F~rbungsmethode der Glia und einiger Kiirnelungen des Nervensystems 1).

Von Dr. mcd. P. Snessareff (Moskau).

(Eingefangen am 21. Juli 1924.)

Die yon mir vorgeschlagene Methode ist fiir die Glia nicht spczifisch. Ich vcrwende sie auch zur F~irbung epithelialer und bindegewebiger Strukturelemente, abet der Glia gegeniiber erscheint sie besonders produktiv. Sie ist nicht elektiv genug, um die Gliafibrillen darzustellen, und steht in dieser Hinsicht der originellen Weiilertmethode und der vorziiglichen Methode yon Holzer nach. Aber sie hat auch ihre Vorziige. Ihre erste positive Eigenschaft besteht gerade darin, da$ sie nicht elektiv ist und in komplex gebauten Bildern die verschiedenen Struktur- clementc vielfarbig darstellt und die Kontraste gut hervorhebt. Sic reproduziert sogar solche Elementc, die mit anderen Methoden ent- weder gar nicht oder nut nach sehr komplizierten Vorbereitungs- prozeduren zu f/irben sind.

Sie ist verhMtnism~l~ig billig und einfach, kann fiir in Formalin fixierte und Gefrierschnitte verwendet werden, 1M.~t beim F/~rbcn kcinc Nicderschli~ge nach und braucht zu seiner Ausfiihrung nur einigc Minuten. Deshalb kann sie auch sehr gut mit anderen Methodcn zus~uu- men angewandt werden.

Im weiteren werde ich mich bemiihcn, die cinzclnen F:~irbungs- schablonen beiseite lassend, auf die verschiedenen Eigentiimlichkciten der May-Griinwald.Farbe beim F~rbcn des Nervensystems aufmcrk- sam zu machen. Die Sache ist die, daI~ May-Grii~wald cine ganz beson- dere Farbe, und ihrer F~rbungsarbeitslcistung nach aui~ergcwShnlich ist. Man gebraucht sie gewShnlich in Methylalkohol gelOst. ])as F~r- bungsresultat ist verschieden, je nachdem, ob wir einen wasserhaltigcn oder entw~isserten Schnitt vor uns haben; in den trockenen oder ent- wi~sserten Schnitten erscheint dic F~irbung besonders elektiv. Falls wir aber die urspriingliche Gewebsfixation irgendwie ver~i~ndern, oder die S$iickchen der Wirkung einer Beize aussetzen wollten, so gebcn wir hiermit auch der ,,Leistung" genannter Farbe eine neue Richtung, so dab neue F~rbungseffekte zum Vorschein kommen.

~) Vorgetragen in der Moskauer Pathologengesellschaft am 16. Marz 1922.

P. Snessareff: Fitrb~l~gmethode der (~lia u~(I einiger K6rnehmgen usw. 757

Grundsdtze meiner Methode. Die Formalinfixation mug geniigend stark sein. Es ist wiinschenswert, die Sttickchen aus einem vor langer Zeit fixierten Gewebe vor dem Schneiden auf dem Mikrotom in einer frischen Formalinl6sung (12--20%) noch einmal zu fixieren; es ist auch sehr ntitzlich, yon Anfang an die Formalin- fixation im Termostat oder mit Zusatz von Kalium bichromicum (1--2,5%) aus- zuftihren. Diese F/~rbungsmethode kann auch bei 1/~ngst fixierten Stiickchen angewandt werden, aber einige KSrnelungen lassen sich nach langer Zeit schlecht f~trben.

Die Formalinfixation ist nicht streng obligatorisch. Um eine bessere Nerven- zellenf/~rbung zu erreichen, kann man sich der Fliissigkeit von Carnoy bedienen. Nach dem Fixieren mit Quecksilber oder mit Hellerscher Fliissigkeit gelingt die F/~rbung der ,,mitochondriellen" KSrnelungen yon Myelinscheiden sehr gut (nach dem Fixieren in Wasser abspiilen, in Formalin nachfixieren, auf dem Gefrier- mikrotom schneiden, mit Lugol und Hyposulfit bearbeiten und dann farben). Es kann aber auch die Gliabeize angewandt werden und dann werden die Gefrier- schnitte nach Ausw~ssern gef/~rbt.

