TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
ETEFON İLE KLORPRİFOS ETİL’ İN TEK VE BİR ARADA
ETKİLERİNİN RAT BAĞIRSAK KASINDA IN VITRO
OLARAK ARAŞTIRILMASI
M. Alp ÇETİNKAYA
FARMAKOLOJİ VE TOKSİKOLOJİ ANABİLİM DALI
DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN
Prof. Dr. Emine BAYDAN
2006 – ANKARA
iii
İÇİNDEKİLER
Kabul ve Onay ii
İçindekiler iii
Önsöz v
Simgeler ve Kısaltmalar vi
Şekiller Dizini viii
Çizelgeler Dizini ix
1. GİRİŞ 1
1.1. İnce Bağırsak Metabolizması 5
1.2. İnce Bağırsaklarda Kolinerjik Etkinlik 6
1.3. Etefon 11
1.4. Klorprifos 14
1.5. Kombinasyon Çalışmaları 18
1.6. Etki Gücü ve Etkililiğin Saptanması 26
1.7. Çalışmanın Amacı 27
2. GEREÇ VE YÖNTEM 29
2.1. Araç ve Gereçler 29
2.1.1. Deney Hayvanları 29
2.1.2. Deney Araçları 29
2.1.3. Kimyasal Maddeler 30
2.1.4. Tyrode Çözeltisinin Bileşimi 30
2.2. Yöntem 31
2.3. Protokoller 32
2.3.1. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Asetilkolinin Etkisinin
Araştırılması
32
2.3.2. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefonun Etkisinin
Tek Başına Araştırılması
32
2.3.3. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefonun Etkisinin
Asetilkolin ile Birlikte Araştırılması
32
iv
2.3.4. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Klorprifosun Etkisinin
Tek Başına Araştırılması
33
2.3.5. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Klorprifosun Etkisinin
Asetilkolin ile Birlikte Araştırılması
33
2.3.6. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefon ve Klorprifosun
Bir Aradaki Etkilerinin Asetilkolin ile Birlikte Araştırılması
34
2.3.7. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Yapılan Diğer Denemeler 34
2.3.7.1. Bağırsak Ortamının Enzimatik Etkinliğinin (AKE) Belirlenmesi 34
2.3.7.2. Çözücünün Dokular Üzerine Etkinliğinin Belirlenmesi 34
2.4. İstatistiksel Analiz 35
3. BULGULAR 36
3.1. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Asetilkolinin Etkisi 36
3.2. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefonun Tek Başına Etkisi 38
3.3. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefonun Asetilkolin ile
Birlikte Etkisi
39
3.4. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Klorprifosun Tek Başına Etkisi 43
3.5. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Klorprifosun Asetilkolin ile
Birlikte Etkisi
44
3.6. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefon ve Klorprifosun
Bir Aradaki Etkileri
48
3.7. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Yapılan Diğer Denemelerin
Bulguları
52
3.7.1. Bağırsak Ortamının Enzimatik Etkinliği (AKE) 52
3.7.2. Çözücünün Dokular Üzerine Etkinliği 55
4. TARTIŞMA 56
5. SONUÇ VE ÖNERİLER 63
ÖZET 65
SUMMARY 66
KAYNAKLAR 67
ÖZGEÇMİŞ 72
v
ÖNSÖZ Giderek artan insan sayısına bağlı olarak yaşamsal talepler de artmaktadır. Bu taleplerin başında canlıların yaşamı için zaruri olan gıdaların kalite ve miktar yönünden iyileştirilmesi gelmektedir. Ürünlerin albenisini, dayanıklılığını, ve miktarını artırmak amacıyla geçmişten günümüze kadar değişik kimyasal maddelerin ve metodların kullanımı söz konusu olmuştur ve halen de bu amaçla değişik kimyasal maddelerin devreye sokulması söz konusu olmaktadır. İyi niyetle, fakat bilinçsizce, bir arada yapılan bu uygulamaların çoğu sağlık sakıncalarını da beraberinde getirir. Aslında, söz konusu bu maddeler tüketime sunulmadan önce çok yönlü testlerden geçirilir. Ancak, spesifik bir uygulama şekli olmadıktan sonra, bu maddelerin bir aradaki etkileşimleri üzerinde testler yapılmaz. Bununla birlikte bu konu pek çok araştırmacı ve hatta bilinçli tüketicinin her zaman ilgisini çekmiştir. Yapılan az sayıdaki konuya yönelik araştırmalar da eş zamanlı uygulanan kimyasal maddelerin istenmeyen etkilere neden olabileceğini göstermektedir.
Yapılan bu araştırmada, Türkiye’ de ve yurt dışında geniş kullanım alanı bulan ve aynı mekanizmayla etkilerini gösteren organik fosforlu pestisidlerden klorprifos ile bitki gelişim düzenleyicilerden etefonun bir arada kullanılmasıyla yapabilecekleri etkilerin in vitro koşullarda rat ince bağırsağı üzerinde yapılan testlerle ortaya konması amaçlanmıştır.
Bu çalışmada yardım, destek ve ilgilerini esirgemeyen, başta danışman hocam Prof. Dr. Emine Baydan olmak üzere, tez izleme komitemde bulunan hocalarım Prof. Dr. Ayhan Filazi ve Prof. Dr. İlksin Pişkin’ e, bilgi ve önerileriyle çalışmalarıma yardımcı olan Farmakoloji ve Toksikoloji Anabilim dalı başkanı Prof. Dr. Sezai Kaya’ ya, Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji bölümü öğretim üyesi Doç. Dr. Pelin Kelicen’ e ve ayrıca laboratuar çalışmalarım sırasında bana yardımcı olan başta Araş. Gör. Sinan İnce olmak üzere tüm araştırma görevlisi arkadaşlarım ile anabilim dalı görevlilerine teşekkür ederim. Çalışmalarım sırasında sabır ve özverilerini esirgemeyen aileme de teşekkürü bir borç bilirim.
vi
SİMGELER VE KISALTMALAR
AK Asetilkolin
AKE Asetilkolinesteraz
ATP Adenozin Trifosfat
BGD Bitki Gelişim Düzenleyicisi
BKE Bütirilkolinesteraz
CAR Karbaril
CD [3H]cis-dioksolan
Cmax Maksimum derişim
CPF Klorprifos
CYP Sitokrom P450
DZN Diazinon
EAA Eğrinin Altında Kalan Alan
EC Etkili derişim
Emax Maksimum Etkililik
ESS Enterik Sinir Sistemi
ETF Etefon
IC İnhibe Edici Derişim
IMHP 2-isopropyl-4-methyl-6-hydroxypyrimidine
KAE Karboksilesteraz
Kd Reseptör Çözünme Sabitesi
KE Kolinesteraz
LD Öldürücü Doz
MH Maleik Hidrazid
MPS Metil-paratiyon
MSS Merkezi Sinir Sistemi
NO Nitrik Oksit
NOAEL Olumsuz Yan Etki Görülmeyen Düzey
OF Organik Fosforlu
vii
pD2 EC50’ nin negatif logaritması
p-F-HHSiD p-floro hekzohidroksiladifenidol
PON1 Paraoksonaz
QNB Kinuklidinil benzilat
RfD Referans Doz
SEM Standart Hata
TCP (3,5,6-trikloro-2-pridinol)
THA Tacrine
viii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 1.1 Etefonun kimyasal yapısı (C2H6ClO3P) 11
Şekil 1.2 Klorprifosun kimyasal yapısı (C9H11Cl3NO3PS) 14
Şekil 1.3 Klorprifosun metabolizması 16
Şekil 3.1 Rat duodenumunda AK kümülatif derişim-cevapları 37
Şekil 3.2 Rat ileumunda AK kümülatif derişim-cevapları 37
Şekil 3.3 Rat duodenumu ve ileumunda kümülatif ETF uygulama
cevapları
38
Şekil 3.4 Rat duodenumunda ETF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 39
Şekil 3.5 Rat ileumunda ETF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 40
Şekil 3.6 Rat duodenumunda ETF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 41
Şekil 3.7 Rat ileumunda ETF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 42
Şekil 3.8 Rat duodenumu ve ileumunda kümülatif CPF uygulama
cevapları
43
Şekil 3.9 Rat duodenumunda CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 44
Şekil 3.10 Rat ileumunda CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 45
Şekil 3.11 Rat duodenumunda CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 46
Şekil 3.12 Rat ileumunda CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 47
Şekil 3.13 Rat duodenumunda ETF+CPF (10-10 M) inkübasyonunun
etkisi
48
Şekil 3.14 Rat ileumunda ETF+CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 49
Şekil 3.15 Rat duodenumunda ETF+CPF (10-7 M) inkübasyonunun
etkisi
50
Şekil 3.16 Rat ileumunda ETF+CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 51
Şekil 3.17 Rat duodenumunda 10-7 M fizostigminin yanıtı 53
Şekil 3.18 Rat ileumunda 10-7 M fizostigminin yanıtı 53
Şekil 3.19 Rat duodenumunda 3x10-7 M fizostigminin yanıtı 54
Şekil 3.20 Rat ileumunda 3x10-7 M fizostigminin yanıtı 54
ix
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 3.1 Rat duodenumu ve ileumunda AK’ in kümülatif
uygulanmasında en yüksek kasılmayı veren değerlerin mg
olarak ortalaması
36
Çizelge 3.2 Rat duodenumu ve ileumunda AK derişim-cevap eğrilerinin
Emax ve pD2 değerleri
36
Çizelge 3.3 Rat duodenumu ve ileumunda tek başına ETF’ nin kastırıcı
etkisi
38
Çizelge 3.4 Rat duodenumunda ETF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 39
Çizelge 3.5 Rat ileumunda ETF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 40
Çizelge 3.6 Rat duodenumunda ETF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 41
Çizelge 3.7 Rat ileumunda ETF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 42
Çizelge 3.8 Rat duodenumu ve ileumunda tek başına CPF’ nin kastırıcı
etkisi
43
Çizelge 3.9 Rat duodenumunda CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 44
Çizelge 3.10 Rat ileumunda CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 45
Çizelge 3.11 Rat duodenumunda CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 46
Çizelge 3.12 Rat ileumunda CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 47
Çizelge 3.13 Rat duodenumunda ETF+CPF (10-10 M) inkübasyonunun
etkisi
48
Çizelge 3.14 Rat ileumunda ETF+CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi 49
Çizelge 3.15 Rat duodenumunda ETF+CPF (10-7 M) inkübasyonunun
etkisi
50
Çizelge 3.16 Rat ileumunda ETF+CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi 51
Çizelge 3.17 Rat bağırsağında asetonun AK üzerine etkisi 55
1
1. GİRİŞ
Pestisid terimi, pest mücadelesi veya kontrolü için kullanılan bir grup kimyasal
bileşiği kapsamaktadır. Pestisidler etkilerinin hedefleri esas alınarak insektisidler,
fungisidler, herbisidler, rodentisidler ve mollusküsidler gibi çeşitli sınıflarda
gruplandırılır. Pestisidlerin ekonomik ve halk sağlığı yararları vardır. Vektör
kaynaklı hastalıkların kontrolü, tarımsal üretimi artırmak ve pestlerin kontrolü için
yıllardır kullanılmaktadır. Bireyler ya mesleki olarak (pestisid imalathanesinde veya
ticari pestisid uygulamalarında) ya da çevresel olarak (pest mücadelesi yapılan
meyve ve sebzeler gibi gıdalardan) pestisidlere maruz kalabilirler. Bireyler ayrıca
konutlarında da pestisidlere maruz kalabilirler (Williams ve ark., 2000).
Pestisidler, belirli “pest” türlerinde toksisite göstermeleri için çevreye bilinçli olarak
salınan tek çevre kirleticileridir. Maalesef, seçiciliğin tam olmaması nedeniyle
sıklıkla insanlarda ve diğer hedef olmayan türlerde zehirlenme problemlerine yol
açarlar. Organik Fosforlu (OF) pestisidler bugün dünyada kullanılan insektisidler
içinde en önemli kimyasal sınıftır (Howard ve Pope, 2002). OF bileşikler en sık
kullanılan insektisidler olarak, pire tasmalarında, karınca tuzaklarında, sinek
kâğıtlarında, ev ve endüstriyel insektisid ürünlerinde bulunurlar. Bu bileşiklerle ilgili
zehirlenmeler çeşitli nedenlere bağlı olarak gelişebilir (Tush ve Anstead, 1997).
Lipofilik doğalarından dolayı OF bileşikler sindirim, solunum ve dermal yollarla çok
kolay şekilde emilebilir (Williams ve ark., 2000). OF bileşiklere en yaygın maruziyet
yolu deri ve ağız yoludur (Tush ve Anstead, 1997).
OF bileşikler, insanlarda toksik etkilerini, asetilkolinin (AK) sinaps aralığındaki
etkisinin devamlılığını ve postsinaptik nöronun sürekli depolarizasyonunu sağlayan
asetilkolinesteraz (AKE) enziminin dönüşümsüz baskılanmasına neden olarak
gösterirler (Tush ve Anstead, 1997; Howard ve Pope, 2002). Enzim baskılanmasına
bağlı olarak aşırı AK birikimi, post-sinaptik kolinerjik reseptörlerin aşırı
uyarılmasına neden olur ve buna bağlı olarak salivasyon, lakrimasyon, ürinasyon,
defekasyon, bradikardi, miozis, bulantı, solunum fonksiyon bozukluğu gibi kolinerjik
2
zehirlenme belirtileri gelişir (Mortensen ve ark., 1998; Karanth ve Pope, 2000;
Howard ve Pope, 2002; Karanth ve ark., 2004).
OF insektisidler geniş şekilde akut toksisite düzeyi gösterirler ve hem insanlar hem
de hayvanlar için kazara akut ve kronik maruziyetlerde ciddi tehlikeler ortaya
çıkarırlar. Gençler, birçok OF insektisidin akut toksisitesine yetişkinlerden çok daha
fazla duyarlıdırlar ve gelişmekte olan sinir sistemleri sebebiyle büyük risk altında
bulunabilirler. İnsektisid ile kontamine giyecekler, yatak çarşafları ve oyuncaklar
gibi nesnelerden kaynaklanan ciddi zehirlenme olguları, çocuklarda bildirilmektedir.
Gençlerin yetişkinlerden OF toksisitesine çok daha duyarlı olması gerçeği, büyük
endişe kaynağıdır (Atterberry ve ark., 1997).
Yaygın şekilde uygulanan birçok OF insektisid, zayıf antikolinesteraz doğasında olan
fosforotiyonatlardır (Atterberry ve ark., 1997). OF insektisidlerin öncelikli etki şekli
ve akut şekilde hayatı tehdit eden etkisi, etkin okson metabolitleri tarafından AKE’
nin inhibisyonunu takiben kolinerjik sinapslarda asetilkolin birikimi ile bir dizi
nörotoksik etki oluşturmasıdır (Kousba ve ark., 2003). Oksonlar ana bileşikten
yaklaşık 3 kat fazla daha güçlü inhibitörlerdir (Atterberry ve ark., 1997; Kousba ve
ark., 2003). Oksonlar sadece hedef noktalarda (yani sinapslar ve nöromüsküler
bağlantılar) AKE’ nin güçlü inhibitörleri değil ayrıca aliesterazlar veya hedef
olmayan dokularda kolinesterazlar gibi diğer serin esterazların da güçlü
inhibitörleridir. Aliesterazlar (karboksilesterazlar), bilinmeyen fizyolojik fonksiyonu
olan serin esterazlardır ki, OF zehirlenmeleri esnasında koruyucu bir rol
üstlenebilirler. Bu hedef olmayan esterazların fosforilasyonu stoikiometrik olarak bir
kısım oksonu yok eder ve oksonun o kısmının hedef AKE’ yi inhibe etmesinden
korur (Atterberry ve ark., 1997).
OF pestisidler sıklıkla bir diğeriyle kombinasyon halinde ve/veya yardımcı
maddelerle kullanılırlar. Çoğunlukla kombinasyonlar arasında sinerjizma
oluşmaktadır (Axelrad ve ark., 2002). Pest mücadelesinde, birçok insektisid yaygın
şekilde kullanıldığından, çok sayıda OF bileşiğe eş zamanlı olarak maruz kalma
3
durumu özellikle tarım ve halk sağlığı çalışanları arasında yüksektir. Ayrıca, gıda ve
diğer kaynaklardan, bu tip insektisidlere ayrı ayrı ancak yakın zamanlı maruziyetler
olabilir. Her ne kadar tek başlarına OF insektisidlerin sağlığa zararları nispeten iyi
tanımlanmış olsa da, birçok OF insektisidin bir aradaki toksisiteleri üzerine az bilgi
vardır (Karanth ve ark., 2004).
Dünya çapında, bir yılda yaklaşık 3 milyon OF insektisid zehirlenme olayı olmakta,
bunların da hemen hemen 200.000’ i ölümle sonuçlanmaktadır. Bunlara ilaveten,
insanlar gıdalardaki kalıntıların tüketilmesiyle ve su kaynaklarının kontamine
olmasıyla, ayrıca solunum ve deri teması yoluyla düşük düzeylerde OF insektisidlere
maruz kalmaktadır. Önemli şekilde akut toksisite olması potansiyeline göre, OF
insektisid maruziyetini doğru bir biçimde ölçme gereksinimi vardır (Kousba ve ark.,
2003).
Gıdaların güvenliğinde pestisidlerle bulaşma konusunda halkın kaygısı, pestisidlerin
ruhsatlandırmasında öncelikli yönlendirici kuvvetlerden biri olmaktadır. Ham veya
işlenmiş tarımsal ürünler üzerinde bulunmasına izin verilen en yüksek yasal pestisid
kalıntı miktarı yani tolerans, tek başına sağlık konusunda temel oluşturmamaktadır.
İnsanların, besinsel maruziyetten ve tüm besinsel olmayan kaynaklardan pestisidlere
bir arada toplam maruz kalma riski ve insan sağlığını korumada, besinlerdeki
toleransların yeterliliğine karar vermek için benzer etki şekline sahip diğer
pestisidlerden kümülatif toksik etki potansiyeli de belirtilmemektedir. Pestisidlerin
etkileriyle ilgili halkın endişesi, bazı pestisidlerin hayvanlarda üreme
endokrinolojisini bozduğu ve insanlar için de benzer sonuçları olabileceğini gösteren
çalışmalarla şiddetlenmektedir. Bunlara ilaveten, bebekler ve çocuklar gibi
muhtemelen duyarlı alt popülasyonların gıdalar yoluyla pestisidlere maruziyet
potansiyeli ile ilgili endişeler ifade edilmektedir (Cochran, 2002).
Etefon, tarımsal ürünlerde hasat öncesi ve sonrası olgunlaşmayı hızlandırmada,
çiçeklenmeyi başlatmada ve diğer bitki cevaplarının oluşturulmasında kullanılan bir
bitki gelişim düzenleyicisidir (BGD) ve etkisini etilen gazını salgılatarak gösterir
4
(Segall ve ark., 1991; U.S. EPA., 1995; Tomlin, 1997; Haux ve ark., 2000). Etefon
1965 yılında keşfedilmiş, 1973 yılında bitki gelişim düzenleyici olarak ticari şekilde
piyasaya sunulmuştur. Etefon birçok meyve, sebze, tahıl ürünleri ile peyzaj ve sera
bitkilerinde kullanılmak üzere ruhsatlandırılmaktadır. Etefon; Ethrel, Florel,
Flordimex gibi yaygın ticari adlarıyla tanınmaktadır (U.S. EPA., 1995). Etefon, bir
OF bileşik olarak her ne kadar kolinerjik nitelikte zehirlenme belirtilerine neden
olmadığı ifade edilse de etki mekanizması yönünden diğerleriyle aynı yolu
kullanmaktadır (Haux ve ark., 2002).
Klorprifos, geniş spektrumlu klorlu bir OF insektisid ve akarisiddir. Birçok besin ve
yem bitkisinde böcekleri ve akarları kontrol altına almak için ilk olarak 1965 yılında
ruhsatlandırılmıştır (Smegal, 2000). Çeşitli tarımsal besinler, süs bitkileri, seralar,
kapalı alan pest kontrol ürünleri, karınca kontrolü, sivrisinek mücadelesi ve pet
tasmaları kullanım alanını oluşturur (Nostrandt et al., 1997; Smegal, 2000; Abu-Qare
et al., 2001). Dow AgroSciences, klorprifosun 1998 yılı kentsel kullanımının %70’
inin karınca mücadelesini içerdiğini belirtmektedir (Smegal, 2000). Klorprifos;
Dursban, Lorsban, Empire, Polaris, Master gibi yaygın ticari isimleri ile
tanınmaktadır (U.S. EPA., 2002).
Klorprifos, AK adlı nörotransmitterin yıkımından sorumlu enzim olan AKE’ ın
dönüşümsüz inhibisyonu yoluyla akut toksisiteye yol açar (Chanda ve ark., 1997).
