Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2011 2012 · Bovendien zijn de stomata van de bladeren gesloten waardoor geen exogeen zuurstof wordt opgenomen. Knopvalgevoelige

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Academiejaar 2011 – 2012

Donkerstress bij orchideeën (Phalaenopsis sp.)

Jarinda Viaene Promotoren: Prof. dr. ir. Kathy Steppe en dr. ir. Veerle De Schepper

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Bos- en Natuurbeheer

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Academiejaar 2011 – 2012

Donkerstress bij orchideeën (Phalaenopsis sp.)

Jarinda Viaene Promotoren: Prof. dr. ir. Kathy Steppe en dr. ir. Veerle De Schepper

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Bos- en Natuurbeheer

De auteur en de promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te

stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de

beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting

uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.

The author and promotors give the permission to use this thesis for consultation and to copy

parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright law, more specifically

the source must be extensively specified when using results from this thesis.

Gent, 1 juni 2012

De promotor, De promotor, De auteur,

Prof. dr. ir. K. Steppe dr. ir. V. De Schepper Jarinda Viaene

i

WOORD VOORAF

Toen Prof. Steppe vorig jaar het onderwerp van deze masterthesis op het laatste moment in de

keuzelijst opnam, was ik zo gelukkig dat er toch nog een thesisonderwerp was waar ik

vlinders van in mijn buik kreeg. ‘Donkerstress bij orchideeën’, het leek mij een heel boeiend

onderzoek waarbij de praktische implicaties van groot belang waren. En dat was het ook. De

uitvoering van de experimenten verliep echter niet altijd van een leien dakje, vooral de

continue fotosynthese- en transpiratiemetingen met de bladcuvette en branchbags kostten mij

letterlijk bloed, zweet en tranen. Gelukkig kon ik steeds op de steun van vele mensen rekenen,

zonder hen had ik deze opdracht nooit kunnen volbrengen. Bij deze wil ik hen dan ook

bedanken.

Een eerste dankwoord gaat uit naar mijn promotor Prof. Kathy Steppe voor de vele hulp

tijdens mijn eerste proeven en het eindeloze enthousiasme. Ik ken werkelijk niemand die zo

motiverend is als jij Kathy, een bezoekje bij jou zorgde elke keer voor nieuwe energie.

Ik wil ook mijn tweede promotor, dr. ir. Veerle Deschepper met heel mijn hart bedanken.

Veerle, zonder jou had ik deze thesis nooit tot zo een goed einde kunnen brengen. Je hebt mij

vele wetenschappelijke inzichten bijgebracht en ik kon steeds bij je terecht met al mijn

vragen. Ook bedankt om mijn thesis zo grondig na te lezen.

Een speciaal woord van dank gaat uit naar Veerle Lamote van Microflor voor het leveren van

de orchideeën. Ook van harte bedankt om mijn literatuurstudie kritisch na te lezen.

Ik mag hier ook zeker onze ‘manusjes-van-alles’ Philip, Geert, Erik en Thomas niet vergeten.

Zonder hun technische hulp zou dit onderzoek nooit tot stand zijn gekomen. Ook de andere

medewerkers van het labo wil ik bedanken voor hun motivatie, goede raad en de lekkere

taartjes. Mijn mede-thesisstudenten ben ik zeer dankbaar voor de leuke en ontspannende

momenten in ons ‘thesiskot’.

Mijn broer verdient ook een speciaal dankwoordje om mij te helpen met de verwerking van de

figuren. Mijn ouders, grootouders en vrienden wil ik bedanken om er altijd voor mij te zijn

wanneer het nodig was. Hun luisterend oor, relativeringsvermogen en optimisme waren voor

mij van onschatbare waarde om door de moeilijke momenten te raken.

Last but not least, mijn allerliefste schat Jonas. Ik kan nooit verwoorden wat je voor mij

betekent en hoe dankbaar ik je ben voor alles wat je al voor mij hebt gedaan.

Jarinda Viaene,

juni 2012

iii

SAMENVATTING

De laatste decennia is de populariteit van Phalaenopsis orchideeën als kamperplanten sterk

toegenomen. Door het grote economische belang willen orchideeëntelers voortdurend het

productieproces optimaliseren. Tijdens dit productieproces wordt Phalaenopsis vaak

(intercontinentaal) getransporteerd waarbij de planten continu in het donker worden

gehouden. Deze transportomstandigheden veroorzaken bij bepaalde hybriden knopval na het

transport. De knopval brengt een daling in de kwaliteit en de commerciële waarde van de

orchideeën teweeg. Uit de literatuur blijkt dat ethyleen een sleutelrol speelt bij het afvallen

van de knoppen aangezien ethyleeninhibitoren de knopval verhinderen. De precieze oorzaak

is echter nog niet achterhaald. Vanwege de vele onduidelijkheden over de negatieve invloed

van donkertransport bij Phalaenopsis, wordt in deze masterthesis de link tussen knopval en

donkertransport bij Phalaenopsis onderzocht.

Tijdens het onderzoek werd het donkertransport gesimuleerd bij vier verschillende

Phalaenopsis hybriden. Ze werden aan een donkerperiode van vijf dagen blootgesteld, waarna

ze 14 dagen een dag/nachtregime (12u licht/12u donker) kregen dat zes à zeven uur

verschoven was ten opzichte van het oorspronkelijke regime. De knopval na de donkerperiode

werd opgevolgd om de knopvalgevoeligheid van de hybriden in te schatten. De fotosynthese-,

transpiratie- en chlorofyl fluorescentiemetingen op de bladeren en bloemstengels werden

gelinkt aan de geobserveerde knopval.

Uit de waargenomen knopval kwam naar voor dat alle hybriden knopvalgevoelig waren na

een donkerperiode van vijf dagen. Enkel knoppen kleiner dan 2,0 cm vielen af. Aangezien

geen uniforme methode beschikbaar is om de mate van knopvalgevoeligheid te bepalen,

werden enkele suggesties gegeven. De knopval wordt best procentueel ten opzichte van het

oorspronkelijk aantal knoppen uitgedrukt. Bovendien is het belangrijk dat de knopval

gemiddeld per hybride wordt bepaald. Ook moet een keuze gemaakt worden tussen enkel

grote knoppen (commercieel belangrijker) of alle knoppen in rekening brengen.

Een bijkomend aspect van dit onderzoek was het voorstellen van een screeningmethode om de

knopvalgevoeligheid van een hybride snel te kunnen inschatten. De maximale efficiëntie van

de fotochemische reacties van PS II in het licht-geadapteerde blad (Fv’/Fm

’) en de niet-

fotochemische quenching (NPQ) in het donker tijdens de herstelperiode bleken hiervoor

geschikte parameters. Een significant lagere Fv’/Fm

’ en een hogere NPQ wezen namelijk op

meer knopvalgevoeligere hybriden.

Door het linken van de fluorescentie-, fotosynthese- en transpiratiemetingen met de knopval

werd de oorzaak van de knopval beredeneerd. Een langdurige donkerperiode zorgt voor stress

ter hoogte van PS II in de bladeren waardoor de planten stresshormonen zoals ethyleen willen

produceren. 1-ACC, de precursor van ethyleen, kan echter niet worden omgezet in ethyleen

door zuurstoftekort. De lichtreacties, die voor zuurstof zorgen, gaan namelijk niet door.

Bovendien zijn de stomata van de bladeren gesloten waardoor geen exogeen zuurstof wordt

opgenomen. Knopvalgevoelige hybriden ondervinden meer stress aan PS II en produceren dus

meer 1-ACC. Via de transpiratie kan 1-ACC naar de bloemen en knoppen worden

getransporteerd. De bladeren van de knopvalgevoelige hybriden transpireren minder in de

iv

donkerperiode waardoor het transport van 1-ACC naar de bloemen en knoppen groter is.

Wanneer de orchideeën terug licht krijgen, kan 1-ACC in de knoppen worden omgezet naar

ethyleen, wat knopval induceert. Bij de gevoeligere hybriden zal de knopval dus groter zijn

aangezien de concentratie 1-ACC in de knoppen hoger is.

v

ABSTRACT

Over the last few decades, the popularity of Phalaenopsis as an indoor plant has been

strongly increasing. Because of the great economic importance, orchid growers want to

continuously optimize its production process. During this process Phalaenopsis is often

(intercontinentally) transported while the plants are constantly kept in the dark. Because of

these transport conditions, certain hybrids show bud drop after the transport. The abortion of

the buds makes the orchids less commercially valuable due to quality loss. The literature

shows that ethylene plays a key role in the abortion of the buds because ethylene inhibitors

prevent the bud drop. The exact cause however, is not yet clear. Because of the many

ambiguities about the negative impact of dark transportation of Phalaenopsis, the link

between bud drop and transportation of Phalaenopsis in the dark is investigated in this

masterthesis.

During the investigation the transportation in the dark was simulated with four different

Phalaenopsis hybrids. They were exposed to a dark period of five days. Afterwards they got a

day/night regime (12h light/12h dark) that was shifted six to seven hours relative to the

original regime during 14 days. The bud drop after the dark period was followed to estimate

the sensitivity to bud drop of the four hybrids. The photosynthesis, transpiration and

chlorofyll fluorescence measurements on the leaves and flower stalks were linked to the

observed bud drop.

The observed bud drop proved that all hybrids were sensitive to bud drop after a dark period

of five days. Only buds smaller than 2,0 cm fell off. Since there is no uniform method

available to determine the degree of bud drop sensitivity, a few recommendations were

proposed. The bud drop is best expressed as a percentage of the original amount of buds.

Moreover, it is important that the bud drop is determined as an average per hybrid. Also the

grower has to make a choice between only taking the great buds (commercially more

important) or all buds into account to determine bud drop sensitivity.

An additional aspect of this experiment was the proposal of a quick screening method to

verify the sensitivity of a hybrid to bud drop. The maximum quantum efficiency of PS II

photochemistry in the light adapted state (Fv’/Fm

’) and the non-photochemical quenching

(NPQ) in the dark during the recovery period seemed to be adequate parameters. A

significantly lower Fv’/Fm

’ and higher NPQ indicated more bud drop sensitive hybrids.

The cause of bud abortion could be deduced by linking the fluorescence, photosynthesis and

transpiration measurements with the bud drop. A prolonged dark period creates stress at the

level of PS II in the leaves causing the plants to produce stress hormones such as ethylene.

However, 1-ACC (the precursor of ethylene) can’t be converted in ethylene because the lack

of oxygen. The light-dependent reactions, which provide oxygen, can’t take place. In addition,

the stomata in the leaves are closed so no exogenous oxygen is taken in. Bud drop sensitive

hybrids encounter more stress at the level of PS II and thus produce more 1-ACC. Through

the transpiration 1-ACC can be transported to the flowers and buds. The leaves of the bud

drop sensitive hybrids transpirate less during the dark period resulting in a greater transport of

1-ACC to the flowers and buds. When the orchids are exposed to light again, 1-ACC could be

vi

converted into ethylene in the buds which induces bud drop. The more bud drop sensitive

hybrids will have a greater bud drop because of the larger concentration 1-ACC in the buds.

vii

INHOUDSOPGAVE

Hoofdstuk 1 Probleemstelling en doel van het onderzoek 1.1. Probleemstelling ........................................................................................................... 1 1.2. Klimaatcondities als stressfactoren tijdens Phalaenopsis transport ............................. 1 1.3. Bloemeigenschappen van Phalaenopsis relevant voor knopval .................................. 2 1.4. Ethyleen induceert bloemen knopval ......................................................................... 3

1.5. Voorkomen van bloemen knopval met 1-MCP ......................................................... 4 1.6. Hypothese en doel van het onderzoek .......................................................................... 5

Hoofdstuk 2 Algemene eigenschappen van orchideeën en hun CAM cyclus 2.1. Economisch belang van orchideeën en Phalaenopsis .................................................. 7 2.2. Het geslacht Phalaenopsis............................................................................................ 8

2.2.1 Historiek, herkomst en anatomie van orchideeën .................................................... 8 2.2.2 Teelt ....................................................................................................................... 10

2.3. Crassulacean Acid Metabolism .................................................................................. 12

2.3.1 Wat is CAM? ......................................................................................................... 13 2.3.2 Vier fasen ............................................................................................................... 13 2.3.3 Invloed van omgevingsfactoren op de CAM cyclus en bloemontwikkeling ......... 15

Hoofdstuk 3 Materiaal en methoden 3.1. Plantmateriaal ............................................................................................................. 19 3.2. Proefopzet ................................................................................................................... 19 3.3. Bloemen en knoppen .................................................................................................. 20 3.4. Microklimaat .............................................................................................................. 20

3.5. Continue bepaling van de CO2 en H2O uitwisseling .................................................. 20 3.5.1 Meetprincipe .......................................................................................................... 22

3.5.2 Kalibratie ............................................................................................................... 23 3.6. Discontinue bepaling van de CO2 en H2O uitwisseling ............................................. 24 3.7. Chlorofyl-a fluorescentieparameters .......................................................................... 25

3.7.1 Theoretische achtergrond ...................................................................................... 26 3.8. Statistische analyse ..................................................................................................... 30

Hoofdstuk 4 Resultaten 4.1. Microklimaat .............................................................................................................. 31

4.2. Knopval ...................................................................................................................... 32 4.3. Fluorescentieparameters ............................................................................................. 33 4.4. Fotosynthese en transpiratie ....................................................................................... 37

4.4.1 Bladeren ................................................................................................................. 37

4.4.2 Bloemstengels ........................................................................................................ 40

Hoofdstuk 5 Discussie 5.1. Definitie knopvalgevoeligheid ................................................................................... 43 5.2. Fluorescentieparameters als screeningparameters ...................................................... 44

5.2.1 Hogere efficiëntie van PS II en grote flexibiliteit als reactie op donkerstress ...... 44

5.2.2 Dalende efficiëntie van PS II wanneer de donkerperiode vorderde ...................... 46 5.2.3 Sommige fluorescentieparameters zijn gerelateerd aan de knopvalgevoeligheid . 46

5.3. De rol van fotosynthese en transpiratie bij verhoogde knopval na donkerstress ....... 47 5.3.1 Bladeren ................................................................................................................. 47 5.3.2 Bloemstengels ........................................................................................................ 48 5.3.3 Link met knopval ................................................................................................... 48

Hoofdstuk 6 Conclusies en perspectieven 6.1. Algemene besluiten .................................................................................................... 51 6.2. Suggesties voor verder onderzoek .............................................................................. 53

Hoofdstuk 7 Referenties

ix

LIJST VAN AFKORTINGEN

1-ACC 1-aminocyclopropaan-1-carbonzuur

A Bladoppervlakte

AdoMet S-adenosyl-L-methionine

AOA ACC synthase inhibitor aminooxy azijnzuur

ATP Adenosinetrifosfaat

AVG Aminoethoxyvinylglycine

CAM Crassulacean Acid Metabolism

CITES ‘The Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna

and Flora’

D Luchtdebiet

DACP Diazocyclopropeen

DOY ‘Day Of the Year’

E Netto H20 uitwisselingssnelheid

ETR Elektronentransportsnelheid

F ‘Steady-state’ fluorescentieniveau in de donker-geadapteerde fase

F’ ‘Steady-state’ fluorescentieniveau in de licht-geadapteerde fase

Fm Maximaal fluorescentieniveau in de donker-geadapteerde fase

Fm’ Maximaal fluorescentieniveau in de licht-geadapteerde fase

F0 Minimaal fluorescentieniveau in de donker-geadapteerde fase

F0’ Minimaal fluorescentieniveau in de licht-geadapteerde fase

Fv Variabel fluorescentieniveau in de donker-geadapteerde fase

Fv’ Variabel fluorescentieniveau in de licht-geadapteerde fase

Fv/Fm Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de donker-

geadapteerde fase

Fv’/Fm

’ Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de licht-

geadapteerde fase

Fq’ Verschil in fluorescentie tussen Fm

’ en F

’

Fq’/Fm

’ Actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II

IR Infraroodstraling

LHC ‘Light harvesting complex’

1-MCP 1-methylcyclopropeen

MM Molaire massa

NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (gereduceerde vorm)

NUE ‘Nitrogen Use Efficiency’

NPQ Niet-fotochemische quenching

P Druk

PAR Fotosynthetisch actieve straling

PEP Fosfoenolpyruvaat

PEPC Fosfoenolpyruvaat-carboxylase

Pn Netto CO2 uitwisselingssnelheid

PPFD ‘Fotosynthetic Photon Flux Density’

PS I Fotosysteem I

PS II Fotosysteem II

x

QA Primaire elektronenacceptor van PS II

qP Fotochemische quenching

R Universele gasconstante

RH Relatieve luchtvochtigheid

Rubisco Ribulose-1,5-bifosfaat carboxylase/oxygenase

STS Zilverthiosulfaat

T Temperatuur

VPD Waterdampdrukdeficiet

WUE ‘Water use efficiency’

Hoofdstuk 1

Probleemstelling en doel van

het onderzoek

Probleemstelling en doel van het onderzoek

1

In dit hoofdstuk wordt de probleemstelling en het doel van deze masterthesis beschreven,

samen met de hieromtrent relevante literatuur. Voor lezers die niet gespecialiseerd zijn in

orchideeën en hun fotosynthese mechanisme wordt verwezen naar het volgende hoofdstuk

waar het Crassulacean Acid Metabolism (CAM) en de algemene eigenschappen van

orchideeën worden beschreven.

1.1. Probleemstelling

Phalaenopsis orchideeën zijn één van de belangrijkste sierplanten van deze eeuw. Daarom

wordt er veel belangstelling gehecht aan de optimalisatie van het productieproces.

Phalaenopsis orchideeën worden geïmporteerd in onze streken om het assortiment uit te

breiden en om de hoge energiekosten, vereist voor de teelt, te drukken. Dit nationaal tot

intercontinentaal transport gebeurt tijdens de verschillende stadia van de teelt. Bijvoorbeeld,

de cultivarontwikkeling vindt plaats in de VS, de geselecteerde klonen worden vervolgens via

weefselcultuur gekweekt in Japan, waarna massaproliferatie van de weefselculturen gebeurt in

China. Ten slotte worden de niet-bloeiende planten opgegroeid in Europa (vb. Nederland en

België) (Griesbach, 2002). Na opkweek worden ze getransporteerd naar binnen- en

buitenlandse bedrijven voor verdere groei en verkoop.

Tijdens het transport, dat vaak langer dan drie dagen duurt, bevinden de planten zich in

suboptimale condities: ze worden continu in het donker gehouden, geschud en blootgesteld

aan variërende temperaturen. Uit de praktijk blijkt dat deze transportcondities voor bepaalde

hybriden knopval induceren. Het wordt geschat dat ongeveer vier à vijf procent van de

verhandelde Phalaenopsis planten knopval vertoont (persoonlijke communicatie met veiling

Aalsmeer). Deze knopval is een groot probleem voor de orchideeënkwekerijen omdat ze de

kwaliteit en de commerciële waarde van de planten negatief beïnvloedt. De planten worden

namelijk tweede keuze op de veiling vanals er één knop is afgevallen. Het verlies voor de

sector wordt geraamd op 10 miljoen euro per jaar (persoonlijke communicatie met V. Lamote,

Microflor). In de literatuur is echter weinig beschreven over de oorzaken van deze knopval.

1.2. Klimaatcondities als stressfactoren tijdens Phalaenopsis

transport

Zolang slechts één klimaatfactor limiterend is tijdens het transport van Phalaenopsis zal geen

fotosynthetische stress worden geïnduceerd (Su et al., 2001). Een combinatie van

verschillende limiterende factoren (dehydratatie en donkerbehandeling) leidt echter wel tot

een sterke onderdrukking van de fotosynthetische activiteit. Hierdoor verloopt het

donkertransport best bij een relatief lage temperatuur en een hoge relatieve luchtvochtigheid

(RH). Zo kunnen de Phalaenopsis planten hun waterinhoud en fotosynthetische activiteit

behouden. Meer specifiek wordt Phalaenopsis het best getransporteerd bij 25°C tijdens de

zomerperiode en tussen de 25°C en 15°C vanaf de late herfst tot de vroege lente (Wang,

2007). Hogere temperaturen induceren namelijk gewichtsverlies (warmte stress), terwijl

lagere temperaturen de kiltegevoeligheid (vlekken op het blad) vergroten. Het tijdstip van

scheutvorming werd tijdens een donkertransport van 14 dagen niet beïnvloed wanneer

Phalaenopsis planten werden opgeslagen bij een temperatuur tussen 15 en 25°C, maar bij

30°C werd de scheutgroei echter wel vijf tot acht dagen vertraagd (Wang, 2007). Het


2

transport gebeurt ook best met een potmedium, aangezien de opslag van Phalaenopsis zonder

potmedium resulteert in meer vergeelde bladeren en een groter waterverlies (Hou et al.,

2010). Na het transport wordt een acclimatisatieperiode van zes tot negen dagen aangeraden

om de fotosynthetische activiteit te verhogen (Hou et al., 2010). Tijdens deze periode wordt

aangeraden het lichtniveau gradueel te doen stijgen van 34 tot 200 μmol m-2

s-1

‘Photosynthetic Photon Flux Density’ (PPFD) of een constant lichtniveau van 140 μmol m-2

s-

1 PPFD te behouden.

1.3. Bloemeigenschappen van Phalaenopsis relevant voor knopval

Fotosynthese kan plaatsvinden in de bloemen van Phalaenopsis planten. Hierdoor kunnen de

bloemen groeien met zelf geproduceerde assimilaten (Aschan & Pfanz, 2003). De

chlorofylinhoud van orchideeënbloemen bedraagt ongeveer 10% van de bladeren (Goh,

1983). De fotosynthesesnelheden van de bloemen zijn afhankelijk van het

ontwikkelingsstadium en de bloemstructuur. Bijvoorbeeld, bij de Dendrobium soort daalt het

gebruik van de fotosynthetische stralingsenergie met de leeftijd van de bloemen (Aschan &

Pfanz, 2003) en bij Cymbidium orchideeën is de CO2 fixatie het hoogst in de kelkbladeren,

lager in de kroonbladeren en het laagst in het vruchtbeginsel (Dueker & Arditti, 1968). Een

groot voordeel van de bloemfotosynthese is de gunstige positie voor licht. Tijdens het

knopstadium zijn de kelk- en kroonbladeren namelijk de buitenste, bedekkende delen van de

reproductieve delen. Hierdoor wordt de efficiëntie van het gebruik van de stralingsenergie

gemaximaliseerd waardoor een hogere koolstofassimilatie kan plaatsvinden (Dueker &

Arditti, 1968). Bij Cymbidium bloemen wordt er in het licht meer CO2 gefixeerd dan in het

donker, maar het fotosynthese mechanisme in de bloemen kan bij sommige orchideeënsoorten

ook een zwak CAM metabolisme vertonen (Dueker & Arditti, 1968; Endo & Ikusima, 1989,

1992; Goh, 1983). De zuurfluctuaties die typisch zijn voor het CAM metabolisme werden in

de bloemen van sommige orchideeënsoorten (Arachnis, Aranda, Dendrobium en Vanda

hybriden) waargenomen (Goh, 1983). Deze fluctuaties waren kleiner maar vergelijkbaar met

die in de bladeren.

