ETI-DELTA-IGMK-2(P001653)

EN: Pay attention to changes!

IT: Attenzione alle modifiche!

FR: Faire attention aux modifications!

DE: Auf die Änderungen aufpassen!

ES: ¡Atención a las modificaciones!

PT: Cuidado com as modificações!

RO: Atenţie la modificări!

NO: Legg merke til endringene!

SV: Uppmärksamma vidtagna ändringar!

DA: Bemærk ændringerne!

CS: Dávejte si pozor na změny!

SK: Venujte pozornost’ zmenám!

PL: Należy zwrócić uwagę na zmiany!

LT: Atkreipkite dėmesį į pakeitimus!

LV: Pievērsiet uzmanību izmaiņām!

HU: Kérjük, figyeljen a változásokra!

BG: Обърнете внимание на промените!

TR: Değişikliklere dikkat edin!

EL: Προσοχή στις τροποποιήσεις!

133

ANTI-HD IgM IMŪNFERMENTATĪVĀS ANALĪZES KOMPLEKTSProcedūra kvalitatīvai

IgM klases imūnglobulīnu pret hepatīta Delta antigēnu (anti-HD IgM) noteikšanai

cilvēka seruma vai plazmas paraugosLietošanai tikai in vitro

1. IEVADSOrganisma seroloģiskā atbildes reakcija uz akūtu inficēšanos ar hepatīta Delta vīrusu(HDV) sastāv no sākotnē jās fāzes, kad asinīs var konstatēt HD antigēnu, kam sekoserokonversija, kad nosakāmas specifiskas antivielas (anti-HD).Tā kā HD virēmija ir īslaicīga un tikai agrīnā infekcijas stadijā, HDAg serumā jānosakatūlīt pēc simptomu parādīšanās. Pozitīvas reakcijas iespējamība turpmāko dienu laikāstrauji samazinās.Pretēji straujajai un spēcīgajai anti-HAV IgM un anti-HBc IgM sintēzei hepatīta A un Bgadījumā, HVD infekcijas gadījumā specifisko antivielu sintēze bieži aizkavējas; laiks līdzantivielu sintēzei lielā mērā ir atkarīgs no tā, vai HDV ir pievienojies HBV infekcijai kākoinfekcija (normāliem indivīdiem) vai kā superinfekcija HBsAg nēsātājiem.Akūtas HBV/HDV koinfekcijas gadījumā IgM klases antivielu pret HDV (anti-HD IgM)koncentrāci ja pieaug dažu dienu l īdz nedēļu laikā pēc simptomu parād īšanās unserokonversija, parādoties anti-HD IgG, notiek vēlāk. Tā kā anti-HD IgM ir antivielas, kasparādās visātrāk, un bieži tās ir vienīgās antivielas klīnisko simptomu fāzē, tās ir izvēlesmarķieris HBV/HDV koinfekcijas diagnosticēšanai akūtiem pacientiem ar HBsAg pozitīvuhepatītu. Veicot sērijveida analīzes vairāku nedēļu laikā, pareizas diagnozes noteikšanasiespējamība palielinās, bet pieņemams kompromisa variants ir pirmā testa veikšana,parādoties simptomiem, un testa atkārtošana pēc 14 dienām. Šāda divkārša analīzesveikšana palielina diagnosticēto HBV/HDV koinfekciju skaitu par 35 līdz 50%, salīdzinotar vienas analīzes veikšanu.Kā likums, antivielu produkcija, atbildot uz superinfekciju, ir ātrāka un enerģiskāka kākoinfekcijas gadījumā. Anti-HD IgM antivielas ir nosakāmas, parādoties simptomiem, vaiarī to koncentrācija palielinās neilgi pēc simptomu parādīšanās, un drīz pēc tam varnoteikt arī IgG klases antivielas; tādējādi anti-HD IgM veidošanās veids palīdz atšķirtkoinfekciju no superinfekcijas.Vēl svarīgāks ir fakts, ka, atveseļojoties no hepatīta D, anti-HD IgG parasti saglabājas,bet anti-HD IgM koncentrācija strauji samazinās, bet progresē jošas HDV infekcijasgadī jumā – to koncentrācija pieaug, sasniedzot augstu titru. Tādē jādi, anti-HD IgMnoteikšana sniedz svarīgu informāciju par hepatīta D gaitu un prognozi, IgM antivielupersistēšana l iecina par hepat ī ta D pāreju hroniskā fāzē . Paties ībā ant i-HD IgMatklāšana un titrs tieši korelē ar HDV replikāciju un aknu iekaisuma aktivitāti.

2. ANALĪZES PRINCIPSKvalitatīvai anti-HD IgM noteikšanai izmanto imūnfermentatīvo analīzi, kas attēlota 1.att.; šai metodei par pamatu izmantota ELISA tehnika (enzimātiskā imūnfermentatīvāanalīze) antivielu noteikšanai. Gēnu inženierijas ceļā iegūta HDAg un anti-HD antivieluf r a g m e n t u ( p e l e s m o n o k l o nā l o ) i z m a n t o š a n a u z l a b o t e s t a u z t i c a m īb u u nreproducējamību.

