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7/22/2019 Extrao e Caracterizao Espetroscpica Da Mioglobina Da Carne
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Extrao e CaracterizaoEspetroscpica da
Mioglobina da CarneBioqumica Experimental II
FacL
Alexa
OlenaPatrcPatrc
Doc
7/22/2019 Extrao e Caracterizao Espetroscpica Da Mioglobina Da Carne
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Mioglobina
Objetivos Gerais
Extrao e identificao das formas reduzida e oxidada da Mioglobinaduas propriedades espetrais.
Estudo das reaes redox de interconverso das espcies.
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Mioglobina
Protena monomrica Massa molecular: 16,949Da
Armazenamento e transporte de oxignio
Possui um grupo heme
Msculos cardaco e esqueltico
Figura 1 Diversas representaes
estrutura da Mioglobina.
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Figura 2 RMioglobina.
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Transporte de Oxignio
Oxignio poucosolvel em soluesaquosas
Difuso do oxigniopelos tecidos ineficiente
Nenhuma das calaterais das prote
adequada paraligao reversve
oxignio.
Metal deTransio
FerroCobre
Tm de possuir elevadatendncia para ligaoao oxignio
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Ferro nas protenas
Ferro Livre Espcies altamentereativas de oxignio
Danos no DNAe noutras molculas
Ligao a estruturasque sequestram e/ou otornam menos reativo.
Grupo Heme Composto associado de modopermanente a uma protena e
que contribui para a funodessa protena.
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Grupo Heme
Complexa estrutura orgnica em anel: porfirina IX qual estnico tomestado ferr
Carctereletres pe
a impedir aferro do hferroso) pa
Estado ferroso: liga forma reversvel.
Estado frrico: no Figura 3 Grupo Heme.
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Met-Mb e Oxy-Mb
Met-Mb Oxy-Mboxidao
reduo
[FeIII-H2O-Mb][F
Figura 5 Representao da forma Met-Mb. Figura 6 Represe
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Procedimento
Esquema 1 Procedi
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Met-Mb e Oxy-Mb
Soluo AA 5mL do sobrenadante juntou-se 0,0549g de ferricianeto de p
conduzindo produo de Met-Mb:
Fe2+-O2-Mb + K6[FeCN6] Fe3+-H2O-Mb (Equa
Soluo BA 5mL do sobrenadante juntou-se 0,1135 g de ditionito d
conduzindo produo de Oxy-Mb:
Fe3+-H2O-Mb + Na2S2O4 Fe2+-O2-Mb (Equa
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Anlise dos Espetros
Sobrenadante Soluo A Soluo B
Anlise dos Espetros
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Espetros de Absoro no UV-Visvel
Amostra Regio Visvel Regio de
Met-Mb 635nm 504nm 409nm
Oxy-Mb 580nm 542nm 417nm
348nm
Quadro 1 Picos de absoro das formas da mioglobina na regio do visvel e na regio de Soret.
= 179 .
= 128 .
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Espetros de Absoro no UV-Visvel - Sobrenadante
Figura 7 Espectro de Absoro (UV-Vis) obtido para oSobrenadante. Foram lidas as absorvncias noscomprimentos de onda 635nm, 580nm, 542nm, 505nm,409nm e 417nm.
Figura 8 Espectro de Absoro (UV-Vis) dArtigo Microburger Biochemistry: ExtCharacterization of Myoglobin from HamburgLaura A. Andersson*Department of Biochemistr
State University, Manhattan, KS 66506
.
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Espetros de Absoro no UV-Visvel Soluo A
Figura 9 Espectro de Absoro (UV-Vis) obtido para asoluo A (Met-Mb). Foram lidas absorvncias noscomprimentos de onda 635nm, 580nm, 542nm, 505nm,409nm e 417nm.
Figura 10 Espectro de Absoro (UV-Vis)Mb). Fonte: Artigo Microburger Biochemistry: ECharacterization of Myoglobin from HamburgeLaura A. Andersson*Department of Biochemistry,
State University, Manhattan, KS 66506.
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Figura 11 Espectro de Absoro (UV-Vis) obtido para asoluo B (Oxy-Mb). Foram lidas absorvncias noscomprimentos de onda 635nm, 580nm, 542nm, 505nm,409nm e 417nm.
Figura 12 Espectro de Absoro (UV-Vis)Mb). Fonte: Artigo Microburger Biochemistry: ECharacterization of Myoglobin from HamburgeLaura A. Andersson*Department of Biochemistry,
State University, Manhattan, KS 66506.