Bu AKE inhibisyonunu metabolitlerinden biri olan klorprifos-okson yoluyla yapar.
Klorprifos en sık kullanılan pestisidlerdendir ve suda ve besinlerde kirletici olarak
bulunabilir (Cook ve Shenoy, 2003).
5
1.1. İnce Bağırsak Metabolizması
Bir kimyasalın veya bir ilacın ağızdan emilimi hem bağırsak hem de karaciğer
metabolizması ile değiştirilebilir. Her ne kadar, bağırsakların kan akışı ve doku
hacmi karaciğerden biraz daha düşükse de, yaygın mikrovillus yapısı, emilim için
çok ideal olan geniş bir yüzey alanı sağlar (Poet ve ark., 2003).
Hem kemirgen hem de insan bağırsak epitel hücreleri (enterositler) geniş alanda
ilaçları ve ksenobiyotikleri metabolize etme yeteneği olan enzimler içerdiğinden,
yakın zamanda yapılan çok sayıda klinik-öncesi ve klinik çalışma, ilk-geçiş
metabolizmasında bağırsakların önemini göstermiştir. İlaçların veya kimyasalların
oral biyoyararlanımı, bağırsak emilimi ve onunla ilişkili ilk-geçiş metabolizmasının
ölçüsünün bir fonksiyonudur. Gıdalardaki düşük düzeydeki pestisid kalıntılarının
alınması potansiyelinin ışığında, bağırsak ve karaciğer metabolizmasının rolünü daha
iyi anlamak, özellikle risklerin değerlendirilmesi için gereklidir. OF insektisidlerin
toksik gücü, hedef bölgeye ulaşan doz ve detoksifikasyona karşı biyoaktivasyon
oranları arasındaki dengeye bağlıdır (Poet ve ark., 2003).
Bağırsak enterositlerinden köken alan mikrozomlar, hem desülfürasyon hem de
dearilasyon reaksiyonlarını içeren benzer bir sitokrom P450 (CYP)-aracılı
metabolizma profili göstermektedir. Her ne kadar, vücuttaki birçok dokunun biraz
CYP aktivitesine sahip olduğu bilinse de, baskın kanı, karaciğerin CYP
metabolizması ile ilişkili öncelikli organ olduğu ve mide-bağırsak kanalından emilen
kimyasalların ve ilaçların ilk-geçiş metabolizmasından sorumlu olduğudur. Son
yapılan çalışmalarda da açıktır ki, ince bağırsaklardaki enterositler de CYP metabolik
kapasitesine sahiptir ve bazı enzimler (3A4 gibi) söz konusu olduğunda enterositler
içindeki derişim karaciğer ile kıyaslanabilir düzeydedir. OF bileşiklerin kendi okson
metabolitlerine metabolize olmasına muhtemelen CYP3A4, 2B6 (insanda), 2B1/2
(ratta) ve 2D6 (insanda) aracılık eder. Her ne kadar insan bağırsağındaki ve
karaciğerindeki enzim profili farklı olsa da, hem karaciğerde hem de ince
bağırsaklardaki yaygın CYP, 3A4’ dür (Poet ve ark., 2003).
6
1.2. İnce Bağırsaklarda Kolinerjik Etkinlik
Mide-bağırsak motor aktivitesinin koordinasyonu ve ayarlanması, iki karmaşık
sinirsel girdinin etkileşimine bağlıdır: bağırsak duvarının içinde tamamen temel
oluşturan enterik sinir sistemi (ESS) ve dıştan sinirler yoluyla (vagal, sempatik)
bağırsağa etkilerini yollayan merkezi sinir sistemi (MSS). MSS ve ESS arasındaki
etkileşim, stres, yemek ve davranış gibi mide-bağırsak cevaplarında önemlidir. Vagal
motor yolaklar, başlıca üst mide-bağırsak kanalı, distal kolon ve rektumu düzenler.
İnce bağırsaklarda, vagal girdiler myenterik sinirlere gönderilir. Bağırsak sempatik
sinir sistemi, bağırsağa giren post-gangliyonik lifleri olan pre-vertebral
gangliyonlarda bulunan sinir hücre gövdesinden oluşur (Seiler ve ark., 2005). Mide-
bağırsak kanalında besinlerin karıştırılması, itilmesi ve emilmesi işlemleri lokal
olarak periferik sinir sisteminin kısıtlı bir parçası olan enterik sinir sistemi yoluyla
kontrol edilmektedir (Brunton ve ark., 2006).
Mide-bağırsak kanalı için intrinsik olan iki büyük sinir lifi ağı vardır: dış longitudinal
ve orta dairesel kas katmanları arasında myenterik pleksus (Auerbach pleksusu) ve
orta dairesel katman ve mukoza arasında submukozal pleksus (Meissner pleksusu)
(Ganong, 2003). Myenterik pleksus, mide-bağırsak düz kasının kasılmasında ve
gevşemesinde önemli bir rol oynarken, submukozal pleksus, mide-bağırsak epitelinin
salgısal ve absorbtif fonksiyonuna, yerel kan akışı ve nöroimmun etkinliklere
dahildir (Brunton ve ark., 2006). ESS, mide-bağırsak fonksiyonunun düzenlenmesi
ile ilgili olan MSS’ nin yer değiştirmiş bir kısmı olarak görülmektedir. MSS’ ye
parasempatik ve sempatik lifler tarafından bağlanır ancak bu bağlantılar olmadan da
otonom olarak görev yapabilir (Ganong, 2003). AK, ESS’ de en önemli
nörotransmitterdir (Davis ve ark., 1998). Mide-bağırsak kanalının kas katmanları
ikili olarak, hücre gövdeleri bağırsak duvarında bulunan uyarıcı ve inhibe edici
motor nöronlar tarafından innerve edilir. AK, ESS’ de parasempatik sinirlerin
transmitteri olmasına ilaveten, yukarı çıkan intramural yolaklardaki nikotinik AK
reseptörlerine de etki eden öncelikli uyarıcı transmitterdir. Bununla birlikte,
7
kolinerjik sinir iletiminin farmakolojik olarak engellenmesi tamamen uyarıcı iletimi
ortadan kaldırmaz çünkü P maddesi ve nörokinin A gibi taşikinin ko-transmitterler
AK ile birlikte salınır ve uyarıcı cevaba katkıda bulunur. Her ne kadar, aşağı inen
motor yolaklarda AK önemli rol oynayabilse de, bu tip yolaklardaki diğer önemli
uyarıcı nörotransmitter P2X pürin reseptörleri yoluyla etkiyen ATP’ dir (Brunton ve
ark., 2006). Rat ince bağırsaklarındaki muskarinik reseptörler başlıca submukozal
nöronlarda bulunan M1 muskarinik reseptörler ve enterositlerde bulunan M3
muskarinik reseptörlerdir. M3 reseptörler çoğu düz kas tipinde kasılmalara aracılık
eder (Becerra ve ark., 2001).
AK, mide-bağırsak kanalındaki iyi bilinen bir nörotransmitterdir ve AK tarafından
muskarinik kolinoseptörlerin aktivasyonu bağırsak ve kolon kontraksiyonlarının
ortaya çıkmasında önemlidir (Tezuka ve ark., 2004). İnce bağırsaklarda, intra-mural
kolinerjik sinirlerden salgılanan AK, nikotinik kolinerjik reseptörlerde enterik
sinirlerin uyarılmasını sağlama ve muskarinik kolinerjik reseptörlerde ince bağırsak
kaslarının kasılmasını sağlama görevi yapar. Böylece, ince bağırsakların AK
tarafından düzenlenen kontraktil fonksiyonu, büyük oranda enterik sinirlerin yapısal
ve fonksiyonel bütünlüğüne bağlıdır (Taha ve ark., 2002).
Asetilkolin (AK), kolinin asetil esteridir. Büyük oranda küçük sinaptik veziküllerde,
yüksek derişimlerde AK salgılayan nöronların terminal uçlarında bulunur. AK’ nin
sentez ve yıkımında sırasıyla kolin asetiltransferaz ve asetilkolinesteraz rol oynar
(Brunton ve ark., 2006). Kolinerjik nöronlar, sentetik enzim kolin asetiltransferaz
aracılığıyla kolin ve kofaktör asetil koenzim A’ dan asetilkolin sentezler (Pope ve
ark., 2005). Kolin asetiltransferaz, AK’ nin sentezindeki ilk basamağı (asetil koenzim
A ile kolinin asetilasyonu) katalizler. Kolinden sentezlendikten sonra, AK öncelikli
olarak sinir sonlarındaki depo veziküllerine alınır (Ganong, 2003; Brunton ve ark.,
2006). Kolinerjik nöronlara bir nakledici vasıtasıyla kolinin etkin bir alımı vardır.
Kolin ayrıca nöronlarda da sentezlenir. Asetat, indirgenmiş koenzim A ile asetat
gruplarının kombinasyonu vasıtasıyla etkinleştirilir (Ganong, 2003). AK molekülleri,
veziküler asetilkolin taşıyıcıları ile sinaptik veziküllere paketlenmiştir. Terminal
depolarizasyonda, sinaptik veziküller plazma membranı ile birleşir ve sinaptik
8
boşluğa AK salgılar (Pope ve ark., 2005). Veziküler taşıyıcı AK’ nin veziküllere
alınmasını sağlar, bu işlem doyurulabilir ve ATP-az’ a bağımlıdır. Aksiyon
potansiyeli motor sinir sonuna ulaştığında, senkronize şekilde 100 veya daha fazla
vezikülden AK ekzositoz yoluyla salınır (Brunton ve ark., 2006). Normal şartlar
altında, AKE hızlı ve etkili bir şekilde AK’ yi hidrolize eder. İnaktivasyondan önce,
AK molekülü, ya postsinaptik hücre zarı boyunca iyon akışını değiştirerek ya da
hücre içi ikinci mesajcıları üreterek hücresel fonksiyonu değiştirmek üzere
postsinaptik kolinerjik reseptörlerle etkileşir (Pope ve ark., 2005).
AK’ nin motor sistemde ve diğer nöronal sinapslarda nörotransmitter olarak görev
yapabilmesi için, sinapsın cevap özelliklerine göre belirlenen zaman aralığında
ortamdan alınması veya etkisizleştirilmesi gerekmektedir (Brunton ve ark., 2006).
Repolarizasyonun oluşması için sinapsdan uzaklaştırma işlemi, AK’ nin kolin ve
asetata hidrolizi yoluyla gerçekleşir, reaksiyon AKE enzimi tarafından katalizlenir.
Bu enzim ayrıca gerçek veya spesifik kolinesteraz olarak da adlandırılır. Afinitesi
çok büyük ölçüde AK için olsa da, diğer kolin esterlerini de hidrolize eder (Ganong,
2003).
Vücutta çok farklı çeşitte esteraz mevcuttur (Ganong, 2003). Hayvan
kolinesterazları, kolinerjik ve kolinerjik olmayan dokularda, ayrıca plazmada ve
diğer vücut sıvılarında yaygın olarak bulunan enzimlerdir. Substrat
özgünlüklerindeki, aşırı substrattaki davranışlarındaki ve inhibitörlerden kolay
etkilenmelerindeki farklılıklara göre iki sınıfa ayrılır: Asetilkolinesteraz veya “gerçek
kolinesteraz” (AKE) ve bütirilkolinesteraz (BKE). BKE, psödokolinesteraz, spesifik
olmayan kolinesteraz veya basit kolinesteraz olarak da bilinir. AKE asetilkolini diğer
kolinesterazlardan daha hızlı hidrolize eder ve bütirilkolin üzerinde az çok etkindir.
Bunun aksine, BKE ayrıcalıklı olarak bütirilkoline etkir ama asetilkolini de hidrolize
eder. Aşırı substrat ile AKE’ nin baskılanması, onu BKE’ den ayıran anahtar
özelliklerden biridir. BKE, substrat fazlalığında substrat aktivasyonu gösterir. Doku
dağılımları da birbirinden farklıdır: AKE’ nin beyinde, kasta ve alyuvar zarında bol
miktarda bulunduğu bilinirken, BKE karaciğer, bağırsak, kalp, böbrek ve akciğerde
yüksek aktiviteye sahiptir. İnsan, at, fare gibi birçok tür plazmalarında yüksek BKE
9
aktivitesi gösterirken, rat, plazmasında BKE’ den çok AKE aktivitesine sahiptir.
Serum BKE karaciğerde sentezlenir ve plazmaya salgılanır (Çokuğraş, 2003).
Her ne kadar halen gerçek substratlar bilinmiyorsa da, BKE, hidrofobik ve hidrofilik
karboksilik veya fosforik asit esteri içeren bileşikleri hidrolize edebilir. AK bağlanma
noktalarını hedef alan zehirli bileşiklere bireysel maruziyet olduğunda, toksikolojik
ve farmakolojik önemi açığa çıkar. AKE fonksiyonunun kaybı, kas felci, nöbetler ve
belki asfeksi sonucu ölüme sebep olur. Organofosfat ve karbamat esterleri, pestisid,
insektisid, kimyasal savaş ajanı olarak ve glokom, parazit enfestasyonu, Alzheimer
hastalığı gibi tıbbi bozuklukların tedavisinde ilaç olarak kullanılır. Bu bileşikler hem
AKE hem de BKE’ nin güçlü inhibitörleridir. BKE, antikolinesteraz bileşiklerinin
endojen bir temizleyicisi olarak düşünülebilir. Fizyolojik olarak önemli hedef
noktalarda AKE’ ye ulaşmalarından önce, BKE onları detoksifiye eder (Çokuğraş,
2003).
AK, AKE enzimi tarafından hidrolize edilmesi yanında, hidrolizinde ayrıca BKE’
nin de etkisi olduğu belirtilmektedir. AKE tüm kolinerjik sinapslarda ve BKE
öncelikli olarak kalp dokusunda, düz kaslarda ve plazmada bulunur (Adler ve ark.,
1991). Omurgalılarda, başlıca enterositlerin oluşturduğu bağırsakların mukozal epitel
tabakası, kolinesteraz aktivitesi gösterir. Bu aktiviteden sorumlu enzim ya
tavşanlarda ve kedilerde olduğu gibi asetilkolinesterazdır ya da sığırlarda,
domuzlarda, koyunlarda, ratlarda, farelerde ve kanatlılarda olduğu gibi
bütirilkolinesterazdır. İnsanlarda her iki enzim de bulunur. Duodenumun distal
kısımları BKE açısından yüksek aktiviteye sahiptir (L'Hermite ve ark., 1996). Çoğu
dokuda BKE, toplam kolinesteraz aktivitesinin % 10’ undan az bir önem teşkil eder.
Omurgalı düz kasında ise BKE, toplam kolinesteraz bölümünün kayda değer kısmını
oluşturur (Adler ve ark., 1991). Bununla birlikte, BKE’ nin AKE’ ye göre AK’ ye
yönelik çok daha az bir afinitesi vardır (Adler ve ark., 1991; Ohrui ve ark., 1991).
AK reseptörleri farmakolojik özelliklerine göre iki gruba ayrılır: muskarinik ve
nikotinik kolinerjik reseptörler (Ganong, 2003). Bilindiği gibi, hem kolinerjik hem de
10
adrenerjik sinir sonları otoreseptörler ve heteroreseptörler içerir. AK salınımı bu
sebeple, M2 ve M4 otoreseptörler üzerine kendisi etki gösteren AK de dahil
nöromedyatörler ve diğer transmitterler veya yerel olarak dokularda üretilen
maddeler (örneğin NO) tarafından karışık bir düzenlemeye tabidir. M2 ve M4
otoreseptörlerin etkinleştirilmesini takiben AK salınımının AK-aracılı
inhibisyonunun, fizyolojik bir negatif-feedback kontrol mekanizması olduğu
düşünülmektedir. Muskarinik otoreseptörler ve heteroreseptörler ayrıca hem
agonsitler hem de antagonistler için ilaç hedefi görevi görürler (Brunton ve ark.,
2006).
Kolinesteraz inhibitörleri önemli sayıda AKE molekülüne bağlandığında, AK’ nin
etkili şekilde yıkımlanması önlenir ve transmitter molekülleri sinapsda birikir. Artan
sinaptik AK düzeyleri, postsinaptik hücrelerdeki kolinerjik reseptörlerin sürekli
uyarılmasına ve daha sonra kolinerjik reseptör aracılı uyarım yolaklarının yani hücre
içi cAMP düzeylerinin değişimine sebep olur. Bu hücresel değişiklikler,
doku/organizma düzeyinde fonksiyonel değişikliklere sebep olur (Pope ve ark.,
2005).
AKE’ yi inhibe eden ilaçlar anti-KE maddeler olarak adlandırılır. Kolinerjik sinir
sonlarında AK birikimine sebep olurlar ve böylece merkezi ve periferik sinir sistemi
boyunca kolinerjik reseptörlerin aşırı uyarılmasına eşdeğer etkiler oluşturma
potansiyeline sahiplerdir. Anti-KE maddelerin tipik farmakolojik etkileri öncelikli
olarak, kolinerjik iletim noktalarında AKE tarafından AK’ in hidrolizinin
engellenmesine bağlıdır. Bu şekilde biriken transmitter, kolinerjik uyarımla serbest
bırakılan veya sinir sonundan kendiliğinden salınan AK’ ye olan cevabı artırır.
Hayvan türleri arasında kolinerjik nöron dağılımındaki yaygınlık göz önüne
alındığında, tarımsal insektisidler, pestisidler ve potansiyel kimyasal silahlar
formunda toksik maddeler olarak anti-KE’ ların yaygın uygulama alanına sahip
olması şaşırtıcı değildir. Bununla birlikte, bu sınıftaki birçok bileşik, geniş çapta
terapötik kullanıma sahiptir (Brunton ve ark., 2006).
11
1.3. Etefon
Etefon (ETF) [(2-kloroetil) fosfonik asit] (CAS No: 16672–87–0), doğal bir bitki
hormonu olan etilen gazını salgılatarak meyve olgunlaşmasını teşvik eden,
absisyonu, çiçeklenmeyi başlatan ve diğer bitki cevaplarında kullanılan bir bitki
gelişim düzenleyicidir (Segall ve ark., 1991; U.S. EPA., 1995). ETF, fizyolojik pH’
da kendiliğinden fitohormon olan etilene ayrışan bir kaynak olarak görev yapan en
önemli bitki gelişim düzenleyicilerinden biridir (Zhang ve Casida, 2002).
Şekil 1.1. Etefonun kimyasal yapısı (C2H6ClO3P) (U.S. EPA., 1995).
ETF, gıdaların ve lifli hububatların hasat öncesi ve sonrası olgunlaşmasını teşvik
etmek için kullanılan en önemli bitki gelişim düzenleyicilerinden birisidir. Büyük
oranda pamukta olmak üzere, ABD’ de yıllık kullanımı 5,4 milyon pound ve
Kaliforniya’ da 0,9 milyon pounddur (Haux ve ark., 2002).
Saf etefon 74–75 °C’ de eriyen beyaz mumsu katı bir maddedir. Etefon suda,
alkolde, asetonda ve propilen glikolde çok iyi çözünür, benzen ve toluen gibi
aromatik çözücülerde sadece hafif çözünür ve kerosen ve dizel yağlarda çözünmez.
Molekül ağırlığı 144,5 g/mol’ dür (U.S. EPA., 1995). Yüksek pH’ da, etilenin
salgılanması ile birlikte ayrışma meydana gelir, pH’ sı 5’ den az sulu çözeltileri
stabildir, pKa1 değeri 2,5, pKa2 değeri 7,2’ dir (Tomlin, 1997). Bileşik, yüksek
konsantrasyonlarda (> % 87) mum kıvamında katı bir madde olduğundan
kullanılması zordur. Birçok toksikolojik çalışmada kullanılan ve de pazarlanan, % 71
etefon ve % 21 su içeren teknik üründür. Her ne kadar ETF, bir dibazik fosfonik asit
olsa da, ticari formülasyonları antikolinesteraz aktivite gösterir (INCHEM, 2002).
Teknik sınıf ETF genelde, yüksek oranda asidik olan yoğunlaştırılmış sulu çözelti
12
olarak formüle edilir. Yavaş bir şekilde pH 3’ ün altında ayrışır ancak daha alkali
pH’ larda hızlı şekilde etilen, fosfat ve klor iyonları oluşturmak üzere ayrışır. Basit
şartlar altında, alkoller veya fenollerle sırasıyla monoester alkil veya aril fosfatlar
oluşturmak üzere tepkimeye girerek fosforile edici etkisini yansıtır (Segall ve ark.,
1991).
ETF’ nin birbiriyle alakası olmayan bitkilerde etilen gazı salgılatması ve insanlarda,
köpeklerde, ratlarda ve farelerde plazma BKE aktivitesini baskılaması gibi iki
biyolojik etkisi vardır. AKE’ ye göre BKE’ ye olan etkisi daha seçicidir. ETF’ nin
enzim inhibisyonu üzerindeki etkinliğini belirlemek amacıyla yapılan bir çalışmada
köpek plazma BKE’ si en duyarlı, insan ve fare BKE’ si orta duyarlı ve rat BKE’ si
en az duyarlı olarak bulunmuştur (Haux ve ark., 2000).