De epidermale laag van de kroonbladeren bevat stomata langswaar de CO2 uitwisseling, nodig

voor fotosynthese, plaatsvindt. De stomatale densiteit in de bloemen is vaak kleiner dan in de

bladeren (Aschan & Pfanz, 2003). De stomatale densiteit is het aantal stomata per

oppervlakte-eenheid en geeft een indicatie van de fotosynthetische capaciteit. Een hoge

densiteit geeft aanleiding tot efficiënte CO2 uitwisseling tussen de plant en de atmosfeer. De

stomatale geleidbaarheid geeft aan in welke mate de stomata geopend zijn, bij een hoge

geleidbaarheid zijn ze open. De bloemstomata van orchideeën blijken niet-functioneel,

aangezien de stomatale geleidbaarheid en transpiratie niet wordt beïnvloed door

veranderingen in CO2 concentratie, stralingsintensiteit, RH en abscissinezuur. Een continue

CO2 uitwisseling tijdens de dag en nacht is waargenomen en vereist bijgevolg een permanente

of op zijn minst partiële stomatale opening (Hew et al., 1980). Algemeen, zijn de bestaande

studies over CO2 uitwisseling bij Phalaenopsis (Lin & Hsu, 2004; Guo & Lee, 2006;

Ichihashi et al., 2008; Shin et al., 2009; Hou et al., 2010; Pollet et al., 2010, 2011) bijna altijd

gericht op de bladeren en is bijgevolg de bestaande data over fotosynthese bij stengels,

bloemen of knoppen zeldzaam. Ook de transpiratie van bladeren, bloemen, knoppen en

stengels bij Phalaenopsis is nagenoeg onbeschreven in de literatuur.


3

Licht heeft een sterk effect op de bloei van Phalaenopsis. Hoge lichtintensiteiten (12% van

het zonlicht, ongeveer 276 µmol m-2

s-1

) leiden bij Phalaenopsis tot vroegere bloei en meer,

grotere bloemen (Konow & Wang, 2001). Waarschijnlijk leidt een verhoogde fotosynthese tot

hogere suikerconcentraties en grotere groeisnelheden. De blootstelling van Phalaenopsis

hybriden (TAM Butterfly) aan lage lichtintensiteiten (zoals tijdens het transport) leidt tot

bloeivertraging (Wang, 1998). De donkeropslag, onafhankelijk van de temperatuur en de tijd,

resulteert steeds in minder bloemen, maar beïnvloedt de grootte van de bloemen niet (Wang,

2007). De donkerperiode kan ook het aantal zijtakken en het aantal bloemen op de primaire

stengel doen dalen (Hou et al., 2010).

1.4. Ethyleen induceert bloemen knopval

Ethyleen speelt een sleutelrol in het reguleren van de biochemische en anatomische

veranderingen die het verouderen van de orchideebloemen induceren (Woltering & van

Doorn, 1988; Nadeau et al., 1993; Ketsa & Thampitakorn, 1995). Het plantenhormoon

ethyleen is een algemene groeiregulator die verschillende ontwikkelingsprocessen in de plant

beïnvloedt, zoals het rijpen van vruchten, veroudering en reactie op stress. Onder normale

omstandigheden produceren planten slechts zeer weinig ethyleen (Klee et al., 1991; Woltering

& Westra, 2010). Ethyleenbiosynthese wordt gestimuleerd door verschillende factoren zoals

ontwikkelingsstadium, omgevingscondities, andere planthormonen en fysische/chemische

stress. Ethyleenbiosynthese varieert ook in een circadiaans patroon, hoger gedurende de dag

en minimaal ’s nachts. De biosynthese van ethyleen in planten verloopt als volgt (Figuur 1.1).

L-methionine wordt geactiveerd door adenosinetrifosfaat (ATP) tot S-adenosyl-L-methionine

(AdoMet). AdoMet wordt vervolgens omgezet in 1-aminocyclopropaan-1-carbonzuur (1-

ACC) via het enzym ACC-synthase. De concentratie van dit enzym wordt gecontroleerd door

omgevings- en interne factoren zoals verwondingen, koudestress, droogtestress,

overstromingen, vruchtrijping, bloemveroudering en auxine. Tot slot wordt 1-ACC met

behulp van het enzym ACC-oxidase, dat zuurstof vereist, omgezet naar ethyleen. Niet al het

1-ACC wordt omgezet naar ethyleen, een deel kan ook omgezet worden naar een

geconjugeerde vorm: N-malonyl ACC. De conjugatie van 1-ACC kan een belangrijke rol

spelen in de controle van ethyleenbiosynthese. Methionine wordt gerecycleerd via de Yang

cyclus (Taiz & Zeiger, 2006).

Meer specifiek, wordt in orchideeën de veroudering van de bloem ingezet door een stijging in

ethyleenproductie en 1-ACC oxidase activiteit, wat autokatalytische productie van ethyleen

suggereert (Mapeli et al., 2009). Bloemknoppen blijken hogere ethyleenconcentraties te

produceren dan open bloemen (Ketsa & Thampitakorn, 1995). De bloemen en knoppen van

orchideeën blijken ook gevoelig te zijn aan exogeen ethyleen (Raffeiner, 2009; Sun et al.,

2009). Wanneer exogeen ethyleen werd toegediend aan Oncidium en Odontoglossum planten,

openden enkel de volledig ontwikkelde knoppen en stagneerde de ontwikkeling van

onvolgroeide knoppen die vervolgens afvielen (Raffeiner et al., 2009). Bij mini Phalaenopsis

planten induceert exogeen ethyleen knopval. De ethyleengevoeligheid verschilt echter wel

volgens cultivar (Sun et al., 2009). De knopval zou te wijten zijn aan beschadiging en

veroudering van de kroonbladeren, geïnduceerd door ethyleen. Zelfs zeer lage

ethyleenconcentraties van 0,1 ppm kunnen binnen enkele dagen bloemen knopval

veroorzaken (Runkle et al., 2005d). Het mechanisme dat de invloed van ethyleen op knoppen


4

en bloemen bij Phalaenopsis orchideeën drijft, is momenteel nog niet achterhaald. Eveneens

wordt de link tussen donkertransport en knopval in de literatuur nagenoeg niet bestudeerd.

1.5. Voorkomen van bloemen knopval met 1-MCP

Het verwelken/afvallen van bloemen en knoppen bij orchideeën wordt momenteel verhinderd

door gebruik te maken van de goed gekende ethyleenbiosynthese (Figuur 1.1) en van

ethyleeninhibitoren zoals zilverthiosulfaat (STS), diazocyclopropeen (DACP),

aminoethoxyvinylglycine (AVG) of ACC synthase inhibitor aminooxy azijnzuur (AOA) (Taiz

& Zeiger, 2006; Raffeiner et al., 2009). DACP en AOA zijn minder efficiënte inhibitoren dan

STS, maar STS brengt milieurisico’s met zich mee en is bijgevolg in vele landen verboden.

Recent werd het niet-toxische gas 1-methylcyclopropeen (1-MCP) geïntroduceerd dat het

effect van ethyleen kan tegengaan (Raffeiner et al., 2009). Behandelingen met 1-MCP vinden

plaats in een afgesloten ruimte en duren een aantal uren (Woltering & Westra, 2010). 1-MCP

zou binden met de ethyleenreceptor waardoor het reeds bij lage concentraties zeer specifiek

en actief is. Het succes van de 1-MCP behandeling is afhankelijk van het genotype, de

concentratie 1-MCP, de blootstellingstijd, de temperatuur en het ontwikkelingsstadium van de

plant (Raffeiner et al., 2009). Fumigatie van Phalaenopsis met 1-MCP (0,2 ppm) voor 6 uur

bij 25°C beschermt de bloemen voor ethyleenconcentraties tot 10 ppm. De periode van

bescherming is echter kort (zeven dagen bij 25°C) en daalt bij hogere temperaturen (Runkle et

Figuur 1.1 - Ethyleenbiosynthese en Yang cyclus. Methionine is de precursor van ethyleen. De snelheidsbepalende stap is de omzetting van S-adenosyl-L-methionine (AdoMet) naar 1-aminocyclopropaan-1-carbonzuur (1-ACC) met behulp van het enzym ACC-synthase. De omzetting van 1-ACC naar ethyleen wordt gekatalyseerd door het enzym ACC-oxidase, dat zuurstof vereist. De CH3-S groep van methionine wordt gerecycleerd via de Yang cyclus zodat continue synthese wordt verzekerd. 1-ACC kan ook ge-conjugeerd worden tot N-malonyl ACC. AOA = ACC synthase inhibitor aminooxy azijnzuur; STS = zilverthiosulfaat; AVG = ami-noethoxyvinylglycine; DACP = diazocyclopropeen (aangepast uit: Taiz & Zeiger, 2006).


5

al., 2005d). De effecten van ethyleen en 1-MCP op veroudering van de bloemen van de

genera Oncidium en Odontoglossum werden onderzocht door Raffeiner et al. (2009). 1-MCP

verlengde de houdbaarheid van de bloemen en voorkwam knopval bij Oncidium en

Odontoglossum. Drie tot zeven dagen na de behandeling met 1-MCP eindigde de

bescherming. 1-MCP verminderde ook de ethyleengeïnduceerde knopval bij mini

Phalaenopsis, cultivar Sogo ‘Yenlin’. Voorbehandeling met 1-MCP zou de

ethyleengeïnduceerde stijging van abscissinezuur in de bloemknoppen verhinderen

(Uthaichay et al., 2007) en zou de ACC-synthase activiteit in open bloemen en ACC-oxidase

activiteit in de bloemknoppen verlagen.

1.6. Hypothese en doel van het onderzoek

Vanwege de vele vragen omtrent de negatieve invloed van donkertransport bij Phalaenopsis,

spitst deze masterthesis zich toe op de link tussen knopval en donkerstress bij Phalaenopsis.

Er zal nagegaan worden of knopval na donkerstress, gepaard gaande met een

tijdsverschuiving ten gevolge van transport, kan verklaard worden door de volgende

hypothese. Tijdens een lange donkerperiode valt de fotosynthese stil in de bladeren. Door de

afwezigheid van licht wordt er geen ATP geproduceerd waardoor CO2 niet kan worden

ingebouwd in suikers tijdens de Calvincyclus. Deze geremde Calvincyclus doet de productie

van fosfoenolpyruvaat (PEP) stilvallen. Aangezien PEP bindt met de opgenomen CO2 uit de

lucht, doet een PEP tekort de interne CO2 concentratie stijgen waardoor de stomata sluiten en

de CO2 opname wordt beperkt. Een lichtperiode is bijgevolg noodzakelijk om de stomata ’s

nachts te openen (Klunge & Ting, 1978). Bij een langere donkerperiode vindt er dus geen

fotosynthese plaats. Hierdoor treedt er een tekort op aan zuurstof en hoopt 1-ACC op in de

bladeren en/of wortels omdat het niet kan worden omgezet naar ethyleen. Wanneer de planten

vervolgens terug in het licht worden geplaatst, beginnen de bloemen meer te transpireren en

vindt er een opwaartse beweging plaats van 1-ACC vanuit de bladeren naar de

bloemknoppen. Aangezien er op dat ogenblik wel voldoende zuurstof is, wordt 1-ACC

massaal omgezet naar ethyleen in de knoppen waardoor ze verkleuren en afvallen. Om deze

hypothese te verifiëren, zal tijdens een donkerperiode van één week en een herstelperiode van

14 dagen de fotosynthese, chlorofylfluorescentie en transpiratie van bladeren en

bloemstengels worden opgemeten. De verschillende variabelen zullen gerelateerd worden aan

de geobserveerde knopval. De waargenomen relaties zullen besproken worden in het kader

van de vooropgestelde hypothese.

Hoofdstuk 2

Algemene eigenschappen van

orchideeën en hun CAM cyclus

Algemene eigenschappen van orchideeën en hun CAM cyclus

7

In dit hoofdstuk wordt het economisch belang, de algemene kenmerken en het fotosynthese

mechanisme van Phalaenopsis besproken.

2.1. Economisch belang van orchideeën en Phalaenopsis

Orchideeën behoren wereldwijd tot één van de grootste segmenten van de sierteelt. De meeste

ochideeën worden gekweekt voor hun prachtige bloemen. Ze worden globaal vermarkt als

potplanten, snijbloemen en zelfs als perkplanten in tropische regio’s. Grootschalige

orchideeënproductie vindt plaats in China, Duitsland, Japan, Nederland, Taiwan, Thailand en

de Verenigde Staten (Lopez & Runkle, 2005; Cha-um et al., 2010).

De orchideeënteelt is de laatste 25 jaar sterk in opmars. In Nederland is van 1983 tot 2009 het

aantal verkochte orchideeën op veilingen gestegen van 50000 naar 96,4 miljoen potten. De

veilingopbrengst bedroeg in 2009 meer dan 331,5 miljoen euro, bijna het tiendubbele dan in

2000. In de VS is de productiewaarde van orchideeën van 1996 tot 2004 gestegen met 170%.

In 2009 werd de groothandelswaarde geschat op 159,6 miljoen dollar. Dit cijfer berust enkel

op de omzet van de grootste commerciële bedrijven en is dus zelfs een onderschatting.

Vandaag zijn orchideeën (waarvan 70 tot 90% Phalaenopsis) de tweede meest waardevolle

potplant in de VS (Griesbach, 2002; Lopez & Runkle, 2005; Ronse, 2008; Vakblad voor de

Bloemisterij, 2005, 2010).

Phalaenopsis domineert de orchideeënmarkt om verschillende redenen. De bloemen hebben

een lange levensduur en een brede waaier aan kleuren. Ze zijn ook gemakkelijk te verzorgen

en het is mogelijk om de bloei te plannen (Runkle et al., 2005a). Na een explosieve groei in

de Phalaenopsis teelt, volgden er echter enkele moeilijke jaren. In 2008 was er een overschot

op de aanbodmarkt waardoor de prijzen sterk daalden, hierdoor raakten vele kwekers in de

problemen. In 2009 bereikte de prijs een dieptepunt. In 2010 zorgde vooral het positieve

voorjaar voor een stijging van de gemiddelde jaarprijs. Om te kunnen overleven, trachten de

bedrijven de kostprijs zo laag mogelijk te houden. Een groot deel van de kwekers teelt daarom

Phalaenopsis in kragen en kokers. Deze zorgen ervoor dat het blad zich omhoog ontwikkelt in

plaats van opzij waardoor er meer planten op een vierkante meter kunnen staan. Ook wordt

gezocht naar rassen met een kortere teeltduur, beter gebruik van energie en verdergaande

automatisering. Een ander gevolg van het instorten van de Phalaenopsis markt was een

omslag in het assortiment. Er ontstond een spreiding van potmaten, een toename van

meertakkers en een breder assortiment van bijzondere kleuren en vormen (Vakblad voor de

Bloemisterij, 2011).

Het grote economische belang van orchideeën en meer specifiek van Phalaenopsis ligt aan de

basis van dit onderzoek. De orchideeënkwekers willen hun productieproces continu

optimaliseren. De nodige kennis over de invloed van verschillende milieufactoren op de groei

en ontwikkeling van Phalaenopsis halen ze uit wetenschappelijk onderzoek.


8

2.2. Het geslacht Phalaenopsis

2.2.1 Historiek, herkomst en anatomie van orchideeën

Orchideeën werden in China al beschreven in meer dan drieduizend jaar oude boeken over

kruidengeneeskunde. Naast hun medicinale eigenschappen stonden ze symbool voor

elegantie, verfijning, nobelheid, zuiverheid en spirituele volmaaktheid. De eerste vermelding

van orchideeën in de Westerse geschiedenis gebeurde door de Griekse filosoof Theophrastus

(370 tot 285 voor Christus). Hij schreef over ‘Orkhis’, het Griekse woord voor teelbal. Deze

benaming verwijst naar de twee olijfvormige knollen waarvan de ene glad en hard en de

andere verschrompeld en zachter is. Ondertussen is geweten dat de harde knol overeenkomt

met de knol die tijdens het lopende jaar gevormd is en de zachtere knol met die van het jaar

ervoor. Deze knollen bevatten reservevoedsel voor de plant. Hoewel slechts een kleine

minderheid binnen de orchideeënfamilie deze bolvormige wortels bezitten, hebben de soorten

van het genus Orchis hun naam gegeven aan de volledige orchideeënfamilie, de Orchidaceae

(Ronse, 2008).

Vandaag vormen de orchideeën na de samengesteldbloemigen (Asteraceae) de tweede

grootste plantenfamilie ter wereld (Runkle et al., 2005a; Ronse, 2008). De orchideeënfamilie

bevat meer dan 25000 beschreven soorten, verdeeld in 859 genera en vijf subfamilies:

Apostasioideae, Cypripedioideae, Vanilloideae, Orchidoideae en Epidendroideae (Pollet,

2010). Orchideeën zijn niet alleen bijzonder omdat er zo veel verschillende soorten bestaan,

ze vallen ook op door hun grote variatie. In geen enkele andere plantenfamilie vind je zoveel

diversiteit qua kleur, geur, vorm en afmetingen (Ronse, 2008). Ondanks de grote diversiteit

aan orchideeën worden slechts een aantal genera in grote hoeveelheden commercieel geteeld.

De belangrijkste zijn Cymbidium, Dendrobium, Oncidium en Phalaenopsis (Pollet, 2010). In

deze thesis ligt de focus op het genus Phalaenopsis, de populairste kamerplant van Europa

(Ronse, 2008). In Nederland bijvoorbeeld behoort 75-80% van alle geproduceerde orchideeën

tot het genus Phalaenopsis (Oudshoorn, 2007). Sinds de jaren ’80 worden Phalaenopsis-

planten in Europa te koop aangeboden als bloeiende potplanten (Ronse, 2008). Volgens

Oudshoorn (2007) is de term Phalaenopsis-groep eigenlijk geschikter, want naast

Phalaenopsis zelf hebben ook andere geslachten een rol gespeeld bij de talrijke kruisingen.

Het succes van Phalaenopsis als kamerplant is te danken aan zijn bloemen die bijna het hele

jaar door kunnen bloeien. De afzonderlijke bloemen blijven meerdere maanden goed en als

een bloemstengel uitgebloeid is, kan deze aan de basis terug uitschieten en verder bloeien. De

naam Phalaenopsis is samengesteld uit het Griekse phalaina, dat ‘nachtvlinder’ betekent, en

opsis, wat ‘gelijkend op’ wil zeggen. De naam Phalaenopsis betekent dus letterlijk ‘gelijkend

op een nachtvlinder’ en werd aan de plant gegeven door ontdekkingsreizigers toen ze de

grote, witte bloemen van Phalaenopsis in het schemerduister van het oerwoud zagen bloeien

(Oudshoorn, 2007).

De orchideeënfamilie heeft een zeer groot verspreidingsgebied. Ongeveer overal waar

plantengroei is, komen ze voor. De standplaatsen variëren van zeeniveau tot hooggebergten,

vochtige gebieden en open, droge vegetaties (Ronse, 2008). Phalaenopsis is van oorsprong uit

de tropische en subtropische gebieden van de Zuid Pacifische eilanden en Azië (Runkle et al.,

2005c; Wang, 2007). Hun verspreidingsgebied omvat China, Japan, Nepal, Papoe-Nieuw-


9

Guinea, Taiwan, de Filippijnen en tropisch Australië. De Filippijnen herbergen de grootste

concentraties aan soorten en veel daarvan hebben een zeer voorname rol gespeeld bij de

talloze kruisingen die zijn ontstaan (Oudshoorn, 2007; Pinske, 2009). Orchideeën kunnen in

drie groepen verdeeld worden naargelang hun manier van leven. Van alle orchideeënsoorten

leven 72% epifytisch, het gaat hier voornamelijk over tropische orchideeën (Silvera et al.,

2009). Epifyten gebruiken bomen als steun om meer licht op te vangen en leven van het vocht

en de humus op de boomtakken. Het zijn echter geen parasieten, ze beschadigen de bomen

niet. De meeste orchideeën uit de gematigde streken zijn terrestrisch en wortelen dus in de

grond. Sommige orchideeën bezitten geen bladgroen, maar zijn saprofyten. Dit zijn planten

die leven van dood organisch materiaal (Ronse, 2008).

Phalaenopsis behoort tot de epifytische orchideeën. Ze groeien dus vaak op aanzienlijke

hoogte. De RH is steeds hoger dan 80% en er valt ter plekke relatief veel neerslag, die

regelmatig over het jaar verdeeld is. De lichtintensiteit op de groeiplaatsen is niet erg groot,

enerzijds doordat de planten door de bladeren van de bomen tegen direct zonlicht worden

beschermd en anderzijds door de vele dagen waarop het bewolkt is (Oudshoorn, 2007). Dit

betekent dat orchideeën zuinig moeten zijn met water en voedingsstoffen. Het water dat ze

krijgen is meestal afkomstig van regen en in sommige gebieden ook van dauw of mist. Hun

voedingsstoffen halen ze uit afgevallen bladeren en stof of aarde die door de wind aangevoerd

worden. Vandaar dat orchideeën zeer traag groeien (Ronse, 2008). De epifytische groeiwijze

houdt ook in dat de wortels worden blootgesteld aan luchtbeweging. Met deze specifieke

kenmerken moet rekenening worden gehouden bij de samenstelling van het potmengsel.

Verluchting, capillaire krachten, water- en nutriëntenvasthoudende capaciteit, stabiliteit en

gewicht van het potmengsel zijn hierbij belangrijke parameters (Runkle et al., 2005b).

Phalaenopsis orchideeën behoren tot de monopodiale orchideeën. De stammen zijn meestal

slechts 30 cm lang. De bladeren zijn min of meer vlezig, meestal eivormig ovaal en 10 tot 40

cm groot. Naargelang de soort kunnen ze naar beneden hangen of zijwaarts afstaan. Bij

sommige soorten zijn ze bijna succulent. De bloeiwijzen ontspruiten telkens aan de onderste

bladoksels. Vaak zijn ze vertakt en afhankelijk van de soort tussen enkele centimeters en één

meter lang (Pinske, 2009). Orchideeën hebben specifieke kenmerken die niet bij andere

plantenfamilies voorkomen. Ze hebben maar één vruchtbare meeldraad. Meeldraad en

stempel zijn soms deels, maar meestal volledig vergroeid tot een orgaan, de zogenaamde zuil

of gynostemium. Bovendien vormen orchideeën talloze extreem kleine zaadjes zonder

reservevoedselorgaan. Naast deze specifieke kenmerken bezitten orchideeën ook nog

kenmerken die bij andere families kunnen voorkomen (Pinske, 2009). De bloemen van

orchideeën zijn vrijwel altijd tweeslachtig (Oudshoorn, 2007), ze bezitten drie kelkbladen

(sepalen) en drie kroonbladen (petalen). Het middelste kroonblad is afwijkend in vorm, kleur

en/of afmeting en wordt de lip of labellum genoemd (Figuur 2.1). Aangezien de lip meestal

dienst doet als landingsplatform voor de bestuivende insecten speelt ze een niet te

onderschatten rol in de voortplanting van de orchideeën. De meeste orchideeën hebben voor

de bestuiving hulp nodig van dieren, voornamelijk insecten. Deze worden gelokt door de

kleur en de geur van de bloemen (Ronse, 2008).


