GeneArt 人工遺伝子合成～タンパク発現

欲しい遺伝子・タンパク質を楽に入手する快適な方法

目次人工遺伝子合成ワークフローの概要 ................................................ 2

GeneArt とは...... ........................................................................ 3

GeneArt 生産拠点 ....................................................................... 4

GeneArt Gene Synthesis ............................................................ 5

GeneArt Strings DNA FragmentsとLibraries ................................ 7

遺伝子最適化............................................................................... 9

発現ベクターへの直接クローニングサービス .................................. 11

クローニング&プラスミドサービス ................................................. 12

GeneArt Elements Vector Construction サービス ....................... 13

GeneArt Elements Combinatorial Parts Assembly サービス ........ 15

Gene-to-protein ....................................................................... 17

GeneArt Directed Evolution ...................................................... 18

GeneArt ポータルサイト ............................................................. 19

人工遺伝子合成ワークフローの概要GeneArt 人工遺伝子を選択する理由

これまで目的遺伝子をクローニングするための時間が想定以上にかかったことはありませんか？従来のPCRおよびクローニング手法では配列の最適化や問題解決に貴重な実験時間や多く経費を費やすこととなります。お客様の求める遺伝子が最適化されたのち合成され、エラーフリーでPCRを行えるとしたらどうでしょうか？人工遺伝子合成、あるいは“Synthetic biology”とも呼ばれる方法で実現します。この技術は分子クローニングのステップをより簡単にします。

業界トップレベルの人工遺伝子合成サービスや最適化されたタンパク質発現、人工遺伝子合成からタンパク質の発現および安定細胞株の樹立までの全てのプロセスの外部委託を望まれている方のために役立つGeneArt製品およびサービスについての概略をこの冊子にまとめました。

一般的なGeneArt 人工遺伝子合成ワークフローの“ステップ・バイ・ステップ”ガイドを以下に示します。

どのテクノロジーがお客様に最適でしょうか？オンライン遺伝子合成製品選択ガイドは、www.thermofisher.com/genesynthesisproductselection をご覧ください。

シーケンシングプラットフォームを使用し、解析します（Invitrogen™ Vector NTI シーケンス解析およびデザインソフトウェア、ならびに Ion Torrent™ システムまたはSOLiD™ システムを使用）

デザインのソフトウェアでお客様の、遺伝子発現に合う配列に最適化します。（ Invitrogen™ GeneArt™ GeneOptimizer™ ソフトウェアを使用）

弊社への作業依頼、あるいはお客様ご自身による作製もできます。業界トップクラススピード、品質、および性能を備えたGeneArt 製品（人工遺伝子合成ツールなど）およびサービス（サブクローニングおよびプラスミド調製）です。

優れた安定発現細胞株の樹立・培養、タンパク質の発現・生産向けの製品およびサービスがあります。小規模の研究から、関連市場における工業生産まで幅広く対応します。

ステップ1－解析

ステップ2－設計

ステップ3－構築

ステップ4－発現

2

GeneArtとは ...私たちはタンパク質の発現および安定発現細胞株の樹立までをサポートする人工遺伝子合成サービスでサポートします。

GeneArt Gene Synthesisご依頼配列に100％マッチするDNAコンストラクトを提供します。Invitrogen™ GeneArt™ Gene Synthesis は信頼性とコスト効率に優れた製品、サービスがあります。

• タンパク質収量の最大化および迅速な生産プロセスを可能にします。

• 高品質－ ISO 9001：2008 認証取得済み

• タンパク質発現レベルの最大限上げる遺伝子最適化

GeneArt カスタムサービス時間の節約や既存のプロセスの改良を求めているお客様にGeneArt サービスは以下を提供します。

• お客様の全ての外部委託ニーズ全てを提供

• 人工遺伝子合成、カスタム細胞株樹立、および哺乳類／バキュロウイルス発現系を用いるタンパク質発現に関するカスタムサービス

• クローニングおよびプラスミド調製サービス

• ISO 9001：2008 および ISO 13485：2003認証取得プロセスによる迅速なプロジェクト管理

GeneArt Strings DNA FragmentsPCRよりも迅速に、最長 3kbpまでの二本鎖DNA断片を提供できます。さまざまな下流クローニング法に対応する Invitrogen™ GeneArt™ Strings™ DNA Fragments をご用意しています。

