaptik salınımının kısıtlandığı belirtilmektedir

(Cochran, 2002). Bu araştırmanın sonuçları da Cochran (2002)’ nin ifadeleriyle

örtüşmektedir.

Bazı kolinesteraz inhibitörlerinin kolinerjik reseptörlerle etkileştiği yıllardır

bilinmektedir. Pope ve ark. (2005) tarafından derlenen kolinesteraz inhibitörleriyle

yapılan çalışmalara dayalı bir makalede, rat striatumunda paraokson, malaokson ve

CPF-oksonun, sub-mikromolar derişimlerde derişime-bağlı bir şekilde [3H]cis-

dioksolan (CD) bağlanmasını inhibe ettiği (CPF-okson>paraokson>malaokson)

59

belirtilmektedir. Ayrıca CPF-okson, paraokson ve metil-paraoksonun

[3H]oksotremorin-M’ nin rat kardiak membran muskarinik reseptörlerine bağlanma

yerini değiştirdiği ve en güçlü şekilde etkiyenin 7 nM’ lık IC50 değeriyle CPF-okson

olduğu vurgulanmaktadır. Dolayısıyla bu araştırma sonucu, söz konusu maddelerin

(CPF de dahil) sadece enzim inhibisyonu ile değil, doğrudan reseptöre bağlanarak da

etkidiklerini göstermektedir.

Rat duodenumunda ETF ve CPF’ nin bir arada 10-10 M derişimde uygulanması AK

ile oluşturulan derişim-cevap eğrilerinin pD2 değerinde istatistiksel olarak anlamlı bir

artışa (p<0,05) sebep olurken, Emax değerinde oluşan azalma istatistiksel olarak

önemsizdi (Çizelge 3.13.). Bu durum kombinasyonun duodenumda 10-10 M

derişiminin AK’ in etki gücünde anlamlı artışa sebep olduğunu ancak maksimum

etkisini değiştiremediğini göstermektedir. İki maddenin 10-10 M derişimde tek

başlarına uygulanması duodenumda anlamlı değişikliklere sebep olmazken (Çizelge

3.4. ve Çizelge 3.9), kombinasyonda iki maddenin varlığına bağlı ilaç yoğunluğunun

artması, daha fazla reseptör işgali, enzim baskılanması ve sinaptik aralıkta AK

birikmesi ile duodenumda doku duyarlılığını artırmıştır. İlave AK uygulaması ile

dokuda daha çabuk etki açığa çıkmıştır. Her iki maddenin bir arada bulunması AK’

nin Emax değerini istatistiksel olarak önemli olmasa da düşürmüştür. Düşüşün çok

belirgin olmaması doku farkından ileri gelebilir.

Rat duodenumunda ETF ve CPF’ nin bir arada 10-7 M derişimde uygulanması ile AK

derişim-cevap eğrilerinin pD2 değerinde anlamlı bir değişiklik gözlenmezken, Emax

değerinde istatistiksel olarak anlamlı bir azalma (p<0,05) görüldü (Çizelge 3.15.). Bu

durum her iki maddenin yoğunluğunun artmasıyla hedefledikleri aynı reseptör ve

enzime bağlanma noktalarına veya kendileri ile ilgili biyoaktivasyon noktalarına

yarışmalarıyla birbirlerinin etkisini zayıflatmaları şeklinde açıklanabilir. Her iki

maddenin daha yoğun varlığına bağlı olarak daha güçlü şekilde görülen down-

regülasyon sonucu AK’ nin Emax değeri daha da belirgin olarak düşmüştür. Karanth

ve ark. (2004), tarafından ratlarda yapılan bir araştırmada oksonlarına dönüşerek

etkili olan CPF ve MPS’ nin eş zamanlı uygulanmasında görülen düşük toksisitenin

60

nedeninin her iki maddenin biyoaktivasyon noktaları için yarışması olarak

yorumlanmıştır.

Duodenumdaki cevapların aksine (10-10 M) rat ileumunda ise, ETF ve CPF’ nin bir

arada 10-10 M derişimde uygulanması ile AK derişim-cevap eğrilerinin pD2

değerinde oluşan artış istatistiksel olarak önemsizken, Emax değerinde istatistiksel

olarak anlamlı bir azalmaya (p<0,05) sebep oldu (Çizelge 3.14.). Bu azalma, tek

başına 10-10 M CPF kontrolüne göre, AK’ nin Emax değerinde sebep olduğu

azalmadan (Çizelge 3.10.) daha fazlaydı. Bu da, her iki maddenin bir aradayken

dokuya bağlı olarak AK’ nin maksimum etkinliğini, tek başlarına yaptıklarından

daha fazla düşürdüklerini (down-regülasyon olayının daha da güçlendiğini)

göstermektedir.