134

1. att.

➀ Iedobe, kas pārklāta ar IgG pret cilvēka IgM (peles monoklonālo).➁ Anti-HD IgM no parauga vai kontroles.➂ HDAg (rekombinanta DNS).➃ Fermentu iezīmētājs: anti-HD Fab (cilvēka un peles monoklonālais), kas konjugēts ar

mārrutku peroksidāzi (HRP).

3

+

1 2

4

+

+

inkubācija(1 stunda, 37°C)

mazgāšana

inkubācija(1 stunda, 37°C)

mazgāšana

hromogēns/substrāts

instrumenta nolasījums pie 450/630 nm.

inkubācija(30 minūtes, istabas temp.)

apturēšanas šķīdums

inkubācija(1 stunda, 37°C)

mazgāšana

135

Anti-HD IgM un HDAg klātbūtnē fermentu iezīmētā js saistās ar cieto fāzi. Tādē jādifermenta aktivitāte ir proporcionāla parauga vai kontroļu anti-HD IgM koncentrācijai.Fermenta aktivitāti nosaka, pievienojot bezkrāsainu hromogēna/substrāta šķīdumu.Fermentam iedarbojot ies uz hromogēnu/substrā tu, veidojas krāsa, ko nosaka arfotometru.

3. REAĢENTI UN PIEDERUMI

3.1. Komplektā iekļautie reaģenti

UZGLABĀŠANA: Pēc saņemšanas uzglabā j iet visus reaģentus 2-8°C temperatūrā,sargājiet no spilgtas gaismas. Nesasaldēt. Pēc atvēršanas komplekta reaģenti ir stabiliastoņas nedēļas, ja tie tiek pareizi uzglabāti, ja nav norādīts savādāk. Komplekts irstabils vienu darba nedēļu, ja to lieto astoņas stundas dienā istabas temperatūrā un naktīuzglabā 2-8°C temperatūrā.Reaģentus nedrīkst lietot pēc derīguma termiņa beigām. Komplekta derīguma termiņš irnorādī ts uz ārē jā marķē juma. Katras sastāvda ļas derīguma termiņš ir norādī ts uzattiecīgā flakona marķējuma.Nedrīkst sajaukt specifiskos reaģentus no dažādām partijām (skatīt 4.a sadaļu). Varsavstarpēji aizstāt nespecifiskos reaģentus no dažādām partijām (skatīt 4.b sadaļu).

3.2. Komplekta sastāvā iekļautie materiāli– 2 iepriekš piegriezti kartona noslēgi, kas piemēroti 1 līdz 12 sloksnēm– 2 kartona noslēgi, kas piemēroti 12 sloksnēm (vienai platei)– maisiņa noslēgs.

3.3. Materiāli, kas vajadzīgi, bet nav komplekta sastāvā– Fotometrs, kas veic vertikālus lasījumus (piem., ETI-SYSTEM lasītājs vai ekvivalents)

ar šādām instrumenta specifikācijām:viļņa garums: divi viļņu garumi – 450 nm un 620-630 nmjoslas platums: ≤ 10 nmabsorbcijas diapazons: 0 absorbcijas vienības līdz ≥ 2,5 absorbcijas vienībasatkārtojamība: 0,005 absorbcijas vienības vai mazāk vai 1%, atkarībā no tā, kuršrādītājs lielākslinearitāte vai ticamība: 0,010 absorbcijas vienības vai mazāk vai 2%, atkarībā no tā,kurš rādītājs lielāksnovirze: mazāk nekā 0,005 absorbcijas vienības stundā.

– Termostatiski kontrolēts mitruma nodalījums ar šādām specifikācijām:temperatūra: 37°C ± 1°C.

– Manuāls vai automātisks aprīkojums iedobju skalošanai (piem., ETI-SYSTEMmazgātājs vai ekvivalents) ar šādām instrumenta specifikācijām:iepildāmais tilpums: 300-370 μL

Sloksnes ar pārklājumu 12 sloksnes ar 8 iedobēmFermentu iezīmētājs 1 flakons, 0,4 mLNegatīvā kontrole 1 flakons, 3,3 mLPozitīvā kontrole 1 flakons, 3,3 mLrHDAg 1 flakons, 15 mLIezīmētāja atšķaidītājs 1 flakons, 14,7 mLParauga atšķaidītājs 2 pudeles, 70 mLMazgāšanas buferis 1 flakons, 40 mLHromogēns 1 flakons, 9 mLSubstrāts 1 flakons, 9 mLApturēšanas šķīdums 1 flakons, 30 mL

Testu skaits 96

136

mazgāšanas ciklu skaits: 5mērcēšanas laiks: 30 sekundesaspirē pēdējo iepildītā šķidruma sadalījumu: jā.