BKE aktivitesi ilerleyen ve geri dönüşümsüz şekilde, paraokson gibi klasik triester
fosfatlar ve ayrıca şaşırtıcı şekilde ETF dianion tarafından Ser-198 noktasında
fosforilasyon ile inhibe edilir. ETF ve yakın analogları tarafından BKE aktivitesinin
dönüşümsüz olarak inhibe edilmesi fosfonik asitler arasında eşsizdir, çünkü
çoğunlukla reaktif türler değillerdir ve dönüşümlü enzim inhibitörleri yerine görev
yaparlar (Zhang ve Casida, 2002).
ETF’ nin etki şekliyle ilgili öne sürülen mekanizma, BKE’ nin S198 aktif
noktasından fosforilasyonudur. BKE’ nin ETF ile inhibisyonunun mekanizması,
triester OF bileşiklerin (paraokson gibi) yaptığı AKE ve BKE inhibisyonunun
mekanizmasıyla benzerliklere sahiptir. Bu inhibisyon ilerleyici ve geri
dönüşümsüzdür (Haux ve ark., 2002). Sulu ortamda ETF, fosfat ve etilen
salgılattığından ve su varlığında primer alkolleri fosforile ettiğinden (Haux ve ark.,
2000), bu gözlem, BKE aktif noktasının ETF tarafından, öne sürülen fosforilasyonu
için bir model olarak görev yapar. İnsan plazmasındaki BKE, ETF tarafından yavaş
ama ilerleyici şekilde inhibe edilir. ETF, fosforilasyon yoluyla, kloroetil kısmıyla
derivatizasyon yoluyla veya serbestleşen etilenin reaksiyonu yoluyla inhibe edebilir.
13
ETF, fosforile edici ajanlara göre çok zayıf bir alkile edici ajandır. Ayrıca, sadece
S198’ i değil, BKE’ deki diğer noktaları da derivatize eder (Haux ve ark., 2002).
İncelenen bir düzineden fazla diğer esteraz, BKE’ nin ETF’ ye olduğundan 10 ila
100 kat daha az duyarlıdır. Bu sebeple, BKE inhibisyonu, ETF maruziyeti için en
duyarlı belirleyici olmaktadır. ETF‘ nin bir BKE ve daha az oranda AKE inhibitörü
olmasının keşfi, daha duyarlı olabileceği düşünülen diğer esterazlar tarafından takip
edilmemiştir. Birçok plazma ve karaciğer esterazı in vitro şartlarda duyarlı olsa da,
BKE in vivo olarak en duyarlıdır. Sonuç olarak, BKE inhibisyonu, ETF
maruziyetinin en duyarlı belirteci olarak kalmaya devam etmektedir (Haux ve ark.,
2002).
EPA’ nın kayıtlarına göre ETF, Grup D’ de yer almaktadır (insanlar için
karsinojenliğini gösterir yeterli kanıtın bulunmadığı grup). İnsanlara ağızdan 28 gün
1,8 mg/kg/gün dozunda ETF verilerek yapılan çalışmalara dayanarak referans doz
(RfD) değeri 0,018 mg/kg/gün olarak belirlenmiştir (U.S. EPA., 1995). Ratlarda,
akut oral LD50 değeri 3030 mg/kg ve kronik besinsel NOEL (etki görülmeyen düzey)
değeri 3000 ppm’ dir (Haux ve ark., 2002).
ETF, tavşanların kullanıldığı akut dermal irritasyon çalışmalarında korozif olarak
bulunmuştur; göz iritasyonuna sebep olma potansiyeli mevcuttur ve bu etkileri
nedeniyle Zehirlilik Kategori I’ de (dört kategorinin en üst düzeyi) yer almaktadır.
Ağızdan, deriden ve solunum yolundan orta dereceli akut toksiktir (Zehirlilik
Kategori III) ve deri duyarlılığına yol açmaz (U.S. EPA., 1995).
Farelerde OF pestisidler ile oluşan BKE inhibisyonunun ve süksinilkolin
toksisitesinin güçlenmesinin araştırıldığı bir çalışmada, ETF periton içi olarak (200
mg/kg, 1 saat) farelere uygulandığında, süksinilkolinin LD50 değerini kontroldeki 2,4
mg/kg’ dan 0,59 mg/kg’ a düşürdüğü, bunun da toksisitedeki 4-kat artışı gösterdiği
belirtilmektedir. Serum BKE aktivitesisinin 1 saat ETF uygulaması ile % 77-94
14
inhibe olduğu, farelerin süksinilkolin toksisitesine duyarlı hale geldiği
kaydedilmektedir (Sparks ve ark., 1999).
İnsan ve hayvan beslenmesinde yararlanılan birçok bitkide kullanılan ETF için
tolerans düzeyi yeniden değerlendirilmiştir. Değerler genelde kabul edilebilir
olmakla beraber yine de bazı değişiklikler gerekmektedir. EPA’ nın besin risk
değerlendirmesine göre ETF’ nin ürünlerde kullanılması durumunda en büyük
maruziyet ve risk grubunu bir yaşın altındaki bebeklerin oluşturduğu belirtilmektedir.
Buna rağmen, EPA riskleri hesaplarken basit değerlendirmeler kullanmıştır, bundan
dolayı bebeklerdeki gerçek besinsel maruziyet ve riskin çok düşük olduğuna
inanılmaktadır. Diğer bir risk grubunu ise pestisid uygulayıcıları ile uygulama
sonrası ETF uygulanan ürünlerle temasta olan işçiler oluşturmaktadır (U.S. EPA.,
1995).
1.4. Klorprifos
Klorprifos (CPF) [ O,O-dietil O-(3,5,6-trikloro-2-pridinil) fosforotioat ] temas,
sindirim ve solunum etkisi ile kolinesteraz inhibitörü olarak etkiyen sistemik
olmayan OF insektisiddir. Tarım, bahçecilik, bağcılık ve ormancılık alanında, çok
sayıda üründe, vektör kontrolünde ve diğer halk sağlığı uygulamalarında
kullanılmaktadır (WHO, 2002).
Şekil 1.2. Klorprifosun kimyasal yapısı (C9H11Cl3NO3PS) (WHO, 2002).
Teknik CPF (CAS No: 2912–88–2), erime ısısı 41,5–42,5 °C olan beyaz kristalize
katı bir maddedir. CPF, nötr ve asidik sulu çözeltilerde stabildir, ancak, artan pH ile
15
birlikte stabilitesi azalır. CPF, pratik olarak suda çözünmez, ama birçok organik
çözücüde (aseton, ksilen, metilen klorür gibi) çözünür. Molekül ağırlığı 350,6 g/mol’
dür (U.S. EPA., 2002).
CPF, yaygın şekilde pest kontrolünde kullanılmaktadır ve diğer OF insektisidler gibi
ortak metabolik işlemleri ve toksisite mekanizmalarını paylaşırlar. Ana CPF bileşiği
AKE’ ın zayıf inhibitörüdür ki asıl güçlü AKE inhibitörü olan CPF-oksona CYP-
aracılı oksidatif desülfürasyon ile metabolize olur (Cochran, 2002; Poet ve ark.,
2003). Birçok yönden, okson-metaboliti KE inhibitörü olarak CPF’ den 106 kat daha
aktifdir. Bu metabolit ayrıca, ana bileşikten rat beyin AKE’ ını inhibe etmede 300-
400 kat daha güçlüdür (El-Masri ve ark., 2004). Öncelikli olarak aktif okson
metaboliti (CPF-okson) ile AKE’ ı dönüşümsüz olarak baskılar. CPF-okson AKE’ yi
fosforile ederek AKE’ yi bağlar ve AK’ nin kolin ve asetata metabolize olmasını
engeller. Bu durum, kolinerjik sinapslarda asetilkolin birikimine bağlı olarak bir dizi
nörotoksik etki ile sonuçlanır (Cochran, 2002; Kousba ve ark., 2004).
CPF’ nin CPF-oksona metabolik etkinleştirilmesine, CYP450-aracılı oksidatif
desülfürasyonu ve önemli metaboliti trikloropridinol (TCP) ve dietilfosfat
oluşturarak detoksifikasyonuna CYP450-aracılı dearilasyon aracılık eder (Kousba ve
ark., 2003; Poet ve ark., 2003; Kousba ve ark., 2004). CPF-okson, AKE’ nin aktif
noktasındaki serin hidroksil grubunu fosforile eden elektrofilik bir bileşiktir (Kousba
ve ark., 2004). Desülfürasyon ve dearilasyon arasındaki denge çok değişik
düzeylerde AKE inhibisyonu ile sonuçlanır. Birçok çalışma, oksonların BKE ve
karboksilesteraz (KAE) gibi diğer hedef olmayan B-esterazların güçlü inhibitörü
olduğunu göstermiştir (Kousba ve ark., 2003). AKE, BKE ve KAE gibi B-esterazlar
stoikiometrik olarak okson tarafından inhibe edilirken, A-esterazlar (PON1)
enzimatik olarak OF bileşikleri hidrolize eder ancak inhibe olmazlar. CPF-oksonun
PON1 metabolizması, TCP oluşturmak üzere oksonun deaktive olması ile sonuçlanır
(Poet ve ark., 2003). CPF-okson KAE ile bağlanarak veya oksonaz (organik
fosforlularla inhibe olmayan esteraz) ile hidrolize olarak detoksifiye olabilir
(Cochran, 2002). BKE ve KAE stoikiometrik olarak bir kısım oksonu detoksifiye
ettiğinden ve bu kısmın AKE’ yi inhibe etmesini önlediğinden, bu esterazların varlığı
16
AKE inhibisyonuna karşı potansiyel bir koruyucu mekanizma olarak
düşünülmektedir (Karanth ve Pope, 2000; Kousba ve ark., 2003).
Şekil 1.3. Klorprifosun metabolizması (U.S. HHS., 1997).
CPF’ nin, CPF-okson ve TCP (3,5,6-trichloro-2-pyridinol) adlı iki ana metaboliti
bulunmaktadır. TCP, kolinesteraz baskılanmasına yol açmaz ve CPF’ den daha az
zehirli bir maddedir. CPF ve diğer bazı organik fosforlu bileşikler iki aşamalı bir
yolla detoksifiye edilirler. Detoksifikasyon aşamaları, ana bileşiğin, oksona
sitokrom-P450 sistemiyle biyoaktivasyonu ve daha sonra oluşan okson bileşiğinin,
karaciğer veya serum paraoksonazları gibi esterazlar ile hidrolizini içerir (U.S. EPA.,
2002).
CPF’ nin etkisini gösterebilmesi için öncelikle karaciğerde CYP sistemi aracılığıyla
CPF-okson oluşturulması gerekir. Bununla birlikte, beyin de dahil diğer dokularda
karaciğer dışı CYP metabolizması bildirilmiştir. Bu bilgiler bağırsak CYP sisteminin
önemini ve CPF metabolizmasında etkin bir paya sahip olduğunu göstermektedir
(Timchalk ve ark., 2002). CPF-oksonun paraoksonaz (PON1) metabolizması, TCP
oluşturmak üzere oksonun deaktive olması ile sonuçlanır. CPF’ nin TCP’ ye
17
deaktivasyonu ile sonuçlanan CYP-aracılı dearilasyona CYP 2C ve 3A4 aracılık
eder. B-esteraz aktivitesi hem bağırsak hem de karaciğerde benzer iken, PON1
aktivitesi bağırsaklarda yaklaşık 100-kat daha düşüktür. Bununla birlikte, hem
biyoaktivasyon hem de detoksifikasyondan sorumlu metabolize edici enzimler,
karaciğerdekinden daha düşük düzeylerde ince bağırsaklarda da mevcuttur ancak
etkileri yine de önemli derecededir (Poet ve ark., 2003).
Ratlarda, CPF’ nin ağızdan 1 mg/kg dozu yaklaşık 2,5 ng/ml’ lik bir kan düzeyi
sağlar. Bu düzeyde beyin AKE aktivitesinde ölçülebilir bir azalmaya neden olmaz.
Bunun nedeni bu dozda CPF-okson’ un sinir sisteminde AKE enzimini
bağlayamamasıdır. Okson koruyucu mekanizmalarla detoksifiye edilir (Cochran,
2002).
Akut toksisite denemelerinde genç ratların yetişkinlere göre belirgin bir biçimde
CPF’ nin toksik etkilerine daha duyarlı oldukları görülmüştür. Gençlerdeki bu
duyarlılığın nedeni CPF-oksonu detoksifiye etme kabiliyetlerindeki azalmayla ilgili
bulunmuştur (Cochran, 2002). Ayrıca kolinesteraz baskılanması ve davranışsal
etkiler açısından yeni doğanlar yetişkinlere göre ağızdan CPF maruziyetine daha
duyarlıdır (Smegal, 2000).
CPF ağız, deri ve solunum yoluyla akut toksisite bakımından orta derecede zehirlidir
(Zehirlilik Kategorisi II). Testler CPF’ nin toksik etkilerine insanların hayvanlara
benzer şekilde ve muhtemelen daha da duyarlı olduğunu göstermektedir. Cinsiyet
bakımından ise dişiler erkeklere göre biraz daha fazla duyarlıdır (Smegal, 2000).
CPF gebe ratların yavrularında beyin gelişmesinde gecikmiş değişikliklere sebep
olur. Fare ve ratlarda kronik toksisite çalışmalarında CPF’ ye bağlı tümör
oluşumu/karsinojenite kanıtı kaydedilmemiştir. CPF, bakterilerde veya memeli
hücrelerinde mutajenik değildir ama mayada çok hafif genetik değişikliğe ve
bakteride de DNA hasarına sebep olur (Smegal, 2000).
18
Ratlarda ağızdan 1 mg/kg/gün’ lük akut toksisite çalışmasında, erkek ratlarda 3–6
saat sonra % 28–40 oranında plazma kolinesteraz baskılanması görülerek 0,5
mg/kg/günlük bir NOAEL (olumsuz etki görülmeyen düzey) belirlenmiştir. Buna
bağlı kalınarak da akut gıda RfD (referans dozu) 0,005 mg/kg/gün olarak
bulunmuştur. Köpeklerde ve ratlarda yapılan çalışmalarla kronik RfD 0,0003
mg/kg/gün olarak belirlenmiştir. Bu RfD’ ları elde etmek için NOAEL değerlerine
100 güven faktörü uygulanmıştır (Smegal, 2000).
1.5. Kombinasyon Çalışmaları
Toksisite verilerinin çoğu tek bileşik kullanılarak yapılan çalışmaları esas alır
(Gordon ve ark., 2006). Çevresel maruziyet ise çoğunlukla birçok kimyasalın
varlığına bağlıdır. Birçok olguda, bu kimyasallar hem farmakokinetik hem de
farmakodinamik toksisite mekanizmalarıyla birbirleriyle etkileşir (El-Masri ve ark.,
2004). Anti-kolinesteraz insektisid karışımları arasındaki bir etkileşim antagonistik
veya sinerjistik olabilir veya karışım sıfır etkileşim yani aditiflik gösterebilir. Toksik
kimyasal karışımlarına insanların maruziyeti, saflaştırılmış bileşiklere maruziyetten
muhtemelen daha yaygındır, ancak pestisid karışımlarının yan etkileri üzerine
çalışmalar sınırlıdır (Gordon ve ark., 2006). Veri yokluğunda, bir karışımın bir
aradaki toksisitesinin değerlendirilmesinde, geçerli doz veya cevap aditifliği esas
alınır. Her ne kadar aditiflik konsepti çoğunlukla düşük doz düzeylerinde kabul
edildiyse de, düşük çevresel maruziyet düzeylerinde, olası bir sinerjistik veya
antagonistik etkileşimin yokluğu olarak aditiflik kullanılmasının geçerliliği için, bu
düzeylerin kantitatif olarak saptanması gerekmektedir. Etkileşimin belirgin hale
geldiği dozlar, etkileşim eşiği olarak tanımlanmaktadır (El-Masri ve ark., 2004).
Karbamat ve OF karışımlar arasındaki etkileşimler üzerine in vitro ve in vivo
yaklaşımları kullanarak yapılan çok az sayıda çalışma mevcuttur (Gordon ve ark.,
2006).
CPF ve paratiyon, özellikle çiftliklere yakın olmak üzere çevrede bir arada
bulunmaktadırlar. Her iki kimyasal ortak toksisite mekanizmasıyla etki gösterirler.
19
Her ikisi de, aynı hedef moleküle sahiptir ve AKE’ yi inhibe ederler. Bu iki kimyasal
arasında, metabolizma düzeyinde P450 enzimleriyle yarışma yoluyla ve cevap
düzeyinde AKE bağlanma noktalarına yarışma yoluyla etkileşim mevcuttur. CPF ve
paratiyonu örnek alarak ikili bir karışım için bir etkileşim eşiği saptanmasında
Fizyolojik Esaslı Farmakokinetik modelin uygulamasını göstermek amacıyla yapılan
bir çalışmada her kimyasalın 0,08 mg/kg’ dan düşük oral doz düzeylerinde aditiflik
elde edildiği, yüksek dozlarda, enzimatik yarışmalı inhibisyon yoluyla
antagonizmanın etkileşim şekli olduğu ifade edilmektedir (El-Masri ve ark., 2004).
OF pestisid ile zehirlenme olgusunda, periferik dokular ve MSS’ de AKE
inhibisyonu ile ilgili olarak bir toksisite aditifliği varsayımı vardır. Eğer gerçekten
böyleyse, o zaman bu pesitisidlerin karışımlarının fizyolojik etkilerinin de aditif
olabileceği beklenmelidir ancak bu çok nadiren denenmiştir. Karbamat olan
fizostigmin ve OF sinir gazı olan sarin arasındaki antagonizma iyi bir şekilde ortaya
konulmuştur. Anti-KE ajanlar ayrıca fiziko-kimyasal özellikler gösterir ve kolinerjik
sistemler dışında, nörotransmitter yolakların aktivasyonu gibi diğer kolinerjik
olmayan hedefleri olabilir. Bu nedenle, farmakokinetik ve ilave etkiler, anti-KE
pestisidlerin ana etki şeklini değiştirebilir ve karışım halinde verildiklerinde toksisite
ve duyarlılıktaki belirtilen farklılıklara muhtemelen katkıda bulunabilir (Gordon ve
ark., 2006).
Toksikolojik belirteç olarak hipotermi ve KE inhibisyonunu kullanarak CPF ve
Karbaril (CAR) antikolinesteraz insektisidlerinin karışımları arasında bir etkileşim
olup olmadığını değerlendirmek amacıyla yapılan bir çalışmada, CPF, 0 ila 50 mg/kg
ve CAR, 0 ila 150 mg/kg uygulanan yetişkin Long-Evans ratlarında çekirdek ısısının
(Tc) devamlı olarak radyotelemetre ile gözlemlendiği, CPF ve CAR 2:1 ve 1:1
orandaki karışımlarının ısı indeksi (TI) üzerine etkilerinin incelendiği
belirtilmektedir. CPF ve CAR’ ın, belirgin bir hipotermi ve TI’ de doza-bağlı bir
düşüş ortaya koyduğu, CPF:CAR’ ın 2:1 oranda karışımının TI cevabının aditiflik ile
tahmin edilene göre belirgin şekilde daha düşük olduğu ve CPF:CAR’ ın 1:1 oranda
karışımının TI cevabının tahmin edilen aditiflikten belirgin şekilde farklı olmadığı
kaydedilmektedir. Plazma ve beyin KE aktivitesi, farklı rat gruplarında CPF, CAR ve
20
karışımları ile dozlamadan 4 saat sonra ölçüldüğünde, beyin KE’ ın inhibisyonu
açısında 2:1 oranı için, bir doz-aditif etkileşimi olduğu ancak 1:1 oranı için bir
antagonistik etkisi olduğu, ayrıca plazma KE’ si üzerine 2:1 ve 1:1 karışımlarının
yine antagonistik bir etkileşimi olduğu belirtilmektedir. Fizyolojik (ısı) ve
biyokimyasal (KE inhibisyonu) belirteçlerin 2:1 ve 1:1 karışım çalışmaları için
aditiflikten ayrılmasının beklendiği gibi olmadığı, CPF ve CAR arasındaki
etkileşimin, karışımdaki bileşiklerin oranına ve biyolojik belirteçlere bağlı olduğunun
görüldüğü ifade edilmektedir. Çalışmada ayrıca, CPF’ nin hipotermik gücünün CAR’
a göre 5 kat fazla olduğu kaydedilmektedir. CPF’ nin birçok davranışsal ve otonom
sistemler söz konusu olduğunda CAR’ dan devamlı daha güçlü olduğu gösterildiği
belirtilmektedir (Gordon ve ark., 2006).