• 人工遺伝子合成における柔軟性および性能の両方の利点を備えたソリューション

• 簡単な注文方法－ GeneArt ポータルサイトからオンラインで、ご希望の配列を直接入力、編集、最適化、および注文可能

GeneArt Directed EvolutionDirected Evolution は、基礎研究、医学、および工業生産向けの生体分子を作製します。この手法では、変異導入とセレクションの数回の繰り返しによって迅速に結果が得られます。Invitrogen™ GeneArt™ Directed Evolution サービスは以下を提供します。

• コンビナトリアルライブラリ

• 部位特異的変異導入

3

GeneArt 生産拠点施設の概要

GeneArt 施設当社の人工遺伝子合成サービスの研究拠点（Global Centers of Excellence） はドイツのレーゲンスブルクとアメリカのカリフォルニア州プレザントンにあります。1999年から、GeneArt は、世界中の研究者に優れた人工遺伝子合成ソリューションを提供してきました。

レーゲンスブルク拠点では1ヶ月当たり6.5Mbpまでの遺伝子を市場に供給しているのに対し、新しいプレザントン拠点では現在1ヶ月当たり1.5Mbp までの生産能力を持っています。いずれの施設も国際標準化機構（ISO）に準拠しています。

当社は、市場の合成遺伝子の需要増大に対応して、当社では両拠点の生産能力を常に拡大しています。最良の製品およびサービスを提供するために、現在全世界で300人以上の従業員が携わっています。

レーゲンスブルク拠点 プレザントン拠点

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GeneArt Gene Synthesis高品質なカスタム人工遺伝子合成

GeneArt Gene Synthesis サービスは、従来のDNA実験に簡便性、柔軟性、及び信頼性を与えるサービスです。ご依頼配列に100％マッチの正確性を持つDNAコンストラクトを高いコスト効率で提供します。時間と資源の節約を可能とします（6ページの図1を参照）。本サービスは、従来の分子生物学手法に代わる代替法であり、より優れたタンパク質の発現効率と品質の向上を可能とするサービスです。GeneArt Gene Synthesisツールは、従来の遺伝子合成法よりはるかに優れ、パフォーマンスを最大限に発揮するための発現の最適化を可能とします。

利点• 発現およびmRNA安定性を高めるための独自の最適化

• 柔軟性の高い遺伝子およびベクターの設計

• 最適化による発現量の増加は実験にて検証済

• 発現およびトランスフェクション用のReady-to-use コンストラクト溶液の作製

• 簡単なオンラインオーダーシステム

性能• Webオーダーのためのプロジェクトセットアップのアシストおよび個別のプロジェクトのサポート

• GeneOptimizer アルゴリズムを用いた発現量を最大化（発現最適化の実績は科学的に実証済み）するための最適化

• 完全自動化された工業スケールの遺伝子処理プラットフォームにより高い生産能力を信頼性が実現

*上記合成期間に約5営業日（約1週間）の配送日数を加算したものが実際の納期です。**エクスプレスおよびSuperSPEEDサービスはアップグレード料金となります。

品質• 全てのプロセスで ISO 認証を取得済

• 包括的な品質保証文書の添付

• 自動化された生産プロセス

• 100％配列保証

合成日数スタンダード• 1,200bpまで→9営業日 *

• 3,000bpまで→12営業日

エクスプレス• 1,200bpまで→7営業日

• 3,000bpまで→10営業日

SuperSPEED**• 1,200bpまで→5営業日

• 1,800bpまで→7営業日

• 緊急リクエスト

詳細は、オーダーサポート TEL：03-6832-6980（音声ガイダンス1→2） メール：jpgene@liftech.com にお問い合わせください

5

A C G C GTA

コロニーのスクリーニング

cDNA

ライブラリ

PCR増幅

シーケンシング

プラスミドの完成

クローニング部位の付加

ライゲーション&

形質転換

野生型DNA配列

GeneArtGeneOptimizer

により最適化された配列

発現GeneOptimize

最適化アルゴリズム

GeneAssembler人工遺伝子合成プラットフォーム

?

