Gaismas mikroskopija

Dr. biol. Tūrs Selga

\\Priede\grozs\MolekularasBiologijas\Mikroskopijas_met

Objektīvi

• Ahromātiskie objektīvi samazina sarkanās un zilās gaismas hromatiskās aberācijas, jo lēcu sistēma objektīvā veidota tā, lai apvienotu vienā fokusa punktā zilās gaismas viļņus ar garumu 486 nm un sarkanās gaismas viļņus ar garumu 656 nm.

• Objektīvs neveic zaļās gaismas hromatisko aberāciju, ap attēlu var veidoties zaļš oreols.

• Objektīvs izlīdzina dzelteni zaļās gaismas sfēriskās aberācijas. Lēcu sistēma ir piemērota, lai skatītos objektu maksimums 30 – 40 reižu lielā palielinājumā.

• Fluorīda jeb semi-apohromātiskā objektīva lēcas satur dabīgo vai sintētisko fluorīdu.

• Tas samazina krāsu izkliedi un labāk novērš optiskās aberācijas.

• Fluorīda objektīvs novērš zilās un sarkanās gaismas hromatiskās aberācijas, kā arī zilās un zaļās gaismas sfēriskās aberācijas.

• Semi-apohromātiskais objektīvs ir piemērots fotomikrogrāfijai baltās gaismas spektrā un tam ir daudz augstāka izšķirtspēja, jo maksimālā skaitliskā aperatūra ir 1,3.

• Vislabākais ir apohromātiskie objektīvi. Tos veido pat 12 dažādas lēcas.

• Tas kavē četru krāsu – tumši zilas, zilas, zaļas un sarkanas – hromatiskās aberācijas, kā arī trīs krāsu – tumši zilas, zilas un zaļas – sfēriskās aberācijas.

• Apohromātiskie objektīvi ir vislabākie ne tikai tādēļ, ka tie novērš visvairāk aberācijas, bet arī tādēļ, ka tie nodrošina vislielāko palielinājumu un skaitlisko aperatūru.

Hromatiskās aberācijas

• Baltā gaisma sastāv no visu trīs pamatkrāsu gaismas viļņiem: zilas, zaļās un sarkanas krāsas gaismas.

• Gaismas viļņi ir ar noteiktu garumu, tāpēc atšķirīgi mainās to ātrums atšķirīgās vidēs un staru laušanas leņķis.

• Tāpēc visas krāsas gaismas stari pēc iziešanas cauri lēcai nekrustojās vienā fokusā.

• Tas rada hromatiskās aberācijas.

Izšķirtspēja

• Izšķirtspēja ir skaitlisks lielums, kas norāda mazāko attālumu, kādā var saskatīt divus

• punktus un tie nesaplūst vienā objektā. Skaitliski izšķirtspēja ir atkarīga no absorbētās gaismas viļņa garuma un skaitliskās aperatūras.

• Izšķirtspēja pa „xy” asi aprēķina

• Izšķirtspēja pa „z” asi aprēķina

Teorētiski mazākais objekts, ko var apskatīt gaismas mikroskopā, kad gaismas viļņa garuma 488 nm un N.A.= 1,4, ir 0,2 mikrometrus liels pa „xy” asi un 0,4 mikrometrus pa „z” asi.

Fokālās plaknes dziļums

• Atkarībā no palielinājuma, skaitliskās aperatūras un imersijas vides, fokālās plaknes dziļums ir mainīgs lielums.

Apgaismojums

• Attēla veidošanos gaismas mikroskopā nodrošina parauga spēja absorbēt gaismu,

• gaismas viļņu difrakcija un interference. • Difrakcija ir gaismas viļņu noliekšanās ap šķērsli. • Difrakcija izraisa divu vai vairāku viļņu pārklāšanās. • Konstruktīvā interference ir tad, kad viļņi pārklājas vienā

fāzē un veidojas gaiša interferences aina,• Viļņu pārklāšanos dažādās fāzēs, sauc par destruktīvo

interferenci un interferences aina ir tumša. • Gaismas stariem virzoties cauri paraugam notiek selektīva

baltās gaismas absorbcija atkarībā no objekta krāsas un blīvuma. Tādējādi iegūst krāsainu attēlu.

Apgaismošanas veidi

Diferenciālās interferences kontrasta mikroskopija

• Diferenciālās interferences kontrasta (DIC) mikroskopija (arī Nomarska mikroskopija

• Apgaismošanas metode, kas ļauj palielināt kontrastu dzīvos, nekrāsotos un caurspīdīgos objektos.

• Darbojas uz interferometrijas principa, mērot optiskā ceļa garumu.• Obligāta prasība ir caurspīdība.• Var pētīt uztriepes, bet nevar biezus krāsotus griezumus.

Mikroskopa adapteris

• Veidots no gaismas necaurlaidīgas caurules un okulāra lēcu komplekta, kas pieskrūvējams pie mikroskopa foto izejas vai ievietojams okulāra vietā.

• Pie mikroskopa adaptera nepieciešams nekustīgi fiksēt foto/video iekārtu.

• Svarīgs ir lēcas diametrs.• Vēlams, lai gaismas stari ietu

paralēli.

Attēla iegūšana

• Attēlu pirms ierakstīšanas apskata uz datora monitora reālā laikā.

• Attēlu ieraksta foto/video iekārtas atmiņā (vēlams izmantot tālvadības pulti).

• Attēlu ieraksta datora atmiņā ar atbilstošu datorprogrammu.

“Virtual Dub” izmantošana attēla kontrolei un ierakstīšanai

• Attēla pieprasīšana:

File/Capture AVI.

• Attēla izšķirtspējas regulēšana.

• Filmēšanas režīms.

Video: Amēba

Šūnu un organoīdu izmēru mērīšana

Kalibrēšana

• Okulāra lineāls

• Mēroga nogrieznis (zīmējums un digitāla kopija)

• Programmas kalibrēšana