– Mikropipetes ar vienreizējās lietošanas uzgaļiem (10 μL: ticamība ± 3%, precizitāte2%; 100 μL: ticamība ± 2%, precizitāte 1%).

– Stikla trauki.– Destilēts ūdens.Automātiskai testa apstrādei var izmantot ETI-LAB vai ETI-MAX 3000 aprīkojumu.

4. REAĢENTU SASTĀVS UN SAGATAVOŠANAVisas seruma un plazmas vienības, kas tika izmantotas šā komplekta komponenturažošanā, tika testētas uz HBsAg, anti-HCV un anti-HIV-1/2 klātbūtni, un šiem testiembija negatīvi rezultāti; izņēmums bija materiāls, kas saturēja anti-HD antivielas – tasreaģēja uz HBsAg un anti-HCV. Tomēr HBsAg un HCV klātbūtne galīgajos reaģentos irizslēgta, jo HBsAg tiek atdalīts attīrīšanas laikā un HCV RNS testa rezultāts ir negatīvs.Tomēr, tā kā neviena testa metode nespēj pilnībā garantēt patogēnu neesamību, visuscilvēka izcelsmes paraugus jāuzskata par potenciāli infekcioziem un ar tiem jārīkojas,ievērojot piesardzību.Komplektā izmantots gēnu inženierijas ceļā iegūts HDAg un himērisks anti-HD IgM, untiek izslēgta augsti infekcioza cilvēka materiāla izmantošana.

a) SPECIFISKIE KOMPLEKTA REAĢENTI

4.1. Sloksnes ar pārklājumuIedobes ir pārklātas ar IgG (peles monoklonālo) pret cilvēka IgM (ar specifisku μ ķēdi).Sloksnes ir gatavas lietošanai, un tās jāuzglabā 2-8°C temperatūrā.Pirms maisiņa atvēršanas novietojiet pārklā tās sloksnes istabas temperatūrā , laineveidotos ūdens kondensāts. Ievietojiet neizmantotās sloksnes maisiņā, stingri tonoslēdziet un uzglabājiet 2-8°C temperatūrā.

4.2. Fermentu iezīmētājs (50x konjugāts)Flakons satur 0,4 mL anti-HD Fab fragmentus (cilvēka un peles monoklonā los), kaskonjugē t i ar mārrutku peroksidāzi (HRP), TRIS buferi , l iel lopu seruma album īnu,stabilizatorus un konservantus.Pirms lietošanas atšķaidiet šķīdumu attiecībā 1:50 ar iezīmētāja atšķaidītāju (4.6) (piem.,100 μL iezīmētāja + 4,9 mL iezīmētāja atšķaidītāja). Sagatavojiet tikai tik daudz fermentuiezīmētāja darba šķīduma, cik nepieciešams cikla veikšanai un uzglabājiet koncentrētofermentu iezīmētāju 2-8°C temperatūrā.Fermentu iezīmētāja darba šķīdumu pēc sagatavošanas var uzglabāt vienu nedēļu 2-8°Ctemperatūrā.

4.3. Negatīvā kontroleFlakons satur 3,3 mL cilvēka seruma/plazmas, kas nereaģē uz anti-HD antivielām; tāatšķaidīta ar PBS buferi, liellopu seruma albumīnu, stabilizatoriem, konservantiem uninerto zilo krāsvielu. Reaģents ir gatavs lietošanai, un tas jāuzglabā 2-8°C temperatūrā.

4.4. Pozitīvā kontroleFlakons satur 3,3 mL cilvēka himērisko anti-HD IgM; tas atšķaidīts ar PBS buferi, liellopuseruma albumīnu, stabilizatoriem, konservantiem un inerto zilo krāsvielu. Reaģents irgatavs lietošanai, un tas jāuzglabā 2-8°C temperatūrā.

137

4.5. rHDAg Flakons satur 15 mL rekombinantā hepatīta D antigēna, liellopu embriju serumu, fosfāta-citrāta buferi un konservantus. Reaģents ir gatavs lietošanai, un tas jāuzglabā 2-8°Ctemperatūrā.

4.6. Iezīmētāja atšķaidītājsF lakons sa tu r 14 ,7 mL c i l vēka seruma/p lazmas , PSB bu fe r i , te ļu serumu unkonservantus. Reaģents ir gatavs l ietošanai, un tas jāuzglabā 2-8°C temperatūrā.Šķīdumu izmanto fermentu iezīmētāja atšķaidīšanai (4.2).