GeneArt Gene Synthesis

Classic cloning

詳細はwww.thermofisher.com/longgenes をご覧ください。

遺伝子断片からゲノムまでを幅広くカバー（長鎖遺伝子）• 1か月当たり8Mbp以上の処理能力を誇るハイスループット遺伝子合成（高速で信頼性の高いアセンブリ用DNA断片の作製）

• 専門的な設計およびアセンブリ技術で、10kb ～数百 kbのDNAアセンブリプロセスを実施、最短25営業日で納品

• 難度の高いDNAコンストラクトを組み立てる確かな技術

• サンガーシーケンシング／次世代シーケンシングによる柔軟な配列検証と最終段階でのQC

• 長年多くのコンストラクトを納品している実績が、大規模で複雑な依頼も確実でタイムリーに作製できる能力を実証

• コンストラクトを設計および組み立てを自作できるアセンブリキットも販売

図1. GeneArt Gene Synthesis および最適化は従来のクローニング法よりも通常迅速で、高い精度の結果を提供

6

¥13,200 ¥16,500 ¥19,800 ¥42,900 ¥49,500 ¥55,000 ¥60,500 ¥66,000 ¥71,500 ¥77,000 ¥82,500

¥1,200 ¥1,500 ¥1,800 ¥3,900 ¥4,500 ¥5,000 ¥5,500 ¥6,000 ¥6,500 ¥7,000 ¥7,500

納期 *2　約 9 営業日～

製品名

納期 *2　約 12 営業日～

価 格 *3

2,751 ～3,000 bp

GeneArt Strings DNA Fragments （ オンラインオーダー , >200 ng ）

Email オーダー時の追加料金 *1

150 ～600 bp

601 ～750 bp

751 ～1,000 bp

1,001 ～1,250 bp

1,251 ～1,500 bp

1,501 ～1,750 bp

1,751 ～2,000 bp

2,001 ～2,250 bp

2,251 ～2,500 bp

2,501 ～2,750 bp

GeneArt Strings DNA FragmentsとLibraries

Invitrogen™ GeneArt™ Strings™ DNA Fragments は、150bp～最長3,000bp までのクローン化されていない直鎖状の二本鎖DNA断片を提供する受託サービスです。GeneArt Gene Synthesisで開発された技術を用い、合成オリゴヌクレオチドから作製されます（図2）。Strings DNA Fragments は、凍結乾燥品で提供しますので、再懸濁後すぐに、クローニング、および正しい配列のクローンが得られていることの確認のためのスクリーニングにご利用いただけます。Strings DNA Fragments は、お客様の人工合成遺伝子とクローンをお客様の発現プラスミドに組み込むための迅速で便利な代替法です（図3のアプリケーション例を参照）。また、変異DNAライブラリーをお探しのお客様には Invitrogen™ GeneArt™ Strings™ DNA Librariesをお求めやすい価格でご提供します。詳細はホームページをご覧ください。

低価格Strings DNA Fragments はお求めやすい価格で遺伝子を合成するサービスです。GeneArt Strings DNA Librariesは、縮重ヌクレオチド変異導入領域を3ブロックまで含む、200~2,000 bpのGeneArt StringsDNA Fragmentsのプールで、各ブロックは30 bpまでで、変異導入部位は全 IUPACコードに対応しています。

最先端のオーダーシステムGeneArt ポータルサイトからオンラインで、ご希望の配列を直接入力、編集、最適化、および注文することができます。

品質Strings DNA Fragments は、合成オリゴDNAからPCR 増幅を経て作製した二本鎖DNA 断片です。お客様のご希望配列が含まれていることを確認するため、DNA フラグメントプールの状態でダイレクトシークエンスを実施しています。90% 以上の確率で正しい配列のクローンを得るために、以下のガイドラインを提供しています。

*1 E-mai（l Excelファイル）によるご注文時に発生する追加料金です。*2 合成難航時および輸入時の輸送状況によりお時間をいただく場合があります。 配列により合成をお受けできない場合があります。*3 記載の価格は2016 年4 月現在の価格です。消費税は含まれておりません。価格は予告なしに変更する場合がありますので、予めご了承ください。

詳細はwww.thermofisher.com/strings をご覧ください。

柔軟性末端配列までデザインできる完全な遺伝子設計により、様々な下流のクローニング法（制限酵素クローニング、TOPO クローニング、Gateway クローニング、GeneArt Seamless Cloning and Assembly、またはGeneArt Type IIs Assembly などの、あらゆるクローニング法）に柔軟に対応します。

GeneArt Strings DNA fragments ～1 kb

2 ～ 4 個の全長クローンを シーケンス

GeneArt Strings DNA fragments 1～2 kb

3 ～ 5 個の全長クローンを シーケンス

GeneArt Strings DNA fragments 2～3 kb

4 ～ 8 個の全長クローンを シーケンス

*配列の特性により作製日数は異なります。配達予定日は、作製日数に、地域によって異なりますが配達日数を加えた日数となります。

迅速200ng 以上の収量のStrings DNA Fragments を9営業日（～1,000bp）か、12営業日（1,001～3,000bp）で納品いたします。*