10

2.2.2 Teelt

Phalaenopsis is de laatste decennia enorm in opkomst. Door betere vermeerderings- en

kweekmethoden is het een plant geworden die door iedereen kan worden aangeschaft. Van

hoge prijzen is geen sprake meer en omdat de plant lang meegaat, is hij in feite goedkoop. De

kwekers voeren ze het hele jaar aan, maar de natuurlijke bloeiperiode ligt in de maanden

februari, maart en april (Runkle et al., 2005; Oudshoorn, 2007).

Eén van de belangrijkste stappen in het teeltproces was de uitvinding van technieken om

orchideeën op grote schaal te zaaien. In het begin van de 20e eeuw ontdekten de Fransman

Noël Bernard (1909) en de Duitser Burgeff (1909) onafhankelijk dat orchideeënzaden kunnen

kiemen in de nabijheid van een Rhizoctoniaschimmel. Deze schimmel werd toegevoegd aan

een gesteriliseerd substraat van turf waarop orchideeënzaden waren gezaaid, wat resulteerde

in een goede kieming. Deze techniek liet toe om orchideeën in grote hoeveelheden te

vermeerderen, iets wat voordien onmogelijk was. Waarom en hoe deze schimmel de kieming

van orchideeën bevorderde, werd ontdekt door Knudson (1922). Hij verklaarde dat

orchideeënzaden in de natuur alleen kiemen nadat ze geïnfecteerd zijn door deze schimmel.

De schimmel geeft namelijk suikers door, wat de zaden van de nodige energie voorziet om te

kiemen. Uit zichzelf hebben de zaden immers onvoldoende kiemkracht aangezien ze stoffijn

zijn. Ze wegen tussen 0,3 en 14 milligram en zijn te klein om endosperm te bevatten. Het

voordeel van hun kleine afmetingen is wel dat ze verspreid kunnen worden door de wind, tot

over tientallen kilometers afstand. De ontdekking van Knudson liet ook toe om een meer

efficiënte zaaitechniek te ontwikkelen, namelijk de ‘asymbiotische methode’. Knudson (1922)

ontwikkelde een volledig synthetische voedingsbodem met suikers, minerale zouten,

vitamines en andere essentiële groeistoffen. Vanaf dan werden orchideeën gezaaid in

kweekbuizen op een complexe voedingsbodem. Het zaaien van orchideeën versnelde de

orchideeënteelt aanzienlijk, maar voor de meeste orchideeën bleef toch vier tot zeven jaar

nodig om uit zaad bloeiende planten te verkrijgen. Dit werd verholpen met het ontwikkelen

Figuur 2.1 - Delen van de bloem van een orchidee


11

van methoden om planten te kloneren. Rond 1960 ontwikkelde de Fransman Morel (1965)

een meristeemcultuur van Cymbidiums waardoor het mogelijk werd om uit een slapende knop

in glazen kolven of proefbuizen duizenden planten op te kweken die identiek zijn aan de

ouderplant. Deze weefselcultuur kon echter niet worden toegepast bij Phalaenopsis omdat er

te veel genetische variatie ontstond. In die tijd werd Phalaenopsis dus vooral uit zaad

voortgeplant. Momenteel zijn er wel specifieke protocols opgesteld voor de weefselcultuur

van Phalaenopsis. Deze methoden zijn over het algemeen succesvol, maar kunnen niet

gebruikt worden voor alle cultivars omdat er soms toch te veel variatie ontstaat (Griesbach,

2002; Ronse, 2008).

Meristeemcultuur, ook wel weefselkweek genoemd gaat als volgt te werk. Onder de

microscoop wordt uit het groeipunt van de plant, meestal van een nieuwe scheut, een heel

klein stukje weefsel gehaald. Dit klein stukje weefsel wordt in flesjes of buisjes gedaan met

een voedingsoplossing. Om de celdeling te bevorderen worden de flesjes geschud of gedraaid.

Hierdoor raken de delende cellen gedesoriënteerd en blijven ze zich delen. De cellen vormen

klompjes ongedifferentieerd weefsel, het zogenaamde protocorm. De belichting is intensief en

er wordt een dagen nachtritme aangehouden van telkens 12 uur. De temperatuur varieert van

20 tot 29°C, afhankelijk van de soort. Per protocorm worden er meestal een paar duizend

plantjes gemaakt. Om scheut- en later ook wortelvorming te krijgen, worden de protocormen

op een vaste voedingsbodem gezet. Er zijn na ongeveer anderhalf jaar jonge plantjes

voorradig die in orchideeëngrond groeien en aan hun taak kunnen beginnen om bloemstengels

te vormen (Oudshoorn, 2007). Sommige Phalaenopsis worden gekweekt vanuit zaad, maar

door de stijgende vraag naar uniformiteit is de massamarkt van Phalaenopsis vooral

gebaseerd op deze meristeemcultuur. Het kloneringsproces vermindert namelijk de

variabiliteit tussen de planten, zodat populaties dezelfde groeien bloeikarakteristieken

hebben (Runkle et al., 2005a). Vermeerdering via protocormen geeft echter meer risico op

mutaties. Daarom wordt in de meeste laboratoria de ‘shoot-by-shoot methode’ gebruikt

(persoonlijke communicatie met V. Lamote, Microflor). Hierbij wordt vertrokken van een

scheut die op een vermeerderingsmedium één of meerdere zijscheuten vormt. Deze kunnen

vervolgens worden afgesneden en terug zijscheuten vormen.

De serreteelt van Phalaenopsis kan onderverdeeld worden in drie fasen: de vegetatieve groei,

de koelingsfase en de afwerkingsfase. Elke fase vereist verschillende

omgevingsomstandigheden, voornamelijk qua temperatuur en licht (Tabel 2.1). In hun

natuurlijke habitat heersen er tropische condities gedurende het hele jaar met dagtemperaturen

tussen de 28 en 35°C en nachttemperaturen tussen de 20 en 24°C. Aangezien epifytische

orchideeën zoals Phalaenopsis groeien op boomstammen en –takken worden ze beschaduwd

door het dense kruinendak. Daarom vereist succesvolle commerciële productie warme en

beschaduwde omgevingen, zeker gedurende de vegetatieve groei (Runkle et al., 2005c). De

vegetatieve groei vereist gemiddeld een dagelijkse temperatuur tussen 28 en 32°C om

bladproductie te stimuleren en bloei initiatie te verhinderen. Warme dagen koude

nachttemperaturen zijn bevorderlijk voor de reproductieve ontwikkeling. Fotosynthese

verzadigt bij een PPFD van 180 µmol fotonen m-2

s-1

, dus deze relatief lage lichtintensiteit

volstaat. De vegetatieve groei duurt 22 tot 27 weken, afhankelijk van de gerealiseerde

temperatuur, de initiële bladbreedte en de gewenste plantgrootte voor het induceren van de

bloei (Lopez & Runkle, 2004; Runkle et al., 2005a). Wanneer de planten vier tot zes bladeren


12

hebben en een minimum bladbreedte van 25 cm, wordt de koelingsfase gestart om bloei te

induceren. Gedurende vier tot zes weken worden de planten gekoeld bij temperaturen van 17

tot 25°C en de lichtintensiteit wordt gereduceerd tot 60 à 160 µmol m-2

s-1

PPFD. Deze

relatief koude temperaturen en lage lichtintensiteiten vertragen de bladontwikkeling en

kunnen bloei in jonge planten induceren. Lage temperaturen zijn noodzakelijk voor de

accumulatie van cytokinine en gibberelline (plantenhormonen betrokken bij de celgroei) en de

verbetering van fotosynthese dat leidt tot verzameling van suikers. Dit resulteert in de initiatie

van bloemknoppen en de verlenging van de stengel (Lopez & Runkle, 2004; Runkle et al.,

2005a; Cha-um et al., 2010). De periode van de verschijning van de scheut tot de

scheutontwikkeling en bloei wordt de afwerkingsfase genoemd. De temperatuur varieert dan

best van 17°C tot 26°C, terwijl de lichtintensiteit gelijkaardig is aan die van de vegetatieve

groei. De gemiddelde dagelijkse temperatuur controleert de ontwikkelingssnelheid van de

scheut, waardoor de temperatuur kan aangepast worden aan een specifieke verkoopdatum.

Deze fase duurt acht tot twaalf weken. De planten zijn klaar voor verkoop wanneer ze

minstens één of twee open bloemen hebben. Op dat ogenblik worden ze verpakt voor

transport (Lopez & Runkle, 2004; Runkle et al., 2005a).

Tabel 2.1 - Overzicht van de duur, temperatuur en lichtintensiteit tijdens de vegetatieve groei, koelingsfase en afwer-kingsfase in het kweekproces van Phalaenopsis.

Vegetatieve groei Koelingsfase Afwerkingsfase

Duur (weken) 22-27 4-6 8-12

Temperatuur (°C) 28-32 17-25 17-26

Lichtintensiteit (µmol m-2

s-1

) 180-400 60-160 180-400

Transport van orchideeën wordt internationaal sterk gecontroleerd. ‘The Convention on

International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora’ (CITES) verzekert dat de

handel van wilde dieren en planten hun bestaan niet bedreigd. Wilde orchideeën mogen niet

zonder toestemming verhandeld worden, enkel kunstmatig voortgeplante orchideeën. De

leverancier moet een kopie van de CITES documenten bij zich hebben die aantonen dat de

orchideeën kunstmatig voortgeplant zijn (Koninklijk besluit van 9 april 2003 inzake de

bescherming van in het wild levende dieren plantensoorten door controle op het

desbetreffende handelsverkeer).

Het transport verloopt volledig in het donker. Als de planten na een aantal dagen hun

bestemming bereiken, worden ze opnieuw aan licht blootgesteld. Deze blootstelling na

donkerperiode veroorzaakt vaak knopabortie bij een aantal hybriden (persoonlijke

communicatie met V. Lamote, Microflor).

2.3. Crassulacean Acid Metabolism

Fotosynthese bij orchideeën kan volgens twee mechanismen verlopen: C3 fotosynthese of

CAM. Neales & Hew (1975) vonden een sterke correlatie tussen het fotosynthesemechanisme

en de bladdikte. De bladeren van orchideeën met dikke, succulente bladeren (> 1 mm) volgen

meestal het CAM mechanisme, terwijl orchideeën met dunnere bladeren aan C3 fotosynthese

doen. Phalaenopsis maakt gebruik van het CAM metabolisme. Omgevingsomstandigheden


13

zoals licht, CO2 en temperatuur hebben een belangrijk effect op dit fotosynthese mechanisme

en worden vervolgens besproken.

2.3.1 Wat is CAM?

CAM is een gespecialiseerde manier van fotosynthetische koolstofassimilatie die geëvolueerd

is als respons op uitzonderlijke omgevingsomstandigheden (Borland & Taybi, 2004). CAM is

namelijk een complexe adaptatie waardoor fotosynthese in de tijd gescheiden verloopt van

water- en CO2 uitwisseling (Black & Osmond, 2003). Deze adapatie is mogelijk opgetreden

in het Mioceen (23 tot 5 miljoen jaar geleden) als een gevolg van verminderde CO2

concentratie in de atmosfeer (Dodd et al., 2002).

2.3.2 Vier fasen

Eenvoudig gesteld is CAM een fotosynthetisch systeem waarbij de enzymactiviteit van C3 en

C4 carboxylases in de tijd gescheiden is. CAM wordt beschouwd als een proces bestaande uit

vier fasen (Figuur 2.2). Deze fasen onderscheiden zich door de netto CO2 opname en de

concentratie sleutelmetabolieten, die verantwoordelijk zijn voor koolstofvoorziening en

-vraag (Dodd et al., 2002; Ceusters et al., 2011).

Enkel ’s nachts (Fase I), wanneer evapotranspiratiesnelheden laag zijn, zijn de stomata open

en wordt bijgevolg atmosferische CO2 opgenomen. Atmosferische en eventueel gerespireerd

CO2 worden enzymatisch omgezet in bicarbonaat (HCO3-), zoals te zien in Figuur 2.3. Dit

HCO3-

wordt vervolgens gefixeerd aan fosfoenolpyruvaat (PEP) door het C4 enzym

fosfoenolpyruvaat-carboxylase (PEPC), wat resulteert in de vorming van malaat. Het enzym

PEPC wordt namelijk geactiveerd tijdens de nacht door fosforylatie. PEP wordt gevormd uit

suikers die geproduceerd werden tijdens de vorige dag. Het gevormde malaat (4C product)

Figuur 2.2 - Dag/nachtpatroon van de CO2 fixatie, malaatzuur- en suikerconcentraties in een CAM plant. PEPC = Fosfoenolpyruvaat-carboxylase; RUBISCO = Ribulose-1,5-bifosfaat carboxylase/oxygenase. De donkerperiode is aangeduid door de zwarte balk (aangepast uit: Black & Osmond, 2003).


14

wordt dan getransporteerd naar de vacuole waar het opgeslagen wordt als malaatzuur. De

vacuoles van succulente weefsels kunnen meer dan 90% van het celvolume innemen. De

opslagcapaciteit van de vacuole en de beschikbaarheid van suikers zijn bepalende factoren

voor de capaciteit van de nachtelijke CO2 opname in CAM planten. In Figuur 2.2 wordt de

toename in CO2 fixatie en malaatzuur en de afname in suikers weergegeven tijdens fase I.

Bij het aanbreken van de dag (Fase II) neemt de activiteit van PEPC geleidelijk af. Dit

feedbackmechanisme verhindert nutteloze cycling van CO2 tussen PEP en malaat gedurende

de dag en wordt als essentieel beschouwd voor de efficiënte functionering van de CAM

cyclus. Tegelijkertijd neemt de activiteit van het C3 enzym ribulose-1,5-bifosfaat

carboxylase/oxygenase (Rubisco) toe. Fase II wordt dus gekarakteriseerd door PEPC

gedomineerde CO2 opname, terwijl de Rubisco activiteit gelijdelijk aan stijgt. Tijdens fase II

wordt vaak een piek (Figuur 2.2) in de CO2 opname waargenomen door de fixatie van CO2

door PEPC en de directe assimilatie door Rubisco.

Tijdens de dag (Fase III) verlaat malaat de vacuole waarna het gedecarboxyleerd wordt in

pyruvaat en CO2 (Figuur 2.3). Dit veroorzaakt een hoge interne partiële CO2 druk waardoor

de stomata sluiten en fotorespiratie wordt gelimiteerd. In de chloroplast wordt CO2

vrijgesteld, geherfixeerd via Rubisco en geïncorporeerd in de Calvincyclus (sterke toename in

suikers in Figuur 2.2).

Op het einde van de lichtperiode (Fase IV) raakt malaatzuur uitgeput (Figuur 2.2) waardoor

de interne CO2 druk daalt en de stomata heropenen. CO2 wordt opnieuw opgenomen uit de

atmosfeer en wordt voornamelijk gefixeerd door Rubisco, de activiteit van PEPC stijgt

opnieuw geleidelijk.

Energetisch gezien verhoogt CAM de metabolische kost met 10% in vergelijking met de

standaard C3 fotosynthese. Deze hogere kosten zijn te wijten aan de stockage van malaat in

de vacuole en aan de dynamische suikeropslag die noodzakelijk is voor de PEP-regeneratie

(Lawlor, 1993; Dodd et al., 2002; Borland & Taybi, 2004; Ogburn & Edwards, 2010; Borland

Figuur 2.3 - CAM: temporele scheiding van CO2 opname en fotosynthetische reacties (aangepast uit: Taiz & Zeiger, 2006).


15

et al., 2011; Ceusters et al., 2011). Het competitievermogen of de trade-off tussen

stresstolerantie en groei zorgt ervoor dat CAM planten een lage groeisnelheid en

productiviteit hebben. Nobel et al. (1992) argumenteren echter dat de lage groeisnelheden en

productiviteit niet intrinsiek zijn voor CAM planten, maar eerder het gevolg zijn van de

stressvolle situaties waarin ze groeien (Ogburn & Edwards, 2010).

2.3.3 Invloed van omgevingsfactoren op de CAM cyclus en

bloemontwikkeling

De CAM fasen zijn geen vaste compartimentering, maar laten plasticiteit toe in respons op

omgevingsfactoren (Dodd et al., 2002). Volgens Lüttge (2004) zijn de zes belangrijkste

omgevingsfactoren die CAM beïnvloeden CO2, water, licht, temperatuur, zoutgehalte en

nutriënten. Deze factoren zijn direct of indirect met elkaar verbonden waardoor een complex

netwerk van interacties van omgevingsfactoren op CAM ontstaat (Figuur 2.4). De individuele

impact van deze factoren op de CAM cyclus wordt hieronder kort toegelicht.

Licht

Fotosynthetisch actieve straling (PAR) is de energiebron voor fotosynthese. Met toenemende

lichtintensiteiten overdag, verhoogt de netto CO2 fixatie gedurende de volgende nacht (Kluge

& Ting, 1978; Konow & Wang, 2001). Dit is te wijten aan de verhoogde suikerbiosynthese in

het licht en dus een grotere beschikbaarheid aan PEP, maar ook de grotere opslagcapaciteit

van de vacuole na de uitputting aan malaatzuur overdag. Een hogere lichtintensiteit

resulteerde in dikkere bladeren, grotere bladoppervlaktes, vroegere bloei en meer, grotere

bloemen. Waarschijnlijk leidde een verhoogde fotosynthese tot hogere suikerconcentraties en

grotere groeisnelheden (Konow & Wang, 2001).

Figuur 2.4 - Netwerk van de belangrijkste omgevingsfactoren en hun effecten op CAM. T = temperatuur; hν = de energie van een foton (h = constante van Planck; ν = frequentie) (aangepast uit: Lüttge, 2004).


16

Volgens Kluge & Ting (1978) is er ook een lichtperiode nodig om de stomata ’s nachts te

kunnen openen. De duur en maximale graad van opening zijn fluctuaties van de lengte van de

lichtperiode van de vorige dag. Tijdens het transport van Phalaenopsis is er geen lichtperiode

en kunnen de stomata waarschijnlijk ’s nachts niet openen.

Een overmaat aan licht daarentegen, zorgt voor een overmaat aan energie en kan het

fotosynthese apparaat beschadigen. Dit leidt tot foto-inhibitie, waarbij de

fotosynthesesnelheid afneemt. De netto-fotosynthesesnelheid van Phalaenopsis bij 20°C

satureert bij 130-180 µmol m-2

s-1

(Hou et al., 2010). Lage lichtintensiteiten hebben ook

nadelige effecten op epifyten.

Haslam et al. (2003) onderzochten de lange termijn effecten van acclimatisatie aan

verschillende lichtregimes in de CAM epifyt Tillandsia usneoides (Bromeliaceae). De

chlorofylinhoud was groter in planten geacclimatiseerd aan lagere lichtintensiteiten (PPFD

van 50 µmol m-1

s-1

). De actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II werd

behouden bij planten geacclimatiseerd aan hoge lichtintensiteiten. De netto-fotosynthese nam

toe bij acclimatisatie aan hogere lichtintensiteit, doordat de carboxylatiecapaciteit van PEPC

en Rubisco toenam. Lin & Hsu (2004) bestudeerden bij Phalaenopsis amabilis de invloed van

lage lichtintensiteit op de fotosynthetische capaciteit van de onderste, beschaduwde bladeren

aan de hand van chlorofylfluorescentie. In dit onderzoek daalde de fotosynthetische capaciteit

van de bladeren wanneer ze geacclimatiseerd zijn aan lagere lichtintensiteiten. Phalaenopsis

is echter in staat om terug te reacclimatisateren aan hogere lichtintensiteiten wanneer de

onderste bladeren aan meer licht worden blootgesteld.

Ceusters et al. (2011) onderzochten de impact van lichtlimitatie op Aechmea ‘Maya’

(Bromeliaceae). Op korte termijn waren de planten niet tolerant aan sterke lichtlimitatie

(gemiddeld 0,46 mol fotonen m-2

d-1

). De afwezigheid van CO2 opname en veranderingen in

de sleutelmetabolieten zoals malaat, zetmeel of opgeloste suikers, wezen op een afgezwakt

metabolisme in de schaduw. Door verzuring van het cytoplasma stierven cellen af in de

fotosynthetisch actieve bladeren (bruine plekken). Na een drietal maand waren de Aechmea

planten geacclimatiseerd aan de extreem lage lichtniveaus. Dit was te wijten aan drie

verschillende processen. Ten eerste vond er een omschakeling plaats van zetmeel naar sucrose

als de belangrijkste suikerbron voor PEP-synthese. Deze verandering zorgt voor het

onderhoud van het metabolisme met zo weinig mogelijk energievereisten. Ten tweede werd

een relatieve toename in de ‘light harvesting complexen’ (LHC) waargenomen. Eveneens trad

er een verandering op in de verschillende gasuitwisselingsfasen. In fase I was de netto CO2

opname voornamelijk te wijten aan PEPC, fase II werd ingekort en fase IV werd vertraagd

met vier uur. De directe CO2 fixatie via Rubisco werd zo verwaarloosbaar klein. Skillman en

Winter (1997) suggereerden dat de hoge interne partieeldruk van CO2, typisch voor fase III,

resulteert in een relatief hoge activatiegraad van Rubisco, zelfs bij weinig licht. Voor de

lichtgelimiteerde Aechmea planten werd dan ook een maximum quantumefficiëntie van

fotosynthese waargenomen die dubbel zo hoog was als bij de controleplanten. Dus de

verlenging van fase III ten koste van de overgangsfasen II en IV lijkt belangrijk te zijn voor

de lange termijn acclimatisatie aan lage lichtintensiteiten.


17

Atmosferische CO2

Het is belangrijk onderscheid te maken tussen de atmosferische partieeldruk van CO2, de

milieufactor sensu stricto, en de interne partieeldruk aan CO2, die sterk gerelateerd zijn met

elkaar via het openen en sluiten van de stomata.