Weiterhin wird nur von Formalinfixation die l~ede sein. Ich ziehe die Gefrierschnitte vor, obgleich auch die Zelloidinschnitte (sie werden

vom Zelloidin mittels NelkenS1 und Aufkleben nach der Methode von Rubaschkin befreit) und 1)araffinschnitte gef/~rbt werden kSnnen.

Was die May-Griinwald-Farbe anbetrifft, so bediene ich reich entweder der fertigen (von Griibler bezogenen) LSsungen oder bereits sie selbst aus Farben- pulver vor. Konzentrierte LSsungen sind iiberfliissig. ~olgende Proportion geniigt vollkommen: 0,05 Farbe, 25,0 Spiriti methylici p~rissimi. Der FarblSsung k6nnen auch Si~uren (Carbols/~ure oder konzentrierte Essigs/iure) beigemengt werden, abet lctzteres ist noch nicht geniigend yon mir untersucht worden.

Man f/trbt den Schnitt, nachdem er auf ein Objektglas mittels Eiwei[~glycerin aufgeklebt worden ist. Das Aufkleben und Trocknen des Schnittes (oder Ent- wi~sserung) wird zu gteicher Zeit ausgefiihrt.

Es wird entweder ein trockener oder entw/isserter Schnitt gefiirbt, doch muB derselbe noch alkoholfeucht sein und diese Feuchtigkeit soll von demselben Alkohol herleiten (oder Alkohol mit Chloroform), welcher zum Aufkleben und Entw/tssern diente.

Bei Anwendung von Methylalkohol mit Chloroform sehen wir im Resultat, wie in der Methode von Holzer, ein Aufhellen und einige Entfettung des Schnittes. Lctzterem lege ich groBen Wert bei, deshalb entfctte ich die Schnitte in einigen Fi~llen vor dem F/trben (Alkohol yon steigender Konzentration, Chloroform 20 t)is 30 Minuten, Alkohol yon einer sich vermindernden Konzentration und Wasscr). lch rue das der allgemeinen Regel gem/~[~, da viele Farben den Schnitt besser f/irl)en, wenn er vorher entfettet ist. Demgem/~l~ kSnnen auch Gefrierschnitte nach dcr Methode von Weigert und Mallory gefi~rbt werden.

Nach dem F/~rben mit May-Griinwahl und nach Auswaschen des Schnittes trockne ich ihn rasch mit Filtrierpapier und ziehe ihn ebenso rasch durch Aceton dutch, denn auf solche Weise bleibt die rosa Farbe besser erhalten.

I n den Modifikationen, wo der Schni t t in Phosphor-Molybdi~n-

s~iure gebeizt wird, k a n n zu seiner Entw~isserung wie Aceton, so auch

Alkohol gebraucht werden. Sehr wichtig, u n d soviel ich weif~, noch vSllig neu erscheint die Tat -

sache, dab die May-Griinwald-Farbe nach Behand lung des Schnit tes

mi t 1)hosphor-Molybd~ns~urenbeize mit den Geweben in solch eine

dauerhaf te Verbindung t r i t t , dal] es nu r mit Miih und Not gelingt,

758 P. S~e, ssareff :

diese Verb indung abzuschwachen, und das nur mi t sehr energischen Dif ferenziermi t te ln .

Auf dieser Ta t sache gr i inde ich eine ganze Reihe yon Modi f ika t ioncn

mi t Erg~nzungsf~rbungen. Modi/ikation Nr. 1 bes t eh t dar in , dal~ das Pappenheimsche Pr inz ip

fiir t rockene Auss t r iche auch bei Gefr ie rschni t ten a n g e w a n d t wird.

l. Formalinfixation. 2. Auswaschen in fliegendem Wasser, Anfertigung yon Gefrierschnitten; die

Schnitte mtissen circa 10 Mikr. dick sein und werden in destilliertem Wasser auf- gefangen.