4.7. Parauga atšķaidītājsKatra pudele satur 70 mL PBS bufera, nespecifisku cilvēka IgG, nespecifisku IgG (pelesmonoklonā lo), l iellopu seruma albumīnu, stabilizatorus, konservantus un inerto zilokrāsvielu. Reaģents ir gatavs lietošanai, un tas jāuzglabā 2-8°C temperatūrā. Šķīdumuizmanto parauga atšķaidīšanai pirms analīzes.

b) REAĢENTI, KAS PARASTI TIEK IEKĻAUTI CITOS ETI KOMPLEKTOS

4.8. Mazgāšanas buferis (25x)Flakons satur 40 mL PBS bufera, Tween® 20 un konservantus.Pirms lietošanas atšķaidiet flakona saturu ar vienu litru destilēta ūdens. Sagatavotaismazgāšanas buferis ir stabils vienu nedēļu 2-8°C temperatūrā, un to izmanto iedobjuskalošanai.Ja 2-8°C temperatūrā parādās kristalizācija, uzsildiet mazgāšanas buferi līdz 37°C unpirms atšķaidīšanas labi samaisiet.

4.9. HromogēnsFlakons satur 9 mL tetrametilbenzidīna atvasinājuma citrāta buferī.Pirms lietošanas samaisiet šķīdumu attiecībā 1:1 ar substrātu (4.10).

4.10. SubstrātsFlakons satur 9 mL ūdeņraža pārskābi un citrāta buferi.Pirms lietošanas samaisiet šķīdumu attiecībā 1:1 ar hromogēnu (4.9) (piem., 1 mLhromogēna + 1 mL substrāta). Sagatavojiet tikai tik daudz hromogēna/substrāta, ciknepieciešams cikla veikšanai un uzglabājiet reaģentus 2-8°C temperatūrā.Pēc atšķaidīšanas hromogēna/substrāta darba šķīdumu var uzglabāt 8 stundas istabastemperatūrā, sargā jot no gaismas. Darba šķīdumam jābūt bezkrāsainam vai viegliiezilganam.

4.11. Apturēšanas šķīdumsFlakons satur 30 mL 1 N sērskābes šķīduma (R 36/38, S 26). Reaģents ir gatavslietošanai, un tas jāuzglabā 2-8°C temperatūrā.

5. PARAUGA PAŅEMŠANA UN SAGATAVOŠANAVar izmantot cilvēka serumu vai plazmu. Ir pārbaudīti šādi antikoagulanti: citrāts, EDTAun heparīns, un tos var izmantot šai analīzei. Asinis jāpaņem aseptiski, izmantojot vēnaspunkciju, tām jāļauj sarecēt, un pēc iespējas ātrāk serums jāatdala no recekļa. Paraugus,kuros redzamas daļiņas, kas ir duļķaini, lipēmiski vai satur eritrocītu atliekas, pirmstestēšanas var būt nepieciešams dzidrināt, izmantojot filtrēšanu vai centrifugēšanu. Stiprihemolizētus vai lipēmiskus paraugus, kā arī paraugus, kas satur daļiņas, vai arī tos,kuriem ir acīmredzama mikrobu kontaminācija, nedrīkst testēt. Ja analīzi veic 48 stundulaikā pēc parauga paņemšanas brīža, paraugus jāuzglabā 2-8°C temperatūrā; pretējāgadījumā tie ir jāsadala un jāuzglabā, sasaldējot zemā temperatūrā (–20°C vai zemākā).

138

Ja paraugus uzglabā sasaldētā veidā, pirms testēšanas atkausētie paraugi labi jāsajauc.Izvairieties no atkārtotas paraugu sasaldēšanas-atkausēšanas.Nedrīkst testēt paraugus, kas inaktivēti augstā temperatūrā.

Parauga atšķaidīšanaVisi paraugi pirms analīzes veikšanas jāatšķaida ar parauga atšķaidītāju (4.7) attiecībā1:100. Iepildiet polistirēna stobriņos 10 μL parauga un 1 mL parauga atšķaidītāja, un,izmantojot Vortex maisītāju, rūpīgi samaisiet.Negatīvo un pozitīvo kontroli nedrīkst atšķaidīt.

6. ANALĪZES PROCEDŪRAPirms analīzes veikšanas novietojiet visus reaģentus istabas temperatūrā (20-25°C). Veiciet visus analīzes soļus norādītajā secībā, un starp soļiem neieturiet pārāk lielaspauzes.Izvē lieties pietiekamu slokšņu skaitu, lai katrā paraugu ciklā singlikātā analizētu 3.negat īvās kontroles kopijas un 2 . pozit īvās kontroles kopijas. Negat īvajām unpozitīvajām kontrolēm jābūt iekļautām katras pacientu paraugu plates analīzē. Kontrolēmun paraugiem jāveic viens un tas pats process, un to inkubācijas laikam jābūt vienādam.Sagatavojiet vienu iedobi, kas nesatur substrātu, bet satur tikai hromogēnu/substrātu.Katras kontroles un parauga iedalīšanai jāizmanto tīrs, vienreizējās lietošanas uzgalis.Izmantojot datu lapu, identi f icē j iet iedobes, kas paredzē tas kontro ļu un paraugutestēšanai. Iepildiet kontroles un paraugus, kā attēlots šajā plānā.