Rat ileumunda ETF ve CPF’ nin bir arada 10-7 M derişimde uygulanması, tek başına

uygulandıklarındakine benzer şekilde AK ile oluşturulan derişim-cevap eğrilerinin

pD2 değerinde istatistiksel olarak anlamlı bir artışa ve Emax değerinde anlamlı bir

azalmaya sebep oldu (p<0,05) (Çizelge 3.16.). Diğer bir ifadeyle ETF ve CPF’ nin

bir arada (10-7 M) kullanılması ileumda AK’ nin etki gücünü arttırırken maksimum

etkisini azalttı. Duodenumda aynı derişimlerde pD2 değerinde anlamlı bir değişiklik

olmazken ileumda görülmesi, ilaçların etkinliğinde doku farklılığının önemli

olabileceğini düşündürmektedir. Ancak ileumda 10-7 M derişimde kombinasyondan

elde edilen sonuçlar tek başlarına olanlara göre çok fazla fark göstermemiştir. Bu

durum aynı derişimlerde duodenumda elde edilen sonuca benzerlik göstermektedir;

her iki maddenin yoğunluğunun artmasıyla hedefledikleri aynı reseptör ve enzime

bağlanma noktalarına veya kendileri ile ilgili biyoaktivasyon noktalarına

yarışmalarıyla birbirlerinin etkisini zayıflatmışlardır.

Kombinasyonlar üzerine yapılan benzer araştırmalarda ikili karışımların etki gücünü

aynı veya zıt yönde değiştirebileceğine yönelik bilgiler bulunmaktadır (Karanth ve

ark., 2004). Okson formuna dönüşerek etkisini gösteren organik fosforlu

bileşiklerden CPF ve paratiyonun ikili karışımının ratlardaki etkileşim eşiğini

61

belirlemek amacıyla yapılan fizyolojik esaslı farmakokinetik modele dayalı bir

çalışmada, her kimyasalın 0,08 mg/kg’ dan düşük oral doz düzeylerinin aditif etkiye,

yüksek dozlarının ise yarışmalı enzim inhibisyonuna bağlı antagonizmaya neden

olduğu bildirilmektedir (El-Masri ve ark., 2004). CPF ve DZN ikili karışımı üzerine

ratlarda yapılan diğer bir araştırmada ise CPF/DZN kombinasyonun doza-bağımlı

olarak ve kolinesteraz inhibisyonu ile tek CPF ve tek DZN’ ye göre daha güçlü

toplam nispi etki gücüne neden olduğu bildirilmiştir (Timchalk ve ark., 2005).

Rat ileumunda ETF ve CPF ile inkübasyon neticesinde AK’ nin Emax değerinde

görülen devamlı ve güçlü düşüş, AK’ nin bağlanabileceği reseptör sayısındaki

azalmaya (down-regülasyon) bağlı bir etki olarak açıklanabilir. Elde edilen sonuçlar

Becerra ve ark. (2001)’ nın bir Alzheimer ilacı olan THA’ nın AK üzerine etkisini

belirlemek amacıyla yaptıkları araştırmadaki sonuçlara benzerlik göstermektedir. Söz

konusu araştırmada elde edilen sonuçlara göre THA’ nın hem antikolinerjik hem de

muskarinik reseptör blokajına bağlı bifazik etkisinin olduğu ve THA gibi

kolinesteraz inhibitörlerinin uzun süre uygulanması neticesinde muskarinik reseptör

sayısında azalmanın görüldüğü ve THA’ nın seçici şekilde down-regülasyon yaptığı

bildirilmiştir.

