ウエストナイルウイルス 特異的血清検査法

独立行政法人 農業・食品産業技術総合研究機構

動物衛生研究所 動物疾病対策センター 知的基盤管理室

清水 眞也

From West Nile Virus in CDC web

West Nile Virus (WNV) WNVはフラビウイルス科フラビウイルス属に属する、エンベロープを有する RNAウイルスで、野鳥と蚊の間で維持および増幅される。 WNV感染症は、ヒト、産業動物および野生動物に被害をもたらす、世界的に重要な 人獣共通感染症である。

West Nile Virus (WNV) WNVは南北アメリカ、ヨーロッパ、中東、アフリカ、ロシア、 オーストラリア等で広範囲に蔓延している。

WNVおよび日本脳炎ウイルス(JEV)の分布図

WNV粒子の電子顕微鏡像 （出典：国立感染症研究所）

直径約 50nmのエンベロープを持ったウイルスです。エンベロープにはEタンパクと Mタンパクの２種類を有します。その内部にはCタンパクのカプシドがあり、中には約11kbのプラス鎖RNAが入っています。 長さ約11kbのウイルスゲノムRNA（内部のひも状のもの、プラス鎖一本鎖RNA）をカプシド（青）が取り囲みヌクレオカプシドを形成している。これを さらに脂質二重膜（緑色）が包み込んでいる。脂質二重膜にはEタンパク、Mタンパクが存在している。Eタンパクはウイルスの抗原性やレセプターとの結合に 関与している。

from: http://www.tmin.ac.jp/medical/11/virus3.html

西ナイルウイルスの粒子構造（模式図）

West Nile Virus流行地での被害例 (2012年)

アメリカでは2012年に、史上最悪の流行が観測された。 48州で5387例のWNV感染が報告され、うち2734例(51%)が神経症状を発症し、243人(4.5%)が死亡した。

2012年のアメリカにおけるWNV発生地点(出典：CDC)

WNV感染症の診断には、1.ウイルス分離、2.ウイルスRNA検出、3.ウイルス抗原検出、4.抗WNV抗体の検出、の四つが用いられる。

WNVのウイルス血症の期間は通常3日程度と短い。また、多くの場合WNV検出可能期間は症状発症前となる。また、ほとんどWNV感染は不顕性に終わることが知られている。このため人や馬などの生前診断は、抗WNV抗体の検出をもって行われている。

WNV感染症の診断法の概要

・WNV感染した動物および人に対する有効な治療薬は現在市販されて いない。

・WNVに対するワクチンが最も期待される対処法であるが、現在市販されて いるのは馬用ワクチンのみであり、人に用いることはできない。

・アメリカなどの流行国では、サーベイランスによりWNV流行が疑われる地 域を特定し、警報の発令、殺虫剤の散布などを行って、感染率を低下させ る試みが行われている。

・野鳥におけるWNV感染は、馬や人での流行よりも早いことが報告されて いる。

WNV感染に対する対処法

→ WNV感染動物の検出が重要である。

近年の日本周辺でのWest Nile Virusの動向 極東シベリアの野鳥において、WNVが流行していることが、複数の研究において明らかにされている (Ternovoi 2006, Murata 2011)。

また、北海道、韓国、中国において抗WNV抗体陽性野鳥が報告されており、 中国において抗WNV抗体陽性犬、猫が報告されている (Saito 2009,Murata 2011, Yeh 2011, Lan 2012)。

2013年現在までに日本国内でWNVの野外分離例は報告されていない。

日本周辺のWNV分布

既存の抗WNV抗体検出法の問題点 1. フラビウイルスの共通抗原性

93

82

77-78

72-74

40-44

77 69

62

46-53

フラビウイルス属ウイルスのE領域アミノ酸配列に基づく系統樹

WNVが属するフラビウイルス科フラビウイルス属には他にも、日本脳炎ウイルス(JEV)、セントルイス脳炎ウイルス(SLEV)、マレーバレー脳炎ウイルス(MVEV)などが属している。これらのウイルスは70%以上のアミノ酸配列を共有している。

→ 中和法、IgM捕捉ELISA、間接ELISAでは交叉反応を生ずる。

日本周辺の主要なフラビウイルスの分布

日本脳炎ウイルスとウエストナイルウイルスはうり二つ。 抗体の特異性では、簡単には区別が付かない。

日本脳炎ウイルス ウエストナイルウイルス

日本は日本脳炎ウイルスが常在しているから、日本脳炎ウイルスのワクチンを打っておこう。

周りの国でウエストナイルウイルスが流行っているから検査し

ましょう。

そんな馬鹿な？日本は汚

染国？

ウエストナイルウイルス陽性です。

血清診断法では、ウエストナイルウイルスと日本脳炎ウイルスでは、交叉反応があるため、区別が困難である。

抗WNV抗体の検出には一般的に、以下の４つの手法が用いられる。 1. 中和法 ・・・・・・・・・・・・・WNVと血清を混合し、血清中の抗体がWNVを不活化 するかどうかを判定する。指標診断法として用いられる。 2. IgM抗体捕捉ELISA・・血清中のIgMのみを固相化し、このIgMとWNVとの反応 性を判定する。初期のWNV感染の判定に用いられる。 3. 競合ELISA ・・・・・・・・・・血清中の抗体とモノクローナル抗体との競合を利用して、 WNV特異的抗体を検出する。 4. 間接ELISA・・・・・・・・・・固相化したWNV抗原に対する、血清中の抗体の 反応性を判定する。