Espetros de Absoro no UV-Visvel Soluo B
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Registo das Absorvncias
Amostra C.d.O.(nm)
Abs
Sobrenadante
1/3
635 0,172
542 0,523
505 0,395
580 0,488
409 3,152
417 3,222
Amostra C.d.O.
(nm)
Abs
Soluo A
1/5
635 -0,005
542 0,009
505 0,028
580 -0,002
409 0,801
417 0,533
Amostra C.d.O
(nm
Soluo B
1/5
635
542
505
580
409
417
Quadro 2 Registo das absorvnciasmedidas para o sobrenadante nosrespetivos comprimentos de onda aps
leitura dos espetros.
Quadro 3 Registo das absorvnciasmedidas para a soluo A nos respetivoscomprimentos de onda aps leitura dos
espetros.
Quadro 4 Registo dmedidas para a soluocomprimentos de onda
espetros.
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Determinao da massa de protena nas solues A e BLei de Lambert-Beer
Lei de Lambert-Beer: Abs=lc
Soluo A
Abs
Absorvncia (a 409nm registou - Coeficiente de absoro molar (=c Concentrao de Met-Mbl percurso tico (l=1 cm)
=
=
=0,801
179 1
= 4,47 10
= 5
= 4,47 10 5
= 2,235 10 = 2,235
Como a soluo A sofreu uma diluio de 1que a concentrao de Met-Mb :
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Determinao da massa de protena nas solues A e BLei de Lambert-Beer
A massa molecular da mioglobina 16949 g/mol, como a Met-Msua constituio gua tem-se que a massa molar da Met-Mb co
16949+2x1+15,999=16966,99gmol -1:
=
= 16966,99/ 2,235 10/ = 0,3792
= 0,3792 /
Como o volume de amostra recolhido na SEC foi de 1,2mL obtm-se a mMb:
= 0,3792
1,2 = 0,4550
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Determinao da massa de protena nas solues A e BLei de Lambert-Beer
Para a soluo B, correspondente Oxy-Mb foram aplicadoclculos.
Soluo A Met-Mb) Soluo B OComprimento de onda utilizado (nm) 409 417
Absorvncia 0,801 0,49
(mM-1.cm-1) 179 128
[protena] M 2,235 10 1,949
Massa molar (g/mol) 16966,99 16964
Volume recolhido (mL) 1,2 2,8
Massa (mg) 0,4550 0,925
Quadro 5 Comparao de diversos parmetros para determinao da massa de protena entre as solu
7/22/2019 Extrao e Caracterizao Espetroscpica Da Mioglobina Da Carne
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Doseamento proteico
Mtodo de Lowry
Mtodo do Biureto
Mtodo de Bradford
Sobrenadante
Soluo A
Soluo B
7/22/2019 Extrao e Caracterizao Espetroscpica Da Mioglobina Da Carne
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Mtodo de Lowry
Tcnica com o objetivo de determinar a concentrao proteica numa d
soluo recorrendo ao reagente Folin Ciocalteau.
Soluo proteica Reagente de FolinCiocalteau
Complexo de cor Azul
Condies alcalinas
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Mtodo do Biureto
Amostra de protenacontendo duas ou mais
ligaes peptdicas.
Reagente de Biureto(Sulfato de Cobre Alcalino)
Complexo prpura
Leitura das Absorvncias a 280nm. Construo de uma reta de calibrao.
Os extratos celulares cmuitos outros composque absorvem a 280nm
.
= 1.55
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Mtodo de Bradford
Resduos de aminocidoscom cadeias lateraisbsicas/aromticas
Corante Coomassie BlueG-250
Colorao Azul
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Mtodo Biureto Lowry B
Exactido Alta Mdia Mais a
Especificidade
Para compostos com
2 ou mais ligaes
peptdicas
Reage com resduos de
tirosina e triptofano.
Suscetvel a agentes
interferentes
Reage c
amin
cade
bsica
Rapidez da Execuo Lenta Mdia
Preciso Preciso Preciso
Quadro Resumo dos Mtodos
Quadro 6 Comparao dos trs mtodos de doseamento proteico.
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Preparao da Curva de Calibrao
Soluo(mL)
Tubos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10BSA(0,35
mg/mL)
0 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0 0 0
Amostra 0 0 0 0 0 0 0 0,10 0,20 0,30
gua 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,40 0,30 0,20
Reagente C 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
MISTRURAR TODOS OS TUBOS E AGUARDAR 10 MINUTOS.