Farelerde Maleik Hidrazid (MH) ve ETF’ nin tek ve kombine haldeki subkronik
toksik etkilerinin araştırıldığı bir çalışmada, klinik bulgularda, bütün deneme
gruplarında kontrole göre farelerin canlı ağırlık kazancında bir düşüş görüldüğü ve
bu düşüşün kombinasyon gruplarında, kontrole ve tekli gruplara göre daha fazla
olduğu belirtilmektedir. Bunun nedeni olarak MH ve ETF’ nin bir arada karaciğer ve
böbrek üzerine güçlenen toksik etkisine bağlı yem ve su tüketiminde azalma olması
gösterilmektedir. Ayrıca MH ve ETF kombinasyonlarında, etki güçlenmesi olmadığı
ve ETF’ nin düşük dozlarında MH’ nin karaciğerdeki etkisini engellediği ve bunun
artan dozla belirginleştiği kaydedilmektedir. Yine aynı çalışmada MH’ in artan
dozunun ETF ile kombinasyonuna bağlı olarak böbrekteki toksik etkisinin arttığı
ancak ETF dozundaki artışın etkiyi değiştirmediği bildirilmektedir. Araştırmada,
erkek farelerde MH ve ETF’ nin karaciğer ve böbreği tek ve kombine halde iken süre
ve dozlar bakımından etkilediği ancak kombinasyonlarda böbrekteki etkiler genelde
güçlenirken karaciğerde iki madde arasında zıt bir etkileşim olduğu, özellikle
erkeklerde belirgin olmak üzere her ikisinin de artan dozlarında ve uzun süre
maruziyette bu etkinin aşılarak aynı yönde etkileşim olduğu sonucuna varıldığı
belirtilmektedir (Yazar, 2005).
Tavşan ve koyun trakea düz kası üzerine levamizolün etkisinin tek başına ve
triklorfon ile birlikte araştırıldığı çalışmalarda, levamizolün tavşanlarda karbakolün
21
pD2 değerini azalttığı, Emax’ ını artırdığı, betanekol cevabını pD2 düzeyinde
azaltırken, Emax düzeyinde herhangi bir değişiklik yapmadığı belirtilmektedir.
triklorfon (10-4M) ve levamizol (5x10-5M) ile bir aradaki uygulamanın, tek başına
triklorfon uygulamsına göre Emax değerini anlamlı şekilde düşürdüğü, bu durumun
levamizolün triklorfonun etkisini azalttığını gösterdiği ifade edilmektedir.
Tavşanlarda, triklorfon (10-6M)+levamizol ile (5x10-5M) dokunun inkübasyonunun
karbakolün pD2 cevaplarını, triklorfon+karbakolünküne göre belirgin şekilde
düşürdüğü ve bu durumun levamizolün karbakolün bağlandığı reseptörlere
bağlandığını ve karbakolün reseptöre afinitesini azalttığını gösterdiği ve Emax’ da ise
bir değişiklik gözlenmemesinin levamizol+triklorfon kombinasyonunun,
triklorfon+karbakol kombinasyonu düzeyinde bir kolinerjik etkiye neden olduğunu
gösterdiği belirtilmektedir (Üstüner, 2003). Koyun trakea düz kasında levamizol ile
20 dakika inkübasyonun asetilkolinin sadece Emax değerlerini istatistiksel önemde
artırdığı, triklorfon ile inkübasyonun asetilkolin pD2 cevaplarını düşürdüğü ve
triklorfonun levamizol ile beraber inkübasyonunun ise, asetilkolin cevaplarını sadece
levamizol ile inkübasyon yapılmış olanınkine göre, pD2 ve Emax düzeyinde
düşürdüğü ve bu durumun iki madde arasında zıt etkileşim olduğunu gösterdiği ifade
edilmektedir (Baydan ve ark., 2002).
Genellikle suda çözünmediklerinden dolayı, birçok pestisid çok değişik çözücüde
formüle edilir ve sıklıkla güçlendiricilerle bir arada kullanılır. Pestisidlerin bir arada
kullanıldığı durumlarda, sadece bu pestisidler arasında değil, ayrıca pestisidler,
çözücüler ve güçlendirici maddeler arasında da etkileşim potansiyeli vardır. Teorik
olarak, bu etkileşimler, etkisiz bir bileşiğin etkin bir bileşiğin etkisini artırdığı
potansiyelizasyon şeklinde, bir etkin bileşiğin diğer bir etkin bileşiğin etkisini
artırdığı sinerjizma şeklinde, bir bileşiğin diğerinin etkisini azalttığı inhibisyon
şeklinde olabilmektedir. Alternatif olarak, bileşikler etkileşmeyebilmekte ve bunların
kombine etkileri basitçe her bir bileşiğin aditif etkisi olabilmektedir (Axelrad ve ark.,
2002).
Pestisidler ve pestisid formülasyonlarının bileşenleri arasında etkileşimin araştırıldığı
bir in vitro nörotoksisite çalışmasında, NB2A nöroblastoma hücreleri, OF Diazinon
22
ve CPF varlığında farklılaşmak için uyarılmışlardır. Her ne kadar OF bileşiklerin
genellikle in vivo olarak piretroidlerden daha nörotoksik olduğu düşünülse de, burada
kullanılan in vitro nörotoksisite denemeleri, nöroblastoma hücrelerine doğrudan
uygulandığında piretrumun OF diazinon ve CPF’ den daha nörotoksik olduğunu
göstermektedir. Çalışmada, her bileşiğin kendi başına yapacağı etkilerden tahmin
edilen, aditif etkilere kıyasla bir aradaki bileşiklerin artmış veya azalmış etkileri
kapsamında etkileşimler saptandığı ve sinerjizmanın, CPF ve Ticari Formülasyon 1’
de bulunan solventlerin biri arasında ve 10 µM CPF ve 500 nM piretrum
kombinasyonları arasında saptadığı belirtilmektedir. Tüm diğer OF ve preparat
kombinasyonlarının nörotoksisite yönünden aditif olduğu ifade edilmektedir. CPF’
nin, pro-konvülzif aktivitesinde ksilen ile aditifliği olduğu ancak sinir hücresi
farklılaşması üzerine etkilerinde CPF ve çözücüler arasında sinerjizma olduğunu
bildirilmektedir. Normal spiritlerin içindeki çözücüler, CPF’ nin toksisitesini
artıracak çok sayıda yolla etki edebilir. CPF’ nin hücre zarından geçişini teşvik
edebilir böylelikle çok yüksek etkili hücre içi derişime izin verir. Bunun dışında,
çözücülerin varlığında artan toksisitenin bir bölümü sinir doku tarafından
pestisidlerin sınırlı bir oranda metabolik işlemlere uğradığı varsayılarak, sinir hücresi
tarafından pestisidlerin metabolizmasının bazı yönleri üzerine bir etkileşime bağlı
olabilir. Örneğin, aseton bazı CYP enzimlerinin oluşumunu artırırken, etanol asetona
metabolize olur ve sonra CYP aktivitesini artırmaktadır. Bu veriler, çoklu OF-içeren
pestisid formülasyonlarına maruziyetin hücresel düzeyde doğrudan bir mekanizma
ile sinerjistik nörotoksisiteye sebep olabileceğini göstermektedir. Çalışmada
kombinasyonlar arasında sinerjizmanın belirlendiği, diğer bütün organik fosforlu
kombinasyonları ve ürünlerinin, nörotoksisite açısından aditif etkili olduğu ve
çalışma sonucunda çoklu organik fosforlu pestisid formülasyonlarının doğrudan
mekanizmayla hücresel düzeyde sinerjistik nörotoksisiteye neden olabileceği
belirtilmektedir (Axelrad ve ark., 2002).
Yaygın şekilde kullanılan iki OF insektisid olan CPF ve metil paratiyonun (MPS)
ikili karışımlarının etkileşimli toksisitelerinin yetişkin ratlarda ardışık veya eş
zamanlı uygulamayı takiben kıyaslanmasının çalışıldığı bir araştırmada, CPF ve 4
saat sonra MPS uygulanan yetişkin ratlarda, aynı dozlar ancak önce MPS’ nin
23
uygulandığı ratlara göre daha çok toksisite belirtisi ve daha yaygın ölüm görüldüğü
belirtilmektedir. Ayrıca her iki OF insektisidin aynı zamanda uygulandığı ratlara
kıyasla CPF’ nin önce uygulandığı grupta daha çok toksisite kaydedildiği ifade
edilmektedir. Bazı dokularda, kolinesteraz inhibisyonunun, MPS’ nin önce
uygulandığı ve eş zamanlı maruziyet gruplarına kıyasla CPF’ nin önce uygulandığı
grupta daha yüksek olduğu ve böylece, ardışık uygulama ile hem fonksiyonel hem de
biyokimyasal toksisite belirteçlerinin iki insektisidin benzer dozlarının verildiği
ancak önce CPF maruziyeti olanda daha yaygın şekilde etkilendiği bildirilmektedir.
Toksik etki için hem CPF hem de MPS kendi ilgili oksonlarına metabolik olarak
aktive olmak zorunda olduğundan, ilk önce CPF uygulanan ratlarla kıyaslandığında
bu grupta gözlemlenen düşük toksisiteye katkıda bulunabilen eş zamanlı maruziyetle
biyoaktivasyon noktaları için yarışabileceği de belirtilmektedir. Maruziyet sırasının
önemli şekilde toksisiteyi belirleyebildiği sonucuna varıldığı ve bunun sinirsel
fonksiyon ile doğrudan ilgili olmayan anahtar detoksifikasyon esterazların
tükenmesinden kaynaklandığı belirtilmektedir (Karanth ve ark., 2004).
Ratlarda, CPF ve DZN’ nin ikili karışımlarına ağızdan maruz kalmayı takiben
farmakokinetik ve farmakodinamik etkileşimlerinin araştırıldığı bir çalışmada ratlara,
ağızdan CPF, DZN veya bir CPF/DZN karışımı uygulandığı ve uygulamadan 0, 3, 6,
12 ve 24 saat sonra kan ve beyin ayrıca 24.saatte idrar örnekleri toplanması sonucu,
CPF, DZN ve ilgili metabolitleri TCP ve IMHP’ nin, kan ve/veya idrarda
hesaplandığı ve kolinesteraz inhibisyonunun beyin, alyuvar ve plazmada ölçüldüğü
belirtilmektedir. CPF/DZN’ ye 15/15 mg/kg düşük dozda maruz kalmanın, CPF,
DZN veya kandaki metabolitlerinin farmakokinetiğini değiştirmediği, yüksek ikili
doz olan 60/60 mg/kg’ ın Cmax ve EAA’ yı artırdığı ve her iki bileşik için klirensi
azalttığı ve bunun muhtemelen CYP metabolizması için CPF ve DZN arasındaki
yarışmaya bağlı olduğu ifade edilmektedir. Kolinesterazın doza-bağımlı şekilde
baskılanmasının hem tek hem de bir arada maruziyetler için dokularda kaydedildiği
ve baskılanma derecesinin plazma>alyuvar>=beyin şeklinde olduğu, kolinesteraz
baskılanması için toplam nispi etki gücünün CPF/DZN>CPF>DZN şeklinde olduğu
belirtilmektedir. Görünür farmakokinetik etkileşimlerin olmadığı düşük ikili dozda
(15/15 mg/kg) kolinesteraz cevabının kıyaslanmasının, toplam kolinesteraz cevabının
24
aditif olduğunu gösterdiği vurgulanmaktadır ve deneylerin, pestisid karışımları için
potansiyel farmakokinetik ve farmakodinamik etkileşimlerle ilgili önemli veriler
sunduğu ve bu insektisidlere mesleki veya çevresel maruziyetle birlikte oluşan
potansiyel kümülatif risklerin değerlendirilmesi için gerekli kavrayışı sağlayacağı
belirtilmektedir (Timchalk ve ark., 2005).
OF insektisidler, neredeyse tüm tarımsal ve ticari uygulamalarda pest kontrolü için
rutin olarak kullanılmaktadır, bu yüzden, profesyonel uygulayıcıların, tarımsal
alanlarda çalışanların ve genel nüfusun insektisid karışımlarına maruz kalabileceğini
ummak tamamen mantıklıdır. Bu yüzden, bu insektisidlere maruziyet, çiftliklerin ve
bahçelerin yakınında yaşayan tarım çalışanları ve ailelerinin ve pestisidlerin evde
uygulanmasıyla veya gıdalardaki kalıntılar yoluyla maruz kalabilen genel nüfusun
dahil olduğu geniş bir popülasyon segmentini içerebilir. Kullanılan çok çeşitli
pestidlere bağlı olarak, hem mesleki hem de çevresel maruziyet öncelikli olarak
karışımlarla ilgili olanlardır; bununla birlikte sadece birkaç çalışma, eş zamanlı veya
ardışık OF pestisid karışımlarına maruziyetin toksikolojik etkilerini tanımlamaya
başlamıştır. Çok sayıda biyo-gözlemleme çalışması idrarda birçok OF metabolitlerin
varlığını ölçmektedir ve bu alanda çalışan işçilerde plazma KE baskılanması
bildirmektedir. Bunlara ilaveten, tarımla uğraşan ailelerin ve çiftlik ve bahçelerin
yakınında yaşayan ailelerin çocukları, konutlarında veya yakınlarında bu kimyasal
maddelerinin yüksek oranda kullanılmasına bağlı olarak karışık kimyasal
maruziyetten kaynaklanan büyük bir risk altında olabilir. Benzer farmakokinetik ve
etki şekli özellikleri esas alındığında, OF insektisid karışımları arasında etkileşim
için bir potansiyel varsayılmaktadır (Timchalk ve ark., 2005).
Gıdalarda kalıntıları sıklıkla bulunan 5 pestisid karışımı (alfa-sipermetrin,
bromopropilat, karbendazim, klorprifos ve mankozeb) ile ratlarda ağızdan 28 günlük
tekrarlı doz toksisite çalışmasında, Danimarka Veteriner ve Gıda Yönetimi
tarafından incelenen örneklerde pestisid kalıntılarının meyve, sebze ve tahıllarda
bulunduğu, Danimarka’ da üretilen meyvelerden alınan test örneklerinin % 30-40’
ında ve Danimarka dışında üretilen meyvelerden alınan test örneklerinde yaklaşık %
70-75 pestisid kalıntısı bulunduğu ve ayrıca meyve ve sebzelerin % 26’ sında çoklu
25
pestisid kalıntısı bulunduğu ve CPF’ nin, Danimarka’ da gıdalarda maksimum kalıntı
düzeyinin aşıldığı pestisidlerden birisi olduğu ifade edilmektedir. Çalışmada, diğer
yaygın şekilde bulunan pestisid kombinasyonlarına aynı anda maruziyetin
toksikokinetik veya toksikodinamik etkileşim ile CPF’ nin toksisitesini değiştirebilip
değiştiremeyeceğini değerlendirmek için beşi arasında en toksik olan güçlü AKE
inhibitörü CPF üzerine odaklanıldığı ve hedef olarak CPF tarafından plazma ve beyin
AKE inhibisyonunun aynı anda dört pestisidin alfa-sipermetrin, bromopropilat,
karbendazim ve mankozeb uygulanmasının karaciğerde veya diğer toksikokinetik
etkileşimlerle CPF’ nin artan metabolizması yoluyla artıp artmayacağını aydınlığa
kavuşturulması olduğu belirtilmektedir. Sonuç olarak, yaşam parametrelerinde klinik
toksisite yan etkileri gözlemlenmediği, tüm grupların deney süresi boyunca ağırlık
kazandığı ve her bir cinsiyette gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar
bulunmadığı bildirilmektedir. Tüm grupların, yem ve su tüketiminde normal bir
yaşa-bağlı azalma gösterdiği ve motor aktivitede doza-bağlı değişiklikler olmadığı
ifade edilmektedir. Aynı çalışmada, plazma ve nispi beyin AKE aktivitesi
incelemelerinde, plazma AKE’ de hafif ancak istatistiksel olarak anlamlı olan düşük
aktivitenin kontrol olarak kullanılan erkeklere kıyasla bazı gruplardaki erkeklerde
tespit edildiği, plazma AKE düzeyinin erkeklere kıyasla dişilerde yaklaşık 3 kat daha
yüksek bulunduğu bildirilmektedir. Kesin veya nispi beyin AKE aktivitesinde
uygulamaya bağlı farklılıklar bulunmadığı belirtilmektedir. Plazma pestisid derişimi
yönünden yapılan denemelerde ise CPF’ nin bazı örneklerde bulunduğu ancak bunun
nicelendirilme düzeyinin altında düşük derişimde bulunduğu ifade edilmektedir.
CPF’ nin yıkımlanma ürünü TCP’ nin bazı gruplardaki tüm örneklerde bulunduğu ve
derişimlerinin doza bağımlı gibi olduğu belirtilmektedir. Yine bazı gruplardaki
erkeklerinin böbreklerinde nispi organ ağırlığının istatistiksel olarak anlamlı şekilde
arttığı ve bazı gruplarda hem erkek hem de dişi ratlarda nispi karaciğer ağırlığında
istatistiksel olarak anlamlı bir artış olduğu vurgulanmaktadır (Jacobsen ve ark.,
2004).
Her gün, insanlar çok sayıda pestiside gıdalar yoluyla eş zamanlı olarak maruz
kalmaktadır. Bununla birlikte, gıdalardaki pestisid kalıntılarının risk
değerlendirmesinde şu anki pratik, genellikle tek bileşikler üzerine yapılan çalışmalar
26
üzerine kurulmuştur. Aynı şekilde, tüketici sık sık gıdalar yoluyla birden çok
pestiside maruz kalır, pestisid kombinasyonlarına maruziyeti takiben yan etki bilgisi
sınırlıdır. Pestisidler bir arada alındığında, tek pestisidlere maruziyeti takiben
gözlenenlerden nicel ve/veya nitel olarak farklı olan toksik etki gözlemlenebilir.
Kimyasalların birlikte etkisinin veya kombinasyonların etkileşiminin üç temel şekli
tanımlanmıştır: basit benzer etki, basit benzemeyen etki ve gerçek etkileşim. Basit
etki, karışımdaki her kimyasalın aynı mekanizmayla aynı şekilde etkidiğini ve
bireysel olarak kimyasalların güçlerinde sadece farklılık olduğu durumu içine alır.
Basit benzemeyen etki, karışımdaki her kimyasalın kendi etkilerini gösterdiği ancak
karışımdaki diğer kimyasalların etkilerini değiştirmediği anlamına gelir. Son
durumda, etkileşim, daha güçlü bir etkiyle (sinerjizma) veya daha zayıf bir etkiyle
(antagonizm, inhibisyon) sonuçlanabilir. Basit karışımlar ve kompleks karışımlar
arasında ayrım yapılmaktadır. Basit bir karışım, nispeten az sayıda kimyasaldan yani
on veya daha az kimyasaldan oluşurken, kompleks karışımlar, onlarca, yüzlerce veya
binlerce kimyasaldan (örneğin bir iş alanı atmosferi gibi) oluşmaktadır (Jacobsen ve
ark., 2004).
1.6. Etki Gücü ve Etkililiğin Saptanması
Genel olarak, ilaç-reseptör etkileşimi ilk olarak ilacın reseptöre bağlanmasıyla ve
ikinci olarak bir biyolojik sistemde bir cevabın oluşmasıyla tanımlanmaktadır. İlk
fonksiyon, ilacın reseptör ile geri dönüşümlü olarak birleşmesine sebep olan
kimyasal kuvvetler tarafından yönetilen afinitenin kimyasal özellikleri tarafından
idare edilirken, ilaç-reseptör kompleksinden bir cevabın oluşması efikasite (ilacın ne
kadar iyi bir agonist ilaç olduğunu saptayan belirli bir ilaca ait intrinsik özelliktir)
olarak tanımlanan bir özellik tarafından idare edilir (Brunton ve ark., 2006).
İlaçlar biyolojik sistemlerde iki gözlemlenen özelliğe sahiptir: Potens ve etkinin
büyüklüğü (biyolojik bir cevap oluştuğunda). Potens, dört faktör tarafından kontrol
edilir: ikisi reseptörleri içeren biyolojik sistemle ilgilidir (reseptör yoğunluğu ve
dokunun uyarı-cevap mekanizmasının verimliliği) ve diğer ikisi reseptör-ilaç
27
etkileşimi ile ilgilidir (afinite ve efikasite). Aynı biyolojik sistemde, eşit efikasiteye
sahip iki agonistin nispi potensi hesaplanırken, verilen bir etkinin oluşması için yarı-
maksimal etkili derişimin (EC50) saptanmasıyla agonistin tarif edilmesi uygundur.
Böylelikle, EC50 değerlerinin kıyaslanmasıyla agonist potensinin ölçülmesi, farklı
agonistlerin bir test sisteminde bir cevap oluşturması için ve bir diğerinde
kıyaslanabilir etkinliğin tahmin edilmesi için kapasitesinin ölçülmesinin bir
metodudur. Agonist etkinliğinin hesaplanmasının diğer bir metodu, agonistin
maksimum cevap oluşturmadığı bir sistemde yaptığı en yüksek etkilerin (Emax)
kıyaslanmasıdır. Emax’ ların kullanılmasının avantajı, bu özelliğin sadece efikasiteye
bağlı olmasıyken, potens hem afinite hem de efikasitenin karma bir fonksiyonudur
(Brunton ve ark., 2006).