De CO2 opname gebeurt via stomatale openingen in de cuticula van het blad. Speciale

sluitcellen begrenzen de opening en zijn in staat om te bewegen waardoor de grootte van de

porie aangepast kan worden aan de omgevingsomstandigheden (Lawlor, 1993). Bij

Phalaenopsis komen er enkel stomata voor aan de abaxiale (onderzijde) van het blad en de

bladeren worden daarom amfistomatisch genoemd (Steppe, 2011). Dit draagt bij tot het

waterbehoud in de plant (Goh et al., 1977). Stomataal gedrag wordt gecontroleerd door de

interne CO2 concentratie in de substomatale ruimten. Bij C3 planten openen de stomata

overdag als respons op een verlaagde CO2 concentratie door fotosynthese. Bij CAM planten is

het openen van de stomata ’s nachts te wijten aan verlaagde CO2 concentratie door de

donkerfixatie. In het licht wordt de CO2 concentratie hoog gehouden door

malaatdecarboxylatie en blijven de stomata dus gesloten (Kluge & Ting, 1978). Indien

exogeen CO2, met dezelfde concentratie als tijdens het licht, wordt toegediend in het donker,

verhoogt de stomatale weerstand (Cockburn et al., 1979). De stomatale opening verkleint dus

bij hogere CO2 concentraties.

Water

De grootste drijvende factor voor CAM is de watervoorraad (Lüttge, 2002). Het grootste

voordeel voor CAM planten is namelijk een verhoogde ‘water use efficiency’ (WUE). De

WUE is de ratio van de hoeveelheid opgenomen CO2 tot de hoeveelheid waterverlies door

transpiratie. Deze is hoog voor CAM planten aangezien ze in staat zijn om ’s nachts hun

stomata te openen en overdag te sluiten. Hierdoor wordt veel minder water getranspireerd

(Kluge & Ting, 1978). Overdag zijn de stomata van orchideeën namelijk bijna gesloten

waardoor ze weinig warmte kunnen dissiperen via transpiratie. Zelfs wanneer de stomata

overdag deels open zijn, hebben ze de neiging om minder te transpireren dan andere planten

(Ogburn & Edwards, 2010).

De WUE in CAM planten wordt ’s nachts geschat op 6-30.10-3

mol gefixeerd CO2 op mol

getranspireerd H2O. Voor C3 planten is dit slechts 0,6-1,3.10-3

en voor C4 planten

1,7-2,4.10-3

. De WUE varieert tijdens de verschillende CAM fasen. Zo is de WUE slechts

1-4.10-3

tijdens fase IV. Fasen II en IV zijn het meest gevoelig aan waterstress. Bij

watertekort sluiten de stomata ’s morgens sneller en ’s avonds openen ze later zodat de

transpiratie verminderd, maar ook de CO2 opname (Lüttge, 2002; Ceusters et al., 2009).

Daarnaast beperken de dikke cuticula en lage stomatale densiteiten in het blad het

waterverlies (Woerner & Martin, 1999; Ogburn & Edwards, 2010). Aangezien orchideeën

slechts één keer per week water nodig hebben, treedt er normaal geen watertekort op tijdens

het transport en is deze factor van minder belang.

Temperatuur

De temperatuur zorgt zowel voor een biochemisch als een fysisch effect bij orchideeën. Het

biochemisch effect heeft te maken met de invloed van temperatuur op de verschillende

enzymen. Optimale groeien bloeicondities van CAM planten vereisen relatief lage


18

nachttemperaturen en hoge dagtemperaturen. Carboxylatie enzymen voor nachtelijke

malaatsynthese en het decarboxylatie enzyme bereiken in vitro respectievelijk een optimum

bij 35°C en 53°C. De lage nachttemperatuur zorgt voor een stabiele actieve gefosforyleerde

vorm van PEPC, waardoor minder malaatinhibitie voorkomt en de nachtelijke CO2 assimilatie

toeneemt. Hogere dagtemperaturen activeren de decarboxylatie enzymen en promoten de

defosforylatie van PEPC, waardoor de gevoeligheid voor malaatinhibitie toeneemt. Toch is er

ook veel bewijs dat CAM planten goed functioneren bij constante temperaturen (Kluge &

Ting, 1978; Lüttge, 2004). De temperatuur heeft naast de impact op enzymen ook een impact

ter hoogte van de vacuole. Hoge temperaturen zorgen namelijk voor een betere fluïdisatie van

de tonoplast waardoor de membraanpermeabiliteit voor malaat verhoogt en een grotere efflux

plaatsvindt. Dit heeft tot gevolg dat PEPC en nachtelijke CO2 opname worden geïnhibeerd.

De stomata zullen bovendien minder lang gesloten blijven door de verhoogde interne CO2

concentraties, waardoor ook minder CO2 wordt opgenomen (Lüttge, 2004).

Tot slot heeft de temperatuur ook een fysisch effect, namelijk de luchtvochtigheid beïnvloedt

de relaties tussen temperatuur en stomatale opening. Bij hogere temperaturen daalt de RH en

stijgt het waterdampdrukdeficiet (VPD). Het VPD is het verschil tussen de hoeveelheid

waterdamp in de lucht en de hoeveelheid vocht die de lucht kan bevatten in verzadigde

toestand. Door het toenemende VPD daalt de stomatale geleidbaarheid waardoor de CO2

opname daalt (Lüttge, 2004).

Nutriënten

In vele CAM planten worden verhoogde concentraties calcium (Ca2+

) aangetroffen. Samen

met kalium (K+), natrium (Na

+) en magnesium (Mg

2+) dient Ca

2+ als tegenion voor de

carboxylaten en draagt dus bij tot de osmotische stabilisatie. Ca2+

bindt bovendien met

negatief geladen eiwitten en vetten, zo zorgt het voor een daling in de

membraanpermeabiliteit (Lüttge, 2004). In C3 planten maakt Rubisco 50% uit van de totale

bladeiwitten, voor de synthese ervan wordt veel stikstof vereist. CAM planten worden

verwacht minder stikstof nodig te hebben dan C3 planten en dus een hogere ‘nitrogen use

efficiency’ (NUE) te hebben. De NUE is een maat voor de geproduceerde hoeveelheid

biomassa per eenheid stikstof (Dawson et al., 2008). CAM soorten hebben namelijk minder

Rubisco nodig en zouden dus minder stikstof moeten binden. Uit studies bleek echter dat de

NUE in CAM planten zeer soortspecifiek is en varieert met leeftijd en milieuomstandigheden.

Het toedienen van stikstof zorgde altijd voor positieve gevolgen (Lüttge et al., 1991a, b).

Zoutgehalte

Zout brengt voornamelijk osmotische stress met zich mee en is dus sterk gerelateerd aan

droogtestress. Aangezien CAM wordt gezien als een waterbesparend mechanisme, kan

verwacht worden dat CAM een eigenschap is van halofyten. Nochtans, uit observaties blijkt

dat halofyten niet altijd CAM planten zijn. Algemeen gesteld zijn CAM planten zelfs zeer

gevoelig aan zoutstress (Lüttge, 2004).

Hoofdstuk 3

Materiaal en methoden


19

3.1. Plantmateriaal

Tijdens dit onderzoek werd gebruik gemaakt van Phalaenopsis orchideeën. Zes hybriden

werden verkregen via Microflor te Lochristi. Deze onderneming omvat een

weefselteeltlaboratorium voor de vermeerdering van plantmateriaal, acclimatieserres voor de

productie van jonge planten en serres voor de veredeling en het testen van nieuwe soorten. De

orchideeën werden opgekweekt bij een natuurlijk dag/nachtregime, een temperatuur van 21°C

en een gemiddelde PPFD van 110 µmol m-2

s-1

. De RH werd gestuurd naar 65%. Alle

hybriden waren tweetakkig.

3.2. Proefopzet

De experimenten werden uitgevoerd aan het Laboratorium voor Plantecologie op de Faculteit

Bio-Ingenieurswetenschappen van de Universiteit Gent.

Het onderzoek kan opgedeeld worden in een preliminaire fase en twee proeven. Tijdens de

preliminaire fase werden bij twee hybriden ‘Blue Sensitive 1’ (BS1) en ‘Red Lip Non-

Sensitive 1’ (RLN1) de fluorescentieparameters en discontinue fotosynthese- en

transpiratiesnelheid opgemeten tijdens een donkerperiode van zeven dagen en een

herstelperiode van vijf dagen. Hierdoor werd een beter inzicht verkregen in de fotosynthese-

eigenschappen van Phalaenopsis en kon de proefopzet worden geoptimaliseerd.

Tijdens proef 1 werden tien Phalaenopsis hybriden ‘White Sensitive 1’ (WS1) en tien

hybriden ‘White Non-Sensitive 1’ (WN1) vijf dagen in het donker gehouden (=

donkerperiode) in een groeikamer onder gecontroleerde omstandigheden. Vervolgens werden

de planten 14 dagen opgevolgd bij een dag/nachtregime van 12u (= herstelperiode). Twaalf

uur donker werd afgewisseld met een lichtperiode van 1u tot 13u. Daardoor werd het

oorspronkelijk dag/nachtregime vervroegd met 6 uur en 51 minuten. WN1 en WS1 worden

verder aangeduid als hybride 1 en hybride 2. Hybride 1 werd als knopvalongevoelig

beschouwd, terwijl hybride 2 als knopvalgevoelig werd aangegeven door de kweker. De

knopval na de donkerperiode werd elke dag opgevolgd. Naast de fluorescentieparameters en

discontinue fotosynthese- en transpiratiemetingen werden ook continue fotosynthese- en

transpiratiemetingen uitgevoerd. De planten kregen één keer per week water, zodat

droogtestress zeker geen invloed had op de resultaten.

Tijdens proef 2 werden tien Phalaenopsis hybriden ‘Purple Sensitive 1’ (PS1) en tien

hybriden ‘Red Lip Non-Sensitive 1’ (RLN1) aan dezelfde donker- en herstelperiode

onderworpen als tijdens proef 1. Het oorspronkelijk dag/nachtregime werd tijdens deze proef

met 5 uur en 54 minuten vervroegd. De volledige donkerperiode duurde 8u langer in

vergelijking met proef 1. PS1 en RLN1 worden verder aangeduid als hybride 3 en hybride 4.

Hybride 3 werd als knopvalgevoelig beschouwd, terwijl hybride 4 als knopvalongevoelig

werd aangegeven door de kweker.


20

3.3. Bloemen en knoppen

De evolutie van de bloemen en knoppen werd in kaart gebracht door ongeveer om de vijf

dagen het aantal bloemen, het aantal knoppen en hun knoplengte op te meten per

bloemstengel. De knoplengtes werden opgedeeld in negen klassen met gelijke intervallen

(Tabel 3.1). Tijdens de herstelperiode werd elke dag het aantal afgevallen knoppen geteld en

en werd de knoplengte ervan opgemeten, dit voor alle tien planten per hybride. In de praktijk

blijkt vooral de knopval in de grotere lengteklassen van commercieel belang te zijn. Microflor

deelt vandaar de knoppen in volgens subjectieve lengteklassen: grote knoppen, midden

knoppen en eindknoppen. De grote knoppen bevinden zich onderaan de stengel, volgend op

de eerste bloem. De eindknoppen zijn de laatste knoppen op de stengel en de midden knoppen

bevinden zich hiertussen. De subjectieve indeling werd in deze experimenten ook

meegenomen.

Tabel 3.1 - Verdeling van knoplengte in klassen.

Klasse Interval (cm)

1 [0,0-0,4]

2 ]0,4-0,8]

3 ]0,8-1,2]

4 ]1,2-1,6]

5 ]1,6-2,0]

6 ]2,0-2,4]

7 ]2,4-2,8]

8 ]2,8-3,2]

9 ]3,2-3,6]

3.4. Microklimaat

Tijdens de experimenten werd het microklimaat in de groeikamer continu opgemeten. De

PPFD werd opgemeten met een PAR sensor (LI-190 S, LI-COR Biosciences, Nebraska, VS),

de temperatuur door middel van een thermokoppel (T, Omega Engineering, Stamford, VS) en

de RH met een relatieve vochtigheidssensor (EE08, E+E Elektronik, Engerwitzdorf,

Oostenrijk). De sensoren waren gekoppeld aan een datalogger (34970A + 34901A, Agilent

Technologies, Diegem, België) die de data om de 20 seconden registreerde en wegschreef.

3.5. Continue bepaling van de CO2 en H2O uitwisseling

In proef 1 en 2 werd gebruik gemaakt van de LI-840 niet-dispersieve infrarood (IR) gas

analysator (LI-840 CO2/H2O Gas Analyzer, LI-COR Biosciences, Nebraska, VS) om de CO2

en H2O uitwisseling van de bladeren en bloemstengels continu op te volgen. De LI-840 IR gas

analysator is een open differentieel gasuitwisselingssysteem. Het systeem wordt ‘open’

genoemd omdat er continu verse lucht wordt aangezogen vanuit de omgeving en er dus geen

hergebruik van lucht plaatsvindt. De IR gas analysator bestaat uit een referentie- en

meetkamer. De concentratiemetingen zijn gebaseerd op de verschilratio in de IR absorptie


21

tussen het referentie- en meetsignaal, daarom wordt het een differentieel systeem genoemd.

De LI-840 IR gasanalysator heeft een meetbereik voor CO2 concentraties tussen 0 en 1000

ppm (µmol mol-1

) en voor H2O concentraties tussen 0 en 80 ppt (mmol mol-1

).

Vooraf werd bij een knopvalgevoelige en een knopvalongevoelige plant bepaald welke

stengel per plant het meest transpireerde. Voor beide hybriden werd de stengel die de meeste

transpiratie vertoonde, geselecteerd als meetstengel tijdens de donker- en herstelperiode. Per

hybride werd dus één bloemstengel opgemeten (Figuur 3.1A). Tijdens de proeven werd ook

telkens het tweede blad van de door de kweker aangegeven knopvalgevoelige hybride

opgemeten (Figuur 3.1B).

Figuur 3.1 – (A) Branchbag met een bloemstengel en (B) bladcuvette met een blad.

A

B


22

3.5.1 Meetprincipe

Lucht werd vanuit de omgeving aangezogen met behulp van een pompsysteem (N 035.1.2

AN.18, KNF Neuberger, Freiburg, Duitsland). De lucht kwam eerst terecht in een buffervat

(50 liter) om eventuele debietfluctuaties te minimaliseren. De luchtstroom werd opgesplitst en

gestuurd naar één bladcuvette (Figuur 3.1B), twee meetbranchbags en één

referentiebranchbag (Figuur 3.2). Het debiet van alle ingaande luchtstromen (behalve van de

referentiebranchbag) werd opgemeten met debietmeters (58605, Brooks Instrument, Hatfield,

VS). De branchbags werden gemaakt van plastiek zakken en werden rond een bloemstengel

vastgebonden en goed afgesloten met spanbandjes (Figuur 3.1A). Eén branchbag omsloot dus

de knoppen en bloemen van één stengel. Ventilatoren in de bladcuvette en branchbags

zorgden voor een homogeen luchtmengsel. De bladcuvette en branchbags werden verbonden

met een gasmultiplexer (Universiteit Gent, België). De luchtstroom die door de lege

branchbag (referentiebranchbag) ging, werd daarentegen verbonden met de gasmultiplexer en

met de referentiekamer van de IR gasanalysator (lijn 5 op Figuur 3.2). Door de werking van

de gasmultiplexer ontving de meetkamer van de IR gasanalysator achtereenvolgens lucht van

de bladcuvette van de gesuggereerde knopvalgevoelige soort (lijn 1 op Figuur 3.2), branchbag

1 met de meest transpirerende stengel van de gesuggereerde knopvalgevoelige soort (lijn 2 op

Figuur 3.2), branchbag 2 met de meest transpirerende stengel van de gesuggereerde

knopvalongevoelige soort (lijn 3 op Figuur 3.2) en de referentiebranchbag (lijn 4 op Figuur

3.2). Wanneer de referentielucht werd geanalyseerd door de meetkamer, kon deze vergeleken

worden met de referentielucht die door de referentiekamer werd opgemeten. Dit zorgde voor

een nulmeting waardoor eventuele afwijkingen konden gecorrigeerd worden. Om de 20

minuten werd er omgeschakeld tussen de verschillende metingen met behulp van de

gasmultiplexer. De meetresultaten werden om de 20 seconden opgeslagen op de datalogger

(34970A + 34901A, Agilent Technologies, Diegem, België). Bij de opstelling werd ervoor

gezorgd dat de lengte van de leidingen even lang waren, zodat de afstand die de lucht moest

afleggen geen invloed had op de meetresultaten.

Figuur 3.2 - Schematische voorstelling van het gasuitwisselingssysteem. De weg die het gas aflegt wordt weergegeven: lucht wordt aangezogen door een pomp en homogeen gemengd in een buffervat. De lucht gaat vervolgens naar een bladcuvette, twee meetbranchbags en een referentiebranchbag. Het debiet van de lucht wordt opgemeten met debietmeters. De bladcu-vette en branchbags worden verbonden met een gasmultiplexer. De luchtstroom die door de referentiebranchbag gaat, wordt verbonden met de gasmultiplexer en ook rechtstreeks met de referentiekamer van de infrarood gasanalysator (IRGA). Met behulp van het concentratieverschil tussen de meet- en referentiekamer worden de netto CO2 en netto H2O uitwisseling be-paald.


23

Omdat de multiplexer steeds wisselde tussen de bladcuvette en branchbags diende er zich tel-

kens een nieuw evenwicht in te stellen. Daarom werd voor de verdere dataverwerking steeds

gewerkt met het gemiddelde van de laatste drie metingen.

De netto CO2 en H2O uitwisselingssnelheid van het blad en de bloemstengels kunnen dan als

volgt worden bepaald:

𝑃𝑛 =∆𝐶𝑂2.𝐷

𝐴.𝑃

𝑅.𝑇.103

60 𝐸 =

∆𝐻2𝑂.𝐷

𝐴.𝑃

𝑅.𝑇.𝑀𝑀𝐻2𝑂 . 103

60

met

Pn: de netto CO2 uitwisselingssnelheid (µmol CO2 m-2

s-1

)

∆CO2: het CO2 concentratieverschil tussen de inkomende en uitgaande lucht in de

cuvette/branchbag (ppm)

D: het luchtdebiet doorheen de cuvette/branchbag (L min-1

)

A: de oppervlakte ingesloten in de cuvette/branchbag (m2)

P: de druk (atm)

R: de universele gasconstante (82,06 atm ml mol-1

K-1

)

T: luchttemperatuur (K)

103

60: eenheidsconversiefactor

E: de netto H2O uitwisselingssnelheid (mg H2O m-2

s-1

)

∆H2O: het H2O concentratieverschil tussen de inkomende en uitgaande lucht in de

cuvette/branchbag (ppt)

MMH2O: de molaire massa van H2O (18 g mol-1

)

De bladoppervlakte A in de bladcuvette werd bepaald door het blad over te tekenen op papier

en op te meten met een bladoppervlaktemeter (LI‐3000 + LI‐3050, LI‐COR Biosciences,

Nebraska, VS). Voor de oppervlakte van de bloemblaadjes werd een bloem van gemiddelde

grootte gekozen en werd analoog tewerk gegaan. Om de oppervlakte van een bloemknop en

bloemstengel te berekenen werden deze benaderd door respectievelijk een bol en een cilinder.

3.5.2 Kalibratie

Debietmeters

Voor de kalibratie van de debietmeters werden met behulp van een gasfles en een draagbare

laboratorium debietmeter (GTLK, Platon, Wemmel, België) luchtstromen met een

verschillend debiet (4 L min-1

, 6,1 L min-1

, 8,2 L min-1

en 10 L min-1

) doorheen de

debietmeters gestuurd. Na evenwicht werden de overeenkomstige spanningen afgelezen op de

datalogger. Om de kalibratievergelijking op te stellen, werden de afgelezen spanningssignalen

uitgezet ten opzichte van de overeenkomstige debieten (Tabel 3.2). Door een stroompanne op

DOY 318 (proef 1), werkten de debietmeters niet meer. Daarom werd in de dataverwerking

gewerkt met de gemiddelde debieten van DOY 315 tot 318.


24

Tabel 3.2 - De kalibratievergelijkingen van de debietmeters in het gasuitwisselingssysteem met het debiet (y, L min-1

) in functie van de afgelezen spanning (x, V).

Debietmeter Kalibratievergelijking Correlatiecoëfficiënt

1 y = 18,141x - 7,2601 0,9998

2 y = 17,626x - 7,0282 0,9997

3 y = 17,251x - 7,0137 0,9997

IR gas analysator

Ook de referentie- en meetkamer van de IR gas analysator werden op een dergelijke manier

gekalibreerd voor gebruik. Achtereenvolgens werd een gas (N2) met 0 ppm CO2 (zero) en 489

ppm CO2 (span) door de beide kamers gestuurd. Een kalibratie werd uitgevoerd door de

interne software.

De CO2 concentratie kan uit het spanningssignaal van de output berekend worden via

volgende formule:

𝐶𝑂2 = 𝑉 𝐶𝑟𝑎𝑛𝑔𝑒

𝑉𝑟𝑎𝑛𝑔𝑒

met V de geregistreerde spanning, Crange het maximum bereik voor CO2 en Vrange de maximum

output voor het geselecteerde bereik. In dit geval moet het gemeten spanningssignaal dus

vermenigvuldigd worden met 400.

De H2O concentratie wordt analoog bepaald met onderstaande formule:

𝐻2𝑂 = 𝑉 𝐻𝑟𝑎𝑛𝑔𝑒

𝑉𝑟𝑎𝑛𝑔𝑒

met Hrange het maximum bereik voor H2O. Het afgelezen spanningssignaal moet aldus

vermenigvuldigd worden met factor 32.

3.6. Discontinue bepaling van de CO2 en H2O uitwisseling

Met behulp van de LI-6400XT (LI-COR Biosciences, Nebraska, VS), afgebeeld in Figuur

3.3A, werden discontinu fotosynthesemetingen uitgevoerd. De principes zijn analoog aan het

gasuitwisselingssysteem met IR gasanalysator (sectie 3.5.1.), aangezien de LI-COR 6400XT

ook een open differentieel gasuitwisselingssysteem is. Het grote voordeel is echter de

automatisatie en compactheid bij de LI-6400. De gas analysators bevinden zich in het

sensorhoofdje, waardoor tijdsvertragingen door leidingen worden geëlimineerd en een snelle

respons van de bladeren kan worden waargenomen (LI-COR, 2004; Steppe, 2011).

Alle metingen werden uitgevoerd op het tweede blad geteld vanaf de apex, dit is het jongste

volledig ontwikkeld blad (Figuur 3.3B). Er werd gemeten in het midden van het blad op

voldoende afstand van de hoofdnerf. De bladeren van zes gesuggereerde gevoelige en zes

gesuggereerde niet-gevoelige planten per hybride werden opgemeten om vervolgens een

gemiddelde te nemen van zes waarden. Tijdens de donkerperiode werden de planten elke dag

opgemeten, achtereenvolgens een gevoelige en een niet-gevoelige hybride. Tijdens de

herstelperiode werden de planten zowel in het licht als in het donker opgemeten. De 12


25

planten werden over twee dagen opgemeten, waardoor de parameters van twee dagen werden

samengenomen voor de berekeningen.