Sonuçta araştırmada kullanılan iki maddeye (Etefon+Klorprifos) bir arada maruz

kalınması AK’ nin etki gücü bakımından aynı yönde etkileşime neden olurken, Emax

yönünde zayıflamaya yol açmıştır. Bu sonuç, dolaylı kolinerjik etkili bu iki kimyasal

maddeye beraber maruziyetin daha düşük dozlarda ve daha erken kolinerjik klinik

cevapların gelişmesine sebep olabileceğini, ancak toksikasyonun şiddetinin daha

zayıf olacağını göstermektedir. Emax’ da görülen düşüş söz konusu kimyasal

maddelere maruz kalan canlılar yönünden olumlu olarak düşünülse de benzer

nitelikli fakat efikasitesi daha güçlü diğer kimyasal maddelerin devreye girmesi ile

durumun daha da kötüleşebileceğini de akla getirmelidir. Nitekim Cochran (2002)

tarafından CPF üzerine yapılan bir makalede CPF’ nin beyin AKE aktivitesinde %

70 oranında bir düşüşe neden olmasına rağmen, hem AK reseptörlerinde down-

regülasyonu ve hem de AK sentezini azaltmasına bağlı olarak klinik belirtilere veya

motor aktivite ve davranışlarda değişikliklere neden olmadığı bildirilmektedir.

62

Ancak, deney hayvanları üzerinden yapılan değerlendirmelerde bu kadar yüksek

düzeyde beyin AKE blokajının hayvanda klinik belirtilere neden olmasa da çevresel

şartlara cevap verme yeteneğinde belirgin bir azalmaya neden olacağını, bunun da

önemli bir yan etki olarak değerlendirileceği vurgulanmaktadır.

63

5. SONUÇ VE ÖNERİLER

Zehirliliklerini etkili formlarına dönüşerek, AKE enzimini baskılama ve kolinerjik

reseptörlere bağlanma yoluyla gösteren biri pest mücadelesinde, diğeri de bitki

gelişim düzenleyicisi olarak kullanılan klorprifos ve etefonun bir aradaki etkilerinin

ortaya konması amacıyla yapılan bu in vitro araştırmada kullanılan iki maddeye

(Etefon+Klorprifos) bir arada maruz kalınması asetilkolinin etki gücü bakımından

aynı yönde etkileşime neden olurken, Emax yönünde zayıflamaya yol açmıştır.

Elde edilen sonuçlar ETF ve CPF’ nin bir arada uygulanmasının, uygulanan derişime

ve doku tipine bağlı olarak tek başlarına olana göre etkilerini daha da artırdığını

göstermektedir. Ayrıca, bu iki maddeye aynı anda maruz kalınması daha düşük

dozlarda ve erken gelişen bir toksik etkiye neden olacaktır. Ancak, etki nicelik olarak

daha da zayıflayacaktır. Nicelik olarak bu zayıflama ilk anda olumlu olarak

algılanmakla birlikte, asetilkoline göre daha zayıf kastırıcı etkiye sahip olan bu iki

madde tarafından asetilkolin reseptörlerinin önceden işgal edilmesiyle asetilkolinin

bağlanacak reseptör sayısının azalması sonucunda geliştiği için bu değerlendirme

yanıltıcı olabilir. Zira bu maddeler aynı zamanda etkilerini esterazları bloke ederek

de göstermektedirler. Dolayısıyla bu maddelere bağlı yüksek düzeydeki enzim

baskılanması, ortama etki gücü ve maksimum etki bakımından daha güçlü ve benzer

etkili diğer maddelerin girmesiyle beklenmedik şekilde istenmeyen etkilerin veya

zehirlenmelerin gelişmesine neden olabilir. Ayrıca, bu şekildeki yüksek düzeyde

enzim baskılanması klinik bozukluğa neden olmasa da fizyolojik fonksiyonlarda

bozulmaya ve dış etkilere cevapta sorunlara da yol açabilir.

Günümüze kadar yapılan çalışmaların çoğu, maddelerin tek başlarına yaptıkları

istenmeyen etkilerine yöneliktir. Oysa canlılar sürekli eş zamanlı olarak çok sayıda

pestiside değişik yollarla maruz kalmaktadır. Vücuda giren bu maddeler bir arada

oldukça karmaşık etkilere yol açabilir; benzer veya farklı mekanizmalarla etkiseler

bile in vivo koşullarda aralarında aynı veya zıt etkileşimler görülebilir. Etkileşimin

64

tipi ne olursa olsun sonuçta vücuda giren çok sayıdaki yabancı maddeler doğal

fizyolojik yolakları bozarak canlılarda basit istenmeyen etkilerden mutasyon veya

kanserojen etkilere kadar giden bir dizi sağlık problemine yol açar. Günümüzde

ulusal ve uluslar arası sağlık kuruluşları bu istenmeyen etkileri azaltabilmek için

genellikle tek başlarına maddeler üzerinden tolerans düzeyleri belirlemektedir.