EC50, bazal çizgi ve Emax arasında yarı yolluk bir cevap oluşturan agonist derişimi
olarak ifade edilmektedir (Motulsky ve Christopoulos, 2003). Emax, ilacın
oluşturduğu maksimum etki ve EC50, Emax’ ın % 50’ sine eşit bir etki (yarı
maksimum etki) oluşturan molar ilaç derişimidir (Kayaalp, 2002). EC50 belirli bir
ilaç için doz-cevap eğrisinin yerini belirlediğinden, agonistin potensinin
ölçülmesinde en sık kullanılan bir ölçüdür. Bununla birlikte, agonistin reseptörüne
bağlanması olan Kd ile çoğunlukla aynı değildir, diğer bir ifadeyle Kd gibi ilacın
afinitesinin doğrudan bir ölçüsü değildir. pD2, EC50’ nin negatif logaritması olarak
tanımlanmaktadır. Potensi, bu şekilde ifade etmenin özel bir avantajı olmasa da bazı
alanlarda bu şekilde kullanılması yaygındır (Motulsky ve Christopoulos, 2003).
İlacın efikasitesinin (etkililiği) deneysel farmakoloji bağlamında göstergesi ilacın
maksimum (Emax değeri) etkisidir (Kayaalp, 2002).
28
1.7. Çalışmanın Amacı
Türkiye’ de ve yurt dışında geniş kullanım alanı olan organik fosforlu pestisidlere
değişik şekillerde maruziyet söz konusudur. Bu pestisidler üzerinde değişik
kombinasyon çalışmaları bulunmaktadır. Yapılan taramalara göre güvenli olduğu
vurgulanan ve toksik etkileri bireysel olarak incelenen etefon ve klorprifos hakkında
kombinasyon çalışması bulunmamaktadır. Klorprifos için daha fazla olmak üzere
klorprifos ve etefon için yapılmış ayrı araştırmalar bulunmaktadır. Bu araştırmalara
göre özellikle etefon genel anlamda güvenli bir madde olarak değerlendirilmektedir.
Ancak, bilindiği gibi yapılan testler saha koşullarına bire bir uymamaktadır.
Dolayısıyla normal yaşamda kimyasal maddelerin birine değil pek çoğuna aynı anda
maruz kalınması söz konusu olmaktadır. Bunun neticesinde in vivo koşullarda
kimyasal maddeler arasında aynı veya zıt yönde etkileşimler görülebilir. Bu durum
zararsız gibi belirlenen bir maddenin daha toksik etkili olmasına veya tamamen
etkisiz hale geçmesine neden olabilir.
Bu araştırma ile pestisid olarak pek çok ülkede olduğu gibi yurdumuzda da halk
sağlığı alanında pestlerle mücadele için yaygın olarak kullanılan klorprifos ile bir
bitki gelişim düzenleyicisi olarak geniş kullanım alanına sahip etefon arasındaki
etkileşimlerin in vitro koşullarda belirlenmesi amaçlandı. Böylece gerek insan ve
gerekse hayvan sağlığı bakımından önem taşıyan ve özellikle de zararsız olarak
görülen etefonun benzer etki mekanizmasına sahip klorprifos ile bir araya gelmesi
durumunda toksik etkinliğinin artıp artmayacağı belirlenmeye çalışıldı. Piyasada
kullanılan bu maddelere karşı olası maruziyet durumunda ne tür etkilerin olacağını
araştırmak amacıyla bu maddeler tek başlarına ve bir arada in vitro olarak rat ince
bağırsak kaslarına uygulandı ve etkileri incelendi. Bu tezin hipotezi, etefon ve
klorprifosun bir arada rat bağırsağında in vitro kolinerjik etkinliği artıracağıdır.
29
2. GEREÇ VE YÖNTEM
2.1. Araç ve Gereçler
2.1.1. Deney Hayvanları
Çalışmada, Sağlık Bakanlığı Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı Serum
Üretim ve Araştırma Laboratuarı Deney Hayvanı Üretim Bölümünden temin edilen
150–160 gram ağırlığında Wistar Albino soyu, 42 adet 3 aylık erkek rat
kullanılmıştır. Denemeler, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Farmakoloji ve
Toksikoloji Anabilim dalının Farmakodinami laboratuarında yürütülmüştür.
2.1.2. Deney Araçları
İzole Organ Banyosu
TDA 99 polygraph sistem (MAY)
FDT-10A izometrik gerim ileticisi (MAY)
WBC 3044V3 su banyosu ve sirkülasyon sistemi (MAY)
Bilgisayar
% 95 O2, % 5 CO2 içeren gaz karışım tüpü
Hassas Terazi (Sartorius Basic BA110S)
Otomatik pipetler: (Jencons – Sealpette 10–100 µl)
(Biohit Proline – Isolab 100–1000 µl)
Cerrahi malzemeler (pens, makas)
Petri kutusu
Enjektör 10 ml’ lik
Deiyonize su cihazı
30
2.1.3. Kimyasal Maddeler
Etefon (EFHUN 250 cc – Agrobest Ankara – 480 g/l saf Etefon), deiyonize suda 1 M
stok çözeltisi hazırlandı ve deiyonize su ile hazırlanan sulandırmaları kullanıldı.
Klorprifos (Klorprifos teknik – Dow AgroSciences), asetonda çözdürülerek 10-2 M
stok çözeltisi hazırlandı ve deiyonize su ile hazırlanan sulandırmaları kullanıldı.
Asetilkolin klorür (MA: 181,7 g/mol – Sigma A6625), deiyonize suda 1 M stok
çözeltisi günlük olarak hazırlandı ve deiyonize su ile hazırlanan sulandırmaları
kullanıldı.
Fizostigmin (MA: 413,5 g/mol – Eserin salisilat – Sigma E8500), deiyonize suda 10-2
M stok çözeltisi hazırlanarak kullanıldı.
Aseton (CH3COCH3 – Merck 1.00013)
Dietil eter ((C2H5)2O – Merck 1.00926)
2.1.4. Tyrode Çözeltisinin Bileşimi
Sodyum klorür (NaCl – Merck 1.16104): 136,9 mmol
Potasyum klorür (KCl – Merck 4935): 2,68 mmol
Kalsiyum klorür %95 (CaCl2 – Riedel-de Haen 12018): 1,8 mmol
Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2.6H2O – Merck 2503231): 1,05 mmol
Sodyum bikarbonat (NaHCO3 – J.T.Baker 0025010009): 11,9 mmol
Sodyum dihidrojenfosfat dihidrat (NaH2PO4.2H2O – Merck 1.06345): 0,4 mmol
D (+)-Glikoz monohidrat (C6H12O6.H2O – Merck 1.04074): 5,5 mmol
Deiyonize su
31
2.2. Yöntem
Yaklaşık 150–160 gram ağırlığındaki ratlar deneylere başlamadan bir gece önce aç
bırakılarak sadece su verildi. Hayvanlar eter anestezisi altında servikal dislokasyon
yöntemi ile öldürüldü (Tezuka ve ark., 2004). Ötenazi tekniğinin seçiminde, bazı
ötenazi metodlarının vasküler araşidonik metabolizma ve vasküler ve intestinal düz
kas kontraktilitesi üzerine etkilerini saptamak için tasarlanan bir çalışma esas alındı.
Söz konusu araştırmada, ratlara, dekapitasyon (DC), pentobarbital aşırı doz (PB)
veya CO2, metoksifluran (Met-DC) veya eter (eter-DC) ile anesteziyi takiben DC ile
ötenazi yapıldığı ve sonuçta, Met-DC ve PB’ nin vasküler prostasiklin sentezini ve
düz kas kontraktilitesini değiştirdiği, eter-DC’ nin bu parametreler üzerinde (düz kas
kontraktilitesi üzerine) değişiklik yapmadığı belirtilmektedir (Butler ve ark., 1990).
Hayvanın karın boşluğu, sternumdan başlayarak ventrale doğru ve göğüs kafesinin
karın boşluğuna birleştiği hat boyunca yanlara doğru T şeklinde açıldı. İnce
bağırsağın tamamı, iliosekal bağlantı ve pilorus kısımlarından ve çevre dokularla
olan bağlantılarından kesilerek Tyrode çözeltisi içeren bir petriye alındı. İlgili ince
bağırsak segmentleri tespit edilip mezenteryum ve pankreas gibi çevre doku
kalıntılarından temizlendi. Yaklaşık 1 cm uzunluğunda kesilen ince bağırsak parçası
daha önceden hazırlanmış ve içinde 10 ml Tyrode çözeltisi (37 °C, pH 7,4) bulunan
izole organ banyosuna her iki ucu açık olacak şekilde bağlanarak, 1 gram gerim
verilerek asıldı. Deney boyunca dokuya % 95 oksijen ve % 5 karbondioksit gaz
karışımı uygulandı.
Bir saat süreyle dengelenmeye bırakılan doku, her 15 dakikada bir Tyrode çözeltisi
ile 3 kez yıkandı. Dengelenme sonrasında deneylere başlanarak elde edilen
kasılmalar ve gerimdeki değişimler izometrik gerim ileticisi aracılığı ile ölçüldü ve
bilgisayara kaydedildi. Elde edilen yanıtların değerlendirilmesi, söz konusu ilaçların
pD2 ve Emax parametrelerinin karşılaştırılması ile yapıldı. En yüksek kasılmada elde
edilen değer %100 kabul edilerek, diğer derişimlerde elde edilen kasılmaların %
32
değerleri hesaplandı. Bu hesaplardan, “GraphPad Prism version 4.00 for Windows”
paket programı kullanılarak pD2 ve Emax değerleri tespit edildi.
2.3. Protokoller
2.3.1. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Asetilkolinin Etkisinin Araştırılması
Dokular organ banyosunda dengelendikten sonra asetilkolin her seferinde 0,5 log
artışla 10-9–10-4 M derişim aralığında kümülatif olarak hem duodenum hem de ileum
dokusuna ayrı ayrı uygulandı. Elde edilen yanıtların pD2 ve Emax değerleri ve en
yüksek kasılmayı veren değerlerin mg olarak ortalaması hesaplandı.
2.3.2. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefonun Etkisinin Tek Başına
Araştırılması
Dokular organ banyosunda dengelendikten sonra etefon kümülatif olarak 10-10, 10-9,
10-8, 10-7 ve 10-6 M derişimlerde hem duodenum hem de ileum dokusuna ayrı ayrı
uygulandı. Elde edilen yanıtlardan, en yüksek artış % 100 kabul edilerek yüzdelik
artış şeklinde hesaplanıp, ortalamaları alındı. Ayrıca etefonun en yüksek kasılmayı
veren değerlerinin mg olarak ortalamaları hesaplanıp, duodenum ve ileum dokusunda
kastırıcı etkisi de ortaya konuldu.
2.3.3. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefonun Etkisinin Asetilkolin ile
Birlikte Araştırılması
Dokular organ banyosunda dengelendikten sonra asetilkolin her seferinde 0,5 log
artışla 10-9–10-4 M derişim aralığında kümülatif olarak hem duodenum hem de ileum
33
dokusuna ayrı ayrı uygulandı. Dokunun yanıtları alındıktan sonra, 15 dakika ara ile
doku 3 kez yıkandı. Daha sonra doku etefon (Ön deneme sonuçlarına göre en
seyreltik derişim olan 10-10 M ile en iyi kasılmayı veren derişimin bir alt derişimi
olan 10-7 M değerinin uygulamalarda kullanılmasına karar verildi) ile 10 dakika
süreyle inkübe edildi, üzerine asetilkolin derişimleri 0,5 log artışla (10-9–10-4 M)
kümülatif olarak uygulandı. Elde edilen yanıtların pD2 ve Emax değerleri hesaplandı.
2.3.4. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Klorprifosun Etkisinin Tek Başına
Araştırılması
Dokular organ banyosunda dengelendikten sonra klorprifos kümülatif olarak 10-10,
10-9, 10-8, 10-7 ve 10-6 M derişimlerde hem duodenum hem de ileum dokusuna ayrı
ayrı uygulandı. Elde edilen yanıtlardan, en yüksek artış % 100 kabul edilerek
yüzdelik artış şeklinde hesaplanıp, ortalamaları alındı. Ayrıca klorprifosun en yüksek
kasılmayı veren değerlerinin mg olarak ortalamaları hesaplanıp, duodenum ve ileum
dokusunda kastırıcı etkisi de ortaya konuldu.
2.3.5. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Klorprifosun Etkisinin Asetilkolin ile
Birlikte Araştırılması
Dokular organ banyosunda dengelendikten sonra asetilkolin her seferinde 0,5 log
artışla 10-9–10-4 M derişim aralığında kümülatif olarak hem duodenum hem de ileum
dokusuna ayrı ayrı uygulandı. Dokunun yanıtları alındıktan sonra, 15 dakika ara ile
doku 3 kez yıkandı. Daha sonra doku klorprifos (Ön deneme sonuçlarına göre en
seyreltik derişim olan 10-10 M değeri ile en iyi kasılmayı veren derişimin bir alt
derişimi olan 10-7 M değerinin uygulamalarda kullanılmasına karar verildi) ile 10
dakika süreyle inkübe edildi, üzerine asetilkolin derişimleri 0,5 log artışla (10-9–10-4
M) kümülatif olarak uygulandı. Elde edilen yanıtların pD2 ve Emax değerleri
hesaplandı.
34
2.3.6. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefon ve Klorprifosun Bir Aradaki
Etkilerinin Asetilkolin ile Birlikte Araştırılması
Dokular organ banyosunda dengelendikten sonra asetilkolin her seferinde 0,5 log
artışla 10-9–10-4 M derişim aralığında kümülatif olarak hem duodenum hem de ileum
dokusuna ayrı ayrı uygulandı. Dokunun yanıtları alındıktan sonra, 15 dakika ara ile
doku 3 kez yıkandı. Daha sonra doku aynı anda etefon ve klorprifos (Tek başlarına
yapılan uygulamalarda kullanılan 10-10 M ve 10-7 M olan derişimleri kullanılmıştır)
ile 10 dakika süreyle inkübe edildi, üzerine asetilkolin derişimleri 0,5 log artışla (10-
9–10-4 M) kümülatif olarak uygulandı. Elde edilen yanıtların pD2 ve Emax değerleri
hesaplandı.
2.3.7. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Yapılan Diğer Denemeler
2.3.7.1. Bağırsak Ortamının Enzimatik Etkinliğinin (AKE) Belirlenmesi
Bağırsak ortamının enzimatik etkinliğinin (AKE) test edilmesi amacıyla fizostigmin
10-7 ve 3x10-7 M derişimlerde duodenum ve ileum dokusuna uygulandı. Elde edilen
yanıtlardan, en yüksek kasılmayı veren değerlerin mg olarak ortalaması hesaplandı.
2.3.7.2. Çözücünün Dokular Üzerine Etkinliğinin Belirlenmesi
Klorprifosun çözücüsü olarak kullanılan asetonun etkisizliğini göstermek amacıyla
dokular organ banyosunda dengelendikten sonra asetilkolin her seferinde 0,5 log
artışla 10-9–10-4 M derişim aralığında kümülatif olarak hem duodenum hem de ileum
dokusuna ayrı ayrı uygulandı. Dokunun yanıtları alındıktan sonra, 15 dakika ara ile
doku 3 kez yıkandı. Daha sonra doku aseton 10-7 M (Deneylerde uygulanan en yoğun
35
klorprifos derişimi ile aynı derişim) ile 10 dakika süreyle inkübe edildi, üzerine
asetilkolin derişimleri 0,5 log artışla (10-9–10-4 M) kümülatif olarak uygulandı. Elde
edilen yanıtların pD2 ve Emax değerleri hesaplandı.
2.4. İstatistiksel Analiz
İstatistiksel hesaplamalarda ve grafik çiziminde “GraphPad Prism version 4.00 for
Windows” paket programı kullanıldı. Çalışmadan elde edilen veriler aritmetik
ortalama ve standart hata şeklinde ifade edildi. Asetilkolin kontrolü ile ilaçların tek
başlarına veya bir arada uygulanması denemelerinde, karşılaştırılacak ikili gruplar
arasında Wilcoxon eşleştirilmiş ikili örnek testi (Wilcoxon Signed Ranks
Nonparametric Test) kullanıldı. Bağırsağın duodenum ve ileum bölümleri arasında
farklarının kıyaslanmasında Mann-Whitney U-testi kullanıldı. İstatistiksel olarak
önemlilik p<0,05 şeklinde ifade edildi (Motulsky, 2003).
36
3. BULGULAR
3.1. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Asetilkolinin Etkisi
Deneylerde kontrol amacıyla kullanılan tüm kümülatif AK (10-9–10-4 M)
uygulamalarının hem duodenum hem de ileum dokusundaki kastırıcı etkileri en
yüksek kasılmayı veren değerlerin mg karşılığı olarak ortalaması Çizelge 3.1.’ de,
kümülatif AK derişim-cevap eğrilerinin Emax ve pD2 değerleri Çizelge 3.2.’ de
gösterildi. Rat duodenum ve ileum dokusunun kümülatif AK uygulamalarına verdiği
cevaplar Şekil 3.1. ve Şekil 3.2.’ de gösterildi.
Çizelge 3.1. Rat duodenumu ve ileumunda AK’ in kümülatif uygulanmasında en yüksek kasılmayı veren değerlerin mg olarak ortalaması. MADDE DOKU EN YÜKSEK KASILMA (mg ± SEM) N
Duodenum 2020 ± 54 74 Asetilkolin
(10-9 – 10-4 M) Ileum 2376 ± 82* 67
* İki bağırsak bölümü arasındaki fark istatistiksel olarak önemlidir (p<0,05).
Çizelge 3.2. Rat duodenumu ve ileumunda AK derişim-cevap eğrilerinin Emax ve pD2 değerleri. MADDE DOKU Emax ± SEM (%) pD2 ± SEM N
Duodenum 90,32 ± 1,14 6,292 ± 0,062 80 Asetilkolin
(10-9 – 10-4 M) Ileum 94,50 ± 0,91 6,101 ± 0,044 78
Elde edilen sonuçlara göre ileum dokusunda AK’ in kastırıcı etkisinin duodenum
dokusuna göre daha fazla olduğu ve bunun istatistiksel olarak anlamlı olduğu
(p<0,05) görüldü (Çizelge 3.1.). AK’ in kümülatif uygulaması sonucu rat
duodenumunda Emax ve pD2 değerleri sırasıyla 90,32 ± 1,14 ve 6,292 ± 0,062 olarak,
ileumda ise sırasıyla 94,50 ± 0,91 ve 6,101 ± 0,044 olarak bulundu (Çizelge 3.2.).
37
Şekil 3.1. Rat duodenumunda AK kümülatif derişim-cevapları.
Şekil 3.2. Rat ileumunda AK kümülatif derişim-cevapları.
38
3.2. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefonun Tek Başına Etkisi
Etefonun kümülatif olarak 10-10, 10-9, 10-8, 10-7 ve 10-6 M derişimlerde hem
duodenum hem de ileum dokusuna uygulanması sonucunda en yüksek kasılmayı
verdiği değerlerin mg olarak ortalaması Çizelge 3.3.’ de ve verdiği cevaplar ise Şekil
3.3.’ de gösterildi.
Çizelge 3.3. Rat duodenumu ve ileumunda tek başına ETF’ nin kastırıcı etkisi. MADDE DOKU EN YÜKSEK KASILMA (mg ± SEM) N
Duodenum 369 ± 92 11 Etefon
(10-10 – 10-6 M) Ileum 413 ± 63 10
İki bölüm arasındaki fark istatistiksel olarak önemsizdir.
ETF kümülatif (DUODENUM)
10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-50
20
40
60
80
100
120
Derişim (M)
Kasılm
a (%
)
ETF kümülatif (ILEUM)
10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-50
20
40
60
80
100
120
Derişim (M)
Kasılm
a (%
)
Şekil 3.3. Rat duodenumu ve ileumunda kümülatif ETF uygulama cevapları.
Elde edilen sonuçlara göre duodenum ve ileum dokusunda ETF’ nin en yüksek
kastırıcı etkileri arasındaki farkın istatistiksel olarak önemsiz olduğu görüldü
(Çizelge 3.3.). ETF’ nin kümülatif uygulaması (10-10-10-6 M) sonucu rat
duodenumunda ve ileumunda farklı derişimlerde spesifik kademeli derişim-cevabına
uygun olmayan kasılmalara sebep olduğu görüldü. Bu kasılmalarda derişime bağlı
kademeli bir artış olmadığından uygun Emax ve pD2 değerleri hesaplanamadı.