Noregulējiet termostatiski kontrolētajā mitruma nodalījumā temperatūru 37° ± 1°C.1. Attiecīgajās iedobēs iepildiet 100 μL negatīvās kontroles un pozitīvās kontroles.

Attiecīgajās iedobēs iepildiet 100 μL paraugus, kas atšķaidīti attiecībā 1:100. 2. Uzlieciet kartona noslēgu, lai aizkavētu izgarošanu. Viegli uzsitiet pa reakciju

iedobēm, lai atbrīvotos no gaisa burbuļiem šķidrumā.3. Inkubējiet vienu stundu ± 5 minūtes 37° ± 1°C temperatūrā.

Atšifrējums: = iedobe NC = negatīvā kontroleBLK = tukšs/nulle PC = pozitīvā kontroleS = paraugi.

BLK

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

A

B

C

D

E

F

G

H

PC

S2

NC

N C

N C

PC

S1

S3

S 4

OO

139

4. Kad inkubācija pabeigta, noņemiet un izmetiet kartona noslēgu. Aspirējiet šķidrumuun piecas reizes izskalojiet katru iedobi ar mazgāšanas buferi, kura tilpums irdiapazonā no 0,30 līdz 0,37 mL. Uzmanieties, lai šķidrums nepārplūst pāri reakcijuiedobēm. Neskatoties uz to, vai tiek izmantots automātiskais vai pusautomātiskaismazgātājs, starp mazgāšanas cikliem jābūt 30 sekunžu ilgam mērcēšanas laikam.Pēc skalošanas apgrieziet sloksnes ar iedobēm uz leju uz susināmā papīra un vieglipasitiet pa tām, lai atbrīvotos no šķ idruma atliekām. Atstā jiet sloksnes apgrieztāveidā uz susināmā papīra, kamēr tiek pipetēts nākamais reaģents, lai izvairītos noizgarošanas.

5. Visās iedobēs, izņemot tukšo/nulles iedobi, iepildiet 100 μL HDAg šķīduma.Atkārtojiet 2. soli.

6. Inkubējiet vienu stundu ± 5 minūtes 37° ± 1°C temperatūrā.7. Otrās inkubācijas beigās sagatavojiet fermentu iezīmētāja darba šķīdumu (4.2 un

4.6).8. Atkārtojiet 4. soli.9. Visās iedobēs, izņemot tukšo/nulles iedobi, iepildiet 100 μL fermentu iezīmētāja

darba šķīdumu. Atkārtojiet 2. soli.10. Inkubējiet vienu stundu ± 5 minūtes 37° ± 1°C temperatūrā.11. Trešās inkubācijas beigās sagatavojiet hromogēna/substrāta darba šķīdumu (4.9 un

4.10).12. Atkārtojiet 4. soli.13. Visās iedobēs iepildiet 100 μL hromogēna/substrāta.14. Inkubējiet 30 ± 2 minūtes istabas temperatūrā, sargājot no tiešas vai spilgtas

gaismas.15. Tādā pašā secībā un ātrumā kā iepildījāt hromogēnu/substrātu visās iedobēs

iepildiet 100 μL apturēšanas šķīdumu.16. Vienas stundas laikā pēc apturēšanas šķīduma pievienošanas, izmantojot

fotometru, nosakiet paraugu absorbciju pie 450/630 nm. Tomēr paraugiem, kuriemir ļoti augsta analizējamās vielas koncentrācija, rezultātus ieteicams nolasīt neilgipēc apturēšanas šķīduma pievienošanas, jo iespējama precipitātu veidošanās, kassamazina sākotnējās absorbcijas vērtības. Šis fenomens tomēr neizraisa nepareizuparaugu klasifikāciju. Ja tiek izmantots specializēts aprīkojums, absorbcijas vērtības tiek aprēķ inātasautomātiski pēc vajadzīgā protokola izvēles. Ja tiek izmantots cits fotometrs, kasveic vertikālus lasījumus, atiestatiet instrumentu uz tukšās/nulles iedobes vērtību,pierakstiet katra parauga absorbciju pie 450/630 nm un no 450 nm absorbcijasvērtības atņemiet 630 nm absorbcijas vērtību.

Automātiskai testa apstrādei var izmantot ETI-LAB vai ETI-MAX 3000 aprīkojumu.

7. REZULTĀTU APRĒĶINĀŠANA

7.1. Robežvērtības aprēķināšanaRobežvērtību aprēķina, pieskaitot 0,100 negatīvās kontroles vidējai absorbcijas vērtībai(NC ).Robežvērtība = NC + 0,100.

xx

140

7.2. Cikla validācijas kritērijiNovērtējot rezultātus, kvalitātes kontroles validācijai jāizmanto turpmāk minētie kritēriji.Vienmēr aprēķiniet un novērtējiet vidējās kontroļu vērtības katrai platei, arī tad, ja vienupartiju veido vairākas plates.Absorbcijas vērtībai tukšajai/nulles iedobei jābūt diapazonā no 0,000 līdz 0,150:0,000 ≤ BLK ≤ 0,150.Starpībai starp pozitīvās kontroles vidējo absorbcijas vērtību un negatīvās kontrolesvidējo absorbcijas vērtību jābūt 0,300 vai lielākai.PC – NC ≥ 0,300.Ja netiek iegūts šāds rezultāts, iespē jams, nav izmantota pareiza tehnika, un ciklsjāatkārto.