De ingestelde parameters tijdens de metingen worden weergegeven in Tabel 3.3. De

instroomsnelheid van verse lucht werd vrij laag gehouden omdat de CO2

uitwisselingssnelheid van orchideeën gering is (Pollet, 2010). Voor elke meting werd

‘gematcht’ om afwijkingen tussen de meet- en referentieanalysators te vermijden. Tijdens het

‘matchen’ wordt hetzelfde gas door de meet- en referentiekamer gestuurd en worden de

gemeten CO2 en H2O waarden van beide cellen aan elkaar gelijkgesteld. Dit verhoogt de

accuraatheid van de metingen, zeker bij lage fotosynthesesnelheden.

Tabel 3.3 - Instelling van de parameters in de LI-COR 6400XT.

Parameter Instelling

Oppervlakte bladcuvette 2 cm²

Instroomsnelheid van verse lucht 200 µmol s-1

Referentieconcentratie CO2 400 ppm

Bloktemperatuur 25 °C

Stomatale ratio 0 (stomata slechts aan één zijde)

Optimum measurement intensity 1,5

Optimum flash intensity 10

3.7. Chlorofyl-a fluorescentieparameters

Met de LI-6400XT kunnen naast fotosynthese- ook fluorescentiemetingen worden uitgevoerd.

De Leaf Chamber Fluorometer van de LI-6400XT bevat een LED gebaseerde lichtbron en

twee detectoren om fluorescentie te meten. De metingen werden simultaan met de

fotosynthesemetingen uitgevoerd op dezelfde planten en bladeren.

Het gebruik van chlorofyl-a fluorescentiemetingen is momenteel een veel gebruikte niet-

destructieve methode om de fotosynthetische status en stress in planten te onderzoeken. Dit is

te wijten aan de ontwikkeling van relaties tussen fluorescentieparameters en fotosynthetisch

elektronentransport en aan de beschikbaarheid van een reeks draagbare en betaalbare

fluorometers (Baker, 2008).

B A

Figuur 3.3 - (A) De LI-6400XT en (B) het sensorhoofdje op het tweede blad geteld vanaf de apex.


26

3.7.1 Theoretische achtergrond

3.7.1.1 Principe van fluorescentie

De lichtreacties van de fotosynthese vinden plaats in de thylakoidmembranen van de

chloroplasten. Tijdens de lichtreacties wordt via de elektronentransportketen lichtenergie

omgezet in chemische energie die gebruikt wordt tijdens de donkerreacties om CO2 vast te

leggen in suikers. In de thylakoidmembranen bevinden zich fotosystemen (PS) die bestaan uit

een kerncomplex met een reactiecentrum en een LHC. Het LHC bestaat uit verschillende

pigmenten die lichtenergie absorberen en doorgeven aan een doelwitpigment in het

reactiecentrum (Figuur 3.4). In dit reactiecentrum vindt de uiteindelijke omzetting van

lichtenergie naar chemische energie plaats.

Er wordt onderscheidt gemaakt tussen fotosysteem II (PS II) dat voornamelijk licht absorbeert

bij 700 nm en fotosysteem I (PS I) dat voornamelijk licht absorbeert bij 680 nm. Via

elektronentransport van PS II naar PS I worden ATP en de gereduceerde vorm van

nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADPH) gevormd die dan aangewend worden in

de donkerreacties.

Figuur 3.4 - De transfer van elektronen (e-) en protonen (H

+) in het thylakoidmembraan. Water (H20) wordt geoxideerd

en protonen worden vrijgesteld in het lumen door PS II. PS I reduceert nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat

(NADP+) tot NADPH in het stroma via ferredoxine (Fd) en het flavoproteïne ferredoxine-NADP reductase (FNR). Protonen

worden ook getransporteerd in het lumen door de actie van het cytochroom b6f complex. Deze protonen dragen bij tot de opbouw van de elektrochemische protongradiënt. De protonen moeten dan diffuseren door het adenosinetrifosfaat (ATP) synthase enzyme waarbij ATP in het stroma wordt gevormd. Gereduceerd plastoquinon (PQH2) en plastocyanine (PC) zorgen respectievelijk voor de transfer van elektronen naar cytochroom b6f en PS I. Gestippelde lijnen verwijzen naar de transfer van elektronen, volle lijnen naar de beweging van protonen (aangepast uit: Taiz & Zeiger, 2006).

Lichtenergie dat geabsorbeerd wordt door chlorofylmoleculen kan drie reacties ondergaan: (1)

het kan gebruikt worden om fotosynthese aan te drijven via de elektronentransportketen

(fotochemie), (2) overmatige energie kan gedissipeerd worden als warmte of (3) de

overmatige energie kan heruitgezonden worden als licht (chlorofyl fluorescentie). Deze drie

processen (Figuur 3.5) staan in competitie met elkaar, zodanig dat een stijging in de

efficiëntie van het ene, resulteert in een daling in de efficiënte van de andere twee processen.

Dus door het meten van de chlorofyl fluorescentie kan informatie gewonnen worden over de

efficiëntie van fotochemie en warmteverlies. Ondanks dat de totale hoeveelheid chlorofyl

fluorescentie klein is (slechts 1 tot 2% van de geabsorbeerde straling) zijn de metingen vrij

eenvoudig. Het spectrum van de fluorescentie is verschillend dan dat van het geabsorbeerde


27

licht. Fluorescentie straling heeft namelijk een langere golflengte dan die van de

geabsorbeerde straling. Bijgevolg kan fluorescentie gekwantificeerd worden door een blad

bloot te stellen aan licht met een gekende golflengte en de hoeveelheid terug uitgestraald licht

met een langere golflengte op te meten (Maxwell & Johnson, 2000; Steppe, 2011).

Figuur 3.5 - De verschillende energetische pathways die een geabsorbeerd foton kan volgen: elektronentransportketen, warmte en fluorescentie (aangepast uit: LI-COR, 2004).

3.7.1.2 Chlorofyl-a fluorescentie quenching

Chlorofyl-a fluorescentie quenching betekent onderdrukking van de uitgezonden fluorescentie

straling, de excitatie-energie wordt dus onbeschikbaar voor fluorescentie. Bij fysiologische

temperaturen wordt 90% van de fluorescentie uitgezonden door chlorofylmoleculen in PS II.

Daarom wordt quenching gelinkt aan de status en de efficiëntie van de reactiecentra van PS II.

Een reactiecentrum wordt geöxideerd of ‘open’ genoemd wanneer de primaire

elektronenacceptor nieuwe elektronen kan accepteren voor gebruik in de

elektronentransportketen. Wanneer een reactiecentrum gereduceerd of ‘gesloten’ is, kan het

geen elektronen accepteren en moet de ongebruikte excitatie-energie op een andere manier

verwijderd worden. Quenching wordt opgesplitst in fotochemische (qP) en niet-

fotochemische quenching (NPQ). Zolang het reactiecentrum van PS II open is en elektronen

kan doorgeven naar PS I, wordt er van qP gesproken. qP zal maximaal zijn wanneer het blad

enkele minuten in het donker wordt gehouden. Deze donkerperiode zorgt voor volledige

oxidatie van alle elektronenacceptors waardoor alle reactiecentra van PS II open zullen zijn.

qP daalt wanneer planten stress hebben (hitte, koude, droogte, herbiciden). Het

elektronentransport wordt door deze stressfactoren geblokkeerd en de fluorescentie straling

neemt toe (Maxwell and Johnson, 2000; LI-COR, 2004; Baker, 2008; Steppe, 2011).

Efficiënte quenching van geëxciteerde energie is noodzakelijk om het fotosynthese apparaat te

beschermen. Indien fotosynthese om een bepaalde reden niet doorgaat, verlengt de levensduur

van de excitatie en kan er schade aan het fotosynthese apparaat ontstaan (Laisk & Oja, 1998).

3.7.1.3 ‘Saturation Pulse Method’

Door gebruik te maken van verzadigde lichtpulsen kan een scheiding van de twee quenching

mechanismen qP en NPQ mogelijk worden gemaakt.

De ‘saturation pulse method’ maakt gebruik van vier lichtbronnen die elk een kwantitatief en

kwalitatief verschillende lichtstraling uitzenden.


28

De eerste lichtbron produceert een meetlicht met een zeer lage intensiteit zodat geen

fotosynthese plaatsvindt, maar wel fluorescentie wordt opgewekt. De tweede lichtbron zendt

actinische straling uit voor het aandrijven van de fotosynthese. De derde lichtbron sluit alle

reactiecentra van PS II door verzadigde lichtpulsen met zeer hoge intensiteit te produceren.

Door de vierde lichtbron wordt PS I geactiveerd met verrood licht zodat de reactiecentra van

PS II snel kunnen openen.

De fluorescentieparameters tijdens de experimenten worden opgemeten wanneer het blad

gedurende 20 minuten is geadapteerd aan het donker. Dit gebeurt door de bladcuvette op het

blad te plaatsen terwijl alle lichtbronnen uitgeschakeld zijn. De primaire electronenacceptor

(QA) is dan maximaal geoxideerd en de reactiecentra van PS II zijn open. Vervolgens wordt

het donkergeadapteerd blad blootgesteld aan een zwak gemoduleerd meetlicht (ongeveer 0,1

μmol m-2

s-1

). Door de zeer lage intensiteit van het meetlicht vinden geen fotochemische

reacties plaats. Alle reactiecentra zijn dus open en qP is maximaal (qP=1). Dit resulteert in het

minimaal fluorescentieniveau F0. Daarna wordt het blad blootgesteld aan een korte actinische

puls met een hoge lichtintensiteit (> 1500 µmol m-2

s-1

). QA zal nu volledig gereduceerd zijn

en er vindt geen fotochemie plaats (qP=0). Het maximaal fluorescentieniveau Fm wordt

bereikt. Het verschil tussen Fm en F0 wordt het variabel fluorescentieniveau Fv genoemd.

Vervolgens wordt bovenop het meetlicht ook het actinisch licht aangeschakeld zodat de

fotosynthese kan doorgaan, samen met herhaaldelijke korte verzadigingspulsen. Hierdoor kan

het ‘steady-state’ fluorescentieniveau F en het maximaal fluorescentieniveau in de licht-

geadapteerde fase Fm’ worden opgemeten. Wanneer het actinisch licht wordt uitgeschakeld en

het verrood licht wordt aangezet, worden de reactiecentra van PS II geforceerd om te openen,

hierdoor kan het minimaal fluorescentieniveau in het licht-geadapteerde blad worden

berekend F0’. In Figuur 3.6 worden de ‘saturation pulse method’ en de

fluorescentieparameters schematisch voorgesteld.

Figuur 3.6 - Verloop van de fluorescentiemeting. Op donker-geadapteerde bladeren wordt het minimaal en maximaal fluo-rescentieniveau F0 en Fm gemeten. Op licht-geadapteerde bladeren wordt het ‘steady-state’ fluorescentieniveau F, het maximaal fluorescentieniveau Fm

’ en het minimaal fluorescentieniveau F0’ opgemeten. Een naar boven gerichte, rechte pijl

staat voor het gemoduleerd meetlicht en een naar boven gerichte, kronkelende pijl staat voor een verzadigingspuls. De naar beneden gerichte pijl staat voor het uitschakelen van het actinisch licht (aangepast uit: LI-COR, 2004).


29

Uit deze basisparameters kunnen verschillende fluorescentieparameters berekend worden, elk

met een specifieke fysiologische betekenis. Hieronder worden de relevante

fluorescentieparameters voor dit onderzoek opgesomd (Maxwell and Johnson, 2000; LI-COR,

2004; Roháček, 2002; Baker 2008; Steppe, 2011).

Fv/Fm wordt gebruikt om de maximale efficiëntie van de fotochemische reacties in PS II te

schatten. Wanneer planten abiotische of biotische stress ondervinden wordt vaak een daling in

Fv/Fm waargenomen. Vandaar wordt deze parameter gebruikt als een simpele en snelle manier

om stress te monitoren (Baker, 2008). Waarden voor Fv/Fm tussen 0,74 en 0,85 wijzen op niet-

gestresseerde planten (Lichtenthaler et al., 2005).

𝐹𝑣𝐹𝑚

=𝐹𝑚 − 𝐹0

𝐹𝑚

NPQ varieert tussen 0 en 1 en geeft de mate van onderdrukking van fluorescentie door

warmteverlies weer.

𝑁𝑃𝑄 =𝐹𝑚 − 𝐹𝑚

′

𝐹𝑚′

qP is een maat voor de onderdrukking van fluorescentie door fotosynthese en varieert

eveneens tussen 0 en 1. qP geeft een indicatie voor de hoeveelheid open reactiecentra in PS II.

𝑞𝑃 =𝐹𝑚′ − 𝐹′

𝐹𝑚′ − 𝐹0

De maximale efficiëntie van PS II in het lichtgeadapteerde blad (Fv’/Fm

’) is de efficiëntie

wanneer alle reactiecentra van PS II open zijn. De factor geeft een schatting van de fractie van

de PS II maximum efficiëntie die gerealiseerd is.

𝐹𝑣′

𝐹𝑚′=𝐹𝑚′ − 𝐹0

𝐹𝑚′

De actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II (Fq’/Fm

’) is een maat voor de

proportie van het licht geabsorbeerd door chlorofylmoleculen in PS II die gebruikt wordt voor

fotochemie. Fq’ is het verschil tussen Fm

’ en F

’.

𝐹𝑞′

𝐹𝑚′=𝐹𝑣′

𝐹𝑚′. 𝑞𝑃 =

𝐹𝑚′ − 𝐹

𝐹𝑚′

De elektronen transportsnelheid (ETR) is de actuele flux aan fotonen die PS II aandrijven, met

Ablad het aandeel van het invallende licht (PPFD) dat geabsorbeerd wordt door de bladeren en

0,5 de fractie aan PS II.

𝐸𝑇𝑅 =𝐹𝑞′

𝐹𝑚′.𝐴𝑏𝑙𝑎𝑑 .𝑃𝐴𝑅. 0,5


30

3.8. Statistische analyse

De statistische verwerking werd uitgevoerd in S-PLUS (v8.2, Insightful Corporation,

California, USA) via een ANOVA-analyse (Fixed Effects). Er werd geopteerd voor een

Tuckey aanpassing met een 5% significantieniveau (p < 0,05) om te zien welke opgemeten

parameters significant verschillend waren tussen de vier hybriden.

Hoofdstuk 4

Resultaten

Resultaten

31

4.1. Microklimaat

Alle metingen werden uitgevoerd in een groeikamer onder gecontroleerde omstandigheden

(Tabel 4.1). In Figuur 4.1 wordt het verloop van de luchttemperatuur, de RH, het lichtregime

en het VPD voor beide proeven weergegeven. De herhaalde pieken in de temperatuur (Figuur

4.1A, C) zijn te wijten aan een probleem met de koelinstallatie in de groeikamer. Uit deze

gegevens wordt geconcludeerd dat het microklimaat tijdens beide proeven gelijkaardig was en

dat variaties in lichtintensiteit, temperatuur en RH van minimale invloed waren op de

metingen. Hierdoor kunnen dus de resultaten van de vier hybriden met elkaar worden

vergeleken.

Tabel 4.1 – Microklimaat: photosynthetic photon flux density (PPFD), temperatuur (T), relatieve vochtigheid (RH) en wa-terdampdrukdeficiet (VPD) in de groeikamer tijdens proef 1 en 2.

PPFD T RH VPD

(µmol m-2

s-1

) (°C) (%) (kPa)

Proef 1 Donkerperiode 0 21.11 48.50 1.30

Herstelperiode 84.01 (licht) 22.33 45.71 1.46

Proef 2 Donkerperiode 0 19.11 44.12 1.06

Herstelperiode 93.49 (licht) 20.03 41.44 1.17

Figuur 4.1 – Verloop van de temperatuur (T) (zwarte lijn) en de relatieve vochtigheid (RH) (grijze lijn) tijdens proef 1 (A) en proef 2 (C) en het waterdampdrukdeficiet (VPD) tijdens proef 1 (B) en proef 2 (D). De zwarte blokken duiden de don-kerperiode aan (DOY = Dag van het jaar).

Resultaten

32

4.2. Knopval

In Figuur 4.2A worden voor de vier hybriden het gemiddeld aantal knoppen per lengteklasse

getoond. Hieruit blijkt dat hybride 2 het minst aantal knoppen bezat en hybride 3 het meest. In

Figuur 4.2B wordt voor elke hybride het relatief gemiddeld aantal afgevallen knoppen per

lengteklasse weergegeven relatief ten opzichte van het aantal oorspronkelijke knoppen. Enkel

knoppen kleiner dan 2,0 cm verkleurden en vielen af, de grotere knoppen konden zich verder

ontwikkelen. Voor hybride 3 viel ook 50% van de knoppen af in de klasse ]2,0 – 2,4] cm. Dit

was echter slechts één knop van 2,1 cm groot, waardoor algemeen kan gesteld worden dat er

geen knopval boven de 2,0 cm plaatsvond. De meeste knopval vond bij de vier hybriden

plaats in de lengteklasse ]0,4 – 0,8] cm. Uit observaties (data niet getoond) bleek er geen trend

te zijn in de knopval van eerst grotere knoppen en dan kleinere of omgekeerd. In Figuur 4.2C

wordt het relatief gemiddeld aantal afgevallen knoppen per subjectieve lengteklasse getoond,

zoals in de praktijk bij het bedrijf Microflor wordt toegepast. Hieruit blijkt dat hybride 2 en 4

procentueel meer eindknoppen ten opzichte van de andere knoppen verloren. Hybride 3

verloor de meeste grotere knoppen. Indien deze classificatie wordt toegepast om de

knopvalgevoeligheid te bepalen, zal hybride 3 dus als de meest gevoelige soort naar voor

komen. In Figuur 4.2D wordt per dag na de donkerperiode getoond hoeveel knoppen er

gemiddeld cummulatief afvielen van het totaal aantal knoppen per plant. Het procentueel

aandeel knoppen dat afviel na de donkerperiode lag bij alle hybriden rond dezelfde grootte-

orde (gemiddeld 47,60%). Hybride 4 was het meest gevoelig aan knopval na een

donkerperiode van vijf dagen (57,31%), gevolgd door hybride 3 (47,51%). Hybride 2

(42,86%) en hybride 1 (42,54%) waren het minst gevoelig. De knopval bij hybride 1 verliep

sigmoïdaal, met een plotse knopval tussen dag zeven en dag tien. De knopval bij de andere

hybriden verliep geleidelijker aan. De knoppen van hybriden 2, 3 en 4 vielen geleidelijk af na

één of twee dagen na de donkerperiode. De knopval stagneerde bij alle hybriden tussen 10 en

12 dagen na de donkerperiode. De tamelijk grote standaardafwijkingen wijzen op een grote

variabiliteit tussen de planten van één hybride. Sommige planten verloren helemaal geen

knoppen, terwijl andere planten van dezelfde hybride bijna al hun knoppen verloren.

Resultaten

33

4.3. Fluorescentieparameters

Figuur 4.3 toont per dag de gemiddelde fluorescentieparameters voor zes opgemeten planten

per hybride. Dag 0 stelt de controledag voor, dag 1 tot 5 de donkerperiode en dag 6 tot 19 de

herstelperiode. In Figuur 4.4 wordt de gemiddelde waarde en standaardafwijking van de

fluorescentieparameters voor de donker- en herstelperiode per hybride weergegeven. Wanneer

de letters boven de balken verschillend zijn voor de verschillende hybriden duidt dit op een

significant verschil (p < 0,05).

Algemeen wordt uit de resultaten afgeleid dat voor alle hybriden Fv/Fm, Fv’/Fm

’, Fq

’/Fm

’, qP en

ETR toenamen en dat NPQ daalde in de donkerperiode. Echter, naarmate de donkerperiode

vorderde, daalden Fv’/Fm

’, Fq

’/Fm

’, qP en steeg ETR. Wanneer de planten opnieuw werden

blootgesteld aan een normaal dag/nachtregime namen de fluorescentieparameters

onmiddellijk ongeveer dezelfde waarde aan als op de controledag. Het aanpassingsvermogen

van de vier hybriden was dus groot.

Figuur 4.2 - (A) Het gemiddeld aantal knoppen per lengteklasse na de donkerperiode voor 10 planten per hybride (n=10), (B) Het gemiddeld (n=10) aantal afgevallen knoppen t.o.v. het oorspronkelijk aantal knoppen per lengteklasse, (C) Het gemiddeld (n=10) aantal afgevallen knoppen t.o.v. het oorspronkelijk aantal knoppen per subjectieve lengteklasse en (D) Het cummulatief gemiddeld aantal afgevallen knoppen relatief t.o.v. het oorspronkelijk aantal knoppen in de tijd. Op het einde van de herstelperiode wordt voor hybride 1 (H1), hybride 2 (H2), hybride 3 (H3) en hybride 4 (H4) de gemiddelde procentuele knopval t.o.v. het totaal aantal knoppen weergegeven.

Resultaten

34

Figuur 4.3 - Tijdsverloop van de gemiddelde fluorescentieparameters berekend voor zes planten (n=6) per hybride in de donker- en herstelperiode (enkel ’s nachts): (A) Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de donker-geadapteerde fase (Fv/Fm), (B) Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de licht-geadapteerde fase (Fv

’/Fm

’), (C) Actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II (Fq

’/Fm

’), (D) Fotochemi-

sche quenching (qP), (E) Niet-fotochemische quenching (NPQ) en (F) Elektronentransportsnelheid (ETR). De zwarte blokken geven de donkerperiode weer.

Resultaten

35

Figuur 4.4 - De gemiddelde waarde en standaardafwijking van de fluorescentieparameters tijdens de donker- (zwarte balk) en herstelperiode (grijze balk) voor zes planten (n=6) per hybride: (A) Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de donker-geadapteerde fase (Fv/Fm), (B) Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de licht-geadapteerde fase (Fv

’/Fm

’), (C) Actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II (Fq

’/Fm

’), (D) Fotochemische quen-

ching (qP), (E) Niet-fotochemische quenching (NPQ) en (F) Elektronentransportsnelheid (ETR). Wanneer twee parameters significant verschillend zijn, worden ze aangeduid met een verschillende letter (Tuckey, p < 0,05); kleine letters worden ge-bruikt voor de donkerperiode en hoofdletters voor de herstelperiode.