39
3.3. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefonun Asetilkolin ile Birlikte Etkisi
Etefon (10-10 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat duodenumunda pD2 ve Emax
değerleri Çizelge 3.4. ve Şekil 3.4.’ de gösterildi. ETF inkübasyonu yapılmamış
dokulara kıyasla, ETF (10-10 M) uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2
değerlerinde bir artış (sırasıyla 6,200 ± 0,128 ve 6,298 ± 0,118), Emax değerlerinde ise
bir azalma (sırasıyla 87,24 ± 2,14 ve 76,88 ± 5,81) belirlendi. Bu değişiklikler
istatistiksel olarak önemsizdi.
Çizelge 3.4. Rat duodenumunda ETF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi. Duodenum (n: 8) pD2 Emax (%)
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,200 ± 0,128 87,24 ± 2,14
Etefon (10-10 M)
+
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,298 ± 0,118 76,88 ± 5,81
Aynı sütundaki değerler arasındaki farklılıklar önemsizdir.
ETF (10-10 M) DUODENUM pD2
AK ETF (10-10 M) + AK0
1
2
3
4
5
6
7
ETF (10-10 M) DUODENUM Emax
AK ETF (10-10 M) + AK0
25
50
75
100
%
Şekil 3.4. Rat duodenumunda ETF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi.
40
Etefon (10-10 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat ileumunda pD2 ve Emax
değerleri Çizelge 3.5. ve Şekil 3.5.’ de gösterildi. ETF inkübasyonu yapılmamış
dokulara kıyasla, ETF (10-10 M) uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2
değerlerinde bir artış (sırasıyla 5,933 ± 0,162 ve 6,025 ± 0,130), Emax değerlerinde ise
bir azalma (sırasıyla 93,87 ± 2,57 ve 77,38 ± 8,34) belirlendi. Bu değişiklikler
istatistiksel olarak önemsizdi.
Çizelge 3.5. Rat ileumunda ETF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi. Ileum (n: 9) pD2 Emax (%)
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
5,933 ± 0,162 93,87 ± 2,57
Etefon (10-10 M)
+
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,025 ± 0,130 77,38 ± 8,34
Aynı sütundaki değerler arasındaki farklılıklar önemsizdir.
ETF (10-10 M) ILEUM pD2
AK ETF (10-10 M) + AK0
1
2
3
4
5
6
7
ETF (10-10 M) ILEUM Emax
AK ETF (10-10 M) + AK0
25
50
75
100
%
Şekil 3.5. Rat ileumunda ETF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi.
41
Etefon (10-7 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat duodenumunda pD2 ve Emax
değerleri Çizelge 3.6. ve Şekil 3.6.’ da gösterildi. ETF inkübasyonu yapılmamış
dokulara kıyasla, ETF (10-7 M) uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2
değerlerinde bir azalma (sırasıyla 6,340 ± 0,167 ve 6,330 ± 0,164), Emax değerlerinde
ise bir artış (sırasıyla 87,79 ± 2,80 ve 92,95 ± 4,31) belirlendi. Bu değişiklikler
istatistiksel olarak önemsizdi.
Çizelge 3.6. Rat duodenumunda ETF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi. Duodenum (n: 12) pD2 Emax (%)
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,340 ± 0,167 87,79 ± 2,80
Etefon (10-7 M)
+
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,330 ± 0,164 92,95 ± 4,31
Aynı sütundaki değerler arasındaki farklılıklar önemsizdir.
ETF (10-7 M) DUODENUM pD2
AK ETF (10-7 M) + AK0
1
2
3
4
5
6
7
ETF (10-7 M) DUODENUM Emax
AK ETF (10-7 M) + AK0
25
50
75
100
%
Şekil 3.6. Rat duodenumunda ETF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi.
42
Etefon (10-7 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat ileumunda pD2 ve Emax
değerleri Çizelge 3.7. ve Şekil 3.7.’ de gösterildi. ETF inkübasyonu yapılmamış
dokulara kıyasla, ETF (10-7 M) uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2
değerlerinde bir artış (sırasıyla 6,241 ± 0,165 ve 6,447 ± 0,160), Emax değerlerinde ise
bir azalma (sırasıyla 94,88 ± 2,34 ve 82,60 ± 4,15) belirlendi. Bu değişiklikler
istatistiksel olarak (p<0,05) önemliydi.
Çizelge 3.7. Rat ileumunda ETF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi. Ileum (n: 9) pD2 Emax (%)
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,241 ± 0,165 94,88 ± 2,34
Etefon (10-7 M)
+
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,447 ± 0,160* 82,60 ± 4,15*
* Aynı sütundaki değerler arasındaki fark önemlidir (p<0,05).
ETF (10-7 M) ILEUM pD2
AK ETF (10-7 M) + AK0
1
2
3
4
5
6
7 *
ETF (10-7 M) ILEUM Emax
AK ETF (10-7 M) + AK0
25
50
75
100
*
%
Şekil 3.7. Rat ileumunda ETF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi.
43
3.4. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Klorprifosun Tek Başına Etkisi
Klorprifosun kümülatif olarak 10-10, 10-9, 10-8, 10-7 ve 10-6 M derişimlerde hem
duodenum hem de ileum dokusuna uygulanması sonucunda en yüksek kasılmayı
verdiği değerlerin mg olarak ortalaması Çizelge 3.8.’ de ve verdiği cevaplar ise Şekil
3.8.’ de gösterildi.
Çizelge 3.8. Rat duodenumu ve ileumunda tek başına CPF’ nin kastırıcı etkisi. MADDE DOKU EN YÜKSEK KASILMA (mg ± SEM) N
Duodenum 434 ± 64 9 Klorprifos
(10-10 – 10-6 M) Ileum 461 ± 76 9
İki bölüm arasındaki fark istatistiksel olarak önemsizdir.
CPF kümülatif (DUODENUM)
10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-50
20
40
60
80
100
120
Derişim (M)
Kasılm
a (%
)
CPF kümülatif (ILEUM)
10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-50
20
40
60
80
100
120
Derişim (M)
Kasılm
a (%
)
Şekil 3.8. Rat duodenumu ve ileumunda kümülatif CPF uygulama cevapları.
Elde edilen sonuçlara göre duodenum ve ileum dokusunda CPF’ nin en yüksek
kastırıcı etkileri arasındaki farkın istatistiksel olarak önemsiz olduğu görüldü
(Çizelge 3.8.). CPF’ nin kümülatif uygulaması (10-10-10-6 M) sonucu rat
duodenumunda ve ileumunda farklı derişimlerde spesifik kademeli derişim-cevabına
uygun olmayan kasılmalara sebep olduğu görüldü. Bu kasılmalarda derişime bağlı
kademeli bir artış olmadığından uygun Emax ve pD2 değerleri hesaplanamadı.
44
3.5. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Klorprifosun Asetilkolin ile Birlikte
Etkisi
Klorprifos (10-10 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat duodenumunda pD2 ve
Emax değerleri Çizelge 3.9. ve Şekil 3.9.’ da gösterildi. CPF inkübasyonu yapılmamış
dokulara kıyasla, CPF (10-10 M) uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2
değerlerinde bir artış (sırasıyla 6,243 ± 0,140 ve 6,252 ± 0,154), Emax değerlerinde ise
bir azalma (91,16 ± 3,30 ve 82,47 ± 2,38) belirlendi. Bu değişiklikler istatistiksel
olarak önemsizdi.
Çizelge 3.9. Rat duodenumunda CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi. Duodenum (n: 10) pD2 Emax (%)
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,243 ± 0,140 91,16 ± 3,30
Klorprifos (10-10 M)
+
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,252 ± 0,154 82,47 ± 2,38
Aynı sütundaki değerler arasındaki farklılıklar önemsizdir.
CPF (10-10 M) DUODENUM pD2
AK CPF (10-10 M) + AK0
1
2
3
4
5
6
7
CPF (10-10 M) DUODENUM Emax
AK CPF (10-10 M) + AK0
25
50
75
100
%
Şekil 3.9. Rat duodenumunda CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi.
45
Klorprifos (10-10 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat ileumunda pD2 ve Emax
değerleri Çizelge 3.10. ve Şekil 3.10.’ da gösterildi. CPF inkübasyonu yapılmamış
dokulara kıyasla, CPF (10-10 M) uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2
değerlerinde bir artış (sırasıyla 6,031 ± 0,150 ve 6,118 ± 0,165) belirlendi. Bu artış
istatistiksel olarak önemsizdi. Emax değerlerinde ise bir azalma (sırasıyla 94,27 ± 2,90
ve 85,76 ± 2,79) belirlendi. Bu azalma istatistiksel olarak (p<0,05) önemliydi.
Çizelge 3.10. Rat ileumunda CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi. Ileum (n: 10) pD2 Emax (%)
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,031 ± 0,150 94,27 ± 2,90
Klorprifos (10-10 M)
+
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,118 ± 0,165 85,76 ± 2,79*
* Aynı sütundaki değerler arasındaki fark önemlidir (p<0,05).
CPF (10-10 M) ILEUM pD2
AK CPF (10-10 M) + AK0
1
2
3
4
5
6
7
CPF (10-10 M) ILEUM Emax
AK CPF (10-10 M) + AK0
25
50
75
100
*
%
Şekil 3.10. Rat ileumunda CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi.
46
Klorprifos (10-7 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat duodenumunda pD2 ve
Emax değerleri Çizelge 3.11. ve Şekil 3.11.’ de gösterildi. CPF inkübasyonu
yapılmamış dokulara kıyasla, CPF (10-7 M) uygulaması yapılan dokularda AK’ nin
pD2 ve Emax değerlerinde bir artış (pD2 sırasıyla 6,471 ± 0,074 ve 6,625 ± 0,145 ve
Emax sırasıyla 88,09 ± 2,03 ve 96,59 ± 4,06) belirlendi. Bu değişiklikler istatistiksel
olarak önemsizdi.
Çizelge 3.11. Rat duodenumunda CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi. Duodenum (n: 13) pD2 Emax (%)
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,471 ± 0,074 88,09 ± 2,03
Klorprifos (10-7 M)
+
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,625 ± 0,145 96,59 ± 4,06
Aynı sütundaki değerler arasındaki farklılıklar önemsizdir.
CPF (10-7 M) DUODENUM pD2
AK CPF (10-7 M) + AK0
1
2
3
4
5
6
7
CPF (10-7 M) DUODENUM Emax
AK CPF (10-7 M) + AK0
25
50
75
100
125
%
Şekil 3.11. Rat duodenumunda CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi.
47
Klorprifos (10-7 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat ileumunda pD2 ve Emax
değerleri Çizelge 3.12. ve Şekil 3.12.’ de gösterildi. CPF inkübasyonu yapılmamış
dokulara kıyasla, CPF (10-7 M) uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2
değerlerinde bir artış (sırasıyla 6,210 ± 0,070 ve 6,575 ± 0,236), Emax değerlerinde ise
bir azalma (sırasıyla 94,58 ± 2,48 ve 86,26 ± 4,36) belirlendi. Bu değişiklikler
istatistiksel olarak (p<0,05) önemliydi.
Çizelge 3.12. Rat ileumunda CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi. Ileum (n: 15) pD2 Emax (%)
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,210 ± 0,070 94,58 ± 2,48
Klorprifos (10-7 M)
+
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,575 ± 0,236* 86,26 ± 4,36*
* Aynı sütundaki değerler arasındaki fark önemlidir (p<0,05).
CPF (10-7 M) ILEUM pD2
AK CPF (10-7 M) + AK0
1
2
3
4
5
6
7 *CPF (10-7 M) ILEUM Emax
AK CPF (10-7 M) + AK0
25
50
75
100 *
%
Şekil 3.12. Rat ileumunda CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi.
48
3.6. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Etefon ve Klorprifosun Bir Aradaki
Etkileri
Etefon (10-10 M)+Klorprifos (10-10 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat
duodenumunda pD2 ve Emax değerleri Çizelge 3.13. ve Şekil 3.13.’ de gösterildi.
ETF+CPF inkübasyonu yapılmamış dokulara kıyasla, ETF (10-10 M)+CPF (10-10 M)
uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2 değerlerinde bir artış (sırasıyla 6,073 ±
0,045 ve 6,200 ± 0,055) belirlendi. Bu artış istatistiksel olarak (p<0,05) önemliydi.
Emax değerlerinde ise bir azalma (sırasıyla 91,17 ± 1,91 ve 80,15 ± 4,54) belirlendi.
Bu azalma istatistiksel olarak önemsizdi.
Çizelge 3.13. Rat duodenumunda ETF+CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi. Duodenum (n: 11) pD2 Emax (%)
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,073 ± 0,045 91,17 ± 1,91
Klorprifos+Etefon (10-10 M)
+
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,200 ± 0,055* 80,15 ± 4,54
* Aynı sütundaki değerler arasındaki fark önemlidir (p<0,05).
ETF+CPF (10-10 M) DUODENUM pD2
AK ETF+CPF (10-10 M) + AK0
1
2
3
4
5
6
7*
ETF+CPF (10-10 M) DUODENUM Emax
AK ETF+CPF (10-10 M) + AK0
25
50
75
100
%
Şekil 3.13. Rat duodenumunda ETF+CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi.
49
Etefon (10-10 M)+Klorprifos (10-10 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat
ileumunda pD2 ve Emax değerleri Çizelge 3.14. ve Şekil 3.14.’ de gösterildi.
ETF+CPF inkübasyonu yapılmamış dokulara kıyasla, ETF (10-10 M)+CPF (10-10 M)
uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2 değerlerinde bir artış (sırasıyla 5,990 ±
0,085 ve 6,104 ± 0,112) belirlendi. Bu artış istatistiksel olarak önemsizdi. Emax
değerlerinde ise bir azalma (94,90 ± 3,14 ve 81,56 ± 4,11) belirlendi. Bu azalma
istatistiksel olarak (p<0,05) önemliydi.
Çizelge 3.14. Rat ileumunda ETF+CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi Ileum (n: 9) pD2 Emax (%)
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
5,990 ± 0,085 94,90 ± 3,14
Klorprifos+Etefon (10-10 M)
+
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,104 ± 0,112 81,56 ± 4,11*
* Aynı sütundaki değerler arasındaki fark önemlidir (p<0,05).
ETF+CPF (10-10 M) ILEUM pD2
AK ETF+CPF (10-10 M) + AK0
1
2
3
4
5
6
7
ETF+CPF (10-10 M) ILEUM Emax
AK ETF+CPF (10-10 M) + AK0
25
50
75
100
*
%
Şekil 3.14. Rat ileumunda ETF+CPF (10-10 M) inkübasyonunun etkisi.
50
Etefon (10-7 M)+Klorprifos (10-7 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat
duodenumunda pD2 ve Emax değerleri Çizelge 3.15. ve Şekil 3.15.’ de gösterildi.
ETF+CPF inkübasyonu yapılmamış dokulara kıyasla, ETF (10-7 M)+CPF (10-7 M)
uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2 değerlerinde bir azalma (sırasıyla 6,398
± 0,085 ve 6,363 ± 0,120) belirlendi. Bu azalma istatistiksel olarak önemsizdi. Emax
değerlerinde de bir azalma (sırasıyla 92,72 ± 1,71 ve 81,90 ± 4,35) belirlendi. Ancak
bu azalma istatistiksel olarak (p<0,05) önemliydi.
Çizelge 3.15. Rat duodenumunda ETF+CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi. Duodenum (n: 16) pD2 Emax (%)
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,398 ± 0,085 92,72 ± 1,71
Klorprifos+Etefon (10-7 M)
+
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,363 ± 0,120 81,90 ± 4,35*
* Aynı sütundaki değerler arasındaki fark önemlidir (p<0,05).
ETF+CPF (10-7 M) DUODENUM pD2
AK ETF+CPF (10-7 M) + AK0
1
2
3
4
5
6
7
ETF+CPF (10-7 M) DUODENUM Emax
AK ETF+CPF (10-7 M) + AK0
25
50
75
100
*
%
Şekil 3.15. Rat duodenumunda ETF+CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi.
51
Etefon (10-7 M)+Klorprifos (10-7 M) ile 10 dakika inkübasyondan sonra rat
ileumunda pD2 ve Emax değerleri Çizelge 3.16. ve Şekil 3.16.’ da gösterildi.
ETF+CPF inkübasyonu yapılmamış dokulara kıyasla, ETF (10-7 M)+CPF (10-7 M)
uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2 değerlerinde bir artış (sırasıyla 6,164 ±
0,065 ve 6,247 ± 0,069), Emax değerlerinde ise bir azalma (93,76 ± 1,52 ve 86,25 ±
3,67) belirlendi. Bu değişiklikler istatistiksel olarak (p<0,05) önemliydi.
Çizelge 3.16. Rat ileumunda ETF+CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi . Ileum (n: 19) pD2 Emax (%)
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,164 ± 0,065 93,76 ± 1,52
Klorprifos+Etefon (10-7 M)
+
Asetilkolin (10-9 – 10-4 M)
6,247 ± 0,069* 86,25 ± 3,67*
* Aynı sütundaki değerler arasındaki fark önemlidir (p<0,05).
ETF+CPF (10-7 M) ILEUM pD2
AK ETF+CPF (10-7 M) + AK0
1
2
3
4
5
6
7 *
ETF+CPF (10-7 M) ILEUM Emax
AK ETF+CPF (10-7 M) + AK0
25
50
75
100 *
%
Şekil 3.16. Rat ileumunda ETF+CPF (10-7 M) inkübasyonunun etkisi.
52
3.7. Rat Duodenumu ve İleumu Üzerine Yapılan Diğer Denemelerin Bulguları
3.7.1. Bağırsak Ortamının Enzimatik Etkinliği (AKE)
Bağırsak ortamının enzimatik etkinliğinin (AKE) uygunluğunun test edilmesi
amacıyla fizostigminin 10-7 ve 3x10-7 M derişimlerde duodenum ve ileum dokusuna
uygulandıktan sonra özellikle 3x10-7 M derişimde fizostigminin dolaylı AKE
inhibitörü etkisi belirgin şekilde gözlemlendi. Dokuda enzimatik etkinlik, AKE
enzim inhibisyonu sonucu özellikle 3x10-7 M derişimde hem duodenum hem de
ileum dokusunda, 10-7 M derişime göre belirgin şekilde kasılma artışı olmasıyla
doğrulandı. Rat duodenum ve ileum dokusunun fizostigminin 10-7 M derişimine
verdiği cevaplar sırasıyla Şekil 3.17. ve Şekil 3.18.’ de ve 3x10-7 M derişimine
verdiği cevaplar sırasıyla Şekil 3.19. ve Şekil 3.20.’ de gösterildi.
53
Şekil 3.17. Rat duodenumunda 10-7 M fizostigminin yanıtı.
Şekil 3.18. Rat ileumunda 10-7 M fizostigminin yanıtı.
54
Şekil 3.19. Rat duodenumunda 3x10-7 M fizostigminin yanıtı.
Şekil 3.20. Rat ileumunda 3x10-7 M fizostigminin yanıtı.
55
3.7.2. Çözücünün Dokular Üzerine Etkinliği
Klorprifosun çözücüsü olarak kullanılan aseton inkübasyonunun AK’ nin pD2 ve
Emax değerlerine etkisi Çizelge 3.17.’ de gösterildi. Aseton (10-7 M) inkübasyonu
yapılmamış dokulara kıyasla, aseton uygulaması yapılan dokularda AK’ nin pD2
değerlerinde (duodenum için sırasıyla 6,425 ± 0,075 ve 6,486 ± 0,105 ve ileum için
sırasıyla 6,062 ± 0,054 ve 6,186 ± 0,113) bir artış, Emax değerlerinde ise (duodenum
için sırasıyla 91,28 ± 2,84 ve 87,69 ± 9,43 ve ileum için sırasıyla 97,29 ± 3,97 ve
95,30 ± 7,17) bir azalma tespit edildi. Bu değişiklikler istatistiksel olarak önemsizdi.
Çizelge 3.17. Rat bağırsağında asetonun AK üzerine etkisi. DOKU MADDE pD2 Emax (%) N
AK (10-9-10-4 M)
6,425 ± 0,075 91,28 ± 2,84 5 Duodenum
Aseton (10-7 M)
+ AK (10-9-10-4 M)
6,486 ± 0,105 87,69 ± 9,43 5
AK (10-9-10-4 M)
6,062 ± 0,054 97,29 ± 3,97 6 İleum
Aseton (10-7 M)
+ AK (10-9-10-4 M)
6,186 ± 0,113 95,30 ± 7,17 6
Aynı sütundaki değerler arasındaki farklar önemsizdir.
Elde edilen bu sonuçlardan, klorprifosu çözdürmek amacıyla kullanılan asetonun
AK’ nin pD2 ve Emax değerlerine istatistiksel olarak önemli bir etkisinin olmadığı,
dolayısıyla rat bağırsağında AK uygulamalarının asetondan etkilenmediği görüldü
(Çizelge 3.17.).