3. Jeder einzelne Schnitt wird mit einem gebogenen Glasst~bchen im Wasser ausgebreitet, in diesem Zustand in eine Petrischale mit destilliertem ~Vasser iiber- tragen, dort mit einem GlasstKbchen yon unten nach oben gestogen und auf der Wasseroberfl~che ausgebreitet. Danach wird er auf einem Objektgl~schen folgender- wcise aufgeklebt: Der Objekttr~ger wird mit einer diinnen Schicht von Eiweig- Glycerin bedeckt und, um das Eiweig zu verdicken, einige Male durch eine Gas- flamme durchgezogen. Sodann taucht man das nun fertige Gli~schen in die Petri- schale ein und f~ngt den Schnitt auf. Bei einer leichten Neigung des Glases fliegt das iiberfliissige Wasser ab und der Schnitt wird auf diese Weise etwas fixiert. Um ihn aufzukleben, kSnnen mehrere Handgriffe gebraucht werden. Die ein- fachsten sind: Ohne den Schnitt mit Fliegpapier zu trocknen, stellt man das Objekt.. glas senkrecht in den Thermostat oder erw~trmt es vorsichtig auf einer Gasflamme; dabei mug auf das Verschwinden des Wasserflecks acht gegeben werden, woraus wir ersehen kSnnen, dag der Schnitt aufgeklebt und gentigend abgetrocknet ist. Der Schnitt kann auch vorsichtig mit Filtrierpapier getrocknet und in ein Glas mit Methylalkohol eingetaucht werden (der Spiritus kann auch yon oben auf- gegossen werden). Es rut gut, wenn dem Alkohol noch Chloroform im Verh~ltnis yon 2 : 1 oder 3 : 1 beigefiigt wird; anstatt des Methylalkohols kann auch ~thyl- alkohol verwendet werden.

4. Auf den trocknen Schnitt (das ~bertrocknen ist zu vermeiden) werden einige Tropfen May-Gri~nwald-Farbe aufgegossen; das F~rben wird fol~gesetzt, his die ]%rbe einzudicken beginnt.

5. 1--2 Tropfen destilliertes Wasser werden zugegossen und dann wird noch 2--3 Minuten weitergef~rbt.

6. Wenn nStig, Giemsa-~arbe beigeftigt (jeder Tropfen wird in einem Kubik- zentimeter Wasser gelSst) und das F~trben noch 1--2 Minuten fortgesetzt (fiir Granulocyten des .Blutes auch l~nger und, wenn es notwendig w~re, sogar erw~rmen).

7. DestillierSes Wasser. 8. Abtrocknen mit Filtrierpapier. 9. 2 Sekunden langes Eintauchen in reines Aceton. Es kann dazu auch eine

Reihe der Mischungen aus Aceton und Xylol gebraucht werden. 10. Reines Xylol. 11. Kanadabalsam.

Alzheimer gib t den R a t , den Schn i t t vorher eine Ze i t lang in dest i l - l ie r tem Wasser , dem einige Tropfen F o r m a l i n und Osmiums~ure bei-

gefi igt sind, zu hal ten . Die Schni t t e nach dem Schneiden auf dem Mikro tom n ich t lange

i~ des t i l l i e r tem Wassc r hal ten.

F~trbungsmethode der Glia und einiger K(irnelungen des Nerveasystems. 759

Wenn wir diese Modifikation wi~hlen, miissen wir danach trachten, einen vielfarbigen Kontrastschni t t mit rosa Grund zu erhalten. Die Kerne miissen nicht iiberf~irbt werden. Wenn das geschieht, muI~ die Farbenkonzentrat ion vermindert oder die Fiirbungszeit abgekiirzt werden. Es kSnnen auch Differenziermittel angewandt werden (schwache Essig- oder Schwefelsi~ure), auch Aceton mit absolutem Alkohol in gleichen Teilen vermischt, und anderes.

I m 4. Paragraph dieser Modifikation wird darauf hingewiesen, dal~ die Farbe auf einen trockenen Schnitt (aber nicht iibertrockneten) aufgegossen wird. Doch der Schnitt kann auch durch AuftrSpfeln von Alkohol (am besten Methylalkohol) oder Alkohol mit Chloroform ent- w~ssert und dann in einem noch feuchten Zustand gef~rbt werden.