Resultaten

36

Uit Figuur 4.3A wordt afgeleid dat Fv/Fm voor alle hybriden relatief constant bleef gedurende

de hele proef, de waarde lag tussen de 0,81 en 0,82. Er werd een lichte stijging waargenomen

op het einde van de donkerperiode. Figuur 4.4A toont dat Fv/Fm significant verschillend was

tussen hybride 3 en de andere hybriden in de donkerperiode. Dit was de tweede meest

gevoelige hybride. Tijdens de herstelperiode was Fv/Fm van hybride 3 significant verschillend

met hybride 4. Dit waren de hybriden met de meeste waargenomen knopval.

Uit het verloop van Fv’/Fm

’ blijkt dat hybride 1 en 2 (minst knopval) een hogere waarde voor

Fv’/Fm

’ bezaten tijdens de donker- en herstelperiode (Figuur 4.3B). Dit wordt bevestigd in

Figuur 4.4B. Fv’/Fm

’ was namelijk zowel in de donker- als de herstelperiode gemiddeld het

hoogst voor de minst knopvalgevoelige hybriden (hybride 1 en 2) en het laagst voor de meest

knopvalgevoelige hybriden (hybride 3 en 4). Fv’/Fm

’ nam tijdens de donkerperiode geleidelijk

aan af (Figuur 4.3B), wat wil zeggen dat de maximale efficiëntie van de fotochemische

reacties van PS II daalde wanneer de donkerperiode langer aanhield. Voor hybride 4 (meest

gevoelig) was deze daling meer uitgesproken. Fv’/Fm

’ van hybride 2 was significant

verschillend met de andere hybriden in de donkerperiode (Figuur 4.4B). Dit was de hybride

met het tweede minst knopval. Fv’/Fm

’ van hybride 3 (tweede meest knopval) was ook

significant verschillend met hybride 1 (minst knopval) in de donkerperiode. In de

herstelperiode was Fv’/Fm

’ van hybride 1 en 2 (minst knopval) significant verschillend met

hybride 3 en 4 (meest knopval).

Het verloop van Fq’/Fm

’ van hybride 1 en 2 (minst gevoelig) was hoger dan van hybride 3 en

4, zowel tijdens de donker- als herstelperiode (Figuur 4.3C). Fq’/Fm

’ was ook gemiddeld hoger

voor hybride 1 en 2, zowel in de donker- als herstelperiode (Figuur 4.4C). Fq’/Fm

’ daalde

naarmate de donkerperiode langer duurde (Figuur 4.3C), wat wijst op een daling van de

actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II. Net zoals bij Fv’/Fm

’ was deze

daling meer uitgesproken voor hybride 4 (meest gevoelig). Fq’/Fm

’ van alle hybriden waren

significant verschillend in de donker- en herstelperiode, met uitzondering van hybride 3 en 4

die onderling niet significant verschilden (Figuur 4.4C). In de donkerperiode was Fq’/Fm

’ van

hybride 4 (meest knopval) ook significant verschillend met hybride 1 (minst knopval).

Het verloop van qP van hybride 1 en 2 (minst knopval) was tijdens de donkerperiode hoger,

met andere woorden het aandeel open reactiecentra was bij deze hybriden dus groter (Figuur

4.3D). Dit wordt bevestigd in Figuur 4.4D, de gemiddelde qP van hybride 1 en 2 was in de

donkerperiode hoger dan qP van hybride 3 en 4. Bovendien had hybride 4 (meest knopval)

gemiddeld de laagste qP, zowel in de donker- als de herstelperiode. Ook hier wordt

waargenomen dat qP daalde naarmate de donkerperiode vorderde en dat deze daling meer

uitgesproken was voor hybride 4 (meest gevoelig) (Figuur 4.3D). qP van hybride 4 (meest

knopval) was significant verschillend met de andere hybriden in de donkerperiode. qP van

hybride 2 (tweede minst knopval) was significant verschillend met de andere hybriden in de

herstelperiode (Figuur 4.4D).

Het verloop van NPQ (Figuur 4.3E) en de gemiddelde NPQ (Figuur 4.4E) waren beide lager

voor hybride 1 en 2 (minst knopval) in vergelijking met hybride 3 en 4 (meest knopval),

zowel tijdens de donker- als herstelperiode. De minder gevoelige hybriden onderdrukten de

fluorescente straling dus minder via warmteverlies. NPQ nam toe naarmate de donkerperiode

langer duurde, het aandeel fluorescente straling dat onderdrukt werd via warmteverlies steeg

Resultaten

37

dus. Deze stijging was het grootst bij hybride 4 (meest gevoelig) (Figuur 4.3E). Uit Figuur

4.4E wordt afgeleid dat NPQ van hybride 2 (tweede minst knopval) in de donkerperiode

significant verschillend was met NPQ van de andere hybriden. NPQ in de herstelperiode was

gemiddeld het hoogst voor de meest knopvalgevoelige hybride (hybride 4) en het laagst voor

de minst knopvalgevoelige hybride (hybride 1). NPQ was significant verschillend in de

herstelperiode tussen hybride 1 (minst knopval) en de andere hybriden. NPQ van hybride 4

(meest knopval) was ook significant verschillend met NPQ van hybride 2 (tweede minst

knopval) en 3 (tweede meest knopval) (Figuur 4.3E).

Uit Figuur 4.3F en 4.4F wordt afgeleid dat zowel het verloop als het gemiddelde van ETR in

de donker- en herstelperiode hoger was voor hybride 1 en 2 (minst gevoelig). Deze hybriden

hadden dus een grotere actuele fotonenflux die PS II aandreef. ETR van hybride 2 (tweede

minst knopval) was zowel in de donker- als herstelperiode significant verschillend met ETR

van de andere hybriden (Figuur 4.4F).

4.4. Fotosynthese en transpiratie

4.4.1 Bladeren

4.4.1.1 Discontinue metingen van fotosynthese, transpiratie en stomatale

geleidbaarheid

Figuur 4.5 toont de gemiddelde (n=6) netto-fotosynthesesnelheid, transpiratiesnelheid en

stomatale geleidbaarheid voor het blad van de vier hybriden. Dag 0 stelt de controledag voor,

dag 1 tot 5 de donkerperiode en dag 6 tot 19 de herstelperiode. De netto-fotosynthesesnelheid

werd negatief gedurende de hele donkerperiode in tegenstelling tot wat verwacht wordt van

CAM planten. De bladeren respireerden dus continu gedurende de donkerperiode, wat duidt

op stress. Ook de transpiratiesnelheid daalde tijdens de donkerperiode, de stomata waren dus

meer gesloten. Wanneer de planten opnieuw blootgesteld werden aan een dag/nachtregime,

herstelden ze zich. Er werd opnieuw een CAM patroon waargenomen: CO2 fixatie in het

donker (stomata open) en respiratie tijdens het licht (stomata dicht). De transpiratiesnelheid

was eveneens hoger gedurende de nachten in de herstelperiode, maar werd niet 0 tijdens het

licht. De stomata waren dus niet volledig gesloten (ook te zien in de stomatale

geleidbaarheid). Hybriden 3 en 4 (Figuur 4.5C, D) herstelden het traagst na de donkerperiode

(meest gevoelige hybriden) en hybride 1 en 2 herstelden het snelst (minst gevoelige). De CO2

fixatie, transpiratiesnelheid en stomatale geleidbaarheid daalden in het donker tijdens de

herstelperiode voor alle hybriden rond dag 10. Dit valt samen met de meeste knopval. De

respiratie bij hybride 1 (Figuur 4.5A) steeg op dag 5 van de donkerperiode (meer stress), de

stomatale geleidbaarheid was dan ook 0. Uit Figuur 4.5B wordt geconcludeerd dat de

respiratie van hybride 2 tijdens de donkerperiode afnam tot dag 3 en daarna toenam van dag 4

tot 5. Vanaf dag 4 werd de stomatale geleidbaarheid bovendien 0, de stomata waren dus

volledig gesloten. Bij hybride 3 (Figuur 4.5C) steeg de respiratie vanaf dag 3 en was de

stomatale geleidbaarheid reeds van dag 1 min of meer nul. Uit Figuur 4.5D wordt afgeleid dat

hybride 4 verschillend reageerde dan de andere hybriden. De respiratie tijdens de

donkerperiode vertoonde een zigzagpatroon, waarbij de stomatale geleidbaarheid rond nul

fluctueerde. Hybride 1, 2 en 3 vertoonden de eerste drie dagen in de donkerperiode een

toename in de transpiratiesnelheid (Figuur 4.5A-C). Op dag 4 of 5 van de donkerperiode

Resultaten

38

daalde de transpiratiesnelheid weer (stomata sloten volledig). Hybride 4 vertoonde opnieuw

een zigzagpatroon in de transpiratiesnelheid tijdens de donkerperiode (Figuur 4.5D).

Uit alle grafieken blijkt dat de stomatale geleidbaarheid het transpiratiepatroon verklaarde. Dit

blijkt ook uit Figuur 4.6. De transpiratiesnelheid volgde zowel tijdens proef 1 (4.6A) als

tijdens proef 2 (4.6B) het VPD patroon niet en werd dus stomataal geregeld.

Figuur 4.7A toont de gemiddelde (n=6) netto-fotosynthesesnelheid in de donker- en

herstelperiode voor de vier hybriden en Figuur 4.7B de gemiddelde transpiratiesnelheid. De

netto-fotosynthesesnelheid was niet significant verschillend tussen de vier hybriden. In de

donkerperiode was de transpiratiesnelheid van hybride 1 (minst knopval) significant

verschillend met de andere hybriden. De transpiratiesnelheid van hybride 1 was bovendien het

hoogst tijdens de donkerperiode en was lager voor de knopvalgevoelige soorten (hybride 3 en

4). De transpiratiesnelheid in de herstelperiode was enkel significant verschillend tussen

hybride 2 (tweede minst knopval) en 4 (meest knopval).

Figuur 4.5 – Gemiddelde netto-fotosynthesesnelheid, transpiratiesnelheid en stomatale geleidbaarheid (n=6) voor de bladeren van hybride 1 (A), hybride 2 (B), hybride 3 (C) en hybride 4 (D) tijdens de donker- en herstelperiode. De zwarte blokken tonen de donkerperiode aan en de grijze blokken de periode met de meeste knopval.

Resultaten

39

4.4.1.2 Continue metingen van fotosynthese en transpiratie

Figuur 4.8 toont de netto-fotosynthesesnelheid, transpiratiesnelheid en het VPD voor het blad

van hybride 2 (Figuur 4.8A) en hybride 3 (Figuur 4.8C). Figuur 4.8B en D tonen een detail

van de overgang van de donkerperiode naar de herstelperiode voor hybride 2 en 3. Tijdens het

uitvoeren van de discontinue metingen steeg de CO2 concentratie telkens wanneer een

persoon in de groeikamer ging vanwege zijn ademhaling. Hierdoor waren de

omgevingscondities niet meer stabiel voor de continue fotosynthese- en transpiratiemetingen.

De ruis op de data werd beperkt door alle waarden bij verhoogde CO2 concentraties weg te

filteren (referentie CO2 concentratie hoger dan 600 ppm). Uit Figuur 4.8B en D is duidelijk af

te leiden dat het blad continu respireerde en in beperkte mate transpireerde in de

donkerperiode. Tijdens de herstelperiode is de netto-fotosynthesesnelheid en

transpiratiesnelheid ’s nachts hoger dan overdag. Dit wijst erop dat de stomata in de bladeren

’s nachts open staan en dat ze terug aan CO2 fixatie doen in het donker (CAM). Net zoals bij

de discontinue metingen (Figuur 4.5C) werd waargenomen dat de fotosynthese en transpiratie

zich minder snel herstelden na de donkerperiode bij hybride 3.

Figuur 4.6 – Gemiddelde transpiratiesnelheid (n=6) van de bladeren tijdens de donker- en herstelperiode en het waterdampdrukdeficiet (VPD) voor proef 1 (A) en proef 2 (B).

Figuur 4.7 – Gemiddelde netto-fotosynthesesnelheid (n=6) in de donker- en herstelperiode voor de bladeren van de vier hybriden en (B) gemiddelde (n=6) transpiratiesnelheid in de donker- en herstelperiode voor de vier hybriden. Wanneer twee parameters significant verschillend zijn, worden ze aangeduid met een verschillende letter (Tuckey, p < 0,05); kleine letters worden gebruikt voor de donkerperiode en hoofdletters voor de herstelperiode.

Resultaten

40

4.4.2 Bloemstengels

De bloemstengels respireerden continu tijdens de hele meetperiode (Figuur 4.9A-D). Tijdens

de donkerperiode was er geen dag/nachtpatroon waar te nemen. Uit de detailfiguren (Figuur

4.9E-H) blijkt dat in de herstelperiode de respiratie ’s nachts toenam en overdag afnam. Dit

kan verklaard worden doordat de bloemen en stengels in het licht een beetje aan fotosynthese

deden, waardoor de totale respiratie kleiner werd overdag.

Figuur 4.10A-D tonen respectievelijk het continu verloop van de transpiratiesnelheid en het

VPD van hybride 1, 2, 3 en 4. In Figuur 4.10E-H wordt een detail weergegeven van de

donkerperiode. De daling in de transpiratiesnelheid bij hybride 1 en 2 (Figuur 4.10A, B) op

DOY 326 wordt verklaard doordat de bladcuvette werd aangespannen om ze meer luchtdicht

te maken. De transpiratiesnelheid was continu positief en volgde het VPD, wat erop wijst dat

de stomata van de bloemen altijd open waren, zowel in de donker- als herstelperiode. De

pieken in de transpiratiesnelheid worden verklaard door de pieken in het VPD voor de vier

hybriden. De stomata van de bloemen van deze hybriden zijn dus niet-functioneel aangezien

de stomata niet openen en sluiten. Uit de detailfiguren (Figuur 4.10E-H) blijkt dat hybride 3

en 4 (meest gevoelige) tijdens de donkerperiode oscillaties in de transpiratie vertoonden.

Hybride 1 en 2 hadden deze oscillaties minder. Er moet echter voorzichtigheid geboden

worden met de interpretatie van deze oscillaties. Deze kunnen namelijk ook het gevolg zijn

van de niet opgemeten en dus ingeschatte luchtdebieten. Er werd tijdens proef 2 namelijk een

gemiddelde waarde van de debieten van proef 1 genomen.

Figuur 4.8 - (A) Netto-fotosynthesesnelheid en transpiratiesnelheid van het blad en het waterdampdrukdeficiet (VPD) in de donker- en herstelperiode voor hybride 2 en (C) voor hybride 3. (B) Detail van de overgang van donker- naar herstelperiode voor hybride 2 en (D) voor hybride 3. De zwarte blokken duiden de donkerperiode aan (DOY = Dag van het jaar).

Resultaten

41

Figuur 4.9 - Netto-fotosynthesesnelheid (zwarte cirkels) en waterdampdrukdeficiet (VPD) (zwarte lijn) voor de meest transpirerende bloemstengel van hybride 1, 2, 3 en 4 (A-D) en detail van de overgang van donker- naar herstelperio-de van hybride 1, 2, 3 en 4 (E-F). De zwarte blokken duiden de donkerperiode aan (DOY = Dag van het jaar).

Resultaten

42

Figuur 4.10 - Transpiratiesnelheid (witte cirkels) en waterdampdrukdeficiet (VPD) (zwarte lijn) voor de meest transpirerende bloemstengel van hybride 1, 2, 3 en 4 (A-D) en detail van de donkerperiode van hybride 1, 2, 3 en 4 (E-F). De zwarte blokken duiden de donkerperiode aan (DOY = Dag van het jaar).

Hoofdstuk 5

Discussie

Discussie

43

5.1. Definitie knopvalgevoeligheid

Het is van belang voor de orchideeënindustrie om (snel) te kunnen achterhalen welke

hybriden knopvalgevoelig zijn en welke niet. Knopvalgevoelige hybriden kunnen namelijk

minder lang in het donker getransporteerd worden waardoor ze soms niet meer gebruikt

worden bij verdere veredeling. Om de gevoeligheid te definiëren is het van groot belang dat er

een eenduidige methode wordt opgesteld. Tijdens dit onderzoek werden vier verschillende

hybriden getest op hun gevoeligheid aan knopval.

Het oorspronkelijk aantal knoppen verschilde sterk tussen de verschillende hybriden en was

bij hybride 2 het laagst (Figuur 4.2A). Dit is mogelijk te wijten aan het minder groeikrachtig

zijn van hybride 2. Hieruit kan worden besloten dat het oorspronkelijk aantal knoppen in

rekening moet worden gebracht om de knopvalgevoeligheid van de hybriden te bepalen.

Daarom wordt de knopval verder procentueel ten opzichte van het oorspronkelijk aantal

knoppen bepaald (Figuur 4.2B-D). Uit deze resultaten blijkt dat alle vier de hybriden gevoelig

zijn aan knopval na een donkerperiode van vijf dagen en dat de knopvalgevoeligheid

toeneemt van hybride 1 naar hybride 4. Uit de standaardafwijkingen blijkt bovendien dat er

een grote variabiliteit is tussen de planten van één hybride. Vandaar is het aangewezen om de

knopval op basis van gemiddelde waarden te definiëren. Verder is het voor de kweker van

belang dat de planten gemiddeld weinig knopval hebben. Het is niet zo erg als er één plant op

een volledige batch knopval vertoont.

Knoppen groter dan 2,0 cm waren blijkbaar groeikrachtig genoeg om zich verder te

ontwikkelen na een donkerperiode aangezien deze zelden afvielen (Figuur 4.2B). De

donkerperiode van vijf dagen heeft dus enkel een invloed op knoppen met een lengte onder de

2,0 cm. De knopval in de kleinere klassen (< 0,8 cm) zijn van geringer economisch belang

voor de kweker. Vooral de knopval van grote knoppen is schadelijk voor de inkomsten van de

kwekerijen. Tijdens deze studie werd ook dit economisch belang meegenomen. Wanneer voor

de bepaling van de knopvalgevoeligheid van de hybriden enkel rekening wordt gehouden met

de knopval van grote knoppen, wordt echter een andere volgorde van gevoeligheid bekomen

dan wanneer met alle knoppen werd rekening gehouden (Figuur 4.2C). Hybride 3 blijkt dan

de meest gevoelige hybride te zijn, gevolgd door hybride 4, 1 en 2. Net zoals wanneer alle

knoppen in rekening worden gebracht, komen hybride 1 en 2 naar voor als de minder

gevoelige, terwijl hybride 3 en 4 gevoeliger zijn. Er is echter wel een verschil in de volgorde.

Aangezien de indeling in lengteklassen bij deze methode subjectief gebeurd, is deze

wetenschappelijk minder aangewezen.

De waargenomen gevoeligheid van de hybriden tijdens deze proef verschilt met de

gevoeligheid die Microflor suggereerde. Microflor stelde de planten echter twee dagen langer

bloot aan een donkerperiode om de gevoeligheid te testen. De knopvalgevoeligheid blijkt

bovendien soms afhankelijk te zijn van de omgevingsomstandigheden tijdens de opgroei van

de verschillende hybriden. Het verschil in gevoeligheid kan ook te wijten zijn aan een extra

stressfactor tijdens deze proef. Het dag/nachtregime werd namelijk verschoven om de

metingen in het donker te kunnen realiseren. In de groeikamer was het licht van 1u tot 13u

waardoor de lichtperiode ongeveer zes tot zeven uur werd vervroegd in tegenstelling tot de

normale lichtperiode. Deze verschuiving van het dag/nachtregime heeft een invloed op het

Discussie

44

circadiaans ritme. Organismen worden normaal blootgesteld aan dagelijkse cycli van licht en

donker waardoor ze een ritmisch gedrag vertonen in associatie met deze cycli. Wanneer

planten getransporteerd worden, gaat de dagelijkse dag/nacht cycli over in continu donker.

Tijdens de donkerperiode blijven vele planten het oorspronkelijk ritme behouden, toch op zijn

minst voor enkele dagen. Onder uniforme omstandigheden is de periode van het ritme

ongeveer 24 uur waardoor de term ‘circadiaans ritme’ wordt gebruikt. Omdat de planten

continu in het donker zitten, zijn deze circadiaanse ritmes geen directe respons op de aan- of

afwezigheid van licht. Ze moeten gebaseerd zijn op een interne klok, een endogene oscillator.

De ritmes worden intern gegenereerd, maar ze vereisen een signaal uit de omgeving om hun

expressie te initiëren (bv. blootstelling aan licht of verandering in temperatuur). Vandaar

vermindert de amplitude van het ritme vaak wanneer de plant gedurende een paar cycli aan

constante omstandigheden wordt blootgesteld. Deze endogene oscillator is gekoppeld aan

verschillende fysiologische processen zoals fotosynthese (Taiz & Zeiger, 2006). Groeiend

bewijs suggereert dat er twee fundamentele niveaus van controle verantwoordelijk zijn voor

het koppelen van de vier CAM-fasen. De circadiaanse controle van de koolstofflux door

PEPC wordt algemeen gezien als de sleutelcomponent in de dag/nachtscheiding van de

carboxylatieprocessen. Een tweede, metabolische controle moduleert de output van de

circadiaanse oscillator op fluctuaties in interne en externe CO2 voorraad (Dodd et al., 2002).

De opgelegde verschuiving van het dag/nachtregime in de twee proeven is echter analoog aan

het intercontinentaal transport over zes tot zeven tijdzones, bijvoorbeeld plantentransport van

Europa naar Azië of van de VS naar Europa. Wanneer de orchideeën na het donkertransport

terug in het licht komen in de serres, is hun dagritme namelijk ook met zes tot zeven uur

verschoven.

Algemeen kan geconcludeerd worden dat het voor de kwekerijen van belang is om een

gestandaardiseerde methode op te stellen om de gevoeligheid voor knopval te bepalen. Hierbij

moet voldoende aandacht besteed worden aan gelijke omgevingscondities, aandeel knopval

op het totaal aantal knoppen, gemiddelde knopval per hybride en een consistente manier om

de lengte van de knoppen in rekening te brengen. Wanneer voor het bepalen van de

knopvalgevoeligheid enkel rekening wordt gehouden met een donkerperiode, kan de

selectiemethode tekorten vertonen bij intercontinentaal transport waarbij verschillende

tijdzones worden doorkruist. In dit geval zou ook het verschuiven van het dag/nachtregime in

rekening moeten worden gebracht.

5.2. Fluorescentieparameters als screeningparameters

5.2.1 Hogere efficiëntie van PS II en grote flexibiliteit als reactie op

donkerstress

Tijdens de donkerperiode namen alle fluorescentieparameters, behalve NPQ, toe (Figuur 4.3).

Dit wijst er algemeen op dat de hybriden veel efficiënter omgingen met het beperkte licht dat

ze kregen in de donkerperiode (afkomstig van de lichtpulsen van de LI-COR).

De maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II (Fv/Fm) bleef voor alle

hybriden relatief constant gedurende de hele proef (Figuur 4.3A) rond een waarde van 0,8 die

erop wijst dat de planten geen stress ondervonden aan PS II (Lichtenthaler et al., 2005). Fv/Fm

Discussie

45

wordt namelijk vaak gebruikt als indicator voor schade aan PS II door foto-inhibitie, omdat

deze ratio sterk daalt bij gestresseerde planten (Roháček, 2002). Dit stemt overeen met het

onderzoek van Lin & Hsu (2004) op Phalaenopsis amabilis waaruit bleek dat Fv/Fm

(gemiddeld 0,8) niet werd beïnvloed door lage lichtintensiteiten. Na donkertransport was

Fv/Fm ook niet verschillend bij Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’ (Hou et al., 2010) en

Phalaenopsis equestris (Su et al., 2001). Pollet et al. (2010) nam bij Phalaenopsis ’s nachts

ook een constante Fv/Fm waar met een gemiddelde waarde van 0,82. Er kan geconcludeerd

worden dat een donkerperiode van vijf dagen geen effect had op Fv/Fm en dat deze

fluorescentieparameter dus niet geschikt is om het effect van donkerstress na te gaan. Dit

bevestigt het onderzoek van Hou et al. (2010). Waarschijnlijk is dit te wijten aan het feit dat

Fv/Fm voornamelijk gelinkt wordt aan stress door foto-inhibitie (overmaat aan licht), wat hier

niet het geval is. De toename van de overige fluorescentieparameters (met uitzondering van

NPQ) tijdens de donkerperiode duidt op een grotere gebruikte fractie van de maximale

efficiëntie van PS II (Fv’/Fm

’), een grotere proportie van het geabsorbeerde licht dat werd

gebruikt voor fotochemie (Fq’/Fm

’), een grotere hoeveelheid open reactiecentra (qP) en een

grotere actuele fotonenflux die PS II aandreven (ETR). Tijdens de donkerperiode

onderdrukten de planten de fluorescentie minder via warmteverlies (lagere NPQ). Bovendien

bleek er een inverse relatie te zijn tussen NPQ en Fq’/Fm

’, wat het onderzoek van Pollet et al.

(2010) bevestigt. De verandering van deze fluorescentieparameters wijzen dus met andere

woorden op een grotere efficiëntie van PS II tijdens de donkerperiode.

De toename van de fluorescentieparameters (en de afname van NPQ) tijdens de aanhoudende

donkerperiode zijn in tegenstelling tot lagere fluorescentieparameters (en een hogere NPQ) in

het donker tijdens een normale dag/nachtcyclus (data niet getoond). ’s Nachts werd ook een

lagere Fq’/Fm

’ en qP en een hogere NPQ waargenomen door Pollet et al. (2010). Een lagere

waarde voor de fluorescentieparameters (en een hogere waarde voor NPQ) tijdens het donker

bij een normale dag/nachtcyclus wordt als volgt verklaard (Figuur 3.5). Overdag draait de

elektronentransportketen op volle toeren, er wordt NADPH en ATP aangemaakt en verbruikt

om CO2 om te zetten in suikers via de Calvincyclus. Er is dus geen ophoping van NADPH en

ATP in het stroma en de efficiëntie van PS II is hoog. Wanneer de planten ’s nachts een

lichtpuls krijgen, raakt de elektronentransportketen verzadigd. De Calvincyclus gaat namelijk

niet door in het donker waardoor geen NADPH en ATP wordt verbruikt. Door de ophoping

van NADPH en ATP in het stroma, wordt de synthese ervan geïnhibeerd. Hierdoor hopen de

elektronen in de elektronentransportketen en de protonen in het thylakoïdlumen op waardoor

de efficiëntie van PS II daalt (lagere waarde voor de fluorescentieparameters). Een grote

transmembrane protongradiënt zorgt bovendien voor de reversibele omzetting van

violaxanthine naar zeaxanthine (pigmenten die een rol spelen bij de dissipatie van een

overmaat aan energie). De binding van protonen en zeaxanthine aan het LHC zorgt voor

veranderingen in de ruimtelijke schikking die leiden tot warmteverlies, hierdoor neemt NPQ

dus toe (Steppe, 2011). Wanneer de planten worden blootgesteld aan een langere

donkerperiode vindt er echter geen CO2 fixatie meer plaats en wordt ook geen NADPH en

ATP gevormd in de lichtreacties. De Calvincyclus valt dus stil. Wanneer de

elektronentransportketen nu elektronen krijgt (van een lichtpuls), zou deze dus weer

verzadigd moeten raken om bovenvermelde redenen. Het is mogelijk dat de planten ‘weten’

dat ze al lang geen licht hebben gekregen (bv. door het circadiaans ritme/de endogene

oscillator). Door de lichtpuls van de LI-COR kunnen ze het idee krijgen dat er een nieuwe

Discussie

46

lichtperiode zal aanbreken waardoor ze zo snel mogelijk NADPH en ATP willen aanmaken

om de CO2 (die nog eventueel aanwezig is in de vacuole in het begin van de donkerperiode) te

kunnen omzetten in suikers. Dit kan de verhoogde efficiëntie van PS II verklaren tijdens de

donkerperiode.

Wanneer de hybriden terug blootgesteld werden aan een dag/nachtregime namen de

fluorescentieparameters onmiddelijk ongeveer dezelfde waarde aan als op de controledag

(Figuur 4.3). De geteste Phalaenopsis hybriden reageerden dus veerkrachtig op de

donkerstress van vijf dagen. Hieruit wordt eveneens besloten dat PS II niet beschadigd werd

door de donkerperiode van vijf dagen. De waarden voor en na de donkerperiode zijn

gelijkaardig. Dit bevestigt het onderzoek van Hou et al. (2010) op Phalaenopsis Sogo

Yukidian ‘V3’.

Uit de belichtingsstudies van Lin & Hsu (2004) en He & Teo (2007) bleek dat qP en ETR

daalden en NPQ steeg met dalende belichting. De Phalaenopsis planten werden niet continu

in het donker gehouden zoals tijdens ons onderzoek, wat de verschillende resultaten kan

verklaren. Hou et al. (2010) vonden geen significant verschil tussen de qP van Phalaenopsis

Sogo Yukidian ‘V3’ na 21 dagen donkertransport en de qP van controleplanten die geen

donkertransport ondergingen. Dit komt overeen met ons onderzoek. Er werd echter geen

vergelijking met controleplanten gemaakt, maar de qP nam na de donkerperiode wel ongeveer

eenzelfde waarde aan als ervoor (Figuur 4.3D). Su et al. (2001) stelden daarentegen een

daling van qP vast, maar geen invloed op NPQ na 10, 20 en 30 dagen donkertransport. Dit

lijkt op het eerste zicht tegenstrijding met onze resultaten, maar in dit onderzoek werd geen

vijf dagen donkertransport gesimuleerd waardoor een vergelijking met onze proef niet

eenduidig is.

5.2.2 Dalende efficiëntie van PS II wanneer de donkerperiode vorderde

Naarmate de donkerperiode vorderde, daalden alle gestegen fluorescentieparameters opnieuw,

met uitzonder van de gedaalde NPQ die opnieuw steeg (Figuur 4.3). Dit wijst erop dat de

verhoogde efficiëntie om met het licht om te springen, afnam naarmate de donkerperiode

langer duurde. PS II werkte dus minder efficiënt naarmate de donkerperiode vorderde. Het is

mogelijk dat de amplitude van de circadiaanse ritmes afzwakten omdat er geen extern signaal

meer was om de expressie van de ritmes te initiëren. De afname van de

fluorescentieparameters (en toename van NPQ) tijdens de laatste dagen van de donkerperiode

was het grootst voor de meest knopvalgevoelige hybride. Het PS II van de

knopvalgevoeligere planten werkte dus minder efficiënt wanneer de planten langdurig aan

donker werden blootgesteld. Het kan gesuggereerd worden dat de productie van

stresshormonen en dus 1-ACC toeneemt wanneer PS II minder efficiënt werkt.

5.2.3 Sommige fluorescentieparameters zijn gerelateerd aan de

knopvalgevoeligheid

Fv’/Fm

’ (Figuur 4.4B) en NPQ (Figuur 4.4E) konden tijdens het donker in de herstelperiode

gerelateerd worden aan de volgorde van de knopvalgevoeligheid. Fv’/Fm

’ was gemiddeld het

hoogst voor de minst knopvalgevoelige hybride (hybride 1) en nam af naarmate de hybriden

meer knopvalgevoelig waren, terwijl NPQ het laagst was voor de minst knopvalgevoelige

Discussie

47

hybride (hybride 1) en steeg naarmate de hybriden meer knopvalgevoelig waren. Fv’/Fm

’ van

de gevoelige hybriden (hybride 3 en 4) was in de herstelperiode bovendien significant

verschillend met deze van de minder gevoeligere hybriden (hybride 1 en 2). Fv’/Fm

’ en NPQ

kunnen dus als screeningparameters worden voorgesteld: hoe hoger en lager deze waarden in

het donker tijdens de herstelperiode, hoe minder knopvalgevoelig de hybride zal zijn. Een

combinatie van Fv’/Fm

’ en NPQ lijkt het meest aangewezen om de hybriden te selecteren op

hun knopvalgevoeligheid.

Ook de andere fluorescentieparameters kunnen gerelateerd worden aan de

knopvalgevoeligheid ondanks het feit dat de significanties niet helemaal overeenstemmen.

Aangezien Fq’/Fm

’ en ETR zowel tijdens de donker- als de herstelperiode gemiddeld lager

waren voor de knopvalgevoelige hybriden (Figuur 4.4C en F), zullen de meer gevoeligere

soorten een lagere efficiëntie van PS II hebben en een kleinere actuele fotonenflux die PS II

aandrijft. Deze redenering gaat ook op voor qP in de donkerperiode: een lagere waarde tijdens

de donkerperiode wijst op meer knopvalgevoelige soorten (Figuur 4.4D). Ze bezitten dus een

kleiner aandeel open reactiecentra in de donkerperiode.

Uit de lagere Fv’/Fm

’, Fq

’/Fm

’, qP en ETR en de hogere NPQ van de meer knopvalgevoelige

soorten wordt afgeleid dat de efficiëntie van PS II lager was bij de gevoeligere soorten. De

werking van PS II was dus meer gelimiteerd bij de knopvalgevoeligere hybriden door de vijf

dagen donker. Als reactie op deze grotere donkerstress kan de aanmaak van het

stresshormoon ethyleen worden bevorderd. Het is dus mogelijk dat er meer 1-ACC

geproduceerd werd bij de meer gevoelige hybriden omdat ze meer stress ondervonden van de

donkerperiode.

5.3. De rol van fotosynthese en transpiratie bij verhoogde knopval

na donkerstress

5.3.1 Bladeren

Na één dag donkerstress vond er in de bladeren geen dagelijkse CAM-cyclus meer plaats en

respireerden de bladeren continu (Figuur 4.5). Door de afwezigheid van licht konden geen

lichtreacties doorgaan en werd er geen NADPH en ATP aangemaakt via de

elektronentransportketen. Door dit tekort aan NADPH en ATP kon CO2 via de Calvincyclus

niet worden omgezet naar suikers, waardoor ook geen PEPC kon worden gevormd uit de

afbraak van suikers. Aangezien PEPC het basissubstraat is om CO2 te binden, steeg de interne

CO2 concentratie. Waarschijnlijk sloten de stomata hierdoor (Figuur 4.5) en werd er geen

atmosferische CO2 en zuurstof meer opgenomen. Ceusters et al. (2011) stelden eveneens een

negatieve totale CO2 balans over de volledige CAM-cyclus vast in beschaduwde Aechmea

planten (zes dagen schaduw). Ook in het onderzoek van Hou et al. (2010) was de netto CO2

opnamesnelheid en stomatale geleidbaarheid nul na een donkerperiode van 21 dagen. Ze

herstelden tot een normaal niveau zes tot acht dagen na het donkertransport. Door het sluiten

van de stomata tijdens de donkerperiode is er een gebrek aan exogene CO2 opname. Hierdoor

kan het hergebruik van CO2 uit respiratie optreden, wat ‘CAM-idling mode’ wordt genoemd.

Dit effect is reeds beschreven bij droogtestress (Su et al., 2001; Ceusters et al., 2009) en kan

mogelijks ook optreden wanneer de stomata sluiten bij donkerstress. De transpiratie in de

Discussie

48

donkerperiode was lager voor de knopvalgevoelige hybriden (Figuur 4.7). De stomata waren

dus meer gesloten. Het sluiten van de stomata lijkt gerelateerd te zijn aan de hogere

fotosynthetische stress veroorzaakt door de donkerperiode bij de gevoeligere hybriden. De

respiratie nam toe en de transpiratie daalde, met uitzondering van hybride 4, naarmate de

donkerperiode langer aanhield. De stomata sloten dus meer. Bij hybride 4 was vanaf de eerste

dag donkerstress de respiratie al groot en de transpiratie al praktisch nul. Hieruit wordt

besloten dat de bladeren meer stress ondervonden bij een langere donkerperiode. Deze

resultaten zijn analoog aan het verloop van de fluorescentieparameters (Figuur 4.3).

Wanneer de planten terug werden blootgesteld aan een normaal dag/nachtregime herstelde de

CAM-cyclus zich in de bladeren (Figuren 4.5 en 4.8). Dit wijst er opnieuw op dat de planten

zeer flexibel konden omgaan met donkerstress en dat het fotosynthese-apparaat niet

beschadigd werd tijdens de donkerperiode en bevestigt de bevindingen die uit de

fluorescentieparameters werden geconcludeerd. Hybride 4, die het meest gevoelig was aan

knopval, herstelde echter trager dan de andere hybriden (Figuur 4.5). Dit blijkt ook uit het

verloop van de fluorescentieparameters (Figuur 4.3). Het kan dus gesuggereerd worden dat de

knopvalgevoeligere hybriden meer fotosynthetische stress ondervonden van de donkerperiode

en minder flexibel reageerden bij de overgang naar een normaal dag/nachtregime. Aangezien

ze meer stress ondervonden, nam mogelijks de 1-ACC productie toe.

5.3.2 Bloemstengels

De bloemen en bloemstengels respireerden tijdens de donkerperiode continu (Figuur 4.9). Dit

was ook zo in de herstelperiode waarbij bovendien een dag/nachtpatroon werd waargenomen

met overdag een kleinere respiratie dan ‘s nachts. De lagere respiratie overdag kan verklaard

worden doordat de bloemen en stengels in het licht een beetje aan fotosynthese deden,

waardoor de totale respiratie kleiner werd overdag in vergelijking met ‘s nachts. De bloemen

en stengels vertoonden dus (samen) een C3 fotosynthesemechanisme. Dit komt overeen met

het onderzoek van Hew & Yong (1997) waarbij de bloemen van Phalaenopsis geen CAM

metabolisme vertoonden. In hun onderzoek lieten de bloemstengels daarentegen wel een zwak

CAM metabolisme zien. Aangezien in onze proef de bloemen en stengels in één branchbag

werden opgemeten, kan het zijn dat de C3 fotosynthese van de bloemen het zwakke CAM

metabolisme van de stengels overheerste. De studies van Endo & Ikusima (1989, 1992) en

Goh (1983) namen echter wel een zwak CAM metabolisme waar in de bloemen van

Phalaenopsis, Arachnis, Aranda, Dendrobium en Vanda hybriden. In onze proef was de

transpiratiesnelheid continu positief en volgde het VPD, wat erop wijst dat de stomata van de

bloemen altijd open waren, zowel in de donker- als de herstelperiode (Figuur 4.10). De

stomata van de bloemen van deze hybriden zijn dus niet-functioneel aangezien de stomata niet

openen en sluiten. Dit stemt overeen met het onderzoek van Hew et al. (1980).

5.3.3 Link met knopval

Op basis van de resultaten waargenomen tijdens dit onderzoek, wordt onze hypothese

(Hoofdstuk 1) voor knopval genuanceerd. Wanneer er geen lichtreacties plaatsvinden in de

bladeren tijdens de donkerperiode, wordt er geen zuurstof gevormd en aangezien de stomata

gesloten zijn, wordt er ook geen atmosferische zuurstof opgenomen. Hierdoor kan 1-ACC niet

Discussie

49

geconverteerd worden in ethyleen, omdat het ACC-oxidase zuurstof vereist, en hoopt het op

in de bladeren. Aangezien de gevoeligere hybriden meer stress ondervinden ter hoogte van PS

II, wordt er mogelijks een grotere hoeveelheid 1-ACC geproduceerd dat niet kan worden

omgezet naar ethyleen. De bloemstengels blijven continu transpireren tijdens de

donkerperiode waardoor 1-ACC vanuit de bladeren naar de bloemen en knoppen kan worden

getransporteerd met de xyleem sapstroom. Dit deel van de hypothese sluit aan bij het

onderzoek van Bradford & Yang (1980) die aantoonden dat 1-ACC transport plaatsvond via

de xyleem sapstroom in tomaat. In hun onderzoek zorgden anaërobe condities rond de wortels

ervoor dat 1-ACC niet kon geconverteerd worden naar ethyleen. Het 1-ACC hoopte hierdoor

op in de wortels en werd via de transpiratiestroom naar de scheut getransporteerd, waar het

wel werd omgezet naar ethyleen. Dit veroorzaakte in het geval van tomaat epinastie

(ombuigen) van de bladeren.

Bij de gevoeligere hybriden wordt waarschijnlijk meer 1-ACC naar de knoppen en bloemen

getransporteerd doordat de bladeren minder transpireren (stomata meer gesloten) en het

aandeel van de bloemtranspiratie tijdens de donkerperiode dus groter is. De fractie van de

bloemtranspiratie op de totale transpiratie (blad + bloem) nam namelijk toe tijdens

donkerperiode naarmate de hybriden meer knopvalgevoelig waren (deze fracties waren voor

hybride 1, 2, 3 en 4 respectievelijk 0,85, 0,93, 0,97 en 0,97). Naast het transport van 1-ACC

naar de bloemen kan 1-ACC eventueel ook naar de wortels worden getransporteerd waar het

wordt gedetoxificeerd tot N-malonyl ACC. Wanneer de planten terug licht krijgen tijdens de

herstelperiode, komen de lichtreacties terug op gang en wordt er weer zuurstof gevormd.

Daardoor kan de omzetting van 1-ACC naar ethyleen plots terug plaatsvinden. Aangezien het

aannemelijk is dat er meer 1-ACC accumuleert tijdens de donkerperiode in de bloemstengels

van de gevoeligere soorten (door meer fotosynthetische stress en minder bladtranspiratie), is

er dus meer ethyleenproductie in hun knoppen tijdens de herstelperiode waardoor een grotere

knopval wordt geïnduceerd.

Hoofdstuk 6

Conclusies en perspectieven


51

Vanwege het grote economische belang van Phalaenopsis voor de sierteelt, was het doel van

deze masterthesis om de link tussen knopval en donkertransport te achterhalen. In dit laatste

hoofdstuk worden de voornaamste besluiten van dit onderzoek samengevat en worden

suggesties gegeven voor toekomstig onderzoek.

6.1. Algemene besluiten

Uit de praktijk blijkt dat het donkertransport van sommige Phalaenopsis hybriden knopval

induceert: de knoppen vallen af wanneer ze terug in het licht worden geplaatst. In de literatuur

(Hoofdstuk 1) is echter weinig beschreven over de oorzaken van deze knopval. Het wordt

algemeen aanvaard dat ethyleen knopval induceert en dat de knopval verhinderd wordt door

ethyleeninhibitoren. Ethyleen heeft dus een sleutelrol in het proces dat knopval veroorzaakt.

Om de vooropgestelde hypothese te verifiëren (Hoofdstuk 1), werden vier Phalaenopsis

hybriden getest op hun gevoeligheid aan knopval na vijf dagen donker. Hieronder worden de

belangrijkste resultaten samengevat.

Aangezien er geen gestandaardiseerde methode bestaat om de knopvalgevoeligheid van een

hybride te definiëren, werden tijdens dit onderzoek verschillende mogelijkheden getest. Uit de

resultaten bleek dat rekening moet worden gehouden met het aantal oorspronkelijke knoppen

die de planten bezitten. De knopval na de donkerperiode wordt best procentueel ten opzichte

van dit oorspronkelijk aantal knoppen uitgedrukt. Bovendien is het belangrijk dat de knopval

gemiddeld per hybride wordt bepaald aangezien er een grote variabiliteit is tussen de planten

van één hybride. Ook moet een keuze gemaakt worden tussen enkel grote knoppen

(commercieel belangrijker) of alle knoppen in rekening brengen. Indien de

knopvalgevoeligheid enkel op de grotere knoppen gebaseerd wordt, is het noodzakelijk om

een consistente ondergrens voor de knopgrootte vast te leggen. Uit de resultaten bleek dat de

vier Phalaenopsis hybriden allemaal gevoelig waren aan knopval na een donkerperiode van

vijf dagen. De donkerperiode had enkel een invloed op knoppen kleiner dan 2,0 cm, terwijl de

grotere knoppen zich verder ontwikkelden.

Het is echter tijdrovend voor de orchideeënkwekers indien na een donkerperiode elke dag de

knopval van de verschillende hybriden moet worden opgevolgd om te bepalen welke hybriden

knopvalgevoelig zijn. Vandaar werd in dit onderzoek ook gefocust op de ontwikkeling van

een snelle screeningmethode. Via het opmeten van fluorescentieparameters met behulp van de

LI-6400XT wordt zo een screening mogelijk. Uit dit onderzoek kwamen namelijk twee

fluorescentieparameters naar voor die samen kunnen gebruikt worden om snel te screenen op

knopvalgevoeligheid, namelijk Fv’/Fm

’ en NPQ. Hoe hoger Fv

’/Fm

’ en hoe lager NPQ in het

donker tijdens de herstelperiode, hoe minder knopvalgevoelig de hybride zal zijn.

Door een combinatie van fluorescentie-, fotosynthese- en transpiratiemetingen op de bladeren

tijdens de donker- en herstelperiode werd getracht de oorzaak van de knopval te achterhalen.