56
4. TARTIŞMA
Bu çalışmada, zehirli etkilerini esteraz enzimini baskılayarak gösteren bir pestisid
olan klorprifos ile bitki gelişim düzenleyicisi olan etefonun bir aradaki etkileri rat
duodenumu ve ileumunda in vitro koşullarda araştırıldı.
Rat duodenum dokusunda 10-10 M derişiminde ETF veya CPF inkübasyonu, AK ile
elde edilen derişim-cevap eğrilerinin pD2 ve Emax değerlerinde (Çizelge 3.4. ve 3.9.)
istatistiksel olarak önemli olmayan değişikliklere sebep oldu. Bunun sebebi olarak,
ETF veya CPF’ nin uygulanan derişiminin (10-10 M) dokuda AK ile oluşturulan
derişim-cevap eğrisinin pD2 ve Emax değerlerine etkimede yetersiz kaldığı veya bu
durumun duodenumun kastırıcı etkisinin zayıflığından (Çizelge 3.1.) kaynaklandığı
söylenebilir.
Rat duodenum dokusunda 10-10 M derişiminde olduğu gibi, 10-7 M derişiminde ETF
veya CPF inkübasyonunda da, AK ile elde edilen derişim-cevap eğrilerinin pD2 ve
Emax değerlerinde (Çizelge 3.6. ve Çizelge 3.11.) istatistiksel önemde olmayan
değişiklikler görülmüştür. Burada 10-7 M derişimin de AK ile oluşturulan derişim-
cevap eğrisinin pD2 ve Emax değerlerine etkimede yetersiz kalması ve 10-10 M
derişimindeki gibi benzer sonuçların ortaya çıkması, bu durumun daha çok
duodenumun özelliğinden ileri geldiğini düşündürmektedir. Biyolojik sistemlerde
etkili olabilmeleri için CPF’ nin, CPF-oksona (Cook ve Shenoy, 2003) ve ETF’ nin,
fosfata (fosforile edici etkilerini ortaya koymaları için) dönüşmesi gerekmektedir
(Segall ve ark., 1991). AK ile oluşturulan cevaplar üzerinde bu maddelerin
etkilerinin zayıf görülmesi duodenumda yeterince etkili formlarına
dönüşmemesinden de kaynaklanıyor olabilir.
Rat ileum dokusunda 10-10 M derişimde ETF inkübasyonu, duodenumda olduğu gibi
AK’ nin derişim-cevap eğrilerinin pD2 ve Emax değerlerinde (Çizelge 3.5.) anlamlı
değişikliklere sebep olmazken, CPF (10-10 M) inkübasyonu AK’ nin derişim-cevap
57
eğrilerinin sadece Emax değerlerinde anlamlı bir azalmaya (p<0,05) (Çizelge 3.10.)
sebep olmuştur. Bu durum, CPF’ nin bifazik etkisi ile açıklanabilir; CPF ile ilgili
literatür bilgilerde etkisini asetilkolinesteraz baskılanması ve kolinerjik reseptörlere
bağlanma üzerinden gösterdiği belirtilmektedir. Yapılan bu araştırmada CPF’ nin
maksimum kastırıcı etkisinin AK’ nin maksimum kastırıcı etkisinden daha düşük
olduğu gözlenmiştir. Dolayısıyla, CPF ile önceden yapılan inkübasyon reseptörlerin
bu madde tarafından işgaline ve reseptör sayısında azalmaya sebep olduğundan AK’
nin yeterli reseptöre bağlanamaması ve beklenen kastırıcı etkiyi gösterememesine
neden olmuştur. Maksimum kastırıcı etkisi CPF’ de olduğu gibi AK’ den daha düşük
olan ETF’ de bu durumun görülememe sebebi, bu iki madde arasındaki reseptörlere
karşı gösterilen afinite farkı, kimyasal maddenin etkinliğini değiştirebilen fiziko-
kimyasal farklılıklar olabilir (Gordon ve ark., 2006).
Rat ileum dokusunda 10-7 M derişimde ETF veya CPF inkübasyonu, AK’ nin
derişim-cevap eğrilerinin pD2 ve Emax değerlerinde (Çizelge 3.7. ve Çizelge 3.12.)
anlamlı değişikliklere sebep oldu. Çizelge 3.7. ve Çizelge 3.12.’ de de görüldüğü gibi
ETF veya CPF 10-7 M derişimiyle inkübasyon, AK ile elde edilen derişim-cevap
eğrilerinin pD2 değerlerinde istatistiksel olarak önemli bir artışa (p<0,05) ve Emax
değerlerinde ise istatistiksel olarak önemli bir azalmaya (p<0,05) sebep oldu. Bu
durum, ETF veya CPF inkübasyonunun AK’ nin etki gücünü artırdığını, maksimum
etkisini ise azalttığını göstermektedir. Sonuçlara göre ETF veya CPF inkübasyonuna
bağlı olarak dokuda bir duyarlılık gelişmiş olduğu düşünülebilir; aslında bir enzim
inhibitörü olan ETF ve CPF hem doğrudan reseptörlere bağlanarak ve hem de dolaylı
yoldan AKE’ yi inhibe ederek sinaps aralığında AK biriktirmesi ile, inkübasyon
süresi sonunda ortama ilave edilen AK’ nin de reseptörlere bağlanmasıyla daha
düşük derişimde ve erken kasılmaya sebep olmakta veya kanallar düzeyinde
değişikliklere sebep olarak duyarlılığı artırmaktadır. Kolin esterlerinin etki gücünün
artışına neden olan benzer nitelikte araştırmalar bulunmaktadır. Farelerde OF
pestisidler ile oluşan BKE inhibisyonunun ve süksinilkolin toksisitesinin
güçlenmesinin araştırıldığı bir çalışmada, ETF periton içi olarak (200 mg/kg, 1 saat)
farelere uygulandığında, süksinilkolinin LD50 değerini kontroldeki 2,4 mg/kg’ dan
0,59 mg/kg’ a düşürdüğü, bunun da toksisitedeki 4-kat artışı gösterdiği
58
belirtilmektedir. Serum BKE aktivitesisinin 1 saat ETF uygulaması ile % 77-94
inhibe olduğu, farelerin süksinilkolin toksisitesine daha duyarlı hale geldiği
kaydedilmektedir (Sparks ve ark., 1999).
Muskarinik reseptörlerle etkinleştirilen bağırsak fonksiyonlarının AK’ ye kontraktil
cevaplarının değerlendirildiği ve ratların jejunum ve kolonlarında çalışıldığı bir
araştırmada, M3 muskarinik alt-tiplerin öncelikli olarak AK-ile oluşturulan
kasılmalarda etkili olmasına rağmen diğer alt-tiplerin de bağırsakta bazı diğer
fizyolojik rollerde görev alabildiği, M1 reseptörlerin ise mukozal iyon transportu ve
düz kas katmanında AK salınımının düzenlenmesinden sorumlu olduğu
belirtilmektedir (Tezuka ve ark., 2004).
ETF veya CPF (10-7 M) inkübasyonu ile AK’ nin Emax değerinde görülen düşmenin
sebebi, ileumda 10-10 M CPF ile inkübasyonu takiben AK uygulamasından elde
edilen sonucun açıklamasında olduğu gibi, ETF veya CPF’ nin reseptör sayısında
azalmaya (down-regülasyon) neden olması, mevcut reseptörlerin çoğunun ise
maksimum etkisi AK’ den daha düşük olan ETF (Çizelge 3.1. ve Çizelge 3.3.) veya
CPF (Çizelge 3.1. ve Çizelge 3.8.) tarafından işgal edilmesi olabilir.
Klorprifosa mesleki olmayan maruziyetlerden kaynaklanan risklerin değerlendirildiği
bir makalede, tek veya tekrarlanan CPF uygulamalarında oluşan çok yönlü
cevapların, AK reseptörlerinin down-regülasyonu ve AK sentezinde azalmayla ilgili
olduğu, böylelikle AK’ in presinaptik salınımının kısıtlandığı belirtilmektedir
(Cochran, 2002). Bu araştırmanın sonuçları da Cochran (2002)’ nin ifadeleriyle
örtüşmektedir.
Bazı kolinesteraz inhibitörlerinin kolinerjik reseptörlerle etkileştiği yıllardır
bilinmektedir. Pope ve ark. (2005) tarafından derlenen kolinesteraz inhibitörleriyle
yapılan çalışmalara dayalı bir makalede, rat striatumunda paraokson, malaokson ve
CPF-oksonun, sub-mikromolar derişimlerde derişime-bağlı bir şekilde [3H]cis-
dioksolan (CD) bağlanmasını inhibe ettiği (CPF-okson>paraokson>malaokson)
59
belirtilmektedir. Ayrıca CPF-okson, paraokson ve metil-paraoksonun
[3H]oksotremorin-M’ nin rat kardiak membran muskarinik reseptörlerine bağlanma
yerini değiştirdiği ve en güçlü şekilde etkiyenin 7 nM’ lık IC50 değeriyle CPF-okson
olduğu vurgulanmaktadır. Dolayısıyla bu araştırma sonucu, söz konusu maddelerin
(CPF de dahil) sadece enzim inhibisyonu ile değil, doğrudan reseptöre bağlanarak da
etkidiklerini göstermektedir.
Rat duodenumunda ETF ve CPF’ nin bir arada 10-10 M derişimde uygulanması AK
ile oluşturulan derişim-cevap eğrilerinin pD2 değerinde istatistiksel olarak anlamlı bir
artışa (p<0,05) sebep olurken, Emax değerinde oluşan azalma istatistiksel olarak
önemsizdi (Çizelge 3.13.). Bu durum kombinasyonun duodenumda 10-10 M
derişiminin AK’ in etki gücünde anlamlı artışa sebep olduğunu ancak maksimum
etkisini değiştiremediğini göstermektedir. İki maddenin 10-10 M derişimde tek
başlarına uygulanması duodenumda anlamlı değişikliklere sebep olmazken (Çizelge
3.4. ve Çizelge 3.9), kombinasyonda iki maddenin varlığına bağlı ilaç yoğunluğunun
artması, daha fazla reseptör işgali, enzim baskılanması ve sinaptik aralıkta AK
birikmesi ile duodenumda doku duyarlılığını artırmıştır. İlave AK uygulaması ile
dokuda daha çabuk etki açığa çıkmıştır. Her iki maddenin bir arada bulunması AK’
nin Emax değerini istatistiksel olarak önemli olmasa da düşürmüştür. Düşüşün çok
belirgin olmaması doku farkından ileri gelebilir.
Rat duodenumunda ETF ve CPF’ nin bir arada 10-7 M derişimde uygulanması ile AK
derişim-cevap eğrilerinin pD2 değerinde anlamlı bir değişiklik gözlenmezken, Emax
değerinde istatistiksel olarak anlamlı bir azalma (p<0,05) görüldü (Çizelge 3.15.). Bu
durum her iki maddenin yoğunluğunun artmasıyla hedefledikleri aynı reseptör ve
enzime bağlanma noktalarına veya kendileri ile ilgili biyoaktivasyon noktalarına
yarışmalarıyla birbirlerinin etkisini zayıflatmaları şeklinde açıklanabilir. Her iki
maddenin daha yoğun varlığına bağlı olarak daha güçlü şekilde görülen down-
regülasyon sonucu AK’ nin Emax değeri daha da belirgin olarak düşmüştür. Karanth
ve ark. (2004), tarafından ratlarda yapılan bir araştırmada oksonlarına dönüşerek
etkili olan CPF ve MPS’ nin eş zamanlı uygulanmasında görülen düşük toksisitenin
60
nedeninin her iki maddenin biyoaktivasyon noktaları için yarışması olarak
yorumlanmıştır.
Duodenumdaki cevapların aksine (10-10 M) rat ileumunda ise, ETF ve CPF’ nin bir
arada 10-10 M derişimde uygulanması ile AK derişim-cevap eğrilerinin pD2
değerinde oluşan artış istatistiksel olarak önemsizken, Emax değerinde istatistiksel
olarak anlamlı bir azalmaya (p<0,05) sebep oldu (Çizelge 3.14.). Bu azalma, tek
başına 10-10 M CPF kontrolüne göre, AK’ nin Emax değerinde sebep olduğu
azalmadan (Çizelge 3.10.) daha fazlaydı. Bu da, her iki maddenin bir aradayken
dokuya bağlı olarak AK’ nin maksimum etkinliğini, tek başlarına yaptıklarından
daha fazla düşürdüklerini (down-regülasyon olayının daha da güçlendiğini)
göstermektedir.
Rat ileumunda ETF ve CPF’ nin bir arada 10-7 M derişimde uygulanması, tek başına
uygulandıklarındakine benzer şekilde AK ile oluşturulan derişim-cevap eğrilerinin
pD2 değerinde istatistiksel olarak anlamlı bir artışa ve Emax değerinde anlamlı bir
azalmaya sebep oldu (p<0,05) (Çizelge 3.16.). Diğer bir ifadeyle ETF ve CPF’ nin
bir arada (10-7 M) kullanılması ileumda AK’ nin etki gücünü arttırırken maksimum
etkisini azalttı. Duodenumda aynı derişimlerde pD2 değerinde anlamlı bir değişiklik
olmazken ileumda görülmesi, ilaçların etkinliğinde doku farklılığının önemli
olabileceğini düşündürmektedir. Ancak ileumda 10-7 M derişimde kombinasyondan
elde edilen sonuçlar tek başlarına olanlara göre çok fazla fark göstermemiştir. Bu
durum aynı derişimlerde duodenumda elde edilen sonuca benzerlik göstermektedir;
her iki maddenin yoğunluğunun artmasıyla hedefledikleri aynı reseptör ve enzime
bağlanma noktalarına veya kendileri ile ilgili biyoaktivasyon noktalarına
yarışmalarıyla birbirlerinin etkisini zayıflatmışlardır.
Kombinasyonlar üzerine yapılan benzer araştırmalarda ikili karışımların etki gücünü
aynı veya zıt yönde değiştirebileceğine yönelik bilgiler bulunmaktadır (Karanth ve
ark., 2004). Okson formuna dönüşerek etkisini gösteren organik fosforlu
bileşiklerden CPF ve paratiyonun ikili karışımının ratlardaki etkileşim eşiğini
61
belirlemek amacıyla yapılan fizyolojik esaslı farmakokinetik modele dayalı bir
çalışmada, her kimyasalın 0,08 mg/kg’ dan düşük oral doz düzeylerinin aditif etkiye,
yüksek dozlarının ise yarışmalı enzim inhibisyonuna bağlı antagonizmaya neden
olduğu bildirilmektedir (El-Masri ve ark., 2004). CPF ve DZN ikili karışımı üzerine
ratlarda yapılan diğer bir araştırmada ise CPF/DZN kombinasyonun doza-bağımlı
olarak ve kolinesteraz inhibisyonu ile tek CPF ve tek DZN’ ye göre daha güçlü
toplam nispi etki gücüne neden olduğu bildirilmiştir (Timchalk ve ark., 2005).
Rat ileumunda ETF ve CPF ile inkübasyon neticesinde AK’ nin Emax değerinde
görülen devamlı ve güçlü düşüş, AK’ nin bağlanabileceği reseptör sayısındaki
azalmaya (down-regülasyon) bağlı bir etki olarak açıklanabilir. Elde edilen sonuçlar
Becerra ve ark. (2001)’ nın bir Alzheimer ilacı olan THA’ nın AK üzerine etkisini
belirlemek amacıyla yaptıkları araştırmadaki sonuçlara benzerlik göstermektedir. Söz
konusu araştırmada elde edilen sonuçlara göre THA’ nın hem antikolinerjik hem de
muskarinik reseptör blokajına bağlı bifazik etkisinin olduğu ve THA gibi
kolinesteraz inhibitörlerinin uzun süre uygulanması neticesinde muskarinik reseptör
sayısında azalmanın görüldüğü ve THA’ nın seçici şekilde down-regülasyon yaptığı
bildirilmiştir.
Sonuçta araştırmada kullanılan iki maddeye (Etefon+Klorprifos) bir arada maruz
kalınması AK’ nin etki gücü bakımından aynı yönde etkileşime neden olurken, Emax
yönünde zayıflamaya yol açmıştır. Bu sonuç, dolaylı kolinerjik etkili bu iki kimyasal
maddeye beraber maruziyetin daha düşük dozlarda ve daha erken kolinerjik klinik
cevapların gelişmesine sebep olabileceğini, ancak toksikasyonun şiddetinin daha
zayıf olacağını göstermektedir. Emax’ da görülen düşüş söz konusu kimyasal
maddelere maruz kalan canlılar yönünden olumlu olarak düşünülse de benzer
nitelikli fakat efikasitesi daha güçlü diğer kimyasal maddelerin devreye girmesi ile
durumun daha da kötüleşebileceğini de akla getirmelidir. Nitekim Cochran (2002)
tarafından CPF üzerine yapılan bir makalede CPF’ nin beyin AKE aktivitesinde %
70 oranında bir düşüşe neden olmasına rağmen, hem AK reseptörlerinde down-
regülasyonu ve hem de AK sentezini azaltmasına bağlı olarak klinik belirtilere veya
motor aktivite ve davranışlarda değişikliklere neden olmadığı bildirilmektedir.
62
Ancak, deney hayvanları üzerinden yapılan değerlendirmelerde bu kadar yüksek
düzeyde beyin AKE blokajının hayvanda klinik belirtilere neden olmasa da çevresel
şartlara cevap verme yeteneğinde belirgin bir azalmaya neden olacağını, bunun da
önemli bir yan etki olarak değerlendirileceği vurgulanmaktadır.
63
5. SONUÇ VE ÖNERİLER
Zehirliliklerini etkili formlarına dönüşerek, AKE enzimini baskılama ve kolinerjik
reseptörlere bağlanma yoluyla gösteren biri pest mücadelesinde, diğeri de bitki
gelişim düzenleyicisi olarak kullanılan klorprifos ve etefonun bir aradaki etkilerinin
ortaya konması amacıyla yapılan bu in vitro araştırmada kullanılan iki maddeye
(Etefon+Klorprifos) bir arada maruz kalınması asetilkolinin etki gücü bakımından
aynı yönde etkileşime neden olurken, Emax yönünde zayıflamaya yol açmıştır.
Elde edilen sonuçlar ETF ve CPF’ nin bir arada uygulanmasının, uygulanan derişime
ve doku tipine bağlı olarak tek başlarına olana göre etkilerini daha da artırdığını
göstermektedir. Ayrıca, bu iki maddeye aynı anda maruz kalınması daha düşük
dozlarda ve erken gelişen bir toksik etkiye neden olacaktır. Ancak, etki nicelik olarak
daha da zayıflayacaktır. Nicelik olarak bu zayıflama ilk anda olumlu olarak
algılanmakla birlikte, asetilkoline göre daha zayıf kastırıcı etkiye sahip olan bu iki
madde tarafından asetilkolin reseptörlerinin önceden işgal edilmesiyle asetilkolinin
bağlanacak reseptör sayısının azalması sonucunda geliştiği için bu değerlendirme
yanıltıcı olabilir. Zira bu maddeler aynı zamanda etkilerini esterazları bloke ederek
de göstermektedirler. Dolayısıyla bu maddelere bağlı yüksek düzeydeki enzim
baskılanması, ortama etki gücü ve maksimum etki bakımından daha güçlü ve benzer
etkili diğer maddelerin girmesiyle beklenmedik şekilde istenmeyen etkilerin veya
zehirlenmelerin gelişmesine neden olabilir. Ayrıca, bu şekildeki yüksek düzeyde
enzim baskılanması klinik bozukluğa neden olmasa da fizyolojik fonksiyonlarda
bozulmaya ve dış etkilere cevapta sorunlara da yol açabilir.
Günümüze kadar yapılan çalışmaların çoğu, maddelerin tek başlarına yaptıkları
istenmeyen etkilerine yöneliktir. Oysa canlılar sürekli eş zamanlı olarak çok sayıda
pestiside değişik yollarla maruz kalmaktadır. Vücuda giren bu maddeler bir arada
oldukça karmaşık etkilere yol açabilir; benzer veya farklı mekanizmalarla etkiseler
bile in vivo koşullarda aralarında aynı veya zıt etkileşimler görülebilir. Etkileşimin
64
tipi ne olursa olsun sonuçta vücuda giren çok sayıdaki yabancı maddeler doğal
fizyolojik yolakları bozarak canlılarda basit istenmeyen etkilerden mutasyon veya
kanserojen etkilere kadar giden bir dizi sağlık problemine yol açar. Günümüzde
ulusal ve uluslar arası sağlık kuruluşları bu istenmeyen etkileri azaltabilmek için
genellikle tek başlarına maddeler üzerinden tolerans düzeyleri belirlemektedir.
Araştırmadan elde edilen veriler ve benzer çalışmalar ışığında, bu değerlendirmelerin
yeterli olamayacağı görülmektedir. Bu nedenle en azından bir arada maruz kalınma
olasılığı fazla olan maddeler üzerinden kombinasyona bağlı değerlendirilmelerin de
yapılması ileride karşılaşılabilecek istenmeyen etkileri önleme bakımından yararlı
olacaktır.