7.3. Rezultātu interpretācijaTo, vai paraugā atrodas vai neatrodas anti-HD IgM, nosaka, salīdzinot nezināmo parauguabsorbcijas vērtības ar robežvērtības absorbcijas vērtību.Nezināmie paraugi, kuru absorbcijas vērtības ir lielākas vai vienādas ar robežvērtību,jāuzskata par reaktīviem attiecībā uz anti-HD IgM. Nezināmie paraugi, kuru absorbcijasvērtības ir mazākas nekā robežvērtība, jāuzskata par nereaktīviem.Paraugiem, kuru absorbcijas vērtības ir robežvērtības līmenī ± 10%, tests jāatkārto, laiapstiprinātu sākotnējo rezultātu. Paraugi, kuri, atkārtojot testu, ir reaktīvi, jāuzskata parpozitīviem. Paraugi, kuri, veicot otro testu, ir nereaktīvi, jāuzskata par negatīviem.

7.4. Aprēķina piemērsDotie dati ir tikai piemērs un tos nevajadzētu izmantot lietotāja iegūto datu vietā.

Negatīvās kontroles absorbcijas vērtības

Vidējā absorbcijas vērtība, NC = 0,032.

Pozitīvās kontroles absorbcijas vērtības

Vidējā absorbcijas vērtība, PC = 1,070.

Robežvērtība (NC + 0,100) = 0,032 + 0,100 = 0,132.

Starpība starp pozitīvo un negatīvo kontroli (P – N) = 1,070 – 0,032 = 1,038.Dotajā piemērā P – N starpība atbilst cikla validācijas kritērijiem, jo tā ir lielāka nekā0,300; tādējādi izmantotā tehnika ir pieņemama un dati jāuzskata par derīgiem.

Nezināmo paraugu skrīningsParaugs nr. 1 = absorbcijas vērtība 0,834Paraugs nr. 2 = absorbcijas vērtība 0,061.Paraugs nr. 1 jāuzskata par reaktīvu attiecībā uz anti-HD IgM un paraugs nr. 2 – parnereaktīvu, jo robežvērtība ir 0,132.

Negatīvās kontroles parauga nr. Tīrā absorbcija pie 450/630 nm

1 0,038 2 0,0273 0,032

Pozitīvās kontroles parauga nr. Tīrā absorbcija pie 450/630 nm

1 1,0922 1,048

x x

x

x

x

141

8. SPECIFISKS VEIKTSPĒJAS RAKSTUROJUMS

8.1. Analītiskais specifiskumsAnal ī t isko speci f iskumu var def inē t kā anal īzes spē ju prec īzi noteikt speci f iskoanalizē jamo vielu, ja parauga matricā atrodas potenciā l i traucē joši faktori (piem.,antikoagulanti, hemol īze, parauga apstrādes ietekme) vai arī antivielas, ar kurāmiespējamas krusteniskās reakcijas.Kontrolētos pētījumos par traucējošām vielām vai stāvokļiem tika noteikts, ka analīzesveiktspēju neietekmē antikoagulanti (EDTA, heparīns, citrāts), lipēmija (triglicerīdi līdz3000 mg/dL), bilirubinēmija (bilirubīns līdz 100 mg/dL) vai antivielas pret citiem infekcijuizraisītājiem. Absorbcijas vērtības paraugiem ar hemoglobīna koncentrāciju 1000 mg/dLbija par aptuveni 18% augstākas nekā vērtības, kas noteiktas neizmainītiem paraugiem.

8.2. PrecizitāteLai noteiktu analīzes atkārtojamību un reproducē jamību (t.i., variabilitāti vienas vaivairāku analīžu ietvaros), tika analizētas dažādas paraugu grupas (A-C grupas) ardažādām specifiskās analizējamās vielas koncentrācijām. Tabulās attēlotā variabilitāteneizraisīja paraugu nepareizu novērtēšanu.

8.3. Diagnostiskais specifiskumsDiagnostiskais specifiskums ir negatīvas analīzes varbūtība, iztrūkstot specifiskajaianalizējamai vielai.Diagnostiskais specif iskums t ika noteikts, testē jot 603 paraugus, kas at las ī t i nopopulācijas ar paredzamu negatīvu anti-HD IgM rezultātu (asins donori; dialīzes pacienti;pacienti, kuri slimo ar dažādām infekcijas slimībām ar līdzīgiem simptomiem, piemēram,akūtu vai hronisku HBV infekciju un HDV infekciju anamnēzē; pacienti, kuri slimo ardažādām akūtām infekciju slimībām; pacienti ar autoimūnām slimībām; subjekti, kuriem irpozitīvs reimatoīdā faktora, heterofīlo antivielu vai anti-HRP antivielu testa rezultāts).Pētītajā populācijā tika iegūti seši pozitīvi rezultāti - diagnostiskais specifiskums: 99,00%(95% ticamības intervāls: 97,85-99,64%).