抗WNV抗体検出法

ウイルス中和試験 ELISA 血球凝集阻止試験

ウエストナイルウイルスの血清検査法およびその特性

西ナイルウイ

ルスと日本脳炎ウイルスの区別

単独感染なら、タイターの比較により可能

生ウイルスの使用 時間がかかる

できない

短時間、高精度

できない

時間がかかる 長所・短所

日本脳炎ウイルスで実施

・代表的な血清診断法である中和法は、感染性のあるWNVを取り扱う必要があるた め、P3施設でしか診断を行う事ができない。 ・IgM抗体捕捉ELISAは比較的WNV特異的であり、アメリカにおいても診断法の第一選択肢として用いられている。しかし、

①JEVワクチン接種をした動物では抗WNV IgM抗体が産生されないことがある。

②抗JEV IgM抗体は交叉反応を示すため、JEV蔓延地域では、JEVに対するIgM抗 体捕捉ELISAも行う必要がある。

③WNVに対するIgM抗体は500日以上に渡って産生され続けることもあるため、近直 の感染か確認するため、抗WNV IgG抗体の有無を確認する必要がある。

等の問題点がある。このため、

既存の抗WNV抗体検出法の問題点 2. その他の問題点

→JEV蔓延地域でも用いることができる、より特異性の高い血清診断法が 求められている。

・単一の抗体産生細胞に 由来するクローンから得られた抗体分子であり、幅広い分野で利用されている。 ・WNVとJEVは77%のアミノ酸

配列が共通であるが、残りの23%のアミノ酸配列を認識する

モノクローナル抗体を確立すれば、ウイルス種特異的な診断に用いる事ができる。

モノクローナル抗体とは

モノクローナル抗体の作成法 (出典：Wikipedia)

1. 血清診断法

・競合ELISA 又は Blocking ELISA →ウマや鳥のサーベイランスに用いられている。市販キットは無い。 2. 抗原検出法

・免疫組織染色 →死亡野鳥のサーベイランスやウマの診断に用いられている。 市販の抗体は交叉性や感度の点で問題がある。

・イムノクロマトグラフィー →蚊や死亡野鳥のサーベイランスに用いられている。 市販のキットは特異性、感度等が確認されている。

モノクローナル抗体を用いた診断法

・競合ELISAは、感染血清中のWNV特異抗体とモノクローナル抗体を競合 させることで、動物のWNV感染を特異的に検出する手法である。 ・アメリカなどでは野外サーベイランスなどに用いられてきた。

競合ELISAとは

・現在アメリカで主流の競合ELISAは、オーストラリア株のWNVに対するモノクローナ ル抗体を用いており、検出可能なWNV株に対する検証が詳細に行われていない。

・JEVとの交叉性は未検討である。

・IgMモノクローナル抗体を用いており、抗体の安定性にも問題がある。

・試験に高濃度の血清が必要であり、野鳥などの小動物での試験が難しい。

→幅広いWNV株に対する抗体を検出可能な、高感度競合ELISA法を 開発した。

従来の競合ELISAの問題点

開発したWNV特異的競合ELISAの特性 1. 各地のWNV株および近縁ウイルスとの反応性

WNV NY99株

WNV Kunjin株

WNV eg101株

WNV g2266株

JEV Nakayama株

JEV JaNAr0102株

SLEV Parton株

MVEV 1/51株

開発したWNV特異的競合ELISAの特性 2. 陽転日数(中和法との比較)

0

20

40

60

80

100

0 20 40

WN

V感染

ニワトリ

陽性

率(%

)

感染後経過日数

SHW-29C2系競合ELISA

SHW-31B2系競合ELISA

SHW-31B2_x100系競合ELISA

中和法(90%プラーク減少)

・馬、人、野鳥でのWNV抗体検査 →より迅速かつ特異的な検査を行う事が可能となるため、 第一選択の一つとなりうる。 ・抗体サーベイランス →高感度系であるため、少量の血清サンプルで診断可能 である。この特性は特に野鳥のサーベイランスにおいて 重要である。

想定される用途

・WNV感染動物の臓器中のWNV抗原を検出することで、WNV感染を 診断する。一般的な手法であるため、世界中で用いられている手法である。

・アメリカなどでは死亡野鳥、馬サーベイランスなどに用いられてきた。

WNVの免疫組織染色 (その他のモノクロ－ナル抗体）

・現在販売されている抗体のうち、ポリクローナル抗体は 近縁のウイルスにも反応するため、正確な診断ができない。

・WNV特異的なモノクローナル抗体も市販されていたが、 感度が低いため、実用性に問題との論文が発表されている。 現在のところ日本での入手はできない。

従来の市販抗体の問題点

→ ポリクローナル抗体に匹敵する感度の WNV特異的モノクローナル抗体を開発

開発した抗WNV抗体の 免疫組織染色における特異性

SHW-32B1抗体 SHW-7A11抗体 市販抗体

WNV 感染野鳥

JEV 感染豚

＊なお、市販のモノクローナル抗体は図のWNV感染野鳥切片には反応しなかった。

・より多くのWNV感染動物血清での検証 ・組換えタンパク質抗原の作製と有用性の検討 ・キット化に向けた手順の簡素化

実用化に向けた課題

本技術に関する知的財産権

発明の名称： ウエストナイルウイルス構造蛋白質特異的モノクローナル抗体、 および該モノクローナル抗体を用いたウエストナイルウイルス感染の判定方法 出願番号 ： 2011-066253 出願人 ：農業・食品産業技術総合研究機構 発明者 ：清水眞也、広田次郎

お問い合わせ先

独立行政法人 農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究所 企画管理部 業務推進室 企画チーム Tel/Fax 029－838－7895

E-mail niah-planning＠ml.affrc.go.jp