Apoptoza u neuromuskularnim i neurodegenerativnim bolestima

Goran ŠimićĐurđica Šešo-Šimić

5. Okrugli stolApoptoza - programirana smrt stanice

Akademija medicinskih znanosti Hrvatskei Hrvatski institut za istraživanje mozga

13. ožujka 2013. Zagreb

Hrvatska zaklada za znanostProjekt br. 09/16 (2012-2014)

Croatian Science Foundation

TNFR1 TNFa

Vanjski put aktivacije apoptoze („Extrinsic" apoptosis pathway)

Apoptosis

CAD

ICADEndoG

PI3KPKC

IkBa

PUMA p53AIP1

FADD

SMAC

Arts

HTRA2

CIAP1

Caspase 9

APAF1

Cytoc

MDM2

ATM

p53

EndoGAIF

AIF

BAKBAX

p90RSK Akt1

CAD

FLIP

BIM

p14(ARF)

Noxa

PARP

BIDBAD

Caspase3

Caspase 8

NF-kB

NF-kB

ApoptosisApoptosis Depolarization

OncogenicSignal

FLIP,CIAP2,BFL1,BCL2 BAK,BAK,BID,

Ras,Noxa,PUMA,APAF1,Survivin,

BCL2

DNA Fragmentation

DNA Fragmentation

Mito

chon

dria

Withdrawalof

GrowthFactors

Apoptosis

IKKs

TRADDTRA

DD

Procaspase 8TRAF2RIP

MMP

BCL2

Procaspase 8

Caspase 7 VDAC

DaxxPAR4

ZIPK

POD

GrowthFactorGrowthFactor

GrowthFactor

Receptor

Apo2L/Apo3L

Apo2/Apo3

FADDProcaspase 8

tBIDBCLXL PMRANT

CypD

PML

p53

FasFasL

FADD

Chk2

Unutarnji put aktivacije apoptoze („Intrinsic" pathway - /mitochondrial/ apoptosis)

APOPTOSIS

Depolarization

Oncogenic Signal

DNA Fragmentation

DNA Damage

ER Stress

Gene Expression

MMP

FasL

Fas

CIAP1

APAF1 CytoC

PKC

p90RSK

BAD

Growth Factor Receptor

Akt

SMAC

Arts

HTRA2

AIF

Noxa PUMAp53AIP1

p14ARF

BCLXL

MDM2

BID

BAXBAK

Withdrawal of Growth Factors

Chemothera-peutic Drugs

Chk2ATM

BIM

AIF

VDAC

PMRCypDANT

PI3K

tBID BCL2Caspase 8

Caspase 3

Procaspase 8

FADD

Caspase9

Endonuclease G

EndoG

p53

p53

Caspase12

Growth Factors

p53

Pojednostavljeni prikaz vanjskog i unutarnjeg puta aktivacije apoptoze

Miller JB, Girgenrath M. The role of apoptosis in neuromuscular diseases and prospects for anti-apoptosis therapy. Trends Mol. Med. 2006;12:279-286

PTP = promjene u permeabilnosti membrane mitohondrija (permeability transition pore), = membranski potencijal mitohondrija, ROS = slobodni radikali kisika (reactive oxygen species)

ICC prikaz aktivirane kaspaze-3 u bioptatima mišićau različitim kategorijama nasljednih NM bolesti

SMA1, SMA2SMA3

CMT1

DMD, BMD,LGMD, FSHD

Weller et al., Greenfield’s neuropathology, 2002

In situ detekcija oligonukleosomalnih fragmenata DNA

- gel elektroforeza (nedovoljno informativna)- in situ tehnike obilježavanja oligonukleosomalnih

fragmenata DNA:- TUNEL (“terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nick end

labeling”)- ISEL (“in situ end-labeling”) – manje lažno pozitivnih rezultata- Na 3’ kraju oligonukleosomalnih fragmenata DNA vežu se

obilježeni nukleotidi (kod ISEL metode biotinom, u TUNEL metodi fluorescinom), koji se zatim vizualiziraju (kod ISEL metode pomoću avidina konjugiranog peroksidazom, a kod TUNEL metode antifluorescinskim protutijelom konjugiranim peroksidazom)

Dokazivanje ultrastrukturalnih obilježja apoptoze

- do sada su obilježja apoptoze proučavana uglavnom na limfocitima i neuronima, manje na mišićnim stanicama

- kondenzacija jezgre i citoplazme- fragmenacija DNA u oligonukleosomalne

fragmente putem aktiviranih endonukleaza

- kondenzacija kromatina sve do piknoze jezgre

- protruzije stanične membrane (zvjezdolik izgled)

- stvaranje “apoptotičkih tijela” i odstranjivanje heterofagocitozom

Clarke P, Anat Embryol, 1990

Nasljedne spinalne mišićne atrofije (SMA)