Araştırmadan elde edilen veriler ve benzer çalışmalar ışığında, bu değerlendirmelerin

yeterli olamayacağı görülmektedir. Bu nedenle en azından bir arada maruz kalınma

olasılığı fazla olan maddeler üzerinden kombinasyona bağlı değerlendirilmelerin de

yapılması ileride karşılaşılabilecek istenmeyen etkileri önleme bakımından yararlı

olacaktır.

65

ÖZET

Etefon ile Klorprifos etil’ in Tek ve Bir Arada Etkilerinin Rat Bağırsak Kasında in Vitro Olarak Araştırılması

Bu araştırmada, Türkiye’ de ve dünyada geniş kullanım alanı olan organik fosforlu pestisid klorprifos ve bitki gelişim düzenleyicisi etefona bir arada maruz kalınması durumunda olası etkileşimlerin ortaya konulması amaçlandı.

Çalışmada, 42 adet Wistar Albino soyu 3 aylık erkek rattan alınan ince bağırsak düz kası (duodenum ve ileum) kullanıldı. Yaklaşık 1 cm uzunluğundaki ince bağırsak segmentine, 10 ml Tyrode çözeltisi içeren izole organ banyosunda 1 gram gerim uygulanarak çalışıldı. Duodenum ve ileum dokusunda, asetilkolin (AK) (10-9–10-4 M), etefon (ETF) (10-10–10-6 M) veya klorprifos (CPF) (10-10–10-6 M) kümülatif derişimlerde uygulanarak tek başlarına doku üzerindeki etkileri değerlendirildi. Ayrıca Etefon ve Klorprifos tek başlarına ve bir arada 10-7 M ve 10-10 M derişimlerde inkübe edilerek asetilkolinin kümülatif derişim cevap eğrisi üzerine etkileri çalışıldı. Dokuların enzimatik etkinliğinin test edilmesi amacıyla fizostigmin uygulaması yapıldı.

Araştırmada elde edilen veriler, klorprifos ve etefonun bir arada kullanılmasının uygulanan derişime ve doku tipine bağlı olarak farklı sonuçlar verdiğini gösterdi; her iki maddenin bir arada 10-7 M derişiminde rat ileumunda hem pD2 ve hem de Emax değerlerinde istatistiksel olarak asetilkolin kontrole göre önemli farklılıklar alınmakla birlikte, tek başlarına olana göre kombinasyondaki farklar çok belirgin değildi. Oysa aynı dokuda bu maddelerin bir arada (Kombinasyon Emax değeri AK: 94,90 ± 3,14, ETF+CPF+AK: 81,56 ± 4,11) daha düşük yoğunlukta uygulanması (10-10 M) özellikle klorprifosun tek uygulamasına göre (Klorprifos Emax değeri AK: 94,27 ± 2,90, CPF+AK: 85,76 ± 2,79) asetilkolinin özellikle Emax değerinde önemli (p<0,05) düzeyde azalmaya neden oldu.

Asetilkolinesteraz baskılanması ve kolinerjik reseptörler üzerinden etkili olan bu maddelerin kombinasyonunun Emax yönünden asetilkolinin etkisini zayıflatması, benzer mekanizmayla etkili olan diğer ilaçların etkilerini de zayıflatacağı veya zehirlenmelerin etkisini hafifleteceği anlamına getirilmemelidir. Özellikle, kombinasyona bağlı esterazların baskılanması efikasite yönünden güçlü ve benzer etkili maddelere maruz kalınmasında istenmeyen etkilerin beklenmedik dozlarda ve zamanda ortaya çıkışına neden olabilecektir.

Anahtar Sözcükler: Etefon, Klorprifos, ince bağırsak, kombinasyon, izole organ.

66

SUMMARY

Investigation of in Vitro Effects of Alone and Combined Ethephon and Chlorpyrifos ethyl in Rat Intestinal Muscle

The aim of this study is to elicit the possible interactions in case of combined exposure to organophosphorus pesticide chlorpyrifos and plant growth regulator ethephon which are widely used in Turkey and worldwide.