8.4. Diagnostiskā jutībaDiagnostiskā jutība ir pozitīvas analīzes varbūtība specifiskās analizē jamās vielasklātbūtnē. Diagnostiskā jutība tika noteikta, testējot 210 paraugus no populācijas ar paredzamupozitīvu anti-HD IgM rezultātu (asimptomātiski HBsAg nēsātāji un pacienti ar akūtu vaihronisku HBV un HDV infekciju). Pētītajā populācijā tika iegūts viens negatīvs rezultāts -diagnostiskā jutība: 99,52% (95% ticamības intervāls: 97,38-99,99%).

Atkārtojamība A grupa B grupa C grupa

Noteikšanu skaits 22 22 22Vidējā absorbcijas vērtība 0,139 0,440 1,076Standarta novirze 0,012 0,020 0,058Variācijas koeficients, % 8,3 4,5 5,4

Reproducējamība A grupa B grupa C grupa

Noteikšanu skaits 66 66 66Vidējā absorbcijas vērtība 0,151 0,421 1,023Standarta novirze 0,021 0,040 0,076Variācijas koeficients, % 13,7 9,5 7,4

142

8.5. Piesātinājuma efekts augstas koncentrācijas gadījumāJa paraugos ir ļoti augsta antivielu koncentrācija, piesātinā juma efekta dēļ noteiktākoncentrācija var būt zemāka nekā patiesā. Tomēr, izmantojot optimizēto divu so ļusviestmaizes metodi, tiek izslēgtas būtiskas rezultātu k ļūdas, jo analītiskais signā lssaglabājas nemainīgi augsts (piesātinājuma līkne).Prozonas efekta (prozone effect) iespējamība tika analizēta, testējot četrus paraugus araugstu anti-HD IgM koncentrāciju. Visiem paraugiem tika iegūtas ļoti augstas absorbcijasvērtības, kādas varētu būt serumam ar augstu koncentrāciju, l iecinot, ka nepastāvprozonas efekts un tādējādi – paraugu nepareiza novērtēšana.

9. PROCEDŪRAS IEROBEŽOJUMIParaugu bakter iā la kontamināci ja, atkār tot i sasaldēšanas-atkausēšanas cik l i vaiinaktivācija karstuma ietekmē var ietekmēt absorbcijas vērības un tādējādi arī anti-HDIgM koncentrācijas.Infekci jas sl im ības diagnozi nedr īkst uzstād ī t , t ika i pamatojot ies uz viena testarezultāt iem. Lai uzstādītu precīzu diagnozi, jāņem vērā pacienta slimības vēsture,simptomi, kā arī seroloģiskie dati.

10. BRĪDINĀJUMI UN PIESARDZĪBAS PASĀKUMILai iegūtu precīzus rezultātus, jālieto pareiza tehnika un stingri jāievēro instrukcijas.Īpaši svarīga ir precīza pipetēšana, aspirācija un mazgāšana.Rezu l tā tu a tkā r to jam ība reak t īv iem paraug iem var ne t ik t nodroš inā ta dažādumetodoloģisko faktoru dēļ, piemēram:– flakonu vāciņu savstarpēja samainīšana– viena un tā paša uzgaļa lietošana, atvelkot šķidrumus no dažādiem flakoniem vai

iepildot dažādus paraugus– reaģentu vai paraugu pakļaušana lielam karstumam vai spēcīgai bakteriālai

kontaminācijai– nepareiza iedobju skalošana– iedobju balstgredzenu kontaminācija ar iezīmētāju vai paraugiem– dažādu sēriju reaģentu lietošana.Turklāt nepieciešams ievērot šādus piesardzības pasākumus:– lai nepieļautu kontamināciju, izmantojiet tīru, šai darbībai paredzētu fermentu

iezīmētāja šķīduma iepildītāju– mazgāšanas buferis jāuzglabā tīros konteineros, lai nepieļautu kontamināciju ar

fermentus inaktivējošām vielām– hromogēna/substrāta sagatavošanai ļoti būtiski ir izmantot tīrus laboratorijas traukus.

143

11. DROŠĪBAS PIESARDZĪBAS PASĀKUMI– Ar hromogēnu, substrātu un apturēšanas šķīdumu rīkojieties piesardzīgi. Nepieļaujiet

hromogēna, substrāta un apturēšanas šķīduma saskari ar oksidējošiem līdzekļiem vaimetāla virsmām.