Ordering information

7

図2. GeneArt Strings™ DNA Fragments を用いた人工合成遺伝子の作製方法

5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘

G

A

A

G

G

AG

GeneArtテクノロジーを用いたDNA断片の作製

遺伝子設計

オリゴヌクレオチドの合成

遺伝子アセンブリ

直接クローニング

下流アセンブリ

直接アセンブリ

0

20%

40%

60%

80%

100%

120%

2,9802,9462,8942,7252,545

断片サイズ（bp）

984960844698624

88 88

7580

88 888683

56

50 50

67

75

94

50

6363

100 100 100

Cloning ef�ciency

Fidelity

図3. GeneArt Seamless Cloning and Assembly Kit を用いた、3,000bp までの10種類のサイズのStrings DNA Fragments のクローニング図はコロニーPCRで確認した正しい長さのクローンが得られた割合（％、クローニング効率）を示しています。また、正しい配列のクローンが得られた割合（％、fidelity）は、全長クローンの数に対しての割合となります。

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遺伝子最適化タンパク質発現量の最大化

遺伝子最適化によるタンパク質発現量の向上生物医学の研究および製品開発のための遺伝子組み換えヒトタンパク質の生産においては、発現収量の低さが障害となることがあります。同様に、一過性タンパク質発現においても十分な発現量が得られないリスクがあります。特に、異種タンパク質発現ではその傾向がみられます。発現に関するこれらの問題は、研究者が行う構造解析および機能解析の障害となり、探索プロセスあるいは研究プロジェクト全体に遅延（時には中止）をもたらします。

遺伝子最適化は、従来のタンパク質発現法の問題を解決するツールです。タンパク質発現に関連する収量等の問題点に対しては、現在では合理的で体系立てられた方法によって対処できます。すでに発表されている論文データを自社独自のデータと組み合わせたGeneOptimizer アルゴリズムはお客様の発現実験に最も適した遺伝子配列を作成することができます（図4）。配列の最適化により、様々な宿主系でタンパク質発現量を最高100倍にまで向上されることが実験で証明されています（Fath et al. 2011）。†

GeneOptimizer による配列の最適化には、次のサービスが含まれます：• お客様のご要望の配列エレメント同士を最適な方法で結合します。

• 潜在的なスプライス部位やmRNA を不安定化する配列を除去し、mRNA の安定性を高めます。

• コドンとGC含有率をお客様の発現系に合わせて最適化します。

• mRNA の二次構造を回避します。

• 繰り返し配列を除去します。

• RNAi レスキュー実験に使用できる野生型遺伝子のRNA-resitant formにすることができます。

9

図4. GeneOptimizer ソフトウェアツールが配列を最適化し、転写および翻訳効率を最大化

詳細はwww.thermofisher.com/geneoptimization をご覧ください。

配列の最適化でタンパク質発現量が最高100倍に向上GeneOptimizer は、mRNA の安定化と翻訳効率の最大化します。そしてタンパク質収量を飛躍的に向上させることができます（図5）。発現効率の向上については、Fathらが行った大規模な遺伝子発現比較試験においても確認されています（Fath et al. 2011）。†

図5. 野生型および最適化したヒト遺伝子によるタンパク質発現量の比較試験α-His 抗体を用いてウェスタンブロット解析を行いました。野生型遺伝子および最適化した2つのコンストラクトを使用しました。タンパク質発現量には3倍の差がみられました。内在性タンパク質量にて標準化しています。

Protein 1

Standardized protein load

25 kDa

15 kDa

70 kDa

55 kDa

Mock

Wild

type

GeneA

rt Gen

eOpti

mizer

Compe

titor 1

Compe

titor 2

Compe

titor 3

Compe

titor 4

Compe

titor 5

†Stephan Fath, Asli Petra Bauer, Michael Liss, Anne Spriestersbach, Barbara Maertens, Peter Hahn, Christine Ludwig, Frank Schafer, Marcus Graf, and Ralf Wagner, “Multiparameter RNA and Codon Optimization: A Standardized Tool to Assess and Enhance Autologous Mammalian Gene Expression,” PLOS One 6: 3, e17596.