65
ÖZET
Etefon ile Klorprifos etil’ in Tek ve Bir Arada Etkilerinin Rat Bağırsak Kasında in Vitro Olarak Araştırılması
Bu araştırmada, Türkiye’ de ve dünyada geniş kullanım alanı olan organik fosforlu pestisid klorprifos ve bitki gelişim düzenleyicisi etefona bir arada maruz kalınması durumunda olası etkileşimlerin ortaya konulması amaçlandı.
Çalışmada, 42 adet Wistar Albino soyu 3 aylık erkek rattan alınan ince bağırsak düz kası (duodenum ve ileum) kullanıldı. Yaklaşık 1 cm uzunluğundaki ince bağırsak segmentine, 10 ml Tyrode çözeltisi içeren izole organ banyosunda 1 gram gerim uygulanarak çalışıldı. Duodenum ve ileum dokusunda, asetilkolin (AK) (10-9–10-4 M), etefon (ETF) (10-10–10-6 M) veya klorprifos (CPF) (10-10–10-6 M) kümülatif derişimlerde uygulanarak tek başlarına doku üzerindeki etkileri değerlendirildi. Ayrıca Etefon ve Klorprifos tek başlarına ve bir arada 10-7 M ve 10-10 M derişimlerde inkübe edilerek asetilkolinin kümülatif derişim cevap eğrisi üzerine etkileri çalışıldı. Dokuların enzimatik etkinliğinin test edilmesi amacıyla fizostigmin uygulaması yapıldı.
Araştırmada elde edilen veriler, klorprifos ve etefonun bir arada kullanılmasının uygulanan derişime ve doku tipine bağlı olarak farklı sonuçlar verdiğini gösterdi; her iki maddenin bir arada 10-7 M derişiminde rat ileumunda hem pD2 ve hem de Emax değerlerinde istatistiksel olarak asetilkolin kontrole göre önemli farklılıklar alınmakla birlikte, tek başlarına olana göre kombinasyondaki farklar çok belirgin değildi. Oysa aynı dokuda bu maddelerin bir arada (Kombinasyon Emax değeri AK: 94,90 ± 3,14, ETF+CPF+AK: 81,56 ± 4,11) daha düşük yoğunlukta uygulanması (10-10 M) özellikle klorprifosun tek uygulamasına göre (Klorprifos Emax değeri AK: 94,27 ± 2,90, CPF+AK: 85,76 ± 2,79) asetilkolinin özellikle Emax değerinde önemli (p<0,05) düzeyde azalmaya neden oldu.
Asetilkolinesteraz baskılanması ve kolinerjik reseptörler üzerinden etkili olan bu maddelerin kombinasyonunun Emax yönünden asetilkolinin etkisini zayıflatması, benzer mekanizmayla etkili olan diğer ilaçların etkilerini de zayıflatacağı veya zehirlenmelerin etkisini hafifleteceği anlamına getirilmemelidir. Özellikle, kombinasyona bağlı esterazların baskılanması efikasite yönünden güçlü ve benzer etkili maddelere maruz kalınmasında istenmeyen etkilerin beklenmedik dozlarda ve zamanda ortaya çıkışına neden olabilecektir.
Anahtar Sözcükler: Etefon, Klorprifos, ince bağırsak, kombinasyon, izole organ.
66
SUMMARY
Investigation of in Vitro Effects of Alone and Combined Ethephon and Chlorpyrifos ethyl in Rat Intestinal Muscle
The aim of this study is to elicit the possible interactions in case of combined exposure to organophosphorus pesticide chlorpyrifos and plant growth regulator ethephon which are widely used in Turkey and worldwide.
In this study, the small intestinal smooth muscle (duodenum and ileum) of 3 months old 42 Wistar Albino male rats were used. The small intestine segments of approximately 1 cm long were studied under a load of 1 gram in isolated organ bath containing 10 ml Tyrode solution. By applying acetylcholine (AK), ethephon (ETF) and chlorpyrifos (CPF) to duodenum and ileum with cumulative concentrations, their effects alone were evaluated. Besides, by incubating ethephon and chlorpyrifos alone and in combination with 10-7 M and 10-10 M concentrations, their effects on cumulative concentration-response curve of acetylcholine were studied. Physostigmine treatment was made in order to test enzymatic activity of the tissues.
The data obtained from this investigation show that the combination of ethephon and chlorpyrifos gives different results according to concentration applied and tissue type; both for pD2 value and Emax value in rat ileum combination of both agents with 10-7 M concentration, statistically significant differences obtained in comparison with acetylcholine control, however, the differences of the combination in comparison with single application was not significant. Yet, on same tissue the combined application (Combination Emax value AK: 94,90 ± 3,14, ETF+CPF+AK: 81,56 ± 4,11) of these agents with lower concentrations (10-10 M) especially in comparison with single chlorpyrifos application (Chlorpyrifos Emax value AK: 94,27 ± 2,90, CPF+AK: 85,76 ± 2,79), caused significantly important (p<0,05) decrease particularly in Emax value of acetylcholine.
Attenuation of the Emax value of acetylcholine by the combination of these agents which act by inhibiting acetylcholinesterase and by binding cholinergic receptors, should not mean to attenuate the effects of other agents that have the same mechanism of action. Especially, this inhibition of esterases by combination may elicit adverse effects with unexpected doses and times when exposed to efficaciously strong and similar agents.
Key Words: Ethephon, Chlorpyrifos, small intestine, combination, isolated organ.
67
KAYNAKLAR
ABU-QARE, A.W., ABDEL-RAHMAN, A., BROWNIE, C., KISHK, A.M., ABOU-DONIA, M.B. (2001). Inhibition of Cholinesterase Enzymes Following a Single Dermal Dose of Chlorpyrifos and Methyl Parathion, Alone and in Combination in Pregnant Rats. J. Tox. Environ. Health A, 63: 173-189.
ADLER, M., REUTTER, S.A., MOORE, D.H., FILBERT, M.G. (1991). Regulation of Acetylcholine Hydrolysis in Canine Tracheal Smooth Muscle. Eur. J. Pharmacol., 205: 73-79.
ATTERBERRY, T.T., BURNETT, W.T., CHAMBERS, J.E. (1997). Age-related differences in parathion and chlorpyrifos toxicity in male rats: target and nontarget esterase sensitivity and cytochrome p450-mediated metabolism. Toxicol. Appl. Pharmacol., 147: 411-418.
AXELRAD, J.C., HOWARD, C.V., McLEAN, W.G. (2002). Interactions Between Pesticides and Components of Pesticide Formulations in an in Vitro Neurotoxicity Test. Toxicology, 173: 259-268.
BAYDAN, E., ÜSTÜNER, E., İNCE, S. (2002). Tavşan ve Koyun Trakeası Üzerine Levamizol’ün Etkisinin Tek Başına ve Triklorfonla Birlikte Araştırılması. 2002-K-120130-8 No’lu DPT projesi. (Yayınlanmamış rapor).
BECERRA, M.A., HERRERA, M.D., MARHUENDA, E. (2001). Action of tacrine on muscarinic receptors in rat intestinal smooth muscle. J. Auton. Pharmacol., 21: 113-119.
BRUNTON, L.L., LAZO, J.S., PARKER, K.L. (2006). Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics – 11th Ed. McGraw-Hill Medical Publishing Division. ISBN 0-07-142280-3.
BUTLER, M.M., GRIFFEY, S.M., CLUBB, F.J., GERRITY, L.W., CAMPBELL, W.B. (1990). The Effect of Euthanasia Technique on Vascular Arachidonic Acid Metabolism and Vascular and Intestinal Smooth Muscle Contractility. Lab. Anim. Sci., 40: 277-283.
CHANDA, S.M., MORTENSEN, S.R., MOSER, V.C., PADILLA, S. (1997). Tissue-Spesific Effects of Chlorpyrifos on Carboxylesterase and Cholinesterase Activity in Adult Rats: An in Vitro and in Vivo Comparison. Fundam. App. Toxicol. 38: 148-157.
COCHRAN, R.C. (2002). Appraisal of Risks from Nonoccupational Exposure to Chlorpyrifos. Reg. Toxicol. Pharmacol., 35: 105-121.
68
COOK, T.J., SHENOY, S.S. (2003). Intestinal Permeability of Chlorpyrifos Using the Single-Pass Intestinal Perfusion Method in the Rat. Toxicology, 184: 125-133.
ÇOKUĞRAŞ, A.N. (2003). Butyrylcholinesterase: Structure and Physiological Importance. Turk. J. Biochem., 28: 54-61.
DAVIS, K.A.M., MASELLA, J., BLENNERHASSETT, M.G. (1998). Acetylcholine Metabolism in the Inflamed Rat Intestine. Experimental Neurology, 152: 251-258.
EL-MASRI, H.A., MUMTAZ, M.M., YUSHAK, M.L. (2004). Application of Physiologically-Based Pharmacokinetic Modeling to Investigate the Toxicological Interaction between Chlorpyrifos and Parathion in the Rat. Environ. Tox. Pharm., 16: 57-71.
GANONG, W.F. (2003). Review of Medical Physiology – 21st Ed. Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Publishing Division. ISBN 0-07-140236-5.
GORDON, C.J., HERR, D.W., GENNINGS, C., GRAFF, J.E., McMURRAY, M., STORK, L., COFFEY, T., HAMM, A., MACK, C.M. (2006). Thermoregulatory response to an organophosphate and carbamate insecticide mixture: Testing the assumption of dose-additivity. Toxicology, 217: 1-13.
HAUX, J.E., LOCKRIDGE, O., CASIDA, J.E. (2002). Specificity of Ethephon as a Butyrylcholinesterase Inhibitor and Phosphorylating Agent. Chem. Res. Toxicol., 15: 1527-1533.
HAUX, J.E., QUISTAD, G.B., CASIDA, J.E. (2000). Phosphobutyrylcholinesterase: Phosphorylation of the Esteratic Site of Butyrylcholinesterase by Ethephon [(2-Chloroethyl)phosphonic Acid] Dianion. Chem. Res. Toxicol., 13: 646-651.
HOWARD, M.D., POPE, C.N. (2002). In Vitro Effects of Chlorpyrifos, Parathion, Methyl Parathion and their Oxons on Cardiac Muscarinic Receptor Binding in Neonatal and Adult Rats. Toxicology, 170: 1-10.
INCHEM (2002). Pesticide residues in food - 2002 - Joint FAO/WHO Meeting on Pesticide Residues. ETHEPHON (addendum). IPCS INCHEM. Erişim: [http://www.inchem.org/documents/jmpr/jmpmono/2002pr05.htm]. Erişim Tarihi: 10.Eylül.2005.
JACOBSEN, H., OSTERGAARD, G., LAM, H.R., POULSEN, M.E., FRANDSEN, H., LADEFOGED, O., MEYER, O. (2004). Repeated dose 28-day oral toxicity study in Winstar rats with a mixture of five pesticides often found as residues in food: alphacypermethrin, bromopropylate, carbendazim, chlorpyrifos and mancozeb. Food Chem. Toxicol., 42: 1269-1277.
69
KARANTH, S., LIU, J., OLIVIER, K.Jr., POPE, C. (2004). Interactive Toxicity of the Organophosphorus Insecticides Chlorpyrifos and Methyl Parathion in Adult Rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 196: 183-190.
KARANTH, S., POPE, C. (2000). Carboxylesterase and A-Esterase Activities during Maturation and Aging: Relationship to the Toxicity of Chlorpyrifos and Parathion in Rats. Toxicol. Sci., 58: 282-289.
KAYAALP, S.O. (2002). Rasyonel Tedavi Yönünden Tıbbi Farmakoloji. 10.Baskı. Hacettepe Taş Kitapçılık - Ankara. ISBN 975-8506-27-7.
KOUSBA, A.A., POET, T.S., TIMCHALK, C. (2003). Characterization of the in vitro Kinetic Interaction of Chlorpyrifos-oxon with Rat Salivary Cholinesterase: A Potential Biomonitoring Matrix. Toxicology, 188: 219-232.
KOUSBA, A.A., SULTATOS, L.G., POET, T.S., TIMCHALK, C. (2004). Comparison of Chlorpyrifos-Oxon and Paraoxon Acetylcholinesterase Inhibition Dynamics: Potential Role of a Peripheral Binding Site. Toxicol. Sci., 80: 239-248.
L'HERMITE, A., SINE, J.P., COLAS, B. (1996). Ultrastructural Localization of Butyrylcholinesterase in Epithelial Cells of Rat Intestine. Eur. J. Histochem., 40: 299-304.
MORTENSEN, S.R., BRIMIJOIN, S., HOOPER, M.J., PADILLA, S. (1998). Comparison of the in Vitro Sensitivity of Rat Acetylcholinesterase to Chlorpyrifos-oxon: What Do Tissue IC50 Values Represent? Toxicol. Appl. Pharmacol., 148: 46-49.
MOTULSKY, H.J. (2003). Prism 4 Statistics Guide – Statistical Analysis for Laboratory and Clinical Researchers. GraphPad Software Inc., San Diego CA, www.graphpad.com.
MOTULSKY, H.J., CHRISTOPOULOS, A. (2003). Fitting Models to Biological Data using Linear and Nonlinear Regression. A Practical Guide to Curve Fitting. GraphPad Software Inc., San Diego CA, www.graphpad.com.
NOSTRANDT, A.C., PADILLA, S., MOSER, V.C. (1997). The Relationship of Oral Chlorpyrifos Effects on Behavior, Cholinesterase Inhibition, and Muscarinic Receptor Density in Rat. Pharm. Biochem. Behav., 58: 15-23.
OHRUI, T., SEKIZAWA, K., YAMAUCHI, K., OHKAWARA, Y., NAKAZAWA, H., AIKAWA, T., SASAKI, H., TAKISHIMA, T. (1991). Chemical Oxidant Potentiates Electrically and Acetylcholine-Induced Contraction in Rat Trachea: Possible Involvement of Cholinesterase Inhibition. J. Pharm. Exp. Therap., 259: 371-376.
POET, T.S., WU, H., KOUSBA, A.A., TIMCHALK, C. (2003). In Vitro Rat Hepatic and Intestinal Metabolism of the Organophosphate Pesticides Chlorpyrifos and Diazinon. Toxicol. Sci., 72: 193-200.
70
POPE, C., KARANTH, S., LIU, J. (2005). Pharmacology and Toxicology of Cholinesterase Inhibitors: Uses and Misuses of a Common Mechanism of Action. Environ. Tox. Pharm., 19: 433-446.
SEGALL, Y., GRENDELL, R.L., TOIA, R.F., CASIDA, J.E. (1991). Composition of Technical Ethephon [(2-Chloroethyl)phosphonic Acid] and Some Analogues Relative to Their Reactivity and Biological Activity. J. Agric. Food. Chem., 39: 380-385.
SEILER, R., RICKENBACHER, A., SHAW, S., BALSIGER, B.M. (2005). α- and ß-Adrenergic Receptor Mechanisms in Spontaneous Contractile Activity of Rat Ileal Longitudinal Smooth Muscle. J. Gastrointestinal Surgery, 9: 227-235.
SMEGAL, D.C. (2000). Human Health Risk Assessment: Chlorpyrifos. U.S. Environmental Protection Agency. Office of Pesticide Programs, Health Effects Division (7509C). Deborah C. Smegal, M.P.H., Risk Assessor. June 8, 2000. Erişim: [http://www.epa.gov/pesticides/op/chlorpyrifos/hedrra.pdf]. Erişim Tarihi: 28.Haziran.2003.
SPARKS, S.E., QUISTAD, G.B., CASIDA, J.E. (1999). Organophosphorus Pesticide-Induced Butyrylcholinesterase Inhibition and Potentiation of Succinylcholine Toxicity in Mice. J. Biochem. Molecular Toxicology, 13: 113-118.
TAHA, M.O., FRAGA, M.M., FAGUNDES, D.J., BANDEIRA, C.P., CARICATI-NETO, A., JURKIEWICZ, A. (2002). Effect of Preservation Conditions on Autonomic Transmission in Rat Small Bowel. Transplantation Proceedings, 34: 1021-1024.
TEZUKA, A., ISHIHATA, A., AITA, T., KATANO, Y. (2004). Aging-Related Alterations in the Contractile Responses to Acetylcholine, Muscarinic Cholinoceptors and Cholinesterase Activities in Jejunum and Colon of the Male Fischer 344 Rats. Experimental Gerontology, 39: 91-100.
TIMCHALK, C., NOLAN, R.J., MENDRALA, A.L., DITTENBER, D.A., BRZAK, K.A., MATTSON, J.L. (2002). A Physiologically Based Pharmacokinetic and Pharmacodynamic (PBPK/PD) Model for the Organophosphate Insecticide Chlorpyrifos in Rats and Humans. Toxicol. Sci., 66: 34-53.
TIMCHALK, C., POET, T.S., HINMAN, M.N., BUSBY, A.L., KOUSBA, A.A. (2005). Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Interaction for a Binary Mixture of Chlorpyrifos and Diazinon in the Rat. Toxicol. Appl. Pharmacol., 205: 31-42.
TOMLIN, C.D.S. (1997). The Pesticide Manual: A World Compendium. 11 th Ed. The British Crop Protection Council.
TUSH, G.M., ANSTEAD, M.I. (1997). Pralidoxime Continuous Infusion in the Treatment of Organophosphate Poisoning. Ann. Pharmacother., 31: 441-444.
71
U.S. EPA. (1995). Reregistration Eligibility Decision (RED): Ethephon. List A Case 0382. United States Environmental Protection Agency. Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances. April 1995. Washington, D.C. 20460. Erişim: [http://www.epa.gov/REDs/0382.pdf]. Erişim Tarihi: 13.Mart.2003.
U.S. EPA. (2002). Interim Reregistration Eligibility Decision for Chlopyrifos. EPA 738-R-01-007. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.
U.S. HHS. (1997). Toxicological Profile for Chlorpyrifos. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service Agency for Toxic Substances and Disease Registry. September 1997. Erişim: [http://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/tp84.pdf]. Erişim Tarihi: 13.Mart.2006.
ÜSTÜNER, E. (2003). Tavşan Trakeası Üzerine Levamizolun Etkisinin Tek Başına ve Triklorfonla Birlikte Araştırılması. Doktora Tezi. Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü.
WHO (2002). WHO Spesifications and Evaluations for Public Health Pesticides. Chlorpyrifos. Evaluation Report 221/2002. Erişim: [http://www.who.int/ctd/docs/whopes/new_docs/new_specifications/Chlorpyrifos_WHO_Evaluation.pdf]. Erişim Tarihi: 20.Haziran.2005.
WILLIAMS, P.L., JAMES, R.C., ROBERTS, S.M. (2000). Principles of Toxicology: Environmental and Industrial Applications – 2nd Ed. John Wiley & Sons, Inc. ISBN 0-471-29321-0.
YAZAR, S. (2005). Farelerde Maleik Hidrazid ve Etefon’un Tek ve Kombine Haldeki Subkronik Toksik Etkilerinin Araştırılması. Doktora Tezi. Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü.
ZHANG, N., CASIDA, J.E. (2002). Novel Irreversible Butyrylcholinesterase Inhibitors: 2-Chloro-1-(substituted-phenyl)ethylphosphonic Acids. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 10: 1281-1290.
72
ÖZGEÇMİŞ
I Bireysel Bilgiler
Adı ve Soyadı: Mustafa Alp Çetinkaya
Doğum yeri ve tarihi: Ankara – 1976
Uyruğu: TC
Medeni durumu: Bekar
Askerlik durumu: Tecilli
İletişim adresi ve telefonu: İlkyerleşim mah. 9.cad. 401.sok. No:16
Batıkent / Ankara Tel: 533 455 92 18
II Eğitimi
Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi (1994 – 1999)
TED Ankara Koleji (İlk ve Orta Öğrenim 1982 – 1993)
Yabancı dili: İngilizce, Fransızca
III Unvanları
Veteriner Hekim (1999)
IV Mesleki Deneyimi
Ülkem İlaç San. Tic. Ltd. Şti. (2000 – 2001 / 2003 – 2003) - Ruhsatlandırma
İnterhas Tıbbi ve Kimyevi Ürünler San. Tic. A.Ş. (2003 – 2006)
Ruhsatlandırma ve İthalat
Çankırı İl Tarım Müdürlüğü – Hayvan Sağlık Şubesi (2006 – )
V Üye Olduğu Bilimsel Kuruluşlar
Veteriner Farmakoloji ve Toksikoloji Derneği
VI Bilimsel İlgi Alanları
Yayınları:
Bitki Gelişim Düzenleyicilerin Sağlık Üzerine Etkileri (Seminer)
Devekuşu ve Hastalıklarında İlaç Kullanımı (Seminer)
Devekuşlarında İlaç Uygulamaları – Akademi Devekuşu Mayıs 2002 (Kitapçık)