- heterogena skupina bolesti koje zahvaćaju DMN

- u djece najčešće zahvaćaju proksimalne skupine mišića ruku i nogu te interkostalne mišiće

- incidencija 4-10/100.000- najčešći oblik se nasljeđuje AR- uzrok SMA su delecije SMN1

gena (eksona 7) na dugom kraku 5. kromosoma

Količina funkcionalnog SMN proteina pune duljine korelira s kliničkom slikom SMA

0102030405060708090

100

Normal Carrier SMA-3 SMA-2 SMA-1

% k

olič

ine

SMN

pro

tein

a pu

ne d

uljin

e

razina SMN proteina potrebna za normalnu funkciju motoneurona (otprilike 23%)

SMN1+/+ SMN1-/-2-3 SMN2

SMN1-/-3-4 SMN2

SMN1-/-4-8 SMN2

SMN1+/-

Feldkötter et al., Am J Hum Genet, 2002

Funkcije SMN proteina

- dio makromolekularnog kompleksa koji sastavlja male ribonukleoproteine jezgre

- sam ima anti-apoptotičku aktivnost (Iwahashi et al., Nature, 1997)

- djeluje sinergistički s anti-apoptotičkim članovima bcl-2 obitelji (Anderton et al., Neuroscience 2012)

- služi kao transporter molekula aktina koje imaju važnu ulogu u diferencijaciji motoričkih neuroblasta (izrastanju aksona i dendrita)

Klinička slika SMA- hipotonija i progresivna mišićna slabost

proksimalnih mišića udova- smanjena spontana mišićna aktivnost i ugasli

duboki tetivni refleksi (arefleksija)- tip “0” – teški prenatalni oblik bolesti- tip 1 - Werdnig-Hoffmannova bolest- tip 2 – srednje teški oblik bolesti- tip 3 – blagi oblik (Wohlfart-Kugelberg-Welanderova

bolest)- tip 4 – adultni oblik

SMA tip 1

- oskudni pokreti fetusa- pri rođenju hipotonija, tihi plač- novorođenče ima poteškoće pri hranjenju- dijete nikad ne nauči sjediti samostalno- smrtni ishod prije druge godine života zbog

razvoja respiratorne insuficijencije- mentalni razvoj normalan

SMA tip 1

teška hipotonija glavica zaostaje u trakciji

Zbog slabosti interkostalne muskulature djeca sa SMA dišu isključivo pomoću kontrakcija dijafragme. Stoga dolazi do čestih i teških respiratornih infekcija, a smrt nastupa obično unutar godine dana od postavljanja dijagnoze.

SMA tip 2- dijete sjedi samostalno- nikad ne prohoda samostalno- tipičan tremor prstiju i šaka zbog fascikulacija i mišićne

slabosti- očituje se od 3. mjeseca života- smrtni ishod najčešće do kraja 7. godine života

SMA tip 3- očituje se obično nakon 18. mjeseca života kada dijete

prohoda- dijete hoda gegajući se, teško hoda po stubama, često pada

EMG- znakovi neurogenog

oštećenja: fibrilacija i fascikulacije mišića

- brzina provođenja normalna, u teškim oblicima može biti usporena (zbog retrogradne Waalerove degeneracije uslijed propadanja DMN i sekundarne demijelinizacije)

- normalan nalaz ne isključuje mogućnost SMA (treba ponoviti pretragu)

- potencijali imaju velike amplitude, ali nisku frekvenciju

Ilustracija preuzeta s http://emedicine.medscape.com/

normalan nalaz

SMA

miopatija (DMD, BMD)

SMA tip 1, biopsija m. biceps brachii (H-E bojenje)

neurogena atrofija mišića:- karakteristična izmješanost fascikula atrofičnih i hipertrofičnih vlakana

Histopatologija SMA - mišić

Izraženost aktivirane kaspaze 3 u skvrčenom pojedinačnom mišićnom vlaknu koje umire apoptozom

Sem

ikva

ntita

tivno

ođ

ređe

na p

oziti

vnos

t

Pretpostavlja se da je uzrok apoptoze mišićnih vlakana u SMA izostanak inervacije (a to je posljedica gubitka motoneurona leđne moždine)

Akt. kaspaza-3 (200x) ISEL 440x

Histopatologija SMA – leđna moždina

- prednji rogovi leđne moždine: simetričan gubitak alfa motoneurona (A = kontrola, B = SMA tip 1)

Bojanje krezil-violetom po Nisslu

Tip 1 (apoptoza) –rane promjene TUNEL

Šimić G. et al., J. Neuropathol.Exp. Neurol. 2000

Tip 1 (apoptoza) –kasne promjene

Šimić et al., J. Neuropathol.Exp. Neurol. 2000

ISEL

Nissl

Tip 1 / tip 2 (apoptoza/autofagija)