Na één dag donker vond er geen dagelijkse CAM-cyclus meer plaats en respireerden de

bladeren continu. Door de afwezigheid van licht konden namelijk geen lichtreacties doorgaan

en werd er geen NADPH en ATP aangemaakt via de elektronentransportketen. Door dit tekort

aan NADPH en ATP kon CO2 via de Calvincyclus niet worden omgezet naar suikers,

waardoor ook geen PEPC kon worden gevormd uit de afbraak van suikers. Aangezien PEPC


52

het basissubstraat is om CO2 te binden, steeg de interne CO2 concentratie. Hierdoor sloten de

stomata en kon er geen atmosferische CO2 meer worden opgenomen. Wanneer de planten

terug werden blootgesteld aan een normaal dag/nachtregime herstelde de CAM-cyclus in de

bladeren zich en namen de fluorescentieparameters ongeveer dezelfde waarde aan als voor de

donkerperiode. Dit wijst erop dat de planten zeer flexibel konden omgaan met donkerstress en

dat het fotosynthese-apparaat niet werd beschadigd tijdens de donkerperiode. De hybriden

gingen tijdens de donkerperiode ook veel efficiënter om met licht waarbij de gevoeligere

hybriden een lagere efficiëntie van PS II hadden in vergelijking met de minder gevoelige

hybriden. De bladeren ondervonden meer stress naarmate de donkerperiode vorderde

aangezien de respiratie toenam, de stomata meer sloten en de verhoogde efficiëntie van PS II

geleidelijk afnam. Deze daling van de fotosynthetische efficiëntie tijdens de laatste dagen van

de donkerperiode was het grootst voor de meest knopvalgevoelige hybride. Het PS II van de

knopvalgevoeligere hybriden werkte dus minder efficiënt wanneer de planten langdurig aan

donker werden blootgesteld. Knopvalgevoelige hybriden ondervonden bijgevolg meer stress

ter hoogte van PS II tijdens de donkerperiode en naarmate de donkerperiode vorderde. Ze

bezaten bovendien een kleiner aanpassingsvermogen bij de overgang naar een normaal

dag/nachtregime. Aangezien deze hybriden meer stress ondervonden, is het waarschijnlijk dat

meer stresshormonen (1-ACC) werden geproduceerd. Uit de fotosynthese- en

transpiratiemetingen uitgevoerd op de bloemstengels bleek dat de bloemen en stengels een C3

fotosynthesemechanisme vertoonden. De stomata waren bovendien niet-functioneel aangezien

er continu transpiratie plaatsvond en het transpiratiepatroon het VPD volgde. Aangezien er

geen lichtreacties plaatsvonden in de bladeren tijdens de donkerperiode en er geen exogeen

zuurstof kon worden opgenomen door de gesloten stomata, was er geen zuurstof aanwezig in

de bladeren. Hierdoor kon 1-ACC niet geconverteerd worden in ethyleen, aangezien het

ACC-oxidase zuurstof vereist, en werd het opgehoopt in de bladeren. Doordat de bloemen

continu transpireerden, zowel tijdens de donker- als de herstelperiode, kon 1-ACC vanuit het

blad via de xyleem sapstroom naar de bloemen en knoppen worden getransporteerd.

Aangezien de gevoeligere hybriden meer stress ondervonden ter hoogte van PS II, werd er

hoogstwaarschijnlijk meer 1-ACC geproduceerd dat niet kon worden omgezet naar ethyleen.

Bovendien was de bladtranspiratie van deze hybriden tijdens de donkerperiode lager.

Hierdoor was het aandeel van de transpiratiestroom die naar de bloemen en knoppen ging

groter en is het dus mogelijk dat er meer 1-ACC met de xyleem sapstroom naar de knoppen

ging. Het is bijgevolg plausibel dat bij de gevoeligere hybriden meer 1-ACC naar de knoppen

en bloemen werd getransporteerd. Wanneer de planten terug licht kregen tijdens de

herstelperiode, kwamen de lichtreacties terug op gang en werd er weer zuurstof gevormd.

Daardoor kon de omzetting van 1-ACC naar ethyleen terug plaatsvinden. Aangezien er

vermoedelijk meer 1-ACC accumuleerde tijdens de donkerperiode in de bloemstengels van de

gevoeligere soorten, was er dus ook meer ethyleenproductie in de knoppen waardoor een

grotere knopval werd geïnduceerd.


53

6.2. Suggesties voor verder onderzoek

De link tussen knopval bij Phalaenopsis na donkertransport, fotosynthese en ethyleen werd

nog nooit eerder gemaakt. Vandaar is verder onderzoek aangewezen waarbij zeker rekening

moet worden gehouden met onderstaande aandachtspunten.

Aangezien Phalaenopsis vaak intercontinentaal wordt getransporteerd, zou moeten getest

worden of er een bijkomend effect is van het verschuiven van het dag/nachtregime bij

intercontinentaal transport op de knopval. Hierbij kan de knopval na een donkerperiode op

controleplanten zonder verschuiving van het dag/nachtregime worden vergeleken met de

knopval bij hybriden die na de donkerperiode wel worden blootgesteld aan deze verschuiving.

Indien het verschuiven van het dag/nachtregime een significante extra stressfactor blijkt te

zijn voor de knopval, zal dit moeten worden meegenomen in de selectie van de

knopvalongevoelige hybriden.

Aan de hand van chlorofyl fluorescentiemetingen op vier Phalaenopis hybriden konden

Fv’/Fm

’ en NPQ tijdens de herstelperiode als screeningparameters worden voorgesteld. Het is

echter wenselijk om de proefopzet uit te breiden met een hoger aantal hybriden om in te

schatten of deze screeningparameters algemeen bij Phalaenopsis kunnen worden gebruikt.

Bovendien kan getest worden of deze parameters significant verschillen tussen gevoelige en

niet-gevoelige soorten zonder dat eerst een donkerperiode moet worden opgelegd. Indien dit

het geval is, kan de screening nog sneller verlopen omdat de planten dan niet eerst een

donkerperiode moeten ondergaan.

Om de oorzaak van de knopval met zekerheid te bevestigen, zouden enkele bijkomende

metingen kunnen worden uitgevoerd. Het opmeten van het verloop van de 1-ACC

concentratie in de knoppen tijdens de donkerperiode kan de hypothese bevestigen dat

knopvalgevoeligere hybriden meer 1-ACC accumuleren in de knoppen in vergelijking met

minder gevoelige hybriden. Door de ethyleenproductie in de bloemen tijdens de

donkerperiode en de herstelperiode op te meten, kan met zekerheid geconcludeerd worden dat

deze verwaarloosbaar is tijdens de donkerperiode door gebrek aan zuurstof. Hierdoor kan 1-

ACC niet omgezet worden in ethyleen omdat het ACC-oxidase zuurstof vereist. In het begin

van de herstelperiode zou dan een plotse piek in de ethyleenproductie moeten worden

waargenomen omdat er dan wel terug lichtreacties doorgaan die zuurstof leveren. De

ethyleenconcentratie kan worden opgemeten via gaschromatografie met een

vlamionisatiedetector. Het gebrek aan zuurstof tijdens de donkerperiode zou ook kunnen

bevestigd worden door de interne zuurstofconcentratie in de bladeren op te meten. Dit kan aan

de hand van een infrarood gas analysator met een absorptieband voor zuurstof of een ‘leaf

disc electrode’ (Hansatech-instruments, Norfolk, England).

Om de knopval te voorkomen zouden, naast ethyleeninhibitoren, ook andere alternatieven

kunnen worden onderzocht. Een eerste mogelijkheid is het verhinderen van de transpiratie.

Wanneer een afgesloten plastieken zak rond de bloemstengels wordt gedaan tijdens het

donkertransport, zal de transpiratie stilvallen (door de hoge RH). Hierdoor kan 1-ACC niet

naar de knoppen worden getransporteerd. Als de planten na het transport terug in het licht

komen te staan, is het waarschijnlijk dat de omzetting van 1-ACC naar ethyleen voornamelijk


54

in de bladeren plaatsvindt. Het gasvormige ethyleen kan dan via de bladeren ontsnappen. Na

enkele dagen bij een normaal dag/nachtregime, als het opgehoopte 1-ACC verdwenen is, zou

de plastieken zak dan kunnen worden verwijderd. Een tweede toekomstmogelijkheid is de

donkerstress voorkomen door een lichtbron in de vrachtwagen te plaatsen. Dit zorgt ervoor

dat de planten een hogere economische waarde hebben aangezien geen knopval plaatsvindt.

De meerkost van het extra energiegebruik van de lichtbron kan mogelijks gecompenseerd

worden door de hogere verkoopwaarde van de orchideeën. Bovendien kunnen de

energiekosten gereduceerd worden via het gebruik van alternatieve energiebronnen zoals

zonne-energie. Hiervoor is verder onderzoek aangewezen.

Hoofdstuk 7

Referenties

Referenties

55

Aschan G. & Pfanz H. (2003). Non‐foliar photosynthesis ‐ a strategy of additional carbon

acquisition. Flora, 198, 81‐97.

Baker N.R. (2008). Chlorophyll fluorescence: A probe of photosynthesis in vivo. Annual

Review of Plant Biology, 59, 89-113.

Bernard N. (1909). L’évolution dans la symbiose. Les orchidées et leurs champignons

commensaux. Annales Des Sciences Naturelles Botanique, 9, 1-196.

Black C.C. & Osmond C.B. (2003). Crassulacean acid metabolism photosynthesis: 'working

the night shift'. Photosynthesis Research, 76, 329-341.

Borland A.M. & Taybi T. (2004). Synchronization of metabolic processes in plants with

Crassulacean acid metabolism. Journal of Experimental Botany, 55, 1255-1265.

Borland A.M., Zambrano V.A.B., Ceusters J. & Shorrock K. (2011). The photosynthetic

plasticity of crassulacean acid metabolism: an evolutionary innovation for sustainable

productivity in a changing world. New Phytologist, 191, 619-633.

Bradford K.J. & Yang S.F. (1980). Stress-induced ethylene production in the ethylene-

requiring tomato mutant diageotropica. Plant Physiology, 65, 327-330.

Burgeff H. (1909). Die Wurzelpilze der Orchideen, ihre Kultur und ihr Leben in der Pflanze.

Jena: Gustav Fischer Verlag.

Ceusters J., Borland A.M., Londers E., Verdoodt V., Godts C. & De Proft M.P. (2009).

Differential usage of storage carbohydrates in the CAM bromeliad Aechmea 'Maya' during

acclimation to drought and recovery from dehydration. Physiologia Plantarum, 135, 174‐184.

Ceusters J., Borland A.M., Godts C., Londers E., Croonenborghs S., Van Goethem D. & De

Proft M.P. (2011). Crassulacean acid metabolism under severe light limitation: a matter of

plasticity in the shadows? Journal of Experimental Botany, 62, 283-291.

Cha-um S., Ulziibat B. & Kirdmanee C. (2010). Effects of temperature and relative humidity

during in vitro acclimatization, on physiological changes and growth characters of

Phalaenopsis adapted to in vivo. Australian Journal of Crop Science, 4, 750-756.

Cockburn W., Ting I.P. & Sternberg L.O. (1979). Relationships between stomatal behavior

and internal carbon dioxide concentration in crassulacean acid metabolism plants. Plant

Physiology, 63, 1029‐1032.

Dawson J.C., Huggins D.R. & Jones S.S. (2008). Characterizing nitrogen use efficiency in

natural and agricultural ecosystems to improve the performance of cereal crops in low-input

and organic agricultural systems. Field Crops Research, 107, 89-101.

Dodd A.N., Borland A.M., Haslam R.P., Griffiths H. & Maxwell K. (2002). Crassulacean

acid metabolism: plastic, fantastic. Journal of Experimental Botany, 53, 569-580.

Referenties

56

Dueker J. & Arditti J. (1968). Photosynthetic 14

CO2 fixation by green Cymbidium

(Orchidaceae) flowers. Plant Physiology, 43, 130-132.

Endo M. & Ikusima I. (1989). Diurnal rhythm and characteristics of photosynthesis and

respiration in the leaf and root of a Phalaenopsis plant. Plant and Cell Physiology, 30, 43-47.

Endo M. & Ikusima I. (1992). Changes in concentrations of sugars and organic acids in the

long-lasting flower clusters of Phalaenopsis. Plant Cell Physiology, 33, 7-12.

Goh C.J. (1983). Rhythms of acidity and CO2 production in orchid flowers. New Phytologist,

93, 25-32.

Goh C.J., Avadhani P.N., Loh C.S., Hanegraaf C. & Arditti J. (1977). Diurnal stomatal and

acidity rhythms in orchid leaves. New Phytologist, 78, 365‐372.

Griesbach R.J. (2002). Development of Phalaenopsis orchids for the mass-market. In: Janick

J. & Whipkey A. (eds.), Trends in new crops and new uses. Alexandria: ASHS Press, 458-

465.

Guo W.J. & Lee N. (2006). Effect of leaf and plant age, and day/night temperature on net CO2

uptake in Phalaenopsis amabilis var. formosa. Journal of the American Society for

Horticultural Science, 131, 320-326.

Haslam R., Borland A., Maxwell K. & Griffiths H. (2003). Physiological responses of the

CAM epiphyte Tillandsia usneoides L. (Bromeliaceae) to variations in light and water supply.

Journal of Plant Physiology, 160, 627-634.

He J. & Teo L.C.D. (2007). Susceptibility of green leaves and green flower petals of CAM

orchid Dendrobium cv. Burana Jade to high irradiance under natural tropical conditions.

Photosynthetica, 45, 214-221.

Hew C.S., Lee G.L. & Wong S.C. (1980). Occurance of non-functional stomata in the flowers

of tropical orchids. Annals of Botany, 46, 195-201.

Hew C.S. & Yong J.W.H. (1997). The physiology of tropical orchids in relation to the

industry. Singapore: World Scientific.

Hou J.-Y., Setter T.L. & Chang Y.-C.A. (2010). Effects of simulated dark-shipping on

photosynthetic status and post-shipping performance in Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’.

Journal of the American Society of Horticultural Science, 135, 183-190.

Ichihashi S., Higuchi T., Shibayama H., Tesima Y., Nishiwaki Y. & Ota K. (2008). Aspects

of CO2 uptake in the crassulacean acid metabolism orchid Phalaenopsis. Acta Horticulturae,

766, 245-256.

K.B. inzake de bescherming van in het wild levende dieren plantensoorten door controle op

het desbetreffende handelsverkeer (9 april 2003), Belgisch Staatsblad, 31045-31061.

Referenties

57

Ketsa S. & Thampitakorn F. (1995). Characteristics of ethylene production of Dendrobium

orchid flowers. Acta Horticulturae, 405, 253-263.

Klee H.J., Hayford M.B., Kretzmer K.A., Barry G.F. & Kishore G.M. (1991). Control of

ethylene synthesis by expression of a bacterial enzyme in transgenic tomata plants. The Plant

Cell, 3, 1187-1193.

Kluge M. & Ting I.P. (1978). Crassulacean Acid Metabolism: Analysis of an ecological

adaptation. Berlin: Springer Verlag.

Knudson L. (1922). Nonsymbiotic germination of orchid seeds. Botanical gazette, 73, 1-25.

Konow E.A. & Wang Y.-T. (2001). Irradiance levels affect in vitro and greenhouse growth,

flowering and photosynthetic behavior of a hybrid Phalaenopsis orchid. Journal of the

American Society of Horticultural Science, 126, 531-536.

Laisk A. & Oja V. (1998). Dynamic gas exchange of leaf photosynthesis. Measurement and

interpretation. Canberra: CSIRO Publishing.

Lawlor D.W. (1993). Photosynthesis: Molecular, physiological and environmental processes.

2nd

ed. Essex, UK: Longman Scientific & Technical.

Lichtenthaler H.K., Buschmann C. & Knapp M. (2005). How to correctly determine the

different chlorophyll fluorescence parameters and the chlorophyll fluorescence decrease ratio

R-Fd of leaves with the PAM fluorometer. Photosynthetica, 43, 379-393.

LI-COR (2004). Using the LI-6400/LI-6400XT Portable Photosynthesis System. 5th

ed. LI-

COR Biosciences, Inc, Lincoln Nebraska.

Lin M.-J. & Hsu B.-D. (2004). Photosynthetic plasticity of Phalaenopsis in response to

different light environments. Journal of Plant Physiology, 161, 1259-1268.

Lopez R. & Runkle E. (2004). The flowering of orchids. A reality check. Orchids, 196-203.

www.aos.org.

Lopez R.G. & Runkle E.S. (2005). Environmental physiology of growth and flowering of

orchids. Hortscience, 40, 1969-1973.

Lüttge U. (2002). CO2-concentrating: consequences in Crassulacean acid metabolism. Journal

of Experimental Botany, 53, 2131-2142.

Lüttge U. (2004). Ecophysiology of Crassulacean Acid Metabolism (CAM). Annals of

Botany, 93, 629-652.

Lüttge U., Ball E., Fetene M. & Medina E. (1991a). Flexibility of crassulacean acid

metabolism in Kalanchoë pinnata (Lam.) Pers. I. Response to irradiance and supply of

nitrogen and water. Journal of Plant Physiology, 137, 259-267.

Referenties

58

Lüttge U., Ball E. & Fetene M. (1991b). Flexibility of crassulacean acid metabolism in

Kalanchoë pinnata (Lam.) Pers. II. Light-use characteristics of plants grown in low or high

light. Journal of Plant Physiology, 137, 268-272.

Mapeli A.M., de Oliveira L.S., Megguer C.A., Barbosa J.G., Barros R.S. & Finger F.L.

(2009). Characterisation of respiration, ethylene production, and carbohydrate contents during

flower opening in Epidendrum ibaguense. Journal of Horticultural Science & Biotechnology,

84, 609-612.

Maxwell K. & Johnson G.N. (2000). Chlorophyll fluorescence - a practical guide. Journal of

Experimental Botany, 51, 659-668.

Morel G.M. (1965). Clonal propagation of orchids by meristem culture. Cymbidium Society

News, 20, 3-11.

Nadeau J.A., Zhang X.S., Nair H. & O'Neill S.D. (1993). Temporal and spatial regulation of

1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase in the pollination-induced senescence of orchid

flowers. Plant Physiology, 103, 31-39.

Neales T.F. & Hew C.S. (1975). 2 types of carbon fixation in tropical orchids. Planta, 123,

303-306.

Nobel, P. S., García-Moya E. & Quero E. (1992). High annual productivity of certain agaves

and cacti under cultivation. Plant, Cell and Environment, 15, 329-335.

Ogburn R.M. & Edwards E.J. (2010). The ecological water-use strategies of succulent plants.

In: Kader J.-C. & Delseny M. (eds.), Advances in Botanical Research, Vol. 55. Burlington:

Academic Press, 179-255.

Oudshoorn W. (2007). Orchideeën. Utrecht: Kosmos Uitgevers.

Pinske J. (2009). Phalaenopsis. De lievelingsorchidee. Aartselaar: Deltas.

Pollet B. (2010). Impact of cool night temperatures on Phalaenopsis photosynthetic activity

and psysiology to support an energy conscious greenhouse heating. PhD thesis, Ghent

University, Belgium.

Pollet B., Steppe K., Dambre P., Van Labeke M.-C. & Lemeur R. (2010). Seasonal variation

of photosynthesis and photosynthetic efficiency in Phalaenopsis. Photosynthetica, 48, 580-

588.

Pollet B., Vanhaecke L., Dambre P., Lootens P. & Steppe K. (2011). Low night temperature

acclimation of Phalaenopsis. Plant Cell Reports, 30, 1125-1134.

Raffeiner B., Serek M. & Winkelmann T. (2009). 1-Methylcyclopropene inhibits ethylene

effects in cut inflorescences and potted plants of Oncidium and Odontoglossum orchid

species. European Journal of Horticultural Science, 74, 10-15.

Referenties

59

Roháček, K. (2002). Chlorophyll fluorescence parameters: the definitions, photosynthetic

meaning, and mutual relationships. Photosynthetica, 40, 13-29.

Ronse A. (2008). Orchideeën. Sublieme Verleiders. Oostkamp: Stichting Kunstboek bvba.

Runkle E., Wang Y., Blanchard M. & Lopez R. (2005a). The Orchid Grower, part 1.

Greenhouse Grower, 1, 64‐67.

Runkle E., Wang Y., Blanchard M. & Lopez R. (2005b). The Orchid Grower, part 2.


Runkle E., Wang Y., Blanchard M. & Lopez R. (2005c). The Orchid Grower, part 3.


Runkle E., Wang Y., Blanchard M. & Lopez R. (2005d). The Orchid Grower, part 4.


Shin Y.-K., Yoon Y.-J., Hahn E.-J. & Paek K.-Y. (2009). Photosynthetic Photon Flux (PPF)

affects growth, photosynthesis and acclimatization of Phalaenopsis 'Amaglade' plantlets.

Korean Journal of Horticultural Science & Technology, 27, 476-481.

Silvera K., Santiago L.S., Cushman J.C. & Winter K. (2009). Crassulacean acid metabolism

and epiphytism linked to adaptive radiations in the Orchidaceae. Plant Physiology, 149, 1838-

1847.

Skillman J.B. & Winter K. (1997). High photosynthetic capacity in a shade-tolerant

crassulacean acid metabolism plant. Plant Physiology, 113, 441-450.

Steppe K. (2011). Ecofysiologie. Cursus, Universiteit Gent, Faculteit

Bio‐Ingenieurswetenschappen.

Su V., Hsu B.-D. & Chen W.-H. (2001). The photosynthetic activities of bare rooted

Phalaenopsis during storage. Scientia Horticulturae, 87, 311-318.

Sun Y., Christensen B., Liu F., Wang H. & Müller R. (2009). Effects of ethylene and 1-MCP

(1-methylcyclopropene) on bud and flower drop in mini Phalaenopsis cultivars. Plant Growth

Regulation, 59, 83-91.

Taiz L. & Zeiger E. (2006). Plant physiology. 4th

ed. Massachusetts: Sinauer.

Uthaichay N., Ketsa S. & van Doorn W.G. (2007). 1-MCP pretreatment prevents bud and

flower abscission in Dendrobium orchids. Postharvest Biology and Technology, 43, 374-380.

Vakblad voor de Bloemisterij. (2005). 27, 46-48.

Vakblad voor de Bloemisterij. (2010). 23a, 92-94.

Vakblad voor de Bloemisterij. (2011). 22, 44-45.

Referenties

60

Wang Y.-T. (1998). Deferring flowering of greenhouse-grown Phalaenopsis orchids by

alternating dark and light. Journal of the American Society of Horticultural Science, 123, 56-

60.

Wang Y.-T. (2007). Temperature, duration in simulated shipping, and thermal acclimatization

on the development of chilling injury and subsequent flowering of Phalaenopsis. Journal of

the American Society of Horticultural Science, 132, 202-207.

Woltering E.J. & van Doorn W.G. (1988). Role of ethylene in senescence of petals -

Morphological and taxonomical relationships. Journal of Experimental Botany, 39, 1605-

1616.

Woltering E.J. & Westra E.H. (2010). Ethyleenvisie GreenRail: ethyleen bij treintransport van

potplanten. Food & Biobased Research N° 1158, 1-19.

Woerner A.C. & Martin C.E. (1999). Mechanistic basis of differences in water-use efficiency

between a CAM and a C3 species of Peperomia (Piperaceae). New Phytologist, 144, 307-312.

Documents

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2011 2012 · Bovendien zijn de stomata van de bladeren gesloten waardoor geen exogeen zuurstof wordt opgenomen. Knopvalgevoelige