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発現ベクターへの直接クローニングサービス

エクスプレスクローニングサービス人工遺伝子合成産物をご指定の発現ベクターに直接クローニングしてお届けするエクスプレスクローニングサービスをご用意しております。このサービスをご選択いただくと、お客様が発現ベクターに直接クローニングされた（expression-ready）遺伝子を入手するまでの日数を従来のサブクローニングサービスに比べ、4-5営業日短縮できます（図6）。GeneArt ポータルサイトからの人工遺伝子合成のご注文の際にエクスプレスクローニングサービスを追加することでご発注いただけます。エクスプレスクローニングサービスの納品物はご指定の発現ベクターに合成配列をクローニングしたプラスミドDNAのみです。従来の人工遺伝子合成サービスのクローニングベクターpMXにクローニングした合成配列は納品されませんのでご注意ください。ご要望の配列pMXベクターにクローニングしたプラスミドはサブクローニングサービスにて提供可能です。

人工遺伝子合成&エクスプレスクローニングの納期は11営業日からです（ご依頼の遺伝子の配列長によります）。さらに、人工遺伝子合成&エクスプレスクローニングと併用して“Express Service”を選択いただくとでは、納期を最大2営業日短縮することができ、また“Super SPEED”ですと最大7営業日短縮することが可能です。エクスプレスクローニングサービスが適用される配列長は4kbp以下の合成配列で、複雑な配列が含まれないものに限られます（配列の最適化はGeneArt ポータルサイト上のGeneOptimizer ソフトウェアを使用して行うことができます）。

詳細はwww.thermofisher.com/expressgenes をご覧ください

図6.発現ベクターへ直接クローニングするエクスプレスクローニング（上図）と従来のスタンダードなpMXベクターから発現ベクターへのサブクローニング（下図）の比較*発現ベクターの例。複数のベクターからお選びいただけます。

GeneOptimizer software

GeneAssembler process

pcDNA™ 3.1*

GeneArt Gene Synthesis

オンラインポータル 人工遺伝子合成：9営業日 エクスプレス

クローニング：1～2営業日

人工遺伝子合成＋ pMXベクターへのクローニング：9営業日 サブクローニング：5～6営業日

GeneOptimizer software

GeneAssembler process

pMx pcDNA™ 3.1*

GeneArt Gene Synthesis

オンラインポータル

エクスプレスクローニング（発現ベクターへの直接クローニング）

エクスプレスクローニングサービスでは下記のベクターがお選び頂けます。

お客さまのニーズを満たすためラインナップを増やし続けています。全てのベクターはこちらから www.thermofisher.com/expressgenes

• pcDNA™ 3.1(+)

• pcDNA™ 3.3-TOPO

• pcDNA™ 3.4-TOPO

• pFastBac™1

• pDONR™221

• pET100/D-TOPO

• pET151/D-TOPO

• pRSET A

• pYes2.1/V5-His-TOPO

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クローニング&プラスミドサービス

GeneArt サブクローニングサービスお客様の合成予定配列をご指定のベクターにサブクローニングし、そのプラスミドを将来のサブクローニングプロジェクト用に保存します。指定のベクターは弊社が保有するベクターの中からお選びいただくこともできます。さらに、複数のオープンリーディングフレームを有する複合クローニングプロジェクトにも対応します（例：モノクローナル抗体を発現するダブル遺伝子ベクターなど）。

GeneArt サブクローニングサービスでは、Invitrogen™ GeneArt Elements™ ベクター構築サービスで作製した新現ベクターを含むあらゆるご指定のベクターへの、お客様の合成遺伝子をサブクローニングすることができます。ご希望があれば、使用した試薬やロットナンバー等を明記した詳細な報告書を添付します。お客様が研究に専念できるよう、サブクローニングはGeneArt サービスにお任せください。

利点• 低価格

• 利便性－ ご要望をお知らせいただけば、すぐにready-to-use のプラスミドをお届けします。

• 信頼性－ インサートの配列が100％一致することを確認し、明記した文書を添付します。

• 独自性－ 組み換えクローニング技術を提供できる唯一の企業です。

• 機密保持－ ご依頼の情報、合成産物を第三者に開示することは一切ありません。

• 拡張可能－ そのままトランスフェクション可能なプラスミドに加えて、スケールアップ等のプラスミド調製サービスもご利用いただけます。

GeneArt プラスミドサービスGeneArt プラスミドサービスは、研究アプリケーションおよび前臨床試験に使用可能な、一貫して高品質なプラスミドDNA調製物を提供します。お客様が研究に専念できるよう、ベクター構築からプラスミドDNA調製まで弊社にお任せください。