Obgleich mit Hilfe der 1. Modifikation auch Gliafibrillen gefi~rbt werden, so ist sie doch besonders geeignet zur Darstellung verschiedener KSrnelungen: der in den peripherischen Nerven gelegenen KSrne- lungen von Reich, der ,,mitochondrie]len" KSrnelung der Myelin- scheiden von Nervenfasern - - besonders nach Fixieren mit Queck- silber -- , der besonderen ,,Pr~tcipitationskSrnelung" der Myelinscheiden (nach Entfettung), der ,,Fleckigkeiten" periaxialer R~ume (ebenfalls nach Entfettung), der fibrinoiden KOrnelung, der metachromatischen Kugeln (Corpora versicolorata), der FiillkSrperchen, der basophilen Kliimpchen, die der Grundsubstanz substantiae grisae angehOren, und anderer. In einem besonderen Vortrage will ich die obengenannten KSrnelungen eingehender besprechen.

Modi/ikation Nr. 2 beruht auf Anwendung von Beize. Sie ist zur Darstellung protoplasmatischer und besonders faseriger Glia am geeignetsten. Von den KSrnelungen werden von ihr die fibrinoiden und basophilen Kliimpchen der Substantia grisea des Hirns gef~rbt. Das Verfahren bei dieser Modifikation ist folgendes:

Variation Nr. 1: 1. Formalinfixation. 2. Gefrierschnitt. 3. Aus destilliertem Wasser wird der Schnitt mit einem Glasstabchen in

I proz. w~sserige Lfsung der 1)hosphor-Molibd/~ns~ure auf 35--60--90 Sekunden iibertragen. In Fallen, wo pathologische Gliasklerosen vorhanden sind, kann der Schnitt auch viel langer gehatten werden. Das 1)hosphor-Molybd/~nsaurepulver 15st sich leicht in Wasser, wobei eine Opalescenz zum Vorschein kommt. Um letztere zu zerstSren, mul~ die Fliissigkeit auf 24--48 Stunden in den Thermostat gestellt werden, oder wenn es gilt rasch zu verfahren, erw~rmt man dieselbe in einem Kolben auf der Gasflamme, bis sie durchsichtig geworden ist.

4. Kurzanhaltendes Aussptilen in destilliertem Wasser und ~bertragen in eine Petrischale, wo der Schnitt auf der Wasseroberflache ausgebreitet wird.

5. Auffangen des Schnittes mittels eines mit Eiweii~-Glycerin bedeckten Objektgl/~schens, das tiberfliissige Wasser abfliellen lassen und im Notfall das Wasser mit Filtrierpapier aufsaugen, um auf solche Weise den Schnitt zu be- festigen.

Z. f. d. g. Neur. u. Psych. X C I I I . 49

760 I ). Snessareff:

6. Mit Filtrierpapier abtrocknen und mit einer Mischung aus Methylalkohol und Chloroform (im Verh~ltnis yon 2 : 1 oder 3 : 1) his zur Entwi~sserung und A~fhellen des Schnittes begiel~en (gleichzei$ig wiederholt mit Filtrierpapier Crocknen). Es kunll auch Methylulkohol ullcin und sogar ~thylalkohol ver- wendet werden. Endlich kunn man sich uuch mit einfuchem Trocknen des Schnittes im Thermostat oder uuf einer Gasflumme beg~ltigen (s. oben).

7. Auf den noch yore ALkohol mit Chloroform (oder yon Methylalkohol ullein) feuchten oder uu~ einen trocknen Schnitt werden 2--3 Tropfen May-Gr~nwald- Farbe aufgegossen, l~icht lunge f~rben, da ]eicht ein ~Jberf~irben der Kerne und der dichten Gliagewebe uuftreten kann.

8. Man ftige 1--2 Tropfen destilliertes Wasser bei und setze das Fiirben fort. In den meisten Fallen ist letzteres sogar iiberfliissig.

