GENES, GENOMAS Y TÉCNICAS DE INGENIERÍA GENÉTICA...

... CON UN TOQUE DE BIOINFORMÁTICA

CÓDIGO GENÉTICO

DNADobleHélice

mRNA

Proteína

5'ATG CTT CCT CGG TGC TAC TGT GAA TAA 3'

3'TAC GAA GGA GCC ACG ATG ACA CTT ATT 5'

Hebracodificadora

Hebra no codificadora

TRANSCRIPCIÓN

TRADUCCIÓN

5'AUG CUU CCU CGG UGC UAC UGU GAA UAA 3'

(NH2)MET-LEU-PRO-ARG-CIS-TIR-CIS-GLU-FIN(COOH)

Retrotranscripción

GENES

Un gen es la unidad básica de herencia de los seres vivos. Un gen es una secuencia lineal de nucleótidos en la molécula de ADN (o ARN en el caso de algunos virus), que contiene la información necesaria para la síntesis de una macromolécula con función celular específica. Por ejemplo: Proteínas, ARNm, ARN ribosómico, ARN de transferencia y ARN pequeños.

GEN PROCARIOTA

mRNA POLICISTRÓNICOS

GEN EUCARIOTA

GENOMAS

El genoma es todo el material genético contenido en las células de un organismo en particular.

EUCARIOTAS

CLOROPLASTOS

MITOCONDRIAS

CROMOSOMA

GENOMA HUMANO 3200 MB

Organismo Tamaño Genoma(pares de bases)Fago λ 5×104

Escherichia coli 4×106

Levadura 2×107

Caenorhabditis elegans 8×107

Drosophila melanogaster 2×108

Humano 3×109

Amphibians109–1011

Psilotum nudum2.5 x 1011

C-value enigma ó C-value paradox

El C-value enigma ó C-value paradox es un término usado para describir la variación en los tamaños de genomas nucleares entre las especies eucariotas. El objeto de estudio del C-value enigma es la observación de que el tamaño del genome no se correlaciona con la complejidad del organismo.

EJERCICIO Hacer un programa que a partir del archivo

MTtabaco.gbk que contiene el genoma mitocondrial de tabaco extraer el gen que pida el usuario con 1000nts upstream y 1000nts downstream y guardarlo en formato fasta.

Especificaciones del formato Genbank. http://www.ebi.ac.uk/embl/Documentation/FT_definitions/feature_table.html

Especificaciones del formato Fasta. http://www.bioperl.org/wiki/FASTA_sequence_format

LOCUS BA000042 430597 bp DNA circular PLN 02-MAY-2006DEFINITION Nicotiana tabacum mitochondrial DNA, complete genome.ACCESSION BA000042 AP006340 AP006341VERSION BA000042.1 GI:56806513KEYWORDS .SOURCE mitochondrion Nicotiana tabacum (common tobacco) ORGANISM Nicotiana tabacum Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; core eudicotyledons; asterids; lamiids; Solanales; Solanaceae; Nicotianoideae; Nicotianeae; Nicotiana.REFERENCE 1 AUTHORS Sugiyama,Y., Watase,Y., Nagase,M., Makita,N., Yagura,S., Hirai,A. and Sugiura,M. TITLE The complete nucleotide sequence and multipartite organization of the tobacco mitochondrial genome: comparative analysis of mitochondrial genomes in higher plants JOURNAL Mol. Genet. Genomics 272 (6), 603-615 (2005) PUBMED 15583938REFERENCE 2 (bases 1 to 430597) AUTHORS Sugiyama,Y., Watase,Y. and Nagase,M. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (04-APR-2003) Yasuo Sugiyama, Nagoya University, Center for Gene Research; Chikusa-ku, Furo-cho, Nagoya, Aichi 464-8602, Japan (E-mail:ysugiya@gene.nagoya-u.ac.jp, Tel:81-52-789-5943, Fax:81-52-789-4526)FEATURES Location/Qualifiers