高品質でスケーラブルなプラスミドDNA調製サービス• 高純度で均質なプラスミドDNA

• 極めて低レベルのエンドトキシン値（＜0.01EU／µg pDNA）

• ミリグラムからグラム規模のプラスミド調製サービス

• ご要望に応じてpDNAを分注およびチューブ等にお客様ご指定のラベルを添付し、すぐに使用可能な状態での納品も可能

プロジェクトのドキュメンテーションプラスミドのご注文毎に分析証明書（CoA）を添付します。ご要望があれば、全てのDIN ISOに準拠した生産プロセスに関する詳細な合成報告書も添付します。

詳細はwww.thermofisher.com/geneartplasmid をご覧ください

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GeneArt Elements Vector Constructionサービス

お客様のオリジナルのベクターを設計Invitrogen™ GeneArt Elements™ DNA パーツコレクションには、生物学的特性が既知のパーツ（配列と機能が確定しているプロモーター、ターミネーター、エンハンサー、オペレーター、およびオープンリーディングフレームなど）のサブセットが含まれます。 Elements パーツと、お客様が定義したカスタム配列／パーツを組み合わせて、ご希望のベクターを構築します。

オンラインGeneArt ポータルは、in vitroでのパーツの構築を可能とするアプリケーションです（図7）。ドラッグ・アンド・ドロップ機能を用いた直観的操作で、核酸配列のジャンクション部位にも制限なく、ポータル上で容易にパーツのシンボルをベクターに挿入することができます。設計したベクターはポータルサイトから直接発注できます。

図7. オンラインGeneArt ポータルサイト上のGeneArt Elements Vector Construction テンプレート

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• 柔軟性－ GeneArt Elements DNA は、設計の制限が最小限抑えられており、シームレスに構築可能 *

• 信頼性－ 全てのご依頼パーツについて、配列の100％一致保証

• 簡便性－ GeneArt ポータルサイト上で、CADのような直観的なソフトウェアを用いたベクター設計が可能

本サービスを用いて、Igκまたは tPA分泌リーダー配列を有するGFP、またはFc-Tag（アフィニティタグ）を融合したベクターを構築しました。これらのコンストラクトをHEK 293細胞に一過性に導入し、遺伝子導入した細胞の培養液について、抗GFP抗体を用いてウェスタンブロット解析を行いました（図8）。設計した全てのGeneArt Elements ベクターコンストラクションがきちんと機能しており、様々なポジティブコントロールのタンパク質が生成分泌されていることが示されました。

図8. GeneArt Elements ベクターコンストラクションサービスを用いて構築したpCMV-GFP ベクターからの発現されたタンパク質のウェスタンブロット解析PCML-GFPベクターを発現した培養液中のタンパク質は抗GFP抗体を用いて検出しました。

詳細はwww.thermofisher.com/elementsvc をご覧ください。

GFP

GFP-Fc

Mo

ck

pC

MV-

IgK

-lea

der

+em

GF

P

pC

MV-

tPA

-lea

der

+em

GF

P

pC

MV-

GF

P (c

ellu

lar)

* 最終的なベクターの作製には、GeneArt Elements リポジストリから、大腸菌薬剤耐性マーカーをお選びいただく必要があります。

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GeneArt ElementsCombinatorial Parts Assemblyサービス

Combinatorial Parts Assembly（CPA）は、所定のDNAパーツ（プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、オペレーター、およびオープンリーディングフレームなど）を組み合わせて、何通りもの幅広いコンストラクトを作製する方法です（図9）。お客様にはオーダーフォームに所定の各DNAパーツの配列とご依頼のパーツと組み合わせの要望をご入力いただきます。最終的なコンストラクトは、配列ジャンクションとリーディングフレームがシームレスに連結された状態で作製されます。

新しい代謝経路や様々な発現カセットの構築および試験を行うために、全ての考えられるパーツの組み合わせを作製し、お客様の研究ニーズに最も価値のある組み合わせを同定します。

• 正確性を試験済－ 全てのCPAに含まれる各コンストラクトは ISO 9001：2008 確認取得プロセスで管理されており、正確な配列と確認されたコンストラクトのみを納品