9. Die Farbe mit Wasser uussptilen und in 30 oder 33proz. LSsung Acidi acetici glaciule (1 T. ac. ac. gluc. uuf 2 T. Wasser) differenzieren. Das Differenzieren mul~ so lunge fortgesetzt werden, bis der Kontrast der weil~en und grauen Substanz ganz deutlich hervortritt und der Grund leicht rosa gef~rbt erscheint.

10. Das Pri~purat wird gewassert und mit Filtrierpapier gut abgetrocknet. 11. Aceton oder ubsoluter Alkohol und, wenn nStig, auch irgendein Ol. 12. Xylol. 13. Reines Xylol. 14. Kunadabulsum.

Die Glia erscheint in Fo rm komplizierter, protoplasmutischer, fibrilli~rer Bildungen. Die Weigertschen Gliufibrillen werden dargestellt, sind aber nicht besonders elektiv. Daftir gelingt uns die Fa rbung der ~einsten fibrill~ren Netze (Fibro-reticulum). Es sind deutlich filzartige Aufschichtungen der feinste~ Fibrillen zu sehen, und gleichzeitig k~n~ beob~chtet werden, wie die Elemente der plasmatischen Gli~ in p~tho- logischen F~llen allm~hlich Gestalt ~nnehmen. Es t re ten Gliazellen mit Fibrillenbiindeln auf, die an l~ibrobl~sten des Bindegewebes erinnern und wenn StauungsOdem vorhanden ist, gewahren wir mi t ten unter den ~ervenf~sern ,,Dr~in~gezellen". I ch werde sic noch in einem besonderen Artikel ausfiihrlich besprechen.

Da diese Farbe sehr dauerhaf t ist, k~nn sich der Modifikation Nr. 2 eine g~nze Reihe yon N~chf~rbungen ~nschliel~en.

I ch betrachte sie als V~ri~tionen.

Variation h~r. 2 der Modi]ikatio~ ~Vr. 2. Die Punkte 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 sind dieselben wie in der ersten Variation.

10. Nuch dem Differenzieren wird gew~tssert. 11. 2--15 Minuten lunge Nachf~rbung mit Erythrosin (mit der LSsung von

Held: Erythrosin 1,0 Aq. dest., 150,0 Acidi acetici glaciale gtt. II). 12. Destilliertes Wusser. 13. Abtrocknen mit Filtrierpapier. 14. Differenzieren und Entwi~sserung mit absolutem Alkohol. 15. Xylol. 16. Kunudabulsum.

D~bei t reten die Gli~fibrillen und Axoncn (Axoplusma) im ros~ .I~tintergrund deutlicher hervor. Ery thros in f~rbt das Myelin besonders gut, wenn der Sctlnitt vor dem F~irben in schwucher LSsung yon Osmium-

Flirbungsmethode der Glia und einiger KSrnelungen des b~erve~,systems. 761

s~ure mi t Fo rma l in gelassen wird. Bei der Degenerat ion yon Nerven-

fasern kSnnen die gekSrnten Zellen u n d der Myelinzerfall deutl ich

wahrgenommen werden.

Zum F~rben der Kerne k a n n noch eine Nachf~rbung mi t Safranin mi t noch anderen F a r b e n hinzugefiigt werden.

Variation N..r. 3. In den Paragraphen 1--9 wird ebenso verfahren, wie in der 1. Variation.

10. W~sserung. 11. Alkohol- oder Anilinl6sung yon Safranin 5 Min. 12. Salzsaurenalkohol. 13. W~sserung, Abtrocknen mit Filtrierpapier. 14. Absoluter Alkohol. 15. Reine gesattigte Alkoholl6sung yon Pikrins~ure oder mit absolutem

Alkohol vermischt. 16. Einige Male in absolutem Alkohol durchspiilen. 17. Xylol. 18. Kanadabalsam. Variation Nr. 4. Von 1--13 dasselbe, wie in Variation Nr. 3. 14. 96proz. Alkohol. 15. Wasser. 16. Ges~ttigte Wasserl6sung von Pikrins/~ure mit ges~ttigter L6sung yon