– Neēdiet, nesmēķējiet un nelietojiet kosmētiku laboratorijā, kurā tiek veiktas analīzes.– Nepipetējiet šķīdumus ar muti.– Izvairieties no tieša kontakta ar visiem potenciāli infekcioziem materiāliem, lietojot

aizsargājošu apģērbu, piemēram, laboratorijas halātus, aizsargbrilles un vienreizējoscimdus. Rūpīgi mazgājiet rokas pēc katras analīzes.

– Izvairieties no šķidrumu izliešanas vai aerosolu veidošanās. Visi izlietie reaģentijānomazgā ar 5% nātrija hipohlorīta šķīdumu un jāiznīcina kā potenciāli infekciozi.

– Visus paraugus, bioloģiskos reaģentus un materiālus, kas tiek lietoti analīzei,jāuzskata par tādiem, kas potenciāli var pārnest infekciju izraisītājus. Līdz ar to, tiejāiznīcina saskaņā ar laboratoriju regulējošo institūciju noteikumiem un vadlīnijām, kāar ī a tb i ls toš i a t t iec īgās va ls ts l ikumdošanai . V ienre iz l ie to jamie mater iā l i i rjāsadedzina; šķidriem atkritumiem vismaz pusstundu jāveic dekontaminācija ar nātrijahipohlorīta šķīdumu, kura galīgā koncentrācija ir 5%. Skābi saturošie šķidrie atkritumipirms apstrādes jāneitralizē. Jebkurš materiāls, kas paredzēts atkārtotai lietošanai, irjāautoklavē, izmantojot dubultiznīcināšanas (overkill) pieeju (USP 24, 2000, 2143.lpp.). Tiek uzskatīts, ka parasti pietiekama ir vismaz viena stunda 121°C temperatūrā,tomēr lietotājiem jāpārbauda izmantotā dekontaminācijas cikla efektivitāte, sākotnējiveicot tā validāciju un regulāri izmantojot bioloģiskos indikatorus.

– Apturēšanas šķīdums (Padomes Direktīva 99/45/EK):R 36/38 − Kairina acis un ādu.S 26 − Ja nokļūst acīs, nekavējoties tās skalot ar lielu daudzumu ūdens un

meklēt medicīnisku palīdzību.

144

ANALĪZES PLĀNS

1 - IZMANTOJOT PARAUGA ATŠĶAIDĪTĀJU, ATŠĶAIDIET PARAUGUS ATTIECĪBĀ 1:100.

2 - IEPILDIET REAĢENTUS IEDOBJU SLOKSNĒS ATBILSTOŠI ŠĀDAI SHĒMAI,ATSTĀJOT TUKŠU NULLES IEDOBI:

3 - INKUBĒJIET VIENU STUNDU 37°C TEMPERATŪRĀ.

4 - ASPIRĒJIET ŠĶIDRUMU. ATKĀRTOTI MAZGĀJIET AR MAZGĀŠANAS BUFERI.

5 - VISĀS IEDOBĒS IEPILDIET 100 μL HDAg, IZŅEMOT TUKŠAJĀ/NULLES IEDOBĒ.

6 - INKUBĒJIET VIENU STUNDU 37°C TEMPERATŪRĀ.

7 - ASPIRĒJIET ŠĶIDRUMU. ATKĀRTOTI MAZGĀJIET AR MAZGĀŠANAS BUFERI.

8 - VISĀS IEDOBĒS IEPILDIET 100 μL FERMENTU IEZĪMĒTĀJA DARBA ŠĶĪDUMU,IZŅEMOT TUKŠAJĀ/NULLES IEDOBĒ.

9 - INKUBĒJIET VIENU STUNDU 37°C TEMPERATŪRĀ.

10 - ASPIRĒJIET ŠĶIDRUMU. ATKĀRTOTI MAZGĀJIET AR MAZGĀŠANAS BUFERI.

11 - VISĀS IEDOBĒS IEPILDIET 100 μL HROMOGĒNA/SUBSTRĀTA.

12 - INKUBĒJIET 30 MINŪTES ISTABAS TEMPERATŪRĀ, TUMSĀ.

13 - VISĀS IEDOBĒS IEPILDIET 100 μL APTURĒŠANAS ŠĶĪDUMA.

14 - IZMANTOJOT FOTOMETRU, NOLASIET ABSORBCIJAS VĒRTĪBAS PIE 450/630 nm.

IEDOBES

REAĢENTI

NEGATĪVĀ KONTROLE

(3x)

POZITĪVĀ KONTROLE

(2x)

PARAUGI(1x)

NEGATĪVĀ KONTROLE 100 μL – –POZITĪVĀ KONTROLE – 100 μL –ATŠĶAIDĪTIE PARAUGI – – 100 μL

ETI-DELTA-IGMK-2 / JULY 2006 200/007-630Rev. G

DiaSorin S.p.A. 13040 SALUGGIA (VERCELLI) - ITALYTel. 39.0161.487093 - Fax 39.0161.487628