• 高いコストパフォーマンス－ 最終的なコンストラクトのパーツは複数回使用可能

• 包括的－ 利用可能な遺伝子エレメントは全て並べ替えが可能

図9. タンパク質発現に最適な組み合わせを探すために、CPAコンストラクトサービスでは5種類の異なる酵母プロモーターと5種類の異なる酵母ターミネーターを組み合わせてセットアップ

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CPAのプロセスサービスの実証のために、Invitrogen™ GeneArt Elements™ パーツコレクションからの酵母プロモーターおよび対応するターミネーターの小セットから構成されるコンビナトリアルライブラリを作成しました。相対的なルシフェラーゼ発現量を分析しました（図10）。本実験では、最も高いホタルルシフェラーゼ発現は、TEF1プロモーター／TEF1ターミネーターの組み合わせで示されました。これにより、この概念の実証が示され、代謝経路などにおける他の機能エレメントについても同様に解析が可能であることが推定されました。

詳細はwww.thermofisher.com/elementscpa をご覧ください。

2桁の違い

図10. 図9で示したCPA実験用の25種類のプロモーターおよびターミネーターの組み合わせで比較したルシフェラーゼ発現量の解析結果

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Gene-to-protein

Gene-to-proteinsGeneArt サービスは、ご希望のDNA配列からスタートして人工遺伝子合成・発現ベクターへのクローニング・プラスミド精製・目的タンパク質の発現・精製を一貫して行うことができます。組換えタンパク質は、ヒト・CHO浮遊細胞（FreeStyle™ 293、FreeStyle™ CHO、Expi293™）を用いた哺乳類培養細胞発現系か、バキュロウイルス発現系（Sf9昆虫細胞）で発現させることができます。また最適化された遺伝子に弊社の先進の発現系システムを組み合わせることで、他の発現系システムや野生型遺伝子を使用した場合に比べてタンパク質収量を向上させることができます。

サービス内容• ご希望の発現系に合わせて、コドン最適化を実施します。

• 弊社発現ベクターに直接クローニング、またはサブクローニングします。

• 培養に必要な量のプラスミドを調製します。

• バキュロウイルス・Sf9昆虫細胞発現系、および哺乳類培養細胞発現系から選択できます。さらにFreeStyle™ 293、FreeStyle™ CHO、Expi293™から選択できます。

• 小スケール培養で複数の発現時間でサンプリングを行い、至適培養時間を検討します。またバキュロウイルスは至適ウイルス液量も検討します。回収したサンプルを用いて、SDS-PAGE、ウェスタンブロット検出を行います。結果をご参照後、ご希望の条件で大量培養を実施します。

• 大量培養は1Lから数十Lまで対応できます。小スケール培養の結果を元にお客様ご希望の培養時間で回収します。

• 大量培養後、すぐにアフィニティ精製を実施します。Hisタグ、GST、Fcタグアフィニティ精製などが実施できます。

• 精製タンパク質のゲル上のクマシー染色およびアフィニティタグの付いたタンパク質のウェスタンブロット検出を含む報告書とともに納品します。

詳細は www.thermofisher.com/G2Pservice をご覧ください

利点• シームレスなプロジェクトプロセシング － ご提供配列情報から遺伝子合成およびタンパク質精製を行います。

• タンパク質収量の向上 － コドン最適化された遺伝子に先進の発現系システムを組み合わせることでタンパク質発現量を向上させます。

• タンパク質発現量の改善 － 遺伝子の最適化により発現が困難なタンパク質の発現を改善します。

• 哺乳類培養細胞発現系では、分泌蛋白質の高発現、立体構造の形成、糖鎖付加、プロセッシングが期待されます。

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GeneArt Directed Evolutionタンパク質エンジニアリング

GeneArt Directed Evolution 技術は、新たな特性を持つタンパク質を作製するための最も効率的なツールです。システマティックなプロセスで目的の変異を導入することでより進化したタンパク質を作製します。

コンビナトリアルライブラリDNA配列は、化学合成プロセスで、あらかじめ（トリヌクレオチオドを用いて）構築することにより多様性が生み出されます。（トリヌクレオチド変異；TRIM技術）本技術により、任意の部位のアミノ酸組成を完全にカスタマイズすることで、指定の部位における終始コドンや特定のアミノ酸の生成を回避することができます。

お客様のスクリーニングアッセイ（例：ファージディスプレイ、mRNAディスプレイ）に使用できるのクローンプールの状態でお届けします。ライブラリは、直鎖状二本鎖PCR産物（2µg 以上のDNA）、またはご指定の大腸菌に形質転換率≧109 でクローニングされたのが納品されます。クローン化ライブラリは、30µg 以上のプラスミドDNA および12x 0.5mL のグリセロールストックが納品されます。