In this study, the small intestinal smooth muscle (duodenum and ileum) of 3 months old 42 Wistar Albino male rats were used. The small intestine segments of approximately 1 cm long were studied under a load of 1 gram in isolated organ bath containing 10 ml Tyrode solution. By applying acetylcholine (AK), ethephon (ETF) and chlorpyrifos (CPF) to duodenum and ileum with cumulative concentrations, their effects alone were evaluated. Besides, by incubating ethephon and chlorpyrifos alone and in combination with 10-7 M and 10-10 M concentrations, their effects on cumulative concentration-response curve of acetylcholine were studied. Physostigmine treatment was made in order to test enzymatic activity of the tissues.

The data obtained from this investigation show that the combination of ethephon and chlorpyrifos gives different results according to concentration applied and tissue type; both for pD2 value and Emax value in rat ileum combination of both agents with 10-7 M concentration, statistically significant differences obtained in comparison with acetylcholine control, however, the differences of the combination in comparison with single application was not significant. Yet, on same tissue the combined application (Combination Emax value AK: 94,90 ± 3,14, ETF+CPF+AK: 81,56 ± 4,11) of these agents with lower concentrations (10-10 M) especially in comparison with single chlorpyrifos application (Chlorpyrifos Emax value AK: 94,27 ± 2,90, CPF+AK: 85,76 ± 2,79), caused significantly important (p<0,05) decrease particularly in Emax value of acetylcholine.

Attenuation of the Emax value of acetylcholine by the combination of these agents which act by inhibiting acetylcholinesterase and by binding cholinergic receptors, should not mean to attenuate the effects of other agents that have the same mechanism of action. Especially, this inhibition of esterases by combination may elicit adverse effects with unexpected doses and times when exposed to efficaciously strong and similar agents.

Key Words: Ethephon, Chlorpyrifos, small intestine, combination, isolated organ.

67

KAYNAKLAR

ABU-QARE, A.W., ABDEL-RAHMAN, A., BROWNIE, C., KISHK, A.M., ABOU-DONIA, M.B. (2001). Inhibition of Cholinesterase Enzymes Following a Single Dermal Dose of Chlorpyrifos and Methyl Parathion, Alone and in Combination in Pregnant Rats. J. Tox. Environ. Health A, 63: 173-189.

ADLER, M., REUTTER, S.A., MOORE, D.H., FILBERT, M.G. (1991). Regulation of Acetylcholine Hydrolysis in Canine Tracheal Smooth Muscle. Eur. J. Pharmacol., 205: 73-79.

ATTERBERRY, T.T., BURNETT, W.T., CHAMBERS, J.E. (1997). Age-related differences in parathion and chlorpyrifos toxicity in male rats: target and nontarget esterase sensitivity and cytochrome p450-mediated metabolism. Toxicol. Appl. Pharmacol., 147: 411-418.

AXELRAD, J.C., HOWARD, C.V., McLEAN, W.G. (2002). Interactions Between Pesticides and Components of Pesticide Formulations in an in Vitro Neurotoxicity Test. Toxicology, 173: 259-268.

BAYDAN, E., ÜSTÜNER, E., İNCE, S. (2002). Tavşan ve Koyun Trakeası Üzerine Levamizol’ün Etkisinin Tek Başına ve Triklorfonla Birlikte Araştırılması. 2002-K-120130-8 No’lu DPT projesi. (Yayınlanmamış rapor).

BECERRA, M.A., HERRERA, M.D., MARHUENDA, E. (2001). Action of tacrine on muscarinic receptors in rat intestinal smooth muscle. J. Auton. Pharmacol., 21: 113-119.

BRUNTON, L.L., LAZO, J.S., PARKER, K.L. (2006). Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics – 11th Ed. McGraw-Hill Medical Publishing Division. ISBN 0-07-142280-3.

BUTLER, M.M., GRIFFEY, S.M., CLUBB, F.J., GERRITY, L.W., CAMPBELL, W.B. (1990). The Effect of Euthanasia Technique on Vascular Arachidonic Acid Metabolism and Vascular and Intestinal Smooth Muscle Contractility. Lab. Anim. Sci., 40: 277-283.

CHANDA, S.M., MORTENSEN, S.R., MOSER, V.C., PADILLA, S. (1997). Tissue-Spesific Effects of Chlorpyrifos on Carboxylesterase and Cholinesterase Activity in Adult Rats: An in Vitro and in Vivo Comparison. Fundam. App. Toxicol. 38: 148-157.

COCHRAN, R.C. (2002). Appraisal of Risks from Nonoccupational Exposure to Chlorpyrifos. Reg. Toxicol. Pharmacol., 35: 105-121.