Šimić et al., J. Neuropathol.Exp. Neurol. 2000

Tip 3b(citoplazmatska smrt, nekroza)

Šimić G et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2000; Šimić G, Acta Neuropathol., 2008

Zaključak

• Apoptoza ima značajnu ulogu u patogenezi SMA, inicijalno zbog odumiranja motoneurona (aktivacijom unutarnjeg puta), a zatim i zbog degeneracije mišićnih vlakana vjerojatno aktivacijom vanjskog puta

Mišićne distrofije

- genetički vrlo heterogena skupina bolesti

- klinički vrlo slične- dominira atrofija proksimalnih mišića

ramenog i zdjeličnog obruča te pseudohipertrofija mišića potkoljenice

- tijek bolesti progresivan- blag do potpun gubitak mišićnih funkcija

Nasljedne mišićne distrofije- abnormalnosti distrofina i

proteina povezanih s distrofinom uzrok većine mišićnih distrofija

- distrofinopatije:• MD Duchenne – distrofin

potpuno nedostaje• MD Becker – količina distrofina

smanjena- po učestalosti značajne i:• pojasne mišićne distrofije –

LGMD• facioskapulohumeralna - FSHD

normalanmišić

BMD

DMD

imunofluorescencija distrofina

Karpati et al., Disorders of Voluntary Muscle, 2010

Distrofinsko-glikoproteinski kompleks (os)

- distrofin s ostalim citoskeletnim proteinima omogućuje mehaničku podršku mišićnoj membrani i normalnu kontraktilnost mišićnog vlakna

Karpati et al., Disorders of Voluntary Muscle, 2010

Distrofinopatije- mutacija gena za distrofin na

Xp21 kromosomu• DMD: mutacija zahvaća

okvir čitanja gena i distrofin se u većini vlakana ne proizvodi

• BMD: delecija ne zahvaća okvir čitanja, već pojedine eksone; nastaje skraćeni oblik distrofina, blaža klinička slika

DMD

BMDKarpati et al., Disorders of Voluntary Muscle, 2010

Klinička slika DMD- prvenstveno boluju muška djeca, djevojčice

obolijevaju uslijed inaktivacije kromosoma X (Turnerov sy, translokacija kromosoma X)

- učestalost - 1:3500 novorođenih dječaka- najčešća klinička manifestacija u dobi 3-5 god.- nestabilni hod na prstima, gegajući hod,

pozitivan Gowersov znak, pseudohipertrofija potkoljenica (zbog umnažanja veziva i masnog tkiva), lordoza, izbočen trbuh, scapulae alatae, većina ima snižen IQ

- kardiomiopatija često nezamjećena zbog mirovanja

- nepokretnost između 7-12 god., smrt između 15-21 god. zbog respiratorne insuficijencije

- povišena vrijednost serumske CK 50-100 x već u pretkliničkoj fazi bolesti

Klinička slika BMD

- blaži oblik- manifestira se obično između 10-20 god.- bolesnici hodaju i 30 god. nakon prvih simptoma- količina distrofina u mišiću je 3-20% normalnih

vrijednosti- često snižen IQ- povišena vrijednost serumske CK (5 i više puta)

EMG

Ilustracija preuzeta s http://emedicine.medscape.com/

normalan nalaz

SMA

miopatija (DMD, BMD)

Potencijali niskih aplituda, fibrilacije, ali normalna brzina provođenja

Histopatologija DMD i BMD

- destrukcija mišićnih vlakana- regenerativne promjene mišićnih vlakana- imunohistokemijsko dokazivanje distofina u bioptatu mišića

neophodno za donošenje dijagnoze• radi razlikovanja DMD od BMD kvantitativno određivanje

količine distrofina PCR-om

DMD 2 god. DMD 6 god. DMD 11 god.

H-E 140x

hiperkontrahirana eozinofilična vlakna

regenerirajuća vlakna s bazofiličnom citoplazmom i velikim jezgrama

nadomještanjemišićnog masnimi vezivnim tkivom

Izgled mišićnih vlakana u bolesnika s DMD

- opsežan gubitak mišićnog tkiva koje je gotovo u cijelosti zamijenjeno masnim i vezivnim tkivom („pseudohipertrofija“) te varijabilna veličina preostalih mišićnih vlakana; na pojedinim rezovima (crne strelice) bila su jasno uočljiva područja invazije preostalih mišićnih vlakana od strane makrofaga