部位特異的変異導入1つまたは複数の変異（塩基置換、挿入、欠失）をご要望のDNA配列に導入します。鋳型配列の最大5領域につきそれぞれ40bp の範囲の変異を導入できます。

鋳型配列から得られたコンストラクト（全ての変異体について、変異の配列を100％保証）は個別に、各5µg のプラスミドとして納品します。

詳細はwww.thermofisher.com/directedevolution をご覧ください。

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GeneArt ポータルサイト

オンラインオーダー弊社のウェブサイト上のGeneArt Gene Synthesis 配列設計およびポータルサイト（"GeneArt Portal"）から、直観的かつシンプルな操作で、お客様の遺伝子合成プロジェクトを作製いただけます。このポータルサイトは、ご依頼の遺伝子配列の入力、編集、および最適化をサポートし、お見積りとご注文をお受けできるかについて直ちにお知らせします。ほぼ全てのGeneArt サービスについて、この直観的なオーダーツールを使用してご注文いただけます。さらに、in silico クローニングや、お客様の遺伝子配列、プロジェクト、および将来的な設計に用いるためのパーソナルベクターの保存も行えます。使用しやすく柔軟性のあるこのワンストップ・ショッピングのこのポータルサービスをご利用いただくことで、時間を節約できます。

GeneArt ポータルシステムサイトの使用に関するインストラクションProject Manager上でお客様のプロジェクトを開始およびオーガナイズします（図11）。スマートなデザインになっており、お客様のプロジェクトを効率的に管理します。次に、 アイコンベースのProject Configurator上で、お客様の個々のプロジェクトの条件等をセットアップします（図12）。

詳細はwww.thermofisher.com/genesynthesis をご覧ください。

図11. オンラインGeneArt ポータルサイト上のProject Manager 図12. オンラインGeneArt ポータルサイト上のProject Configurator

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• スタート画面からの野生型遺伝子をすぐに注文できます－配列をコピー&ペーストするだけです

• スタンダードなpMXベクターかエクスプレスクローニングサービスにてリスト上の発現ベクターを選択します

• 配列編集や遺伝子の最適化用のツールがあります（野生型配列を望まない場合のオプション）

• 編集：5’ または3’ クローニング部位のための、配列の付加／除外／置換を行います

• 最適化：発現生物種、保護配列、および回避するモチーフを選択します

• 全ての要件を満たす配列サマリーがダウンロードできます

• カートに追加し、お見積り情報を得ることができます。

GeneArt ポータルの使用法（概略、セットアップ、クイックオーダー、最適化、およびサブクローニングサービス）については、www.thermofisher.com/genearttutorials サイト上のビデオライブラリーをご覧ください。

図13. オンラインGeneArt ポータル内の注文画面の例この例では、エクスプレスクローニングサービスと、さらにプラスミド調製サービスが選択されています。

GeneArt 人工遺伝子合成サービスの注文の例（図13）GeneArt ポータルサイトでは、多くのGeneArt 製品およびサービスがご注文いただけます。これらには、Invitrogen™ GeneArt Strings™ DNA Fragments 、Invitrogen™ GeneArt Elements™ 、GeneArt Precision TALs 、およびサブクローニング、プラスミド調製、GeneArt Directed Evolution 、ならびにカスタムタンパク質および細胞株作製などのサービスが含まれます。また、オンラインオーダーでのお客様のご注文品の作業進捗状況については、ポータルサイト上のGeneObserver™ モジュールで24時間いつでも簡単にご確認いただけます。

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Notes

Notes

詳細はwww.thermofisher.com/geneart をご覧ください。

テクニカルサポート 0120-477-392 jptech@thermo�sher.com

オーダーサポート TEL：03-6832-6980 FAX：03-6832-9584営　業　部 TEL：03-6832-9300 FAX：03-6832-9580

サーモフィッシャーサイエンティフィックライフテクノロジーズジャパン株式会社

研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続上での使用はできません。記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。 標準販売条件はこちらをご覧ください。 www.thermo�sher.com/TCFor Research Use only.Not for use in diagnostic procedures. © 2016 Thermo Fisher Scienti�c Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scienti�c and its subsidiaries unless otherwise speci�ed. Printed in Japan. IVC048-A1603OB

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