68

COOK, T.J., SHENOY, S.S. (2003). Intestinal Permeability of Chlorpyrifos Using the Single-Pass Intestinal Perfusion Method in the Rat. Toxicology, 184: 125-133.

ÇOKUĞRAŞ, A.N. (2003). Butyrylcholinesterase: Structure and Physiological Importance. Turk. J. Biochem., 28: 54-61.

DAVIS, K.A.M., MASELLA, J., BLENNERHASSETT, M.G. (1998). Acetylcholine Metabolism in the Inflamed Rat Intestine. Experimental Neurology, 152: 251-258.

EL-MASRI, H.A., MUMTAZ, M.M., YUSHAK, M.L. (2004). Application of Physiologically-Based Pharmacokinetic Modeling to Investigate the Toxicological Interaction between Chlorpyrifos and Parathion in the Rat. Environ. Tox. Pharm., 16: 57-71.

GANONG, W.F. (2003). Review of Medical Physiology – 21st Ed. Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Publishing Division. ISBN 0-07-140236-5.

GORDON, C.J., HERR, D.W., GENNINGS, C., GRAFF, J.E., McMURRAY, M., STORK, L., COFFEY, T., HAMM, A., MACK, C.M. (2006). Thermoregulatory response to an organophosphate and carbamate insecticide mixture: Testing the assumption of dose-additivity. Toxicology, 217: 1-13.

HAUX, J.E., LOCKRIDGE, O., CASIDA, J.E. (2002). Specificity of Ethephon as a Butyrylcholinesterase Inhibitor and Phosphorylating Agent. Chem. Res. Toxicol., 15: 1527-1533.

HAUX, J.E., QUISTAD, G.B., CASIDA, J.E. (2000). Phosphobutyrylcholinesterase: Phosphorylation of the Esteratic Site of Butyrylcholinesterase by Ethephon [(2-Chloroethyl)phosphonic Acid] Dianion. Chem. Res. Toxicol., 13: 646-651.

HOWARD, M.D., POPE, C.N. (2002). In Vitro Effects of Chlorpyrifos, Parathion, Methyl Parathion and their Oxons on Cardiac Muscarinic Receptor Binding in Neonatal and Adult Rats. Toxicology, 170: 1-10.

INCHEM (2002). Pesticide residues in food - 2002 - Joint FAO/WHO Meeting on Pesticide Residues. ETHEPHON (addendum). IPCS INCHEM. Erişim: [http://www.inchem.org/documents/jmpr/jmpmono/2002pr05.htm]. Erişim Tarihi: 10.Eylül.2005.

JACOBSEN, H., OSTERGAARD, G., LAM, H.R., POULSEN, M.E., FRANDSEN, H., LADEFOGED, O., MEYER, O. (2004). Repeated dose 28-day oral toxicity study in Winstar rats with a mixture of five pesticides often found as residues in food: alphacypermethrin, bromopropylate, carbendazim, chlorpyrifos and mancozeb. Food Chem. Toxicol., 42: 1269-1277.

69

KARANTH, S., LIU, J., OLIVIER, K.Jr., POPE, C. (2004). Interactive Toxicity of the Organophosphorus Insecticides Chlorpyrifos and Methyl Parathion in Adult Rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 196: 183-190.

KARANTH, S., POPE, C. (2000). Carboxylesterase and A-Esterase Activities during Maturation and Aging: Relationship to the Toxicity of Chlorpyrifos and Parathion in Rats. Toxicol. Sci., 58: 282-289.

KAYAALP, S.O. (2002). Rasyonel Tedavi Yönünden Tıbbi Farmakoloji. 10.Baskı. Hacettepe Taş Kitapçılık - Ankara. ISBN 975-8506-27-7.

KOUSBA, A.A., POET, T.S., TIMCHALK, C. (2003). Characterization of the in vitro Kinetic Interaction of Chlorpyrifos-oxon with Rat Salivary Cholinesterase: A Potential Biomonitoring Matrix. Toxicology, 188: 219-232.

KOUSBA, A.A., SULTATOS, L.G., POET, T.S., TIMCHALK, C. (2004). Comparison of Chlorpyrifos-Oxon and Paraoxon Acetylcholinesterase Inhibition Dynamics: Potential Role of a Peripheral Binding Site. Toxicol. Sci., 80: 239-248.