H-E, 60xH-E, 75x

Izgled mišićnih vlakana u bolesnika s BMD

- šarolika histološka slika: obilježja ranih, umjerenih i kasnih stadija - rani: nakupine nekrotičnih mišićnih vlakana, invazija fagocita (siva strelica) - umjereni: pokušaj regeneracije vlakana (crne strelice) - kasni: povećena količina vezivnog tkiva (pseudohipertrofija), divovska vlakna (plave strelice) hiperkontrahirana vlakna (zelena strelica)

promjene u ranom i umjerenom stadiju

promjeneu kasnom stadiju

Izraženost kaspaze-3 i ISEL pozitivnosti u bioptatima mišića bolesnika s MD

BMD, ISEL, x60

DMD, ISEL, x200BMD, imf na akt. kaspazu-3 + DAPI, x200

Zaključak – neuromišićne bolesti

• Broj mišićnih stanica pozitivnih na aktiviranu kaspazu-3 daleko je manji u BMD i DMD (kod LGMD i FSHD gotovo zanemariv) nego u SMA.

• Ipak, iako ne statistički značajan, uočen je trend manjeg broja pozitivnih stanica u starijih ispitanika, te veći broj apoptotičnih stanica u DMD u odnosu na BMD

• Apoptoza u ovim mišićnim stanicama očigledno nastupa aktivacijom unutarnjeg puta

Nema izražene apoptoze živčanihstanica u Alzheimerovojbolesti (Šimić G. et al., Exp.Neurol. 2000)

Apoptoza u neurodegenerativnim bolestima – Alzheimerova bolest

Hipokampalna formacija

Abortivna apoptoza (abortoza)

Budući da su u AD aktivirane neke aktivacijske kaspaze, npr. kaspaza 8 (slika A) i kaspaza 9 (slika C) u CA1 području hipokampusa (Raina et al., 2001), ali nisu izvršne (npr. kaspaze 7, 6 i 3), ovaj proces je nazvan abortivna apoptoza (abortoza).

Reina et al., 2001

Tip 4 (aponekroza, abortoza)

Cheng et al.,Biochem. J. 2003

Stanična smrt – kontinuum promjena

Martin, Prog. Mol. Biol. 2012

ALS (Lou „Buster” Gehrig’s disease)

Ledler & Dokholyan, Prog. Mol. Biol. 2012

Mutacije gena povezanih s nastankom fALS

Ledler & Dokholyan, Prog. Mol. Biol. 2012

Mutacije Cu,Zn-SOD1 gena

Ledler & Dokholyan, Prog. Mol. Biol. 2012

Ledler & Dokholyan, Prog. Mol. Biol. 2012

Aktivacija apoptoze u ALS vanjskim putem

Zbog mutacije SOD1, disfunkcionalni protein se veže za VEGF mRNA, zbog čega nastupa gubitak neurotropne potpore aksonima motoneurona (nastupa povlačenje aksona s NMJ).

Ledler & Dokholyan, Prog. Mol. Biol. 2012

Aktivacija apoptoze u ALS unutarnjim putem

Martin, J. Bioenerg. Biomembr. 2011

Ledler & Dokholyan, Prog. Mol. Biol. 2012

ALS / FTLD-U kontinuum – aktivacija unutarnjeg puta

2006: transactive response DNAbinding protein (TDP-43) iFUS/TLS (fused in sarcoma or translocated in lyposarcoma)

Arai T et al., TDP-43 is acomponent of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in FTLD and ALS. Biochem Biophys Res Commun 2006, 351:602-611

Neumann M et al., Ubiquitinated TDP-43 in FTLD and ALS. Science 2006,314:130-133

Sreedharan J et al., TDP-43mutations in fALS and sALS, Science 2008, 319:1668-1672

Kwiatkowski TJ Jr et al., Mutations in the FUS/TLS gene on chromosome 16 cause fALS. Science 2009, 323:1205-1208

FTLD / ALS – različiti fenotipovi uslijed istih ili sličnih mutacija

Boxer et al., Alzheimer’s & Dementia, 2012

Zaključak – neurodegenerativne bolesti

Aktivacija apoptoze i vanjskim (ALS) i unutarnjim putem ima značajnu ulogu i u brojnim drugim neurodegenerativnim bolestima, posebice u ALS, Huntingtonovoj bolesti, Friedreichovoj ataksiji i sinukleinopatijama. Iako dolazi do aktivacije pojedinih kaspaza i drugih markera karakterističnih za rane faze apoptoze, apoptoza nije dominantan način smrti živčanih stanica u tijeku Alzheimerove bolesti (nema aktivacije aktivirane kaspaze-3 (osim ponekad samo u CA1 području hipokampusa) kao ni ultrastrukturalne morfološke potvrde da doista dolazi i do izvršenja apoptoze).

Hvala na pažnji!

Prezentaciju možete preuzeti na:

http://alzbiotrack.hiim.hr

Hrvatska zaklada za znanostProjekt br. 09/16 (2012-2014)

Croatian Science Foundation