Indigokarmin im Verh~ltnis yon 1 : 1 oder 3 : 1 gemischt -- 2 bis 5 Min. 17. Abwaschen im Wasser, Abtrocknen mit Filtrierpapier. 18. Absoluter Alkohol. 19. Xylol. 20. Kanadabalsam. Das Zellenprotoplasma f/~rbt sich dpnkelblau; die Kerne treten grell rot und

die Gliafibrillen hellblau auf dem gelblich-hellrosa Fond hervor. Variation Nr. 5. Von 1--9 dieselben Handgriffe, wie in der Variation ~/r. 1. 10. Ferner ein langsames oder rasches F~rben mit Safranin (im letzten Falle

ebenso, wie in den vorhergehenden Variationen). l l . Wenn es nStig ist, so differenziert man Safranin mit Salzsaurenalkohol. 12. W/~sserung. 13. Ges~ttigte LichtgriinwasserlSsung. 14. Vorsichtiges Waschen in destilliertem Wasser so lange, bis die Kontraste

gut hervortreten. 15. Filtrierpapier. 16. Kurzes Durchziehen durch Aceton oder absoluten Alkohol. 17. Xylol. 18. Kanadabalsam. Dabei 1/~$t Lichtgriin die F/~rbung der Gliafibrillen intensiver erscheinen. Es

t~te gut, den Schnitt vorerst eine Zeitlang in einer schwachen LSsung von Osmium- s/iure mit Formol zu legen, dann nimmt das Myelin die bl/~nliche Farbe an.

Ganz appart kann noch eine Kombination mit der Beize yon Cajal -- Ammonii bromati 3,0; Formalini 6,0; Aq. dest. 50,0 -- versucht werden.

Modifikation ~Yr. 3. 1. Formalinfixation (oder Ca]als Beize) bis zu 4 Tagen. 2. Gefrierschnitt. 5. Die Schnitte werden in Cajals Beize eingesenkt und auf einige Stundea

in den Thermostat gestellt. 6. Kurze W/isserung.

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762 P. Snessareff: F~trbungsmethode der Glia und einiger KOrneluuge~ usw.

Weiter wird das Aufkleben des Schnittes ~tuf den Objekttrhger, die F~trbung und das iibrige ebenso wie in der Modifikation Nr. 1 ausgeftihrt.

Da bier die Beize yon Ca]al angewandt wird, so sehen wir der F~rbung in der Modifikation Nr. 1 entgegengesetzte F~trbungsresultate; die Gliofibrillen farben sich rosa, die ,,mitochondrielle" KSrnelung der Myelinscheiden hellblau. Die F~trbung ist nicht dauerhaft, aber stellt dafiir die Fibrillen und auch die ver- schiedenen KSrnelungen dar.

Zum Schluft mOchte ich noch einer Fiirbungskombination gedenken. Man kann z. B. den Schnitt zuerst nach der yon mir modifizierten Methode ftir Bindegewebe yon Bielschowslcy (mit Alumen ferricum) bearbeiten und dann mit May-Griinwald f~rben (1. Modifikation); diese Modifikation paftt fiir Granulome besonders gut. Die Myelin- scheiden kSnnen auch nach Gierlich-Herxheimer oder nach Spielmeyer gefRrbt werden und danach die Modifikation Nr. 2 angewandt werden.

Indem ich alle diese Modifikationen und ihre Variationen beschreibe, mSchte ich darauf hinweisen, dab die May-Griinwald-Farbe eine grofte f~rberische Potenz besitzt, welche fiir die normale und pathologische ttistologie des Nervensystems ausgenutzt werden kann. Aber ich muft nochmals wiederholen, daft sie auch fiir ~ndere Gewebe und Organe gebraucht werden kann.

Diejenigen, welche vcrsuchen wollten, meine Methode anzuwenden, bit te ich mit der 2. Variation der Modifik~tion Nr. 2 zu beginnen (Phos- phor-Molybd~ns~urebeize und Nachfi~rbung mit Erythrosin), da die- selbe die hervorragendste ist, und zur Untersuchung entweder deut- liche Gliasklerosen oder Stiickchen aus dem verl~ingerten Rtickeno mark zu w~hlen.