L'HERMITE, A., SINE, J.P., COLAS, B. (1996). Ultrastructural Localization of Butyrylcholinesterase in Epithelial Cells of Rat Intestine. Eur. J. Histochem., 40: 299-304.

MORTENSEN, S.R., BRIMIJOIN, S., HOOPER, M.J., PADILLA, S. (1998). Comparison of the in Vitro Sensitivity of Rat Acetylcholinesterase to Chlorpyrifos-oxon: What Do Tissue IC50 Values Represent? Toxicol. Appl. Pharmacol., 148: 46-49.

MOTULSKY, H.J. (2003). Prism 4 Statistics Guide – Statistical Analysis for Laboratory and Clinical Researchers. GraphPad Software Inc., San Diego CA, www.graphpad.com.

MOTULSKY, H.J., CHRISTOPOULOS, A. (2003). Fitting Models to Biological Data using Linear and Nonlinear Regression. A Practical Guide to Curve Fitting. GraphPad Software Inc., San Diego CA, www.graphpad.com.

NOSTRANDT, A.C., PADILLA, S., MOSER, V.C. (1997). The Relationship of Oral Chlorpyrifos Effects on Behavior, Cholinesterase Inhibition, and Muscarinic Receptor Density in Rat. Pharm. Biochem. Behav., 58: 15-23.

OHRUI, T., SEKIZAWA, K., YAMAUCHI, K., OHKAWARA, Y., NAKAZAWA, H., AIKAWA, T., SASAKI, H., TAKISHIMA, T. (1991). Chemical Oxidant Potentiates Electrically and Acetylcholine-Induced Contraction in Rat Trachea: Possible Involvement of Cholinesterase Inhibition. J. Pharm. Exp. Therap., 259: 371-376.

POET, T.S., WU, H., KOUSBA, A.A., TIMCHALK, C. (2003). In Vitro Rat Hepatic and Intestinal Metabolism of the Organophosphate Pesticides Chlorpyrifos and Diazinon. Toxicol. Sci., 72: 193-200.

70

POPE, C., KARANTH, S., LIU, J. (2005). Pharmacology and Toxicology of Cholinesterase Inhibitors: Uses and Misuses of a Common Mechanism of Action. Environ. Tox. Pharm., 19: 433-446.

SEGALL, Y., GRENDELL, R.L., TOIA, R.F., CASIDA, J.E. (1991). Composition of Technical Ethephon [(2-Chloroethyl)phosphonic Acid] and Some Analogues Relative to Their Reactivity and Biological Activity. J. Agric. Food. Chem., 39: 380-385.

SEILER, R., RICKENBACHER, A., SHAW, S., BALSIGER, B.M. (2005). α- and ß-Adrenergic Receptor Mechanisms in Spontaneous Contractile Activity of Rat Ileal Longitudinal Smooth Muscle. J. Gastrointestinal Surgery, 9: 227-235.

SMEGAL, D.C. (2000). Human Health Risk Assessment: Chlorpyrifos. U.S. Environmental Protection Agency. Office of Pesticide Programs, Health Effects Division (7509C). Deborah C. Smegal, M.P.H., Risk Assessor. June 8, 2000. Erişim: [http://www.epa.gov/pesticides/op/chlorpyrifos/hedrra.pdf]. Erişim Tarihi: 28.Haziran.2003.

SPARKS, S.E., QUISTAD, G.B., CASIDA, J.E. (1999). Organophosphorus Pesticide-Induced Butyrylcholinesterase Inhibition and Potentiation of Succinylcholine Toxicity in Mice. J. Biochem. Molecular Toxicology, 13: 113-118.

TAHA, M.O., FRAGA, M.M., FAGUNDES, D.J., BANDEIRA, C.P., CARICATI-NETO, A., JURKIEWICZ, A. (2002). Effect of Preservation Conditions on Autonomic Transmission in Rat Small Bowel. Transplantation Proceedings, 34: 1021-1024.

TEZUKA, A., ISHIHATA, A., AITA, T., KATANO, Y. (2004). Aging-Related Alterations in the Contractile Responses to Acetylcholine, Muscarinic Cholinoceptors and Cholinesterase Activities in Jejunum and Colon of the Male Fischer 344 Rats. Experimental Gerontology, 39: 91-100.