/db_xref="GI:56806523" /translation="MDLYSIRNQRISPQKREEFPLLSFCSARAWHSLLAERHTEKKKR LPYLSNSSYSYSFLVVVPILVFFFLAFLGPSVFRTVRLATMNEYYVNRVSCSLSCALN TKLGQRCEGL" gene complement(24579..25766) /gene="atp6" CDS complement(24579..25766) /gene="atp6" /note="CDS is reported in Acc# X06595" /codon_start=1 /product="ATP synthase F0 subunit 6" /protein_id="BAD83425.1" /db_xref="GI:56806524" /translation="MFRRIFLFDEDSLNSSVTSYTNASQSTTTIMDYSLKSSDTQGSS SGIFTDHPGLNPCSERIVELQYDIRLKLGALMPKESAQKVLEASEALHGESNNIAFLE YLLEDLQQNGVGGEAYKDAVDLSKDLVSSPLEQFEIISLIPMKIGNLYFSFTNPSLFM LLTLSLVLLLVYFVTKKGGGNSVPNAWQSLVELIYDFVLNPVNEQIGGLSGNVKQKFS PRISVTFTFSLFCNPQGMIPYSFTVTSHFLITLGLSFSIFIGITIVGFQKNGLHFLSF LLPAGVPLPLAPFLVLLELIPYCFRALSSGIRLFANMMAGHSSVKILSGFAWTMLCMN DLLYFIGDLGPLFIVLALTGLELGVAISQAHVSTILICIYLNDAINLHQSASFFIIEQ KRV" gene complement(31411..31743)

Formato Genbank

ORIGIN 1 attcacagtg ctcttcgcaa tctcgatcct cgcaatgctc tgcaacccga gggtgagcgc 61 cattgaagga ctggaagcaa gcttcacacc ttccacaacg gcaactacac cgtcgactcc 121 acaagaactc caagaacact cgttcttctc tcacacagca ctcctccctc cgatcttgtc 181 ccatctcggc ttccacgcgc gtgtcgcccc tatatgctgt caccgactag gctcggacgg 241 tggaggaagc tggtagcatt aggagaattt tcagcacttt tataacacag agtcagcgcg 301 aagaaaggca gatccatact agatcaacgg ttttcctttc tcttacgaga ttttcatttc 361 tagttagagg agcagaccac tctaacttac tttagaacaa tgagaaatgt aacactcacc 421 aactgaagaa cgaatgtgag ctcgggagga aatgtgcctc tccaactcgt actttgctac 481 aacgatcttt gtatgtacgg gtatcgataa tggaagagac tagatcaaat agggcaattc 541 gtaatgctct cttcctgtcc tagaataaga aagtagcttg tctgccgtac tggctgcttc 601 attgaatgtg tcgatctgca ttctatataa ggagttgatt tgcatccttg tctggcagtt 661 agctaagcga gaagctgtga tcgaggaagc cccgcccagt agtgcctcta ctctactagt 721 cctagtacta gatactagat agacaggccg gtcaccggtg gcataagatc cttctctgct 781 tgtctaactc aagccagata gcagcaatca ctcgaaatag tcatatgcgg aacacatgca 841 agtccagatt gaaagataag gaaggcaagt caaagcggaa agaaa

Formato Fasta

>gi|142864|gb|M10040.1|BACDNAE B.subtilis dnaE gene encoding DNA primase, complete cdsGTACGACGGAGTGTTATAAGATGGGAAATCGGATACCAGATGAAATTGTGGATCAGGTGCAAAAGTCGGCAGATATCGTTGAAGTCATAGGTGATTATGTTCAATTAAAGAAGCAAGGCCGAAACTACTTTGGACTCTGTCCTTTTCATGGAGAAAGCACACCTTCGTTTTCCGTATCGCCCGACAAACAGATTTTTCATTGCTTTGGCTGCGGAGCGGGCGGCAATGTTTTCTCTTTTTTAAGGCAGATGGAAGGCTATTCTTTTGCCGAGTCGGTTTCTCACCTTGCTGACAAATACCAAATTGATTTTCCAGATGATATAACAGTCCATTCCGGAGCCCGGCCAGAGTCTTCTGGAGAACAAAAAATGGCTGAGGCACATGAGCTCCTGAAGAAATTTTACCATCATTTGTTAATAAATACAAAAGAAGGTCAAGAGGCACTGGATTATCTGCTTTCTAGGGGCTTTACGAAAGAGCTGATTAATGAATTTCAGATTGGCTATGCTCTTGATTCTTGGGACTTTATCACGAAATTCCTTGTAAAGAGGGGATTTAGTGAGGCGCAAATGGAAAAAGCGGGTCTCCTGATCAGACGCGAAGACGGAAGCGGATATTTCGACCGCTTCAGAAACCGTGTCATGTTTCCGATCCATGATCATCACGGGGCTGTTGTTGCTTTCTCAGGCAGGGCTCTTGG

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Las técnicas más importantes:

- Clivado del ADN en sitios específicos por enzimas de restricción.

- Hibridación de ácidos nucléicos. Southern blot, Northern blot, hibridación in situ y Western blot.

- Clonado molecular del ADN. Vectores de clonado.

- PCR, reacción en cadena de la polimerasa.