Reagente D 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
DEIXAR REPOUSAR TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 30 MINU
Volume final 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25
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Preparao da Curva de Calibrao
Tubos AbsorvnciaRegistada
1 0,000
2 0,093
3 0,182
4 0,278
5 0,324
6 0,400
7 0,520
Determinao da concentrao dprotena padro em cada tubo:
[] =[] ()
[] =0,35 0,05
3,25 = 0,0054
Quadro 8 Registo das absorvncias relativasaos tubos para construo da reta de calibrao.
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Curva de Calibrao
Tubos Absorvncia [protena]
(mg/mL)
1 0,000 0,0000
2 0,093 0,0054
3 0,182 0,0108
4 0,278 0,0162
5 0,324 0,0215
6 0,400 0,0269
7 0,520 0,03230
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,0000 0,0050 0,0100 0,0150 0,0200 0,
A
bs(750nm)
[protena]/tubo (mg/m
Curva de Calibrao - Mtodo
Quadro 9 Registo das absorvncias econcentraes proteicas determinadas relativasaos tubos para construo da reta de calibrao.
Grfico 1 Reta de Calibrao para o mtodo deLowry.
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Determinao da concentrao proteica
Sobrenadante
Tubos 8
9
10
11
y=mx+b y=Abs e x=[protena]
Abs=m[protena]+b
Com m=15,361 e b=0,0086
Exemplo Tubo 8:
= [] + [] =
[] =,,
, [] =0,031 m
Quadro 10
Rdos tubos com asobrenadante.
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Determinao da concentrao proteica Fatores de D
Inicialmente realizou-se uma diluio de 1:20 pa
espetrofotomtrica e para o doseamento proteico, ento c
determinada pelo mtodo de Lowry multiplica-se o fator de diluio qu
20:
(1) = []
[] = (1) 20 0,031 (1) = 0,6
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Determinao da concentrao proteica Fatores de D
Quando adicionada a amostra aos tubos de ensaio a analisar,
nova diluio devido presena do reagente C, do reagente D e da
necessrio determinar o fator de diluio:
=
=,
,= 0,030769
(2) = 0,6138
,= 19,95 /
Volume de amostra =Volume total do tubo
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Registo das concentraes proteicas - Sobrenadante
O mesmo procedimento foi aplicado a todos os restante
sobrenadante, da soluo A e da Soluo B.
Tubos Absorvncia 1 Fator diluio 2 Fator diluio [pr
8 0,480 1/20 0,0308
9 0,789 1/20 0,0615
10 1,025 1/20 0,0923
11 1,231 1/20 0,1231
Quadro 11 Registo das absorvncias, diluies e concentrao proteica final relativasao sobrenadante.
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Registo das concentraes proteicas Soluo A
Tubos Absorvncia 1 Fator de Diluio 2 Fator de Diluio [prote
8 0,566 1:5 0,0308 5,
9 0,940 1:5 0,0615 4,
10 0,186 1:5 0,0923 0,
11 1,425 1:5 0,1231 3,
Quadro 12 Registo das absorvncias, diluies e concentrao proteica final relativas soluo A.
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Tubos Absorvncia 1 Fator de Diluio 2 Fator de Diluio [prote
8 0,439 1:5 0,0308 4
9 0,657 1:5 0,0615 3
10 0,882 1:5 0,0923 3
11 1,075 1:5 0,1231 2
Registo das concentraes proteicas Soluo B
Quadro 13 Registo das absorvncias, diluies e concentrao proteica final relativas soluo B.
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[Protena]
mg mL-1
[Met-Mb]
mg mL-1
[Oxi-Mb]
mg mL-1
Mprotena
(mg)
(%) Gra
Purif
Sobrenadante 19,95 - - 19,95 100
Soluo A 5,897 0,3792 - 7,0764 35,47 0,
Soluo B 4,552 - 0,3306 12,7456 63,88 0,0
Quadro de purificao
=
100
o =
Quadro 14
Quadro de pu
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http://www.uniprot.org/uniprot/P02192 consultado a 21/03/2014 14h19 http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=1 consultado a 21/03/2014 14h34 http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/Biochem_353/Bradford.html consultad
15h20
Bibliografia
http://www.uniprot.org/uniprot/P02192http://www.uniprot.org/uniprot/P02192http://www.uniprot.org/uniprot/P02192http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=1http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=1http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=1http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/Biochem_353/Bradford.html%20consultado%20a%2022/03/2014http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/Biochem_353/Bradford.html%20consultado%20a%2022/03/2014http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/Biochem_353/Bradford.html%20consultado%20a%2022/03/2014http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/Biochem_353/Bradford.html%20consultado%20a%2022/03/2014http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=1http://www.uniprot.org/uniprot/P02192