TIMCHALK, C., NOLAN, R.J., MENDRALA, A.L., DITTENBER, D.A., BRZAK, K.A., MATTSON, J.L. (2002). A Physiologically Based Pharmacokinetic and Pharmacodynamic (PBPK/PD) Model for the Organophosphate Insecticide Chlorpyrifos in Rats and Humans. Toxicol. Sci., 66: 34-53.

TIMCHALK, C., POET, T.S., HINMAN, M.N., BUSBY, A.L., KOUSBA, A.A. (2005). Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Interaction for a Binary Mixture of Chlorpyrifos and Diazinon in the Rat. Toxicol. Appl. Pharmacol., 205: 31-42.

TOMLIN, C.D.S. (1997). The Pesticide Manual: A World Compendium. 11 th Ed. The British Crop Protection Council.

TUSH, G.M., ANSTEAD, M.I. (1997). Pralidoxime Continuous Infusion in the Treatment of Organophosphate Poisoning. Ann. Pharmacother., 31: 441-444.

71

U.S. EPA. (1995). Reregistration Eligibility Decision (RED): Ethephon. List A Case 0382. United States Environmental Protection Agency. Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances. April 1995. Washington, D.C. 20460. Erişim: [http://www.epa.gov/REDs/0382.pdf]. Erişim Tarihi: 13.Mart.2003.

U.S. EPA. (2002). Interim Reregistration Eligibility Decision for Chlopyrifos. EPA 738-R-01-007. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.

U.S. HHS. (1997). Toxicological Profile for Chlorpyrifos. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service Agency for Toxic Substances and Disease Registry. September 1997. Erişim: [http://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/tp84.pdf]. Erişim Tarihi: 13.Mart.2006.

ÜSTÜNER, E. (2003). Tavşan Trakeası Üzerine Levamizolun Etkisinin Tek Başına ve Triklorfonla Birlikte Araştırılması. Doktora Tezi. Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü.

WHO (2002). WHO Spesifications and Evaluations for Public Health Pesticides. Chlorpyrifos. Evaluation Report 221/2002. Erişim: [http://www.who.int/ctd/docs/whopes/new_docs/new_specifications/Chlorpyrifos_WHO_Evaluation.pdf]. Erişim Tarihi: 20.Haziran.2005.

WILLIAMS, P.L., JAMES, R.C., ROBERTS, S.M. (2000). Principles of Toxicology: Environmental and Industrial Applications – 2nd Ed. John Wiley & Sons, Inc. ISBN 0-471-29321-0.

YAZAR, S. (2005). Farelerde Maleik Hidrazid ve Etefon’un Tek ve Kombine Haldeki Subkronik Toksik Etkilerinin Araştırılması. Doktora Tezi. Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü.

ZHANG, N., CASIDA, J.E. (2002). Novel Irreversible Butyrylcholinesterase Inhibitors: 2-Chloro-1-(substituted-phenyl)ethylphosphonic Acids. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 10: 1281-1290.

72

ÖZGEÇMİŞ

I Bireysel Bilgiler

Adı ve Soyadı: Mustafa Alp Çetinkaya

Doğum yeri ve tarihi: Ankara – 1976

Uyruğu: TC

Medeni durumu: Bekar

Askerlik durumu: Tecilli

İletişim adresi ve telefonu: İlkyerleşim mah. 9.cad. 401.sok. No:16

Batıkent / Ankara Tel: 533 455 92 18

II Eğitimi

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi (1994 – 1999)

TED Ankara Koleji (İlk ve Orta Öğrenim 1982 – 1993)

Yabancı dili: İngilizce, Fransızca

III Unvanları

Veteriner Hekim (1999)

IV Mesleki Deneyimi

Ülkem İlaç San. Tic. Ltd. Şti. (2000 – 2001 / 2003 – 2003) - Ruhsatlandırma

İnterhas Tıbbi ve Kimyevi Ürünler San. Tic. A.Ş. (2003 – 2006)

Ruhsatlandırma ve İthalat

Çankırı İl Tarım Müdürlüğü – Hayvan Sağlık Şubesi (2006 – )

V Üye Olduğu Bilimsel Kuruluşlar

Veteriner Farmakoloji ve Toksikoloji Derneği

VI Bilimsel İlgi Alanları

Yayınları:

Bitki Gelişim Düzenleyicilerin Sağlık Üzerine Etkileri (Seminer)

Devekuşu ve Hastalıklarında İlaç Kullanımı (Seminer)

Devekuşlarında İlaç Uygulamaları – Akademi Devekuşu Mayıs 2002 (Kitapçık)