MANIPULACIÓN DEL ADN IN VITROENZIMAS DE RESTRICCIÓN

- Permiten realizar cortes en sitios específicos en el ADN, que permiten aislar y manipular genes individuales.

- Son endonucleasas (cortan enlaces internos de la molécula) de origen bacteriano.

- Reconocen secuencias específicas de ADN de diferente longitud.

- Luego del reconocimiento realizan el corte.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

- Existen alrededor de 4000 enzimas de restricción conocidas.

- 671 disponibles comercialmente.

- Hay bases de datos de enzimas de restricción y sus sitios de reconocimiento y corte:

REBASE

http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html

from Bio import Restrictionfrom Bio import Seqfrom Bio.Alphabet import IUPAC

an=Restriction.Analysis(Restriction.CommOnly, Seq.Seq\(secuencia, IUPAC.unambiguous_dna))an.print_as ("map")

Resultado (output):

7 TspEI Sse9I Tsp509I FokI | | 12 HpyCH4V CviRI | | | | 20 BstF5I BseGI | | | ATGGGTAATTGCAACGGGGCATCCAAG|||||||||||||||||||||||||||TACCCATTAACGTTGCCCCGTAGGTTC1 27

RESTRICCIÓN EN 2 PASOS

HIBRIDACIÓN DE ACIDOS NUCLÉICOS

- El apareamiento de las bases (A-T y C-G) para formar una doble hélice se llama hibridación, dado que puede utilizarse para formar ADN híbrido compuesto por cadenas de diferentes orígenes.- La hibridación permite la formación de complejos DNA:DNA y ADN:ARN usando la complementariedad de bases (A-T, C-G).- El fenómeno de hibridación ocurre bajo condiciones especiales en solución (pH, concentración de sales, T0, etc).

5'- A T G C T A G A G G G C T A A C G T A C T A G -3'

5'- A T CT C C C G A T T G C A T -3'

5'- A T G C T A G A G G G C T A A C G T A C T A G -3' 5'- A T C T C C C G A T T G C A T -3'

DNACortado por enzimas de

restricción

PROTEÍNARNA

Tranferencia de proteínas, RNA o DNA separados por electroforesis a membranas sintéticas.

Hibridación del DNA o RNA con secuencias marcadas con radiactivo (“sondas”).Revelado por radioautografía.

Detección de Proteínas con anticuerpos marcados.

Southern blot Northern blot Western blot

RESULTADOS

REVELADO

TRANSFERENCIA

ELECTROFORESIS

TÉCNICAS BÁSICAS

HIBRIDACIÓN IN SITU

CLONADO MOLECULAR

Introducción en una célula húesped de una mólecula de ADN capaz de replicarse en paralelo con el genoma del húesped en estado episomal, es decir sin integrarse al genoma.

VECTORES DE CLONADO

BACTERIÓFAGO O “FAGO”

PLÁSMIDOS

PCR

TM temperature melting

DNApol de bacterias termofilas

Diseño de primers15-30 nts

MUESTRAS

USOS DE LA PCR

Huella genéticaTest de PaternidadDiagnóstico de enfermedades hereditariasClonación de genesMutagénesisAnálisis de ADN fósilGenotipado de mutaciones específicasIdentificación de especies

SECUENCIACION

A partir de 1970 fue posible determinar secuencia nucleotídica de fragmentos de DNA

Métodos clásicos: químico y enzimático

Método químico de Maxam y Gilbert

Pero en la actualidad los métodos de secuenciación utilizados se basan en el Método enzimático de Sanger

Otros métodos de secuenciación automática:- Empleando microarray- Pirosecuenciación

Ventajas

- Automatización completa de todo el proceso, no siendo necesaria siquiera la presencia de un técnico que cargue las muestras.- Rapidez en el análisis de cada muestra: dado el pequeño diámetro de los capilares, por lo que pueden leerse del orden de 450 nucleótidos en el plazo de 1 hora.

Lectura de unas 100 millones de bases por corrida del instrumento (7.5 horas).

http://www.biologyreference.com/images/biol_02_img0140.jpg

http://www.gbiosciences.com/Image/BE307.jpg

www.biopython.org

http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/Labs/Genetics/PCR/PCR_Protocol.htm

http://members.aol.com/BearFlag45/Biology1A/LectureNotes/LNPics/Recomb/pcr.gif

Molecular Biology of The Cell. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books

Referencias

Introducción a la Oncología Molecular. Goméz y Alonso. Universidad Nacional de Quilmes, 1998.

Lic. Virginia González

http://www.genomesonline.org/gold_statistics.htm